KAJIAN MOLEKULER MEKANISME RESISTENSI MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS

KAJIAN MOLEKULER MEKANISME RESISTENSI MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS Tristia Rinanda Abstrak. Program penanggulangan Tuberkulosis (TB) yang komprehensif seperti Directly Observed Treatment Shortcourses (DOTS) telah dijalankan di seluruh dunia sejak tahun 1995. Selama 2 dasawarsa, prevalensi TB menurun secara signifikan, namun tidak bia dipungkiri bahwa penyakit infeksi ini masih tetap ada dan menjadi masalah kesehatan di dunia, terutama di negara-negara berkembang. Saat ini dunia sedang menghadapi fenomena yang juga cukup meresahkan, yaitu munculnya kasus TB resisten obat. Fenomena ini membuat semakin kompleknya permasalahan terkait TB, seperti peningkatan morbiditas dan mortalitas serta peningkatan beban biaya pengobatan. Resistensi ini sangat terkait dengan terjadinya sejumlah perubahan dalam struktur genom Mycobacterium tuberculosis yang menurunkan bahkan menghilangkan efikasi Obat Anti Tuberkulosis (OAT). Tulisan ini membahas mengenai struktur genom Mycobacterium tuberculosis dan kaitannya dengan mekanisme resistensi terhadap OAT. Pemahaman mengenai aspek molekuler ini banyak digunakan dalam pengembangan berbagai teknik deteksi resistensi dalam kasus TB resisten obat. (JKS 2015; 3: 162-167) Kata kunci: Tuberkulosis, resistensi, genom, obat anti tuberkulosis

Abstract. Comprehensive Tuberculosis eradication programs such as Directly Observed Treatment Short courses (DOTS) have been implemented worldwide since 1995. In the past two decades, the prevalence of Tuberculosis has significantly declined. However, it is undeniable that this infectious disease remains present as one of the health problems in the world, particularly in developing countries. Also, the world is currently facing an alarming phenomenon in the form of drugs-resistant Tuberculosis cases, which result in Tuberculosisrelated issues of greater complexity such as the rise in morbidity and mortality as well as in medication costs. This resistance is closely related to a number of changes occurred in the structure of Mycobacterium tuberculosis genome which reduce or even eliminate the efficacy of Anti Tuberculosis Drugs. This article discusses the structure of Mycobacterium tuberculosis genome and its relationship with the resistance mechanism of Anti Tuberculosis Drugs. The understanding of this molecular aspect is used a great deal in the development of various resistance detection techniques in drugs-resistance Tuberculosis cases. (JKS 2015; 3: 162-167) Keywords: Tuberculosis, resistance, genome, tuberculosis drugs

Pendahuluan1 Secara global, sejak tahun 1990 hingga 2013, angka kematian akibat TB telah mengalami penurunan sebanyak 45% dan prevalensi kasus juga menurun hingga 41%. Sejumlah target Millenium Development Goals (MDGs) di tahun 2015 terkait dengan TB telah tercapai dengan baik di sebagian besar negara dengan beban TB yang tinggi, salah satunya adalah Indonesia1. Namun berdasarkan laporan World Health Organization, beban TB di Indonesia sebenarnya lebih besar dari pada Tristia Rinanda adalah Dosen Bagian Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Syiah Kuala Banda Aceh

yang digambarkan sebelumnya, bahkan Indonesia masuk dalam 3 besar negara dengan prevalensi TB terbesar di dunia setelah India dan China. Hal ini semakin diperburuk dengan lemahnya sistem pendeteksian kasus serta adanya peningkatan jumlah kasus Tuberkulosis resisten obat dan ko-infeksi HIV/AIDS2. Indonesia seperti halnya negara berkembang lainnya mengalami penurunan jumlah kasus TB namun terjadi peningkatan kasus TB resisten obat3. Indonesia saat ini menjadi salah satu negara dengan beban TB resisten obat yang cukup tinggi di dunia, terutama

