Újabb tenyésztésen, valamint nukleinsav amplifikációs módszereken alapuló technikák alkalmazása a Mycobacterium tuberculosis primér izolálására és rifampicin rezisztenciájának meghatározására
Ph.D. értekezés
Dr. Bártfai Zoltán Semmelweis Egyetem, Általános Orvostudományi Kar, Pulmonológiai Klinika
Témavezető: Dr. Somoskövi Ákos
Budapest, 2003
1
TARTALOMJEGYZÉK TARTALOMJEGYZÉK
2
ÖSSZEFOGLALÁS
4
SUMMARY
6
RÖVIDÍTÉSEK
8
AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE
9
1. BEVEZETÉS
11
1.1. Általános bevezető 1.1.1. A tuberkulózis megbetegedés és a Mycobacterium tuberculosis komplex 1.1.2. A tuberkulózis és az antituberkulotikum-rezisztens tuberkulózis epidemiológiája (I) 1.1.3. A tuberkulózis laboratóriumi diagnosztikájának alapjai (I) 1.1.4. Az antituberkulotikum rezisztencia (II, III, V)
11 11 11 13 16
1.2. A Mycobacterium tuberculosis izolálása az automatizált BACTEC MGIT 960 rendszer segítségével, összehasonlítva a BACTEC 460 TB rendszerrel és a Löwenstein-Jensen táptalajon való tenyésztéssel (IV) 19 1.3. Magyarországról származó Mycobacterium tuberculosis izolátumok rifampicinrezisztenciájának molekuláris elemzése DNS szekvenálással és Line Probe Assay segítségével (II, V) 20 2. CÉLKITŰZÉSEK
22
3. MÓDSZEREK ÉS ESZKÖZÖK 23 3.1. A Mycobacterium tuberculosis izolálása az automatizált BACTEC MGIT 960 rendszer segítségével, összehasonlítva a BACTEC 460 TB rendszerrel és a Löwenstein-Jensen táptalajon való tenyésztéssel (IV) 23 3.1.1. Betegek, minták 23 3.1.2. A minták előkészítése 23 3.1.3. Leoltás 23 3.1.4. Statisztika 24 3.2. Magyarországról származó Mycobacterium tuberculosis izolátumok rifampicinrezisztenciájának molekuláris elemzése DNS szekvenálással és Line Probe Assay segítségével (II) 25 3.2.1. Betegek, klinikai minták 25 3.2.2. Kontrollok és identifikálás 25 3.2.3. Hagyományos rezisztencia meghatározás 26 3.2.4. DNS szekvenálás 26 3.2.5. Line Probe Assay 28
2
4. EREDMÉNYEK 29 4.1. A Mycobacterium tuberculosis izolálása az automatizált BACTEC MGIT 960 rendszer segítségével, összehasonlítva a BACTEC 460 TB rendszerrel és a Löwenstein-Jensen táptalajon való tenyésztéssel (IV) 29 4.2. Magyarországról származó Mycobacterium tuberculosis izolátumok rifampicinrezisztenciájának molekuláris elemzése DNS szekvenálással és Line Probe Assay segítségével (II) 33 5. MEGBESZÉLÉS 38 5.1. A Mycobacterium tuberculosis izolálása az automatizált BACTEC MGIT 960 rendszer segítségével, összehasonlítva a BACTEC 460 TB rendszerrel és a Löwenstein-Jensen táptalajon való tenyésztéssel (IV) 38 5.2. Magyarországról származó Mycobacterium tuberculosis izolátumok rifampicinrezisztenciájának molekuláris elemzése DNS szekvenálással és Line Probe Assay segítségével (II, V) 42 6. ZÁRÓ KÖVETKEZTETÉSEK
46
7. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
48
8. IRODALOMJEGYZÉK
49
9. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE 9.1. Az értekezés témájával összefüggő közlemények 9. 2. Egyéb közlemények
59 59 61
3
Összefoglalás A tuberkulózis továbbra is jelentős népegészségügyi kihívást jelent a Föld minden pontján. Ismételt fellángolásában elsősorban gazdasági és szociális tényezők, a humán immundeficiencia vírus és a tuberkulózis közötti szinergizmus, valamint a XX. század végén újabb komoly fenyegetésként megjelent rezisztens és multidrog rezisztens tuberkulózis terjedése játszik kiemelkedő szerepet. Mindezek miatt fontos szem előtt tartani a Center for Disease Control and Prevention jelenlegi ajánlását, miszerint a Mycobacterium tuberculosis complex izolálása, identifikálása valamint az ezt követő rezisztencia vizsgálatok lehetőleg a mintavétel időpontjától számított 2-3 (izolálás, identifikálás) illetve 2-5 (rezisztencia meghatározás) héten belül történjenek meg. Ahhoz, hogy ez az ajánlás a gyakorlatban is megvalósítható legyen, nélkülözhetetlen egyrészt az újabb folyékony táptalaj alapú rendszerek rutinszerű alkalmazása, másrészt az antituberkulotikum- és ezek közül is az egyik legfontosabb, a rifampicin-rezisztencia minél gyorsabb és pontosabb kimutatása. A vizsgálat első lépéseként, a különböző tenyésztési eljárások elemzése céljából két különböző folyékony és egy hagyományos szilárd táptalaj használatával összehasonlító vizsgálatot végeztünk a mycobacterium törzsek kimutathatóságának szempontjából. 377 klinikai mintából 57 mycobacterium törzs (Mycobacterium tuberculosis, n = 55; nem tuberculosist okozó mycobacterium, n = 2) volt izolálható. BACTEC MGIT 960 folyékony táptalaj esetén 96,4%, BACTEC 12B folyékony táptalajjal 92,7%, míg Löwenstein-Jensen szilárd táptalaj alkalmazásakor 81,8% volt a Mycobacterium tuberculosis izolálási rátája. A mikroszkóposan pozitív Mycobacterium tuberculosis átlagos tenyésztési ideje 12,6 nap volt BACTEC MGIT 960 rendszerrel, 13,8 nap BACTEC 12B médiummal, és 20,1 nap Löwenstein-Jensen táptalajon. Mikroszkóposan negatív törzsek izolálásakor az átlagos tenyésztési idő BACTEC MGIT 960 alkalmazásával 15,8 nap, BACTEC 12B használatával 17,7 nap, Löwenstein-Jensen táptalajon pedig 42,2 nap volt. A kontaminációs ráta 3,7 % volt BACTEC MGIT 960, 2,9 % BACTEC 12B és 1,2% Löwenstein-Jensen táptalaj esetén. Eredményeink összefoglalása alapján elmondható, hogy a nem radiometriás, teljesen automatizált 7 ml-es BACTEC MGIT 960 rendszer megbízható alternatívája lehet a félig automatizált, radiometriás BACTEC 460 TB rendszernek.
4
A kutatások következő lépéseként Magyarország három megyéjéből származó 29 rifampicin-rezisztens Mycobacterium tuberculosis törzsnél két olyan rpoB génszakaszt vizsgáltunk, amelyek összefüggést mutattak a rifampicin-rezisztenciával. A 29 rezisztens törzsből 27-nél találtunk mutációt a 81 bázispár régióban (26 törzs), illetve az N-terminális régióban (1 törzs), míg két törzs esetében egyik szakaszon sem lehetett mutációt kimutatni. A mutációk lokalizációja és gyakorisága eltért a korábban közöltektől. A D516V mutáció, amely a leggyakoribb volt a jelen vizsgálatban, 38%ban volt kimutatható a magyar törzsekben, ami 2-10-szer gyakoribb, mint más országokban. A 29 izolátumot az Inno-LiPA Rif. TB teszttel (LiPA) is megvizsgáltuk, ami a rifampicin-rezisztencia gyors kimutatását szolgáló reverz hibridizációs teszt. A LiPA teszt 26 rezisztens törzsben mutatta ki az rpoB mutációt, de 4 izolátumban nem tudta meghatározni a mutáció típusát, mivel a LiPA teszt nem tartalmazta ezeket a mutációkat. Emellett az egyik rifampicin-érzékeny kontroll törzsben lévő néma mutációt a LiPA teszt rifampicin-rezizstens mutációnak minősítette. Eredményeink azt jelzik, hogy elengedhetetlen a gyors molekuláris tesztek validálása az egyes földrajzi területeknek megfelelően, a DNS szekvencia analízis segítségével, mielőtt egy adott tesztet a rutin diagnosztikába bevezetnek.
5
Summary Tuberculosis continues to be a great challenge all over the world. The cause of recent epidemic is multifactorial, including economic and social factors, synergism between the human immundeficiency virus and Mycobacterium tuberculosis and spreading of multidrug resistant tuberculosis, what emerged as an important problem by the end of the XX. century. For these reasons the present recommendations of Center for Disease Contol and Prevention should be kept in mind, it states that the complex isolation, identification and further resistance examinations of Mycobacterium tuberculosis should be performed within 2-3 weeks (isolation, identification) and 2-5 weeks (resistance tests) after sample taking. Routine use of new liquid media and the more rapid and accurate detection of antituberculotic – especially rifampicin–resistance – are essential factors for putting these recommendations into daily clinical practice. Using two different liquid media and one conventional solid medium, a total of 57 mycobacterial isolates (Mycobacterium tuberculosis, n = 55; nontuberculous mycobacteria, n = 2) were recovered from 377 clinical specimens. The rates of recovery of Mycobacterium tuberculosis were 96,4% with the BACTEC MGIT 960 liquid medium, 92,7% with BACTEC 12B liquid medium, and 81,8% with the LöwensteinJensen medium. The mean time to detection of Mycobacterium tuberculosis in smearpositive specimens was 12,6 days for BACTEC MGIT 960 medium, 13,8 days for BACTEC 12B medium, and 20,1 days for Löwenstein-Jensen medium, and in smearnegative specimens it was 15,8 days for BACTEC MGIT 960 medium, 17,7 days for BACTEC 12B medium, and 42,2 days for Löwenstein-Jensen media, respectively. In conclusion, the nonradimetric, fully automated 7-ml BACTEC MGIT 960 system can be considered a viable alternative to semiautomated, radiometric BACTEC 460 TB system. Two regions of rpoB associated with rifampin resitance were sequenced in 29 rifampin-resistant (determinde by the proportion method) isolates of Mycobacterium tuberculosis obtained from patients from three counties of Hungary. Of the 29 resistant strains, 27 had a mutation either the 81-bp region (26 strains) or the N-terminal region (1 strain), while the other 2 strains had no mutations in either region. The locations and frequencies of the mutations differed from those previously reported. The most common
6
mutation in this study, D516V, was found in 38% of the Hungarian strains, a frequency 2 to 10 times higher than that found in studies from other countries. These same 29 isolates were also evaluated with the Inno-LiPA Rif. TB test (LiPA), a reverse hybridization assay for the rapid detection of rifampin resistance. Although LiPA detected the presence of an rpoB mutation in 26 of the resistant isolates, the type of mutation could not be determined in 4 isolates because the mutations present were not among those included on the LiPA strip. In addition, a silent mutation in one of the rifampin-susceptible control strains was interpreted as rifampin resistant by LiPA. These findings demonstrate the importance of validating this rapid molecular test by comparison with DNA sequence results in each geographic location before incorporating the test into routine diagnostic work.
7
Rövidítések
AIDS – szerzett immunhiányos szindróma ATCC - American Type Culture Collection bp – bázis pár DNS – dezoxiribonukleinsav EMB – ethambutol HIV – humán immundeficiencia vírus INH – isonicid LIPA – Line Probe Assay LJ – Löwenstein-Jensen MGIT – Mycobacteria Growth Indicator Tube MDR – multi drog rezisztens M. tuberculosis – Mycobacterium tuberculosis NTM - nem tuberculosist okozó mycobacteriumok RMP – rifampicin RNS- ribonukleinsav rpoB – RNS polimeráz
-alegység
PCR – polimeráz láncrekció PZA – pyrazinamid SM - streptomycin TBC – tuberkulózis ZN - Ziehl-Neelsen Az értekezés alapjául szolgáló közlemények jegyzéke
8
Ez az értekezés az alábbi közleményeken alapszik, amelyekre a szövegben az itt jelzett római számozásukkal történik hivatkozás:
I.
Bártfai Z., Somoskövi Á., Hutás I. A tuberculosis járványtana, terjedése, patológiája, diagnosztikája és klinikai megjelenési formái. Családorvosi Fórum 2001; január:10-15.
II.
Bártfai Z., Somoskövi Á., Ködmön CS., Szabó N., Puskás E., Kosztolányi L., Faragó E., Mester J., Parsons L.M., Salfinger M. Molecular characterization of rifampin-resistant isolates of Mycobacterium tuberculosis from Hungary by DNA sequencing and the Line Probe Assay. J. Clin. Microbiol. 2001; 39:3736-3739. IF: 3,965
III.
Mester J., Vadász I., Bártfai Z., Ködmön Cs., Somoskövi Á. A Mycobacterium tuberculosis antituberkulotikum-rezisztenciájának molekuláris alapjai. Medicina Thoracalis 2002; 55:30-36.
9
IV.
Somoskövi Á., Ködmön Cs., Lantos Á., Bártfai Z., Tamási L., Füzy J., Magyar P. Comparison of recoveries of Mycobacterium tuberculosis using the automated BACTEC MGIT 960 system, the BACTEC 460 TB system, and LöwensteinJensen Medium. J. Clin. Microbiol. 2000; 38:2395-2397. IF: 3,965
V.
Bártfai Z., Somoskövi Á., Hutás I. A tuberculosis elleni küzdelem, a betegség gyógykezelése, a betegek gondozása Családorvosi Fórum, 2001; január:16-19.
10
1. 1.1.
Bevezetés Általános bevezető
1.1.1. A tuberkulózis megbetegedés és a Mycobacterium tuberculosis complex Nitrogén kötő aktivitásuk és más mikroorganizmusok tápanyag szükségleteit kielégítő szervesanyag bontó képességük folytán, a Mycobacterium genus legtöbb tagja a talaj és a felszíni víztakaró hasznos és nélkülözhetetlen lakója. Néhány mycobacterium faj azonban az evolúció során kórokozóvá vált. Ezek közül is a Mycobacterium tuberculosis komplexhez tartozó Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) és M. bovis vált a legjelentősebbé. Habár a komplex tagjai (M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis bacillus Calmette-Guerin, M. africanum, M. microti, M. canetti, M. caprae) között virulenciájukat valamint a gazdaszervezetet illetően számottevő
különbségek
dezoxiribonukleinsav
észlelhetők,
(DNS)
szintű
genetikailag
azonosságot
mintegy
mutatnak.
