Új prognosztikai markerek és a gyulladásos válasz szerepe a krónikus szívelégtelenség patomechanizmusában

Új prognosztikai markerek és a gyulladásos válasz szerepe a krónikus szívelégtelenség patomechanizmusában Doktori értekezés

Dr. Gombos Tímea Semmelweis Egyetem Molekuláris Orvostudományok Doktori Iskola

Témavezető: Dr. Prohászka Zoltán, az MTA doktora Hivatalos bírálók: Dr. Nyolczas Noémi, főorvos Ph.D. Dr. Molnár Miklós Zsolt, Ph.D. Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Oláh Imre egyetemi tanár, az MTA doktora Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Holub Marianna tudományos munkatárs, Ph.D. Dr. László Zoltán osztályvezető főorvos, Ph.D.

Budapest 2010.

Tartalomjegyzék: 1. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ............................................................................................................... 4 2. BEVEZETÉS .......................................................................................................................................... 5 2.1. A KRÓNIKUS SZÍVELÉGTELENSÉG ...................................................................................................... 5 2.1.1. Definíció.................................................................................................................................... 5 2.1.2. Epidemiológia és etiológia........................................................................................................ 6 2.1.3. Patofiziológia ............................................................................................................................ 6 2.1.4. Prognosztikai faktorok .............................................................................................................. 8 2.2. SZISZTÉMÁS GYULLADÁSOS VÁLASZREAKCIÓ SZÍVELÉGTELENSÉGBEN........................................... 10 2.2.1. A gyulladás etiológiája ........................................................................................................... 11 2.2.1.1. A szív direkt cytokin termelése ....................................................................................................... 11 2.2.1.2. Hemodinamikai eltérések, oxidatív stressz ...................................................................................... 12 2.2.1.3. Az endotoxin hipotézis .................................................................................................................... 12 2.2.1.4. Neurohormonális aktiváció.............................................................................................................. 13

2.2.2. A vizsgált gyulladásos cytokinek ............................................................................................. 14 2.2.2.1. TNF-α .............................................................................................................................................. 14 2.2.2.2. Szolúbilis TNF receptorok .............................................................................................................. 15 2.2.2.3. IL-6.................................................................................................................................................. 17

2.2.3. A gyulladás kardiális következményei ..................................................................................... 17 2.2.3.1. Kontraktilis diszfunkció .................................................................................................................. 17 2.2.3.2. Remodelling, myocardium hypertrophia ......................................................................................... 18 2.2.3.3. Az extracelluláris mátrix változásai ................................................................................................. 18 2.2.3.4. Apoptózis ........................................................................................................................................ 19

2.2.4. A gyulladás egyéb szervrendszerekre kifejtett hatásai ............................................................ 19 2.2.4.1. Anémia ............................................................................................................................................ 19 2.2.4.2. Cachexia .......................................................................................................................................... 20 2.2.4.3. Endothel diszfunkció ....................................................................................................................... 20

2.3. VAZOREGULÁCIÓS FEHÉRJÉK SZÍVELÉGTELENSÉGBEN .................................................................... 21 2.3.1. B-típusú natriuretikus peptid .................................................................................................. 21 2.3.2. Endothelin-1............................................................................................................................ 22 2.3.2.1. Az endothelin-1 szerepe szív- és érrendszeri betegségekben........................................................... 24 2.3.2.2. Az endothelin-1 szívelégtelenségben............................................................................................... 25 2.3.2.3. Az endothelin-1-gyel kapcsolatos terápiás lehetőségek ................................................................... 26

2.3.3. Adrenomedullin ....................................................................................................................... 27 2.3.3.1. Az adrenomedullin biológiai hatásai ............................................................................................... 28 2.3.3.2. Az adrenomedullin szerepe szív- és érrendszeri betegségekben ...................................................... 29 2.3.3.3. Az adrenomedullin szívelégtelenségben .......................................................................................... 30 2.3.3.4. Az adrenomedullinnal kapcsolatos terápiás lehetőségek ................................................................. 30

2.4. A 70KDA MOLEKULATÖMEGŰ HŐSOKKFEHÉRJÉK ........................................................................... 31 2.4.1. A 70kDa-os Hsp-k családja, a Hsp70 genetikája .................................................................... 32 2.4.1.1. HspA1B A(+1267)G ........................................................................................................................ 33 2.4.1.2. HspA1L C(+2437)T ......................................................................................................................... 34

2.4.2. A Hsp70 biológiai funkciója ................................................................................................... 34 2.4.3. Az extracelluláris Hsp70 ......................................................................................................... 35 2.4.4. Az szérum Hsp70 szintek patológiás állapotokban ................................................................. 36 2.5. A THROMBOEMBOLIÁS SZÖVŐDMÉNYEK SZÍVELÉGTELENSÉGBEN ................................................... 36 2.5.1. A fokozott véralvadás okai szívelégtelenségben ...................................................................... 37 2.5.2. A von Willebrand faktor .......................................................................................................... 38 2.5.3. ADAMTS13 – a VWF hasító proteáz ...................................................................................... 40 2.5.4. A VWF és az ADAMTS13 szerepe a cardiovascularis megbetegedésekben ............................ 41 2.5.4.1. VWF ................................................................................................................................................ 41 2.5.4.2. ADAMTS13 .................................................................................................................................... 42

3. CÉLKITŰZÉSEK ................................................................................................................................ 44 4. MÓDSZEREK ...................................................................................................................................... 48 4.1. BETEGEK BEVONÁSA A VIZSGÁLATBA ............................................................................................. 48 4.2. BETEGEK KÖVETÉSE ........................................................................................................................ 49 4.3. LABORATÓRIUMI MÉRÉSEK.............................................................................................................. 49

2

4.3.1. Gyulladásos paraméterek meghatározása .............................................................................. 50 4.3.1.1. TNF-α, IL-6 ..................................................................................................................................... 50 4.3.1.2. TNF-RI, TNF-RII ............................................................................................................................ 50

4.3.2. Vazoregulációs peptidek meghatározása ................................................................................ 51 4.3.2.1. NT-proBNP ..................................................................................................................................... 51 4.3.2.2. MR-proADM, CT-proET-1 ............................................................................................................. 51

4.3.3. Hősokkfehérje meghatározások .............................................................................................. 52 4.3.3.1. Szolúbilis Hsp70.............................................................................................................................. 52 4.3.3.2. HspA1B genotipizálás...................................................................................................................... 53 4.3.3.3. HspA1L genotipizálás ...................................................................................................................... 53

4.3.4. ADAMTS13 aktivitás meghatározása ..................................................................................... 54 4.3.5. VWF:antigénszint mérése ....................................................................................................... 54 4.4. STATISZTIKAI SZÁMÍTÁSOK ............................................................................................................. 55 5. EREDMÉNYEK ................................................................................................................................... 56 5.1. A BETEGPOPULÁCIÓ JELLEMZÉSE .................................................................................................... 56 5.1.1. Bevételi adatok ........................................................................................................................ 56 5.1.2. Követéses adatok ..................................................................................................................... 58 5.2. VAZOAKTÍV PEPTIDEK SZEREPÉNEK VIZSGÁLATA SZÍVELÉGTELENSÉGBEN ..................................... 60 5.2.1. MR-proADM, CT-proET-1, NT-proBNP és a szívelégtelenség súlyossága ............................ 60 5.2.2. NT-proBNP, CT-proET-1 és MR-proADM biológiai összefüggései szívelégtelenségben ....... 62 5.2.3. Az MR-proADM és a CT-proET-1 összefüggése a gyulladásos markerekkel ......................... 63 5.2.4. Az MR-proADM és a CT-proET-1 prognosztikai értéke szívelégtelenségben ......................... 64 5.3. SHSP70 SZINT ÉS A HSP70 GÉN POLIMORFIZMUSOK SZÍVELÉGTELENSÉGBEN................................... 67 5.3.1. A sHsp70 szint és a szívelégtelenség súlyossága..................................................................... 67 5.3.2. A Hsp70 gén polimorfizmusa szívelégtelenségben .................................................................. 69 5.3.3. A sHsp70 szint és a Hsp70 gén polimorfizmus összefüggése a betegség kimenetével ............. 70 5.3.4. A sHsp70 biológiai összefüggései ........................................................................................... 71 5.4. AZ ADAMTS13 ÉS A VWF SZEREPE SZÍVELÉGTELENSÉGBEN ........................................................ 72 5.4.1. ADAMTS13 aktivitás és VWF:Ag szint a szívelégtelenség súlyosságának függvényében ....... 72 5.4.2. Az ADAMTS13 és a VWF hányados prediktív értéke szívelégtelenségben.............................. 73 5.4.3. Az ADAMTS13 aktivitás és a VWF:Ag biológiai összefüggései .............................................. 75 6. MEGBESZÉLÉS .................................................................................................................................. 77 6.1. VAZOAKTÍV PEPTIDEK ..................................................................................................................... 77 6.1.1. A vazoaktív peptidek és a szívelégtelenség súlyossága ........................................................... 77 6.1.2. A vazoaktív peptidek biológiai összefüggései.......................................................................... 78 6.1.3. Az MR-proADM, a CT-proET-1 és a gyulladás kapcsolata .................................................... 79 6.1.4. Az MR-proADM és a CT-proET-1 prognosztikus értéke szívelégtelenségben ........................ 82 6.2. HSP70 ÉS GENETIKAI POLIMORFIZMUSAI ......................................................................................... 83 6.2.1. sHsp70 szintje szívelégtelenségben ......................................................................................... 84 6.2.2. A sHsp70 szint emelkedés lehetséges okai .............................................................................. 84 6.2.3. A HspA1B és HspA1L polimorfizmusa .................................................................................... 85 6.3. ADAMTS13 AKTIVITÁS ÉS VWF:AG SZINT.................................................................................... 87 6.3.1. Az ADAMTS13 aktivitás .......................................................................................................... 87 6.3.2. Az ADAMTS13/VWF hányados változásának klinikai jelentősége ......................................... 88 6.4. KITEKINTÉS ..................................................................................................................................... 90 7. KÖVETKEZTETÉSEK....................................................................................................................... 92 8. ÖSSZEFOGLALÁS ............................................................................................................................. 94 9. IRODALOMJEGYZÉK ...................................................................................................................... 96 10. SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE ........................................................................................... 135 11. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS .......................................................................................................... 137

3

1. Rövidítések jegyzéke ACE ADM ALP AMI ANOVA ANP ARB

Angiotenzin konvertáló enzim Adrenomedullin Alkalikus foszfatáz Akut myocardialis infarktus Variancia analízis Atrialis natriuretikus peptid Angiotenzin receptor blokkoló

AT-II AUC BK-EF BMI BNP CAGB

Angiotenzin-II Area under curve Bal kamrai ejekciós frakció Body mass index B-típusú natriuretikus peptid Coronary artery bypass grafting Cirkuláris adenozinmonofoszfát Krónikus szívelégtelenség Konfidencia intervallum Krónikus obstruktív légúti betegség C-reaktív protein C-terminális-pro-ET-1 Diabetes mellitus Dezoxi-ribonukleinsav Etiléndiamin-tetraecetsav

cAMP CHF CI COPD CRP CT-proET DM DNS EDTA ELISA ET-1 γ-GT GFR GOT GPT Hgb HLA HMWVWF HR HRP hsCRP Hsp HT ICD

IL kDa LAK LDH LPS LS MHC

Interleukin kilo Dalton Limfokin aktivált killer sejt Laktát dehidrogenáz Lipopoliszacharid Least squares Fő hisztokompatibilitási génkomplex MMP Matrix metalloproteáz MR-proADM Mid-regionális-pro-ADM NK sejt Natural killer sejt NO Nitrogén-monoxid NT-proBNP N-terminális-proBNP NYHA New York Heart Association OPD

o-phenylene-diamine

OR PAH PBS

Odds ratio Pulmonális artériás hypertonia Phosphate Buffered Saline

PCI PF PM PTCA RAAS

Percutan coronaria intervenció Pitvar fibrilláció Pacemaker Percutan coronaria angioplastica Renin-angiotenzin-aldoszteron rendszer Red cell distribution width

Enzyme-Linked Immun Sorbent Assay Endothelin-1

RDW

Gamma-glutamyltransferase Glomerulus filtrációs ráta Glutarát-oxálacetát transzamináz Glutamát-piruvát transzamináz Hemoglobin Humán leukocyta antigén High molecular weight VWF

sTNF-R sHsp70 SD

Receiver Operating Characteristic Szolúbilis TNF-R Szérum Hsp70, szolúbilis Hsp70 Standard deviáció

TGF-β

Transforming growth factor beta

TIA TIMP TLR

Tranziens ischaemiás attak Szöveti MMP inhibítor Toll-like receptor

Hazard risk Torma-peroxidáz high sensitivity CRP Hősok fehérje Hypertonia Intracardialis defibrillátor

TNF- α TNF-R TTP UL-VWF VWF VWF:Ag

Tumor-nekrózis-faktor-α TNF receptor Thrombocytopeniás purpura Ultra large VWF von Willebrand faktor VWF antigén

ROC

4

2. Bevezetés 2.1. A krónikus szívelégtelenség 2.1.1. Definíció Az utóbbi évtizedekben többféleképpen definiálták a szívelégtelenséget, ám tökéletes, csupán objektív értékeken alapuló meghatározás máig sem alakult ki. Az egyik definíció szerint a szívelégtelenség egy olyan komplex klinikai szindróma, melyet bármilyen strukturális vagy funkcionális kardiális rendellenesség létrehozhat, amely a bal kamra szisztolés és/vagy diasztolés funkcióját károsítja. A krónikus szívelégtelenség jellegzetes panaszokkal és klinikai tünetekkel jellemezhető. A betegek fő panaszai a nyugalomban vagy fizikai terhelés során jelentkező légszomj és fáradtságérzés, illetve a vízretenció jelei, például a bokaduzzanat. Fő klinikai tünetei a tachycardia, a tachypnoe és a krónikus pangás jelei (pulmonális, gastrointestinalis, alsó végtagi ödéma, hepatomegalia) [1, 2]. Az Európai Kardiológiai társaság (ESC) 2008-as irányelvei [3] alapján a szívelégtelenség definíciója három kritériumra épül, a diagnózis felállításához mindháromnak teljesülnie kell: Szívelégtelenségre jellemző panaszok nyugalomban vagy terhelésre Szívelégtelenségre jellemző tünetek Kardiális diszfunkció igazolása objektív módszerrel (pl. cardiomegalia, echocardiographiával észlelt eltérések, emelkedett natriuretikus peptid szint) A bal kamra funkció károsodásának jellege alapján a krónikus szívelégtelenségen belül megkülönböztetünk szisztolés és diasztolés formát. A két funkciózavar azonban gyakran keveredik, nem válik el határozottan egymástól. A szisztolés szívelégtelenségre inkább jellemző a csökkent bal kamrai ejekciós frakció, hátterében legtöbbször ischaemias károsodás áll. A diasztolés funkciózavart megtartott bal kamrai ejekciós frakciós szívelégtelenségként is emlegetik, jellemzője a relaxációs zavar. Idősebb korban és nőknél gyakoribb, legtöbbször myocardialis hypertrophia vagy fibrosis okozza [1]. Dolgozatomban ’szívelégtelenség’ megnevezéssel a betegség krónikus, bal kamrai ejekciós frakció csökkenéssel járó formáját jelölöm.

5

2.1.2. Epidemiológia és etiológia A szívelégtelenség igen gyakori betegség, mely jelentős népegészségügyi problémát jelent az iparilag fejlett országokban. Míg a koszorúér-betegség és a stroke miatti halálozás ezekben az országokban az elmúlt évtizedekben csökkent, addig a krónikus szívelégtelenség prevalenciája drámaian növekedett. A betegség előfordulása az átlagpopulációban 1-2% között van, szoros összefüggést mutat az életkorral, 75 év felett akár több, mint 10% is lehet. Európában körülbelül 10 millió ember érintett [1, 4, 5]. A szívelégtelenség kezelésében az elmúlt évtizedben bekövetkezett jelentős fejlődés ellenére a betegség mortalitása ma is igen magas, eléri vagy meg is haladja a malignus betegségekét [6]. A szívelégtelenség multifaktoriális betegség, melynek hátterében ischaemiás szívbetegség, magas vérnyomás, billentyűbetegség, toxikus hatás (alkohol) és idiopathiás cardiomypathia is állhat. Az esetek 25 százalékában részletes kivizsgálást követően is ismeretlen az etiológia. Egy több ezer fős vizsgálat adatai szerint a leggyakrabban ischaemiás

szívbetegségre vezethető vissza a szívelégtelenség

kialakulása, a betegek 60 százalékánál sikerült coronaria betegséget igazolni. A kórkép kialakulása azonban ritkán vezethető vissza egy okra, a koszorúér-betegségben szenvedőknél átlagosan 1,9, míg a jelentős koszorúér betegség nélküli csoportban átlagosan 1,5 etiológiai tényezőt találtak [7].

2.1.3. Patofiziológia A szívelégtelenség patofiziológiájáról alkotott elképzelésben az utóbbi két évtizedben jelentős szemléletváltozás történt. Míg korábban a hemodinamikai koncepció uralkodott a betegség kialakulásában, progressziójában és így kezelésében is, újabban a hangsúly áttevődött a neurohormonális rendszerre. A diuretikumok és a pozitív inotrop szerek mellett az 1980-as évektől kezdve az ACE-gátlók, majd később a β-adrenerg receptor gátlók és az aldoszteron antagonisták is bekerültek a szívelégtelenség során alkalmazható készítmények közé [8, 9]. A betegség kialakulásának kezdetét egy mechanikus modellekkel is leírható pumpafunkció elégtelenség jellemzi. Később a szívelégtelenség etiológiájától függetlenül, a pumpafunkció romlása következtében krónikus pangás, perfúziócsökkenés, hypoxia és elektrolitzavar alakul ki, amely gyakorlatilag a szervezet összes szervét és szervrendszerét érinti. Szöveti szinten

6

apoptózis történik [10], fokozódik egyes cytokinek termelése, aktiválódik a stresszválasz és az immunrendszer. Következményekén kezdetben enyhe, majd egyre súlyosabb krónikus többszervi elégtelenség alakul ki, mely érinti többek között a májat, a csontvelőt, a vázizmokat, a veséket, a tüdőt, az emésztőrendszert és magát a szívet is (1. ábra).

Csontvelõ

Alulmûködés

Anémia

Malnutrició

Gyulladás

Emésztõ R Endotoxin adsorb.