162

JURNAL KEDOKTERAN SYIAH KUALA Volume 15 Nomor 3 Desember 2015

Multidrug Resistant Tuberculosis/MDRTB2. Tuberkulosis resisten obat terdiri dari MDR-TB, yaitu resistensi terhadap rifampisin dan isoniazid dengan atau tanpa resistensi terhadap OAT lain, serta Extensively Drug Resistant Tuberculosis (XDR-TB) yaitu resistensi terhadap OAT lini kedua seperti golongan 4,5 fluorokuinolon . Di Indonesia diperkirakan terdapat 2% MDR-TB dari kasus baru (resistensi primer) dan 19% dari kasus yang telah diobati (resistensi sekunder)5. Resistensi obat pada TB bukan hanya disebabkan oleh pengobatan yang tidak adekuat atau gagal, namun juga disebabkan oleh munculnya strain resisten yang ditransmisikan oleh penderita MDR-TB6. Strain yang resisten muncul akibat adanya perubahan atau mutasi pada gen-gen tertentu dalam genom M. tuberculosis. Gen-gen ini merupakan target dari mekanisme kerja OAT7. Pada tulisan ini dibahas mengenai kaitan struktur genom M. tuberculosis dengan target kerja OAT dan aspek molekuler mekanisme resistensi terhadap OAT. Struktur Genome Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium tuberculosis memiliki karakteristik pertumbuhan yang lambat, dorman, memiliki komponen dinding sel yang kompleks, merupakan organisme intraseluler serta memiliki homogenitas genetik8,9. Karakteristik pertumbuhan yang lambat dan dorman sangat berkontribusi dalam kronisitas infeksi yang ditimbulkan. Hal ini juga berdampak pada lamanya masa terapi selain juga menjadi kendala terutama dalam hal menumbuhkan bakteri basil Gram positif ini. Keadaan dormansi merupakan akibat dari ditekannya jalur metabolik bakteri akibat aktivasi sistem imun seluler. Mekanisme ini merupakan bentuk pertahanan terhadap infeksi namun tidak dapat mengeradikasi infeksi. Apabila terjadi penurunan sistem imun dan proses penuaan, maka infeksi dapat teraktivasi9.

Genom M. tuberculosis berukuran sangat besar, yaitu 4,4 Megabasa dan terdiri dari 3920 gen10. Stuktur genom ini diketahui mengalami evolusi dan pengaturan ulang yang bertujuan untuk mempertahankan gen-gen yang bersifat konstitutif (dibutuhkan untuk kelangsungan hidup) serta menghilangkan sejumlah gen yang tidak diperlukan lagi11. Dengan kemajuan teknologi abad ini, genom M. tuberculosis beserta protein yang diekspresikanna telah dapat dipetakan. Pengetahuan ini sangat bermanfaat dalam studi terkait patogenesis serta penemuan obat dan vaksin12. Resistensi alamiah terhadap banyak antibiotika merupakan salah satu keunikan yang dimiliki oleh M. tuberculosis7. Resistensi ini terjadi akibat adanya dinding sel yang sangat hidrofobik dan berperan sebagai barrier permeabilitas13. Selain itu juga terdapat sejumlah determinan lain pada genom yang juga menyebabkan resistensi, antara lain adanya ekspresi dari enzim hidrolitik dan drug modifying enzymes, seperti β-laktamase dan aminoglycoside acetyl transferase. Adanya sistem pompa efluks juga berperan dalam mekanisme resistensi alamiah9.

Mekanisme Molekuler Resistensi Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium tuberculosis memiliki kemampuan untuk mengembangkan resistensi secara alamiah terhadap berbagai antibiotika. Resistensi tingkat rendah dapat disebabkan oleh struktur dinding sel yang yang sangat hidrofobik dan berperan dalam mempertahankan permeabilitas dinding dari mekanisme pengrusakan oleh obat14. Resistensi ini umumnya disebut dengan resistensi intrinsik15. Resistensi dapatan (acquired) yang terjadi pada MDR-TB umumnya disebabkan oleh karena adanya sejumlah mutasi pada sejumlah gen yang mengkode sensitivitas Mycobacterium tuberculosis terhadap OAT13.