Így
99,9%-os ezeket
az
organizmusokat sokkal inkább alfajoknak semmint egymástól elkülönülő fajoknak tartják 1-3. A tuberkulózis a M. tuberculosis okozta fertőzés eredményeképp kialakuló kórkép. A leggyakoribb kórformaként jelentkező tüdőtuberkulózisban a kórokozó hatására a különféle szabályozó mediátorokat termelő alveoláris makrofágok és limfociták aktivációja és felszaporodása, és ennek következményeként egy T helper limfocita/makrofág alveolitis kialakulása figyelhető meg 4-7. 1.1.2.
A
tuberkulózis
és
az
antituberkulotikum-rezisztens
tuberkulózis
epidemiológiája (I) A tuberkulózis továbbra is jelentős népegészségügyi kihívást jelent a Föld minden pontján. Világszerte évente mintegy 8 millió ember betegszik meg újonnan és 2 millió ember hal meg csak tuberkulózis következtében. A Föld lakosságának egyharmada M. tuberculosis-sal fertőzött
8-10
. A tuberkulózis tehető felelőssé az
elkerülhető felnőttkori halálokok 25%-ért, és ugyancsak figyelemre méltó, hogy a megbetegedettek
80%-a
gyermekkorú
vagy
a
legproduktívabb 15-59 éves korosztályhoz tartozik
8-10
munkavégzés
szempontjából
. Az Egészségügyi Világszervezet
előrejelzése alapján 2000 és 2020 között közel 1 milliárd ember válik újonnan fertőzötté
11
és ezek közül várhatóan 200 millió egyénben ez a fertőzés klinikai megbetegedéshez vezet majd. Ezen 200 millió ember közül 35 millió menthetetlenül meghal amennyiben a tuberkulózis elleni védekezés nem erősödik számottevően a jövőben 8-10. A helyezet súlyosságát jelzi, hogy jelenleg minden másodpercben egy újabb egyén fertőződik meg M. tuberculosis-sal, és annyian halnak meg tuberkulózis következtében mintha a nap minden órájában lezuhanna egy Boeing 747-es utasszállító repülőgép. A M. tuberculosis fertőzöttek élete során kb. 10%-ban a fertőzés biztosan megbetegedéshez vezet. A humán immundeficiencia vírus (HIV) fertőzöttek esetében ugyancsak a fertőzöttek 10%-ban várható tuberkulózis megbetegedés kialakulása, mégpedig az expozíciót követő egy éven belül
5, 8-10
. Évi mintegy 1,5 millió új
megbetegedés a szub-szaharai Afrikából származik, és ez a mutató a HIV/AIDS epidémiának köszönhetően évről évre drasztikusan emelkedik. Közel évi 3 millió új eset dél-kelet ázsiai országokban (India, Kína) jelentkezik, míg Kelet-Európában évente negyedmillió új megbetegedést regisztrálnak 8-11. A tuberkulózis ismételt fellángolásában elsősorban gazdasági és szociális tényezők, a HIV vírus és a tuberkulózis közötti szinergizmus (világszerte az AIDS betegek 15%-a hal meg tuberkulózisban), valamint a XX. század végén újabb komoly fenyegetésként megjelent rezisztens és multidrog rezisztens tuberkulózis (MDR, rezisztencia legalább isonicidre és rifampicinre) terjedése játszik kiemelkedő szerepet. Az Egészségügyi Világszervezet adatai szerint 1995-ben mintegy 50 millió ember volt fertőzött rezisztens M. tuberculosis törzzsel 11, 12. Magyarországon több évtizedes csökkenést követően 1990 és 1995 között a tuberkulózis incidenciája jelentős, 23,5%-os (34,0 per 100 000 lakosról 42,0 per 100 000 lakosra), míg a pulmonalis tuberkulózis incidenciája 28,7%-os (31,0 per 100 000 lakosról 39,9 per 100 000 lakosra) növekedést mutatott
9, 13
. 1996 és 2001 között a
hatásosnak tekinthető programok valamint a Nemzeti Tuberkulózis Surveillance Rendszer bevezetésének köszönhetően mindkét incidencia csökkenő tendenciája volt megfigyelhető (tuberkulózis: 42,0 per 100 000 lakosról 32,5 per 100 000 lakosra; pulmonalis tuberkulózis: 39,2 per 100 000 lakosról 30,2 per 100 000 lakosra) 10, 14-17. A megbetegedések előfordulása jelentős földrajzi különbségeket is mutat, elsősorban a szociális helyzet, a bevándorlás, illetve határokon keresztüli migráció, valamint a szűrési fegyelem meglazulásának következményeként
12
10,
14-17
. A pulmonalis
tuberkulózis incidenciája tartósan a legmagasabb Szabolcs-Szatmár-Bereg megyében (50,3 per 100 000 lakos), de a szomorú statisztikában kiemelkedik, Hajdú-Bihar (34,2 per 100 000 lakos), Jász-Nagykun-Szolnok (34,1 per 100 000 lakos), Borsod-AbaújZemplén (27,7 per 100 000 lakos) megye illetve Budapest (40,24 per 100 000 lakos) is 10, 16, 17
. Mindezen mutatók mellett a 2000-es epidemiológiai jelentések alapján,
rezisztens és MDR eset az összes megbetegedett 12,9 illetve 2,1%-ban fordult elő. A látszólag kedvező adatok kapcsán nem szabad figyelmen kívül hagyni azonban, hogy a betegek (3598 fő) csak 39,7%-ban állt rendelkezésre pozitív tenyésztés és ezeknek csak 67,4%-ból történt végül rezisztencia vizsgálat 17. 1.1.3. A tuberkulózis laboratóriumi diagnosztikájának alapjai (I) A klinikai mycobacteriológia alapvető szerepet játszik a tuberkulózis elleni hatékony védekezésben, hiszen a tuberkulózis definitív klinikai diagnózisának felállításához nélkülözhetetlen feltétel a kórokozó baktérium izolálása és identifikálása. Önmagában a klinikum, valamint a radiomorfológiai kép a mycobacteriológiai vizsgálatok
hiányában
nem
eléggé
specifikus
a
tuberkulózis
diagnózisának
felállításában, hiszen a tuberkulózishoz hasonló panaszok és radiológiai eltérések más tüdőbetegségben is előfordulhatnak 18. Továbbá a röntgenkép alapján gyakran az akutan zajló tuberkulózis és egy korábban lezajlott folyamat maradványai között sem lehet különbséget tenni. A mycobacteriológiai vizsgálatok a kezelés hatásosságának monitorozásához is elengedhetetlen információkat szolgáltatnak, részben a kórokozó kimutathatóságával, részben az izolálást követő rezisztencia vizsgálatok eredményeivel. A mikroszkópia a mycobacteriológiai vizsgálatok legolcsóbb, legegyszerűbben kivitelezhető és leggyorsabb módszere. A kenetkészítést követően a festés vagy ZiehlNeelsen (ZN) féle karbol fukszin alapú vagy auramin alapú fluoreszcein eljárásokkal történhet
19, 20
. A mikroszkópia legnagyobb hátránya, hogy nem kellően érzékeny és a
negatív eredmény kiadásához minimum 100-300 látótér áttekintése szükséges, ami meglehetősen munkaigényes. A mikroszkópia érzékenysége az adott beteg populáción belül a kiterjedt tuberculosisban szenvedő betegek hányadától, a vizsgált minta típusától, a mintagyűjtés minőségétől, a mycobacteriumok mintán belüli számától, az alkalmazott dekontaminálási és centrifugálási módszertől függően 50-75%
21, 22
. Míg a
pozitív mikroszkópos eredmény a tuberkulózis preszumptív diagnózisa mellett szól,
13
addig a negatív eredmény, az alacsony érzékenységi mutató miatt, nem zárja ki a tuberkulózis lehetőségét. Legalább 10 000 mycobacterium milliliterenkénti jelenléte szükséges ahhoz, hogy egy kenet teljes átvizsgálását követően legalább néhány saválló pálca megfigyelhető legyen
20
. A mikroszkóposan pozitív betegek megkülönböztetett
figyelmet igényelnek, hiszen az általuk ürített baktérium mennyiség miatt ezek a páciensek a legfertőzőbbek. Éppen ezért, hogy az ilyen esetben szükséges izolációs lépések időben foganatosíthatók legyenek, a mikroszkópos vizsgálat eredményét a laboratórium 24 órán belül vissza kell hogy jelezze a vizsgálatkérő számára. Nem szabad elfeledkezni azonban arról sem, hogy a mikroszkópia nem képes különbséget tenni élő és élettelen mycobacterium között. Így egy megfelelően kezelt és ellenőrzött beteg esetében a mikroszkópos negatívvá válást követő esetleges pozitivitás nem feltétlenül a klinikai romlás jele. Ugyancsak fontos szem előtt tartani azt a tényt is, hogy a mikroszkópia nem tud különbséget tenni a M. tuberculosis complex és a nem tuberculosist okozó mycobacteriumok (NTM) között. Azaz a kenet pozitivitás atípusos mycobacterium jelenlétének eredménye is lehet, amely nem biztos hogy aktuálisan klinikai fontossággal bír. Mint minden laboratóriumi vizsgálati leletet, így a mikroszkópia eredményét is az egyéb klinikai adatok tükrében kell kezelni. A
mycobacteriológiai
vizsgálatok
következő
lépése
a
tenyésztés.
A
mycobacteriumok izolálására használt talán legismertebb táptalaj a tojás alapú, szilárd Löwenstein-Jensen (LJ) táptalaj. Az agar alapú táptalajok, mint amilyen a Middlebrook 7H10 vagy 7H11 agar, a LJ táptalajhoz képest némileg gyorsabb tenyésztési idő, és a transzparenciájuk folytán egyszerűbb kolónia morfológia vizsgálat lehetősége miatt kedveltek
20, 23-25
. Mindazonáltal, ezeken a hagyományos szilárd táptalajokon a M.
tuberculosis complex telepei ritkán jelennek meg korábban mint 6-8 hét. Az izolálást követő identifikálás, majd rezisztencia meghatározás további 3-6 héttel növelheti ezt az amúgy is tetemes tenyésztési időt
20, 23-25
. Mindemellett vizsgálatok azt is igazolták,
hogy csak szilárd táptalajon tenyésztve a klinikailag egyértelműen tuberkulózisként diagnosztizált esetek mintegy 20-30%-ban nem sikerült a M. tuberculosis izolálása 26-30. Ez az adat világosan jelzi, hogy a szilárd táptalajon való tenyésztés érzékenysége, bár lényegesen jobb mint a mikroszkópiáé, mégsem haladja meg a 70-80%-ot. Folyékony táptalajon tenyésztve, a tenyésztési idő a minta mycobacterium tartalmától függően 1-3 hétre rövidíthető. Emellett a folyékony táptalajok szenzitivitása
14
90% feletti. Hátrányuk, hogy jóval hajlamosabbak a befertőződésre
26-30
. A jelenleg
arany standardnak tekintett folyékony táptalaj alapú rendszer a BACTEC 460 TB rendszer (Becton-Dickinson Diagnostic Instrument Systems, Sparks, Md., U.S.A.). Önmagában sem a szilárd, sem a folyékony táptalaj érzékenysége nem éri el a 100%-ot, azaz mindkét táptalajtípus esetében előfordulhatnak olyan törzsek, amelyek vagy csak az egyik vagy csak a másik táptalajtípuson képesek növekedni. Ez az oka, hogy jelenleg a nemzetközi ajánlásoknak megfelelően a mycobacteriumok izolálása legalább két szilárd és egy folyékony táptalaj kombinációján kell, hogy alapuljon a kórokozó minél gyorsabb és érzékenyebb detektálása, valamint a rezisztencia vizsgálatok minél gyorsabb elvégezhetősége érdekében 20, 31, 32. Amennyiben növekedés nem észlelhető az inokulált szilárd vagy folyékony táptalajokon úgy negatív tenyésztési eredmény 8 illetve 6 hetes inkubálást követően adható ki 26, 27. 1.1.4. Az antituberkulotikum rezisztencia (II, III, V) A Mycobacterium tuberculosis és a komplex többi tagja számos specifikus mechanizmust használva alakítja ki az antibiotikumokkal és antituberkulotikumokkal szembeni rezisztenciáját. A mycobacterium elsődleges védelmi rendszere a speciális hidrofób sejtfal, amely nagymértékben csökkenti a legtöbb vegyület permeabilitását (1. ábra)
33-35
. Kutatások igazolták, hogy a M. tuberculosis-ban több különböző, a
gyógyszerek eltávolítását segítő aktív pumpa rendszer, a gyógyszerek inaktiválását és aktiválását végző enzim, valamint ezeket a funkciókat irányító gének találhatók 36, 37. Az eddigi genetikai vizsgálatok szerint a M. tuberculosis antituberkulotikumokkal szembeni rezisztenciájának kialakulásában vagy a gyógyszer támadáspontját kódoló génekben, vagy a gyógyszer aktiválásáért felelős enzimeket kódoló génekben kialakuló spontán pontmutációk a felelősek. A rezisztenciával kapcsolatos pontmutációk, deléciók és inzerciók az összes elsővonalbeli szernél (isonicid (INH), rifampicin (RMP), pyrazinamid (PZA), ethambutol (EMB) és streptomycin (SM)) és már néhány másodvonalbeli
újabb
szernél
(ethionamid,
fluorokinolonok,
makrolidek,
nitroimidazopirin) is felismerésre kerültek 38-43. Mindezek alapján nagy valószínűséggel kizárható egy olyan egyedüli gén jelenléte, amelynek mutációi önmagukban vezetnének MDR fenotípus kialakulásához. Ezzel szemben úgy tűnik, hogy az MDR több, egymással párhuzamosan, illetve lépcsőzetesen kialakuló mutációk sorozatának az
15
eredménye a különböző génszakaszokon. Rezisztencia leggyakrabban a nem megfelelő gyógyszeres kombináció és dózis, a beteg együttműködésének hiányos volta következtében
az
egyébként
kis
kópiaszámban
jelenlévő
mutáns
törzsek
szelektálódásával alakul ki. Mivel az MDR törzsek kialakulása halmozódó mutációk következménye, a M. tuberculosis szaporodását megfelelő kombinált kezeléssel (legalább három, de inkább négy antituberkulotikummal) lehet eredményesen befolyásolni 44, 45.
16
1. ábra. Az isonicid, pyrazinamid, rifampicin, és ethambutol feltételezett hatásmechanizmusa a Mycobacterium tuberculosis sejten.