Elõrehaladott szívelégtelenség: -hypoxia -perfúzió csökkenés -elektrolit rendellenésségek

Cachexia

Tüdõk

Hypoxia

Szövetek

Apoptózis

Szív

BNP

Szervi diszfunkció

Sejtszétesés Halál Májelégtelenség Stresszválasz

Máj Vesék

Agy

Szintetizáló képesség Veseelégtelenség

GFR

Folyadék retenció

Étvágy Neuroendokrin R aktiváció

Életminõség romlás

Endothel diszfunkció

1. ábra. A krónikus szívelégtelenségben patomechanizmusának sematikus ábrázolása.

kialakuló

többszervi

elégtelenség

Az így kialakuló következményes és kompenzáló folyamatok sora szinte végtelen, csak a lényegesebbeket emelem ki. Már a betegség kezdeti szakaszában aktiválódik a neurohormonális rendszer, fokozódik az adrenerg hatás, nő a renin-angiotenzin tengely (RAAS) szerepe, vazoaktív és natriuretikus fehérjék sora termelődik [10]. Ezek a neurohormonális változások a korai stádiumban a fiziológiás vérnyomás, perctérfogat és elektrokitháztartás fenntartását eredményezik. Később károssá válnak, elősegítik a bal kamra diszfunkció progresszióját, a szívizom remodellinget és felborítják a vazoregulációs rendszerek kényes egyensúlyát [11]. A remodelling kialakulásában többek között fontos szerepet játszik még az oxigén- és tápanyaghiány, a reaktív oxigén

7

gyökök és a gyulladásos folyamatok. A remodelling során megváltozik a szívizomban lévő sejtek anyagcseréje, összetétele és térfogata és ezáltal a bal kamra geometriája és szerkezete. Az így kialakult változások progresszívek, ördögi körként működnek, hatásukra egyaránt romlik a szív szisztolés és diasztolés funkciója, növekszik a ritmuszavarok kockázata [12]. Az emésztőrendszerben a bélfalödéma miatt fokozódik a bakteriális endotoxinok beáramlása, csökken a felszívódás ezáltal malnutrició, nyomelem és kalóriahiány alakul ki. Ezt a folyamatot tovább erősíti a romló étvágy, míg a fokozott katabolizmus következtében csökken az izomtömeg. A folyamatok összessége kardiális cachexiához vezet [13, 14]. Ezzel párhuzamosan romlik a vesék perfúziója, aktiválódik a renin-angiotenzin rendszer, mérséklődik az erythropoetin termelése és a kiválasztása, fokozódik a proteinuria, a vízretenció és az elektrolitzavar, a vesefunkciós paraméterek emelkednek [15]. Az ödéma és az érfalfeszülés aktiválja a vazoaktív fehérjék termelését, endothel diszfunkció alakul ki, fokozódik a thrombosis hajlam [16]. Csökken a máj szintetikus kapacitása, a kevesebb albumin csökkenti a vér ozmolaritását, még tovább fokozódik az ödéma. Sérül a véralvadási rendszer is, emelkedik a bilirubin és a transzaminázok szérumszintje, súlyos esetben kardiális cirrhosis és ascites alakulhat ki [17]. A csontvelő perfúzió csökkenése mellett a nyomelem, vitamin- és erythropoetin hiány is elősegíti az anémia kialakulását [18]. A tüdő pangása tovább fokozza az hypoxiat, dyspnoe, gyengeség alakul ki. Az agyi áramláscsökkenés hozzájárul a neuroendokrin rendszer aktiválódásához, hosszas fennállása kardiális demenciához vezet [19, 20]. Dolgozatomban ezen - a szívelégtelenség etiológiájától független, a betegség későbbi szakaszában kialakuló - mechanizmusok közül a gyulladásos folyamatokra és a gyulladással kapcsolatban álló egyéb útvonalakra koncentrálok.

2.1.4. Prognosztikai faktorok Klasszikus értelemben véve a prognosztikai faktorok lehetővé teszik a betegség kimenetelének becslését, míg technikai értelemben prognosztikai faktornak nevezhetjük azokat a paramétereket, melyek nagy esetszámú vizsgálatokban statisztikailag szoros összefüggést mutatnak a betegség kimenetelével. Ebből adódik, hogy a prognosztikai faktorok többségére igaz, hogy önmagában, egy egyénre vetítve nem, csak populációs szinten alkalmasak a prognózis tényleges becslésére. Megismerésük kimagaslóan

8

fontos, mert segítségükkel felderíthetőek a patomechanizmus főbb útvonalai, segíthetik az alapkutatás irányvonalainak meghatározását és a betegség kialakulásának megértését. Ismeretükben könnyebben állíthatók fel terápiás irányelvek, továbbá lehetővé tehetik azoknak a betegcsoportoknak az elkülönítését, melyekben bizonyos terápiás lépések kimondottan előnyösek lehetnek [21]. Kifejezetten előnyös tulajdonságokkal rendelkező prognosztikai faktorok a klinikai gyakorlatban a prognózis becslésén kívül segíthetik a diagnózis felállítását, kvantitatív módon jellemezhetik a betegség súlyosságát és hozzájárulhatnak a terápia helyességének megítéléséhez. Az ideális prognosztikai markernek a magas specificitás, szenzitivitás és reprodukálhatóság mellett jellemzője, hogy független a dermográfiai és klinikai változóktól, prospektív vizsgálatokkal validált és meghatározása egyszerű, olcsó, könnyen elérhető, megbízható [21]. A prognosztikai faktorok közül a szívelégtelenségben is használatosak az olyan általános, a beteget jellemző paraméterek, mint például az életkor, a társbetegségek fennállása vagy a betegség súlyossága. Ez utóbbira a szívelégtelenek körében leggyakrabban a NYHA (New York Heart Association) stádiumbeosztást, az ödéma jelenlétét, a bal kamrai ejekciós frakciót vagy a terhelhetőséget használják [21]. A betegségre specifikus prognosztikai faktorok, ezen belül is a vérből mérhető biomarkerek közül a natriuretikus peptidek váltak a legjelentősebbé az elmúlt évtizedben [22]. A B-típusú natriuretikus peptid (BNP) egyre nagyobb szerephez jut a klinikai gyakorlatban, diagnosztikus markerként is használható [23, 24]. Számos nagy esetszámú

vizsgálat folyik,

mely a

BNP

irányította kezelés hatékonyságát

tanulmányozza, az eddigi eredmények pozitívak [25, 26]. Jó prognosztikai faktornak bizonyultak a szisztémás gyulladásos válasz mértékét tükröző paraméterek is, mint például a tumor nekrózis faktor-α (TNF- α), az interleukin-6 (IL-6) vagy a klinikai gyakorlatban használt C-rekatív protein (CRP) [27]. A jó prognosztikus érték ellenére a gyulladás mérséklését célzó terápiás lépések, a várttal ellentétben, egyelőre nem jártak sikerrel [28, 29]. A metabolikus változásokat tükröző biomakerek közül kiemelném a húgysav szintet [30], a cachexia jelenlétét [31], a testsúlyvesztést [31, 32], az inzulinrezisztenciát [33], a lipoproteineket [34] és a testtömeg-indexet (BMI) [35]. Az utóbbi kettő, a többivel ellentétben, fordított összefüggést mutat a szívelégtelen betegek mortalitásával. Az elmúlt évek felismerése, hogy az anémia is jelentős prognosztikai faktor

szívelégtelenségben

[36,

37].

Ezt

9

munkacsoportunk

is

megerősítette,

eredményeink szerint az anémia első jeleként is ismert RDW (red cell distribution width), vagyis a vörös vértest átmérő eloszlás szélessége, szignifikáns prediktív értékkel bír a halálozás szempontjából [38]. A klinikai gyakorlatban elterjedtek a több prognosztikai faktor kombinálásával kialakított prediktív modellek. A multimarker stratégia nagy mértékben fokozza a predikció pontosságát. Az első ilyen modell a metabolikus, funkcionális és hemodinamikai (MFH) stádiumbeosztás volt. A magas húgysav, mint metabolikus paraméter, a terheléskor mért legmagasabb oxigén fogyasztás (csúcs VO2), mint a funkcionális állapot jelzője és a csökkent ejekciós frakció, mint hemodinamikai változó, alkották a modellt [30]. Ezt követően vált ismerté a Heart Failure Survival Score (HFSS), mely az etiológiát, a hemodinamikai állapotot, a neurohormonális aktivációt, a myocardialis fibrosist és a funkcionális kapacitást foglalta magába [39]. A Seattle Heart Failure Model egy olyan több változós prognosztikai modell, melyet több, mint tízezer beteg adatai alapján alkottak meg és validáltak [40]. A modell az alap klinikai adatokon kívül (nem, életkor, testsúly, ejekciós frakció, NYHA stádium, szisztolés vérnyomás, ischaemiás etiológia) figyelembe veszi a gyógyszeres terápiát, a QRS szélességet, a ritmusszabályzó készülékeket, a hemoglobin és lymphocyta számot, a húgysav, a teljes koleszterin és a szérum nátrium értéket. Segítségével az is megbecsülhető, hogy különböző terápiás módosítások hogyan befolyásolhatják a túlélést. Nemrégiben a modellt továbbfejlesztették, a BNP értékkel kibővítve még pontosabbá vált [41]. A világhálón keresztül bárki számára elérhető a modell (http://depts.washington.edu /shfm/app.php?accept=1&enter=Enter), mely így könnyen alkalmazható a mindennapi gyakorlatban.

2.2. Szisztémás gyulladásos válaszreakció szívelégtelenségben Elsőként Levine és munkatársai [42] közölték 1990-ben, hogy egy gyulladásos cytokin, a tumor-nekrózis-faktor α (TNF-α) szintje megemelkedett szívelégtelen betegekben. A közlemény megjelenése után rengeteg tanulmány látott napvilágot az úgynevezett kardioinflammatorikus modellről, annak patomechanizmusáról és a szívelégtelenségben betöltött patofiziológiai és prognosztikus jelentőségéről. Kimutatták, hogy a TNF-α mellett egyéb gyulladásos cytokinek, például az interleukin-1β (IL-1β), IL-6, IL-18, IL8 és a macrophag inflammatorikus protein-1α koncentrációja is magas a betegekben

10

[43-47]. Több vizsgálat megerősítette, hogy a cytokinek szintje pozitívan korrelált a betegség súlyosságával (a pumpafunkció csökkenésével és a NYHA stádiumokkal, mely a tüneteken alapuló klinikai stádiumbeosztás), illetve a prognózissal és a mortalitással [45, 48]. Érdekes módon a gyulladásos cytokinek koncentráció növekedését nem kíséri az anti-inflammatorikus cytokinek szintnövekedése, így a szívelégtelenségben tulajdonképpen a cytokin hálózat zavarával állunk szemben [43]. A gyulladás egyéb jelei is megfigyelhetőek a betegségben: az egészségesekhez képest szignifikánsan magasabb a szolúbilis (s) cytokin receptorok szintje, mint például a TNF receptor, sCD14 [27] és az IL-6 receptor gp130 alegysége [49]. A CRP [50-52] és a hsCRP [53] szint a betegség súlyosságával párhuzamosan emelkedik, prognosztikus jelentőséggel bír. Az eddigi eredmények kétségtelenül alátámasztják, hogy a gyulladásnak szerepe van a szívelégtelenség progressziójában, így akár fontos terápiás célpont is lehet. Ahhoz azonban, hogy megfelelő gyulladáscsökkentő, immunmoduláló terápiát dolgozhassanak ki, alapvető fontosságú, hogy pontosan ismerjük a gyulladás okát, kialakulásának módját és egyes részfolyamatainak relatív szerepét.

2.2.1. A gyulladás etiológiája Számos, sokszor egymással összefüggő és egymást kiegészítő elmélet magyarázza a szívelégtelenségben kialakuló krónikus gyulladást. Úgy tűnik, hogy a gyulladáskeltő stimulusok, például az oxidatív stressz, a hypoxia, a neurohormonok, az endotoxinok és egyéb mikrobiális antigének azonos patogenetikai útvonalakat aktiválnak, függetlenül a kiváltó ágenstől [54]. Ebben a fejezetben sorra veszem az etiológiára vonatkozó elméleteket. 2.2.1.1. A szív direkt cytokin termelése Levine és munkatársainak cikke után az első és legkézenfekvőbb hipotézisnek az tűnt, hogy a myocardiumsérülés következtében maga a szívizom termeli a proinflammatorikus cytokineket. Több munkacsoport is kimutatta, hogy a gyulladásos markerek koncentrációja magasabb a koszorúserekben, mint a szisztémás keringésben [55, 56]. Később bebizonyosodott, hogy a sérült myocardium fokozott mennyiségben expresszálja a gyulladásos mediátorokat, például adhéziós molekulákat, TNF-α-t, IL-6-

11

ot, komplement fehérjéket és kemokineket [57-59]. Prabhu és munkatársai kimutatták, hogy a szívizom cytokin termelését tovább erősíti az adrenerg stimuláció [60]. Fontos megjegyezni, hogy a szíven belül nemcsak a cardiomyocyták, hanem egyéb sejtek is részt vehetnek a cytokin termelésben, például az endothelsejtek vagy a fibroblastok [54]. A szívizomban ily módon kialakuló lokális gyulladás azonban nem csak autokrin, illetve parakrin módon fokozza a szívelégtelenség progresszióját, hiszen az inflammatorikus cytokinek a szisztémás keringésbe is bejutnak. 2.2.1.2. Hemodinamikai eltérések, oxidatív stressz A vízháztartás zavara miatt megnövekedett intravascularis folyadék feszíti az érfalat. Ez a feszülés számos sejtben fokozza a cytokintermelést, például az endothelsejtekben és a különböző leukocyta szubpopulációkban [61]. A betegség következtében kialakuló szöveti hypoxia szintén fokozza a cytokinek termelését. A szívelégtelen betegekben az oxidációt elősegítő és gátló folyamatok egyensúlyzavarát is leírták, mely szintén kedvez a gyulladásos folyamatok kialakulásának. 2.2.1.3. Az endotoxin hipotézis Anker és munkatársai fogalmazták meg elsőként ezt az elméletet, melynek lényege, hogy az ödémás bélfal permeabilitása megnövekszik, így nagy mennyiségű bakteriális endotoxin jut a keringésbe [62]. A szívelégtelenségben kialakuló szimpatikus aktivitás és a vér redisztribució következtében a splanchnicus területek vérátáramlása csökken. Kimutatták, hogy szívelégtelen betegekben már alacsony fizikai terhelés következtében is csökken a mucosalis pH, mely a bélfal ischaemia egyik jele [63]. Az emésztőrendszer morfológiai és funkcionális eltérései is bizonyítottak: Anker és munkatársai úgy találták, hogy a szívelégtelen betegek vastagbelében nagyobb a falvastagság, mint egészségesekében. Ezenkívül a laktóz/mannitol teszttel megnövekedett permeabilitást találtak, a passzív karrier fehérjékkel mediált transzport károsodottnak bizonyult. A bakteriális biofilm is kiterjedtebb és a bélfalhoz kötöttebb volt, mint az egészséges kontrollokban [64]. A több ponton károsodott epitheliális barrier funkció következtében az endotoxinok, melyek fő összetevője a lipopoliszacharid (LPS), nagyobb mennyiségben jutnak a keringésbe és így fokozzák a monocyták és egyéb célsejtek proinflammatorikus cytokin termelését [62]. Ezt bizonyítandó kimutatták, hogy szignifikánsan magasabb az LPS és az LPS-t kötő szolúbilis CD14 receptor

12

koncentrációja a szívelégtelen betegekben az egészséges kontrollokhoz képest [62, 65]. Ráadásul az LPS koncentráció az ödémás, dekompenzációs időszakokban a legmagasabb [65]. Tekintettel arra, hogy akut szívelégtelenségben az endotoxin koncentrációja magasabb a véna hepaticában, mint a bal kamrában [66], bizonyított, hogy az LPS forrása ténylegesen a gastrointestinális rendszer. 2.2.1.4. Neurohormonális aktiváció A közelmúltban megjelent tanulmányok szerint a neurohormonális hatások, úgymint a RAAS és az adrenerg rendszer aktiválódása, hozzájárulhatnak a szívelégtelenségben kialakuló gyulladás fenntartásához [60, 67]. Számos in vitro és állatmodelles kísérlet alátámasztotta, hogy az angiotenzin II (AT-II) aktiválja a keringő leukocytákat, fokozza bennük a gyulladásos cytokinek, kemokinek és adhéziós molekulák termelését és ezáltal az endothelsejtekhez való kötődésüket. Feltételezések szerint az AT-II a reaktív oxigén gyökök termelésén és az NF-κB útvonal aktiválódásán keresztül fejti ki a gyulladáskeltő hatását [68]. Az utóbbi időben az aldoszteronról is kiderült, hogy képes az immunválasz kiváltására [69]. Patkányokban az aldoszteron infúzió aktiválta a lymphocytákat, a monocytákat és az endothelsejteket, fokozta az adhéziós molekulák és kemokinek termelését a reaktív oxigén gyökök által mediált NF-κB aktiváción keresztül [70, 71]. In vitro körülmények között a spironolacton anti-inflammatorikus hatást fejtett ki a perifériás vérből izolált monocytákon [72]. Az autonóm idegrendszer zavara, a paraszimpatikus hatásokkal szembeni szimpatikus túlsúly fontos szerepet játszik a szívelégtelenség patofiziológiájában és ez már a korai stádiumban, etiológiától függetlenül is megfigyelhető [73, 74]. Ismert, hogy a leukocyták és a monocyták sejtfelszínén is megtalálhatóak a β-adrenerg receptorok. Az in vitro vizsgálatok arra utaltak, hogy az adrenerg stimuláció az intracellularis ciklikus adenozin monofoszfát (cAMP) szintjének növelésén keresztül szabályozza a cytokinek termelését [75], azon belül is főként az IL-6 kiválasztást [76]. A mechanizmus valószínűleg megegyezik azzal, amikor a nagyfokú, szimpatikus aktivitással járó terhelést gyulladásos válaszreakció követi [77]. Egyre több a bizonyíték arra, hogy a paraszimpatikus rendszer aktivációja gyulladás gátló hatással is rendelkezik. Ez az úgynevezett kolinerg anti-inflammatorikus útvonal [78], melynek lényege, hogy az acetilkolin a nikotinerg jelátvitelen keresztül

13

hatékonyan gátolja a macrophagok működését [79]. A nervus vagus efferens ágának elektromos stimulációja gátolta a máj, a lép és a szív TNF szintézisét és mérsékeli az endotoxémiában mért szérum TNF koncentrációt [80], míg a vagotómia a legtöbb vizsgálati eredmény szerint gyulladáshoz vezethet. Már több, mint harmincöt éve ismert, hogy a szívelégtelenségre csökkent kolinerg aktiváció jellemző [81]. Kimutatták, hogy a mérsékelt paraszimpatikus tónus negatív prognosztikai tényező [82]. Mindezek ismeretében logikus a feltételezés, hogy szekunder módon a paraszimpatikus rendszer csökkent aktivitása is hozzájárul a gyulladás kialakulásához [83]. A neurohormonális és a gyulladásos folyamatok között valószínűleg ennél sokkal több kapcsolódási pont létezik, nagy jelentőségű annak felismerése, hogy ennek a két rendszernek az interakciói hogyan befolyásolják a szívelégtelenség prognózisát és milyen terápiás célpontot jelenthetnek [84]. Dolgozatom egyik fő célkitűzése a vazoaktív peptidek és a gyulladás összefüggéseinek vizsgálata.