163

Tristia Rinanda, Kajian Molekuler Mekanisme Resistensi Mycobacterium Tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis mengembangkan mekanisme resistensi yang berbeda dengan bakteri lain pada umumnya. Pada prokariot, resistensi umumnya disebabkan karena adanya transfer materi genetik, baik melalui plasmid, transposon dan lain-lain. Pada M. tuberculosis, resistensi dipicu oleh adanya mutasi yang terjadi secara spontan pada gen kromosomal. Resistensi hanya akan menguntungkan bakteri pada saat terpapar dengan obat target. Pada paparan OAT yang tidak adekuat, bakteri yang sensitif akan mati dan mutan akan berkembang biak dengan pesat tanpa

adanya persaingan yang berarti dalam hal nutrisi13,15. Tuberkulosis pada kasus MDR cenderung akan berkembang menjadi kasus kronik dan kondisi ini semakin mempermudah penyebaran M. tuberculosis galur MDR13. Mutasi terhadap OAT terjadi 10-9 kali per pembelahan sel. Oleh sebab itu OAT diberikan secara kombinasi untuk memperkecil kemungkinan terjadinya mutasi hingga 10-18 per pembelahan sel15. Sejumlah gen yang terlibat dalam mekanisme resistensi M. tuberculosis terhadap OAT dapat dilihat pada tabel 1.

Tabel 1. Lokus gen yang terlibat dalam resistensi pada Mycobacterium tuberculosis14,15 Obat

Gen

Rifampisin

rpoB

Isoniazid (INH)

katG OxyR-ahpC inhA rpsL rrs gyrA pncA embB

INH-Etionamid Streptomisin Fluorokuinolon Pirazinamid Etambutol

Mekanisme Resistensi terhadap INH Resistensi terhadap INH disebabkan oleh adanya mutasi pada sejumlah gen, yaitu katG, inhA dan ahpC. Gen katG berperan dalam mengkode enzim katalaseperoksidase yang dibutuhkan untuk mengaktivasi Isoniazid (INH) yang masuk ke dalam tubuh sebagai pro-drug15. Dalam mekanisme kerjanya INH menghambat biositesis mycolic acid sehingga bakteri menjadi rentan terhadap paparan radikal bebas dan faktor lingkungan lainnya13. Dalam mekanisme kerja menghambat sintesis mycolic acid, INH yang teraktivasi menghambat enzim NADH- dependent enoyl-ACP reductase yang dikode oleh gen inhA16. Gen ahpC berperan dalam mengkode enzim alkyl hydroperoxidase reductase yang menyebabkan bakteri resisten terhadap radikal bebas berupa oksigen dan nitrogen bebas7,14.

Produk Β-subunit RNA polymerase Katalase-peroksidase Alkyl-reductase Enoyl-ACP reductase Ribosomal protein S12 16s RNA DNA gyrase Amidase EmbB

Frekuensi dalam strain resisten > 95% 60-70% ~20% <10% 60% <10% >90% 70-100% 69%

Mutasi yang paling sering dijumpai pada katG adalah mutasi asam amino Serin menjadi Threonin pada kodon 315 (Ser315Thr)14,13,15,16. Mutasi ini banyak ditemukan pada kasus MDR-TB dibandingkan monoresisten INH. Berdasarkan hal ini diduga bahwa mutan ini merupakan hasil mutasi tahap kedua setelah paparan INH dalam dosis suboptimal15,16. Mutasi pada inhA pada bagian promotor (posisi -15C/T) merupakan mutasi yang paling banyak ditemukan pada resistensi INH dan mutasi ini juga mengakibatkan resistensi silang dengan etionamid karena memiliki target kerja obat yang sama16. Peningkatan ekspresi atau mutasi pada ahpC diketahui merupakan bentuk kompensasi dari hilangnya aktivitas catalase peroxidase dan bukan mekanisme dasar resistensi terhadap INH15.

