Tudományos Diákköri Dolgozat
BARANYAI ZSUZSA
Mycobacterium tuberculosis tenyészetének növekedését gátló peptidkonjugátumok szintézise és funkcionális jellemzése
Témavezetők: Dr. Bősze Szilvia, tudományos főmunkatárs Dr. Horváti Kata, tudományos munkatárs
Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi Kar Budapest, 2009
Tartalomjegyzék 1. BEVEZETÉS ...............................................................................................................5 2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS ............................................................................................7 2.1. A Mycobacterium tuberculosis kórokozó baktérium ..................................................7 2.2. A tuberkulózis kezelésében alkalmazott legfontosabb antituberkulotikumok és jellemzőik....................................................................................................................8 2.3. A rezisztens, gyógyszeres kezelésnek ellenálló baktériumtörzsek megjelenése .......11 2.4. A hatóanyagok célbajuttatása konjugátumok alkalmazásával ...................................12 2.4.1. Anyagfelvétel a sejtmembránon keresztül..............................................................13 2.4.2. A hatóanyagok fertőzött makrofágokba történő célbajuttatására elméletileg alkalmazható hordozómolekulák bemutatása ................................................14 2.4.3. A hatóanyag – hordozó egység között kialakítható kémiai kötések típusainak bemutatása ....................................................................................................16 2.4.4. A spacerek (távolságtartó egységek) szerepe a hatóanyag molekulák hordozóhoz történő kapcsolása során .............................................................................18 2.4.4.1. A GFLG szekvencia spacer peptidként (távolságtartó egység) való alkalmazása .............................................................................................................18 2.4.5. Antituberkulotikum – hordozó konjugátumok áttekintése .......................................20 2.5. Új, lehetséges antituberkulotikumok meghatározása in silico módszerek alkalmazásával ................................................................................................................21 3. CÉLKITŰZÉS ..............................................................................................................23 4. A KÍSÉRLETI MÓDSZEREK ELMÉLETI ALAPJAINAK ÁTTEKINTÉSE ......................24 4.1. Szilárdfázisú peptidszintézis .....................................................................................24 4.1.1. A Boc/Bzl módszer ................................................................................................24 4.1.2. Az Fmoc/tBu módszer ...........................................................................................25 4.1.3. A peptidkötés kialakítása a szintézis során ............................................................25 4.1.4. A kapcsolási reakciók követése .............................................................................26 4.2. Szintetikus peptidekben a cisztein oxidációs állapotának meghatározása ................26 4.3. Minimális gátló koncentráció és telepszám meghatározása......................................27 4.4. Az áramlási citometria ..............................................................................................29
2
5. A KÍSÉRLETI MUNKA .................................................................................................31 5.1. A peptidek és peptidszármazékok szintézise ............................................................31 5.1.1. A H-GFLGC-NH2 peptidamid és származékainak szintézise Boc/Bzl stratégiával .........................................................................................................31 5.1.2. A H-[TKPKG]2C-NH2 peptidamid és származékainak szintézise Fmoc/tBu stratégiával ......................................................................................................33 5.1.3. Az in silico meghatározott hatóanyag jelöltek származékainak (vegyület 102 és 103) konjugálása ..................................................................................34 5.2. A hordozóban a cisztein oxidációs állapotának ellenőrzése a konjugálási reakciót megelőzően.....................................................................................................................35 5.3. A hordozó peptiszármazék dimerizációjának követése a konjugálási reakciót megelőzően .......................................................................................................35 5.4. A konjugálási reakcióban alkalmazott klóracetilezett SAK származék előállítása .....35 5.5. A 103-Aoa-OT10-Cys konjugálása ClAc-SAK-hoz ....................................................36 5.6. A konjugátumok minimális gátló koncentrációjának és telepszámának meghatározása ...............................................................................................................36 5.7. A hordozómolekulák és a konjugátumok sejtekbe történő bejutásának, felvételének vizsgálata áramlási citometriával .................................................................37 5.7.1. A Cf-GFLGC előállítása .........................................................................................37 5.7.2. A Cf-GFLGC konjugálása klóracetilezett SAK-hoz ................................................38 5.7.3. A Cf-GFLGC-SAK konjugátum karboxifluoreszcein tartalmának meghatározása ...............................................................................................................38 5.7.4. A Cf-GFLGC peptidszármazék sejtbejutásának vizsgálata MonoMac6 humán monocita sejtvonalon áramlási citometriával ........................................................38 5.7.5. A Cf-GFLGC-SAK peptidszármazék sejtbejutásának vizsgálata MonoMac6 humán monocita sejtvonalon áramlási citometriával ........................................................39 5.8. Tisztítási és analitikai módszerek .............................................................................40 5.8.1. Analitikai és preparatív RP-HPLC ..........................................................................40 5.8.2. ESI-MS spektrometria............................................................................................40 5.8.3. A peptidek és a konjugátumok aminosavanalízise .................................................41 6. EREDMÉNYEK ...........................................................................................................44 6.1. A GFLGC, az Aoa-GFLGC és az Aoa-OT10-Cys peptidek, peptidszármazékok előállítása ........................................................................................................................44 6.2. 102-Aoa-GFLGC és 103-Aoa-OT10-Cys előállítása, az előállított vegyületek vizsgálata ........................................................................................................................47 3
6.3. ClAc-SAK előállítása ................................................................................................53 6.4. A 103-Aoa-OT10-Cys-SAK előállítása ......................................................................53 6.5. A vegyületek, konjugátumok MIC és CFU értékei .....................................................54 6.6. Cf-GFLGC és Cf-GFLGC-SAK előállítása, és a kapott konjugátumok sejtekbe történő bejutása ................................................................................................55 7. ÖSSZEFOGLALÁS .....................................................................................................62 Rövidítésjegyzék .............................................................................................................63 Irodalom ..........................................................................................................................65 Köszönetnyilvánítás ........................................................................................................71
4
1. BEVEZETÉS A gümőkór vagy tuberkulózis (tbc) egy fertőző betegség, melyet a Mycobacterium tuberculosis (továbbiakban M. tuberculosis) baktérium okoz. A tuberkulózist okozó baktériumot Robert Koch 1882-ben fedezte fel, kutatásaiért 1905-ben Nobel-díjat kapott [1] (1. ábra). A betegség elsősorban a tüdő szöveteit érinti (pulmonáris tbc), a beteg tüdejében rögök keletkeznek, innen a betegség magyar neve: gümőkór [2]. A baktérium megtámadhatja a központi idegrendszert (meningitisz), a nyirokrendszert, a keringési rendszert (miliáris tbc), az ivarszerveket, a húgyutakat, a csontokat és az ízületeket is. A
B
1. ábra: (A és B) Robert Koch, a tuberkulózist okozó baktérium felfedezője A tuberkulózis a történelem során a legtöbb halálesetet okozó fertőző betegségek egyike. A betegség gyógyítható, de napjainkban több mint kétmilliárd ember fertőzött a baktériummal. A harmadik világ országaiban évente kilencmillió új fertőzést és kétmillió halálesetet jelentenek. A fertőzöttek élete során kb. 10%-ban a fertőzés biztosan megbetegedéshez vezet. A rezisztens, vagyis a gyógyszeres kezelésnek ellenálló baktériumtörzsek okozta megbetegedések száma évről évre lassú növekedést mutat. 2006ra félmilliónyira tehető a multirezisztens esetek száma. A fejlettebb országokban főként az immunrendszer csökkent védekezőképessége teszi lehetővé a tbc-s fertőzést. A legtöbb megbetegedést Afrikának a Szaharától délre eső részéről, illetve Dél-Kelet-Ázsiából (India, Kína) jelentik [3] (2. ábra). Ez a mutató a HIV és AIDS terjedése miatt évről évre drasztikusan emelkedik. Világszerte az AIDS-es betegek 15%-a hal meg tuberkulózisban [3-5].
5
2. ábra: A tuberkulózis incidencia 2007-ben [3] Magyarországon a tuberkulózis incidenciája tartósan a legmagasabb Szabolcs-SzatmárBereg megyében, de kiemelkedik Hajdú-Bihar, Jász-Nagykun-Szolnok, Borsod-AbaújZemplén megye illetve Budapest is. Hazánkban a szűrési fegyelem lazulása mellett az alkoholizmus, a romló szociális helyzet, a munkanélküliség játszanak szerepet az incidencia emelkedésében. A szűrővizsgálattal kiemeltek korcsoportos vizsgálata azt mutatja, hogy a legmagasabb arány az új tbc-s esetek között a fiatal és középkorú korcsoportokban van [6]. Egy tbc-ben szenvedő, kezeletlen személy évente kb. 10-15 embert fertőzhet meg [3]. Csak azok fertőznek, akiken már kitört a betegség, a látensek nem. A baktérium dormans állapotban évekig lehet a szervezetben, amely csak az immunrendszer legyengülésére vár, és már „robban” is. Dolgozatomban röviden összefoglalom a tuberkulózist okozó baktérium jellemzőit, valamint a betegség kezelésében alkalmazott antituberkulotikumokat és legfontosabb jellemzőiket. Bemutatom a hatóanyagok szelektív célbajuttatásának lehetőségeit.
6
2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 2.1. A Mycobacterium tuberculosis kórokozó baktérium A M. tuberculosis egy lassan szaporodó, intracelluláris, obligát aerob baktérium (3. ábra). A baktérium 16-20 óránként osztódik. Ez más baktériumok osztódási idejéhez képest lassúnak számít. A baktériumok osztódási ideje többnyire percekben mérhető – az Escherichia coli húszpercenként osztódik, de a szintén mikobaktériumok közé tartozó Mycobacterium leprae húsznaponként. A M. tuberculosis pálcika alakú baktérium, ami ellenáll a gyengébb fertőtlenítőknek. Hetekig tűri a szárazságot, de csak a gazdaszervezeten belül képes osztódni (in vitro tenyészetet csak hosszú idő után sikerült a baktériumból létrehozni és fenntartani) [2].
3. ábra: A M. tuberculosis mikroszkópos képe Ziehl-Neelsen festést követően, forrás: http://www.kimicontrol.com/edu-e.html A M. tuberculosis 60% lipidet tartalmaz, ennek jelentős része a sejtfalban lokalizált. Ez lehet az egyik fő oka annak, hogy a baktériumsejt nagymértékben rezisztens a hőmérséklet változásaival szemben. A sejtfal külső rétegeinek peptidláncai képezik a sejtfal tömegének 15%-át és a biológiailag fontos antigének is itt találhatók. Ezek felelősek a celluláris immunválasz kiváltásáért. A baktérium maga beszáradt exhalációs cseppecskékben, köpetben 6 hónapig is életképes maradhat. Rendkívül ellenálló savakkal és lúgokkal szemben is [7]. Stewart Cole és munkatársai 1998-ban közölték a M. tuberculosis H37Rv virulens baktériumtörzs teljes genomjának szekvenciáját [8]. A projekt során kapott információkat az interneten hozzáférhető TubercuList (http://genolist.pasteur.fr/TubercuList/) adatbázisban gyűjtik. A frissített adatok szerint [9, 10] a teljes genom ~4,4 millió bázispárból áll és összesen 4066 gént tartalmaz. Ebből 4009 fehérje kódoló gén, 57 gén RNS-t kódol. A fehérjéket kódoló gének elnevezése Rv kóddal kezdődik (pl. Rv2654), ami a H37Rv törzsre utal. 7
2.2. A tuberkulózis kezelésében alkalmazott legfontosabb antituberkulotikumok és jellemzőik A tuberkulózisos betegeket antibiotikumokkal, ún. antituberkulotikumokkal kezelik. A ma alkalmazott alapvető hatóanyagokat nagyrészt még az 50-es években fejlesztették ki. A megfelelően megválasztott kezelés az esetek döntő többségében teljes gyógyulást eredményez. A legelterjedtebben használt antituberkulotikumok a következők [11, 12] (4. ábra): •
első vonalbeli antituberkulotikumok: izoniazid (INH), rifampicin (RAMP), pirazinamid (PZA), etambutol (ETB), sztreptomicin (SM)
•
második vonalbeli antituberkulotikumok: aminoglikozidok, polipeptidek, fluorokinolonok, tioamidok, cikloszerin (CS), p-aminoszalicilsav (PAS)
4. ábra: Az első vonalbeli antituberkulotikumok, és néhány másodvonalbeli antituberkulotikum szerkezeti képlete [12]
8
A M. tuberculosis baktérium szaporodását döntően befolyásolja a környezet oxigén szintje és kémhatása. A magas oxigéntenzió és az enyhén lúgos kémhatás mellett a tüdő kavernákban a legmagasabb a baktérium anyagcseréjének aktivitása és szaporodási frekvenciája is. Az antituberkulotikumok hatékonyságát a M. tuberculosis szaporodási sebessége és a környezet kémhatása nagymértékben befolyásolja. A neutrális és enyhén lúgos közegben, gyorsan szaporodó baktérium populációkkal szemben az INH a leghatékonyabb, bár a RAMP és a SM is hatásosnak bizonyult. A RAMP a semleges pH-jú sajtos gócokban lassan szaporodó baktériumokkal szemben is kimagasló aktivitással rendelkezik. A PZA intracellulárisan savas kémhatásnál fejti ki hatását [13] (5. ábra).
5. ábra: A leggyakrabban alkalmazott antituberkulotikumok feltételezett hatása az egyes baktérium populációkra [13]
9
Sok antituberkulotikumot használtak évtizedeken keresztül, anélkül, hogy ismerték volna a hatásmechanizmusaikat. A hatásmechanizmus kiderítésére irányuló kutatások eredményét mutatja be vázlatosan az 1. táblázat. Tulajdonság
Antituberkulotikum INH: prodrug, a KatG géntermék aktiválja, mikolsav (a mikobakteriális
zsírsav
sejtfal fontos építőeleme) szintézist gátolja, NADH-val képez
bioszintézis
származékot, ezáltal a metabolizmust is megzavarja
inhibitorok
PZA: szerkezete hasonlít az INH-hoz, prodrug, aktiválódik Tioamidok (etionamid, protionamid): prodrug ETB:
arabinogalaktám és peptidoglikán bioszintézis inhibitorok
arabinozil-transzferáz
inhibitor,
növeli
a
sejtfal
áteresztő
képességét azáltal, hogy nem tud létrejönni a mikolsav-arabinogalaktám komplex D-cikloszerin: gátolja a D-alanin-racemáz és D-alanin-ligáz enzimeket, melyek szükségesek az UDP-muramil-pentapeptid szintéziséhez (sejtfal kialakításában van szerepe) SM: a baktérium riboszómájának 30S alegységéhez kötődik (az emberi
fehérje szintézis inhibitorok
sejtek riboszómája különbözik, ezért szelektív a baktériumsejtekre) Aminoglikozidok Polipeptidek RAMP: az RNS szintézist gátolja, a DNS-függő RNS-polimeráz béta
DNS alapú folyamtok inhibitora
alegységéhez köt, ezzel megakadályozza a transzkripció folyamatát Fluorokinolonok: az ATP-függő DNS-girázt (topoizomeráz II) és az ATPfüggő topoizomeráz IV-et gátolják, ezért akadályozzák a DNS replikációt és a transzkripciót (eukarióta sejtekben nincsenek ilyen enzimek)
dihidrofolátreduktáz inhibitorok
PAS: kötődik a mikobakteriális dihidrofolát-reduktáz enzimhez, így gátolja a DNS szintézist, mely sejthalálhoz vezet
1. táblázat: A főbb antituberkulotikumok irodalomban leírt lehetséges hatásmechanizmusa [12]
10
A makrofágok olyan intracelluláris kórokozók gazdasejtjei lehetnek, mint a M. tuberculosis. A tbc megbetegedést okozó baktérium a makrofágok fagoszómáiban (sejten belüli membránnal határolt sejtalkotó, amely a fagocitózis során jön létre) képesek kikerülni a szervezet védekező mechanizmusait. A makrofágok reaktív oxigéngyökök, nitrogén-oxidok, lizozim, hidrolitikus enzimek segítségével bontják le a baktériumokat savas vezikulumaikban. Az aktivált makrofágok nem képesek elpusztítani az összes bekebelezett baktériumot. Ha a fertőzött makrofágok elpusztulnak, a kiszabaduló baktériumok újabbakat fertőzhetnek meg [14]. A fertőzött makrofágok eljuthatnak a környező nyirokcsomókba, illetve a véráram útján egyéb szövetekbe is. Intracellulárisan a M. tuberculosis alacsony anyagcsereszinten, dormans állapotban hosszú ideig életképes marad. Az antituberkulotikumok többsége az inaktivált makrofágokból kiszabaduló extracelluláris baktériumokra hat [13].
2.3. A rezisztens, gyógyszeres kezelésnek ellenálló baktériumtörzsek megjelenése A helytelen, rendszertelen és nem kellő ideig tartó gyógyszerszedés a rezisztencia kialakulásának leggyakoribb oka. Az 1990-es évek során világszerte új fenyegetésként jelent meg a multirezisztens (multidrug-resistant, MDR) tuberkulózis, amely a két leghatékonyabb gyógyszerrel, az INH-dal és RAMP-nel szemben ellenállóvá vált M. tuberculosis törzsek megjelenését jelenti. A tuberkulózisos megbetegedések 5%-a MDR tuberkulózis. Ennek a formának a kezelése a másodvonalbeli antituberkulotikumokkal lehetséges. Ezek az antituberkulotikumok azonban az első vonalbeli hatóanyagokhoz képest lényegesen kevésbé hatékonyak, alkalmazásuk sokkal több és kellemetlenebb mellékhatással jár [11, 14]. A MDR törzsek csoportján belül megjelent egy ún. extenzíven rezisztens (extensively drug resistant, XDR) forma, amely már nemcsak az elsővonalas készítményekkel, de a jelenleg használt hat fajta második vonalas gyógyszer közül hárommal szemben is ellenálló. Évente 40 ezer XDR megbetegedést jelentenek [3]. A rezisztens törzsek többsége genetikai változások és az utólagos szelekció útján jön létre. A spontán létrejött ellenálló mutációk szelekcióját a gátlóanyag jelenléte biztosítja. A kemoterápia
során
megjelenő
gyógyszerrezisztencia
lehetőségének
minimumra
csökkentését azzal érik el, hogy a szövetekben és szervekben a hatóanyagnak olyan magas szintjét alakítják ki, mely elnyomja mind a kórokozó eredeti populációjának, mind az esetlegesen létrejött mutánsainak szaporodását. Továbbá két olyan hatóanyagot igyekeznek egyszerre alkalmazni, melyek alkalmazásakor keresztrezisztencia nem alakul ki, illetve a két hatóanyag megakadályozza a másikkal szemben kialakuló mutánsok szaporodását [15].