2.2.2. A vizsgált gyulladásos cytokinek A szívelégtelenségben kialakuló szisztémás gyulladásos válaszreakcióban többek között, számos cytokin és akut fázis fehérje vesz részt. Az utóbbi eredmények szerint nem is annyira egy-egy cytokinnek van jelentős szerepe, hanem inkább a cytokin hálózat egyensúlya, illetve annak felborulása a meghatározó [84]. Valószínűleg részben ez is az oka annak, hogy a specifikusan egy cytokint megcélzó új, anti-inflammatorikus terápiás próbálkozások kudarcot vallottak [85]. A következő fejezetben részletesebben bemutatom a két leginkább vizsgált cytokint (TNF-α-t és az IL-6-t), valamint a szolúbilis TNF receptorokat. 2.2.2.1. TNF-α A TNF-ről, 1984-es izolálása óta több, mint 75 ezer közlemény látott napvilágot. A korábban egy molekulának tartott TNF-ről kiderült, hogy egy cytokin aktivitású, szerteágazó hatásokkal rendelkező szupercsalád tagja. A német P. Burns felismerte, hogy a bakteriális fertőzéseket követően csökken a tumorok mérete. Később kimutatták, hogy a tumor regresszióért az LPS felelős azáltal, hogy fokozza egy faktort termelését, melyet a kutató, L. Old tumor-nekrózis faktornak nevezett el [86].

14

A TNF szupercsalád legjobban ismert tagja a proinflammatorikus TNF-α, más néven cachexin vagy lymphotoxin. Főképp neutrophilek, aktivált T és B lymphocyták, NK (natural killer) és LAK (lymphokin aktivált killer) sejtek, astrocyták, endothelsejtek és simaizomsejtek termelik [87, 88]. Termelődése során elsőként membránhoz kötött formában kerül a sejtfelszínre, majd proteolítikus hasítás (TNF-alpha converting enzyme, TACE) révén kerül a keringésbe. A membránon lévő TNF-α egyrészt rezervoárként szolgál, másrészt részt vesz a sejtek közötti kommunikációban [89, 90]. A TNF-α hatásai extrém módon szerteágazóak, számos jelátviteli útvonalat képes aktiválni. Több gén expressziós szintjét szabályozza, így többek között növekedési faktorok, cytokinek, transzkripciós faktorok, receptorok, gyulladásos mediátorok és akut fázis fehérjék génjeiét [87]. A TNF-α kulcsfontosságú a szervezet fertőzések elleni védelmében, a tumorok elleni immunválasz kialakításában és az apoptózis indukálásában. Másfelől azonban a TNF-α túltermelése és kedvezőtlen hatása számos kórfolyamatban megfigyelhető, például cachexiában [91], illetve meglepő módon az obezitásban is, kimutatták ugyanis, hogy fokozza az inzulinrezisztenciát. A TNF-α szerepet jászik továbbá a Gram-negatív baktériumok vagy a meningococcusok okozta szepszisben [92, 93], autoimmun és reumatológiai betegségekben [94] vagy sclerosis multiplexben [95]. A TNF család másik prominens tagja a TNF-β, melynek hatásai nagyon hasonlóak a TNF- α hatásaihoz. Elsősorban a T-lymphocyták és a leukocyták termelik, az interferonok és az IL-2 hatására. Fokozza a fibroblastok proliferációját, gátolja az endothelsejtek növekedését, hozzájárul a tumorsejtek líziséhez és számos területen fokozza a neutrophilek működését [96]. A

TNF-α

volt

az

első

cytokin,

amelyről

leírták,

hogy

krónikus

szívelégtelenségben emelkedett a koncentrációja [42]. A magas TNF-α szinttel rendelkező betegekben szignifikánsan gyakoribb a cachexia, a magas koncentráció rosszabb prognózisra utal [42, 45, 48]. Számos elmélet létezik a TNF-α progressziót fokozó hatásairól, feltehető, hogy csökkenti a myocardialis kontraktilitást és mérsékli az ejekciós frakciót, fokozza a fibrosist és a szívizomsejtek apoptózisát [97]. 2.2.2.2. Szolúbilis TNF receptorok A TNF-α-nak és a TNF-β-nak ugyanaz a két receptora ismert, a TNF-Receptor I (TNFRI) és a TNF-RII. A CD27, CD30 és CD40 molekulák mellett mindkét receptor a TNF

15

receptor család része, korábbi elnevezésük a RI esetén CD120a vagy p55TNF-R, míg a TNF-RII-nél

CD120b

vagy

p75TNF-R

[98].

A

TNF-R-ok

megtalálhatóak

macrophagok, neutrophilek, T és B sejtek és NK sejtek felszínén, a TNF-RII különösen gyakori az aktivált T lymphocyták felszínén [87, 99]. A zsírszövetben is expresszálódnak, és szintjük korrelál az obezitással [100, 101]. Termelődésüket számos stimulus fokozza így például a TNF-α, az IL-6 vagy az LPS [102, 103]. A TNF-RI egyike az úgynevezett „halál receptoroknak”, az intracellularis halál domainen keresztül indított jelátviteli útvonallal hozzájárul az apoptózis kialakulásához. Mindkét receptornak ismert a szérumban szabadon megtalálható, receptor-vedlés (shedding) útján kialakuló, szolúbilis formája (sTNF-R-ok). In vitro minkét szolúbilis receptor köti a TNF-α-t, és ezáltal kompetitív jelleggel gátolják a TNF-α kötődését a sejtfelszíni receptorokhoz [104]. Ezzel párhuzamosan a TNF-α megkötéséből adódóan a sTNF-R-ok képesek arra, hogy lokalizálják a gyulladásos folyamatot [105]. Azt is megfigyelték, hogy a szolúbilis TNF-R-ok fokozhatják a kis dózisú TNF-α hatását azáltal, hogy stabilizálják a cytokint, gátolják lebontását [106]. Összességében valószínű tehát, hogy a TNF receptorok levedlésükkel és a TNF-α kötésével fontos reguláló szerepet töltenek be. A sTNF-R-ok szintjét magasabbnak, ng/ml-es nagyságrendűnek találták uveitis esetén a szemben. Az ilyen nagy dózisú rekombináns TNF-R-ok in vitro fokozták a szemet infiltráló T-sejtek TNF-α termelését, azonban a fiziológiás, pg/ml-es dózisú TNF-R-ok esetében nem sikerült ilyen hatást kimutatni [107]. Szintén magasabb sTNFR koncentrációkat mértek rheumatoid arthritisben, azon belül is főleg a follicularis synovitises formában [108]. Szívelégtelen betegekben a keringő TNF-R szintje szorosan korrelál a betegség súlyosságát tükröző funkcionális stádiumokkal és a neurohormonális aktiváció markereivel [109-111]. A koncentráció emelkedés oka még nem egyértelmű, lehetséges, hogy a TNF-α szint növekedése fokozza a TNF-R-ok expresszióját, és elképzelhető, hogy az amúgy is nagyobb mennyiségben lévő TNF-R-ok levedlése fokozódik a betegségben [112]. Érdekes módon szívelégtelenségben a TNF-R-ok szintjének növekedése egyöntetűen reprodukálható eredmény, míg a TNF-α emelkedés esetében kevésbé egybehangzóak az irodalmi adatok. Valószínűleg ez az oka annak, hogy a TNF-R-ok jobb prediktorai mind a rövidtávú, mind a hosszútávú túlélésnek, mint maga a TNF- α [27, 109], így kiemelten fontos a TNF-R-ok vizsgálata. Sok még a

16

megválaszolatlan kérdés a TNF-R szintjének szabályozásával kapcsolatban, mind az expresszió, mind a szolúbilissá válás és a lebontás körül. Ezen információk ismeretében talán érthetőbbé válik a TNF-R-ok és a szívelégtelenség progressziója között megfigyelhető szoros összefüggések háttere. 2.2.2.3. IL-6 Az IL-6 anti- és pro-inflammatorikus hatásokkal is rendelkező cytokin. Az immunrendszer sejtjein, a monocytákon és a macrophagokon kívül a cardiovascularis rendszer sejtjei, az endothelsejtek, az ér simaizomsejtjei és az ischaemiás izomsejtek is képesek termelni [113-115]. Pleiotrop hatása közé tartozik a B és a T sejtek differenciálódásának stimulálása, továbbá aktiválja az NK sejteket, fokozza a májban az akut fázis fehérjék termelését. Ezzel párhuzamosan a CRP hatására nő az IL-6 termelése [116]. Feltételezések szerint az IL-6 az atheroscleroticus érelváltozásokhoz vezető gyulladásos folyamatok egyik kulcsszereplője [117]. Mint pro-inflammatorikus cytokin felelős lehet a koszorúereken lévő atheroscleroticus plakkok destabilizálásáért, és a mátrix metalloproteázok (MMP) termelésének fokozása révén részt vehet az ér remodellingben [118, 119]. Ismert, hogy a szívelégtelenségben mért magasabb IL-6 szérumszint szoros korrelációt mutat a betegség súlyosságával és a szimpatikus, illetve a renin-angiotenzin rendszer aktivitásával [120]. A magas IL-6 szint jelentős prognosztikai értékkel bír az időskori és a szívelégtelenek közötti mortalitás, illetve az instabil angina kedvezőtlen kimenetele szempontjából [121, 122].

2.2.3. A gyulladás kardiális következményei A gyulladásos cytokinek jelentős prediktív értékének hátterében az áll, hogy nem csupán markerei a betegség súlyosságának, hanem több célponton hatva fokozzák a szívelégtelenség kedvezőtlen

progresszióját,

kimenetelével.

A

ok-okozati

összefüggésben

következő

fejezetekben

a

állnak

a

betegség

szívelégtelenségben

megfigyelhető krónikus, szisztémás gyulladás következményeit mutatom be. 2.2.3.1. Kontraktilis diszfunkció Számos ismert mechanizmus vezethet a szívelégtelenségben kialakuló cytokin-indukálta kontraktilis diszfunkcióhoz. A TNF-α megzavarja a szívizomsejtek kalcium homeosztázisát, képes fokozni a NO termelést, aktiválja a komplement rendszert és

17

károsítja a β-adrenerg stimulusokra adott válaszkészséget [123]. In vitro vizsgálatok szerint a TNF-α és az IL-1β direkt negatív inotrop hatással rendelkezik [123]. Patkányoknál

a

TNF-α

infúzió

dilatatív

cardiomyopathiához,

kontraktilis

diszfunkcióhoz és ventrikuláris dilatációhoz vezetett [124]. Szeptikus állapotokra extrém magas cytokin szintek jellemzőek, megfigyelések szerint ilyenkor gyakran alakul ki következményes myocardialis diszfunkció, szeptikus cardiomyopathia [125, 126]. Ismert, hogy a szepszisben magas koncentrációban lévő komplement anafilatoxin, a C5a, a cardiomyocyták kalcium anyagcseréjének módosítása révén képes károsítani a szívizmot [126]. Nem meglepő tehát, hogy a tartósan fennálló, a szívelégtelenségre jellemző enyhébb gyulladás direkt módon is hozzájárulhat a myocardialis funkció károsodásához. 2.2.3.2. Remodelling, myocardium hypertrophia Bozkurt és munkatársai bemutatták, hogy patkányokban a patológiás mennyiségű, tartós TNF infúzió elegendő a myocardialis remodelling indukciójához [124]. Később bebizonyosodott, hogy a TNF-α antagonista etanercept mesterségesen szívelégtelenné tett patkányokban képes mérsékelni a kollagén degradációt, a kamra tágulatot és a kamrai hypertrophiát [127]. A remodelling egyik leglényegesebb eleme a cardiomyocyták hypertrophiája. Számos cytokinről, a TNF-α-ról, IL-6-ról és az IL-1β-ról is bebizonyosodott, hogy in vitro és in vivo is képesek fokozni a szívizomsejtek hypertrophiáját [84]. A TNF-α az egyik legerősebb ilyen hatású cytokin, feltehető, hogy a RAAS közreműködésével okozza a myocardialis hypertrophiát [128]. 2.2.3.3. Az extracelluláris mátrix változásai A gyulladásos cytokinek, főként a TNF-α, fontos szabályozói MMP-oknak és az endogén gátló fehérjéiknek (szöveti metalloproteáz inhibitor, TIMP). A fokozott MMP aktivitás fontos szerepet játszik a szívelégtelenséget jellemző kardiális remodelling, ezen belül is főként a ventrikuláris dilatáció kialakulásában, míg az MMP és a TIMP közötti egyensúly lényeges a myocardialis fibrosis kifejlődésében [129]. A szív fokozott TNF-α termelése következtében kezdetben nő az MMP aktivitás, amely hozzájárul a kollagén termelés zavarához és a szívkamrák kitágulásához. Később azonban a TIMP

18

expresszió fokozódásával csökken az MMP aktivitása, amely a kollagén tartalom növekedésével jár, és végül myocardialis fibrosishoz vezethet [130]. 2.2.3.4. Apoptózis A szívelégtelenség progressziója során csökken a szívizomtömeg, melynek hátterében döntően a cardiomyocyták apoptózisa áll [131]. Egyre több bizonyítékkal rendelkezünk arra nézve, hogy egy állandó, tartósan fennálló izomsejt apoptózis kardiális diszfunkcióhoz és végső soron szívelégtelenséghez vezethet. Számos cytokin részt vehet az apoptózis indukálásában, például a kaszpáz aktiváció, a fokozott intracelluláris oxidatív stressz és a cytoplazmába történő cytokrom C kibocsájtás révén. Újabb megfigyelések szerint a cytokinek külön-külön mért koncentrációjánál lényegesebb egyes cytokinek, például a TNF-α és az IL-10, közötti érzékeny egyensúly [132]. Mindemellett az apoptózis véd is a szívelégtelenség fokozódásától, hiszen a károsodott sejtek eliminációja gátolja a gyulladás továbbterjedését. Ráadásul a fiziológiás mértékű apoptózis fontos szerepet játszik a myocardialis hypertrophia megelőzésében [84].

2.2.4. A gyulladás egyéb szervrendszerekre kifejtett hatásai A szívelégtelenségben kialakult gyulladás a kardiális hatásain keresztül jelentős mértékben hozzájárul az alapbetegség progressziójához. Mindemellett a szisztémás gyulladásnak egyéb, más szerveket és szöveteket érintő következményei is vannak. Ezek közvetett módon tovább súlyosbítják a betegséget, illetve részét képezik a szívelégtelenséget jellemző tünetegyüttesnek. 2.2.4.1. Anémia A szívelégtelenségben kialakuló anémia fokozza a betegség tüneteként jelentkező fulladást és gyengeséget, valamint tovább rontja a szívizom vérellátását. Klinikai vizsgálatok támasztják alá, hogy szívelégtelenekben az anémia jelentős prediktív értékkel bír a halálozás szempontjából. Számos tényező együttesen felelős a vérszegénység kialakulásáért, így például a hemodilúció, a csontvelő depresszió, a gastrointestinalis pangás következtében kialakuló vasfelszívódási zavar és a krónikus gyulladás, amely úgy tűnik kapcsolódási pont a sok útvonal között. A cytokinek károsítják az erythropoetin termelést és erythropoetin rezisztenciát okoznak, ezen kívül

19

direkt módon is csökkentik a csontvelői erythropoesist [133]. A gyulladásos cytokinek fokozzák a máj hepcidin termelését, mely a vas anyagcsere módosításával tovább fokozza a vashiányt [134]. 2.2.4.2. Cachexia A szívelégtelenség progressziójával párhuzamosan fogyás és vázizom atrophia alakul ki, mely végül kardiális cachexiához vezet. A folyamatok hátterében nagyrészt a gastrointestinalis pangás következtében kialakuló felszívódási zavar, az enyhe májelégtelenség és az étvágytalanság áll [135]. Figyelembe véve, hogy a TNF-α korábbi elnevezése a cachexin volt, nem meglepő, hogy a gyulladásos cytokinek is fontos szerepet játszanak a kardiális cachexia kialakulásában. A TNF-α és az IL-6 is bizonyítottan szabályozzák a proteolízist, módosítják a lipidanyagcserét (mérséklik a lipoproteinlipáz aktivitását, fokozzák a lipolízist) és növelik a leptin plazma koncentrációját, mely csökkenti az étvágyat [136]. Klinikai vizsgálatok mutattak rá, hogy a cachexia jelentősen rontja a túlélést szívelégtelenségben [135]. 2.2.4.3. Endothel diszfunkció A szívelégtelenségre jellemző a károsodott endothelialis funkció, melyet számos módon okozhat vagy súlyosbíthat a szisztémás gyulladás. Egyrészt a gyulladásos cytokinek fokozzák az adhéziós molekulák expresszióját, amelyek tovább növelik az érfalban a gyulladást, ezáltal egy ördögi kört képezve. Másrészt a vazokonstrikció felé billenthetik az

endogén

vazodilatátorok

(például

nitrogén

monoxid)

és

az

endogén

vazokonstriktorok (például endothelin-1) közötti egyensúlyt. Harmadrészt, bizonyított, hogy bizonyos cytokinek direkt módon képesek fokozni az endothelsejtek apoptózisát. Az endothel diszfunkció hozzájárul a myocardialis funkció károsodásához, rontja a szervek vérellátását, ezáltal összefügg a csökkent terhelhetőséggel és a májfunkció romlásával, fokozza a betegség progresszióját. A későbbi fejezetekben az endothelialis diszfunkció, a thromboemboliás szövődmények és a szívelégtelenség progressziója közötti kapcsolatról részletesebben is szó lesz.

20

2.3. Vazoregulációs fehérjék szívelégtelenségben Az 1960-as években vált egyértelművé, hogy szívelégtelenségben aktiválódik a neurohormonális rendszer, emelkednek a RAAS hormonszintjei, később magasabbnak találták a natriuretikus fehérjék koncentrációját is [137]. A szívelégtelenségben megfigyelhető neurohormonális aktiváció mértéke, az etiológiától függetlenül, szoros összefüggést mutat a kardiális diszfunkció súlyosságával.

2.3.1. B-típusú natriuretikus peptid A natriuretikus peptidek közül a B-típusú (vagy korábbi elnevezése szerint brain) natriuretikus peptid (BNP) a legnagyobb jelentőségű. A BNP egy 32 aminosav hosszúságú biológiailag aktív peptid, fő hatása a vazodilatáció, a natriuresis és a diuresis fokozása [138]. Termelése során egy 108 aminosavból álló pro-hormonról hasítódik, melléktermékként felszabadul egy 78 aminosav hosszúságú darab, az Nterminális-proBNP (NT-proBNP). Ez a fragment a BNP-vel ekvimoláris mennyiségben termelődik, biológiai hatással nem rendelkezik (2. ábra). Az NT-proBNP hosszabb felezési idejének köszönhetően megbízhatóbban mérhető, mint a BNP [139].