Lipoarabinomannán (LAM)
Mycolsav
EMB
INH Arabinogalaktán
Rövid szénláncú zsirsavprekurzor RNS polimeráz (ß-alegység)
Kromoszómális DNS
RNS transzkripció
RMP
17
Cytoplazma
PZA
Sejtfal és cytoplazma membrán
Szabad sejtfal glikolipidek Porin és peptidek
1.2. A Mycobacterium tuberculosis izolálása az automatizált BACTEC MGIT 960 rendszer segítségével, összehasonlítva a BACTEC 460 TB rendszerrel és a Löwenstein-Jensen táptalajon való tenyésztéssel (IV) A Center for Disease Control and Prevention jelenlegi ajánlása az, hogy a M. tuberculosis complex izolálása, identifikálása valamint az ezt követő rezisztencia vizsgálatok lehetőleg a mintavétel időpontjától számított 2-3 (izolálás, identifikálás) illetve 2-5 (rezisztencia meghatározás) héten belül történjenek meg 46. Ahhoz, hogy ez az ajánlás a gyakorlatban is megvalósítható legyen és ezáltal a klinikus számára a tuberkulózis definitív diagnózisa, valamint az ugyancsak elengedhetetlenül szükséges rezisztencia vizsgálatok eredménye mihamarabb rendelkezésre álljon nélkülözhetetlen az újabb, folyékony táptalaj alapú rendszerek rutinszerű alkalmazása. A radiometriás BACTEC 460 TB folyékony táptalaj alapú rendszer (Becton Dickinson Diagnostic Instrument Systems, Sparks, Md.) alkalmazása nagymértékben javította
a
mycobacterium
tenyésztés
érzékenységét,
és
egyúttal
jelentősen
megrövidítette a detektálás idejét. Ugyanakkor a tenyésztés még ezen eljárás alkalmazásával is munkaigényes és a radioizotópok használata miatt fokozott figyelmet igényel a speciális biztonsági előírások és rendszabályok betartása
47
. Korábbi
felmérések adatai szerint a 4-ml-es Mycobacteria Growth Indicator Tube (MGIT; BBL Becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, Md.) és az MB Redox (Biotest AG, Dreieich, Germany) folyékony táptalajok a BACTEC 460 TB rendszer megfelelő nem radiometriás alternatívái lehetnek kivitelezést
igénylő,
nem
26, 48, 49
automatizált
. Ezen módszerek azonban manuális
rendszerek,
amelyek
leginkább
azon
laboratóriumok számára alkalmasak, melyeknek nem áll módjában az automatizált módszerek bevezetése, vagy az alacsony feldolgozandó mintaszámnak köszönhetően nincs
szüksége
műszerezett
rendszerre.
A
nagyszámú
mintákkal
dolgozó
laboratóriumok számára azonban a tenyésztés automatizálása igen fontos kérdés. Bár a közelmúltban kifejlesztett MB/BacT (Organon Teknika, Turnhout, Belgium) és ESP II (Difco Laboratories, Detroit, Mich.) tenyésztési rendszerek teljesen automatizáltak, sajnos mindkét módszer esetében az alkalmazott műszerek kapacitása igen csekély (MB/BacT 240 cső gépenként; ESP II 384 cső gépenként)
28, 30, 50, 51
. Ezért magasabb
mintaszám esetén több műszerre is szükség lehet, ami jelenleg csak nagyon kevés laboratórium számára elfogadható anyagi teher. A BACTEC MGIT 960 rendszer nagy
18
kapacitású, teljesen automatizált, a tenyésztést folyamatosan monitorozó, nem radiometriás rendszer, mely 960 darab 7 ml-es MGIT csövet képes egyszerre befogadni 52,
53
. A tenyésztéshez használt MGIT csövek egy olyan fluoreszcens szenzort
tartalmaznak, mely a táptalaj oxigénkoncentrációjának csökkenésére reagál. A műszer fotodetektora minden csőben 60 percenként méri a fluoreszcenciát. A fluoreszcencia szintje
megfelel
a
táptalajra
leoltott
mintákban
esetlegesen
jelenlévő
mikroorganizmusok által felhasznált oxigénszint csökkenés mértékének, ezáltal az osztódó baktériumok számának. Mikor a fluoreszcencia mértéke egy bizonyos határértéket elér, a szerkezet a csőben levő mintát pozitívnak értékeli, és ezt kijelzi. Jelen tanulmány célja az MGIT rendszer szenzitivitásának és az átlagos tenyésztési idejének a meghatározása volt a referencia BACTEC 12B és LJ szilárd táptalajjal összevetve.
Az
eredmények
alapján
a
MGIT
rendszer
rutin
diagnosztikai
alkalmazhatóságát értékeltük. 1.3.
Magyarországról
származó
Mycobacterium
turberculosis
izolátumok
rifampicin-rezisztenciájának molekuláris elemzése DNS szekvenálással és Line Probe Assay segítségével (II, V) Az antituberkulotikum rezisztens M. tuberculosis törzsek egyre gyakoribb előfordulása miatt világszerte nagy az igény az antituberkulotikum- és ezek közül is a RMP-rezisztencia minél gyorsabb és pontosabb kimutatására, hiszen a RMP az egyik legfontosabb antituberkulotikum
33-35
. A RMP az aktív metabolizmust folytató M.
tuberculosis baktériumokat pusztítja igen hatékonyan, a klinikai relapszus hátterében a legtöbb esetben RMP-rezisztencia áll
44, 45, 54, 55
. Mivel a hagyományos érzékenységi
tesztek elvégzése hosszú időt vesz igénybe, a rezisztens törzsekkel fertőzött betegek kezelése nem mindig adekvát és így hosszabb ideig maradnak fertőzőképesek, mint azok a betegek, akiknél a fertőzést érzékeny törzsek okozzák. Számos molekuláris módszert fejlesztettek ki a M. tuberculosis RNS polimeráz ß-alegység (rpoB) régió mutációinak gyors (24-48 óra) kimutatására, ami azon a kollektív megfigyelésen alapul, miszerint a RMP-rezisztens M. tuberculosis törzsek több mint 96%-ában találhatók olyan mutációk az rpoB gén 81 bázispárnyi (bp) core régiójában, melyek aminosav cseréhez vezetnek
56-64
. Azt is kimutatták, hogy a RMP-
rezisztenciával járó mutációk bár ritkábban, de az rpoB gén egyéb területén is
19
előfordulhatnak
65-67
. Ezeknek a molekuláris teszteknek az eredményei epidemiológiai
markerként is szolgálhatnak, mivel a rezisztenciáért felelős allélok relatív gyakorisága földrajzi területenként változhat 57, 68.
20
2. Célkitűzések Vizsgálataink célkitűzései a következők voltak: •
A teljesen automatizált MGIT 960 folyékony táptalaj alapú rendszer magyarországi bevezetése a Semmelweis Egyetem Pulmonológiai Klinikáján.
•
A teljesen automatizált MGIT 960 folyékony táptalaj alapú rendszer értékelése az érzékenység és az átlagos tenyésztési idő vonatkozásában a Bactec 460TB rendszerrel valamint a hagyományos LJ táptalajon végzett tenyésztéssel összevetve a M. tuberculosis primer izolálását illetően.
•
Magyarországon izolált RMP-rezisztens M. tuberculosis izolátum rezisztencia profiljának meghatározása az első vonalbeli antituberkulotikumokra (INH, RMP, EMB és SM).
•
Magyarországon
izolált
RMP-rezisztens
M.
tuberculosis
izolátum
RMP
rezisztenciával összefüggésbe hozható, az rpoB génen jelenlévő mutációk kimutatása és karakterizálása.
21
3. Módszerek és eszközök (II, IV) 3.1. A Mycobacterium tuberculosis izolálása az automatizált BACTEC MGIT 960 rendszer segítségével, összehasonlítva a BACTEC 460 TB rendszerrel és a Löwenstein-Jensen táptalajon való tenyésztéssel (IV) 3.1.1. Betegek, minták A
vizsgálatok
a
Semmelweis
Egyetem
Pulmonológiai
Klinikájának
Mycobacteriológiai Laboratóriumában történtek. A 243 betegből származó 377 klinikai minta (288 köpet, 51 bronchoalveolaris lavage vagy bronchialis váladék aspirátum, 32 gyomormosó folyadék, és 6 pleuralis fluidum) 1999. március 29. és 1999. május 31. között került levételre. Valamennyi beteg HIV negatív volt. 3.1.2. A minták előkészítése Minden klinikai minta a Kent és Kubica
25
által leírt N-acetyl-L-cystein-NaOH
metodikának megfelelő emésztésen és dúsításon esett át. A NaOH-t 4%-os koncentrációban (induló koncentráció) használtuk. A dekontaminációt és dúsítást követően mikroszkópos vizsgálat céljából a minták koncentrált üledékből keneteket készíttettünk, melyeket ZN szerint festettünk meg. A visszamaradó üledéket 1,5 ml steril foszfát puffer sóoldatban (pH 6,8) oldottuk fel. A minták leoltása előtt a BACTEC MGIT 960 és a BACTEC 12B csöveket a gyártó előírásának megfelelő adalékkal (Polymyxin, Amphotericin, Nalidixin sav, Trimethoprim, Azlocillin) készítettük elő leoltáshoz. 3.1.3. Leoltás A feldolgozott mintából 0,5 ml-t injektáltunk a BACTEC MGIT 960 csőbe, 0,5 ml-t a BACTEC 12B palackba, és 0,2-0,2 ml-t 2 LJ táptalajra. Minden leoltott táptalajt 370C-on inkubáltuk. A BACTEC MGIT 960 csöveket a gyártó cég utasításainak megfelelően helyeztük el a BACTEC MGIT 960 automatába és teszteltük mindaddig, amíg pozitívnak nem mutatkozott, vagy egyébként 6 hétig, amelynek végén negatívként adtuk ki a mintát. A BACTEC 12B csöveket az első két héten hetente két alkalommal mértük le a BACTEC 460 TB műszerrel, majd további 4 héten át hetente egy alkalommal. Amikor a BACTEC 12B cső növekedési indexe elérte a ≥10 mértéket, a
22
csövet naponta ellenőriztük mindaddig, amíg a növekedési index el nem érte a ≥100 értéket, amikor is a mintát pozitívnek tekintettük. Amennyiben 6 hét elteltével sem sikerült
14
CO2 termelést kimutatni, a BACTEC 12B csőben levő mintát negatívnak
tartottuk. A LJ táptalajt 8 héten át hetente vizsgáltuk mycobacterium telepek megjelenését keresve. Mind a folyékony, mind a szilárd táptalajon észlelt mycobacterialis növekedés esetén továbbiakban a párhuzamos táptalajokon naponta végeztünk leolvasást. A detektálás napján minden pozitív folyékony vagy szilárd táptalajt ZN festéssel vizsgáltunk meg a saválló baktérium jelenlétének megerősítése céljából. A kontamináció
kizárása
céljából
Columbia
agarra
is
leoltottuk
(bio-Merieux
Microbiology Systems, Marcy l’Etoile, France). A mikroszkóppal pozitívnak talált tenyészetet AccuProbe nukleinsav hibridizációs teszt (Gen-Probe, San Diego, Calif.) és hagyományos biokémiai tesztek segítségével identifikáltuk 25 . 3.1.4. Statisztika A chi négyzet tesztet használtuk a különböző táptalajok közötti érzékenységbeli különbségek értékelésére. A variancia analízist (ANOVA) és a Newman-Keuls tesztet alkalmaztuk az egyes táptalajok átlagos tenyésztési ideje közötti különbségek vizsgálatára.
3.2.
Magyarországról
származó
Mycobacterium
turberculosis
izolátumok
rifampicin-rezisztenciájának molekuláris elemzése DNS szekvenálással és Line Probe Assay segítségével (II) 3.2.1. Betegek, klinikai minták Magyarországon 20 év csökkenés után a pulmonalis tuberkulózis incidenciája 1990 és 1999 (a vizsgálatra került törzsek izolálásának éve) között 18,1%-kal növekedett (31,0-ről 36,6 per 100 000 lakosra nőtt) 9. Ezen belül Kelet-Magyarország területén (Borsod-Abaúj-Zemplén, Hajdú-Bihar és Szabolcs-Szatmár-Bereg megyék) a
23
legnagyobb a tuberkulózis incidenciája (38,7, 51,5, illetve 56,7 per 100 000 lakos), illetve a drog-rezisztens tuberkulózis előfordulása 9. 1999-ben ebből a három megyéből összesen 888 esetet jelentettek a 3912 (22,7%) magyarországi tuberkulózis esetből. A vizsgálat során elemzett 29 RMP-rezisztens törzs a fenti megyékből származó 29 esetből került izolálásra 1999 során 9. A minták gyűjtésében részt vett a Jósa Kórház, Prodia laboratórium, Nyíregyháza, a Borsod Abaúj Zemplém Megyei Állami Népegészségügyi
és
Tisztiorvosi
Szolgálat,
Miskolc,
valamint
a
Debreceni
Tudományegyetem Általános Orvostudományi Kar, Mycobacteriológiai Laboratórium, Debrecen. A 29 betegből 25 férfi, 4 nő volt, átlag életkoruk 48,9 év. 5 beteg volt hajléktalan és ugyanakkor munkanélküli is. A rizikófaktorok közül megemlítendő, hogy az anamnézisben 5 beteg esetén szerepelt alkoholizmus, két esetben pedig diabetes mellitus. A betegek HIV negatívak voltak. A vizsgált betegek közül kettőt tuberkulózis miatt korábban még nem kezeltek, 27 beteg előzőleg már állt kezelés alatt tuberkulózis miatt. 3.2.2. Kontrollok és identifikálás Kontrollként H37Rv American Type Culture Collection 27294 M. tuberculosis referencia törzset és hat olyan klinikai M. tuberculosis izolátumot használtunk, melyek mind a négy elsővonalbeli antituberkulotikumra érzékenyek voltak. Valamennyi tenyészetet az AccuProbe teszttel (Gen-Probe Inc., San Diego, Calif), illetve hagyományos biokémiai tesztekkel identifikáltuk 10, 23, 25, 27, 69, 70. 3.2.3. Hagyományos rezisztencia meghatározás A 36 izolátum INH, RMP, EMB, valamint SM érzékenységét a proporciós módszerrel határoztuk meg LJ táptalajon, Canetti és munkatársai közlése szerint 71. Az INH-ra, RMP-re, EMB-ra, illetve SM-re vonatkozó kritikus koncentráció 0,2, 40, 1,0 illetve 10 µg/ml volt. 3.2.4. DNS szekvenálás Vizsgálataink során két molekuláris tesztet alkalmaztunk. Először két, a RMPrezisztenciával összefüggő rpoB régiót amplifikáltunk polimeráz láncreakcióval (PCRel), majd szekvenálással meghatároztuk az amplifikált DNS szakasz bázissorrendjét.