11
2.4. A hatóanyagok célbajuttatása konjugátumok alkalmazásával A betegség kezelésében alkalmazott antituberkulotikumok korlátozott mértékben, diffúzióval juthatnak be a fertőzött makrofágokba a sejtmembránon keresztül. A betegség kezelése hosszú (minimálisan 6-12 hónap), ezért számolni kell az antituberkulotikumok mellékhatásaival, így a szervezet egészét érintő nem specifikus toxicitásukkal. A szervezet kiválasztórendszere
gyorsan
kiürítheti
a
gyógyszert
a
véráramból.
A
hatóanyag
konjugátumok alkalmazása csökkentheti a mellékhatásokat, mivel lehetőséget adhat a hatóanyagok szelektív, specifikus célbajuttatására a fertőzött makrofágokba. Továbbá a hatóanyag
fokozatos
felszabadulása
a
konjugátumokból
retard
(elnyújtott)
hatást
eredményez és ezáltal a hatóanyag lassabban ürül ki a szervezetből. Hatóanyagok és a természetes, vagy a szintetikus eredetű makromolekulák konjugálása 50 évvel ezelőtt kezdődött. Jatzkewitz dipeptid spacert (más szóval: távolságtartó egységet) használt, hogy egy hatóanyagot polivinilpirrolidonhoz kapcsoljon [16]. Mások számos vízoldható polimer – hatóanyag konjugátumot szintetizáltak [17], hatóanyagot konjugáltak immunoglobulinokhoz. Leírtak olyan polimereket is, melyek irányítható célbajuttatóként használhatóak [18]. A gyógyszerhordozó rendszerek különféle egységekből épülnek fel. Inert szintetikus polimer hordozóra kapcsolják a hatóanyagot, aminosav vagy peptid spacerrel összekötve. A rendszer tartalmazhat még célbajuttató egységet [19] (6. ábra).
6. ábra: Egy gyógyszerhordozó rendszer sematikus ábrája
12
2.4.1. Anyagfelvétel a sejtmembránon keresztül A kemoterápiában használt kis molekulasúlyú gyógyszerek diffúzióval bejutnak bármilyen típusú sejtbe a sejtmembránon keresztül. A szelektivitás hiánya csökkenti ezeknek a vegyületeknek a hatékonyságát, továbbá nem kívánatos mellékhatások kialakulásához vezet. Az endocitózis során az anyagok felvétele korlátozott. Endocitózisnál a sejtet határoló membrán egy része körbeveszi, mintegy „elnyeli” a makromolekulát, majd belül leválik egy ún. intracelluláris hólyagot formálva, mely tartalmazza a bekerített makromolekulát. A hatóanyagok konjugációja hordozókhoz segíthet abban, hogy a gyógyszerkonjugátumokat specifikusan azokba a sejtekbe irányítsuk, amelyekben a kívánt hatást el akarjuk érni. A makromolekulák az endocitózist követően lizoszómákba kerülnek, ahol a hidrolítikus enzimek találhatóak. A polimerhordozó – hatóanyag kötés érzékeny a lizoszomális hidrolízisre, elbomlása során felszabadul a hatóanyag a célsejt citoplazmájában. Ilyen rendszerek tervezésénél két kritériumot kell figyelembe venni: (1) olyan gyógyszer – hordozó kémiai kötést kell tervezni, mely elbomlik a lizoszomális hidrolízis során, viszont képes ellenállni az enzimek működésének a véráramban; (2) fontos továbbá, hogy a konjugátum (hatóanyag – hordozó rendszer) felvétele specifikus legyen, csak a célsejtekbe kerüljön be hatóanyag, és minimálisan jusson be más sejtekbe. Az endocitózis szelektivitása javítható a molekula súlyának változtatásával, de nagyobb szelektivitás érhető el, ha specifikus célbajuttató egységet építenek be a makromolekulába. Célbajuttató részek lehetnek peptidek, fehérjék, szénhidrátok, szénhidrát származékok és antitestek, amelyek a célsejtre jellemző sejtfelszíni struktúrákat ismernek fel [19]. A sejtek felületén specifikus receptorok és antigének találhatók, melyek felismernek és kapcsolatba lépnek bizonyos típusú molekulákkal [19]. A hatóanyagok szelektív transzportja – antituberkulotikumok esetén – a fertőzött makrofágokba történhet receptor mediált endocitózissal. A hatóanyag molekulát olyan célbajuttató egységhez kapcsoljuk, amely specifikusan a makrofágok sejtfelszínén található struktúrához, receptorhoz kötődik. Ilyen receptorok lehetnek a scavenger és a tuftsin receptorok [20, 21]. A kötődés után a konjugátum bekerül a sejtbe, majd lizoszomális degradáción megy keresztül [22, 23]. A scavenger receptorok főként a makrofágok és a makrofágszerű sejtek felszínén expresszálódnak, a mintázatfelismerő receptorok közé tartoznak. Elsősorban a módosult LDL-t (low density lipoprotein, kis sűrűségű lipoprotein), – pl. oxidált LDL, acetilezett LDL – veszik fel a keringésből [24, 25.]. Továbbá ezek a receptorok polianionos ligandumok [26], endogén anyagok, anionos foszfolipidek, kollagén, zsírsavak, peptidek, apoptotikus sejtek, mikrobális lipopeptidek [27, 28] megkötésére képesek, melyek ezután bejutnak a sejtbe endocitózissal [29, 30]. 13
A makrofágokon, monocitákon megtalálható tuftsin receptor is alkalmas hatóanyagok célzott sejtbejuttatására. A tuftsin-konjugátum (a tuftsin a γ-globulinból származó frakció, egy tetrapeptid [31]) kötődése a receptorához nem csak az endocitózist segíti elő, hanem a makrofág aktiválódását is eredményezi. Az aktivált makrofág már képes az intracelluláris parazitákat elpusztítani [20, 23, 32, 33].
2.4.2. A hatóanyagok fertőzött makrofágokba történő célbajuttatására elméletileg alkalmazható hordozómolekulák bemutatása Az első konjugátumoknál természetes makromolekulákat használtak hordozóként. A szintetikus polimerek alkalmazása több előnnyel jár: (1) a molekulatömeg tartomány befolyásolható, (2) eltérően sok természetes makromolekulától, ezek a szintetikus hordozók általában nem immunogének, (3) a polimerláncok térhálósíthatók a gélképződési szint eléréséig [19]. Fehérjék széles köre használható hordozóként: egy mélytengeri csiga hemocianinja (keyhole limpet hemocyanin, KLH), marha szérum albumin (bovine serum albumin, BSA), ovalbumin (OVA), tetanusz toxoid (TT) és tisztított fehérje kivonatok (purified protein derivative, PPD). A természetes vegyületek alkalmas hordozók, mert növelik a kapcsolt epitóp immunogenitását, de jelentős hordozóspecifikus ellenanyagválasz kialakulása miatt, alkalmazásuk a humán terápiában nem ajánlott. Ezekkel a természetes eredetű hordozókkal ellentétben a szintetikus polimereknek és szekvenciális oligopeptideknek általában nincs immunogén hatása [34]. A szintetikus hordozókat polimerizációval előállított (pl. elágazó láncú polipeptidek, Nvinil-pirrolidon – maleinsav kopolimer) és diszkrét molekulákra oszthatjuk. Az előbbi csoporttal kapcsolatban problémaként felmerül a megfelelő jellemezhetőség, illetve a reprodukálhatóság hiánya, ami a klinikai alkalmazásuk komoly gátja. A kémiailag jól jellemezhető molekulák közül a legelterjedtebbek a lizin dendrimerek és a lizin tartalmú szekvenciális oligopeptidek. N-(2-hidroxipropil)-metakrilamid (HPMA) alapú szintetikus polimerek a daganatterápiában bizonyultak megfelelő hordozónak. Az ilyen polimerek oldhatóak vizes közegben és biokompatibilisek.
Továbbá
N-metakriloil
oligopeptidek
p-nitrofenilésztereinek
hozzákapcsolásával kombinálhatók sok olyan gyógyszerrel, melyek primer aminocsoportot tartalmaznak [35]. A kisebb méretű lineáris peptidek gyógyászatban való alkalmazását nehezíti, hogy az élő szervezetbe kerülve igen gyorsan lebomlanak, ezért nem jutnak el a kívánt hatás helyére. A terápiás alkalmazhatóság céljából nagy jelentősége van a peptidek makromolekuláris hordozókhoz való konjugálásának. Szintetikus hordozóként régóta alkalmaznak elágazó 14
láncú poli-α-aminosavakat, mert ezek a vegyületek megfelelőnek bizonyultak a természetes fehérjék modellezésére. Szemben a természetes antigénekkel, egyszerű, könnyen variálható szerkezettel rendelkeznek, ezáltal megkönnyítik az immunológiai eredmények értelmezését. Polilizin gerincű, elágazó láncú szintetikus polipeptideket Sela és munkatársai alkalmaztak először hordozóként [36]. Az oldalláncok N- vagy C- terminálisa egy optikailag aktív aminosavat tartalmaz. Az oldallánc végén lévő aminosav jelentős hatással van a molekula fiziko-kémiai, illetve biológiai tulajdonságaira. A peptidkonjugátumok előállításához az MTA-ELTE Peptidkémiai Kutatócsoportban kifejlesztett
szintetikus
polipeptidek
alkalmasak
hordozónak
(általános
képletük:
poli[Lys(Xi-DL-Alam)], (XAK), ahol i≅1, m≅2-4, és X: optikailag aktív aminosav). Ilyen polilizin gerincű, elágazó láncú polipeptid a SAK és az EAK (7. ábra).
7. ábra: A SAK és EAK polipeptidek sematikus vázlata A polilizin lánc kb. 100 lizinegységből épül fel, melyek ε-aminocsoportjaihoz átlagosan 3 DL-alaninból álló oligomer kapcsolódik. Az oldallánc N-terminálisához szerin illetve glutaminsav van kötve. A kemotaktikus receptorok érzékenyek a ligandum szerkezeti változásaira, megkülönböztetik a D-, L-aminosavakat [37]. Az EAK polipeptid amfoter karakterű molekula, a SAK polikationos, vízoldékonysága nagy a hidroxil csoportot tartalmazó szerin oldalláncok miatt. Hosszabb ideig stabilak a véráramban. Citotoxikus aktivitásuk nincs vagy elenyésző [38]. Az MTA-ELTE Peptidkémiai Kutatócsoportban vizsgálták a makrofágok polimerfelvételét. Összehasonlították a mintázatfelismerő scavenger receptoron keresztül a polilizin gerincű, elágazó láncú molekulák sejtbejutását [28, 30].
15
Az 1970-es évek elején Najjar és munkatársai azonosítottak egy frakciót a γ-globulinból (leukokinin), mely specifikusan kötődik a vér neutrofil granulocitáihoz, és monocitáihoz. Ez a molekula egy tetrapeptid, a tuftsin, melynek szekvenciája embernél: TKPR,
kutyánál:
TKPK.
A
szervezetben
a
tuftsint
két
enzim
hasítja
ki
a
γ-globulinból [31]. A tuftsin befolyásolja a fagocitózist, a kemotaxist, magas koncentrációban immunstimuláló, antimikrobális és daganatellenes hatása van. Ezek a tulajdonságok teszik a tuftsint figyelemreméltó hordozó jelöltté a sejtspecifikus célbajuttatásnál [39]. Egyéb természetes eredetű tuftsinanalóg tetrapeptidek (TRPR, TKPK, TRPK) is a tuftsinhoz hasonló tulajdonságokkal rendelkeznek [31]. Az MTA-ELTE Peptidkémiai Kutatócsoportban a hordozóként alkalmazható szekvenciális oligopeptidek egy új csoportját fejlesztették ki: az ismétlődő pentapeptid egységet tartalmazó oligotuftsin származékokat: [TKPKG]n (n=2, 4, 6, 8). Ezek a vegyületek jól jellemezhetőek, nem toxikusak, biodegradábilisak és tuftsinszerű biológiai tulajdonságokkal rendelkeznek [34]. Hatékonyan használhatók hatóanyag hordozóként fertőzött makrofágok esetében – mint a tuberkulózis vagy leishmaniasis – a liposzómához kapcsolt tuftsinszármazékok. A TKPR antimikrobiális aktivitása jelentősen növekedett azáltal, hogy a C-terminálishoz zsírsav származékot kapcsoltak etiléndiamin spaceren (távolságtartó egység) keresztül. A palmitoil tuftsint
tartalmazó
liposzómák
bejutnak
a
monocitákba,
a
makrofágokba
és
a
polimorfonukleáris (PMN) leukocitákba [40].
2.4.3. A hatóanyag – hordozó egység között kialakítható kémiai kötések típusainak bemutatása Az antituberkulotikum hatásának megőrzésében fontos a hatóanyag és a hordozó között lévő kötés kémiai jellege. A hatóanyag tulajdonságai előnytelenül változhatnak, ha a molekula nem funkcionálisan aktív, megfelelő kémiai szerkezettel szabadul fel. A konjugációnál leggyakrabban amid, észter, éter, oxim, tioéter, hidrazon és hidrazin jellegű kötéseket alkalmaznak (8. ábra). Az amidkötés kialakítását általában a lépésenkénti szintézis során alkalmazzák, a hordozó szabad aminocsoportja és a peptid aktivált karboxilcsoportja között jön létre. Ez a reakció azonban csak védett peptidekkel kivitelezhető. Diszulfidhídon
keresztül
való
kapcsoláshoz
nem-védett
peptidszármazékok
is
használhatók, de a konjugátumok stabilitása nem minden esetben megfelelő. Tioéterkötés kialakításával kemoszelektív ligációra van lehetőség. Így kémiailag stabilabb konjugátum állítható elő és a kapcsoláshoz nem kell védett peptideket alkalmazni. A tioéterkötést tartalmazó konjugátumok szintézise során az epitóppeptidet ciszteinnel 16
hosszabbítjuk, és ezt a származékot oldatban reagáltatjuk a hordozón kialakított haloacetilezett aminocsoporttal [34, 41]. A stratégia hátránya, hogy a cisztein tartalmú peptidek diszulfidhíd kialakításával dimerizálódnak lúgos közegben. Ez a mellékreakció különösen gyors abban az esetben, amikor a cisztein a peptid N-terminálisán van, és az N-terminális szabad aminocsoportként van jelen. A gyors dimerizáció kiküszöbölhető az N-terminális aminocsoport acetilezésével vagy a cisztein C-terminálisra kapcsolásával [42]. Hidrazon-, tiazolidin- és oximkötések kialakítása egy aldehidcsoport és egy gyenge bázis tulajdonságú oldallánc között megy végbe, savas közegben. Ezek a gyenge bázisos oldalláncok lehetnek aminooxicsoportok, hidrazincsoportok a peptid N-terminálisán [43]. Az oximkötés létrejöttét gyorsítja a poláris aprotikus oldószerek (DMF, DMSO) használata. Az oximkötés kialakítása során mellékreakciók is fellépnek. Az egyik ilyen reakció a többszörös aceileződés [44, 45]. Megfelelő megoldás az etoxietilidén védőcsoport használata, mely átmeneti oximkötést hoz létre (hasítás: 5% TFA 47,5% acetonitril, 47,5% víz, 1 óra) [46]. Az aminooxiacetil csoport stabil oximot képezhet a laboratóriumban jelen lévő aldehidekkel és ketonokkal, mint például az aceton, ezért ezen vegyületeket jelenlétét igyekeznünk kell kiküszöbölni a reakció alatt [47].
amid
oxim
-NH-CO-
-CH=N-Otiazolidin S
tioéter
diszulfidhíd
-CH2-S-CH2-
-CH2-S-S-CH2-
hidrazon
hidrazin
-NH-N=CH-
-NH-NH-CH2-
N H 8. ábra: A konjugálás során a hatóanyag és a hordozó molekula között kialakítható kötések A konjugátumból a hatóanyag felszabadulhat hidrolízissel (pl. észter- és amidkötés), enzimatikus degradációval vagy pH kontrollált reakcióval. Tam és munkatársai hidrazon-, tiazolidin- és oximkötést tartalmazó peptid dendrimerek stabilitásának pH függését vizsgálták. A tiazolidinkötésű vegyület stabil pH=3-9 oldatban; az oximkötésű származék savas és semleges pH-n stabil; a hidrazonkötésű konjugátum savas (pH=3) és lúgos (pH=9) oldatban disszociálódik [43, 48].
17
Zeng és munkatársai két epitóppeptidet kapcsoltak össze különböző kötésekkel, hogy tanulmányozzák a kötések befolyását a biológiai aktivitásra. A tioéterkötés nem változtatott a peptidek funkcionális
aktivitásán, az oximkötés enyhén, a diszulfidhíd jelentősen
csökkentette a funkcionális aktivitást [41].