1

76

77

NT-proBNP

108

BNP

COOH

NH2

2. ábra. A pro-BNP sematikus szerkezete. Az előhormon hasítása során a BNP-n kívül egy inaktív, ekvimoláris mennyiségben termelődő fragment, az NT-proBNP szabadul fel.

A BNP termelésének fő ingere a szív kamrai feszülése. A hormon a keringésből két módon ürül, egyrészt receptor mediálta internalizációval, másrészt proteolítikusan hasítódik a vesékben, a vascularis endotheliumban, a tüdőkben és a szívben [137]. Már a korai vizsgálatok is egyértelművé tették, hogy a BNP (illetve az NT-proBNP) nagyszerűen tükrözi a bal kamrafal feszülésének mértékét és a szív pumpafunkcióját, az előbbivel egyenesen, az utóbbival fordítottan arányos. Jelenlegi tudásunk szerint BNP, illetve az NT-proBNP a szívelégtelenség egyik legjobb markere.

21

A

BNP

(vagy

mérésnek

NT-proBNP)

4

fő

indikációja

ismert

szívelégtelenségben. Elsősorban fontos szerepe van a betegség diagnózisának felállításában, segítséget nyújt az akut dyspnoe differenciáldiagnózisában. Ezen kívül lehetővé teszi a kockázati csoportokban a tünetmentes bal kamrai diszfunkciós betegek szűrését. A BNP szintje és a tünetek együttesen segítik a krónikus szívelégtelenség dekompenzációjának felismerését. Másodsorban a BNP egy kvantitatív biomarker, mely alkalmas a progresszió követésére. Harmadsorban erőteljes prediktor a túlélés és a rehospitalizáció szempontjából. A negyedik indikációs terület pedig a terápia irányítása, a BNP szint alapján beállított gyógyszerelés csökkentheti a mortalitást és a morbiditást [22, 137]. A BNP és az NT-proBNP kedvező diagnosztikai tulajdonságai ellenére tovább folyik a kutatás a még megbízhatóbb, a BNP szint mellett plusz információt nyújtó biomarkerek irányában.

2.3.2. Endothelin-1 Az endothelin-1 (ET-1), az endothelin család legjelentősebb tagja, egy 21 aminosavból álló

peptid,

amely

jelentős

szereppel

bír

a

cardiovascularis

homeosztázis

szabályozásában. Elsősorban az ér endothelsejtjei termelik, de a simaizomsejtek, a légúti epithel, a macrophagok, a fibroblastok, a szív myocytai, az agyi neuronok és a hasnyálmirigy szigetsejtjei is képesek a termelésre [140]. Az ET-1 egy nagy prekurzor peptid, a 212 aminosav hosszú prepro-ET-1 hasítása során keletkezik. Elsőként a 38 aminosav hosszú big-ET-1 válik le, melyből az endothelin konvertáló enzim (ECE-1) hasítja le az érett ET-1-t. Az ET-1 féléletideje körülbelül 1-2 perc, ezért koncentrációjának meghatározása nehézkes. A lassabb lebomlású big-ET-1, vagy egyéb, korábbi hasítási lépés során felszabaduló pepid fragment (például a CT-proET-1) szintjének mérése alternatív megoldást jelent az ET-1szint becslésére (3. ábra) [141].

22

1

17

53

73

212

90

CT-proET-1

ET-1

NH2

COOH

Big-ET-1

3. ábra: A prepro-ET-1 sematikus ábrája. Az előhormon hasítása során az aktív metabolit mellett azonos moláris mennyiségben inaktív fragmentek is keletkeznek. [forrás: BRAHMS AG, Hennigsdorf, Németország]

A peptid szint szabályozása történhet a szintézis, a tárolás, a kibocsájtás és a lebomlás szintjén. Az ET-1 termelő sejtek többsége nem rendelkezik tároló vesiculumokkal, így az ET-1-szint szabályozás fő színtere a transzkripció. Az ET-1 expresszióját fokozzák a cytokinek, mint például a TNF-α és az interleukinok. Ezen kívül a növekedési hormonok, főként a transforming growth faktor-β (TGF-β), valamint az inzulin, az angiotenzin II, a noradrenalin és a trombin növeli a termelését. Az endothelsejtekben az ET-1 mRNS szintjét növeli a hypocapnia és csökkenti a hypoxia. Az érfalfeszülés kezdetben fokozza, majd mérsékli az ET-1 termelését. A NO, a prostacyclin, az adrenomedullin és az atrialis natruretikus peptid (ANP) szintén a termelés csökkenését idézhetik elő [140]. Az ET-1 két, G fehérjékkel kapcsolt receptoron keresztül fejtheti ki hatását. Az ETA receptor révén a hormon főként érösszehúzódást okoz és fokozza a sejtproliferációt. Az ETB receptorok ellentétes hatásokért felelősek: vasodilatációhoz vezetnek, fokozzák a vesében a natriuresist és gátolják a proliferációt a szívizomban valamint az ér szöveteiben [142]. Az ETB receptorok közvetítésével történik az ET-1 lebontása, melynek fő színtere a tüdő [143, 144]. Számos faktor hatással van az ET receptorok expressziós szintjére, az ETA génről történő átírást a NO és az inzulin, az ETB gén expresszióját pedig a TNF-α és a fibroblast növekedési faktor fokozza [140]. A szervezetben nem egyenletes a két receptor típus eloszlása: a vénákban kisebb az ETA:ETB arány, mint az artériákban [145]. Az ETB receptorok gyakrabban fordulnak elő a vesében, ahol a nátrium- és vízháztartás, a glomerularis filtráció és a vese véráramlásának szabályozásában vesznek részt [146]. Az ET-1 igen szerteágazó hatásspektrummal rendelkezik. Jelenléte alapvető fontosságú az embrionális fejlődés során, a knockout egerek (ET-1-/-) teljesen életképtelenek [147]. Az ET-1 nagy jelentőségű az érfaltónus szabályozásában: az

23

endothelin az egyik legerősebb és leghosszabb hatású humán vazokonstriktor, melynek hatása százszor erősebb, mint a noradrenaliné. Egészséges egyénekben az intravénásan befecskendezett ET-1 bólus egy rövid, pár perces érellenállás csökkenéshez, majd egy hosszabb, majdnem egy órás, vazokonstrikcióhoz vezet. Az endogén ET-1 azonban a receptorok révén egy komplex, kiegyensúlyozott rendszer része, melyben szerepet játszik a receptorok elhelyezkedése, aránya, és az endothel integritása [145]. Az ET-1 a vazokonstrikción kívül egyéb cardiovascularis folyamatok szabályozásában is részt vesz. Sejtes kísérletek eredményei szerint kamra specifikus, a szív állapotától függő, pozitív inotrop hatása van, jelentősen elősegíti a fokozott preload miatti túlterhelés kompenzálását. Akut esetben a myocardialis disztenzibilitás növelése révén úgy képes javítani a diasztolés funkciót, hogy közben nem károsítja a kontraktilitást. Feltételezik hogy az ET-1 a szív funkció szabályozásában részt vevő egyéb neurohormonális folyamatok között összekötő és közvetítő szerepet is játszik. A myocardialis ischaemia során felszabaduló ET-1 azonban pro-arrhythmogen és hozzájárul a reperfúziós ritmuszavarok kialakulásához. Lehetséges továbbá, hogy hosszútávon felelős a kamrai dilatáció és a remodelling kialakulásáért. [146]. A fajok többségében az ET-1 plazma koncentrációja körülbelül 1 pikomol (vagy átlagosan 3pg/ml), ami jelentősen a 4 pikomolos (vagy 10 pg/ml-es) farmakológiai küszöb alatt van. Az érfalban azonban az ET-1 koncentrációja több, mint százszorosa a plazmában mért szintnek, ugyanis az ET-1 kibocsájtás 80 százaléka az endothelsejt bazális oldalán történik. Fiziológiás körülmények között tehát az endothelin nem egy keringő hormon, sokkal inkább parakrin vagy autokrin módon fejti ki hatását [146]. 2.3.2.1. Az endothelin-1 szerepe szív- és érrendszeri betegségekben Számos klinikai vizsgálat célja, hogy az endothelin antagonista vegyületek, például a bosentan, darusentan, ambrisentan vagy az anransentan hatásosságát tanulmányozza különböző cardiovascularis megbetegedésben. Az eredmények szerint az ET-1 antagonisták hatékonyak lehetnek a nehezen kontrollálható hypertoniás betegeknél. Javítani tudják az endothelfunkciót, csökkenthetik az artériák merevségét és mérsékelhetik az atherosclerosis kifejlődését. Különösen előnyösek lehetnek krónikus veseelégtelenséghez kapcsolódó magasvérnyomásban. Mind a diabétesz következtében, mind a cukorbetegségtől függetlenül kialakuló veseelégtelenségben javítani tudják a renális vérátáramlást, csökkentik a proteinuriát és mérséklik a vesefunkció romlását

24

[148]. A pulmonális artériás hypertensioban (PAH) is jelentős szerepe van az ET-1-nek. Pro-fibrotikus, pro-inflammatorikus és proliferációt fokozó hatásai révén hozzájárul az érellenállás növeléséhez és az érfalátépüléséhez. A keringő és a szöveti ET-1 is lényegesen magasabb a PAH betegekben, mint az egészségesekben, szintje jól korrelál a betegség súlyosságával, magas szintje rossz prognózisra utal. Állatkísérletes és klinikai vizsgálatok szerint a súlyos idiopathiás PAH-ban az ET-1 antagonista terápia lassítja a betegség lefolyását és növeli a túlélést. Az Amerikai Egyesült Államokban már törzskönyvezték az ETA szelektív antagonista molekulát, az ambrisentant, a PAH betegek kezelésére [149]. 2.3.2.2. Az endothelin-1 szívelégtelenségben Már az 1980-as évek végén kimutatták, hogy a kamrafunkció károsodása esetén, akut myocardialis infarktust követően, megemelkedik a keringő ET-1 és bigET-1-szintje [150]. Mért értékük megbízható prognosztikai marker a túlélés szempontjából [151]. Az ET-1 kardiális, vascularis, renális és neurohormonális hatásaiból logikusan következik, hogy az ET-1 szerepet játszhat a szívelégtelenség progressziójában (4. ábra).

4. ábra. Az endothelin-1 szerepe a szívelégtelenség patomechanizmusában, Brunner után [146]. A szívelégtelenséget jellemző patológiás folyamatok aktiválják az ET-1 rendszert. A következményes folyamatok eleinte védhetik a veséket és a szívet, később azonban az előnytelen hatások dominálnak.

25

Klinikai vizsgálatok megerősítették, hogy a krónikus szívelégtelenségben szenvedők szérumában magasabb az ET-1 koncentrációja, mint az egészségesekében és mért értéke jól korrelál a tünetekkel valamint a hemodinamikai súlyossággal [152]. Feltételezhető, hogy az ET-1 koncentráció növekedésében szerepe van a pulmonális pangásnak is, mely következtében károsodik az ET-1 lebontása [153]. Staniloae és munkatársainak eredményei nem támasztották alá a fenti feltételezést, ugyanis nem találtak szignifikáns különbséget a tüdők vénás és artériás plazma ET-1-szintjei között [153]. Számos vizsgálati eredmény alátámasztotta, hogy az ET-1 és a bigET-1 magas koncentrációja mind a súlyos, mind a kevésbé súlyos szívelégtelenségben előrejelzi a halálozást [154-156]. Gardner és munkatársai nem erősítették meg ezt összefüggést a magas ET-1-szint és a halálozás között [157]. Egy osztrák munkacsoport nemrég publikált közleményében a várttal ellentétben, a CT-proET-1-nek negatív prediktív értéke volt a halálozás szempontjából az illesztett Cox regressziós modellekben, míg a primer összefüggés pozitív volt. Eredményeiket nem a patomechanizmussal magyarázták, előfordulhat, hogy az ellentmondásos adataik hátterében a nem megfelelő statsztikai elemzés áll [158]. Az CT-proET-1 prognosztikai értékének tisztázására mindenképpen további, jól tervezett, validáló vizsgálatokra van szükség. 2.3.2.3. Az endothelin-1-gyel kapcsolatos terápiás lehetőségek Számos eredmény arra utalt, hogy a krónikus endothelin blokád előnyös a túlélés és a bal kamra remodelling szempontjából myocardialis infarktuson átesett állatokban [159]. Ennek ellenére, nagy meglepetést és csalódást okozott, hogy a szívelégtelen betegek bevonásával készült vizsgálatokban az endothelin antagonisták adása nem vezetett bizonyíthatóan előnyös hatáshoz [160]. A nem szelektív ET receptor antagonisták és a szelektív ETA receptor antagonisták rövid távon csökkentették a pulmonális nyomást és az érellenállást, illetve növelték a kardiális indexet. Az igen bíztató korai eredmények után azonban kivétel nélkül, az összes hosszútávú klinikai vizsgálat negatív eredménnyel zárult [149, 159]. Kelland és munkatársai szerint figyelembe kell venni, hogy a vizsgálatokban a betegek az endothelin antagonistákat a standard kezelésen felül kapták,

ami

magyarázhatja

a

szignifikáns

eredmények

hiányát,

hiszen

két

neurohormonális útvonal (szimpatikus idegrendszer a β-blokkolókkal, és RAAS az ACE-gátlókkal vagy ARB-kel) gátlása után a harmadik vélhetően nem hoz nagy eredményt. Az is lehetséges, hogy a terápia hatékonyságát a szívelégtelenség olyan

26

tünetei alapján ítélték meg, mint például a perifériás ödéma jelenléte, ami egyben az endothelin antagonisták leggyakoribb mellékhatása is. Bizonyára az antagonisták dózisának megválasztása is kritikus lehetett az eredmények szempontjából [160].

2.3.3. Adrenomedullin Az értágító hatású adrenomedullin (ADM) egy 52 aminosavból álló polipeptid, melyet először 1993-ban izoláltak phaemochromocytomás eredetű szövetből [161]. A további vizsgálatok során bebizonyosodott, hogy az ADM génje számos egészséges szövetben és sejtben is expresszálódik. Kifejeződik például a mellékvesében, a szívben, a vesékben, a zsírszövetben, a neutrophil leukocytákban, a macrophagokban és a vérerekben [162-165]. A fehérje a plazmában, a nyálban, az izzadtságban, az ízületi nedvben [166] és az amnion folyadékban is megtalálható [167]. Termelését a hypoxia, az ischaemia [168] és a mechanikai stimulusok, például az érfalfeszülés [169] indukálhatják, de a gyulladásos faktorok, például az IL-1 és a TNF-α vagy akár az LPS is fokozhatják a kiválasztását [170-172]. Állatkísérletes adatok szerint az AT-II [173] és a noradrenalin [174] is stimulálhatja az ADM termelését. Az ADM gén a 11. kromoszóma rövid karján helyezkedik el, 4 exont és 3 intront tartalmaz, egy 185 aminosav hosszúságú pre-pro-hormont kódol (5. ábra). A termékből az érési folyamat során elsőként egy 21 aminosav hosszúságú szakasz hasad le az Nterminális végről. Így keletkezik a 164 aminosav hosszúságú pro-ADM. A prohormonból további hasítás során két biológiailag aktív fehérje keletkezik, a PAMP (proADM N-terminális 20 peptid) és maga az ADM. A középről felszabaduló harmadik fragment az inaktív mid-regional-proADM (MR-proADM), mely a két aktív hormonnal azonos moláris mennyiségben termelődik. Az MR-proADM az ADM-nal ellentétben egy stabil vegyület, így mérése lehetővé teszi az ADM-szint megbízható becslését [165, 175].

27

1

21

45

PAMP

92 95

MR-proADM

146

185

Adrenomedullin

COOH

NH2

5. ábra: A pre-proADM sematikus szerkezete. A prohormon hasítása során két aktív (PAMP, ADM) és egy inaktív (MR-proADM) fragment keletkezik azonos moláris mennyiségben. [forrás: BRAHS AG, Hennigsdorf, Németország]

2.3.3.1. Az adrenomedullin biológiai hatásai Az ADM biológiai hatásai közül legismertebb a vazodilatáció, melyet cAMP és NO mediálta útvonalon vált ki [176]. Hatására csökken a perifériás vérnyomás, fokozódik a coronariák keringése, a cAMP-szint növelésén keresztül fokozódik a myocardialis kontraktilitás, összességében nő a kardiális output [177, 178]. A vese erek tágulata következtében az ADM hatására nő a renális vérátáramlás, fokozódik a diuresis és a natriuresis [179]. A vazoreguláción kívül az ADM-nak számos egyéb hatása ismert, szabályozza a sejtosztódást és a sejtnövekedést [180], gátolja az apoptózist [181], védelmet nyújt az oxidatív stressz ellen [169, 182]. Az ADM több ponton is kapcsolódik a neurohormonális rendszerhez, az adatok igen ellentmondásosak, de úgy tűnik, hogy gátolja a renin-angiotenzin rendszert és az endothelin hatásait [169], valamint csökkenti a hasnyálmirigy inzulin kiválasztását [183]. Az utóbbi időben egyre nagyobb jelentőséget tulajdonítanak az ADM immunrendszerben betöltött szerepének [165]. Pio és munkatársai ismerték fel, hogy az ADM kötő fehérje a H-faktor, a komplement rendszer alternatív útvonalának regulátora [184]. Ha az ADM és a H-faktor komplexet képez, mindkét fehérje bioaktivitása megváltozik. Érdekes módon nem csökken az ADM receptor affinitása, de a fehérje védetté válik az enzimatikus degradációval szemben [185]. Allker és munkatársai korong diffúziós módszererrel szemléltették, hogy az ADM-nak jelentős antimikrobiális hatása van az emberi bélflóra Gram-negatív és Gram-pozitív törzseivel szemben. [186]. Az is kiderült, hogy az ADM expressziója fokozódik bakteriális fertőzés esetén, így lokálisan, in vivo is eléri az antimikrobiális hatáshoz szükséges koncentrációt [187]. Sok ellentmondásos adat olvasható az irodalomban az ADM gyulladásos sejtekre kifejtett hatásáról. In vitro sejtes és állatkísérletes eredmények alapján anti- és proinflamatorikus hatásai is vannak.