24
Ezután a DNS szekvenálás eredményét összehasonlítottuk a kereskedelemben kapható gyors teszt, a PCR-alapú reverz hibridizációs line-probe teszt (Inno-LiPA Rif. TB Test (LiPA); Innogenetics N.V., Ghent, Belgium) eredményeivel 72. A
molekuláris
tesztek
elvégzéséhez
az
antituberkulotikum
érzékeny
kontrollokból és a RMP-rezisztens izolátumokból BACTEC 12B táptalajra oltottunk le. A szubkultúrákat már korábban közölt szempontok alapján kezeltük, illetve monitoroztuk
27
. A 999-es növekedési index detektálásának napján az érzékeny
kontrollok és a RMP-rezisztens izolátumok BACTEC 12B tenyészeteinek 200 µl-ét 80°C-on inkubáltuk 1 órán keresztül, a mycobacteriumok elölése céljából. Rpo95 (5’CCACCCAGGACGTGGAGGCGATCACACCG-31)
és
rpo397
(5’-
GTCAACCCGTTCGGGTTCATCGAAACG-3’) primérek segítségével, melyek az rpoB 81 bp-nyi core régióját fogják közre, a 36 izolátum mindegyikéből egy 329 bp-nyi terméket állítottunk elő 72, 73. Az amplifikációt Perkin-Elmer 480 programozható hőblokkban végeztük, az amplifikációs protokoll a következő volt: Denaturáció: 95°C 5 perc Amplifikáció: 95°C 1 perc 55°C 1 perc 72°C 1 perc 35 ciklusban ismételve az amplifikációs ciklus Extenzió:
72°C 10 perc 4°C
végtelen
Ugyanezekkel a primérekkel történt az amplifikált DNS szakasz mindkét szálának szekvencia analízise is, automata Applied Biosystems 377 DNS szekvenáló segítségével (Applied Biosystems, Foster City, Calif.) 72. Egy nemrégiben közölt vizsgálatban kimutatták, hogy néhány olyan RMPrezisztens törzsben, ahol a 81 bp régióban mutáció nem észlelhető (vad-típus), egy V146F mutáció található az N-terminális régióban
66
. Ennek a mutációnak a
kimutatására a Tb176-f (5’-CTTCTCCGGGTCGATGTCGTTG-3’) és Tb176-r (51CGCGCTTGTCGACGTCAAACTC-3’) primérekkel végeztünk amplifikációt és szekvenálást 66.
25
Az amplifikációt Perkin-Elmer 9700 programozható hőblokkban végeztük, az alábbi amplifikációs protokollnak megfelelően: Denaturáció: 94°C 5 perc Amplifikáció: 94°C 45 másodperc 64°C 1 perc 72°C 2 perc 40 ciklusban ismételve az amplifikációs ciklus Extenzió:
72°C 7 perc 4°C
végtelen
Így egy 365 bp-nyi terméket állítottunk elő, amelyből ugyanezekkel a primérekkel végeztünk szekvenálást 72. A molekuláris biológiai teszteket a Semmelweis Egyetem Pulmonológiai Klinikájának Molekuláris Biológiai Laboratóriumában végeztük. A szekvenálási vizsgálatokat a Wadsworth Center, Albany NY, USA Központi Szekvenáló részlegétől rendeltük meg. 3.2.5. Line Probe Assay A Line Probe Assay (LIPA) vizsgálatok a Semmelweis Egyetem Pulmonológiai Klinikájának Molekuláris Biológiai Laboratóriumában történtek. A LiPA kittel, a gyártó utasításainak megfelelően egy biotinnal jelölt 256 bp-nyi rpoB gén fragmentumot amplifikáltunk a hővel elölt mintákból
72, 74
. A biotinnal jelölt PCR terméket
denaturálást követően 10 specifikus oligonukleotid próbával hibridizáltuk (19-23 bázis hosszú). Az első próba a M. tuberculosis komplexre specifikus, további öt (S1-S5) pedig egymást részlegesen átfedve a vad-típusra (RMP érzékeny) jellemző DNS szakasz komplementere az rpoB gén 509-534-es aminosavakat kódoló régiójának megfelelően. A négy másik próba az rpoB génen belül előforduló leggyakoribb mutációkra specifikus: D516V, H526Y, H526D és S531L, (R2, R4a, R4b és R5 próbák)
72, 74
.A
hibridizált PCR produktumok detektálását követően a LiPA vizsgálat eredményeit az irodalomban már korábban közzétett módon értékeltük 75.
26
4. Eredmények 4.1. A Mycobacterium tuberculosis izolálása az automatizált BACTEC MGIT 960 rendszer segítségével, összehasonlítva a BACTEC 460 TB rendszerrel és a Löwenstein-Jensen táptalajon való tenyésztéssel (IV) A 377 leoltásra került klinika mintából 57 (15,1%) esetében észleltük mycobacterium növekedését. Az 57 mycobacterium pozitív mintából 14 (24,6%) mikroszkóposan saválló baktérium pozitív, 43 (75,4%) pedig mikroszkóposan negatív volt. A mycobacterium fajok közül M. tuberculosis (n=55), M. avium complex (n=1), és M. xenopi (n=1) volt identifikálható. A BACTEC MGIT 960, a BACTEC 12B és a LJ táptalajon izolált mycobacteriumok száma az 1. táblázatban került megadásra. A BACTEC MGIT 960 az 55 M. tuberculosis izolátumból 53 (96,4%), a BACTEC 12B 51 (92,7%), míg a LJ táptalajon történő tenyésztés 45 (81,8%) esetben észlelte a kórokozó jelenlétét. A BACTEC MGIT 960 és a LJ táptalaj között statisztikailag szignifikáns különbség volt kimutatható (p < 0,05), míg a BACTEC 12B és LJ, valamint a két folyékony táptalaj közötti különbség nem volt szignifikáns. A 14 mikroszkóposan pozitív törzs mindhárom táptalajtípuson növekedést mutatott, és a törzsek mindegyike M. tuberculosis-nak bizonyult az identifikálást követően. A mikroszkóposan negatív M. tuberculosis-t tartalmazó minták esetében a tenyésztés szenzitivitása 95,1% (39/41) volt a BACTEC MGIT 960, 90,2% (37/41) a BACTEC 12B, és 75,6% (31/41) a LJ táptalajon (1. táblázat). Ismét statisztikailag szignifikáns különbség volt kimutatható a BACTEC MGIT 960 és a LJ táptalaj között (p < 0,005). A BACTEC 12B és LJ, valamint a két folyékony táptalaj közötti különbség nem volt szignifikáns. A NTM száma a jelen vizsgálatban túl alacsony volt megbízható statisztikai számítások végzéséhez. A szenzitivitást meghatároztuk a két folyékony táptalaj és a LJ táptalaj kombinációjára vonatkoztatva is, amely a M. tuberculosis-ra vetítve 96,4% (53/55) volt a BACTEC MGIT 960 és LJ táptalaj, illetve 92,7% (51/55) volt a BACTEC 12B és LJ táptalaj kombinációja esetében. A statisztikai analízis nem mutatott szignifikáns különbséget a két kombináció között.
27
Az egyes táptalaj típusokon észlelt kontamináció mértéke (az összes leoltásra került mintaszám százalékában megadva) a BACTEC MGIT 960, a BACTEC 12B és a LJ táptalaj esetén 3,7%, 2,9% illetve 1,2% volt (1. táblázat). A M. tuberculosis–t illető átlagos izolálási idő BACTEC MGIT 960 esetén 14,3 (6-24) nap, BACTEC 12B esetén 16,6 (8-23) nap, LJ táptalaj esetén pedig 35,8 (14-58) nap volt. Az ANOVA és a Newman-Keuls teszt statisztikailag szignifikáns különbséget mutatott a BACTEC MGIT 960 és a LJ táptalaj, valamint a BACTEC 12B és a LJ táptalaj tenyésztési idejei között (p < 0,001 mindkét esetben). A két folyékony táptalaj tenyésztési idejei között nem volt szignifikáns különbség. A mycobacteriumok és a M. tuberculosis növekedésének észlelhetőségéig eltelt átlagos tenyésztési idők a mikroszkópos vizsgálat eredményét is tekintetbe véve a 2. táblázatban kerültek összefoglalásra. A M. tuberculosis izolálási ideje a mikroszkóposan pozitív törzsek esetén hasonló volt a 7 ml-es BACTEC MGIT 960 és a BACTEC 12B (12,6 versus 13,8 nap) esetében. Vizsgálatunkban a mikroszkóposan negatív törzsek esetén a M. tuberculosis átlagos tenyésztési ideje a 7 ml-es BACTEC MGIT 960 esetén minimálisan volt csak rövidebb mint a BACTEC 12B-vel (15,8 versus 17,2 nap).
28
1. táblázat. A BACTEC MGIT 960, a BACTEC 12B és a LJ táptalaj érzékenysége a mycobacteriumok és a M. tuberculosis izolálását illetően, valamint a kontaminált tenyészetek aránya az egyes táptalajokra vonatkoztatva.
Táptalaj
Az izolált törzsek száma (%)a Minden NTM M. mycobacterium tuberculosis (MTB+NTM) 55 (96,5) 53 (96,4) 2 (100)
Kontaminált (%)b
BACTEC MGIT 960 BACTEC 12B 53 (93,0)
51 (92,7)
2 (100)
11 (2,9)
LJ
45 (81,8)
1 (50)
4 (1,2)
46 (80,7)
14 (3,7)
a
Az izolált mycobacteriumok teljes száma 57 volt, ebből 55 M. tuberculosis, 2 NTM
volt. Emellett 17 tenyészet kontaminált volt. A chi négyzet teszt az egyes táptalaj típusok érzékenysége közötti különbségekre vonatkoztatva a mycobacteriumok izolálását illetően: BACTEC MGIT 960 versus LJ táptalaj: p < 0,05 (szignifikáns). A chi négyzet teszt az egyes táptalaj típusok érzékenysége közötti különbségekre vonatkoztatva a M. tuberculosis izolálását illetően: BACTEC MGIT 960 versus LJ táptalaj: p < 0,05 (szignifikáns). b
Az összes leoltásra került mintaszám százalékában megadva.
MTB: Mycobacterium tuberculosis, NTM: nem tuberculosist okozó mycobacteriumok.
29
2. táblázat. Az átlagos tenyésztési idők az összes mycobacteriumokra és M. tuberculosisra vonatkoztatva.
Táptalaj BACTEC MGIT 960 BACTEC 12B LJ
A kimutatás napjainak átlaga napokban (tartomány)a M. tuberculosis Mycobacterium Mikroszkóposan Mikroszkóposan pozitív negatív 13,2 (6-24) 12,6 (8-18) 15,8 (6-24) 16,8 (8-23) 36,2 (14-58)
13,8 (8-23) 20,1 (14-27)
17,7 (9-23) 42,2 (18-58)
a
ANOVA, p < 0,001. Newman-Keuls teszt a mycobacteriumok és a M. tuberculosis
átlagos tenyésztési idejét illetően az egyes táptalaj típusokon: BACTEC MGIT 960 versus LJ táptalaj, p < 0,001 (szignifikáns), BACTEC 12B versus LJ táptalaj, p < 0,001 (szignifikáns).
30
4.2.
Magyarországról
származó
Mycobacterium
turberculosis
izolátumok
rifampicin-rezisztenciájának molekuláris elemzése DNS szekvenálással és Line Probe Assay segítségével (II) A 29 RMP-rezisztens izolátumból csupán két (6,95%) olyan törzs volt, amely csak RMP-re mutatott rezisztenciát. Huszonhat (89,7%) törzs a RMP-rezisztencia mellett INH-ra is (így multidrog rezisztensnek minősült), 18 (62,1%) EMB-ra is, és 9 (31,0%) SM-re is rezisztens volt (3. táblázat). A vizsgált 29 törzsből összesen 20 olyan izolátum fordult elő (70,0%), amely legalább három elsővonalbeli szerre rezisztens volt. A korábbi közleményekkel ellentétben (4. táblázat)
63, 68, 76-82
a mutációk
előfordulási gyakorisága eltérő volt az általunk vizsgált kelet-magyarországi izolátumokban, mivel 11 (37,95%) izolátumban a kevésbé gyakori D516V mutáció volt kimutatható 72. Kilenc izolátumban (31,05%) az S531L mutációt észleltük, míg kettőben (6,95%) a H526D mutációt. Ezeket a mutációkat a LiPA teszttel is azonosítani tudtuk. Emellett a DNS szekvenálás során egy eddig az irodalomban még nem szereplő kettős mutációt (S509T és D516V), valamint egy deléciót (522-525 deléció) is sikerült kimutatnunk 42, 72. Ebben a két esetben a LiPA a mutáció pontos típusát nem volt képes azonosítani, de genetikai eltérés jelenlétét jelezte (3. táblázat). Emellett azonban a LiPA teszt két további törzs esetében sem volt képes azonosítani két további ritkán előforduló mutáció típusát (Q513K és Q513P) (3. táblázat). Ráadásul a teszt álrezisztenciát jelzett az egyik teljesen érzékeny kontroll törzs néma mutációja esetében (R529R) (3. táblázat) 72
. A LiPA teszttel kapcsolatos beszámolók alapján a módszer egy egyszerű,
könnyen használható eszköz a RMP-rezisztencia gyors kimutatására
72, 74
. A teszt kit
formában szerezhető be, így különösen olyan klinikai laboratóriumok rutin munkájához nyújthat segítséget, ahol nincs mód DNS szekvenálás elvégzésére 75, 83. Vizsgálatunkban a LiPA a 29 RMP-rezisztens törzs közül 26 (89,7%) esetben jelezte genetikai eltérés jelenlétét, de csak 22 esetben volt képes a mutáció típusát is meghatározni (75,9%) (3. táblázat)
72
. A LiPA ugyanis a mutáció típusát csak a négy leggyakoribb rpoB gén
mutációjának esetében képes azonosítani (S531L, H526Y, H526D és D516V), míg az egyéb mutációk esetében csak a genetikai eltérés jelenlétét mutatja 74.
31
3. táblázat. Magyarországi rifampicin rezisztens Mycobacterium tuberculosis törzsek rezisztencia típusai a proporciós módszerrel, a Line Probe Assay-vel, és az rpoB gén 81 bázispárnyi centrális régiójának DNS szekvencia analízisével. No. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22.