2.4.4. A spacerek (távolságtartó egységek) szerepe a hatóanyag molekulák hordozóhoz történő kapcsolása során A hatóanyag és a polimerhordozó összekötéséhez a peptidek alkalmasnak bizonyultak. Különböző
enzimekkel
(pl.
kimotripszin,
tripszin,
papain,
katepszin
B)
végeztek
tanulmányokat, annak érdekében, hogy kiderítsék, milyen peptidek a legmegfelelőbbek erre a célra. A lizoszomális enzimek között nagy számban találunk proteázokat. A hatóanyag és a hordozó közé épített peptid spacerek degradálhatóak lizoszomális enzimekkel. Az elhasított kötés rendszerint a hatóanyag és a szomszédos aminosav között van. A lizoszomális hidrolízis hatásfokát a spacert alkotó aminosavak minősége, száma, valamint szerkezeti tényezők befolyásolják [19]. Irodalmi adatok alapján (elsősorban a proteolitikus enzimek peptidekkel alkotott komplexének szerkezetéről írt tanulmányok szerint) spacerként alkalmazhatóak az alábbi peptidek, amelyekben az alkotó aminosavakat egybetűs kódokkal jelöltem: GG, GFG, GFF, GLG, GVA, GFA, GLF, GLA, AVA, GFLG, GFFL, GLLG, GFYA, GFGF, AGVF, GFFG, GFLGF, GGFLGF [19]. Funkcionális vizsgálatokat folytattak különböző polimer hordozók, hatóanyagok és spacerek kombinációira. A GFLG szekvenciájú peptid spacer több kísérlet eredménye alapján is megfelelőnek bizonyult [19, 35].
2.4.4.1. A GFLG szekvencia spacer peptidként (távolságtartó egység) való alkalmazása A hatóanyagot peptid spaceren keresztül kapcsolhatjuk a hordozóhoz. A spacer konjugálása a hordozóhoz többféleképpen történhet. A ciszteinnel hosszabbított spacer konjugálását a tiolcsoporton keresztül szelektíven végre lehet hajtani. A diszulfidkötést tartalmazó konjugátumok biológiai rendszerekben való stabilitása sokat vitatott, előnyösebb a tioéterkötés kialakításán keresztül való kapcsolás. A tioéterkötés előnye, hogy nem igényel védett peptidet, kémiailag és biológiailag stabilabb kötést biztosít, nem antigén karakterű. A tioéterkötés
kialakítása
történhet
a
ciszteinnel
hosszabbított
konjugálandó
peptid
tiolcsoportja és a hordozó molekulán kialakított klóracetilezett aminocsoport között [34] (9. ábra). 18
PEPTID-NH-CH-CONH2
+
Cl-CH2-CO-NH-HORDOZÓ
CH2 SH -HCl
PEPTID-NH-CH-CONH2 CH2 S-CH2-CO-NH-HORDOZÓ
9. ábra: Tioéterkötés kialakítása klóracetilezett hordozó és cisztein tartalmú peptid között Az MTA-ELTE Peptidkémiai Kutatócsoportban a Herpes simplex vírus glikoproteinjének peptidepitópjait, Alzheimer-kór specifikus β-amiloid peptidet, és tumorellenes aktivitású GnRH-III peptidet ciszteinnel hosszabbítottak és közvetlenül, vagy spacer közbeékelésével klóracetilezett tetratuftsin származékhoz kapcsoltak tioéterkötésen keresztül. A konjugálás eredményességét növelte a spacer, a GFLG vagy oligoglicin szekvenciájú peptidek alkalmazása. Tanulmányozták a spacer régiónak a peptid dimerekhez vezető diszulfidhidak kialakulásában betöltött szerepét. A spacer szekvencia beépítésével csökkenthető a diszulfidhíd képződés valószínűsége, mert a spacer beépítése növelheti a konjugálási reakció sebességét, így csökkentheti a melléktermékként keletkező dimerek mennyiségét. A cisztein helyzete jelentősen befolyásolja a konjugálási reakciót és az intermolekuláris diszulfid dimerek létrejöttét [34]. A Kutatócsoportban előállítottak GFLG spacerrel módosított tetratuftsin származékot (Ac[TKPK(ClAc-GFLG)G]4-NH2). A peptid szintézise során a lizin oldallánc védőcsoportok különbözőek voltak, a szelektív kapcsolás miatt. A 2-es pozíciójú lizin ε-aminocsoportján 2-klórbenziloxikarbonil
(ClZ),
a
4-es
pozíción
9-fluorenilmetiloxikarbonil
(Fmoc)
védőcsoportot alkalmaztak. Az Fmoc-csoport szelektív hasítását követően a GFLG spacert a 4-es pozíciójú lizin oldalláncán építették be. A GFLG szakasz N-terminálisát klóracetilezték, a ciszteinnel hosszabbított epitóppeptiddel kialakították a tioéterkötést [34].
19
2.4.5. Antituberkulotikum – hordozó konjugátumok áttekintése Az irodalomban találunk példát antituberkulotikum hordozóhoz konjugálásáról: a PAS molekulát konjugálták maleilezett marha szérum albuminhoz (MBSA). A makrofágokon található MBSA kötőhelyek, sejtfelszíni receptorok segítségével a konjugátum hatékonyan bejutott a sejtekbe. A lizoszómában hidrolízis útján felszabadult a hatóanyag aktív formája. A kísérleteket egérből származó fertőzött peritoneális makrofágokon végezték. A vizsgálatok alapján a konjugátum százszor hatékonyabban pusztította el az intracelluláris M. tuberculosis baktériumokat, mint a szabad PAS. Tehát a konjugátum alkalmazásával a hatékonyság eléréséhez nem szükséges akkora mennyiség, mint a szabad PAS esetén. Hasonló eredményeket értek el acetilezett lipoproteinek hordozóként való alkalmazásával is [49]. A RAMP antituberkulotikum alkalmazása során tuftsinnal konjugált, foszfatidilkolinból álló liposzóma belsejébe juttatták be a hatóanyagot, és így meghosszabbodott terápiás hatást értek el [40]. Az MTA-ELTE Peptidkémiai Kutatócsoportban INH antituberkulotikumot tartalmazó peptidkonjugátumokat terveztek, és ezek biológiai aktivitását vizsgálták. Hordozóként tuftsinszármazékokat (GTKPKG (T6), és [TKPKG]4 (OT20)) [42] és az M. tuberculosis immundomináns 16 kDa fehérjének egy T-sejt epitóppeptidjét (91SEFAYGSFVRTVSLPV106) választották [50, 51]. Az INH hordozóhoz konjugálása során kétféle szintézis módszert alkalmaztak. A munka célja a kémiai kötés funkcionális aktivitásra kifejtett hatásának vizsgálata volt. Egyik esetben az epitóppeptidet szerinnel hosszabbították, majd szelektíven oxidálták NaIO4-tal. Az INH-t közvetlenül a peptidhez kapcsolták hidrazonkötés kialakításával (10.
ábra).
A másik
esetben az INH-t glioxilsavval módosították,
a keletkezett
izonikotinoilhidrazono-ecetsavat NaBH3CN-del redukálták izonikotinoilhidrazino-ecetsavvá. Az aktivált (DIC/HOBt) izonikotinoilhidrazino-ecetsav reagált a még gyantán lévő peptid aminocsoportjával, amidkötés létrejötte során (11. ábra). Ezen vegyületek segítségével tanulmányozták a kémiai átalakítások hatását az INH in vitro antituberkulotikus aktivitására. Mindegyik konjugátum hatásosnak bizonyult a M. tuberculosis H37Rv tenyészeten [50].
20
pH 8,2
NH2-CH-CO-PEPTID
O=CH-CO- PEPTID
NaIO4
pH 4,6
CO-NH-N=CH-CO- PEPTID
CO-NH-NH2
CH2OH Ser -PEPT ID
hidr azon
izoniazid N N
10. ábra: Izoniazid konjugálása peptidaldehidhez hidrazonkötés kialakításával
CO-NH-N=CH-COOH
CO-NH-NH2
O=CH-COOH glioxilsav
N izoniazid
N izonikotinoilhidrazono-ecetsav NaBH3CN
CO-NH-NH-CH2-COOH
CO-NH-NH-CH2-CO-NH-PEPTID-
HOBt DIC hidr azid
NH2-PEPTIDN
N
izonikotinoilhidrazino-ecetsav
11. ábra: Izoniazid-peptid konjugátum kialakítása szilárdfázison hidrazidkötés létrejöttével
2.5. Új, lehetséges antituberkulotikumok meghatározása in silico módszerek alkalmazásával A rezisztens és multirezisztens törzsek terjedése miatt egyre nagyobb szükség van új típusú antibiotikumokra. Új hatóanyagok keresése történhet ún. in silico módszerek segítségével. A baktérium anyagcseréjében kis molekulatömegű vegyületek létfontosságú enzimekhez való kötődését (és ezen keresztül közvetve ezen enzimek gátlását) dokkolóalgoritmusok alkalmazásával lehet jósolni. Az in silico módszer lényege, hogy ismert háromdimenziós (NMR, vagy röntgenkrisztallográfia) szerkezettel rendelkező fehérjékhez dokkolják egy több millió molekulából álló vegyülettár elemeit. A kísérletekben használt 21
molekulatár a nyilvános Zinc adatbázis (Zinc – a free database for virtual screening, http://zinc.docking.org/) [52, 53]. A M. tuberculosis túléléséhez fontos enzimekhez kötődő vegyületeket egy újonnan kifejlesztett dokkolási algoritmus segítségével az ELTE Számítógéptudományi Tanszékén Dr. Grolmusz Vince kutatócsoportjában határozták meg. A ligandumok dokkolása a DUTPáz enzimhez történt, mely a baktérium anyagcseréjében kulcsfontosságú szerepet játszik [54]. Az így talált molekulák in vitro antibakteriális hatása meghatározható. Az in vitro antibakteriális hatást mutató vegyületek hatékonysága ezután szintetikus optimalizálási lépések sorozatával javítható, így az eredeti kiindulási vegyületek lehetséges gyógyszer jelölt molekulákká alakíthatók.
22
3. CÉLKITŰZÉS A dolgozatban összefoglalt munka célja a fertőzött makrofágokba való szelektív célbajuttatásra
alkalmas
hatóanyag
–
hordozó
konjugátumok
előállítása
és
funkcionális vizsgálata volt: •
peptid típusú távolságtartó egység és hordozómolekulák előállítása szilárdfázisú peptidszintézissel, a vegyületek kémiai jellemzése;
•
új in silico meghatározott és in vitro antituberkulotikus hatású vegyületek származékainak oligo-, illetve polipeptid típusú hordozómolekulákhoz kapcsolása, a konjugátumok kémiai jellemzése;
•
a hatóanyag-hordozó konjugátumok in vitro antituberkulotikus hatásának vizsgálata M. tuberculosis H37Rv tenyészetén;
•
fluoreszcensen jelölt konjugátumok előállítása és kémiai jellemzése;
•
fluoreszcens
származékok
in
vitro
citométerrel.
23
sejtbejutásának
vizsgálata
áramlási
4. A KÍSÉRLETI MÓDSZEREK ELMÉLETI ALAPJAINAK ÁTTEKINTÉSE
Ebben a fejezetben foglaltam össze röviden az általam alkalmazott módszerek elméleti hátterét. A kísérleti munkám leírásai, illetve a műszeres mérések körülményei az 5. fejezetben olvashatók.
4.1. Szilárdfázisú peptidszintézis A szintetikus munka során a peptideket szilárdfázisú peptidszintézissel állítottam elő. A szilárdfázisú szintézis lényege, hogy az első aminosavat hozzákapcsoljuk egy szilárd hordozóhoz, majd újabb aminosavat kapcsolunk az előzőhöz, és az egyenkénti kapcsolást a kívánt lánchossz eléréséig folytatjuk. A szintézis C-terminális – N-terminális irányban halad, mert így kisebb az epimerizáció előfordulásának valószínűsége. A szintézis során olyan aminosavszármazékokat
használunk,
melyek
nukleofil
oldalláncaikon
állandó
védőcsoportokkal, az α-NH2 csoportjaikon pedig átmeneti védőcsoportokkal vannak ellátva. Egy aminosav kapcsolása előtt az előző aminosavszármazékról az átmeneti Nαvédőcsoportot eltávolítjuk és a kapcsolni kívánt aminosavszármazék karboxil-terminálisát aktiváljuk. A kész peptidet lehasítjuk a hordozóról, és ezzel egy időben távolítjuk el az állandó oldallánc védőcsoportokat is. A szilárdfázisú módszer nagy előnye, hogy az aminosavakat és egyéb reagenseket a reakció végén egyszerű szűréssel el lehet távolítani. A lehasított peptid oldatát szintén szűréssel lehet megkapni. Az oldatból a peptid hosszadalmas tisztítási lépések mellőzésével, viszonylag tisztán különíthető el. A szilárdfázisú
peptidszintézisnek
két,
széles
körben
elterjedt
stratégiája
van,
a
terc-butiloxikarbonil/benzil (Boc/Bzl) módszer és a 9-fluorenilmetiloxikarbonil/terc-butil (Fmoc/tBu) módszer.
4.1.1. A Boc/Bzl módszer A Boc/Bzl módszer a különböző erősségű savakra érzékeny (átmeneti) és kevésbé érzékeny (állandó) védőcsoportokon alapul. A terc-butiloxikarbonil (Boc) védőcsoport lúgokkal és nukleofil reagensekkel szemben stabil, de szervetlen vagy szerves savakkal eltávolítható [55]. Hasítóelegyként 33% trifluorecetsav (TFA) / 67% DCM V/V elegyet alkalmazunk. Mivel az acidolízis során az Nα-aminocsoport trifluoracetát sója jön létre, ezért a hasítás után semlegesítenünk kell. Ekkor tercier-amin hatására jön létre a szabad Nαaminocsoport. Semlegesítő elegyként a 10% diizopropiletilamin (DIEA) / 90% DCM V/V elegyét használjuk. A Boc/Bzl módszernél az oldallánc védőcsoportok a benzil-alkohol éter-,
24
észter- ill. uretán- származékai [56]. Ezek az oldallánc védőcsoportok csak erős savak jelenlétében hasíthatóak, tehát a Boc-csoport lehasítása során stabilak maradnak. A szilárd hordozóról a peptidet és az oldallánc védőcsoportokat hidrogén-fluorid (HF) segítségével távolítottuk el, teflon készülékben, gyökfogók jelenlétében.
4.1.2. Az Fmoc/tBu módszer Az Fmoc/tBu szintézis stratégia kiküszöböli a Boc/Bzl stratégia hátrányait: 1. az állandó és átmeneti védőcsoportok is savérzékenyek, 2. a speciális készüléket igénylő HF alkalmazása
[57].
Ezen
módszer
esetében
az
aminosavszármazékok
átmeneti
védőcsoportja a 9-fluorenilmetiloxikarbonil-csoport (Fmoc), mely savakkal szemben stabil, bázisokkal szemben viszont labilis. A hasítást 2% piperidin / 2% DBU / 96% DMF V/V hasítóelegyével végezzük. A hasítás során dibenzofulvén átmeneti termék keletkezik, mely reaktív, de a piperidinnel stabil adduktot képez, ezáltal elkerülhetőek az alkileződési mellékreakciók. Bizonyos peptidszekvenciák esetében a kísérletek azt igazolták, hogy a 2% piperidint és 2% 1,8-diazabiciklo[5.4.0]-undek-7-ént (DBU) tartalmazó eleggyel gyors, hatékony hasítás érhető el, ezen kívül csökkenthető az enantiomerizáció valószínűsége és nagyobb az effektív hasítás mértéke térbeli gátlás esetén [58-60]. Az állandó oldallánc védőcsoportok (tBu, OtBu, Boc, Trt, stb.) hasítása és a peptidek gyantáról való eltávolítása általában TFA-val történik [56]. Mivel a hasítás során reaktív karbokationok keletkeznek, gyökfogók használata szükséges.
4.1.3 A peptidkötés kialakítása a szintézis során A peptidkötést a gyantához kötött szabad N-terminálisú aminosav vagy peptid és a karboxilcsoportján aktivált és aminocsoportján védett aminosavszármazék között alakítjuk ki. A kapcsolás in situ aktív észter kialakításával történik. A használt kapcsolószerek a DIC és a HOBt. A DIC O-acil-izourea származékot képez az aminosavszármazék karboxilcsoportjával és ez acilezi a szabad aminocsoportot HOBt jelenléte nélkül, N,N’-diizopropil-urea képződése mellett. A karbodiimidek felhasználhatók aktív észterek kialakításhoz is, amelyeket in situ a reakcióelegyben 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) segítségével alakítanak ki. Ezáltal gyors kapcsolás érhető el és az aszparagin és glutamin esetében a dehidratáció megelőzhető [61, 62].
25
4.1.4. A kapcsolási reakciók követése A kapcsolás és védőcsoport eltávolítás végbemenetelét Kaiser (ninhidrin)-próba és izatin-próba segítségével ellenőrizzük [63]. Kaiser-próba a szabad amino-terminálissal rendelkező (primer aminocsoport) aminosav- és peptidszármazékok kimutatására alkalmas. A keletkező vegyület sötét ibolya színű (abszorpciós λmax = 570 nm) primer aminocsoportot tartalmazó α-aminosavak esetén (12. ábra). A szekunder aminocsoportot tartalmazó prolin esetében a keletkező vegyület sárga színű (abszorpciós λmax = 440 nm), ezért a szilárdfázisú peptidszintézisnél alkalmazott gyanták szintén sárga színe miatt nem érzékelhető. Az izatinpróba a szabad iminocsoportok jelenlétét jelzi [64], ezt alkalmazzuk a prolin N-terminálisának védőcsoport eltávolításának ellenőrzésére, valamint a prolin utáni aminosav kapcsolás sikerességének ellenőrzésére.