28

Befolyásolja a neutrophil sejtek migrációját, elősegíti az aktivált T lymphocytak túlélését, hatással van a mastocytakra, hozzájárul a macrophagok cytokin termelésének szabályozásához [163, 165, 188]. A terület intenzíven kutatott, az ADM hatásai erősen függenek a célsejttől, a koncentrációtól és egyéb környezeti faktoroktól. Az ellentmondásos eredmények oka lehet még az a metodikai nehézség is, hogy az ADM féléletideje igen rövid, a kereskedelmi forgalomban kapható ADM fragmensek pedig különbözőek, akár eltérő hatással rendelkezhetnek. 2.3.3.2. Az adrenomedullin szerepe szív- és érrendszeri betegségekben Az ADM-szintje szignifikánsan emelkedett tartósan magas vérnyomás esetén [189], kiváltképp olyan betegeknél, ahol a hypertonia együtt jár szervi eltérésekkel, például bal kamra hypertrophiaval [190]. Klinikai vizsgálatok szerint pulmonális hypertensioban is magasabb az ADM-szintje, a véna pulmonálisokban nagyobb mértékben, mint az artériákban [169]. Az ADM inhaláció ezen betegeknél a szisztémás vérnyomás és a szívfrekvencia csökkentése nélkül javította a tüdők a hemodinamikáját [191]. Kimutatták, hogy az ADM-szintje emelkedik az akut myocardialis infarktus korai szakaszában, és a növekedés mértéke arányos a klinikai súlyossággal [192, 193]. Az ADM emelkedés egyike az ilyenkor kialakuló hasznos védő, kompenzációs mechanizmusoknak. Patkányoknál az akut fázisban adagolt ADM vazodilatációs hatásának köszönhetően gátolja a szívelégtelenség kialakulását, antioxidáns és antiapoptotikus hatása révén csökkenti az elhalt szívizom terület nagyságát [169]. Az MR-proADM önállóan és az NT-proBNP szinttel együttesen, nagyon jó prediktorai az AMI után kialakuló szívelégtelenségnek, cardiogen sokknak és a halálozásnak [194, 195]. A plazma ADM-szint szignifikánsan magasabb ischaemiás stroke krónikus fázisában, mint egészséges kontrollokban [196], továbbá a súlyos athreosclerosis összefüggést mutat a megemelkedett ADM-szinttel [197]. A perifériás artériás érszűkületes

betegekben

is

magasabb

az

ADM

koncentrációja,

mint

az

egészségesekben, szoros korrelációt mutatva a betegség súlyosságával (Fontaine stádiumok) és a gyulladásos markerekkel (hs-CRP, IL-6) [198]. Nishida és munkatársai arra a következtetésre jutottak, hogy a magas plazma ADM-szint független prediktora a cardiovascularis eseményeknek és prediktív értéke még a hs-CRP-nél is nagyobb [199].

29

2.3.3.3. Az adrenomedullin szívelégtelenségben Az ADM plazmakoncentrációja a szívelégtelenség súlyosságával párhuzamosan emelkedik, szintje a kezelés hatására csökken [200]. Pozitívan korrelál a pulmonális artériákban mért nyomással és a pulmonális éknyomással, míg negatívan korrelál a bal kamrai ejekciós frakcióval [201, 202]. Koncentrációja szignifikáns összefüggést mutat a betegség súlyosságát jelző ANP-vel, BNP-vel és a renin aktivitással [203-205]. Ezáltal az ADM jó biokémiai marker a szívelégtelenség súlyosságának becslésére [206]. Míg egészségesekben az ADM fő forrása az érfal, valószínű, hogy a szívelégtelenekben a szív ADM termelése is hozzájárul a koncentráció növekedéshez [207]. Kimutatták, hogy a pericardialis folyadék ADM koncentrációja magasabb, ami a szív direkt ADM termelésére utalhat. Hasznos lehet a lokális pozitív inotrop hatásán kívül a koszorúereken kifejtett vazodilatáció és a remodelling gátlása is [208]. Az ADM-szintje prognosztikai értékkel bír szívelégtelenségben, mind az ischaemiás, mind a nem ischaemiás eredetű betegekben [155, 209]. Az ADM jól korrelál a BNP szintjével, Kaplan-Meier analízis és a ROC görbék alatti terület alapján a halálozás szempontjából ugyanolyan jó prediktor, mint a BNP [206]. Adlbrecht és munkacsoportjának eredményei szerint az ADM kiváltképp a közepesen súlyos és súlyos betegekben jelzi előre a halálozást, míg a BNP leginkább a re-hospitalizáció szempontjából jelentős [158]. Az ADM a dyspnoe differenciáldiagnosztikájában, a kardiális és a pulmonális okok elkülönítésében is hasznos lehet. Fulladásos panaszok miatt orvoshoz fordulók között az ADM prognosztikai ereje nagyobb volt, mint a BNP-jé vagy az NT-proBNPjé [210]. 2.3.3.4. Az adrenomedullinnal kapcsolatos terápiás lehetőségek Az ADM biológiai hatásai nagyrészt előnyösek, a sejtek és szövetek védelmét szolgálják. Ezáltal az ADM adása vagy az endogén ADM termelés fokozása a kórképek széles körében jelenthet terápiát. Az intravénásan adott ADM féléletideje azonban csupán 22 perc [211], ezért hosszan tartó hatás kifejtéséhez folyamatosan infúziós terápiára van szükség. Az ADM krónikus, ozmotikus pumpás adagolása hatékonynak bizonyult hypertonias és szívelégtelen patkányoknál [212]. Hatására csökkent a

30

vérnyomás, illetve mérséklődött a kardiális diszfunkció progressziója, azonban ilyen formában történő humán felhasználás nem valószínű. A másik terápiás lehetőség az endogén termelődő ADM bontásáért felelős neutrális endopeptidáz gátlása [213], amely az ADM-n kívül egyéb depresszor fehérjék, például a kininek és a natriuretikus peptidek degradációjáért is felelős [214]. A kettős hatásmechanizmusú omapatrilat, a neutrális endopeptidáz gátlásán kívül ACE-gátló hatással is rendelkezik, így effektív antihypertensivumnak tűnik. Az OCTAVE (Omepatrilat Cardiovascular Treatment Assessment Versus Enalapril) elnevezésű klinikai vizsgálat bíztató eredményekkel zárult [215]. Hasonlóan kedvező hatású volt az omapatrilat a szívelégtelenségben. Az OVERTURE (Omapatrilat Versus Enalapril Randomized Trial of Utility in Reducing Events) vizsgálatban az omapatrilatot kapó betegeknél 11 százalékkal kisebb volt a halálozás és a hospitalizáció, mint az enalaprilt kapó csoportban [216]. Az omapatrilat kezelés mellékhatásaként kialakuló angioödéma azonban egyelőre nem teszi lehetővé széleskörű alkalmazását [217]. A jövőben esetleg más stratégiákkal, például sejt transzplantációs vagy génterápiás beavatkozásokkal lehetővé válhat az ADM-szintjének tartós emelése [169].

2.4. A 70kDa molekulatömegű hősokkfehérjék A hősokkfehérjék (heat shock proteins-Hsp) filogenetikailag konzervált ubiquiter molekulák,

melyek

gyakorlatilag

azonos

molekuláris

szerkezettel,

biokémiai

tulajdonságokkal és részben megőrzött immunológiai felépítéssel megtalálhatóak a prokaryotáktól, az eukaryotákon át az emberig, minden szervezetben. Ez a nagy mértékű konzerváltság funkcionális jelentőségükre utal. A hősokkfehérjék konstitutív módon termelődve a sejtek protein tartalmának 1-2 százalékát alkotják. Expressziójukat számos élettani, patológiás és környezeti tényező fokozhatja, ezek hatására mennyiségük a sejtben az összfehérje mennyiségének 15 százalékát is elérheti [218]. A hősokkfehérjék élettani körülmények között a sejtosztódási ciklus, a sejtek differenciálódása és a szövetfejlődés során indukálódhatnak, illetve növekedési faktorok és hormonok szabályozhatják termelésüket. Kóros körülmények között a vírusok, baktériumok és paraziták okozta fertőzések, láz, gyulladás, ischaemia, oxidatív stressz, hypertrophia, malignitás, autoimmunitás és toxinok (pl. bakterialis LPS) fokozhatják génátírásukat a celluláris stresszválasz részeként. A környezeti tényezők közül

31

hőmérsékletváltozás (hő- vagy hidegsokk), nehézfémek, etanol, antibiotikumok és sugárzás képesek indukálni a Hsp-k expresszióját [219]. A hősokkfehérjéket hagyományosan molekulatömegük alapján csoportosítják. A major hősokkfehérjék csoportja magába foglalja a 60, 70, 90 és 110 kDa molekulatömegű Hsp-ket. Ezek 37°C-on, hősokk hiányában is kifejeződnek a sejtekben. A minor Hsp-k cukor megvonás hatására indukálódnak (glükózregulált fehérjék (Grps): Grp 34, 47, 56, 75, 78, 94 és 174 kDa). A harmadik csoport, a kis molekulatömegű Hspk csoportja, amelyek molekulatömege 20 kDa körüli [220].

2.4.1. A 70kDa-os Hsp-k családja, a Hsp70 genetikája A tágabb értelemben vett Hsp-70 család tagjait az emberben legalább 15 gén kódolja. A Hsp70 multigén család tagjainak termékei szerkezetileg azonos, vagy nagyon hasonló fehérjék. A különbség a fehérjék celluláris és szöveti lokalizációjában, az expresszió típusában (konstitutív, indukálható) és a génátírást indukáló tényezőkben van. A gének egy része az MHC III-as régióban helyezkedik el a 6. kromoszómán, de Hsp gének találhatóak a 1., 5., 9., 11., 14. és talán a 21. kromoszómán is [221]. A Hsp70 családba tartozó fehérjék megkülönböztetése a hasonló szerkezet miatt nehézkes. Az irodalomban fellelhető adatok áttekintését megnehezíti a sokszor eltérő és nem egyértelmű nómenklatúra. A konstitutívan termelődő, nem indukálható Hsp70-ek közé tartozik az endoplazmatikus retikulumban található Hsp70-5 (más néven BIP, GPR78), a sejtmagban és a citoplazmában lévő Hsp70-8 (alternatív nevén HSC70, Hsp73) és a mitokondriális Hsp70-9 (vagy: GPR75, PBP74, mtHsp75) [220, 221]. A fő hő-indukálható Hsp70-et (Hsp70, 72kDa) a 6-os kromoszóma rövid karján (6p21.3), az MHC III régióban található két gén kódolja (Hsp70-1 (HspA1A), Hsp70-2 (HspA1B)). A két gén fehérjeterméke teljesen azonos, 641 aminosavból áll. A hősokk mindkét gén átírását indukálja, de a Hsp70-1 konstitutívan is kifejeződik a sejtekben. Feltételezik, hogy a két gén eltérő módon válaszol a hősokktól különböző stressz faktorokra. Az MHC III régióban egy harmadik gén is található, ami a Hsp70-családba tartozó fehérjét kódolja. A Hsp70-Hom (HspA1L) gén terméke 641 aminosavat tartalmaz és aminosav sorrendje 90%-ban azonos a Hsp70 aminosav sorrendjével. A különbség a C-terminalis domainben a legnagyobb mértékű. A Hsp70-Hom gén

32

konstitutív módon fejeződik ki a sejtekben, átírását hősokk nem indukálja. Szöveti expressziója a herékben és a spermatidákban a legkifejezettebb. Dolgozatomban a továbbiakban a Hsp70 alatt a HspA1A és HspA1B gének által kódolt fő hő-indukálható Hsp70-et (Hsp70-1, 72kDa) értem. 2.4.1.1. HspA1B A(+1267)G A Hsp géneknek számos polimorfizmusa ismert, melyek a HspA1B gén esetében potenciálisan felelősek lehetnek a Hsp70 funkciójáért és a szervezet stressz toleranciájáért [222]. Egyik legismertebb ezek közül a gén +1267-es pozíciójában történő adenin-guanin váltás, mely nem jár aminosav cserével a Hsp70 szerkezetében. Igen ellentmondásosak az eredmények, melyek a polimorfizmus és a génről átíródó mRNS szintje közötti kapcsolatot firtatják [223-225], miközben a szérum Hsp70 szint és a fenti polimorfizmus közötti kapcsolat ma még nem ismert. A Hsp70-2 G allél része a 8.1-es ősi haplotípusnak, mely egy viszonylag gyakori konstelláció a kaukázusi rasszban [226]. A haplotípus jellemzője a magasabb antitest, autoantitest, TNF-α és keringő immunkomplex szint. Ezáltal valószínűleg evolúciós előnyt jelentett a fertőzések elleni fokozott védelem révén [227], ám nem feltétlenül előnyös például a daganatos vagy autoimmun betegségekben. Az elmúlt években kimutatták, hogy számos immunrendszer érintettségével járó kórképpel kapcsolatba hozható, például, többek között az 1-es típusú cukorbetegséggel [228], a szisztémás lupus

erythematosusszal

[229],

a

cysticus

fibrosisban

kialakuló

bakteriális

kolonizációval [230] és a colorectalis karcinómával [231]. Irodalmi adatok szerint a G allél hordozása bizonyos betegségekben kedvezőtlenebb kimenetellel párosul. Crohn betegségben a genotípus és az allélfrekvencia nem különbözött a betegek és a kontrollok között, de legalább egy A allél hordozása sokkal enyhébb lefolyású betegséggel társult és kisebb volt a sebészeti beavatkozások szükségessége japán [232], német [233] és magyar populációkban [234]. Akut pancreatitisben hasonló összefüggést találtak: a betegek és az egészségesek között nem mutatkozott különbség az allélfrekvencia szempontjából, de a súlyos betegek között sokkal gyakoribb volt a G allél hordozása [235]. A 2-es típusú cukorbetegek között szignifikánsan gyakoribb a G allél hordozása, mint az egészséges kontrollokban. A G allélt hordozó betegeknek szignifikánsan rosszabb a lipid profilja, fokozottabb a gyulladásos cytokinek expressziója, gyakrabban alakulnak ki az artéria carotison soft plakkok, nagyobb a stroke illetve a TIA

33

előfordulási aránya [225] és nagyobb a diabéteszes nephropathia kialakulásának az esélye [236], mint a G- (G allélt nem hordozó) betegeknél. A koszorúér betegek [237] és az obesitasban szenvedők [238] között is szignifikánsan gyakoribb a G allél hordozása. 2.4.1.2. HspA1L C(+2437)T A HspA1L más néven, Hsp70-hom génnek is ismertek polimorfizmusai. A gén 2437-es pozícióján történő timin-citozin csere következtében a fehérje termék 483. aminosava metionin helyett treonin lesz (Met

Thr). Feltételezhető, hogy ennek az aminosav

cserének a következtében megváltozik a Hsp70-1 fehérjekötő képessége [239]. A Hsp-k fiziológiás és stressz állapotban betöltött fontos funkciói miatt logikus a feltételezés,

hogy

a

polimorfizmusnak

szerepe

lehet

különböző

kórképek

kialakulásában. Egy német kutatócsoport eredményei szerint a CT genotípus esetén, a traumás sérüléseket követően nagyobb a májelégtelenség kialakulásának valószínűsége [240]. Sarcoidosisban a C allél jelenléte a HLA DRB1*03 pozitivitástól függetlenül összefüggést mutatott a betegséggel és a Löfgren szindróma jelenlétével [241]. Úgy találták, hogy legalább egy C allél hordozása hajlamosíthat a prosztata karcinómára [238]. Sok egyéb kórképben azonban a várttal ellentétben nem sikerült összefüggést kimutatni, így például rheumatoid arthritsben [242], spondylitis ankylopoeticában [243], asztmában [239], stroke-ban [244], skizofréniában [245] vagy Parkinson-kórban [246].

2.4.2. A Hsp70 biológiai funkciója A Hsp70-család konstitutív tagjai (Hsc70, Hsp75, Grp78) dajkafehérjeként (molekuláris chaperon) működnek, elősegítik az újonnan szintetizált fehérjék natív szerkezetének kialakulását, részben direkt módon, részben a Hsp60-család tagjaihoz szállítva azokat. Irányítják a fehérjék transzportját a subcellularis kompartmentekbe (sejtmagba, lizoszómába, mitokondriumba, endoplazmatikus reticulumba), részt vesznek az oligomer fehérje struktúrák szétbontásában, az instabil fehérjék proteolítikus lebontásában és más fehérjék, köztük transzkripciós faktorok, szteroid receptorok (például ösztrogén, progeszteron, prolaktin, glükokortikoid receptor) biológiai aktivitásának szabályozásában [247]. A sejtet ért stressz indukálja a Hsp70 expresszióját, amely a cellularis stresszválasz részeként fontos szerepet játszik a sejtek

34

védelmében. Megakadályozza a fehérjék aggregációját, elősegíti a már aggregálódott fehérjék szerkezetének és funkciójának helyreállítását és az irreverzibilisen károsodott fehérjék transzportját a proteoszomákba. Protein kinázok és transzkripciós faktorok működését gátolva befolyásolja a jelátviteli és enzimatikus folyamatokat, ezáltal mind a nekrózis, mind az apoptózis ellen hat [220, 248, 249].

2.4.3. Az extracelluláris Hsp70 A Hsp-k elsősorban intracelluláris fehérjeként ismertek, azonban kifejeződhetnek a sejtek felszínén is, ezt a folyamatot a sejtet ért stresszhatás fokozhatja [250-252]. Számos sejtről, például patkány embrió sejtekről és gliasejtekről [253], humán pancreas szigetsejtekről [254], neuroblastoma sejtvonalról [253] és oxidatív stressznek kitett vascularis simaizomsejtekről [255] leírták, hogy in vitro képesek az extracelluláris térbe Hsp-ket kibocsájtani. A Hsp60 és a Hsp70 jelen van egészséges emberek perifériás keringésében is, szöveti forrásuk azonban még nem ismert [256, 257]. Az intracelluláris hősokkfehérjék extracelluláris térbe történő kijutásának mechanizmusa még nem teljesen ismert. A Hsp-k kiszabadulhatnak passzív módon a nekrotikus sejtekből a plazmamembrán destrukcióját követően [258]. Egyre több a bizonyíték, hogy a sejtek aktív módon, exoszomák közvetítésével és kis hányadban szabadon, exoszomák nélkül, lipid raftokon keresztül is képesek a Hsp-k kibocsájtására. Ezt részben konstitutív módon, részben különböző stimulusok, például transzport cytokinek hatására teszik [259-261]. Az extracelluláris Hsp70 (szolúbilis, szérum Hsp70 – sHsp70) a sejtek közötti ősi veszély jeleként képes aktiválni a veleszületett és az adaptív immunrendszert. Ezáltal fontos szerepet játszik a szervezet patogén mikroorganizmusok és tumorsejtek elleni védelmében [262]. A Hsp70 egyrészt antigéntől független módon képes stimulálni az antigén prezentáló sejteket [263, 264], másrészt dajkafehérje képességénél fogva antigéneket szállít és elősegíti azok prezentálását az adaptív immunrendszer sejtes elemei

felé.