Proporciós módszer SM INH RMP EMB TB-P S1 S R R R + + S R R S + + S R R R + + S R R S + + R S R S + + S S R S + + S R R R + + S R R R + + R R R S + + S R R R + + R R R R + + R R R R + + S R R R + + R R R R + + S R R R + + S R R R + + S R R S + -S R R R + + S R R R + + R R R S + +/-S R R S + + S R R S + +
S2 -+ -+ + + --+ ---+ + --+ + + + + +
S3 + + + + + -+ + + + + + + + + + + + + + + +
LiPA S4 S5 + + + -+ + + -+ --+/-+ + + + -+ + + + + + + + -+ -+ + + + + + + + + -+ + + --+
32
Mutációk R2 + -+ ---+ + -+ + + --+ + -------
R4a R4b -----------------+ -------------------------+
R5 -+ -+ + -------+ + ----+ -+ --
LiPA D516V S531L D516V S531L S531L AR D516V D516V H526D D516V D516V D516V S531L S531L D516V D516V AR A S531L AR S531L H526D
Szekv. D516V S531L D516V S531L S531L Deléció 522-525 D516V D516V H526D D516V D516V D516V S531L S531L D516V S509T / D516V Q513K VT S531L Q513P S531L H526D
No. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. Ko.1. Ko.2. Ko.3. Ko.4. Ko.5. Ko.6. H37Rv
Proporciós módszer SM INH RMP EMB TB-P S1 S R R R + + S R R R + + S R R S + + S S R S + + R R R R + + R R R R + + R R R R + + S S S S + + S S S S + + S S S S + + S S S S + + S S S S + + S S S S + + S S S S + +
S2 ---+ + + + + + + + + + +
S3 + + + + + + + + + + + + + +
LiPA S4 S5 + + + + + + + -+ -+ + + + --+ + + + + + + + + + + +
Mutációk R2 + + + ------------
R4a R4b -----------------------------
R5 ---+ + ----------
LiPA D516V D516V D516V S531L S531L VT VT AR VT VT VT VT VT VT
Szekv. D516V D516V D516V S531L S531L VTa VT R529R VT VT VT VT VT VT
Ko. = kontrol; Szekv. = a hipervariábilis régió DNS szekvencia analízise; EMB = Ethambutol; INH = Izoniacid; H37Rv = Mycobacterium tuberculosis H37Rv ATCC 27294; RMP = Rifampicin; SM = Streptomycin; A = azonosítatlan; AR = azonosítatlan rezisztens; VT = Vad típus; a = egy V146F mutáció volt detektálható ebben az izolátumban. Az R2, R4a, R4b és R5 oligonukleotid próbák a D516V, H526Y, H526D, és S531L mutációkra specifikusak.
33
4. táblázat. Rifampicin rezisztens Mycobacterium tuberculosis törzsek mutáció típusainak gyakorisága különböző földrajzi térségekben. Ázsiab Ausztrália Brazíliac Németo.d Görögo.e Olaszo. USA Magyaro.f Afrikaa ref. 79 Ref. 76 Ref. 82 ref. 80 Ref. 68 ref. 77 ref. 78 Ref. 63 Mutáns kódon n = 105 N = 77 N = 33 n = 82 n = 36 n = 17 n = 37 n = 61 n = 29 % % % % % % % % % 572 3.0 533 2.9 1.2 3.3 531 50.5 46.8 48.5 53.7 36.1 47.1 56.7 34.4 31.0 526 20 18.2 30.3 20.6 22.2 17.7 29.7 39.3 6.8 522 0.9g 1.3 6.1 2.4 1.6 521 1.6 518 0.9 1.6 516 12.4 16.9 9.1 7.4 2.8 5.9 2.7 6.6 37.9 514 2.6 1.6 513 2.9 6.5 1.2 6.8 511 1.9 1.3 1.2 508 17.7 505 5.9 504 1.9 531 és 526 1.2 2.8 5.9 2.7 Nincs mutáció 5.7 6.5 3.0 3.7 33.3 8.2 10.3h a
Dél-Afrika (n=87),Sierra Leone és Uganda (n=16), Namíbia (n=2). Banglades (n=2), India (n=4), Indonézia (n=1), Malajzia (n=14), Myanmar (n=15), Nepál (n=2), Fülöp szigetek (n= 4), Thaiföld (n=14) és Jemen (n=21). c Ritka mutációk (egyenként 1,2 %): 531 és 514; 516 és 511; 515 és 511; 526 és 531; 524, 525, és 526 valamint 527 deléció; deléció 515, 516 517, és 518; 513 és deléció 514, 515, és 516. d Egy ritka (2,8%) kettős mutáció volt detektálható az 526 és az 511 kodonokon. e Ritka (egyenként 2,7%) tripla mutáció volt detektálható az 553, 541 és 526; 525, 523 és 516; és 516, 512, és 511 kodonokon. f Ezen törzsek egyikében egy, még az irodalomban nem publikált deléció (kodon 522-525) volt detektálható (3,4%). g Néma mutáció. h Ezen három törzs egyikében egy N-terminális V146F mutáció volt detektálható. b
34
5. Megbeszélés 5.1. A Mycobacterium tuberculosis izolálása az automatizált BACTEC MGIT 960 rendszer segítségével, összehasonlítva a BACTEC 460 TB rendszerrel és a Löwenstein-Jensen táptalajon való tenyésztésse (IV) Az 57 (15,1%) mycobacterium pozitív mintából 14 (24,6%) mikroszkóposan saválló baktérium pozitív, 43 (75,4%) pedig mikroszkóposan negatív volt. A mycobacterium fajok közül M. tuberculosis (n=55), M. avium complex (n=1), és M. xenopi (n=1) volt identifikálható. A BACTEC MGIT 960, a BACTEC 12B és a LJ táptalajon izolált mycobacteriumok száma az 1. táblázatban került megadásra. A BACTEC MGIT 960 az 55 M. tuberculosis izolátumból 53 (96,4%), a BACTEC 12B 51 (92,7%), míg a LJ táptalajon történő tenyésztés 45 (81,8%) esetben észlelte a kórokozó jelenlétét. A BACTEC MGIT 960 és a LJ táptalaj között statisztikailag szignifikáns különbség volt kimutatható (p < 0,05). Jelen vizsgálatban az automatizált 7-ml-es BACTEC MGIT 960 rendszer a M. tuberculosis kimutatásának tekintetében (96,4%) magasabb érzékenységet mutatott, mint a korábbi beszámolókban alkalmazott manuális 4-ml-es MGIT (Pfyffer és munkatársai (89,4%) (81,3%)
26
, Piersimoni és munkatársai (85%)
49
48
, Somoskövi és Magyar
, és szintén magasabb volt az
érzékenysége, mint az eddigi, automata rendszerekkel közölt eredmények (Hanna és munkatársai (77%) 52, Tortoli és munkatársai (88%) 53. A 7-ml-es BACTEC MGIT 960 sokkal hatékonyabb volt, mint a hasonlóan teljesen automatizált ESP II rendszer (szenzitivitás 85,3% és 89%)
30, 51
, és hasonló szenzitivitást mutatott, mint a MB/BacT
rendszer (96%) 28. Hanna és munkatársai, valamint Tortoli és munkatársai által közölt alacsonyabb érzékenység a 7-ml-es BACTEC MGIT 960 kapcsán észlelt magasabb kontaminációs rátából eredhet. Ugyanis amikor Hanna és munkatársai az analízisből kizárták a kontaminált mintákat, a BACTEC MGIT 960 szenzitivitása 77%-ról 86%-ra emelkedett 52
. Saját vizsgálataink során a kontamináció nem okozott ilyen komoly problémát. A
kontamináció mértéke a BACTEC MGIT 960, a BACTEC 12B és a LJ táptalaj esetén 3,7%, 2,9%, illetve 1,2% volt (1. táblázat). Eredményeink alapján megállapítható, hogy a 7-ml-es BACTEC MGIT 960 esetén a kontamináció mértéke alacsonyabb volt mint a más hasonlóan teljesen automatizált folyékony táptalaj alapú rendszereknél észlelt kontamináció 28, 30, 51-53, de hasonló volt, a 4-ml-es MGIT esetében észlelt értékekhez 26,
35
48, 49
. Ezzel kapcsolatban fontos kiemelni, hogy a NaOH koncentrációja a más
automatizált rendszerekkel folytatott vizsgálatokban alacsonyabb volt (2%), mint akár a mi vizsgálatunkban (4%), akár a 4-ml MGIT-el kapcsolatos tanulmányokban (3%) 26, 28, 30, 48, 49, 51-53
. Emellett a mintagyűjtés és feldolgozás között eltelt idő (Hanna és
munkatársainak egyik vizsgálati helyén 2-5 nap), valamint a betegpopuláció eltérő volta is magyarázhatja a fenti eltéréseket
48, 52
. A mi laboratóriumunk a minták nagy részét
általában a mintavételt követően 30 percen belül átveszi. Elképzelhető, hogy ez a gyors mintaátvétel és feldolgozás vezetett az alacsony kontaminációs rátához és a magas érzékenységhez a saját vizsgálati anyagunkat illetőleg. A 7 ml-es BACTEC MGIT 960 rendszerben két olyan M. tuberculosis törzs tenyészett ki, mely a BACTEC 12B-ben illetve a LJ táptalajon nem mutatott növekedést. Csak BACTEC 12B vagy csak LJ táptalajon egyetlen izolátum sem volt detektálható. Azon két törzs esetén, amelyek csak a 7 ml-es MGIT-ben növekedtek, lehetséges, hogy ezek a törzsek nem metabolizálták a BACTEC 12B táptalajban növekedési indikátorként alkalmazott 14C palmitin savat, de az is elképzelhető, hogy a nagyobb térfogatú 7 ml-es BACTEC MGIT 960 táptalaj (versus 4 ml BACTEC 12B) a hígítási faktor révén potenciálisan közömbösítette a mintákban esetlegesen jelenlévő növekedési inhibítorokat. Minden egyes rendszer rendszerben növekedést mutatott a 14 mikroszkóposan pozitív törzs, és ezek mindegyike M. tuberculosis-nak bizonyult az identifikálást követően. A mikroszkóposan negatív M. tuberculosis-t tartalmazó minták esetében a tenyésztés szenzitivitása 95,1% (39/41) volt a BACTEC MGIT 960, 90,2% (37/41) a BACTEC 12B és 75,6% (31/41) a LJ táptalajon. Ismét statisztikailag szignifikáns különbség volt kimutatható a BACTEC MGIT 960 és a LJ táptalaj között (p < 0,05). A NTM száma jelen vizsgálatban túl alacsony volt megbízható statisztikai számításokat végzéséhez. Alacsony érzékenysége (60-70%) és a hosszú tenyésztési idő (8-12 hét) miatt a mycobacteriumok primér izolálására a szilárd táptalajok önmagában való alkalmazása nem javasolt. A tenyésztés szenzitivitásának növelése, a tenyésztési idő megrövidítése a szilárd táptalajoknak a folyékony táptalajokkal való kombinációjától várható 25, 31, 47, 48. Jelenleg ezt a kombinációt tekintik a mycobacterium tenyésztés „arany standard”-jának. A szenzitivitást különböző táptalaj kombinációkra is meghatároztuk. A szenzitivitás a M. tuberculosisra vetítve 96,4% (53/55) volt BACTEC MGIT 960 és LJ táptalaj, illetve
36
92,7% (51/55) volt a BACTEC 12B és LJ táptalaj kombinációja esetében. A statisztikai analízis nem mutatott szignifikáns különbséget a két kombináció között. Ezért a 7 ml-es BACTEC MGIT 960 és a LJ táptalaj kombinációja megbízható alternatívája lehet a jelenlegi standardnak, azaz a folyékony, de radioaktív BACTEC 12B és szilárd táptalaj kombinációjának. Vizsgálatunkban a 7 ml-es BACTEC MGIT 960 és szilárd táptalaj esetén a M. tuberculosis izolálásának érzékenysége hasonló volt a Pfyffer és munkatársai 48 által közölt 92%-hoz, a Somoskövi és Magyar 26 által közölt 94,6%-hoz, és a Piersimoni és munkatársai
49
által közölt 92%-hoz, akik 4 ml-es MGIT és szilárd
táptalaj kombinációját alkalmazták. A 7 ml-es BACTEC MGIT 960 és szilárd táptalaj kombináció felmérésünk során észlelt érzékenysége ugyancsak hasonló volt mint a Woods és munkatársai 51 által közölt 94%, a Tortoli és munkatársai 30 által közölt 96,1% ESP II és szilárd táptalaj alkalmazása esetén, valamint a Hanna és munkatársai közölt 97%, és a Tortoli és munkatársai
53
52
által
által közölt 97% a 7 ml-es BACTEC MGIT
960 és szilárd táptalaj kombináció esetén. A M. tuberculosis–t illető átlagos izolálási idő BACTEC MGIT 960 esetén 14,3 (6-24) nap, BACTEC 12B esetén 16,6 (8-23) nap, LJ táptalaj esetén pedig 35,8 (14-58) nap volt. Az ANOVA és a Newman-Keuls teszt statisztikailag szignifikáns különbséget mutatott a BACTEC MGIT 960 és a LJ táptalaj, valamint a BACTEC 12B és a LJ táptalaj tenyésztési idejei között (p < 0,001 mindkét esetben). A két folyékony táptalaj tenyésztési idejei között nem volt szignifikáns különbség. A mycobacteriumok és a M. tuberculosis növekedésének észlelhetőségéig eltelt átlagos tenyésztési idők a mikroszkópos vizsgálat eredményét is tekintetbe véve a 2. táblázatban kerültek összefoglalásra. A M. tuberculosis izolálási ideje a mikroszkóposan pozitív törzsek esetén hasonló volt a 7 ml-es BACTEC MGIT 960 és a BACTEC 12B (12,6 versus 13,8 nap) esetében. A 7 ml-es BACTEC MGIT 960 esetén a detektálási idő rövidebb volt mint a Piersimoni és munkatársai
49
által közölt 15,3 nap (manuális MGIT használata),
de hosszabb volt mint amit Pfyffer és munkatársai 48 (9,9 nap), valamint Somoskövi és Magyar
26
közöltek (7,2 nap) a 4 ml-es MGIT-re, és ugyancsak hosszabb volt mint a
Hanna és munkatársai által közölt 52 10,6 nap, és a Tortoli és munkatársai által publikált 53
12,5 nap a 7 ml-es BACTEC MGIT 960 rendszerrel. A jelen tanulmányban a M.
tuberculosis detektálási ideje a 7 ml-es BACTEC MGIT 960 rendszerrel más teljesen automatizált rendszerekkel összehasonlítva rövidebb volt, mint a Woods és munkatársai
37
51
által jelzett 14,5 nap az ESP II rendszerrel, de hosszabb volt, mint a Benjamin és
munkatársai 28 által közölt 10,3 nap a MB/BacT rendszerrel. Meg kell azonban jegyezni, hogy a tenyésztési idő hosszát nagyban befolyásoló mikroszkóposan pozitív törzsek aránya az említett felmérésekben eltérő volt. Vizsgálatunkban a mikroszkóposan negatív törzsek esetén a M. tuberculosis átlagos tenyésztési ideje a 7 ml-es BACTEC MGIT 960 esetén minimálisan volt csak rövidebb mint a BACTEC 12B-vel (15,8 versus 17,2 nap). Eredményeink szerint a 7 ml-es BACTEC MGIT 960 detektálási ideje rövidebb volt, mint amit Hanna és munkatársai 52 (18,1 nap), Tortoli és munkatársai 53 (19,6 nap), Pfyffer és munkatársai 48 (20,3 nap), Somoskövi és Magyar 26 (19,1 nap), Piersimoni és munkatársai 49 (22,4 nap) közöltek a 7 ml-es BACTEC MGIT 960 vagy manuális 4 ml-es MGIT alkalmazása kapcsán. A mikroszkóposan negatív M. tuberculosis tartalmú klinikai minták átlagos tenyésztési ideje a 7 ml-es BACTEC MGIT 960 használatakor sokkal rövidebb volt, mint az ESP II vagy a MB/BacT rendszer használata esetén mért értékek: így 18,9 nap Woods és munkatársai
49
, 20,1 nap Benjamin és munkatársai
28
közlése szerint.