O
OH
O
OH 2
+ OH
H2N
CH
N
COOH -3 H2O
R
-CO 2
O
O
O
-RCHO
12. ábra: A ninhidrin a primer aminocsoportot tartalmazó α-aminosavakkal a fenti reakcióba lép, a keletkező vegyület sötét ibolya színű
4.2. Szintetikus peptidekben a cisztein oxidációs állapotának meghatározása Sok esetben a konjugátumokban a hordozót és a spacerpeptidet, vagy a hatóanyag származékot tioéterkötésen keresztül kapcsoljuk egymáshoz. A tioéterkötés kialakítását a cisztein tiolcsoportja és egy haloacetilezett csoport között végezzük. A szintetikus peptidek cisztein tartalmának meghatározására a klasszikus aminosavanalízis módszere nem mindig alkalmas, mert a cisztein a hidrolízis során cisztinné oxidálódhat. A megfelelő jellemezhetőség érdekében pontosan ismernünk kell az adott vegyületben a cisztein oxidációs állapotát. Az oxidáció a szintézis vagy a peptid tárolása során is bekövetkezhet, így nem lehet megállapítani, hogy az oxidáció az analízis előtt vagy után történt. További probléma a cisztein meghatározásánál az ioncserélő kromatográfiás elválasztást követő ninhidrines származékképzés alapú módszer esetén, hogy a cisztein és a prolin retenciós ideje közel azonos. Ezen problémák miatt szükséges egy módszer a szintetikus cisztein tartalmú peptidek szabad tiolcsoportjának mérésére. Erre a célra megfelelőnek bizonyult a szabad tiolcsoport és az N-etilmaleimid (NEM) reakciója (13. ábra). A reakció rövid idő alatt, 26
semleges vagy enyhén bázisos közegben végbemegy. A peptidet N-etilmaleimiddel reagáltatva stabil S-(N-etilszukcinimido)-származék keletkezik, mely molekula RP-HPLC körülmények
között
elválasztható
a
kiindulási
peptidtől,
és
tömegspektrométerrel
azonosítható. A kvantitatív meghatározáshoz kevesebb, mint 0,1 µM peptid elegendő [65]. O
O SH H2C
PBS +
N
Et pH 7,0
-NHCHCO-
S H2C
Et
-NHCHCOO
O cisztein oldallánc
N
N-etilmaleimid
S-(N-etilszukcinimido)-szár mazék
13. ábra: N-etilmaleimid reakciója ciszteintartalmú peptiddel
4.3. Minimális gátló koncentráció és telepszám meghatározása Az antibiotikumok hatásának kvantitatív jellemzésére a minimális gátló koncentráció (minimal inhibitory concentration, MIC) meghatározása szolgál. A MIC az a legkisebb hatóanyag mennyiség, amely 1ml térfogatban gátolja a baktériumtörzs szaporodását. Mértékegysége µg/ml, mg/l. A MIC érték meghatározását folyékony táptalajban ún. hígításos leves módszerrel végezzük, ahol az adott antibiotikumra nézve csökkenő koncentrációjú csöveket befertőzzük a baktérium megfelelő sűrűségű szuszpenziójával [2]. A minimális gátló szintet annak a csőnek a vegyület koncentrációja jelenti, amelyben a kellő időtartamú inkubálás után szabad szemmel még nem észleltünk növekedést. A minimális gátló koncentráció értéke függ az alkalmazott táptalajtól, a táptalaj pH értékétől, az inokulum (az oltáshoz felhasznált mikróba-sejttömeg) kolónia számától, az inkubáció hőmérsékletétől, atmoszférájától és időtartamától. A baktériumok esetében ez a jelenség a mikroszervezetek gyors adaptív tulajdonságával magyarázható, nem örökletes, modifikatív sajátság. A MIC leolvasást követően a baktériumnövekedést nem mutató csövekből szilárd táptalajra való kioltással meghatározható a telepszám (colony forming unit, CFU). A telepszámlálásos módszerek alkalmazhatóságának alapfeltétele, hogy a táptalajokon kinőtt telepek egyetlen sejt szaporodásából származzanak, és a telepek számolhatók legyenek, vagyis a cél olyan lemeztenyészetek előállítása, amelyen az egyedülálló telepek száma 10300 közötti. A CFU/ml érték megadja, az adott minta esetében, az egységnyi térfogatban jelenlévő életképes sejtek közelítő számát, amelyekből a számolható telepek kifejlődtek. A módszer lényegét a 14. ábra foglalja össze. 27
14. ábra: Minimális gátló koncentráció (MIC) és telepszám (CFU) meghatározásának sematikus vázlata
28
4.4. Az áramlási citometria Az áramlási citometria [66] alkalmazásával egyszerre mérhető önálló részecskék és sejtek fényszórási és fluoreszcens tulajdonsága. A mérhető sejtek vagy részecskék átmérője körülbelül 0,2 µm és 150 µm közé esik. Az áramlási citométer vázlatos felépítését mutatja be a 15. ábra.
elektronika
folyadékrendszer optikai rendszer
lézer
detektorok
15. ábra: Egy áramlási citométer vázlatos felépítése, forrás: http://probes.invitrogen.com Az áramlási citométer több lézert is tartalmazhat. Ezek lehetnek szilárdtest lézerek (355 nm, 405 nm, 488 nm) és gázlézerek (633 nm). A készülékben folyadékáram továbbítja a sejteket. A hidrodinamikai fókuszálás biztosítja, hogy a sejtek vékony sugárban, egymás után haladjanak és a lézersugár egyenként világítsa meg őket. A sejtek a lézersugár elé kerülve kölcsönhatásba lépnek azzal, a lézersugár fénye részben szóródik, részben a sejtek előre megfestett molekuláiból fénykibocsátást vált ki (16. ábra). Az ún. előre irányuló fényszórás (forward scatter, FSC) a sejt relatív méretéről, míg az oldalra irányuló fényszórás (side scatter, SSC) a relatív granuláltságáról, belső komplexitásáról ad információt. A fluoreszcencia intenzitásból fluoreszcens anyagok, vagy fluoreszcens jelzéssel ellátott vegyületek sejtbejutásáról kapunk információt. A sejtekben jelen vannak fluoreszcens sajátságú molekulák (aminosavak, porfinvázas vegyületek, nukleinsavak, klorofill stb.), ezek
29
adják a sejtek autofluoreszcenciáját, melyet az áramlási citométerrel detektálni lehet. A legtöbb esetben a részecskéket és a sejteket ún. fluoreszcens festéssel teszik „láthatóvá” a citométer számára. A megfelelő fluoreszcens festék (fluorofór) kiválasztása függ az alkalmazott megvilágítás
hullámhosszától,
a fluorofórok
abszorpciós
és
emissziós
tulajdonságától. A sejtek és a lézerfény kölcsönhatása következtében emittálódó fényt az optikai rendszer segítségével továbbítják a megfelelő detektorok felé. A sejtek autofluoreszcenciájához viszonyítva a fluoreszcensen jelölt peptidszármazékok felvételének mértéke detektálható. Fluoreszcens jelölésre sokféle fluorofór használatos. A leggyakrabban használt az 5(6)-karboxifluoreszcein, a karboxirodamin, és ezek izotiocianát és szukcinimidil-észter származékai. Elterjedtek még pl. danzilklorid, fluoreszkamin, o-ftálaldehid,
9-fluorenilmetiloxikarbonil
(Fmoc),
kumarinszármazékok,
nitrobenzofurán
származékok [67-70].
előre irányuló szórás
oldalirányú szórás
fluoreszcencia
16. ábra: Egy sejt kölcsönhatása a lézersugárral, forrás: http://probes.invitrogen.com
30
5. A KÍSÉRLETI MUNKA 5.1. A peptidek és peptidszármazékok szintézise A következő szekvenciájú peptidamidokat állítottam
elő manuális
szilárdfázisú
szintézissel: H-GFLGC-NH2, és H-[TKPKG]2C-NH2. A H-GFLGC-NH2 peptidet Boc/Bzl stratégia, a H-[TKPKG]2C-NH2 peptidet Fmoc/tBu stratégia alkalmazásával szintetizáltam.
5.1.1.
A
H-GFLGC-NH2
peptidamid
és
származékainak
szintézise
Boc/Bzl
stratégiával A
szintézishez
4-metilbenzhidrilamin
(MBHA,
kapacitása:
1,2
mmol/g)
gyantát
használtam, az aminosavakat Nα-Boc-származék formájában kapcsoltam. A felhasznált Bocaminosavak közül csak a cisztein oldalláncán volt védőcsoport: 4-metilbenzil-védőcsoport (4MeBzl). Az MBHA gyanta hidroklorid formában kerül kereskedelmi forgalomba, ezért a gyantát a DCM-ben történő duzzasztás után 33% TFA / 67% DCM V/V hasítóelegyével kezeltem 5 + 30 percig, majd a DCM-mel való ötszöri mosást követően 10% DIEA / 90% DCM V/V elegyével 5 x 1 percig semlegesítettem, ezután újból mostam ötször DCM-mel. A gyantához az előkezelés után kapcsoltam az első Boc-aminosav származékot, a Boc-Cys(4-MeBzl)OH-t. A gyantakapacitásra számolva háromszoros moláris feleslegben adtam az aminosavszármazékot, és az in situ aktív észter kialakításához szükséges kapcsolószereket (DIC, HOBt) DCM-ben oldva. Az egy órás kapcsolási idő lejárta után DCM-es mosási lépés következett. Ezután Kaiser-próbával ellenőriztem a kapcsolás sikerességét. Pozitív Kaiserpróba esetén a kapcsolást meg kell ismételni. A Boc-védőcsoportot minden esetben a gyanta előkezelésénél leírt hasítóeleggyel (33% TFA / 67% DCM V/V) távolítottam el, majd a DCM-mel való mosást követően semlegesítettem 10% DIEA / 90% DCM V/V eleggyel. A szintézis egy ciklusának menetét a 2. táblázat foglalja össze.
31
Művelet Boc-védőcsoport eltávolítása
Reagens, oldószer
Időtartam (perc)
2 x 2-4 ml hasítóelegy (33% TFA / 67% DCM V/V)
5 + 30
gyanta mosása
5 x 2-5 ml DCM
5x1
semlegesítés
5 x 2-5 ml elegy (10% DIEA / 90% DCM V/V)
5x1
gyanta mosása
5 x 2-5 ml DCM
5x1
kapcsolás
3 ekvivalens (gyanta kapacitásra számított) Boc-aminosav / DCM ekvimoláris HOBt / DCM ekvimoláris DIC / DCM
gyanta mosása
5 x 2-5 ml DCM
kapcsolási reakció követése
Kaiser (ninhidrin)-próba
60 5x1 5
2. táblázat: A Boc/Bzl stratégia szerint végzett szilárdfázisú peptidszintézis egy ciklusának menete A gyantán lévő peptid egy részére aminooxiecetsavat kapcsoltam. Lehasítottam az Nterminális Boc-védőcsoportját, DCM-es mosás, semlegesítés, majd újabb mosás után 3 ekvivalens Boc-aminooxiecetsavat, HOBt-t, PyBOP-ot és 6 ekvivalens DIEA-t adtam NMPben oldva. A kapcsolási reakció ideje 1 óra volt. A peptidhez kapcsolt aminooxiacetil csoportról eltávolítottam a Boc-védőcsoportot a TFA tartalmú hasítóeleggyel. A kapcsolás és védőcsoport eltávolítás végbemenetelét Kaiser-próba segítségével ellenőriztem. A Kaiser-próbához szükséges oldatok összetétele: 1. ninhidrin / etanol 10:1 (m/V), 2. fenol / etanol 4:1 (m/V), 3. piridin / víz 98:2 (V/V) 4 µmol/liter KCN-dal. Egy kisebb kémcsőbe kevés gyantaszemet rakunk és erre a 3 reagensből 1.-3. sorrendben 2-2 cseppet adunk, majd a kémcsövet 105°C-on tartjuk 5 percig. A szilárd hordozóról a peptidet, az aminooxiacetil-peptidet, és a peptidek oldallánc védőcsoportjait hidrogén-fluorid (HF) segítségével távolítottam el. A hasítást teflon készülékben
végeztem,
0°C-on
1,5
óráig,
gyökfogók
(p-krezol,
1,4-DL-ditiotreitol)
jelenlétében. 0,5-1,0 g peptidre átlagosan 10 ml HF-ot számolva 0,5 g p-krezolra és 0,1 g 1,4-DL-ditiotreitolra volt szükség. Hasítás után a HF-ot a gyanta – peptid elegyről ledesztilláltam, majd a hasítási terméket kicsaptam hideg éterrel, ezután szűrtem. A szűrés után kevés A eluens (0,1% TFA / víz V/V) segítségével kioldottam a peptidet a szűrőn a gyantaszemek közül. Az oldatot lefagyasztottam, majd liofilizáltam. Az amniooxiacetilpeptidek szintézise és feldolgozása során mindvégig kerültem az aceton és egyéb ketonok, aldehidek használatát.
32
5.1.2. A H-[TKPKG]2C-NH2 peptidamid és származékainak szintézise Fmoc/tBu stratégiával A szintézishez Rink Amide MBHA gyantát használtam, az aminosavakat Nα-Fmocszármazék formájában kapcsoltam. A felhasznált Fmoc-aminosavak oldalláncai a 3. táblázatban felsorolt védőcsoportokat tartalmazták. aminosav
funkciós csoport
védőcsoport
rövidítés
Lys
amino
terc-butiloxikarbonil
Boc
Thr
hidroxil
terc-butil
tBu
Cys
tiol
tritil
Trt
Gly, Pro
oldallánc védőcsoport nélkül
3. táblázat: Az Fmoc/tBu stratégia szerint végzett szintézishez használt Fmocaminosavszármazékok oldallánc védőcsoportjai A Rink Amide MBHA gyanta (kapacitása: 0,65 mmol/g) Fmoc-védőcsoporttal ellátva kerül kereskedelmi forgalomba. Az Fmoc-védőcsoport eltávolítása érdekében a gyantát a DMFben történő duzzasztás után 2% piperidin / 2% DBU / 96% DMF V/V hasítóelegyével kezeltem 2 + 2 + 5 + 10 percig, majd DMF-fel ötször mostam. Az Fmoc/tBu stratégiánál nem kell semlegesítési lépést alkalmazni. A gyantához az előkezelés után kapcsoltam az első Fmoc-aminosav származékot, az Fmoc-Cys(Trt)-OH-t. A gyantakapacitásra számolva háromszoros moláris feleslegben adtam az aminosavszármazékot, és az in situ aktív észter kialakításához szükséges kapcsolószereket (DIC, HOBt) NMP-ben oldva. Az egy órás kapcsolási idő lejárta után DMF-es mosási lépés következett. Ezután Kaiser-próbával ellenőriztem a kapcsolás sikerességét. Pozitív Kaiser-próba esetén a kapcsolást meg kell ismételni. A prolinhoz való kapcsolás ellenőrzéséhez az izatin-próbát alkalmaztam, mely hasonló a Kaiser-próbához, de itt még van egy 4. reagens, melynek összetétele 3% izatin, 5% Boc-Phe-OH / benzilalkohol volt, melyet a Kaiser-próba reagnesei előtt csepegtettünk a gyantaszemekhez. Az Fmoc-védőcsoportot minden esetben a gyanta előkezelésénél leírt hasítóeleggyel (2% piperidin / 2% DBU / 96% DMF V/V) távolítottam el, majd DMF-fel mostam. A szintézis egy ciklusának menetét a 4. táblázat foglalja össze.
33
Művelet Fmocvédőcsoport eltávolítása
Reagens, oldószer
Időtartam (perc)
gyanta mosása
5 x 2-5 ml DMF
kapcsolás
3 ekvivalens (gyanta kapacitásra számított) Fmoc-aminosav / ekvimoláris HOBt / NMP ekvimoláris DIC / NMP
gyanta mosása
5 x 2-5 ml DMF
kapcsolási reakció követése
Kaiser (ninhidrin)-, izatin-próba
4 x 2-4 ml hasítóelegy (2% piperidin / 2% DBU / 96% DMF V/V)
2 + 2+ 5 + 10 5x1 60 5x1 5
4. táblázat: Az Fmoc/tBu stratégia szerint végzett szilárdfázisú peptidszintézis egy ciklusának menete A
gyantán
lévő
peptidre
Boc-aminooxiecetsavat
kapcsoltam.
Lehasítottam
az
N-terminális Fmoc-védőcsoportját, DMF-es mosás után 3 ekvivalens Boc-aminooxiecetsavat, HOBt-t és DIC-et adtam NMP-ben oldva. A kapcsolási reakció ideje 1 óra volt. Az
Fmoc/tBu
módszernél
az
oldallánc
védőcsoportokat,
az
N-terminális
Boc-
védőcsoportot és a peptidet a gyantáról TFA-val távolítottam el. A hasítás során keletkező reaktív karbokationok miatt 2,5% vizet, 2,5% TIS-t tartalmazó TFA elegyet használtam.
5.1.3. Az in silico meghatározott hatóanyag jelöltek származékainak (vegyület 102 és 103) konjugálása A gyakorlati munkám során két, in silico meghatározott vegyület származékát kapcsoltam peptidszármazékokhoz. A ligandumok szerkezetét nem mutatom be a dolgozatomban. A vizsgált hatóanyag jelöltek (kódjuk: 102 és 103) in vitro antituberkulotikus hatással rendelkeznek M. tuberculosis H37Rv törzsön. Mindkét hatóanyag jelölt heteroaromás vegyület, és tartalmaznak aldehidcsoportot, melyeken keresztül oximkötéssel valósítható meg a konjugálás. A gyantáról lehasított, RP-HPLC segítségével megtisztított aminooxiacetil-GFLGC-NH2 (továbbiakban: Aoa-GFLGC-NH2) peptidszármazékhoz a 102-es kódú vegyületet kapcsoltam. A kapcsolás oximkötés kialakításával történt. 10,4 mg Aoa-GFLGC-NH2-t feloldottam 1 ml piridin / metanol / víz 1:4:1 V/V elegyében, majd 2 ekvivalens 102-es anyagot adtam hozzá. A reakcióelegyet 24 órán át kevertettem. Az oldatból óránként mintát vettem, hogy a reakció előrehaladását vizsgálhassam analitikai RP-HPLC segítségével.
34
A 103-as vegyületet az aminooxiacetil-[TKPKG]2C-NH2-hez (továbbiakban: Aoa-OT10Cys) kapcsoltam szintén oximkötésen keresztül. 45 mg Aoa-OT10-Cys-t feloldottam 0,5 ml nátrium-acetát oldatban (pH=5,08). 3 ekvivalens 103-as anyagot feloldottam 0,5 ml DMFben, majd az oldatokat összeöntöttem, a reakcióelegy oldószeraránya NaOAc / DMF 1:1 V/V. Az oldatból óránként mintát vettem és analitikai RP-HPLC-vel vizsgáltam a reakció előrehaladását.