Az

extracelluláris

Hsp70

tehát

cytokinként

és

chaperonként,

dajkafehérjeként is működik, amit Asea „chaperokine” aktivitásnak nevezett el [264, 265]. Az antigén prezentáló sejtek aktiválásán kívül a Hsp70 képes a dendritikus sejteket [266], az NK sejteket [267], valamint komplement rendszer klasszikus útvonalát [268] is aktiválni.

35

A

Hsp-k,

mint

immunmoduláns

fehérjék,

célpontjai

is

lehetnek

az

immunválasznak. A patogén mikroorganizmusok elleni immunválasz részben a mikrobiális Hsp-k ellen irányul, mely a molekuláris mimikri révén keresztreakciót adhat az endogén, humán Hsp-kel, ezáltal potenciális kapcsolatot létrehozva a fertőzések és az autoimmunitás között [269]. A saját hősokkfehérjékre, mint kiemelten védett saját antigénekre az immunrendszer reguláló, védő immunválaszt ad. Ennek zavara esetén azonban a Hsp-k potenciális antigénként viselkedve szintén elősegíthetik az autoimmun betegségek kialakulását [219].

2.4.4. Az szérum Hsp70 szintek patológiás állapotokban Ismert, hogy a Hsp70 akár egészséges emberek szérumában is megtalálható [132, 256], szintje fizikai megterhelés hatására emelkedik [270, 271]. A keringő Hsp70 koncentráció emelkedését figyelték meg tompa szöveti trauma [272, 273], perifériás és renális érbetegség esetén [274], akut myocardialis infarktus [275, 276] vagy koszorúér bypass műtét (CAGB) után [277], preeclampsiában [278] és HELLP (Haemolysis, Elevated Liver enzymes, Low Platelet count) szindrómában [278]. Genth-Zotz és munkatársai magasabb szérum Hsp70 szintet figyeltek meg szívelégtelenségben és úgy találták, hogy a Hsp70 korrelál a betegség súlyosságával és a cachexia jelenlétével, de nem függ össze a túléléssel [279]. A Hsp70 biológiai kapcsolatait vizsgálva úgy találták, hogy AMI után a magasabb Hsp70 szint pozitívan korrelált az IL-6, IL-8, TNFés a TLR 4 koncentrációjával. A keringő Hsp70 szint pozitív összefüggést mutatott a troponin T és az MB kreatinin kináz szintekkel [275, 276].

2.5. A thromboemboliás szövődmények szívelégtelenségben Régóta ismert, hogy a szívelégtelenségben szenvedő betegekben a thromboemboliás szövődmények kockázata fokozott. Stroke és egyéb vérrögképződéssel járó betegségek akár a betegek 30 százalékában is előfordulhatnak és gyakran vezetnek halálhoz [16, 280]. Az enyhe és a közepesen súlyos szívelégtelenségben a stroke éves incidenciáját 1,5 százaléknak találták, míg az átlagos populációban az incidencia 0,5 százalék. A súlyos, 20 százalékos bal kamrai ejekciós frakciónál rosszabb kamra funkcióval bíró betegeknél a rizikó még nagyobb, 4 százalékos volt [281, 282]. A SAVE vizsgálat

36

eredményei szerint minden 5 százaléknyi ejekciós frakció csökkenés 18 százalékkal növelte a stroke rizikóját [283]. A szívelégtelenséget tanulmányozó nagy vizsgálatok többségében az elsődleges végpontok a halálozás és a rehospitalizáció, míg a thromboemboliás szövődmények, a stroke és a myocardialis infarktus háttérbe szorulnak. Ráadásul a mortalitásért nagy részben felelős hirtelen szívhalált nemcsak ritmuszavar, hanem thromboticus érelzáródás is okozhatja [284]. Valószínű, hogy a szívelégtelenségben kialakuló thromboemboliás

szövődmények

incidenciáját

a

morbiditás

és

a

mortalitás

szempontjából is jelentősen alábecsüljük [16, 285].

2.5.1. A fokozott véralvadás okai szívelégtelenségben Rudolf Virchow körülbelül 150 évvel ezelőtt írta le a véralvadásra és ezáltal a thrombogenezisre hajlamosító három fő tényezőt: 1. csökkent véráramlás 2. érfalsérülés 3. hypercoagulabilitas – a vér összetételének megváltozása. A Virchow triász jól magyarázza a szívelégtelenségben megfigyelhető vérrögképződés patomechanizmusát is. A csökkent kardiális output, a tágult szívkamrákban megfigyelhető áramlási zavar és a csökkent kontraktilitás révén teljesül az első kritérium. Ez az állapot legfőképpen intracardialis trombus kialakulására hajlamosít [16]. Tovább rontja a véráramlást a szívelégtelenségben nem ritkán (kb. az esetek 2030%-ban) előforduló pitvarfibrilláció is. A szívelégtelenségben megfigyelhető ér- és endothel-eltérések megfelelnek a Virchow triász második elemének. A betegségben károsodott az endothelből származó nitrogén monoxid (NO) felszabadulása, mely hozzájárul a kórképre jellemző fokozott perifériás vazokonstrikcióhoz. A csökkent mennyiségű NO elősegítheti a monocyták és vérlemezkék érfalhoz való kitapadását, ezáltal hajlamosítva az in situ trombus képződésre. Az endothelialis diszfunkció és sérülés egyik jól ismert markere a von Willebrand faktor (VWF), melynek koncentrációja megemelkedik a szívfunkció romlásakor [286-288]. A triász harmadik eleme, a vér összetételének megváltozása, szintén ismert a szívelégtelenségben. A plazma és a vér viszkozitása növekszik, fokozódik a vérlemezke

37

aktivitás, emelkedik a fibrinopeptid-A, a D-dimer és a von Willebrand faktor szintje [289-291]. A szívelégtelenség során gyakran hosszútávon használt vízhajtók szintén növelik a hypercoagulabitást azáltal, hogy hemokoncentrációhoz vezethetnek, növelik a hematokritszintet és hozzájárulnak a rheologiai abnormalitásokhoz.

2.5.2. A von Willebrand faktor A von Willebrand faktor (VWF) története 1924-ben kezdődött, ekkor került Dr. Eric von Willebrandhoz

egy

súlyos

vérzési

rendellenességben szenvedő 5 éves finn kislány [292]. Először úgy gondolták, hogy a vérzés hátterében

valamilyen

thrombocyta

funkciózavar áll, csak évtizedek múlva derült ki, hogy a hiba egy haemostasisért felelős plazma proteinben van. A fehérjét 1971-ben azonosították Zimmerman és munkatársai, 6. ábra : A vWF szerkezete [forrás: www.esrf.eu]

VWF-nak nevezték el [293] (6. ábra).

A VWF két fontos szerepet tölt be a haemostasisban: közvetíti a vérlemezkék adhézióját a sérült érfalhoz azáltal, hogy a felszínre került subendotheliumhoz és thrombocytán lévő glikoprotein Ib-hez kapcsolódik és aktiválja a thrombocytát. Másodsorban megköti és stabilizálja a véralvadásban kulcsfontosságú VIII faktort. Ezáltal a véralvadás mindkét alapvető lépésében – a thrombocyta dugók és a fibrin rögök alkotásában – részt vesz [293]. A VWF génje a 12-es kromoszóma rövid karjának végén helyezkedik el, 52 exonból áll [294]. A gént csak a megakaryocyták és az endothelsejtek expresszálják. Az endothelsejtekből a VWF kétféleképpen kerülhet a keringésbe, egyrészt konstitutív módon szekretálódik a szintézist követően, másrészt pedig szabályozott módon a Weibel-Palade testekben raktározódik és különböző stimulusok hatására kiválasztódik [295, 296]. A degranulációt számos vegyület kiválthatja, például a hisztamin, az ösztrogén, a trombin és a fibrin [297-299]. Ez utóbbi kettő azért lényeges, mert a véralvadási kaszkád aktivációja visszacsatoltan növeli a véráramban a VWF szintet.

38

Arra is fény derült, hogy a gyulladásos folyamatok lokálisan fokozhatják a VWF szekrécióját [300, 301]. Az endothelsejteken kívül a thrombocyták α-granulumaiban is raktározódik VWF, itt található a véráramban lévő összmennyiség 20 százaléka. Az α-granulumok egyéb, szintén a haemostasisban szerepet játszó fehérjéket tartalmaznak, például fibrinogént, thrombospondint és fibronektint [302]. Az itt található VWF a megakaryocytákban termelődik, a granulumok többek között adenosin-di-foszfát (ADP), kollagén és trombin hatására ürülnek [303]. Az érett VWF egy multimer glikoprotein, mely azonos felépítésű alegységekből áll. A monomerek diszulfidhidakkal kapcsolódnak össze dimerré, mely körülbelül 500kDa nagyságú. Ezekből a dimerekből aztán különböző nagyságú multimerek képződnek, méretük meghaladhatja a 10000kDa vagy az 1μm hosszúságot [304]. A VWF thrombogenitása a multimer méretével arányosan nő, melynek az lehet az oka, hogy a nagy méretű fehérjén sokkal több kötőhely található [305]. A kifejezetten hosszú molekulákat, méretük alapján ultra-large-VWF-nak (UL-VWF) nevezik. Ez a forma egészségesek keringésében csak átmenetileg található meg, fiziológiás állapotban gyorsan eltűnik a keringésből, kisebb méretű, érett VWF-rá hasítódik [306-308] (7. ábra).

7. ábra: Elektroforézissel szeparált csíkok a különböző méretű VWF multimereknek felelnek meg. Az kis molekulatömegű (1-4 alegység), a közepes (5-7) és a nagy (8-11) molekulatömegű (HMW-VWF – high molecular weight VWF) VWF molekulák közül a HMW-VWF tölti be fiziológiásan a legnagyobb szerepet. A több, mint 11 alegységet tartalmazó UL-VWF a WeibelPalade testekben és a thrombocyták α-granulumaiban található (Reininger után [292]).

39

Kísérletekkel bizonyították, hogy az UL-VWF sokkal erősebben köti a vérlemezkék GPIb receptorát és sokkal hatékonyabban növeli a thrombocytaaggregációt, mint a plazmában található egyéb VWF [305, 309]. Ennek a több kötőhelyen kívül az lehet az oka, hogy az UL-VWF spontán is tud a GPIb-hez kötődni, míg a keringésben megtalálható egyéb VWF-k csak ristocetin jelenlétében képesek erre [305]. A WeibelPalade testekben és az α-granulumokban lévő VWF a főként a prothromboticus ULVWF. Sérülés esetén igen előnyös, hogy degranulációval ez a leginkább thromobogen forma kerül a véráramba [292].

2.5.3. ADAMTS13 – a VWF hasító proteáz A UL-VWF multimereket a plazmában megtalálható enzim, az ADAMTS13 proteáz hasítja érett faktorrá. Az ADAMTS13 mozaikszó az „a disintegrin and metalloprotease with thrombospondin type 1 motif, 13” megnevezés egyes kezdőbetűiből alakították ki, a proteáz működésű multidomén szerkezetű molekula egyes alegységeire utal. Az ADAMTS

családba

tartozó,

13-as

sorszámot

kapott

fehérjét

a

9q34-es

kromoszómarégióban található, egy kifejezetten nagy gén (37 kb, 29 exon) kódolja. Az ADAMTS13 proteáz a májban és az endothelsejtekben termelődik, a plazmában 2–4 nap a fél életideje [310, 311]. Az ADAMTS13 egy metalloproteáz, mely cinket és kalciumot használ kofaktorként. A proteáz főképpen az UL-VWF molekulákat hasítja, in vivo működéséhez feltételezhetően a véráramlásból adódó szakító erőre is szükség van. Az áramlás hatására a VWF multimer megnyúlik, így az enzim számára elérhetővé válik az A2 kötőhely, amely egyébként a sokkal nagyobb A1 és A3 régiók között fekszik. A véráram nem kizárólagosan, de legkönnyebben a rögzített VWF-t tudja megfeszíteni és kinyújtani. Úgy tűnik, hogy a szekréciót követően a VWF az endothelsejt felszínén lévő P-selectin segítségével képes a sejtekhez kapcsolódni [312]. A hasítás szabályozása fontos, hiszen a proteáz a szubsztrátjával együtt kering és, ha az összes VWF kis tömegű vagy monomer forma lenne, károsodna a véralvadás folyamata. Ez az állapot jellemzi a von Willebrand betegség 2A típusát. Szintén a nagy multimerek

hiánya

magyarázhatja

a

súlyos

aortastenosisban

megfigyelhető

gastrointestinalis vérzéseket. Az aorta szűkületben a megváltozott véráramlás és a megnövekedett nyíróerő megnyújtja a VWF láncot, amelynek 2A régiója könnyebben

40

elérhetővé válik az ADAMTS13 számára. Megfigyelések szerint a szűkület műtéti megoldása után már 3 órával megjelennek a HMW-VWF multimerek [292]. Az ADAMTS13 funkcionális vagy tényleges hiányában a felszaporodott mennyiségű UL-VWF fokozza a véralvadási hajlamot. A hosszú láncok megkötik a thrombocytákat, melyek aktiválódnak, aggregálódnak, elindítják a coagulatiot és a kis ereket fibrinszálcsák és aggregálódott thrombocyták zárhatják el. A folyamat során kialakuló kórkép a thromboticus thrombocytopeniás purpura (TTP) (8. ábra) [313].

8. ábra: Az ADAMTS13 hasítja az endothelsejt Weibel-Palade testeiből felszabaduló nagyméretű VWF-t kisebb és kevésbé thromobogen multimerekre. ADAMTS13 hiányában a az ultranagy VWF megköti, aktiválja és aggregálja a thrombocytákat. Az így kialakuló microangiopathia a thromboticus thrombocytopeniás purpura [forrás: Moake, N.Eng.J.Med. [313]].

2.5.4. A VWF és az ADAMTS13 szerepe a cardiovascularis megbetegedésekben 2.5.4.1. VWF A VWF-ral foglalkozó tanulmányok a fehérje haemostasisban betöltött kulcsszerepén kívül a VWF szint cardiovascularis betegségekben megfigyelhető prediktív értékéről szólnak. A kettő természetesen nem független egymástól, hiszen a coronaria betegségek vagy a stroke hátterében legtöbbször artériás thrombusképződés áll. Nem biztos azonban, hogy a VWF szint változás előidézi a vérrög kialakulását, lehetséges, hogy mint az endothel diszfunkció markere csupán előrejelzi azt [314]. Nagy esetszámú

41

populációs vizsgálatok, ugyan nem egybehangzóan, de arra az eredményre jutottak, hogy a magas VWF szint, az alacsony koncentrációval összehasonlítva kockázatot jelent a koszorúér betegség kialakulására [315, 316]. Ráadásul a magas VWF szint akut myocardialis infarktuson átesett betegekben összefügg a mortalitással és a reinfarktussal [317, 318]. Irodalmi adatok szerint VWF szerepet játszhat az atheroscleroitcus plakkok kialakulásában [314]. Ismert, hogy a VWF szintje emelkedett krónikus szívelégtelenségben, és a koncentráció korrelál a betegség súlyosságával [319]. Magasabb a VWF szint, ha a betegség akut, dekompenzált stádiumban van, ha a betegség gyakrabban jár dekompenzációs epizódokkal vagy többször van szükség kórházi felvételre [286, 320]. Szintén magasabbnak találták a VWF szintjét olyan szívelégtelenekben, akikben a betegség pitvarfibrillációval [287] vagy cukorbetegséggel [321] társult. Egybehangzó eredmények szerint a magas VWF koncentráció kedvezőtlen rövidtávú kimenettel párosul és előrejelzi a mortalitást [286, 322]. Klinikai vizsgálatok szerint az ACE-gátló kezelés csökkenti a VWF szintet. A mechanizmus egyelőre ismeretlen, de magyarázhatja, hogy miért kisebb az ischaemias események száma a készítmény szedése mellett [323]. Egy holland csoport a fizikai tréning jótékony, VWF szint normalizáló hatását írta le szívelégtelekben [324]. 2.5.4.2. ADAMTS13 Az akut myocardialis infarktus (AMI) kialakulásának hátterében gyakran áll a korábbi coronaria plakk megrepedését követő thrombusképződés [325]. Korábbról ismerték, hogy a magas VWF szint hajlamosít AMI-ra [326, 327], így kézenfekvő volt a feltételezés, hogy az ADAMTS13 is szerepet játszhat a betegség kialakulásában. Alacsony szintje hajlamosíthat a magas VWF koncentrációra és a thrombogenitást is fokozza. Kimutatták, hogy AMI-ban szenvedő betegekben szignifikánsan alacsonyabb az ADAMTS13 aktivitás és az antigénszint, mint a stabil anginás vagy egyéb mellkasi fájdalom miatt kezelt betegekben. Az AMI-n átesett betegek közül a VWF/ADAMTS13 hányados szignifikánsan magasabb volt azokban a betegekben, akiknél a kórházi kezelés alatt kardiális szövődményt észleltek [328]. Ugyanakkor szignifikánsan alacsonyabb ADAMTS13 szintet találtak instabil anginában, mint stabil anginában, vagy coronaria szűkülettel nem járó mellkasi fájdalomra panaszkodó betegeknél [329]. Chion és munkatársai [317] legalább hat hónappal az infarktus lezajlása után vett

42

vérmintákban határozták meg az ADAMTS13 szintjét, ekkor nem találtak különbséget a beteg és a kontroll csoport között. Matsukawa és kollégái [318] percutan coronaria intervenció (PCI) után 1, 3, 7 és 14 nappal vettek vért AMI-ban szenvedő betegektől. Eredményeik szerint az ADAMTS13 szint a betegekben a kontrollokhoz képest csökkent, legkisebb a PCI utáni harmadik napon volt. Ez az alacsony érték egy változós Cox modellekben szignifikánsan előrejelezte az egyéves követési idő alatti klinikai eseményeket. Többváltozós modellekben a VWF/ADAMTS13 hányadosnak az első és a harmadik nap közötti nagy különbsége több, mint másfélszeres kockázatot jelentett a klinikai eseményekre (OR 1,66, CI 1,12-2,47). Horii és munkatársai [330] az ok-okozati összefüggéseket keresve meghatározták AMI-n átesett betegekben az ADAMTS13 aktivitást és az UL-VWF szintjét. A várttal ellentétben, a kontrollokhoz és a krónikus fázishoz képest az akut szakban nem találtak szignifikánsan alacsonyabb ADAMTS13 aktivitást, azonban a korai mintában sikerült UL-VWF-t kimutatni, míg a krónikus fázisban vett mintában nem. Egy glasgow-i tanulmányban [329] az AMI után 3-9 hónappal vett mintákban nem volt szignifikánsan alacsonyabb ADAMTS13 szint az egészséges kontrollokhoz képest, azonban logisztikus regressziós analízis során a főbb cardiovascularis rizikóra illesztett modellekben 1 SD-nyi ADAMTS13 szint növekedés 27%-kal csökkentette az AMI rizikóját. Úgy tűnik tehát, hogy az ADAMTS13 aktivitás csökkenése jellemzi az AMI akut fázisát, ám több hónappal az esemény után a kontroll csoporthoz képest nincs különbség a proteáz szintjében. Az ADAMTS13 aktivitás csökkenéssel párhuzamosan, az AMI kialakulásakor kimutatható az UL-VWF a keringésben, mely thromobogen hatásán keresztül elősegítheti az érelzáródást. Az ADAMTS13 szint negatívan korrelál az AMI után kialakuló szövődményekkel. Egy holland csoport eredményei szerint az ADAMTS13 aktivitás malignus hypertensioban is csökkent. Az ADAMTS13 aktivitás meghatározása segítheti a thromboticus microangiopathiával járó formák elkülönítését [331]. Egy közelmúltban megjelent tanulmányban arról számoltak be, hogy az ADAMTS szintje alacsonyabb pitvarfibrilláló

betegekben,

mint

az

egészséges

kontroll

csoportban,

illetve

koncentrációja szignifikánsan korrelált a remodellinggel [332]. Jelen tudásunk szerint nemzetközi irodalomban nem jelent még meg közlemény, mely az ADAMTS13 aktivitását ismerteti szívelégtelen betegekben.