Eredményeink arra engednek következtetni, hogy az automatizált 7 ml-es BACTEC MGIT 960 rendszer számottevően gyorsabb lehet a mikroszkóposan negatív törzsek esetében a M. tuberculosis izolálását illetően, mint a manuális 4 ml-es MGIT metodika vagy az egyéb automatizált folyékony táptalaj alapú rendszerek. Ez azt jelenti, hogy ezekben az alacsony baktériumtartalmú és ezért lassú növekedést mutató mintákban az izolálást követő rezisztencia vizsgálat is hamarabb elvégezhető. Vizsgálatunk során a BACTEC MGIT 960 rendszerrel nem észleltünk álpozitív tenyésztési eredményt (automatával pozitív, de mikroszkóposan és Columbia agar subcultura negatív). Ugyanakkor nyolc BACTEC MGIT 960 csőben a rendszer pozitivitást jelzett, úgy, hogy a mikroszkópos vizsgálat a detektálás napján negatív volt és a saválló baktériumok csak 3-4 nap további inkubációt követően voltak kimutathatóak ismételt ZN festéssel.
38
5.2.
Magyarországról
származó
Mycobacterium
turberculosis
izolátumok
rifampicin-rezisztenciájának molekuláris elemzése DNS szekvenálással és Line Probe Assay segítségével (II, V) A RMP (ami az erősen lipofil ansamycin, a rifamycin B szemiszintetikus derivátuma) egy olyan széles spektrumú antibiotikum amely a hidrofób sejtfalon és az azt körülölelő borítékon (envelope) keresztül könnyedén képes a sejt belsejébe diffundálni. A tuberkulózis elleni kezelésre 1966 óta alkalmazzák. A tuberkulózis sikertelen kezelésének és az ezzel járó fatális klinikai következményeknek az egyik legfőbb oka a RMP rezisztencia
54, 55
. Amellett, hogy a RMP-nek kifejezett korai
bactericid hatása van a metabolikusan aktív M. tuberculosis-ra, ugyancsak kiváló az időszakosan rövid időre metabolikusan aktiválódó szemi-dormáns baktériumokon kifejtett ú.n. késői sterilizáló hatása is
33-35, 45
. A RMP e késői hatásának felismerése,
valamint a PZA terápiás bevezetése együttesen járult hozzá, hogy a tuberkulózis kezelésének időtartamát egy évről fél évre lehetett csökkenteni
84, 85
. Míg az INH
monorezisztencia elég gyakori, addig a RMP monorezisztencia ritka. A RMPrezisztencia leggyakrabban olyan törzsekben fordul elő amelyek INH-ra szintén rezisztensek, így a RMP-rezisztencia egyben az MDR esetek kiváló indikátora is 33-35, 45. A RMP hatásmechanizmusa a mycobakteriális transzkripció gátlásán alapszik (1. ábra) azáltal, hogy kapcsolódik a baktérium DNS dependens RNS polimerázához. Az RNS polimeráz egy olyan oligomer, amelynek a katalitikusan aktív core enzim részét négy fehérjelánc alkotja (
2
’). A transzkripciót a holoenzim egy újabb ú.n.
alegységhez kapcsolódva képes megindítani
33-35,
42,
58
. A RMP rezisztencia
kifejlődéséért az esetek nagy többségében egy meghatározott, 81 bázis párnyi, 27 kodont tartalmazó centrális génszakasz a felelős, amely a DNS dependens RNS polimeráz béta alegységét (rpoB) kódolja. A RMP rezisztens törzsek több mint 96%-a tartalmaz mutációt az rpoB ezen rövid 81 bp-nyi régiójában 33-35, 42, 58. A leggyakoribb mutációk (65-86%-ban) vagy az 526-os vagy az 531-es kodonon fordulnak elő, magas szintű RMP rezisztenciát eredményezve (minimális gátló koncentráció 32 µg/ml). A 81 bp-nyi régióban történt mutációk azonban érdekes módon nem minden esetben vezetnek azonos szintű rezisztenciához. Például az 511, 516, 518 és 522 kodon mutációi a RMP-nel és a rifapentinnel szemben alacsonyabb szintű
39
rezisztenciát eredményeznek, de érdekes módon érzékenyek maradnak a másik két rifamycin származékkal szemben (rifabutin és rifalazyn)
86, 87
(Parsons L.M., még nem
közölt adatok). Ezek a felismerések jelentős gyakorlati szereppel is bírnak. Az rpoB gén mutációk meghatározása egyrészt azonnali információval szolgálhat a rezisztencia fokáról, valamint arról, hogy fennáll-e keresztrezisztencia, azaz más rifamicin származék további adása még szóba jöhet-e
33-35
. Ezzel kivédhetővé válik a sok hetes
tenyésztéses rezisztencia meghatározás okozta késedelem. A fentiek tekintetbe vételével saját eredményeink azt jelzik, hogy az olyan földrajzi területeken, mint amilyen a vizsgált Kelet-Magyarország is, ahol az rpoB gén ritka mutációi, illetve korábban még nem ismert mutáció típusok gyakrabban fordulnak elő, a LiPA teszt eredményének értékelése bonyolultabb és nagyobb körültekintést igényel
72
. Ebben a környezetben elengedhetetlen a mutáció pontos típusának (és a
következményes aminosavcserének) DNS szekvenálással való azonosítása, mivel az álpozitív RMP-rezisztencia eredmény csak így kerülhető el. Bár az esetek döntő többségében (96%) a mutációk a 81 bp-nyi centrális régiót is tartalmazó ú.n. I. cluster-ban (512-534 aminosav régió) fordulnak elő, RMP rezisztenciát eredményező ritkább mutációkat találtak az rpoB N-terminális (kodon 174 és 381) aminosav szakaszán, valamint a II. (563-574 aminosav régió) és III. (kodon 679 és 687) cluster-okban is 33-35, 42, 45, 65-67. Vizsgálatunk során három olyan RMP-rezisztens izolátumot találtunk, ahol sem a 81 bp régió DNS szekvenálása, sem a LiPA vizsgálat nem mutatott mutációt (3. táblázat) 72. Ugyanakkor a fenti három izolátum egyikénél a ritka N-terminális V146F mutáció volt kimutatható a DNS szekvenálással (28. törzs, 3. táblázat). A többi vizsgált törzs esetében ebben a régióban a RMP-érzékeny törzsekre jellemző vad allélt lehetett kimutatni
72
. Az a két izolátum, ahol egyik régió (N-
terminális vagy 81 bp régió) vizsgálata sem mutatott mutációt, arra utal, hogy a molekuláris vizsgálatok eredményeinek hagyományos tesztekkel való megerősítése továbbra is szükséges. Mivel a rutinszerűen használt DNS szekvenálási módok során általában csak az rpoB gén 81 bp régióját elemzik
42
, javasoljuk, hogy azokban az
esetekben, ahol a hagyományos érzékenységi vizsgálat alapján rezisztencia igazolódik, de a 81 bp régióban nincs kimutatható mutáció, a V146F mutáció szűrővizsgálatát is végezzék el
72
. Ha ez a teszt sem mutat mutációt, akkor az rpoB gén egyéb ritka
40
mutációi, heterorezisztencia (érzékeny és rezisztens törzsek keveréke), vagy kisebb valószínűséggel más mechanizmusú rezisztencia állhat a háttérben 65, 66, 83, 88.
41
6. Záró következtetések Eredményeink összefoglalása alapján elmondható, hogy a nemzetközileg a közelmúltban, Magyarországon pedig elsőként a laboratóriumunkban bevezetésre került, teljesen automatizált 7 ml-es BACTEC MGIT 960 rendszer megbízható alternatívája lehet mind a félautomata és jelenleg standard módszernek tekintett radiometriás BACTEC 460TB rendszernek, mind a manuális 4 ml-es MGIT-nek, vagy akár az automatizált ESP II-nek, és MB/BacT rendszereknek is a M. tuberculosis gyorsabb és érzékenyebb izolálására, és ezáltal a tuberkulózis definitív diagnózisának mihamarabbi felállításában. A 7 ml-es BACTEC MGIT 960 rendszernek köszönhetően a hagyományos LJ táptalajnál gyorsabb izolálás révén a klinikus számára szükséges rezisztencia vizsgálatok is lényegesen hamarabb rendelkezésre állnak. A BACTEC 460TB rendszerrel ellentétben a BACTEC MGIT 960 módszer nem radiometriás, nincs szükség injekciós tűkre a minta leoltásához, ezáltal kevésbé balesetveszélyes is. A teljesen automatizált 7 ml-es BACTEC MGIT 960 rendszer használatakor nem szükséges a mérési napokon a mérő automata feltöltése a vizsgálandó tenyészetekkel, és a leolvasási és mérési időpontok előjegyzése sem, úgy mint a manuális vagy félautomatizált BACTEC 460TB rendszer esetén. Ezen felül a BACTEC MGIT 960 a teljes automatizáltság miatt kevesebb laboratóriumi munkát igényel, amely által többlet időt biztosít a laboratórium dolgozóinak az egyéb feladatok elvégzésére. Mivel a 7 mles BACTEC MGIT 960 kapacitása jelentősen nagyobb, mint a hasonlóan automatizált ESP II vagy MB/BacT rendszereké, ezért használata jelentősen megkönnyíti és felgyorsítja a napi munkamenetet azon laborok számára, ahol különösen magas a naponta tenyésztésre érkező minták száma. Az antituberkulotikum rezisztencia molekuláris mechanizmusainak megismerése és ezen keresztül a molekuláris biológiai módszereknek az antituberkulotikum rezisztencia rutin kimutatásában való alkalmazása jelentős áttörést eredményezett a klinikai mycobacteriológiában. Magyarországon elsőként alkalmazva nukleinsav amplifikációs módszert antituberkulotikum rezisztencia kimutatására arra a felismerésre jutottunk, hogy a kelet-magyarországi RMP-rezisztens M. tuberculosis törzsek mutációinak gyakorisága különbözik az egyéb földrajzi területekről származó törzsek mutációinak gyakoriságától (4. táblázat). Az rpoB gén két szakaszának DNS
42
szekvenálása 27 (93.1%) törzsnél mutatott ki mutációt a 29 rezisztens törzsből, míg a LiPA teszttel 26 izolátumnál sikerült azonosítani a mutációt (89.7%). Ugyanakkor a 26 törzsből 4 esetben a gyors LiPA teszttel nem sikerült meghatározni a mutáció típusát, mivel olyan sajátos mutációkról volt szó, melyeket a teszt nem képes pontosítani. Ráadásul az egyik törzsnél, mely az rpoB gén N-terminális régióján lévő V146F mutációt hordozta, a LiPA teszt ál RMP érzékenységet jelzett. Végül, a LiPA ugyancsak álrezisztens eredményt adott az egyik néma (aminosav változást nem eredményező) mutációt tartalmazó RMP-érzékeny kontroll törzs esetében is. Eredményeink azt jelzik, hogy a RMP-rezisztencia kimutatására használt molekuláris tesztek DNS szekvencia analízissel történő validálása, valamint a különböző mutáció típusok egyes földrajzi területekre jellemző gyakoriságának meghatározása, az adott teszt rutin klinikai gyakorlatba történő bevezetését megelőzően elengedhetetlen. A megfelelően bevezetett és alkalmazott RMP-rezisztencia molekuláris tesztek viszont gyors segítséget jelenthetnek a klinikus számára a MDR tuberkulózis korai felismerésében, a rezisztencia fokának megítélésében és az egyéb rifamycin származékok terápiás alkalmazhatóságát (keresztrezisztencia megléte vagy hiánya) illetően.
43
7. Köszönetnyilvánítás Hálás szívvel mondok köszönetet kedves barátomnak, munkatársamnak és témavezetőmnek, Dr. Somoskövi Ákosnak, aki segített rátalálni erre az izgalmas kutatási területre. A tudományos munka során minden problémás esetben számíthattam rá, értékes észrevételeivel gazdagította előadásaimat, cikkeimet és a disszertáció elkészültét. Köszönettel tartozom Magyar Pál Professzor Úrnak, aki mindig is ösztönzött a kutatómunkára, lehetőséget biztosított és serkentett a disszertáció elkészítésében illetve programvezetőként hasznos tanácsokkal látott el a dolgozat megírásában. Szeretnék köszönetet mondani Hutás Imre Profeszor Úrnak a sok hasznos észrevételért, mellyel publikációs munkánkat segítette. Szeretném megköszönni Losonczy György Professzor Úrnak a disszertáció megírásában adott értékes tanácsait. Hálával tartozom Dr. Linda M. Parsons-nak és Dr. Max Salfinger-nek, a kooperációért, a munkánkat előrevivő ötletekért, a publikálásban, prezentációban nyújtott segítségért. Köszönettel tartozom Ködmön Csabának, aki nélkülözhetetlen volt a laboratóriumi munkákban. Köszönetet kell mondanom munkacsoportunk minden tagjának, Dr. Mester Juditnak, Dr. Szabó Nórának, Dr. Faragó Eszternek, Dr. Puskás Erzsébetnek és Kosztolányi Lászlónénak. Ugyancsak hálával tartozom laboratóriumunk asszisztenseinek is, Gulyás Katalinnak, Szilágyi Zsuzsannának, Dombai Ágnesnek áldozatos munkájukért. Végül, de természetesen nem utolsó sorban hálával tartozom feleségemnek, gyermekeimnek, családomnak, hogy mindvégig támogattak és kibírták, elviselték mindazt, ami az első lépésektől a dolgozat elkészültéig tartott.