5.2. A hordozóban a cisztein oxidációs állapotának ellenőrzése a konjugálási reakciót megelőzően A megtisztított 103-Aoa-OT10-Cys-ből PBS pufferrel (pH=7,04) 1 mg/ml-es oldatot készítettünk, majd felvettük az oldat analitikai RP-HPLC kromatogramját. Az oldathoz 1,1 ekvivalens NEM-törzsoldatot (10 mg/ml-es etanolos oldat) adtunk, és erről az elegyről is készítettünk analitikai RP-HPLC kromatogramot.
5.3. A hordozó peptiszármazék dimerizációjának követése a konjugálási reakciót megelőzően A cisztein tartalmú peptidek bázikus közegben diszulfidhídon keresztül dimereket képezhetnek, mely reakció verseng a tioéterkötés kialakulásával. A konjugálás előtt ezért dimerizációs próbát végeztünk, hogy a reakció körülményeit meghatározhassuk. A megtisztított 103-Aoa-OT10-Cys-ből 0,1 M TRIS pufferrel (pH=8,12) 0,5 mg/ml-es oldatot készítettünk. Az oldatot kevertettük, és óránként mintát vettünk belőle. A mintákat analitikai RP-HPLC-vel vizsgáltuk, hogy a cisztein oxidálódásának gyorsaságáról kapjunk információt.
5.4. A konjugálási reakcióban alkalmazott klóracetilezett SAK származék előállítása A hordozón klóracetilcsoport jelenléte szükséges, hogy a ciszteinnel hosszabbított peptideket
tioéterkötésen
klóracetilezését
keresztül
konjugálhassuk
klórecetsav-pentaklórfenilészter
hozzá.
(ClAc-OPcp)
A
hordozó
reagens
molekulák
segítségével
állítottam elő. A reakcióban felhasznált poli[Lys(Ser0,90-DL-Ala2,60)] (SAK) jellemzői a következők: Ser : Ala : Lys = 0,90 : 2,60 : 1,00 (aminosavanalízis alapján, 5.8.3. fejezet), a monomer számított móltömege: 409,35 g/mol. 120 mg SAK-ot feloldottam 2 ml víz és 9 ml DMF elegyében. A monomerre számított 2 ekvivalens ClAc-OPcp-t 9 ml DMF-ben oldottam és hozzáadtam a feloldott SAK-hoz, így az oldószerarány víz / DMF 1:9 V/V. A reakcióelegyet egy éjszakán át kevertettem. Ezután dialízishártyába (10000 MWCO)
35
öntöttem, és 24 óráig dializáltam. A dialízis után szűrtem, majd liofilizáltam. Az előállított klóracetilezett SAK (továbbiakban: ClAc-SAK) klórtartalmát Schöniger-módszerrel határoztuk meg [71]. Az előállított ClAc-SAK-ot az 5.5. fejezetben leírt konjugálási reakcióban használtam fel. Ugyanilyen módszerrel állítottam elő egy másik kiiundulási poli[Lys(Ser0,92DL-Ala2,89)] (SAK) klóracetilezett származékát. Ennek a kiindulási polimernek a jellemzői a következők: Ser : Ala : Lys = 0,92 : 2,89 : 1,00 (aminosavanalízis alapján, 5.8.3. fejezet), a monomer számított móltömege: 431,70 g/mol. Ezt a ClAc-SAK-ot az 5.7.2. fejezetben leírt konjugálási reakcióban használtam fel.
5.5. A 103-Aoa-OT10-Cys konjugálása ClAc-SAK-hoz A konjugálási reakciót TRIS pufferben (pH=8,12) végeztem. A gyengén lúgos közegben a hordozó (aminosavösszetétel: Ser : Ala : Lys = 0,90 : 2,60 : 1,00) ClAc-csoportja reagált a cisztein tiolcsoportjával tioéterkötés kialakításával. A reakcióban felhasznált ClAc-SAK klórtartalma 3,03% volt, melyet Schöniger-módszerrel [71] határoztunk meg. A dimerizáció elkerülése érdekében a cisztein tartalmú peptidet itt is kis részletekben, adagoltam a klóracetilezett hordozó oldatához. A reakcióelegyet 24 óráig kevertettem, majd ciszteint adagoltam hozzá, amely reagálhat az elreagálatlan ClAc-csoportokkal, és a keletkezett dimer peptideket is visszaredukálhatja. Ezután a reakcióelegyet 24 órán át dializáltam, majd liofilizáltam. A konjugátum (103-Aoa-OT10-Cys-SAK) szubsztitúciófokát aminosavanalízissel határoztuk meg.
5.6. A konjugátumok minimális gátló koncentrációjának és telepszámának meghatározása Kísérleteinket az Országos Korányi TBC és Pulmonológiai Intézet területén található Bakteriológiai Laboratóriumban (Corden International Magyarország Kft.), Dr. Szabó Nóra irányításával és Dávid Sándor közreműködésével végeztük. A steril hatóanyag oldatok az ELTE-MTA Peptidkémiai Kutatócsoport sejttenyésztő laboratóriumában készültek. Kísérleteinkben referencia vegyületként INH-t alkalmaztunk. A vizsgálatokhoz folyékony, félszintetikus Sula táptalajt használtunk, a kémcsövek 5 ml steril tápfolyadékot tartalmaztak [72-74]. Első lépésként a táptalajt tartalmazó csövekbe a vizsgálandó vegyület (102-es vegyület, 103-as vegyület, OT10, SAK, 102-Aoa-GFLGC, 103-Aoa-OT10-Cys, 103-AoaOT10-Cys-SAK)
megfelelő
koncentrációjú
oldatából
(0,1-50
µg/ml
koncentráció-
tartományban, 10 koncentrációban) egyforma mennyiségeket, 100 µl-t pipettáztunk. A végkoncentráció a referencia INH-ra nézve a következő sorozatnak megfelelő volt (γ [µg/ml]): 0,05; 0,1; 0,14; 0,16; 0,18; 0,20; 0,22; 0,24; 0,30; 0,40. 36
A vegyületekből a törzsoldatokat és a megfelelő higításokat steril körülmények között készítettük. A vegyületek különböző koncentrációit 2 párhuzamosban teszteltük. A MIC és CFU értékekeket minden esetben legalább két független kísérletben határoztuk meg. M. tuberculosis H37Rv (ATCC 27294) 4 hetes friss tenyészetéből golyós lombikban 0,5 Mcfarland (amely közelítőleg 1,5×108 sejtszámnak felel meg [75] sűrűségű szuszpenzió készült Sauton táptalajban. A vizsgálandó vegyületet tartalmazó és a kontroll csöveket a baktériumszuszpenzió 103–104 hígításainak 100 – 100 µl-ével fertőztük be. A mintákat 28 napig, 37°C-os termosztátban inkubáltuk. A 28 nap elteltével meghatároztuk a vizsgált vegyületnek azt a legkisebb koncentrációját, amely szabad szemmel vizsgálva teljes gátlást okozott, a kontrol csövekben tapasztalható zavarosodáshoz képest (baktériumok szaporodása). A növekedést szabad szemmel vizsgálva nem mutató csövekből szilárd Löwenstein-Jensen táptalajokra oltottunk ki, és 4 – 6 hét múlva megszámláltuk a kinövekedett kolóniák számát (CFU) [76, 77]. A kolónia vagy telepszámnak a megfelelő baktériumszuszpenzió hígítással való szorzatát hasonlítottuk össze a kiindulásként alkalmazott 0,5 Mcfarland szuszpenzió telepszámával (1,5×108 CFU/ml).
5.7. A hordozómolekulák és a konjugátumok sejtekbe történő bejutásának, felvételének vizsgálata áramlási citometriával A hordozómolekulák, illetve a konjugátumok sejtbejutásának vizsgálatára az áramlási citometria
módszerét
választottuk.
5(6)-karboxifluoreszceinnel
Az
áramlási
(továbbiakban:
Cf)
citometriás
jelöltem
a
vizsgálatokhoz
az
konjugátumokat.
Az
5(6)-karboxifluoreszcein 488 nm-en gerjeszthető a készülék szilárdtest lézerével.
5.7.1. A Cf-GFLGC előállítása A Boc/Bzl stratégiával előállított, még gyantán lévő GFLGC peptidhez fluoreszcens jelölőmolekulát kapcsoltam. Az utolsó aminosav N-terminális Boc-védőcsoportjának lehasítása után 2,5 ekvivalens feleslegben használtam az 5(6)-karboxifluoreszceint, a HOBt-t és a DIC-et. A reakcióidő 1 óra volt. A kapcsolás végbemenetelét Kaiser-próbával ellenőríztem (5.1.1. fejezet). A peptidszármazékot a gyantáról HF-os hasítással távolítottam el (5.1.1. fejezet).
37
5.7.2. A Cf-GFLGC konjugálása klóracetilezett SAK-hoz A klóracetilezéshez felhasznált poli[Lys(Ser0,92-DL-Ala2,89)] (SAK) jellemzői a következők: Ser : Ala : Lys = 0,92 : 2,89 : 1,00 (aminosavanalízis alapján, 5.8.3. fejezet), a monomer számított móltömege: 431,70 g/mol. 28,6 mg ClAc-SAK hordozó polimert feloldottam 0,1 M TRIS pufferben (pH=8,15), és hozzáadagoltam a klórtartalomra számított 1 ekvivalens CfGFLGC-t. A reakcióban felhasznált ClAc-SAK klórtartalma 1,17% volt, melyet Schönigermódszerrel [71] határoztunk meg. A dimerizáció elkerülése érdekében a cisztein tartalmú peptidet kis részletekben adagoltam a klóracetilezett hordozó oldatához. Így a cisztein-peptid koncentrációja a reakcióelegyben alacsony volt, hogy a peptid dimerizációjának a valószínűségét csökkenthessük. A reakcióelegyhez, a Cf-GFLGC hozzáadagolása után, 2 ekvivalens ciszteint adagoltam. A cisztein reagálhat az elreagálatlan ClAc-csoporttal, és a keletkezett dimer peptideket is visszaredukálhatja. Az oldatot 2 óra kevertetés után dializáltuk 24 óráig, majd liofilizáltuk.
5.7.3. A Cf-GFLGC-SAK konjugátum karboxifluoreszcein tartalmának meghatározása Az előállított Cf-GFLGC 100 µg-ját 6 M HCl oldattal hidrolizáltuk 110°C-on, 24 órán át, leforrasztott, evakuált csőben kalibrálósor felvételéhez, a Cf-tartalom meghatározásához a konjugátumban. Analitikai RP-HPLC-vel (oszlop: Eurosphere-100, C18, 100 Å, 5 µm, grad: 45-99 B%, 20 perc) különböző koncentrációjú Cf-GFLGC hidrolizátumok kromatogramját és a vizsgált Cf-GFLGC-SAK hidrolizátum kromatogramját vettük fel. A detektálást λger = 419 nm-es abszorpciós és λem = 519 nm-es emissziós hullámhosszon végeztük. A mért csúcsterületek alapján készítettük a kalibrációs egyenest, melybe behelyettesítve megkaptuk az elhidrolizált Cf-GFLGC-SAK karboxifluoreszcein tartalmát [29].
5.7.4. A Cf-GFLGC peptidszármazék sejtbejutásának vizsgálata MonoMac6 humán monocita sejtvonalon áramlási citometriával A logaritmikus növekedési fázisban lévő MonoMac6 sejteket 24 lyukú szuszpenziós lemezre osztottuk (1,5×105 sejt / 0,75 ml fenolvörös nélküli RPMI-1640 szérummentes médium). A vizsgálandó Cf-GFLGC peptidszármazékot fenolvörös nélküli RPMI-1640 szérummentes médiumban oldottuk. A törzsoldat végkoncentrációja 10-3 M volt. Ebből 10szeres tovafutó hígítással állítottuk elő a többi oldatot (10-3 M – 10-7 M). A sejtekről centrifugálás (1250 rpm, 5 perc) után eltávolítottunk 500 µl médiumot, majd a kontrollokhoz 125 µl szérummentes médiumot és a kezelendő sejtekhez 125 µl Cf-GFLGC-oldatot adtunk. 38
1 óra inkubálás után (37°C, 5% CO2) a sejtszuszpenziót a szövettenyésztő lemez mélyedéseiből FACS csövekbe vittük át. A csöveket centrifugáltuk (1250 rpm, 5 perc), eltávolítottuk a médiumot. A vizsgált sejtek egyik feléhez 1000 µl szérummentes médiumot adtunk, a másik feléhez 100 µl 1 mM tripszin oldatot adtunk. A tripszinnel kezelt sejteket 5 percig inkubáltuk 37°C-on, majd 900 µl teljes médiumot adtunk hozzá, hogy a tripszint inaktiváljuk. A tripszin eltávolítja a sejtfelszínhez kötődő struktúrákat, így az aspecifikusan kötődött Cf-GFLGC peptidet is. Az inaktiválás után a csöveket centrifugáltuk (1250 rpm, 5 perc). Ezután 1 ml fenolvörös nélküli RPMI-1640 szérummentes médiumot adtunk a csövekhez, majd mosás után a sejteket 0,5 ml megegyező médiumban vettük fel. A sejteket BD LSR II áramlási citométerrel analizáltuk (lézer: 488 nm, Coherent Sapphire szilárdtest lézer, 22 mW, FL1 csatorna, szoftver: BD FACSDiva 5.0.3). A kapott eredményeket WinMDI program segítségével értékeltük ki.
5.7.5. A Cf-GFLGC-SAK peptidszármazék sejtbejutásának vizsgálata MonoMac6 humán monocita sejtvonalon áramlási citometriával A logaritmikus növekedési fázisban lévő MonoMac6 sejteket 24 lyukú szuszpenziós lemezre osztottuk (1,5×105 sejt / 0,70 ml fenolvörös nélküli RPMI-1640 szérummentes médium). A vizsgálandó Cf-GFLGC-SAK peptidszármazékot fenolvörös nélküli RPMI-1640 szérummentes médiumban oldottuk. A törzsoldat végkoncentrációja 3,04⋅10-3 M volt. Ebből 3-szoros tovafutó hígítással állítottuk elő a többi oldatot (3,04⋅10-3 M - 3,75⋅10-5 M). A sejtekről centrifugálás (1250 rpm, 5 perc) után eltávolítottunk 450 µl médiumot, majd a kontrollokhoz 125 µl szérummentes médiumot és a kezelendő sejtekhez 125 µl Cf-GFLGCSAK-oldatot adtunk. 1 óra inkubálás után (37°C, 5% CO2) a sejtszuszpenziót a szövettenyésztő lemez mélyedéseiből FACS csövekbe vittük át. A csöveket centrifugáltuk (1250 rpm, 5 perc), eltávolítottuk a médiumot. A vizsgált sejtek egyik feléhez 1000 µl szérummentes médiumot adtunk, a másik feléhez 100 µl 1 mM tripszin oldatot adtunk. A tripszinnel kezelt sejteket 5 percig inkubáltuk 37°C-on, majd 900 µl teljes médiumot adtunk hozzá, hogy a tripszint inaktiváljuk. A tripszin eltávolítja a sejtfelszínhez kötődő struktúrákat, így az aspecifikusan kötődött Cf-GFLGC-SAK peptidszármazékot is. Az inaktiválás után a csöveket centrifugáltuk (1250 rpm, 5 perc). Ezután 1 ml fenolvörös nélküli RPMI-1640 szérummentes médiumot adtunk a csövekhez, majd mosás után a sejteket 0,5 ml megegyező médiumban vettük fel. A sejteket BD LSR II áramlási citométerrel analizáltuk (lézer: 488 nm, Coherent Sapphire szilárdtest lézer, 22 mW, FL1 csatorna, szoftver: BD FACSDiva 5.0.3). A kapott eredményeket WinMDI program segítségével értékeltük ki.
39
5.8. Tisztítási és analitikai módszerek A lehasított peptideket RP-HPLC segítségével választottuk el a szennyezésektől. A nyers termékek homogenitását minden esetben analitikai RP-HPLC vizsgálattal ellenőriztük. A célvegyületet
a
frakciók
azonosítása
(tömegspektrometria)
után
a
retenciós
idő
meghatározásával (RP-HPLC) is jellemeztük. Az elkészített peptidekkel aminosavanalízist végeztünk.
5.8.1. Analitikai és preparatív RP-HPLC A lehasított peptideket, a peptidszármazékokat és a konjugátumokat RP-HPLC segítségével választottam el a szennyezésektől szobahőmérsékleten. Az elválasztást Knauer rendszeren a következő oszlop alkalmazásával végeztem: Jupiter (C18 10x250 mm) 10 µm, 300 Å. Az elúcióhoz alkalmazott elegyek a következők voltak: A eluens: 0,1% TFA / víz V/V; B eluens: 0,1% TFA / acetonitril-víz 80:20 V/V, vagy 0,1% TFA / MeOH-víz 90:10 V/V. A detektálás abszorbancia mérésével történt 214 nm-en vagy 220 nm-en, a folyási sebesség 4 ml/perc volt.. Az alkalmazott gradienst a tisztítandó vegyület polaritása határozta meg (általában: 5 percig ekvilibrálás, 5-60 B% 35 perc alatt). A főkomponenst tartalmazó elegyet vákuum alatt bepároltam, a bepárlási maradékot lefagyasztottam, majd liofilizáltam. A tisztított termék homogenitását analitikai RP-HPLC vizsgálattal ellenőriztem. Az analitikai RP-HPLC vizsgálatok Knauer rendszeren a fentebb ismertetett eluensek alkalmazásával történtek. Az analitikai oszlopon (Jupiter C18 4,6x250 mm, 5 µm szilika, 300 Å, Cf-tartalom meghatározásnál: Eurosphere-100 C18 4x250 mm, 5 µm szilika, 100 Å) lineáris gradiens elúciót alkalmaztunk. Az A eluensben oldott 0,5-1,0 mg/ml töménységű mintákból az oszlopra 20 µl mennyiségeket injektáltunk. Az elválasztásokat szobahőmérsékleten végeztük, a folyási sebesség 1 ml/perc volt. A detektálás a félpreparatív tisztítási eljárásnál alkalmazottal megegyezően abszorbancia mérésével (λ= 214 nm vagy 220 nm) történt. Az alkalmazott gradiens: 5 percig ekvilibrálás, 35 perc alatt 5-60 B%.