43

3. Célkitűzések Egy részletesen jellemzett, krónikus szívelégtelenségben szenvedő betegpopuláció követéses vizsgálatával az alábbi kérdésekre kerestük a választ:

1,

Milyen

prognosztikai

értékkel

bír

az

MR-proADM

és

a

CT-proET-1

szívelégtelenségben a mortalitást és morbiditást illetően, a „gold standardként” elfogadott NT-proBNP-hez képest? A szívelégtelenekkel foglalkozók körében folyamatos az igény a megbízható diagnosztikus és prognosztikus biológiai markerek iránt, amelyek segítik a klinikai döntéshozatalt és irányíthatják a terápiát. Az utóbbi években az NT-proBNP töltötte be ezt a szerepet, azonban az egyetlen marker alapján végzett rizikó besorolásnak bizonyos korlátai lehetnek. Újabban igény merült fel a több markeren alapuló stratégiák kidolgozására, amit a közelmúlt metodikai újításai is lehetővé tettek. Sikerült újabb vazoaktív peptid hormonok megbízható meghatározását kifejleszteni, így például az MR-pro-adrenomedullinét és a CT-pro-endothelin-1-ét. Célunk tehát az volt, hogy meghatározzuk az adrenomedullin és az endothelin-1 kapcsolatát a szívelégtelenség súlyosságával, és felmérjük a két vazoaktív peptid prediktív értékét a túlélés és a rehospitalizáció vonatkozásában. 2, Milyen biológiai kapcsolatokkal rendelkezik az NT-proBNP, az MR-proADM és a CT-proET-1 a krónikus szívelégtelenségben? Egy biomarker tulajdonságának megismeréséhez és funkciójának megértéséhez feltétlenül szükséges annak meghatározása, hogy az adott fehérje in vivo milyen összefüggéseket mutat a beteg egyént és a betegséget jellemző főbb klinikai és laboratóriumi paraméterekkel. A markerek elterjedt használata ellenére meglepően kevés adattal rendelkezünk erre vonatkozóan, ezért célul tűztük ki a három peptid biológiai korrelációinak felmérését szívelégtelenségben. 3, Fennáll-e a szívelégtelenség súlyosságától független, szoros összefüggés a gyulladás és a vazoaktív fehérjék (MR-proADM és CT-proET-1) szintje között? Állatmodellekben és sejtes vizsgálatok során tett megfigyelések alapján feltételezhető, hogy az ADM és az ET-1 termelését befolyásolják a gyulladásos

44

cytokinek, illetve arra utaló adatok is ismertek, hogy a két vazoaktív peptid immunmoduláló hatásokkal rendelkezik. A gyulladás és a vazoaktív molekulák közötti kölcsönös reguláció megléte újabb útvonalat jelenthet a szívelégtelenségben kialakuló szisztémás gyulladáshoz, valamint egyike lehet a betegség progressziójához vezető ördögi körnek. Legjobb tudásunk szerint humán, szívelégtelenek körében végzett klinikai vizsgálatban még nem tanulmányozták a betegség súlyosságát is figyelembe véve a gyulladásos markerek és a két vazoaktív peptid kapcsolatát, ezért célunk volt, hogy statisztikai modellek segítségével feltárjuk ezt a kapcsolatot. 4, Kimutatható-e kapcsolat a stresszválasz (sHsp70 szint) és a szívelégtelenség között, illetve a magas sHsp70 szint összefügg-e a mortalitással és a morbiditással? Az irodalmi adatok szerint eddig egy munkacsoport határozta meg humán vizsgálat során a sHsp70 szintjét krónikus szívelégtelenségben. Eredményeik szerint a betegség súlyosságával párhuzamosan nő a sHsp70 koncentrációja, de a túléléssel nem mutat összefüggést [279]. Célunk volt a stresszválasz plazmamarkerének vizsgálata, hogy megállapítsuk, valóban létezik-e összefüggés a szívelégtelenség súlyosságával és a prognózissal. 5, Van-e összefüggés a HspA1B A(1267)G, valamint a HspA1L C(2437)T genetikai polimorfizmus és a szívelégtelenség súlyossága vagy kimenetele között? Mutatnak-e kapcsolatot a fenti a polimorfizmusok az extracelluláris sHsp70 szintekkel? A 70kDa-os Hsp-t kódoló gének polimorfizmusai különböző kórképekben összefüggést mutatnak a betegség súlyosságával, a szívelégtelenségre vonatkozóan azonban nem rendelkezünk ilyen adatokkal. Szintén nem ismert, hogy a két polimorfizmus milyen hatással van a gén termékének, a Hsp70-nek a szérumszintjére. Ez utóbbi azért is lényeges, mert összefüggés esetén a polimorfizmus és a kórképek lefolyása közötti kapcsoltat ok-okozati tulajdonságára utalna. Célunk volt tehát a HspA1B A(1267)G, valamint a HspA1L C(2437)T allélfrekvenciák meghatározása, és a betegség súlyosságával, kimenetelével illetve a sHsp70 szinttel mutatott összefüggéseik tanulmányozása.

45

6, Van-e korreláció a sHsp70 és a gyulladás markerei között? A sHsp70 szintje milyen biológia összefüggésekkel rendelkezik krónikus szívelégtelenség esetén? A sHsp70 mint a celluláris stressz markere hozzájárulhat a krónikus szívelégtelenségben kialakuló szisztémás gyulladáshoz. Kevés adattal rendelkezünk a gyulladásos cytokinek és a sHsp70 szintje közötti összefüggésekről szívelégtelenekben. A sHsp70 koncentráció növekedés lehetséges okainak megismerése céljából fontosnak tartottuk a sHsp70 klinikai és laboratóriumi paraméterekkel mutatott egyéb korrelációinak tanulmányozását. 7, Eltér-e az ADAMTS13, a VWF hasító proteáz, aktivitása szívelégtelenségben szenvedőkben az egészségesekben mért értékhez képest? Ezzel párhuzamosan hogyan változik a VWF:Ag szintje a betegségben? A thromboemboliás szövődmények jól ismert komplikációi a krónikus szívelégtelenségnek. Ismert, hogy a betegekben kialakuló endothel diszfunkció a VWF szint növekedéséhez vezet, azonban egyáltalán nem ismert, hogy az ADAMTS13 aktivitás,

és

ezáltal

a

klinikailag

feltehetően

informatívabb

ADAMTS13

aktivitás/VWF:Ag hányados hogyan módosul a betegség során. Célul tűztük ki, hogy a VWF:Ag szint mérésén túl, elsőként meghatározzuk az ADAMTS13 aktivitást krónikus szívelégtelenségben szenvedő betegekben. 8, Milyen biológiai összefüggései vannak szívelégtelenségben a VWF-nak és az ADAMTS13 aktivitásnak? Hogyan alakul a két fehérje szintje a betegség súlyosságának függvényében? A VWF:Ag koncentráció valamint az ADAMTS13 aktivitás szabályozásának megértéséhez és a szívelégtelenekben megfigyelt változásaikat okozó tényezők felméréséhez fontosnak tartottuk a klinikai és laboratóriumi paraméterekkel mutatott összefüggéseik vizsgálatát. 9, Rendelkezik-e az ADAMTS13/VWF hányados prognosztikai értékkel a mortalitás, a rehospitalizáció és a thromboemboliás szövődmények tekintetében? Ismert, hogy szívelégtelenségben magas VWF szint esetén kedvezőtlenebb túlélésre számíthatunk, azonban kevés adattal rendelkezünk a szívelégtelenségben

46

kialakuló thromboemboliás szövődmények és a VWF kapcsolatáról. Az ADAMTS13 biológiai funkciója miatt feltételeztük, hogy az ADAMTS13 aktivitás mind a mortalitás, mind a morbiditás tekintetében javítja a VWF prediktív értékét. Célul tűztük ki ezen hipotézisünk vizsgálatát.

47

4. Módszerek 4.1. Betegek bevonása a vizsgálatba A Semmelweis Egyetem III.sz. Belgyógyászati Klinikájának fekvőbeteg osztályáról és kardiológiai járóbeteg szakrendeléséről konszekutív módon gyűjtöttük a krónikus, manifeszt bal-kamrai szisztolés szívelégtelenségben szenvedő betegeket. A beválasztási kritériumok között szerepelt a betegség tüneteinek megléte, a 45%-nál kisebb bal kamrai ejekciós frakció és megfelelő tájékoztatást követően a beleegyező nyilatkozat aláírása. 2005. február és 2007. áprilisa között 194 beteg került be a vizsgálatba, a későbbi analízisek némelyike során 8 beteget akut, gyulladásos szövődmények fennállása miatt kizártunk. A vizsgálati protokoll szerint a bevonás során minden beteg fizikális és transthoracalis echocardiographiás vizsgálaton esett át. Minden résztvevőről bevételi adatlapot töltöttünk ki, mely a következő információkat tartalmazta: Személyes adatok, születési dátum, beteg elérhetősége, háziorvosának neve a követés lebonyolításához Betegség diagnózisának időpontja, a szívelégtelenség etiológiája (ischaemiás ill. hypertonia okozta, toxikus, ismeretlen) A szívelégtelenség súlyossága: NYHA stádium, perifériás ödéma és tüdőpangás jelenléte Pulzusszám, szisztolés és diasztolés vérnyomás Testmagasság, testsúly, fél évvel korábbi testsúly (retrospektív adat), az elmúlt egy évben tapasztalt 10%-ot meghaladó súlynövekedés vagy fogyás Az utóbbi két évben a szívelégtelenség miatti hospitalizációk száma Gyógyszerszedés (a vascularis készítmények esetében hatóanyag csoportokra bontva) Anamnézis, különös tekintettel az alábbi kórképekre: szívinfarktus, invazív kardiológiai beavatkozások (PTCA, CAGB), COPD, stroke, hypertonia, cukorbetegség, pitvarfibrilláció, perifériás verőérszűkület, vénaelégtelenség, pulmonális embólia, mély vénás thrombosis, daganatos megbetegedés, krónikus gyulladással járó kórkép, depresszió, hyperlipidemia Dohányzási és alkoholfogyasztási szokások, speciális diéta Családi anamnézis (szívelégtelenség, szívinfarktus, stroke, cukorbetegség, hirtelen halál, daganatos megbetegedés, hypertonia előfordult-e a közvetlen családtagoknál) Pacemaker vagy ICD készülék, beültetés ideje Szociális-gazdasági helyzet: legmagasabb iskolai végzettség, lakóhely típusa, jelenlegi munkavégzés jellege, családi állapot

48

Életminőség, az EuroQol Group EQ-5D [333] kérdőívének segítségével meghatározva A betegvizsgálat és a bevételi adatlap kitöltését követően vérvétel történt, mely a vizsgálattól függetlenül is része volt a Klinikán megjelenő betegek kivizsgálásának. A szakorvosi vizit miatt szükséges alább felsorolt laboratóriumi adatokat is rögzítettük adatbázisunkban: Ionok: nátrium, kálium Vesefunkció: karbamid, kreatitin Máj enzimek: GOT, GPT, γGT Egyéb klinikai kémia: bilirubin, LDH, albumin, összfehérje, kreatinin kináz, CRP, glükóz, húgysav, ALP Mennyiségi és minőségi vérkép INR, fibrinogén A vérvételek reggel, 12 órás éhezés után, az antecubitális véna punkciójával történtek, zárt vérvételi rendszer alkalmazásával. Egy natív, egy EDTA-val és egy nátriumcitráttal alvadásgátolt vérmintából megfelelő előkészítés után szérum és plazma aliquotok készültek, melyeket a további feldolgozásig -70 ˚C tároltunk. Az EDTA-val alvadásgátolt vérből kisózásos módszerrel [334] DNS-t szeparáltunk.

4.2. Betegek követése A betegeket követtük, a vizsgálatba vétel és az első követési vizit között átlagosan 14,85 (SD 7,46) hónap telt el. Az összes betegnél egységesen a vizsgálat kezdő időpontjától számított 365 napot tekintettük a követéses (cenzorálási) időszaknak. A személyes, illetve telefonos interjú, a beteg nyilvántartási rendszer és a hozzátartozók segítségével rögzítettük a követési intervallum alatt előforduló eseményeket, a mortalitást, a szívelégtelenség rosszabbodása miatti kórházi felvételt, valamint a thromboemboliás és egyéb cardiovascularis megbetegedéseket.

4.3. Laboratóriumi mérések A rutin laboratóriumi meghatározások a Semmelweis Egyetem, Kútvölgyi Klinikai Tömb Központi Laboratóriumában, Roche Integra 8000 és Cell-Dyn 3500 automaták segítségével készültek.

49

4.3.1. Gyulladásos paraméterek meghatározása 4.3.1.1. TNF-α, IL-6 A TNF-α és az IL-6 szérumszintjét ELISA (Enzyme-Linked Immun Sorbent Assay) technikán alapuló Quantikine High Sensitivity Kittel határoztuk meg (R&D Systems Minneapolis, Minnesota, USA, Cat. No.: TNF-α – HSTA00C, IL-6 – HS600B). A mérés során a gyártó utasításait követtük. A gyárilag monoklonális anti-TNF-α-val és IL-6-tal fedett 96 lyukú ELISA lemezt 200μl hígítatlan vizsgálati szérummintával 3 órán keresztül szobahőmérsékleten inkubáltuk. Többszörös mosást követően lyukankén 200μl alkalikus foszfatázzal konjugált poliklonális anti-TNF-α-t illetve anti-IL-6-t adtunk a rendszerhez, melyet további 2 órás inkubáció követett. Újabb mosási ciklus után 50μl stabilizált NADPH-t tartalmazó szubsztrát hozzáadása, majd egyórás inkubációt követően egy amplifikációs lépés következett, mely során 50μl amplifikáló oldatott mértünk a lyukakba. Kénsavas leállítást követően az optikai denzitást 490nm-en olvastuk le, 650nm-es referencia mellett. A gyártó adatai szerint a mérés detekciós küszöbe a TNF-α esetében 0,12pg/ml, míg az IL-6 meghatározásnál 0,039 pg/ml, az intra/inter-assay variabilitás az IL-6 esetében 10% alatti, a TNF-α mérésnél 6 és 12% volt. 4.3.1.2. TNF-RI, TNF-RII A szérum szolúbilis TNR receptor I és II tartalmát szendvics immunassay technikával mértük. A méréshez az R&D Systems (Minneapolis, Minnesota, USA, Cat. No.:DRT100 illetve DRT200) ELISA kit-et használtuk. A teszt során „capture” monoklonális anti-TNF-RI vagy anti-TNF-RII antitesttel érzékenyített (100μl/lyuk; 4μg/ml illetve 2μg/ml; bikarbonát pufferben (pH 9.5) egy éjszakán át 4°C-on) 96 lyukú ELISA lemezt háromszori mosás (PBS, 0,1% Tween 20) és a nem-specifikus kötőhelyek blokkolása (200μl PBS, 0,5% zselatin, 0,1% Tween 20, 1 órán át, szobahőmérsékleten) után hígító oldattal (1% BSA, 1x-es PBS) tízszeresére hígított vizsgálati szérummintával inkubáltuk (2 óra, szobahőmérsékleten). Újabb mosási ciklust követően biotinnal jelzett poliklonális anti-TNF-RI vagy RII antitesttel (1,5 óra, szobahőmérsékleten)

és

avidin-torma

peroxidáz

komplex-szel

(20

perc,

szobahőmérsékleten) detektáltuk a lemezhez kötődött TNF-RI illetve TNF-RII fehérje mennyiségét. Standardként rekombináns humán TNF-RI vagy TNF-RII hígítási sorát

50

használtuk. A lemezeket 100μl o-phenylene-diamine (OPD, Sigma) szubsztráttal hívtuk elő, az optikai denzitást 490nm-en (referencia 620nm) mértük.

4.3.2. Vazoregulációs peptidek meghatározása 4.3.2.1. NT-proBNP A szérum NT-proBNP szintjét szendvics immunoassay (ELISA) technikával, gyári kit (Biomedica Gruppe, Cat.No.: BI-20852) segítségével határoztuk meg. A mérés során pontosan a gyártó útmutatása szerint jártunk el. A poliklonális anti-NT-proBNP-vel gyárilag fedett 96 lyukú ELISA lemezt 200μl nyolcszorosra hígított vizsgálati szérum mintával és 50μl konjugátummal (szintetikus NT-proBNP-HRPO (torma peroxidáz)) 24 órán keresztül, sötétben, 4 °C-on inkubáltuk. Többszörös mosást követően a lemezeket lyukanként 200μl szubsztrát hozzáadásával hívtuk elő, 20 perc sötétben történő inkubálás és kénsavas leállítás után az optikai denzitást 450nm-en határoztuk meg (referencia 620nm). Az NT-proBNP szinteket az ismert koncentrációjú standardok értekeiből készült kalibrációs görbe alapján adtuk meg. A gyár adatai szerint a detekciós küszöb 5 fmol/ml, az intra/inter-assay variabilitás értéke a kérdéses tartományban 5%-nál kisebbnek mutatkozott. 4.3.2.2. MR-proADM, CT-proET-1 Az ADM és ET-1 mérés korábban pontatlan és kevéssé megbízható volt a molekulák rövid féléletideje és instabilitása, illetve a plazmában lévő kötőfehérjék jelenléte miatt [335, 336]. Morgenthaler és munkatársai mind a két vazoaktív peptid esetében egy olyan szendvics immun-luminometrián alapuló eljárást dolgoztak ki, mely során a hormonnal azonos moláris mennyiségben termelődő, hosszú féléletidejű, az előalakokból lehasadó fehérje koncentrációját határozzák meg (9. ábra). Az adrenomedullin termelődésekor a pre-proADM-ból kihasadó középső MRproADM (45-92. aminosav) a hormonnal azonos mennyiségben található a plazmában [337]. Stabil, nem kötődik az ADM kötő fehérjéhez, így meghatározásával megbízhatóan következtettünk az ADM koncentrációjára [175]. Hasonló elvi megfontolások alapján az ET-1 mérésnél az ellenanyagok az előalak C-terminális végéről lehasadó 168-212 CT-proET-1-hez kötődtek [141]. A MR-proADM és CT-proET-1 plazma koncentrációk meghatározását a BRAHMS Kft végezte Németországban (BRAHMS Aktiengesellschaft, Hennigsdorf,

51

Germany)

EDTA-val

alvadásgátolt

vér

mintákból

tudományos

kollaborációs

megállapodás alapján.