164

JURNAL KEDOKTERAN SYIAH KUALA Volume 15 Nomor 3 Desember 2015

Mekanisme Resistensi terhadap Rifampisin Gen rpoB adalah gen yang mengkode sub unit beta, salah satu struktur penyusun enzim DNA polymerase. Gen ini bertanggung jawab terhadap resistensi Rifampisin. Rifampisin bekerja dengan berikatan pada sub unit beta DNA polymerase. Karakteristik rifampisin adalah kemampuan untuk bekerja membunuh bakteri yang tumbuh dengan aktif maupun tidak15. Mutasi yang terjadi pada gen rpoB akan merubah struktur sub unit beta sehingga Rifampisin kehilangan site of action7. Mutasi umumnya terjadi pada 81 pasang basa di daerah core yang disebut Rifampicin Resistance determining Region (RRDR) dan biasanya berupa perubahan nukleotida tunggal yang akan mengakibatkan perubahan susunan asam amino15. Mutasi berupa delesi inframe serta insersi juga dapat terjadi pada frekuensi yang lebih rendah. Perubahan asam amino serin pada kodon 531 serta Histidin pada kodon 526 ditemukan pada 70% isolat resisten terhadap rifampisin14. Mekanisme Resistensi terhadap Pirazinamid Pirazinamid adalah analog nikotinamid yang bekerja selektif terhadap M. tuberculosis13. Obat ini efektif dalam menghambat pertumbuhan bakteri semidorman yang tidak dapat dibunuh oleh obat lain serta bekerja sinergis dengan Rifampisin dan INH14. Pirazinamid memiliki aktivitas sterilisasi pada awal terapi yang mampu membunuh bakteri persisten dan mempersingkat masa terapi dari 9 bulan menjadi 6 bulan17. Mutan resisten Pirazinamid akan kehilangan aktivitas amidase/pyrazinamidase yang dibutuhkan untuk mengubah pirazinamid menjadi Pyrazinoic acid di intraselular7. Mutasi yang terjadi pada pncA dapat berupa mutasi titik, insersi dan delesi nukleotida serta mutasi terminasi18,19.

Mekanisme Resistensi terhadap Etambutol Etambutol adalah salah satu OAT lini pertama yang bekerja secara sinergis dengan OAT lain dalam menghambat sintesis arabinogalaktan dinding sel M. tuberculosis, terutama dalam menghambat transfer arabinosil7,14,15. Mutasi yang sangat mempengaruhi fenotip resistensi terhadap etambutol terjadi pada gen embB20. Gen embB memiliki asam amino metionin pada posisi kodon 306. Susunan ini bersifat lestari atau conserved pada M. tuberculosis, M. smegmatis, M. avium dan M. leprae. Mutasi titik yang mengakibatkan subtitusi asam amino Metionin pada posisi 306 ditemukan pada sebagian besar kasus resistensi etambutol. Hal inilah yang mendasari penggunaan mutasi kodon 306 sebagai marker resistensi20,21. Mekanisme Resistensi terhadap Streptomisin Streptomicin berkerja menghambat ribosom yang berperan dalam proses translasi protein pada M. tuberculosis14. Resistensi terhadap streptomisin ditemukan pada gen rpsL dan rss, yang mengkode protein ribosomal S12 dan 16S RNA22,23. Mutasi umumnya terjadi di kodon 43 dan 88 pada gen rpsL serta di daerah spesifik yaitu loop 530 serta daerah 912 pada gen rrs22. Perubahan asam amino Lisin menjadi Arginin atau Threonin pada kodon 4323 dan perubahan Lisin menjadi Arginin atau Glutamin pada kodon 88, merupakan bentuk mutasi yang sering ditemukan pada isolat Mycobacterium tuberculosis yang resisten terhadap Streptomisin13. Mekanisme Resistensi terhadap Fluorokuinolon Saat ini golongan Fluorokuinolon digunakan untuk mengobati kasus TB dengan resistensi terhadap rifampisin dan INH24. Obat ini bekerja dengan menghambat pembentukan supercoiling dan aktivitas relaksasi dari DNA gyrase (salah satu DNA topoisomerase tipe II)