5.8.2. ESI-MS spektrometria A tömegspektrumokat electrospray ionforrással, Bruker Esquire 3000+ típusú ioncsapdás készüléken vettük fel. A mintákat 0,1% AcOH-t tartalmazó AcN / víz 1:1 V/V oldószerelegyben oldottuk és 10 µl/perc áramlási sebességgel injektáltuk. A spektrumokat pozitív módban, 50-3000 m/z tartományban, 13,000 m/z/sec mintavételi sebességgel vettük fel. A tömegspektrometriai méréseket az MTA-ELTE Peptidkémiai Kutatócsoportban Horváti Kata (tudományos munkatárs) végezte. 40
5.8.3. A peptidek és a konjugátumok aminosavanalízise Az
aminosavösszetétel
és
a
konjugátum
szubsztitúciófokának
meghatározását
aminosavanalízissel végeztük. A konjugátum 100-250 µg-nyi mennyiségét 6 M HCl-dal, 110°C-on, 24 óra alatt hidrolizáltuk. A hidrolizátumból az aminosavösszetételt SYKAM 4300 automata aminosavanalizátor alkalmazásával határoztuk meg. Az aminosavanalíziseket az MTA-ELTE Peptidkémiai Kutatócsoportban Dr. Medzihradszky Schweiger Hedvig végezte. A szintetikus munka során használt vegyszereket, műszereket és oszlopokat az 5-7. táblázatok foglalják össze.
41
Név, kapacitás
Rövidítés
terc-butiloxikarbonil- (Boc) aminosavszármazékok
Boc-aminosav
4-metilbenzhidrilamin-gyanta (1,2 mmol/g)
MBHA
4-(2’, 4’-dimetoxifenil-Fmoc-aminometil)fenoxiacetamido-norleucil-MBHA-gyanta (0,65 mmol/g)
Rink Amide MBHA
9-fluorenilmetiloxikarbonilaminosavszármazékok
Fmoc-aminosav
trifluorecetsav
TFA
Kaiser-reagens alkotói (ninhidrin, etanol, fenol, piridin, KCN)
Gyártó cég
Nova Biochem (Läufelfingen, Svájc)
Reanal (Budapest, Magyarország)
diklórmetán
DCM
N,N-dimetilformamid
DMF
N-metilpirrolidon
NMP
Merck (Budapest, Magyarország)
klórecetsav-pentaklórfenilészter
ClAc-OPcp
laboratóriumban előállított
N,N’-diizopropilkarbodiimid
DIC
1-hidroxibenztriazol
HOBt
benztriazol-1-il-oxi-trisz-pirrolidinofoszfónium-hexafluorofoszfát
PyBOP
N,N-diizopropiletilamin
DIEA
5(6)-karboxifluoreszcein
Cf
Molar (Budapest, Magyarország)
p-krezol
1,4-DL-ditiotreitol
DTT
hidrogén-fluorid
HF
piperidin 1,8-diazabiciklo[5.4.0]undek-7-én
DBU
triizopropilszilán
TIS
N-etilmaleimid
NEM
metanol
MeOH
foszfát puffer
PBS
2-amino-2-hidroximetil-propán-1,3-diol
TRIS
szövettenyésztő médium
RPMI 1640
Fluka, Sigma-Aldrich (Budapest, Magyarország)
5. táblázat: A szintetikus munka során használt aminosavszármazékok, gyanták, oldószerek, reagensek 42
Elnevezés
Gyártó cég
Knauer RP-HPLC rendszer
Knauer (Bad Homburg, Németország)
Bruker Daltonics Esquire 3000+ tömegspektrométer
Bruker (Bremen, Németország)
SYKAM 4300 automata aminosavanalizátor
SYKAM (Eresing, Németország)
HF teflonkészülék
Peninsula Laboratories, INC. (Belmont, CA, USA)
liofilizátor
Virtis (Warminster, PA, USA)
áramlási citométer BD LSR II
BD Biosciences (San Jose, CA, USA)
Snake skin dialízishártya
Pierce Biotechnology (Rockford, IL, USA)
Sedival fénymikroszkóp
Carl Zeiss (Jena, Németország)
2
2
2
25 cm , 75 cm , 175 cm szövettenyésztő flaska 24 lyukú szuszpenziós szövettenyésztő lemez
Sarstedt (Nümbrecht, Németország)
1ml, 5ml, 10ml, 25 ml szerológiai pipetta 5 ml áramlási citometriás cső 6. táblázat: A szintetikus munka során alkalmazott műszerek
Elnevezés
Jellemzők
Gyártó cég
Phenomenex félpreparatív
fordított fázisú, módosított szilika töltet Jupiter (C18 10x250 mm) 10 µm, 300 Å
Phenomenexanalitikai
fordított fázisú, módosított szilika töltet Jupiter (C18 4,6x250 mm) 5 µm, 300 Å
Eurospheranalitikai
fordított fázisú, módosított szilika töltet (C18 4x250 mm) 5 µm, 100 Å
Phenomenex (Torrance, CA, USA) Knauer (Bad Homburg, Németország)
7. táblázat: A szintetikus munka során alkalmazott RP-HPLC oszlopok, töltetek
43
6. EREDMÉNYEK 6.1. A GFLGC, az Aoa-GFLGC és az Aoa-OT10-Cys peptidek, peptidszármazékok előállítása Előállítottam a C-terminálison cisztein aminosavval hosszabbított GFLGC szekvenciájú spacerként (távolságtartó egység) alkalmazott peptidamidot szilárdfázisú peptidszintézissel Boc/Bzl stratégiával (5.1.1. fejezet). A 17. ábra mutatja a tisztított peptid analitikai RP-HPLC kromatogramját (a) és tömegspektrumát (b, c).
a.
0,4
GFLGC
Rt=24,1 perc
A (220nm)
0,3
0,2
0,1
0,0
-0,1 0
10
20
t / min
44
30
40
b.
Intens. x10 7
+M S, 0.6-2.0m i n (#27-#90) Intens. x10 7 4
495.2
+MS, 0.6-2.0min (#27-#90)
[M+H]+
495.2 3
3
2
2
496.1
1
c.
497.2
0 490
1
492
494
496
498
500
m/z
0 200
400
600
800
1000
1200
1400
1600 m /z
17. ábra: a. A tisztított GFLGC peptid analitikai RP-HPLC kromatogramja (körülmények: Phenomenex Jupiter oszlop, C18, 300 Å, 1 mg/ml, λ = 220 nm, grad: 5-60 B%, 35 perc) és b. tömegspektruma (Mmo (számított)=494,2), c. izotópeloszlása A GFLGC spacer N-terminálisra Boc-aminooxiecetsavat kapcsolva előállítottam az AoaGFLGC peptidszármazékot (5.1.1. fejezet) (18. ábra). A 19. ábra mutatja a tisztított peptid analitikai RP-HPLC kromatogramját (a) és tömegspektrumát (b, c).
Boc-NH-O-CH2-COOH + NH2-PEPTID
Boc-NH-O-CH2-CO-NH-PEPTID - H2O
Boc-aminooxiecetsav
peptid
Boc-aminooxiacetil-peptid
18. ábra: A Boc-aminooxiecetsav reakciója a peptid szabad N-terminálisával
45
0,4
a.
Aoa-GFLGC
Rt=24,6 perc 0,3
A (214 nm)
0,2
0,1
0,0
-0,1 0
10
20
30
40
t / min
b.
Intens. x10 6
+MS, 0.0-0.3min (#2-#14)
[M+H]
+
568.4
Intens. x10 6
+MS, 0.0-0.3min (#2-#14) 568.4
3
3
2
2 569.3
1
c.
570.4
0
1
564
566
568
570
572
574 m/z
495.4 0
156.2 200
400
600
800
1000
1200
1400
1600 m/z
19. ábra: a. A tisztított Aoa-GFLGC peptidszármazék analitikai RP-HPLC kromatogramja (körülmények: Phenomenex Jupiter oszlop, C18, 300 Å, 1 mg/ml, λ = 214 nm, grad: 5-60 B%, 35 perc) és b. tömegspektruma (Mmo (számított)=567,3), c. izotópeloszlása
46
Előállítottam szilárdfázisú peptidszintézissel, Fmoc/tBu stratégiával a C-terminálison ciszteinnel hosszabbított OT10-Cys oligotuftsin származékot (5.1.2. fejezet). Az OT10-Cys N-terminálisára is Boc-aminooxiecetsavat kapcsoltam, így előállítva az Aoa-OT10-Cys-t (5.1.2. fejezet) (18. ábra). A 20. ábra mutatja a nyers peptid tömegspektrumát (a, b). Ezt a peptidet tisztítás nélkül használtam fel a konjugáláshoz.
a.
Intens. x106
+MS, 0.0-0.0min (#1-#2)
[M+3H]3+
Intens. x10 5
406.5
+All, 0.3-0.8min (#11-#30) 609.0
2.5
4
2.0
3
[M+4H]
4+
609.5 1.5
[M+2H]2+
305.2
2
610.0
1.0
b.
0.5
610.4
0.0 606
1
607
608
609
610
611
612
m/z
609.0
0 200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
m/z
20. ábra: a. A nyers Aoa-OT10-Cys tömegspektruma (Mmo (számított)=1215,8), b. izotópeloszlás
6.2. 102-Aoa-GFLGC és 103-Aoa-OT10-Cys előállítása, az előállított vegyületek jellemzése A 102-es vegyületet az Aoa-GFLGC-hez, a 103-ast az Aoa-OT10-Cys-hez konjugáltam oximkötés kialakításával (5.1.3. fejezet) (21. ábra). A reakció közben az oldatból óránként mintát
vettem
és
analitikai
RP-HPLC-vel
követtem
a
reakció
előrehaladását.
A
kromatogramok elemzése alapján megállapítottam, hogy a reakció egy óra alatt lejátszódott. Az
előállított
és
tisztított
konjugátumok
analitikai
RP-HPLC
kromatogramját
és
tömegspektrumait a 22. és 23. ábrákon mutatom be.
--CH=N-O-CH2-CO-PEPTID
--CHO + NH2-O-CH2-CO- PEPTID - H2O
21. ábra: Aldehidcsoportot tartalmazó hatóanyag jelöltek és aminooxiacetil-peptid konjugálása oximkötés kialakításával 47
a.
1400
102-Aoa-GFLGC
Rt=32,5 perc 1200
A (214 nm)
1000 800 600 400 200 0 -200 0
10
20
30
40
t / min
Intens. x10 6
+MS, 0.2-0.5min (#9-#27)
b.
Intens. x10 6
779.7
779.7
[M+H]+
6
+MS, 0.2-0.5min (#9-#27)
6
4 780.6
4 2
[’102’+H]
c.
+
781.6 782.6
0
2
776
230.3
778
780
782
784
m/z
636.6
381.9
0 250
500
750
1000
1250
1500
1750
2000
2250
m/z
22. ábra: a. A tisztított 102-Aoa-GFLGC konjugátum analitikai RP-HPLC kromatogramja (körülmények: Phenomenex Jupiter oszlop, C18, 300 Å, λ = 214 nm, grad: 5-60 B%, 35 perc) és b. tömegspektruma (Mmo (számított)=778,6), c. izotópeloszlása
48
1000
a.
103-Aoa-OT10-Cys
Rt=20,1 perc
900 800
A (220 nm)
700 600 500 400 300 200 100 0 0
10
20
30
40
t / min
b.
Intens. x107 1.25
+MS, 0.0-0.4min (#3-#20)
[M+4H]4+
Intens. x10 5
+MS, 0.0-0.4min (#3-#20)
361.5
721.5 4
1.00
[M+3H]3+
722.0
3
0.75
2
481.6 0.50
1
[M+2H]
2+
c.
0 719
720
721
722
723
724
m/z
0.25 218.2
721.5
0.00 200
23.
ábra:
a.
A
400
600
800
1000
tisztított
103-Aoa-OT10-Cys
1200
1400
peptidszármazék
1600
analitikai
m/z
RP-HPLC
kromatogramja (körülmények: Phenomenex Jupiter C18 oszlop, 300 Å, λ = 220 nm, grad: 560 B%, 35 perc) és b. tömegspektruma (Mmo (számított)=1441,1), c. izotópeloszlás
49
A 103-Aoa-OT10-Cys konjugátumban meghatároztuk a cisztein oxidációs állapotát NEMreagens segítségével (5.2. fejezet). A kromatogramok alapján megállapítható, hogy a cisztein a konjugátumban szabad tiolcsoportot tartalmaz. A peptidet N-etilmaleimiddel reagáltatva stabil S-(N-etilszukcinimido)-származék keletkezett, amelyet az analitikai RPHPLC körülmények között elválasztottunk a kiindulási peptidtől, és tömegspektrométerrel azonosítottuk (24. ábra). 1000
a.
Rt2=20,9 perc
900 800
szukcinimid származék
Rt1=12,3 perc
A (220 nm)
700 600
N-etilmaleimid
500 400 300 200 100 0 0
10
20
30
40
t / min
b.
Intens. x105
+MS, 0.0-0.1min (#2-#6)
[M+4H]4+ 392.7
5
[M+3H]3+ 4 523.4
3
2 1 338.5
664.0
0 200
400
600
766.0 800
1000
1200
1400
1600 m/z
24. ábra: a. A 103-Aoa-OT10-Cys és a NEM reakciója után felvett analitikai RP-HPLC kromatogram (körülmények: Phenomenex Jupiter C18 oszlop, 300 Å, λ = 220 nm, grad: 5-60 B%, 35 perc), és b. a keletkezett szukcinimid-származék tömegspektruma (Mmo (számított)=1566,2)
50
A 103-Aoa-OT10-Cys dimerizációs sebességét vizsgáltuk TRIS pufferben (5.3 fejezet). Azt az eredményt kaptuk a kromatogramok analízise alapján, hogy TRIS pufferben 3 óra elteltével a konjugátum 80%-a dimer formában van jelen (25. ábra). A 26. ábrán látható a dimerizálódott 103-Aoa-OT10-Cys tömegspektruma. 100
monomer %
80
60
40
20
0 0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
t/h
25. ábra: A 103-Aoa-OT10-Cys dimerizációs próbája során felvett analitikai RP-HPLC kromatogramokon a monomer mennyiségének fogyása az idő függvényében (körülmények: Phenomenex Jupiter C18 oszlop, 300 Å, λ = 214 nm, grad: 0-80 B%, 35 perc) Intens. x105 1.2
+MS, 0.2-2.1min (#10-#106)
[2M-2H+7H] 338.5
7+
[2M-2H+6H]6+
1.0 481.3
0.8
[2M-2H+5H]5+
412.8 0.6 577.3
0.4 0.2
663.6
0.0 200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
m/z
26. ábra: A dimerizációs próba során a dimerizálódott 103-Aoa-OT10-Cys konjugátum tömegspektruma (Mav (számított)=2880,9) 51
A
peptidek,
peptidszármazékok
és
konjugátumok
homogenitását
RP-HPLC-vel
jellemeztük, az előállított anyagok elsődleges szerkezetét tömegspektrometriával és aminosavanalízissel igazoltuk (8. táblázat). Szekvencia
Mmo számított
Mmo mérta
Rt (perc)b
GFLGC
494,2
494,2
24,1
Aoa-GFLGC
567,3
567,4
24,6
102-Aoa-GFLGC
778,6
778,7
32,5
Cf-GFLGCc
852,5
852,6
35,1 és 35,7
Aoa-OT10-Cys
1215,8
1216,0
-
103-Aoa-OT10Cys
1441,1
1441,0
20,1
Aminosavanalízis
G 2,16 [2]; F 1,10 [1]; L 1,06 [1]; C 0,68 [1]
T 1,90 [2]; K 4,23 [4]; P 2,00 [2]; G 2,05 [2]; C 0,84 [1]
a
monoizotópos molekulatömeg, ESI-MS, Bruker Esquire 3000+
b
analitikai RP-HPLC, Phenomenex Jupiter, C18, 4,6x250 mm, 5 µm, 300 Å, grad: 5-60 B%, 35 perc
c
a Cf-GFLGC származék előállítása és kémiai jellemzésének leírása a 6.6. fejezetben található
8. táblázat: Az előállított konjugátumok analitikai jellemzései
52
6.3. ClAc-SAK előállítása A SAK hordozó molekulák klóracetilezését ClAc-OPcp reagens segítségével valósítottam meg (5.4. fejezet). Két különböző kiindulási SAK polimert használtam: (1) poli[Lys(Ser0,90-DLAla2,60)], aminosavösszetétel: Ser : Ala : Lys = 0,90 : 2,60 : 1,00; (2) poli[Lys(Ser0,92-DLAla2,89)], aminosavösszetétel: Ser : Ala : Lys = 0,92 : 2,89 : 1,00). Az előállított ClAc-SAK vegyületek Schöniger-módszerrel [71] meghatározott klórtartalma: (1): 3,03% és (2): 1,17% volt. Az alacsonyabb klórtartalmú vegyületet használtam fel a karboxifluorszcein származék előállításához. A karboxifluoreszceint tartalmazó polimer esetében kis szubsztitúciófokra törekedtünk, a vízoldhatóság megőrzése, valamint a karboxifluoreszcein okozta esetleges citotoxicitás kivédése érdekében. Az előállított ClAc-SAK sematikus ábrája a 27. ábrán látható.