44
8. Irodalomjegyzék 1.
Brosch R, Gordon SV, Marmiesse M, et al.: A new evolutionary scenario for the Mycobacterium tuberculosis complex. Proc Natl Acad Sci U S A 2002; 99:3684-3689.
2.
Brosch R, Gordon SV, Eiglmeier K, et al.: Genomics, biology, and evolution of the Mycobacterium tuberculosis complex. In: Hatfull GF, Jacobs J, W.R., eds. Molecular genetics of Mycobacteria. Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 2000:19-36.
3.
Parsons LM, Brosch R, Cole ST, et al.: Rapid and simple approach for identification of Mycobacterium tuberculosis complex isolates by PCR-based genomic deletion analysis. J. Clin. Microbiol. 2002; 40:2339-2345.
4.
Gergely P.: A tuberkulózis immunológiája. Medicina Thoracalis 1998; 51:185188.
5.
Schluger NW, Rom WN.: The host immune response to tuberculosis. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1998; 157:679-691.
6.
Somoskovi A, Zissel G, Zipfel PF, et al.: Different cytokine patterns correlate with the extension of disease in pulmonary tuberculosis. Eur. Cytokine Netw. 1999; 10:135-142.
7.
Somoskovi A, Zissel G, Ziegenhagen MW, Schlaak M, Muller-Quernheim J.: Accessory function and costimulatory molecule expression of alveolar macrophages in patients with pulmonary tuberculosis. Immunobiology 2000; 201:450-460.
8.
WHO report on the tuberculosis epidemic. Geneva: World Health Organization, 1997.
9.
A pulmonológiai intézmények 1999. évi epidemiológiai és mûködési adatai. Budapest: Országos Korányi TBC és Pulmonológiai Intézet, 2000.
10.
Bártfai Z, Somoskövi Á, Hutás I.: A tuberculosis járványtana, terjedése, patológiája és klinikai megjelenési formái. Családorvosi Fórum 2001; január:1015.
11.
Sepkowitz KA, Raffalli J, Riley L, Kiehn TE, Armstrong D.: Tuberculosis in the AIDS era. Clin. Microbiol. Rev. 1995; 8:180-199.
45
12.
Cohn DL, Bustreo F, Raviglione MC.: Drug-resistant tuberculosis: review of the worldwide situation and the WHO/IUATLD Global Surveillance Project. International Union Against Tuberculosis and Lung Disease. Clin. Infect. Dis. 1997; 24 Suppl 1:S121-130.
13.
A pulmonológiai intézmények 1995. évi epidemiológiai és mûködési adatai.: Budapest: Országos Korányi TBC és Pulmonológiai Intézet, 1996.
14.
Vadász I, Pataki G, Fodor T.: Tuberkulózis surveillance-a tuberkulózis elleni program minõségbiztosítása. Medicina Thoracalis 2001; 54:181-186.
15.
Vadász I, Ajkay Z, Barsiné Fodor K.: Tuberkulózis surveillance-1998. Medicina Thoracalis 2000; 53:1-6.
16.
A pulmonológiai intézmények 2001. évi epidemiológiai és mûködési adatai.: Budapest: Országos Korányi TBC és Pulmonológiai Intézet, 2002.
17.
Mester J, Vadász I, Pataki G, et al.: Tuberculosis surveillance in Hungary in 2000. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2002; accepted for publication.
18.
Tattevin P, Casalino E, Fleury L, Egmann G, Ruel M, Bouvet M.: The validity of medical history, classic symptoms, and chest radiographs in predicting pulmonary tuberculosis. Chest 1999; 115:1248-1253.
19.
Somoskovi A, Hotaling JE, Fitzgerald M, O'Donnell D, Parsons LM, Salfinger M.: Lessons from a proficiency testing event for acid-fast microscopy. Chest 2001; 120:250-257.
20.
Salfinger M, Pfyffer GE.: The new diagnostic mycobacteriology laboratory. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1994; 13:961-979.
21.
Smithwick RW.: Laboratory manual for acid-fast microscopy. Atlanta, GA.: Center for Disease Control, 1976.
22.
Technical guide for sputum examination for tuberculosis by direct microscopy. Bull. Int. Union Tuberc. Lung Dis. Suppl. No. 2. Paris: International Union Against Tuberculosis and Lung Disease, 1978.
23.
Somoskövi Á.: A mycobacteriosisok laboratóriumi diagnosztikája. In: Magyar P, Hutás I, Vastag E, eds. Pulmonológia. Budapest: Medicina, 1998:164-171.
24.
Somoskovi A, Mester J, Hale YM, Parsons LM, Salfinger M.: Laboratory diagnosis of nontuberculous mycobacteria. Clin. Chest Med. 2002; 23:585-597.
46
25.
Kent PT, Kubica GP.: Public health mycobacteriology. A guide for a level III laboratory. Atlanta, Ga.: Center for Disease Control and Prevention, 1985.
26.
Somoskovi A, Magyar P.: Comparison of the Mycobacteria Growth Indicator Tube with MB Redox, Lowenstein-Jensen, and Middlebrook 7H11 media for recovery of mycobacteria in clinical specimens. J. Clin. Microbiol. 1999; 37:1366-1369.
27.
Somoskovi A, Kodmon C, Lantos A, et al.: Comparison of recoveries of Mycobacterium tuberculosis using the automated BACTEC MGIT 960 system, the BACTEC 460 TB system, and Lowenstein-Jensen medium. J. Clin. Microbiol. 2000; 38:2395-2397.
28.
Benjamin WH, Jr., Waites KB, Beverly A, et al.: Comparison of the MB/BacT system with a revised antibiotic supplement kit to the BACTEC 460 system for detection of mycobacteria in clinical specimens. J. Clin. Microbiol. 1998; 36:3234-3238.
29.
Rusch-Gerdes S, Ebrahimzadeh A, Hanna BA.: Evaluation of the Bactec MGIT 960 for direct culture identification of mycobacteria with nucleic acid probes. Abstracts of the 100th Annual Meeting of the American Society for Microbiology 2000; C-6:127.
30.
Tortoli E, Cichero P, Chirillo MG, et al.: Multicenter comparison of ESP Culture System II with BACTEC 460TB and with Lowenstein-Jensen medium for recovery of mycobacteria from different clinical specimens, including blood. J. Clin. Microbiol. 1998; 36:1378-1381.
31.
Tenover FC, Crawford JT, Huebner RE, Geiter LJ, Horsburgh CR, Jr., Good RC.: The resurgence of tuberculosis: is your laboratory ready? J. Clin. Microbiol. 1993; 31:767-770.
32.
Styrt BA, Shinnick TM, Ridderhof JC, Crawford JT, Tenover FC.: Turnaround times for mycobacterial cultures. J. Clin. Microbiol. 1997; 35:1041-1042.
33.
Mester J, Vadász I, Bártfai Z, Ködmön C, Somoskövi Á.: A Mycobacterium tuberculosis antituberkulotikum-rezisztenciájának molekuláris alapjai. Medicina Thoracalis 2002; 55:30-36.
34.
Parsons LM, Driscoll JR, Taber HW, Salfinger M.: Drug resistance in tuberculosis. Infect.Dis.Clin.North Am. 1997; 11:905-928.
47
35.
Somoskovi A, Parsons LM, Salfinger M.: The molecular basis of resistance to isoniazid, rifampin, and pyrazinamide in Mycobacterium tuberculosis. Respir. Res. 2001; 2:164-8.
36.
Kwon HH, Tomioka H, Saito H.: Distribution and characterization of betalactamases of mycobacteria and related organisms. Tuber.Lung Dis 1995; 76:141-148.
37.
Cole ST, Brosch R, Parkhill J, et al.: Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence [see comments] [published erratum appears in Nature 1998 Nov 12;396(6707):190]. Nature 1998; 393:537544.
38.
Stover CK, Warrener P, VanDevanter DR, et al.: A small-molecule nitroimidazopyran drug candidate for the treatment of tuberculosis. Nature 2000; 405:962-966.
39.
Vester B, Douthwaite S.: Macrolide resistance conferred by base substitutions in 23S rRNA [In Process Citation]. Antimicrob.Agents Chemother. 2001; 45:1-12.
40.
Scorpio
A,
Zhang
Y.:
Mutations
in
pncA,
a
gene
encoding
pyrazinamidase/nicotinamidase, cause resistance to the antituberculous drug pyrazinamide in tubercle bacillus [see comments]. Nat.Med. 1996; 2:662-667. 41.
Zhang Y, Heym B, Allen B, Young D, Cole S.: The catalase-peroxidase gene and isoniazid resistance of Mycobacterium tuberculosis [see comments]. Nature 1992; 358:591-593.
42.
Zhang Y, Telenti A.: Genetics of drug resistance in
Mycobacterium
tuberculosis. In: Hatful GF, Jacobs Jr. W, R., eds. Molecular genetics of mycobacteria. Washington, D.C.: ASM Press, 2000:235-254. 43.
Heym B, Honore N, Truffot-Pernot C, et al.: Implications of multidrug resistance for the future of short-course chemotherapy of tuberculosis: a molecular study [see comments]. Lancet 1994; 344:293-298.
44.
Bártfai Z, Somoskövi Á.: Néhány gondolat a tuberculosis gyógyszeres kezelésérõl. Családorvosi Fórum 2001; január:20.
45.
Bártfai Z, Somoskövi Á, Hutás I.: A tuberculosis elleni küzdelem, a betegség gyógykezelése, a betegek gonodozása. Családorvosi Fórum 2001:16-19.
48
46.
Centers for Disease Control and Prevention. TB Elimination Cooperative Agreement. Atlanta, Ga.: CDC, 2002.
47.
Salfinger M, Pfyffer GE.: The new diagnostic mycobacteriology laboratory. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1994:961-979.
48.
Pfyffer GE, Welscher HM, Kissling P, et al.: Comparison of the Mycobacteria Growth Indicator Tube (MGIT) with radiometric and solid culture for recovery of acid-fast bacilli. J Clin.Microbiol. 1997; 35:364-368.
49.
Piersimoni C, Scarparo C, Cichero P, et al.: Multicenter evaluation of the MBRedox medium compared with radiometric Bactec system, Mycobacteria Growth Indicator Tube (MGIT), and Löwenstein-Jensen medium for detection and recovery of acid-fast bacilli. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 1999; 34:293299.
50.
Rohner P, Ninet C, Metral S, Emler S, Auckenthaler R.: Evaluation of the MB/BacT system and comparison to the Bactec 460 system and solid media for isolation of mycobacteria from clinical specimens. J. Clin. Microbiol. 1997; 35:3127-3131.
51.
Woods GL, Fish G, Plaunt M, T. M.: Clinical evaluation of Difco ESP culture system II fro growth and detection of mycobacteria. J. Clin. Microbiol. 1997; 35:121-124.
52.
Hanna BA, Ebrahimzadeh A, Elliott LB, et al.: Multicenter evaluation of the BACTEC MGIT 960 system for recovery of mycobacteria. J. Clin. Microbiol. 1999; 37:748-752.
53.
Tortoli E, Cichero P, Piersimoni C, Simonetti MT, Gesu G, Nista D.: Use of BACTEC MGIT 960 for recovery of mycobacteria from clinical specimens: multicenter study. J. Clin. Microbiol. 1999; 37:3578-3582.
54.
Goble M, Iseman MD, Madsen LA, Waite D, Ackerson L, Horsburgh CR, Jr.: Treatment of 171 patients with pulmonary tuberculosis resistant to isoniazid and rifampin. N.Engl.J.Med. 1993; 328:527-532.
55.
Mitchison DA, Nunn AJ.: Influence of initial drug resistance on the response to short-course chemotherapy of pulmonary tuberculosis. Am Rev Respir Dis 1986; 133:423-430.
49
56.
Cooksey RC, Holloway BP, Oldenburg MC, Listenbee S, Miller CW.: Evaluation of the invader assay, a linear signal amplification method, for identification of mutations associated with resistance to rifampin and isoniazid in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob.Agents Chemother. 2000; 44:12961301.
57.
Kapur V, Li LL, Iordanescu S, et al.: Characterization by automated DNA sequencing of mutations in the gene (rpoB) encoding the RNA polymerase beta subunit in rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains from New York City and Texas. J. Clin. Microbiol. 1994; 32:1095-1098.
58.
Musser JM.: Antimicrobial agent resistance in mycobacteria: molecular genetic insights. Clin.Microbiol.Rev. 1995; 8:496-514.
59.
Piatek AS, Tyagi S, Pol AC, et al.: Molecular beacon sequence analysis for detecting drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. Nat.Biotechnol. 1998; 16:359-363.
60.
Telenti A, Imboden P, Marchesi F, et al.: Detection of rifampicin-resistance mutations in Mycobacterium tuberculosis. Lancet 1993; 341:647-650.
61.
Telenti A, Imboden P, Marchesi F, Schmidheini T, Bodmer T.: Direct, automated detection of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis by polymerase chain reaction and single-strand conformation polymorphism analysis. Antimicrob.Agents Chemother. 1993; 37:2054-2058.
62.
Victor TC, Jordaan AM, van Rie A, et al.: Detection of mutations in drug resistance genes of Mycobacterium tuberculosis by a dot-blot hybridization strategy. Tuber.Lung Dis. 1999; 79:343-348.
63.
Williams DL, Waguespack C, Eisenach K, et al.: Characterization of rifampinresistance in pathogenic mycobacteria. Antimicrob.Agents Chemother. 1994; 38:2380-2386.
64.
Watterson SA, Wilson SM, Yates MD, Drobniewski FA.: Comparison of three molecular assays for rapid detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis. J.Clin.Microbiol. 1998; 36:1969-1973.
65.
Taniguchi H, Aramaki H, Nikaido Y, et al.: Rifampicin resistance and mutation of the rpoB gene in Mycobacterium tuberculosis. FEMS Microbiol.Lett. 1996; 144:103-108.
50
66.