165

Tristia Rinanda, Kajian Molekuler Mekanisme Resistensi Mycobacterium Tuberculosis

tanpa menghilangkan aktivitas ATPase. Akibatnya enzim gyrase akan terus memutuskan DNA14. Penelitian terhadap M. tuberculosis dan M. Smegmatis menunjukkan bahwa resistensi terhadap fuorokuinolon disebabkan oleh adanya perubahan asam amino pada area pengikatan fluorokuinolon pada gen gyrA dan gyrB, yang disebut quinolon resistance determining region (QRDR)15. Mutasi pada gyrA merupakan bentuk mutasi yang paling banyak ditemukan pada kasus TB resisten fluorokuinolon. Sejumlah mutasi tersebut antara lain perubahan asam amino Alanin menjadi Valin pada posisi kodon 90, Asam aspartat menjadi Alanin pada kodon 94, Asam aspartate menjadi Glisin pada posisi kodon 94 dan Asam aspartat menjadi Asparagin pada kodon 9425.

3.

4.

5. 6.

7.

8.

Kesimpulan Tuberkulosis resisten obat merupakan permasalahan kesehatan global. Resistensi tidak hanya disebabkan oleh pengobatan yang tidak adekuat. Saat ini diketahui bahwa struktur genetik atau susunan genom M. tuberculosis mempengaruhi mekanisme resistensi. Pada M. tuberculosis, resistensi dapat terjadi secara instrinsik ataupun dapatan. Resistensi instrinsik disebabkan oleh struktur dinding sel yang sangat hidrofobik dan impermeable serta adanya ekspresi protein tertentu yang menrunkan kerja obat. Resistensi dapatan cenderung disebabkan oleh adanya mutasi pada gen-gen tertentu yang berperan dalam kerja OAT. Resistensi terhadap rifampisin terjadi akibat mutasi pada gen rpoB, isoniazid pada gen katG dan ahpC, pirazinamid pada gen pncA, etambutol pada gen embB, streptomisin pada rpsL dan rrs serta fluorokuinolon pada gen gyrA dan gyrB. Mutasi pada M. tuberculosis juga dapat terjadi secara spontan. Daftar Pustaka 1.

2.

Kementerian Kesehatan Republik Indonesia. Pedoman Nasional Pengendalian Tuberkulosis. Jakarta; 2014. WHO|Global tuberculosis report 2015.

9.

10.

11.

12.

13.

14.

15.