27. ábra: Az előállított ClAc-SAK sematikus ábrája
6.4. A 103-Aoa-OT10-Cys-SAK előállítása A 103-Aoa-OT10-Cys konjugátumot ClAc-SAK-hoz (aminosavösszetétel: Ser : Ala : Lys = 0,90 : 2,60 : 1,00; Schöniger-módszerrel meghatározott klórtartalom: 3,03%) kapcsoltuk tioéterkötésen keresztül, az 5.5. fejezetnek megfelelően. A konjugátum (103-Aoa-OT10-CysSAK) szubsztitúciófokát aminosavanalízissel meghatározva 10,1%-ot kaptunk. Az előállított 103-Aoa-OT10-Cys-SAK sematikus ábrája a 28. ábrán látható.
53
28. ábra: Az előállított 103-Aoa-OT10-SAK sematikus ábrája
6.5. A vegyületek, konjugátumok MIC és CFU értékei A vizsgált vegyületek MIC és CFU értékeinek meghatározását az 5.6. fejezetben leírt módon végeztük. A kapott értékeket a 9. táblázatban foglaltam össze. Az OT10 és a SAK hordozó nem mutatott antituberkulotikus hatást.
Vegyület
MICa γ (µ µg/ml)
MIC (µ µmol/dm3)
CFUb
INH (kontroll)
0,16
1,17
12
102-es vegyület
1,00
4,36
3
103-as vegyület
0,50
2,06
3
102-Aoa-OT10c
6,90
30,1
10
102-Aoa-GFLGC
n.a.d
n.a.d
n.a.d
103-Aoa-OT10-Cys
10,1
41,6
n.a.d
130-Aoa-OT10-Cys-SAK
n.a.d
n.a.d
n.a.d
a
minimális gátló koncentráció M. tuberculosis H37Rv baktériumtörzsön Sula táptalajban; hatóanyag tartalomra számítva b telepszám Löwenstein-Jensen szilárd táptalajon c előállításának körülményei nem szerepelnek a dolgozatban, a 102-es hatóanyag oximkötésen keresztül kapcsolódik az OT10 hordozóhoz d meghatározása folyamatban
9. táblázat: Az előállított konjugátumok minimális gátló koncentrációja (MIC) és telepszáma (CFU) M. tuberculosis H37Rv baktériumtörzsön
54
6.6. Cf-GFLGC és Cf-GFLGC-SAK előállítása, és a kapott konjugátumok sejtekbe történő bejutása A sejtbejutás követése érdekében a GFLGC spacer N-terminálisára fluoreszcens molekulát, 5(6)-karboxifluoreszceint kapcsoltam (29. ábra), így előállítva a Cf-GFLGC-t (5.7.1. fejezet, 8. táblázat). A 30. ábra mutatja a tisztított peptid analitikai RP-HPLC kromatogramját (a) és tömegspektrumát (b-e). A két frakció az 5(6)-karboxifluoreszcein két izomere, tömegspektrumuk megegyezik.
29. ábra: 5(6)-karboxifluoreszcein reakciója aminocsoporttal
a.
2500
Cf-GFLGC
Rt2=35,7 perc
A (220 nm)
2000
Rt1=35,1 perc
1500
1000
500
0 0
10
20
t / min
55
30
40
b.
Intens. x106
+MS, 0.1-0.5min (#6-#24)
1.25
[M+H]+
853.6
Intens. x10 6
+MS, 0.1-0.5min (#6-#24)
1.25
1.00
[M-H2O+2H]
0.75
418.9
2+
853.6
1.00
0.75 854.6 0.50
0.50
0.25
c.
855.6 856.6
0.00 850
0.25
854
856
858
m/z
733.5 99.4
338.7
0.00 200
d.
852
400
Intens. x106
563.4 600
800
1000
1200
1400
1600
m/z
+MS, 0.0-0.2min (#3-#11)
[M+H]+
3.0
853.6
+MS, 0.0-0.2min (#3-#11)
3.0
[M-H2O+2H]2+
2.5
Intens. x10 6 853.6 2.5
2.0
2.0 1.5
1.5
854.6
1.0
418.9
0.5
1.0
e.
855.6 856.5
0.0 850
0.5 0.0
298.0
99.4 200
563.4 400
600
852
854
856
858
733.6 800
1000
1200
1400
1600
m/z
30. ábra: a. A tisztított Cf-GFLGC konjugátum analitikai RP-HPLC kromatogramja (körülmények: Phenomenex Jupiter oszlop, C18, 300 Å, 0,5 mg/ml, λ = 220 nm, grad: 5-60 B%, 35 perc), b. Rt1-hez tartozó tömegspektrum (Mmo (számított)=852,5), c. izotópeloszlása, d. Rt2-höz tartozó tömegspektrum (Mmo (számított)=852,5), e. izotópeloszlása A ClAc-SAK-hoz (aminosavösszetétel: Ser : Ala : Lys = 0,92 : 2,89 : 1,00; Schönigermódszerrel meghatározott klórtartalom: 1,17%) a Cf-GFLGC fluroeszcensen jelölt peptidet kapcsoltam tioéterkötés kialakításával (5.7.2. fejezet). Meghatároztuk a Cf-GFLGC-SAK konjugátum Cf-tartalmát az 5.7.3. fejezetben leírt módon, a kapott érték: 6,1% (31. ábra).
56
860
m/z
6000
Csúcs alatti területek összege
5000
4000
3000
2000
1000
0 0,000
0,004
0,008
0,012
0,016
cCf-GFLGC / mg/ml
31. ábra: A Cf-GFLGC-SAK konjugátum karboxifluoreszcein tartalmának meghatározására szolgáló kalibráló egyenes (az egyenes egyenlete: y=113,83+342752,61x; R=0,99965) A Cf-GFLGC peptidszármazék sejtekbe történő bejutását áramlási citométerrel vizsgáltuk tripszinnel kezelt és kezeletlen MonoMac6 humán monocita sejtvonalakon (5.7.4. fejezet). A tripszin eltávolítja a sejtfelszínhez kötődő struktúrákat, így az aspecifikusan kötődött CfGFLGC peptidet is. A 32. ábra mutatja a Cf-GFLGC sejtbejutásának koncentrációfüggését, amit a fluoreszcencia intenzitásának emelkedése jelez (a citometriás analízist megelőzően nem történt tripszines kezelés a sejteken). A 33. ábra mutatja a tripszines kezelés nélküli és a tripszinnel kezelt sejtek Cf-GFLGC felvételének összehasonlítását. Nem tapasztalható jelentős különbség a tripszinnel kezelt és kezeletlen sejtek Cf-GFLGC felvételében, vagyis a felvett Cf-GFLGC bekerül a sejtbe és nem a sejt felszínéhez kötődik aspecifikusan. A 34.
ábra a kezeletlen (kontroll) és a különböző koncentrációjú Cf-GFLGC peptiddel kezelt sejtpopulációk fluoreszcencia intenzitás eloszlását mutatja be (tripszines kezelés nélkül). A kontrollhoz viszonyítva az egyes görbék középértékének eltolódása mutatja a peptid sejtekbe történő bejutásának koncentrációfüggését.
57
5
Fluoreszcencia intenzitás
10
4
10
3
10
2
10
-7
10
10
-6
10
-5
10
-4
-3
10
c (M)
32. ábra: A Cf-GFLGC peptidszármazék sejtbejutásának koncentrációfüggésének
Fluoreszcencia intenzitás
meghatározása áramlási citometriával, tripszines kezelés nélkül
1,4x10
5
1,2x10
5
1,0x10
5
8,0x10
4
6,0x10
4
4,0x10
4
2,0x10
4
tripszin nélkül tripszinnel
0,0 -7
10
-6
-5
10
10
10
-4
10
-3
c (M)
33. ábra: A Cf-GFLGC peptidszármazék sejtbejutásának koncentrációfüggésének meghatározása áramlási citometriával, tripszinnel nem kezelt (fekete négyzet) és tripszinnel kezelt (piros kör) sejtek esetében
58
Esemény / sejt
― kontroll -7 ― 10 M -6 ― 10 M -5 ― 10 M -4 ― 10 M -3 ― 10 M
Fluoreszcencia intenzitás
34. ábra: A különböző koncentrációjú Cf-GFLGC peptidszármazékkal (tripszin nélkül) kezelt sejtpopulációk fluoreszcencia intenzitás eloszlása
A Cf-GFLGC-SAK sejtekbe történő bejutását is vizsgáltuk áramlási citométerrel tripszinnel kezelt és kezeletlen sejteken (5.7.5. fejezet). A 35. ábra mutatja a Cf-GFLGC-SAK sejtbejutásának koncentrációfüggését, amit a fluoreszcencia intenzitásának emelkedése jelez. A 36. ábra mutatja a tripszines kezelés nélküli és a tripszinnel kezelt sejtek Cf-GFLGCSAK felvételének összehasonlítását. Minimális különbség tapasztalható a tripszinnel kezelt és kezeletlen sejtek Cf-GFLGC-SAK felvételében. A különbség oka lehet az aspecifikus kötődés. Annak tisztázása, hogy ez az eltérés jelenthet-e receptorhoz való kötődést, további vizsgálatokat igényel (a felvétel időfüggésének vizsgálata, receptorspecifikus ellenanyaggal való előkezelés, stb.). A 37. ábra a kezeletlen (kontroll) és a különböző koncentrációjú CfGFLGC-SAK peptiddel kezelt sejtpopulációk fluoreszcencia intenzitás eloszlását mutatja be. A kontrollhoz viszonyítva az egyes görbék középértékének eltolódása mutatja a peptid sejtekbe történő felvételének koncentrációfüggését.
59
Fluoreszcencia intenzitás
3
10
2
10
10
-4
-3
10
10
-2
c (M)
35. ábra: A Cf-GFLGC-SAK peptidszármazék sejtbejutásának koncentrációfüggésének meghatározása áramlási citometriával, tripszines kezelés nélkül
3
3,5x10
tripszin nélkül tripszinnel
3
Fluoreszcencia intenzitás
3,0x10
3
2,5x10
3
2,0x10
3
1,5x10
3
1,0x10
2
5,0x10
0,0 -4
-3
10
c (M)
10
36. ábra: A Cf-GFLGC-SAK peptidszármazék sejtbejutásának koncentrációfüggésének meghatározása áramlási citometriával, tripszinnel nem kezelt (fekete négyzet) és tripszinnel kezelt (piros kör) sejtek esetében
60
Esemény / sejt
― kontroll -5 ― 3,75x10 M -4 ― 1,13x10 M -4 ― 3,38x10 M -3 ― 1,01x10 M -3 ― 3,04x10 M
Fluoreszcencia intenzitás
37. ábra: A különböző koncentrációjú Cf-GFLGC-SAK peptidszármazékkal (tripszin nélkül) kezelt sejtpopulációk fluoreszcencia intenzitás eloszlása
61
7. ÖSSZEFOGLALÁS A tuberkulózis (tbc), a Mycobacterium tuberculosis okozta megbetegedés, világszerte az egyik fő közegészségügyi probléma napjainkban. A tbc kezelése 6-12 hónapot vesz igénybe, és a jelenleg alkalmazott antituberkulotikumok többségének számos mellékhatása ismert. Dolgozatomban röviden ismertettem a betegséget okozó baktériumot és áttekintettem az alkalmazott antituberkulotikumokat. A kezelés során jelentkező káros mellékhatások, és a nagy dózisok alkalmazásának elkerüléséhez szükség van a hatóanyagok szelektív célbajuttatására. Dolgozatomban bemutattam a fertőzött makrofágokba való szelektív célbajuttatás egy lehetséges útját. Ismertettem a témához kapcsolódó szintetikus munkámat:
•
Előállítottam
szilárdfázisú
H-[TKPKG]2C-NH2
•
peptidszintézissel
a
H-GFLGC-NH2
és
a
(OT10-Cys) peptidamidokat.
A H-GFLGC-NH2-hez és az OT10-Cys-hez Boc-aminooxiecetsavat kapcsoltam, majd oximkötés kialakításával az Aoa-GFLGC-NH2-hez a 102-es jelű hatóanyagot, az AoaOT10-Cys-hez a 103-as hatóanyagot konjugáltam.
•
A 103-Aoa-OT10-Cys konjugátumban meghatároztam a cisztein oxidációs állapotát NEM-reagens segítségével.
•
Meghatároztam a 103-Aoa-OT10-Cys konjugátum dimerizációs sebességét.
•
Előállítottam a ClAc-SAK hordozót a SAK polimer klóracetilezésével.
•
Előállítottam a 103-Aoa-OT10-Cys-SAK konjugátumot a 103-Aoa-OT10-Cys és a ClAcSAK reakciójával tioéterkötésen keresztül.
•
Meghatároztam a 102-es, a 103-as vegyületek minimális gátló koncentráció (MIC) értékét és telepszámát (CFU). A konjugátumok MIC és CFU értékének meghatározása folyamatban van.
•
A H-GFLGC-NH2-hez fluoreszcens molekulát, az 5(6)-karboxifluoreszceint kapcsoltam. Az Cf-GFLGC peptidszármazék sejtekbe történő bejutásának koncentrációfüggését áramlási citométerrel határoztam meg.
•
A ClAc-SAK-hoz a Cf-GFLGC fluoreszcensen jelölt peptidet kapcsoltam tioéterkötés kialakításával. Az előállított Cf-GFLGC-SAK szubsztitúciófokát aminosavanalízis adatok alapján határoztam meg A Cf-GFLGC-SAK sejtekbe történő bejutásának koncentrációfüggését áramlási citométerrel történt mérések segítségével határoztam meg.
•
Az előállított konjugátumokat kémiailag jellemeztem aminosavanalízissel, RP-HPLC és ESI-MS módszerek alkalmazásával.