Heep M, Rieger U, Beck D, Lehn N.: Mutations in the beginning of the rpoB gene can induce resistance to rifamycins in both Helicobacter pylori and Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob. Agents Chemother. 2000; 44:10751077.
67.
Heep M, Brandstatter B, Rieger U, et al.: Frequency of rpoB mutations inside and outside the cluster I region in rifampin-resistant clinical mycobacterium tuberculosis isolates [In Process Citation]. J. Clin. Microbiol. 2001; 39:107-110.
68.
Rinder H, Dobner P, Feldmann K, et al.: Disequilibria in the distribution of rpoB alleles in rifampicin-resistant M. tuberculosis isolates from Germany and Sierra Leone. Microb.Drug Resist. 1997; 3:195-197.
69.
Somoskövi Á, Magyar P.: Mycobacterium tuberculosis complex kimutatása Accuprobe nukleinsav hibridizációs próba segítségével. Medicina Thoracalis 1997; 50:9-13.
70.
Metchock BG, Nolte FS, Wallace RJ.: Mycobacterium. In: Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, Tenover FC, Yolken RH, eds. Manual of clinical microbiology. Washington, D.C.: ASM Press, 1999:399-437.
71.
Canetti G, Fox W, Khomenko A, et al.: Advances in techniques of testing mycobacterial drug sensitivity, and the use of sensitivity tests in tuberculosis control programmes. Bull.WHO 1969; 41:21-43.
72.
Bartfai Z, Somoskovi A, Kodmon C, et al.: Molecular characterization of rifampin-resistant isolates of Mycobacterium tuberculosis from Hungary by DNA sequencing and the Line Probe Assay. J. Clin. Microbiol. 2001; 39:37363739.
73.
Hunt JM, Roberts GD, Stockman L, Felmlee TA, Persing DH.: Detection of a genetic locus encoding resistance to rifampin in mycobacterial cultures and in clinical specimens. Diagn.Microbiol.Infect.Dis 1994; 18:219-227.
74.
Innogenetics NV. Inno-LiPA Rif.TB test package insert. 1999.
75.
De Beenhouwer H, Lhiang Z, Jannes G, et al.: Rapid detection of rifampicin resistance in sputum and biopsy specimens from tuberculosis patients by PCR and line probe assay. Tuber.Lung Dis. 1995; 76:425-430.
76.
Hirano K, Abe C, Takahashi M.: Mutations in the rpoB gene of rifampinresistant Mycobacterium tuberculosis strains isolated mostly in Asian countries
51
and their rapid detection by line probe assay. J.Clin.Microbiol. 1999; 37:26632666. 77.
Matsiota-Bernard P, Vrioni G, Marinis E.: Characterization of rpoB mutations in rifampin-resistant clinical Mycobacterium tuberculosis isolates from Greece. J.Clin.Microbiol. 1998; 36:20-23.
78.
Pozzi G, Meloni M, Iona E, et al.: rpoB mutations in multidrug-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis isolated in Italy. J.Clin.Microbiol. 1999; 37:1197-1199.
79.
Schilke K, Weyer K, Bretzel G, et al.: Universal pattern of rpoB gene mutations among multidrug-resistant isolates of Mycobacterium tuberculosis complex from Africa. Int.J.Tuberc.Lung Dis. 1999; 3:620-626.
80.
Valim AR, Rossetti ML, Ribeiro MO, Zaha A.: Mutations in the rpoB gene of multidrug-resistant
Mycobacterium
tuberculosis
isolates
from
Brazil.
J.Clin.Microbiol. 2000; 38:3119-3122. 81.
Traore H, Fissette K, Bastian I, Devleeschouwer M, Portaels F.: Detection of rifampicin resistance in Mycobacterium tuberculosis isolates from diverse countries by a commercial line probe assay as an initial indicator of multidrug resistance. Int.J.Tuberc.Lung Dis 2000; 4:481-484.
82.
Yuen LK, Leslie D, Coloe PJ.: Bacteriological and molecular analysis of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains isolated in Australia. J.Clin.Microbiol. 1999; 37:3844-3850.
83.
Marttila HJ, Soini H, Vyshnevskaya E, et al.: Line probe assay in the rapid detection of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis directly from clinical specimens. Scand. J. Infect. Dis. 1999; 31:269-273.
84.
Mitchison DA.: The Garrod Lecture. Understanding the chemotherapy of tuberculosis--current problems. J Antimicrob.Chemother. 1992; 29:477-493.
85.
Grosset J.: The sterilizing value of rifampicin and pyrazinamide in experimental short-course chemotherapy. Bull.Int.Union Tuberc. 1978; 53:5-12.
86.
Ohno H, Koga H, Kuroita T, et al.: Rapid prediction of rifampin susceptibility of Mycobacterium tuberculosis. Am.J.Respir.Crit.Care Med. 1997; 155:2057-2063.
87.
Moghazeh SL, Pan X, Arain T, Stover CK, Musser JM, Kreiswirth BN.: Comparative antimycobacterial activities of rifampin, rifapentine, and KRM-
52
1648 against a collection of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates with known rpoB mutations. Antimicrob.Agents Chemother. 1996; 40:2655-2657. 88.
Rinder H, Mieskes KT, Löscher T.: Heteroresistance in Mycobacterium tuberculosis. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2001; 5:339-345.
53
9. Saját közlemények jegyzéke 9.1. Az értekezés témájával összefüggő közlemények Somoskövi Á., Ködmön Cs., Lantos Á., Bártfai Z., Tamási L., Füzy J., Magyar P.: Comparison of recoveries of Mycobacterium tuberculosis using the automated BACTEC MGIT 960 system, the BACTEC 460 TB system, and Löwenstein-Jensen Medium. J. Clin. Microbiol. 2000; 38:2395-2397. IF: 3,965 Bártfai Z., Somoskövi Á., Hutás I.: A tuberculosis járványtana, terjedése, patológiája, diagnosztikája és klinikai megjelenési formái. Családorvosi Fórum 2001; január:10-15. Bártfai Z., Somoskövi Á., Hutás I.: A tuberculosis elleni küzdelem, a betegség gyógykezelése, a betegek gondozása, Családorvosi Fórum, 2001; január:16-19. Bártfai Z., Somoskövi Á.: Néhány gondolat a tuberculosis gyógyszeres kezeléséről. Családorvosi Fórum, 2001; január:20. Bártfai Z., Somoskövi Á., Ködmön CS., Szabó N., Puskás E., Kosztolányi L., Faragó E., Mester J., Parsons L.M., Salfinger M.: Molecular characterization of rifampinresistant isolates of Mycobacterium tuberculosis from Hungary by DNA sequencing and the Line Probe Assay. J. Clin. Microbiol. 2001; 39: 3736-3739. IF: 3,965 Somoskövi Á., Bártfai Z., Ködmön Cs., Hutás I.: A Mycobacterium tuberculosis komplex direkt kimutatására szolgáló polimeráz láncreakción alapuló gyorsteszt rutinszerű alkalmazása magyarországi betegpopuláción, Orvosi Hetilap, 2001; 38:20852090. Mester J., Vadász I., Bártfai Z., Ködmön Cs., Somoskövi Á.: A Mycobacterium tuberculosis antituberkulotikum-rezisztenciájának molekuláris alapjai. Medicina Thoracalis 2002; 55:30-36.
54
Bártfai Z., Somoskövi Á., Ködmön Cs., Szabó N., Puskás E., Kosztolányi L., Faragó E., Mester J., Parsons L.M., Magyar P., Salfinger M.: Magyarországról származó Mycobacterium tuberculosis izolátumok rifampicin - rezisztenciájának molekuláris elemzése DNS szekvenálással és Line Probe Assay segítségével, Medicina Thoracalis, 2002; 55:83-88.
55
9.2. Egyéb közlemények Bártfai Z., Appel J., Zsiray M., Orosz M.: Tumort utánzó endoscopos kép idegentest aspiráció után 4 hónappal, Medicina Thoracalis, 1993; 9:333-336. Bártfai Z., Gyõri Zs., Magyar P.: Klinikai tünetek alapján diagnosztizált Wegener granulomatosis, Medicina Thoracalis 1994; 47:73-79. Orosz M., Nagy L., Bártfai Z.: Gyulladásos sejtek és mediátorok foglalkozási tüdõasztmában, Medicina Thoracalis, 1995; 48:59-64. Bártfai Z.: Az inhalációs kezelés, Háziorvos Továbbképzõ Szemle, 1996; 1:162-165. Lantos Á., Bártfai Z., Falus F., Szondy K., Tarján E., Várnai Zs., Zsiray M.: A malignus folyadékgyülem miatti kémiai pleurodesis technikája és eredményei oxytetracyclinnel, doxyciclinnel és talkummal, Medicina Thoracalis, 1995; 48:67-73. Pálfy L., Saranyik Á., Bártfai Z.: A fővárosi pulmonológiai intézményekben dolgozó ápolók helyes inhaláció technikájának felmérése, Nővér, 1996; 4:45-46. Bártfai Z., Nagy L.: A cytokinek szerepe az asthma bronchiale gyulladásos patogenezisének “reparatív” fázisában, Medicina Thoracalis 1997; 50:509-514. Orosz M., Szentpály O., Bártfai Z., Nagy L., Süttõ Z., Temesi G., Tolnay E.: Gabona és lisztporok okozta megbetegedések, Környezeti ártalmak és a légzõrendszer 1997; VII:78-82. Zsiray M., Márczi V., Csanády K., Várnai Zs., Bártfai Z.: Tüdõtranszplantáció idiopátiás tüdõfibrózisban, Medicina Thoracalis 1998; 51:158-160. Bártfai Z.: A rohamoldó- és a krónikus kezelés korszerû lehetõségei allergiás eredetû asztmában, Kórház, 1999; 1:3-8.
56
Révai T., Bártfai Z., Harmos G., Tomcsányi K., Makleit L.: A ciszplatin-nefropátia kezelési és diagnosztikai lehetőségei, Medicina Thoracalis, 1999; 52:179-181. Süttõ Z., Bártfai Z., Lantos Á., Major T.jr., Vadász G., Várnai Zs., Zsiray M.: Humán polyclonalis intravénás immunglobulin terápia Wegener-granulomatosisban. Esetismertetés és irodalmi áttekintés. Medicina Thoracalis 1999; 52:134-138. Bártfai Z., Tamási L., Somoskövi Á.: Krónikus bronchitis, akut exacerbatio, Praxis, 2000; 2:11-18. Bártfai Z., Somoskövi Á.: Az asthma bronchiale lépcsőzetes terápiája, Családorvosi Fórum, 2000; április:18-23. Bártfai Z., Somoskövi Á.: Asthma bronchialéban szenvedő betegek gondozása, Családorvosi Fórum, 2000; április:45-49. Bártfai Z., Somoskövi Á, Kocsis J.: A lokális gylükokortikoszteroidok sejtszintű hatásai légúti allergiás megbetegedésekben, Allergológia és Klinikai Immunológia, 2000; 3:1822. Bártfai Z.: Terhelés kiváltotta asthma. Kommentár, Orvostovábbképző Szemle, 2000; szeptember:156-158. Tamási L., Bohács A., Wollák A., Bártfai Z., Somoskövi Á., Magyar P.: Felnőttkorban diagnosztizált congenitalis elváltozás-Esetismertetés, Medicina Thoracalis 2000; 53:148-150. Bohács A., Wollák A., Bártfai Z., Hutás I., Magyar P.: Burkholderia cepacia szuperinfekció allergiás bronchopulmonalis aspergillosisban, Medicina Thoracalis 2000; 53:153-156.
57
Bártfai Z., Muraközy G., Kocsis J., Sömöskövi Á., Magyar P.: A Wegenergranulomatosis definíciója és klasszifikációja, Medicina Thoracalis, 2001; 54:138-143. Bártfai Z., Kocsis J., Somoskovi Á., Vastagh E.: Tüdőembólia, Családorvosi Fórum, 2001; december:10-14. Bártfai Z, Somoskovi Á., Kocsis J., Zsiray M.: A sarcoidosis, Családorvosi Fórum, 2001; december:20-24. Mészáros Á, Major T Jr., Bártfai Z, Meskó A, Vincze Z: Az asthmás betegek életminőségének vizsgálata. Acta Pharm Hung, 2001; 71 (2):196-200. Bohács A., Wollák A., Somoskövi Á., Bártfai Z.: Szisztémás lupus erythematosus (SLE) pleuropulmonális manifesztációi, Allergológia és Klinikai Immunológia, 2002; 5:71-76. Somoskövi Á., Bártfai Z., Tolnay E., Muraközy G., Tamási L., Magyar P.: Inhalációs kortikoszteroidok alkalmazhatósága terhességben, Medicina Thoracalis 2002; 55:199201. Vatay Á., Rajczy K., Pozsonyi É., Hosszúfalusi N., Prohászka Z., Füst Gy., Karádi I., Szalai Cs., Grósz A., Bártfai Z., Pánczél P.: Differences in the genetic background of latent autoimmune diabetes in adults (LADA) and type 1 diabetes mellitus, Immunology Letters, 2002; 2:109-115. IF: 2,01 Meszaros A., Bartfai Z., Major T., Magyar P., Mesko A., Vincze Z.: Assesing quality of life of asthmatics with a visual analogue scale and the St George’s Respiratory Questionnaire, Allergologie, in print, IF: 0,278 Bártfai Z., Somoskövi Á., Tamási L., Bohács A., Boyle B., Lantos Á.: A tartós hatású formoterol gyors hatáskezdetének vizsgálata asthma bronchialéban és COPD-ben szenvedő betegeken, Medicina Thoracalis, közlés alatt
58
Bártfai Z., Lantos Á.: A bronchoscopia a felnőttkori tüdőbetegségekben, Családorvosi Fórum, közlés alatt Tamási L., Bártfai Z., Mészáros Zs., Bohács A., Zsiray M.: Pulmonalis actinomycosis – Esetismertetés, Medicina Thoracalis, közlés alatt Bohács A., Wollák A., Muraközy G., Nagy A., Tamási L., Mészáros Zs., Juhász M., Ivaskevics K., Somoskövi Á., Bártfai Z.: “A képalkotó eljárások csapdái.” A bronchioloalveolaris carcinoma típusai, Medicina Thoracalis, közlés alatt Somoskövi Á., Tamási L., Bártfai Z., Tolnay E.: Az asthma bronciale kezelése terhességben, Orvosi Hetilap, közlés alatt
59
10. Az értekezés alapjául szolgáló közlemények
60
I
61
62
63
64
65
66
67
II
68
69
70
71
72
III
73
74
75
76
77
78
79
80
IV
81
82
83
84
V
85