2015; Available from: http://www.who.int/tb/publications/global _report/en/ Gandhi NRNNR, Nunn P, Dheda K, Schaaf HS, Zignol M, van Soolingen D, et al. Multidrug-resistant and extensively drug-resistant tuberculosis: a threat to global control of tuberculosis. Lancet; 2010;375(9728):1830–43. Soepandi PZ. Jurnal tuberkulosis indonesia. J Tuberkulosis Indones. 2010;7:16-18. Hanafi AW, Prasenohadi. Mekanisme dan Diagnosa MDR TB. PPTI. 2010;7:14–23. Dye C, Espinal MA, Watt CJ, Mbiaga C, Williams BG. Worldwide Incidence of Multidrug‐Resistant Tuberculosis. J Infect Dis. 2002;185(8):1197–202. Blanchard JS. Molecular Mechanisms of Drug Resistance in Tuberculosis. Annu Rev Biochem. 1996;65:215–39. Misaki W, Byarugaba W. Emphasizing the vitality of genomics related research in the area of infectious diseases. Sci Res Essay. 2008;3(4):125–31. Dijl V, Haven N, Sweet RM, Mosimann S, Medical BC. Deciperhing the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence. Nature. 1998;396: 537-544 Pagel M, Pomiankowski A. Genomics and Tuberculosis. Indian J Chest Dis Allied Sci. 2002. p. 221–3. Kato-Maeda M, Rhee JT, Gingeras TR, Salamon H, Drenkow J, Smittipat N, et al. Comparing genomes within the species Mycobacterium tuberculosis. Genome Res. 2001;11(4):547–54. Ahmed N, Hasnain SE. Genomics of Mycobacterium tuberculosis: Old threats & new trends. Indian J Med Res. 2004;120(4):207–12. Johnson R, Streicher EM, Louw GE, Warren RM, van Helden PD, Victor TC. Drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. CurrIssues Mol Biol. 2006;8:97–111. Rattan A. Multidrug-Resistant Mycobacterium tuberculosis: Molecular Perspectives. Emerg Infect Dis. 1998;4(2):195–209. Almeida Da Silva PE, Palomino JC. Molecular basis and mechanisms of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis: classical and new drugs. J Antimicrob

166

JURNAL KEDOKTERAN SYIAH KUALA Volume 15 Nomor 3 Desember 2015

Chemother 2011;66(7):1417–30. 16. Palomino J, Martin A. Drug Resistance Mechanisms in Mycobacterium tuberculosis. Antibiotics. 2014;3(3):317– 40. 17. Zhang Y, Mitchison D. The curious characteristics of pyrazinamide: A review. Int J Tuberc Lung Dis. 2003;7(1):6–21. 18. Sreevatsan S, Pan X, Zhang Y, Kreiswirth BN, Musser JM. Mutations associated with pyrazinamide resistance in pncA of Mycobacterium tuberculosis complex organisms. Antimicrob Agents Chemother. 1997;41(3):636–40. 19. Cheng SJ, Thibert L, Sanchez T, Heifets L, Zhang Y. pncA mutations as a major mechanism of pyrazinamide resistance in Mycobacterium tuberculosis: Spread of a monoresistant strain in Quebec, Canada. Antimicrob Agents Chemother. 2000;44(3):528–32. 20. Sreevatsan S, Stockbauer KE, Pan X, Kreiswirth BN, Moghazeh SL, Jacobs WR, et al. Ethambutol resistance in Mycobacterium tuberculosis: critical role of embB mutations. Antimicrob Agents Chemother. 1997;41(8):1677–81. 21. Park YK, Ryoo SW, Lee SH, Jnawali HN, Kim C-K, Kim HJ, et al. Correlation of the phenotypic ethambutol susceptibility

22.

23.

24.

25.

of Mycobacterium tuberculosis with embB gene mutations in Korea. J Med Microbiol. 2012;61:529–34. Tudó G, Rey E, Borrell S, Alcaide F, Codina G, Coll P, et al. Characterization of mutations in streptomycin-resistant Mycobacterium tuberculosis clinical isolates in the area of Barcelona. J Antimicrob Chemother. 2010;65(11):2341–6. Ozturk CE, Sanic a, Kaya D, Ceyhan I. Molecular analysis of isoniazid, rifampin and streptomycin resistance in Mycobacterium tuberculosis isolates from patients with tuberculosis in Duzce, Turkey. Jpn J Infect Dis. 2005;58(5):309– 12. Huang T-S, Kunin CM, Shin-Jung Lee S, Chen Y-S, Tu H-Z, Liu Y-C. Trends in fluoroquinolone resistance of Mycobacterium tuberculosis complex in a Taiwanese medical centre: 1995-2003. J Antimicrob Chemother. 2005;56:1058– 62. Li J, Gao X, Luo T, Wu J, Sun G, Liu Q, et al. Association of gyrA/B mutations and resistance levels to fluoroquinolones in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis. Emerg Microbes Infect. 2014;3:e19.

167