62
Rövidítésjegyzék A dolgozatban előforduló rövidítések, jelölések jegyzéke: AcN
acetonitril
AcOH
ecetsav
Aoa-
aminooxiacetil-
ATCC
American Type Culture Collection (Global Bioresource Center)
Boc
terc-butiloxikarbonil
BSA
bovine serum albumin, marha szérum albumin
Bzl
benzil
Cf
5(6)-karboxifluoreszcein
CFU
colony forming unit, telepszám
ClAc-OPcp
klórecetsav-pentaklórfenilészter
ClZ
2-klórbenziloxikarbonil
CS
cikloszerin
DBU
1,8-diazabiciklo[5.4.0]undek-7-én
DCM
diklórmetán
DIC
N,N’-diizopropilkarbodiimid
DIEA
N,N-diizopropiletilamin
DMF
N,N-dimetilformamid
DMSO
dimetilszulfoxid
DTT
1,4-DL-ditiotreitol
DUTPáz
dezoxiuridin 5’-trifoszfát nukleotidohidroláz (EC 3.6.1.23)
EAK
poli[Lys(Glui-DL-Alam)] (ahol i≅1, m≅2-4,)
ESI-MS
electrospray ionisation mass spectrometry, electrospray ionizációs tömegspektrometria
ETB
etambutol
FACS
fluorescent-activated cell sorter, áramlási citométer
Fmoc
9-fluorenilmetiloxikarbonil
FSC
forward scatter, előre irányuló fényszórás
HCl
hidrogén-klorid
HF
hidrogén-fluorid
HIV
human immunodeficiency virus, humán immundeficiencia vírus
HOBt
1-hidroxibenztriazol
INH
izoniazid
KCN
kálium-cianid
63
KLH
keyhole lympet hemocyanin
LDL
low density lipoprotein, kis sűrűségű lipoprotein
Mav
átlag molekulatömeg
Mmo
monoizotópos molekulatömeg
MBHA
4-metilbenzhidrilamin
MBSA
maleilated bovine serum albumin, maleilezett marha szérum albumin
MDR-TB
multi-drug resistant tuberculosis, multirezisztens tuberkulózis
4-MeBzl
4-metilbenzil
MIC
minimal inhibitory concentration, minimális gátló koncentráció
MWCO
molecular weight cut off, molekulatömeg szerinti áteresztőképesség
NaOAc
nátrium-acetát
NEM
N-etilmaleimid
NMP
N-metilpirrolidon
OT10
[TKPKG]2, dituftsin származék
OVA
ovalbumin, tojásalbumin
PAS
p-aminoszalicilsav
PBS
phosphate buffered saline, foszfát puffer
PPD
purified protein derivative, tisztított fehérje keverék
PyBOP
benztriazol-1-il-oxi-trisz-pirrolidino-foszfónium-hexafluorofoszfát
PZA
pirazinamid
RAMP
rifampicin
RP-HPLC
revers phase high performance liquid chromatography, fordított fázisú nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia
RPMI-1640
Roswell Park Memorial Institute medium, szövettenyésztő oldat
Rt
retention time, retenciós idő
SAK
poli[Lys(Seri-DL-Alam)] (ahol i≅1, m≅2-4,)
SM
sztreptomicin
SSC
side scatter, oldalra irányuló fényszórás
tbc
tuberkulózis
tBu
terc-butil
TFA
trifluorecetsav
TIS
triizopropilszilán
TRIS
2-amino-2-hidroximetil-propán-1,3-diol
Trt
tritil
XAK
poli[Lys(Xi-DL-Alam)] (ahol m≈3,5, i≤1, és X: Glu vagy Ser)
XDR
extensively
drug
resistant
tuberkulózis
64
tuberculosis,
extenzíven
rezisztens
Irodalom [1] R. Koch: Die Aetiologie der Tuberculose, 1882, Berliner Klinischen Wochenschrift, 19, 221-230. [2] É. Ádám, F. D. Tóth, L. Emődy, L. Gergely, É. Gönczöl, E. Nagy, T. Pál, R. Pusztai, F. Rozgonyi, B. Szabó: Orvosi mikrobiológia, 2003, Alliter Kiadói és Oktatásfejlesztői Alapítvány [3] Global tuberculosis
control –
epidemology,
strategy, financing,
2009, WHO,
(WHO/HTM/TB/2009.411) [4] TB/HIV Fact Sheet. WHO, 2008, http://www.who.int/tb/challenges/hiv/tbhiv_facts08_en.pdf [5] S. H. E. Kaufmann, S. K. Parida: Changing funding patterns in tuberculosis, 2007, Nature
Medicine, 13, 299-303. [6] J. Jónás, K. Barsiné Fodor, P. Kiss, M. Péterfiné Tüfgyei, L. Nyári: A pulmonológiai Intézmények 2004. évi epidemiológiai és működési adatai, 2005, Országos Korányi TBC és Pulmonológiai Intézet [7] I. M. Szabó: A bioszféra mikrobiológiája III., 1989, Akadémiai Kiadó, 1971-1972. [8] S. T. Cole, R. Brosch, J. Parkhill, T. Garnier, C. Churcher, D. Harris, S. V. Gordon, K. Eiglmeier, S. Gas, C. E. 3rd Barry, F. Tekaia, K. Badcock, D. Basham, D. Brown, T. Chillingworth, R. Connor, R. Davies, K. Devlin, T. Feltwell, S. Gentles, N. Hamlin, S. Holroyd, T. Hornsby, K. Jagels, A. Krogh, J. McLean, S. Moule, L. Murphy, K. Oliver, J. Osborne, M. A. Quail, M. A. Rajandream, J. Rogers, S. Rutter, K. Seeger, J. Skelton, R. Squares, S. Squares, J. E. Sulston, K. Taylor, S. Whitehead, B. G. Barrell: Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence, 1998,
Nature, 393, 537-544. [9] R. D. Fleischmann, D. Alland, J. A. Eisen, L. Carpenter, O. White, J. Peterson, R. DeBoy, R. Dodson, M. Gwinn, D. Haft, E. Hickey, J. F. Kolonay, W. C. Nelson, L. A. Umayam, M. Ermolaeva, S. L. Salzberg, A. Delcher, T. Utterback, J. Weidman, H. Khouri, J. Gill, A. Mikula, W. Bishai, Jr W. R. Jacobs, J. C. Venter, C. M. Fraser: Whole-genome comparison of Mycobacterium tuberculosis clinical and laboratory strains, 2002, Journal
of Bacteriology, 184, 5479-5490. [10] J. C. Camus, M. J. Pryor, C. Medigue, S. T. Cole: Re-annotation of the genome sequence of Mycobacterium tuberculosis H37Rv, 2002, Microbiology, 148, 2967- 2973. [11] J. Collazos, J. Mayo, E. Martinez: The chemotherapy of tuberculosis – from the past to the future, 1995, Respiratory Medicine, 89, 463-469. [12] Y. L. Janin: Antituberculosis drugs: Ten years of research, 2007, Bioorganic & Medicinal
Chemistry, 15, 2479-2513. 65
[13] S. Egerszegi: A tuberculosis kezelésének aktuális problámái, 1995, Magyar Infektológiai
Társaság tudományos és továbbképző folyóirata, 2, 20-26. [14] T. R. Frieden, T. R. Sterling, S. S. Munsiff, C. J. Watt, C. Dye: Tuberculosis, 2003,
Lancet 362, 887-899. [15] I. M. Szabó: A bioszféra mikrobiológiája II., 1989, Akadémiai Kiadó, 927-933. [16] H. Jatzkewitz: Peptamin (glycyl-L-leucyl-mescaline) bound to blood plasma expander (polyvinylpyrrolidone) as a new depot form of a biologically active primary amine (mescaline), 1955, Zeitschrift für Naturforschung, 10b, 27-31. [17] E.F. Panarin, S.N. Ushakov: Synthesis of polymer salts and amidopenicillines, 1968,
Khim.- Pharm. Zhur., 2, 28-31. [18] H. Ringsdorf: Structure and properties of pharmacologically active polymers, 1975,
Journal of Polymer Science, Polym. Symp., 51, 135-153. [19] J. Kopecek, P. Rejmanova, J. Strohalm, K. Urlich, B. Rihova, V. Chytry, J. B. Lloyd, R. Duncan: Synthetic polymeric drugs, 1991, US Patent 5,037,883 [20] P. Gottlieb, E. Hazum, E. Tzehoval, M. Feldman, S. Segal, M. Fridkin: Receptormediated endocytosis of tuftsin by macrophage cells, 1984, Biochemical and Biophysical
Research Communications, 119, 203-211. [21] N. J. Bumo, V. A. Najjar, J. Reichler: The characteristics of purified HL60 Tuftsin receptors, 1990, Molecular and Cellular Biochemistry, 92, 77-84. [22] P. R. Taylor, L. Martinez-Pomares, M. Stacey, H. H.Lin, G. D. Brown, S. Gordon: Macrophage receptors and immune recognition, 2005, Annual Review of Immunology, 23, 901–944. [23] S. M. Moghimia, A. R. Rajabi-Siahboomib: Recent advances in cellular, sub-cellular and molecular targeting, 2000, Advanced Drug Delivery Reviews, 41, 129–133. [24] J. L. Goldstein, Y. K. Ho, S. K. Basu, M. S. Brown: Binding site on macrophages that mediates uptake and degradation of acetylated low density lipoprotein, producing massive cholesterol deposition, 1979, Proceedings of the National Academy of Sciences
of the United States of America, 76, 333–337. [25] M. Krieger, J. Herz: Structures and functions of multiligand lipoprotein receptors: macrophage scavenger receptors and LDL receptor-related protein (LRP), 1994, Annual
Review of Biochemistry, 63, 601–637. [26] N. Platt, R. Haworth, L. Darley, S. Gordon: The many roles of the class A macrophage scavenger receptor, 2002, International Review of Cytology, 212, 1–40. [27] S. Mukhopadhyay, S. Gordon: The role of scavenger receptors in pathogen recognition and innate immunity, 2004, Immunobiology, 209, 39–49. [28] K. J. Moore, M. W. Freeman: Scavenger receptors in atherosclerosis: beyond lipid uptake, 2006, Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology, 26, 1702-1711.
66
[29] R. Szabó, L. Peiser, A. Plüddemann, Sz. Bősze, S. Heinsbroek, S. Gordon, F. Hudecz: Uptake of branched polypeptides with poly[l-Lys] backbone by bone-marrow culturederived murine macrophages: the role of the class A scavenger receptor, 2005,
Bioconjugate Chemistry, 16, 1442-1450. [30] R. Szabó, G. Mező, É. Pállinger, P. Kovács, L. Köhidai, Sz. Bősze, F. Hudecz: In vitro
cytotoxicity, chemotactic effect, and cellular uptake of branched polypeptides with poly[LLys] backbone by J774 murine macrophage cell line, 2008, Bioconjugate Chemistry, 19, 1078-1086. [31] V. A. Najjar: Tuftsin, a natural activator of phagocyte cells: an overview, 1983, Annals of
the New York Academy of Sciences, 419, 1–11. [32] S. Khare, L. K. Bhutani, D. N. Rao: Quantitative assessment of tuftsin receptor expression and second messenger during in vitro differentiation of peripheral blood derived monocytes of leprosy patients, 1997, Molecular and Cellular Biochemistry, 171, 1-10. [33] K. B. Bai, O. Láng, E. Orbán, R. Szabó, L. Köhidai, F. Hudecz, G. Mező: Design, synthesis, and in vitro activity of novel drug delivery systems containing tuftsin derivatives and methotrexate, 2008, Bioconjugate Chemistry, 19, 2260-2269. [34] G. Mező, M. Manea, A. Jakab, B. Kapuvári, Sz. Bősze, G. Schlosser, M. Przybylski, F. Hudecz: Synthesis and structural characterization of bioactive peptide conjugates using thioeter linkage approaches, 2004, Journal of Peptide Science, 10, 701-713. [35] J. Kopecek, P. Kopecková, T. Minko, Z.-R. Lu: HPMA copolymer-anticancer drug conjugates: design, activity, and mechanism of action, 2000, European Journal of
Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 50, 61-81. [36] M. Sela: Chemical synthesis for the understanding of immune response phenomena and for their medical application, 1980, In: C. Larrade, K. Wills, L. Oritz-Oritz, et al. eds. Molecules, cells and parasites in immunology, New York, Academic Press, 215-228. [37] M. Algamor, A. Ron, J. Bar-Tana: Chemotaxis in Tetrahymena thermophilia, 1981, Cell
Motility, 1, 261-268. [38] G. Mező, J. Kajtár, I. Nagy, Zs. Majer, M. Szekerke, F. Hudecz: Carrier design: synthesis and conformational studies of poly(L-lysine) based branched polypeptides with hydroxyl groups in the side chains, 1997, Biopolymers, 42, 719-730. [39] M. Fridkin, V. A. Najjar: Tuftsin: its chemistry, biology, and clinical potential, 1989,
Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 24, 1-40. [40] C. M. Gupta, W. Haq: Tuftsin-bearing liposomes as antibiotic carriers in treatment of macrophage infections, 2005, Methods in Enzymology, 391, 291-304.
67
[41] W. Zeng, S. Ghosh, M. Macris, J. Pagnon, D. C. Jackson: Assembly of synthetic peptide vaccines by chemoselective ligation of epitopes: influence of different chemical linkages and epitope orientations on biological activity, 2001, Vaccine, 19, 3843-3852. [42] M. Manea, M. Przybylski, F. Hudecz, G. Mező: Design, structural, and immuno-analytical properties of antigenic bioconjugates comprising a beta-amyloid-plaque specific epitope, 2008, Biopolymers, 90, 94–104. [43] J. Shao, J. P. Tam: Unprotected peptides as building blocks for the synthesis of peptide dendrimers with oxime, hydrazone, and thiazolidine linkages, 1995, Journal of the
American Chemical Society, 117, 3893–3899. [44] I. P. Decostaire, D. Leliévre, H. Zhang, A. F. Delmas: Controlling the outcome of overacylation of N-protected aminooxyacetic acid during the synthesis of an aminooxypeptide for chemical ligation, 2006, Tetrahedron Letters, 47, 7057–7060. [45] C. Jiménez-Castells, B. G. de la Torre, R. G. Gallegoa, D. Andreua: Optimized synthesis of aminooxy-peptides as glycoprobe precursors for surface-based sugar–protein interaction studies, 2007, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 17, 5155–5158. [46] V. Duléry, O. Renaudet, P. Dumy: Ethoxyethylidene protecting group prevents Noveracylation in aminooxy peptide synthesis, 2007, Tetrahedron, 63, 11952–11958. [47] L. E. Canne, A. R. Ferré-D'Amaré, S. K. Burley, S. B. H. Kent: Total Chemical Synthesis of a Unique Transcription Factor-Related Protein: cMyc –Max, 1995, Journal of the
American Chemical Society, 117, 2998-3007. [48] K. Rose, W. Zeng, P.O. Regamey, I.V. Chernushevich, K. G. Standing, H. F. Gaertner: Natural peptides as building blocks for the synthesis of large protein-like molecules with hydrazone and oxime linkages, 1996, Bioconjutate Chemistry, 7, 552-556. [49] S. Majumdar, S. K. Basu: Killing of intracellular Mycobacterium tuberculosis by receptormediated drug delivery, 1991, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 35, 135-140. [50] K. Horváti, G. Mező, N. Szabó, F. Hudecz, Sz. Bősze: Peptide conjugates of therapeutically used antitubercular isoniazid – design, synthesis and antimycobacterial effect, 2009, Journal of Peptide Science, 15, 385-391. [51] A. F. Cunningham, C. L. Spreadbury: Mycobacterial stationary phase induced by low oxygen tension: cell wall thickening and localization of the 16-kilodalton alphacrystallin homolog, 1998, Journal of Bacteriology, 180, 801-808. [52] K. Hill, C. B. Pénzes, B. G. Vértessy, Z. Szabadka, V. Grolmusz, É. Kiss: Amphiphilic nature of new antitubercular drug candidates and their interaction with lipid monolayer, 2008, Progress in Colloid and Polymer Science, 135, 87–92. [53] J. J. Irwin, B. K. Shoichet: ZINC − A free database of commercially available compounds for virtual screening, 2005, Journal of Chemical Information and Modeling, 45, 177-182.
68
[54] C. M. Sassetti, D. H. Boyd, E. J. Rubin: Genes required for mycobacterial growth defined by high density mutagenesis, 2003, Molecular Microbiology, 48, 77-84. [55] G. Barany, N. Kneib-Cordonier, D. G. Mullen: Solid-phase peptide synthesis: a silver anniversary report, 1987, International Journal of Peptide and Protein Research, 30, 705739. [56] A. G. Grant: Principles and Practice of Solid-Phase Peptide Synthesis, 1992, Synthetic
peptides A User's Guide, Oxford, University Press, 88-96. [57] L. A. Carpino, G. Y. Han: The fluorenylmethoxycarbonyl amino-protecting group, 1972,
Journal of Organic Chemistry, 37, 3404-3409. [58] R. Newcomb, B. Szoke, A. Palma, G. Wang, X. Chen, W. Hopkins, R. Cong, J. Miller, L. Urge, K. Tarczy-Hornoch, J. A. Loo, D. J. Dooley, L. Nadasdi, R. W. Tsien, J. Lemos, G. Miljanich: Selective peptide antagonist of the class E calcium channel from the venom of the tarantula Hysterocrates gigas, 1998, Biochemistry, 37, 15353-15362. [59] A. K. Tickler, C. J. Barrow, J. D. Wade: Improved preparation of amyloid-beta peptides using DBU as N alpha-Fmoc deprotection reagent, 2001, Journal of Peptide Science, 7, 488-494. [60] J. D. Wade, J. Bedford, R. C. Sheppard, G. W. Tregear: DBU as an N alpha deprotecting reagent for the fluorenylmethoxycarbonyl group in continuous flow solidphase peptide synthesis, 1991, Journal of Peptide Research, 4, 194-199. [61] W. König, Eine neue Methode zur Synthese von Peptiden: Aktivierung der Carboxylgruppe mit Dicyclohexylcarbodiimid unter Zusatz von 1-hydroxybenzotriazolen, 1970, Chemische Berichte, 103, 788-798. [62] S. Mojsov, A. R. Mitchell, R. B. Merrifield: A quantitative evaluation of methods for coupling asparagine, 1980, The Journal of Organic Chemistry, 45, 555-560. [63] E. Kaiser, R. L. Colescott, C. D. Bossinger, P. I. Cook: Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase peptide synthesis of peptides, 1970, Analytical
Biochemistry, 34, 595-598. [64] E. Kaiser, R. L. Colescott, C. D. Bossinger, D. B. Olser: Color test for terminal prolyl residues in the solid-phase synthesis of peptides, 1980, Analytica Chimica Acta, 118, 149-151. [65] K. Horváti, Sz. Bősze, F. Hudecz, H. Medzihradszky-Schweiger: A simple method for monitoring the cysteine content in synthetic peptides, 2008, Journal of Peptide Science, 14, 838–844. [66] T. S. Hawely, R. G. Hawely: Methods in molecular biology, Volume: 263 (2005): Flow Cytometry Protocols, 2nd ed., Humana Press Inc., Totowa, NJ, Chapter 1, 1-33.
69
[67] J. M. Mullins: Overwiev of fluorochromes, From: Methods in Molecular Biology, Vol. 115: Immunocytochemical Methods and Protocols, Edited by: L. C. Javois © Humana Press Inc., Totowa, NJ, Chapter 14, 97-105. [68] G. B. Wisdom: Conjugation of antibodies to fluorescein or rhodamine, From: Methods in Molecular Biology, vol. 295: Immunochemical Protocols, Third Edition, Edited by: R. Burns © Humana Press Inc., Totowa, NJ, Chapter 10, 131-134. [69] S. Kei Lau, F. Zaccardo, M. Little, P. Banks: Nanomolar derivatizations with 5-carboxyfluorescein
succinimidyl
ester
for
fluorescence
detection
in
capillary
electrophoresis, 1998, Journal of Chromatography A, 809, 203-210. [70] Classic reactive fluorescent labeling dyes and their applications, ABD Bioquest, Inc., 923 Thompson Place, Sunnyvale, CA 94085. Tel: 408-733-1055; Technical Support: http://abdbioquest.com/images/B1200d1 [71] W. Schöniger: Eine mikroanalitische Schnellbestimmung von Halogen in organishen Substances, 1954, Mikrochlinica Acta, 1, 123-129. [72] L. Sula: WHO cooperative studies on a simple culture techniques for the isolation of mycobacteria: 1. Preparation, lyophilization and reconstitution of a simple semisynthetic concentrated liquid medium; culture technique, growth pattern of different mycobacteria, 1963, Bulletin of the World Health Organization, 29, 589-606. [73] L. Sula: WHO cooperative studies on a simple culture techniques for the isolation of mycobacteria: 2. Comparison of the efficacy of lyophilized liquid medium with that of Lowenstein-Jensen (L-J) medium, 1963, Bulletin of the World Health Organization, 29, 607-625. [74] B. Lányi: Folyékony mycobacterium tenyésztésre alkalmas standard táptalaj, Módszertani Útmutató, 1980, Budapest, Járványügyi és Klinikai Bakteriológia [75] J. McFarland: Nephelometer: an instrument for estimating the number of bacteria in suspensions used for calculating the opsonic index and for vaccines, 1907, Journal of
the American Medical Association, 14, 1176-1178. [76] E. Löwenstein: Die Zachtung der Tuberkelbazillen aus dem stramenden Blute. Zentralb., 1931, Bakteriol Parasitenkd. infektionskr. hyg. Abt. I orig., 120, 127. [77] K. A. Jensen: Rinzuchtung und Typenbestimmung von Tuberkelbazillentamen. Zentralb., 1932, Bakteriol Parasitenkd. infektionskr. hyg. Agt. I Orig., 125, 222.
70
Köszönetnyilvánítás Köszönetet mondok Dr. Perczel András tanszékvezető egyetemi tanárnak, aki lehetővé tette, hogy az ELTE Szerves Kémiai Tanszéken dolgozhassak. Köszönöm
Dr.
Hudecz
Ferencnek,
az
MTA-ELTE
Peptidkémiai
Kutatócsoport
vezetőjének, hogy lehetővé tette, hogy a kutatócsoportban folyó munkába bekapcsolódjak. Köszönöm Dr. Horváti Kata tudományos munkatársnak és Dr. Bősze Szilvia tudományos főmunkatársnak, témavezetőimnek, hogy segítségemre voltak a téma kidolgozásában és a dolgozat elkészítésében.
71