N-20 terminal peptide 21 (PAMP) 45

1

17

146

185

MR-proADM

Signal

1

Adrenomedullin 92 95

Endothelin-1 53

73

168

90

Signal

212

CT-proET-1

9. ábra: Az ADM és ET-1 koncentráció immun-luminometriás módszeren alapuló mérése a BRAHMS Kft. által szabadalmaztatott eljárással. Az antitestek a peptidekkel azonos moláris mennyiségben termelt előalak fragmentumokhoz kötődnek. [forrás: BRAHS AG, Hennigsdorf, Németország]

4.3.3. Hősokkfehérje meghatározások 4.3.3.1. Szolúbilis Hsp70 A szérum szolúbilis Hsp70 tartalmát szendvics immunassay technikával mértük. A méréshez az R&D Systems (Minneapolis, Minnesota, USA, Cat. No.:DYC1663E) ELISA kit-et használtuk. A teszt során „capture” monoklonális anti-Hsp70 antitesttel érzékenyített (100μl/lyuk; 2μg/ml; bikarbonát pufferben (pH 9.5) egy éjszakán át 4°Con) 96 lyukú ELISA lemezt háromszori mosás (PBS, 0,1% Tween 20) és a nemspecifikus kötőhelyek blokkolása (200μl PBS, 0,5% zselatin, 0,1% Tween 20, 1 órán át, szobahőmérsékleten) után hígítatlan vizsgálati szérummintával inkubáltuk (2 óra, szobahőmérsékleten). Újabb mosási ciklust követően biotinnal jelzett anti-Hsp70 monoklonális antitesttel (1,5 óra, szobahőmérsékleten) és avidin-torma peroxidáz komplex-szel (20 perc, szobahőmérsékleten) detektáltuk a lemezhez kötődött Hsp70 fehérje mennyiségét. Standardként rekombináns humán Hsp70 hígítási sorát használtuk. A lemezeket 100μl o-phenylene-diamine (OPD, Sigma) szubsztráttal hívtuk elő, az optikai denzitást 490nm-en (referencia 620nm) mértük. A detekciós küszöb 0,05 ng/ml volt, az intra/inter-assay variabilitás értéke <10/<16%-nak mutatkozott.

52

4.3.3.2. HspA1B genotipizálás A Hsp70-2, más néven HspA1B A(1267)G, rs1061581, egy pontos polimorfizmusát Vargas-Alarcon által leírt, restrikciós

fragmentum

hosszúság

polimorfizmuson

alapuló módszerrel határoztuk meg [338]. A szensz 5’CATCGACTTCTACACGTCCA-3’ és az antiszensz 5’CAAAGTCCTTGAGTCCCAAC-3’ primer pár felhasználásával a kérdéses DNS szakaszt polimeráz lánc reakció segítségével felszaporítottuk, és PstI enzimes hasítás után a termékekkel 2%-os agaróz gélen, ethidium bromidos festés mellett elektroforézist végeztünk. Az 1117 bázispár (bp) hosszúságú termék az AA, a 936 és 181 bp a GG, míg mind a háromféle termék jelenléte AG genotípusra utal (10.

10. ábra: HspA1B genotipizálás elektroforetikus képe. A 181bp termék kis mérte miatt az ábrázolt tartományon kívül van

ábra). 4.3.3.3. HspA1L genotipizálás A Hsp70-hom, más néven HspA1L C(2437)T, rs2227956, egy pontos polimorfizmusát Milner és Campbell által leírt [339], restrikciós fragmentum hosszúság

polimorfizmuson

alapuló

módszerrel

határoztuk meg. A kérdéses DNS szakaszt polimeráz lánc reakció segítségével felszaporítottuk, a forward primer

szekvenciája

GGACAAGTCTGAGAA-

GGTACAG, míg a reverz primeré GTAACTTAGATTCAGGTCTGG volt. A termékkel NcoI enzimes hasítás után 2%-os agaróz gélen, ethidium bromidos

11 ábra: A HspA1L genotipizálás elektroforetikus képe.

festés mellett elektroforézist végeztünk. Az 878 bázispár (bp) hosszúságú termék a CC, a 551 és 327 bp a TT, míg mind a háromféle termék jelenléte CT genotípusra utal (11. ábra).

53

4.3.4. ADAMTS13 aktivitás meghatározása Az ADAMTS 13 aktivitás meghatározása Kobayashi és munkatársai által kidolgozott FRETS-VWF-73 fluorescens quenching szubsztrát hasításából eredő fluoreszcencia kinetikus mérésével történt [340]. A citrátos plazma mintákból reakció pufferrel (5 mM Bis-Tris, 25 mM CaCl2, 0,005% v/v Tween 20, pH 6.0) 1:25-ös hígítást készítettünk, majd a 100μM-os FRETS-VWF-73 szubsztrátot hússzorosára hígítottuk. A két oldatból azonos mennyiséget összemérve 37 ˚C fokon, 1 órán keresztül, 340nm-es exmissziós és 460nm-es emissziós hullámhosszon kinetikus fluorimetriás mérést végeztünk. A kapott fluoreszcencia értékeket az idő függvényében ábrázoltuk, lineáris regresszióval meghatároztuk a meredekséget. Egészséges véradók poolozott plazmájából készült hígítási sorozat meredekségi értékeit a hígítás százalékának függvényében ábrázoltuk. Az így készített standard görbe (100% -hígítás nélküli normál plazma, 0% - vak, reakció puffer) segítségével határoztuk meg az ismeretlen plazmák aktivitását. Az eredményeket a poolozott egészséges véradó plazma aktivitásának százalékos arányában adtuk meg. Technikai okok miatt csak 152, véletlenszerűen kiválasztott beteg mintájában határoztuk meg az ADAMTS13 aktivitását.

4.3.5. VWF:antigénszint mérése A VWF:antigén (VWF:Ag) szintjét citrátos plazmából, ELISA (enzyme-linked immunsorbent assay) módszer segítségével határoztuk meg, kereskedelmi forgalomban kapható antitestek (Dakopatts, Glostrup, Denmark) segítségével. Mikrotiter lemezeket 1:8000 arányban nátrium bikarbonát pufferben hígított (pH 9,6) poliklonális anti-human VWF ellenes nyúl antitestekkel fedtük. Egy éjszakán át tartó 4˚C fokos inkubálás és mosás (TBS-T – Tris pufferelt oldat, 0,05% Tween-20 tartalommal) után a hozzáadott 1:500 arányban hígított plazma mintákat 2 óráig szobahőmérsékleten inkubáltuk. Ismételt mosás után HRP-konjugált anti-humán VWF ellenes poliklonális nyúl antitestekkel egy órán át inkubáltuk a lemezeket, majd ortho-phenylenediamine (OPD) hozzáadása után 492 nm-es hullámhosszon határoztuk meg az optikai denzitást. Az eredményeket 10 egészséges véradó mintáiból poolozott plazmában mért érték százalékos arányában adtuk meg.

54

4.4. Statisztikai számítások A statisztikai analízis és az adatábrázolás a STATISTICA (StatSoft Inc. Tulsa OK, Amerikai Egyesült Államok), SPSS (SPSS Inc, Chicago, Illionis, Amerikai Egyesült Államok), MedCalc (MedCalc Software, Mariakerke, Belgium) illetve a Prism for Windows (GraphPad Software, San Diego, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok, 3.0 és 4.02 verzió) programok használatával készült. A vizsgált változók többsége eltért a normál eloszlástól, ezért nem-paraméteres statisztikai teszteket használtunk az analízisek során. Két független minta folytonos változóinak összehasonlításához Mann-Whitney U-tesztet, a kategorikus változók összehasonlításához Pearson χ2 próbát használtuk. A csoporton belüli variancia analízist Dunnet-féle post hoc teszttel kiegészített Kruskal-Wallis teszttel végeztük. Interakciók analíziséhez faktoriális ANOVA tesztet használtunk. A változók közötti korrelációk vizsgálatánál a Spearman-féle rank-korrelációs koefficiens értékét határoztuk meg. Bináris adatok kapcsolatának vizsgálatára többszörös logisztikus regressziós analízist végeztünk. A folyamatos változók összetett kapcsolatának elemzésekor többszörös lineáris regressziót alkalmaztunk. A re-hospitalizációra és a halálozásra vonatkozó túlélési analízisek során Cox regressziós analízist végeztünk. A legmegfelelőbb vágópontok meghatározása receiver operator characteristics (ROC) görbe analízis segítségével történt. Az analíziseknél, szükség esetén az interkvartilis tartományra normalizáltunk, vagy logaritmikus transzformációhoz folyamodtunk. Minden statisztikai tesztet kétoldalasan végeztünk, a próbák eredményét p<0,05 értékek esetén tekintettük szignifikánsnak. A szövegben megadott értékeknél a medián (interkvartilis tartományt) került feltüntetésre, az ettől eltérő eseteket a szövegben jeleztem.

55

5. Eredmények 5.1. A betegpopuláció jellemzése 5.1.1. Bevételi adatok A betegek vizsgálatba vételkor rögzített adatait az 1. és a 2. táblázatban foglaltam össze. A betegek körülbelül 75 százaléka férfi, az átlag életkor 68 év. A vizsgálatba vételkor 134 egyén (69%) volt fekvőbeteg, ám a betegek 54 százaléka (105 fő) nem

feküdt

szívelégtelenség

diagnózissal

kórházban a bevételt megelőző két évben. A betegek közel 70 százalékában magas vérnyomás társult az alapbetegséghez, a betegek többsége megfelelő terápiában részesült. A szívelégtelenség hátterében 122 betegnél (62,9%) bizonyított az ischaemia. 72 beteg anamnézisében nem szerepelt ischaemiára utaló eltérés (típusos angina, pozitív ergometria, AMI), közülük 47 paciensénél a negatív

eredménnyel

zárult

koszorúér-festés

1. táblázat: Betegpopuláció gyógyszerelése a bevételkor és az anamnézisben szereplő társbetegségek gyakorisága n % Gyógyszerelés: Kacsdiuretikum 146 75,3 ACE-gátló, ARB 133 68,6 Ca-antagonista 30 15,5 Digoxin 38 19,6 β-blokkoló 131 67,5 Statin 76 39,2 Aspirin 75 38,7 Kumarin 77 39,7 Nitrát 63 32,5 Társbetegségek: AMI 80 41,2 CABG 30 15,5 PCI 29 14,9 PF 89 45,9 COPD 18 9,3 HT 134 69,1 DM 73 37,6 TIA, stroke 21 10,8

kizárta az ischaemiás etiológiát. Az alkoholfogyasztási szokások alapján 27 betegnél feltételezhető a toxikus eredet. A betegek 62 százaléka, 121 ember, dohányzott rendszeresen valamikor élete során, a vizsgálatba vételkor azonban csak 13 százalék, 25 egyén. A bevettek 48 százaléka (94 fő) fogyasztott rendszeresen alkoholt, 42 százalék tartott valamilyen diétát. A betegeket a NYHA stádiumok alapján két csoportra bontottuk, a kevésbé súlyos betegek csoportjában 38 NYHA I. és 63 NYHA II. stádiumú egyén került. A súlyosabb betegek közül 70 a NYHA III. és 23 a NYHA IV. stádiumú paciens. Elmondható

tehát,

hogy

a

betegség

súlyossága

reprezentatív.

56

szempontjából

vizsgálatunk

2. táblázat: A betegpopuláció, a súlyos és a kevésbé súlyos betegek klinikai és laboratóriumi adatai. A medián (interkvartilis tartomány), vagy az esetszám és a százalék látható, a p-értéket a folyamatos változóknál Mann-Whitney teszt, a kategorikus változóknál Pearson teszt segítségével határoztuk meg. Összes beteg (n=194) NYHA I-II (n=101) NYHA III-IV (n=93) Median Interkvart.tart. Median Interkvart.tart. Median Interkvart.tart. p-érték vagy n vagy % vagy n vagy % vagy n vagy % Kor (év) 69,45 (59,26–77,33) Nem (ffi) 145 74,7 Ödéma 81 42 Pulm. Pangás 81 42 BMI (kg/m2) 26,73 (24,35–31,02) Szívf. (1/min.) 80 (70–90) Sziszt. vp.(Hgmm) 120 (110–140) Diaszt. vp. (Hgmm) 80 (70–80) BK-EF (%) 34 (27–40) NT-proBNP (pmol/ml) 0,68 (0,37–1,56) MR-proADM (nmol/l) 0,98 (0,77–1,43) CT-proET-1 (pmol/l) 109,0 (77,5–162) Nátrium (mmol/l) 140 (137–142) Kreatinin (umol/l) 96 (78–136) GFR (ccs/min) 67 (45–84) Húgysav (mg/dl) 421,5 (349–512) Koleszterin (mg/dl) 4,12 (3,46–4,96) Bilirubin (umol/l) 13,40 (8,9-20,1) GOT (U/l) 23 (19–32) GPT (U/l) 23 (17–36) ALP (U/l) 80 (64–103) γGT (U/l) 64 (34–123) LDH (U/l) 207 (179–242) Összfehérje (g/l) 72 (67–77) Albumin (g/l) 41 (38–44) Prealbumin (g/l) 0,22 (0,17-0,27) CRP (mg/l) 6,35 (2,98–13,71) Hgb (g/l) 141,5 (129–154) RDW (%) 14,5 (13,7-15,8) Thromboc. (109/l) 195 (161-231) TNF-RI (ng/ml) 5,85 (3,69–9,00) TNF-RII (ng/ml) 4,03 (2,94–5,57) TNF-α (pg/ml) 2,38 (1,4–3,75) IL-6 (pg/ml) 10,13 (6,13–16,43) ADAMTS13 akt. (%) 74,16 (57,34–95,10 ADAMTS/VWF 0,66 (0,43–0,93) VWF:Ag (%) 114,69 (85,16–150,7) sHsp70 (ng/ml) 0,33 (0,26–0,52)

67,07 73 31 21 26,77 72 125 80 38 0,46 0,85 94,9 141 92 73,0 401 4,30 12,32 23 23 76 60 202 74 42 0,24 5,19 145,0 14,0 200 4,98 3,49 2,03 8,94 82,00 0,81 103,05 0,30

(57,64–75,85) 72,5 30,7 20,8 (24,65–30,88) (67–85) (120–140) (70–80) (30–41) (0,28–0,94) (0,63–1,08) (73,4–122) (139–143) (75–108) (57–91) (335–480) (3,63–5,21) (8,16–18,6) (19–32) (17–36) (63–99) (27–116) (169–231) (69–78) (40–45) (0,19-0,29) (2,52–10,69) (135–155) (13,4–14,9) (169–232) (3,60–7,02) (2,84–4,59) (1,19–3,32) (4,79–14,20) (66,86–95,49) (0,51–1,07) (76,29–137,1) (0,24–0,42)

71,05 72 50 60 26,58 80 120 70 31 1,20 1,33 143,0 139 107 57,0 438 4,05 14,49 23 23 88 75 215 70 40 0,21 8,18 138,0 15,1 187 7,54 5,05 2,89 11,24 66,12 0,53 127,33 0,39

(63,39–77,86) 77,4 53,8 64,5 (23,94–31,14) (70–93) (105–135) (62–80) (24–37,5) (0,48-2,22) (0,91–1,84) (91,6–188) (136–142) (86–157) (38–79) (353–577,5) (3,36–4,58) (9,5–22) (18–33,5) (16–37) (67–113) (36,5–127,5) (192–251) (64–74) (36–42) (0,15-0,26) (3,82–16,74) (121,5–149,5) (14,1–16,4) (153,5–222) (4,34–11,29) (3,21–6,46) (1,96–4,28) (6,97–20,27) (49,19–90,35) (0,33–0,83) (94,65–175,7) (0,28–0,65)

0,037 0,410 0,001 <0,0001 0,424 0,040 0,006 <0,001 <0,001 <0,0001 <0,0001 <0,0001 0,001 <0,001 <0,001 0,037 0,037 0,114 0,756 0,951 0,027 0,135 0,012 <0,001 <0,0001 0,002 0,008 0,002 <0,0001 0,183 <0,0001 <0,0001 0,003 0,015 0,006 <0,001 <0,001 0,002

ffi.- férfi, pulm.- pulmonális, szívf.- szívfrekvencia, sziszt. vp, diaszt. vp.- szisztolés és diasztolés vérnyomás, thromboc.-thrombocyta, ccs/min – ml/min/1,73m2. A többi rövidítés feloldása a szövegben megegyező módon.

57

A vártnak megfelelően a súlyos stádiumú betegeknél gyakoribb volt a perifériás és/vagy pulmonális pangás, rosszabb volt a szív pumpafunkciója. Az irodalmi adatokkal megegyezően az előrehaladottabb betegségben szenvedők között magasabb volt a vazoaktív peptidek koncentrációja, rosszabb volt a vesefunkció, az akut fázis fehérjék és a gyulladásos cytokinek szintjei megnövekedtek, alacsonyabb volt a hemoglobin szint és magasabb volt az RDW, mint az enyhébb stádiumú betegeknél. Eredményeink szerint a NYHA III-IV osztályú betegekben magasabb a szolúbilis Hsp70 szintje, alacsonyabb az ADAMTS13 aktivitás és nagyobb a VWF:Ag szint, mint a másik csoportban.

5.1.2. Követéses adatok A követési idő első egy évében 36 beteg halt meg. A zárójelentések, boncolási jegyzőkönyvek és a hozzátartozók beszámolói alapján 24 esetben valószínűsíthető a kardiális halálozás. Hét esetben nem sikerült hozzátartozóval beszélni, az Országos Egészségügyi Pénztár nyílvántartása alapján tudtuk meg a halálozás tényét és időpontját. A halál oka ezekben az esetekben ismeretlen. Öt esetben a kardiális betegségen kívüli egyéb okok vezettek halálhoz (trauma, szepszis, neurológiai okok, daganatos megbetegedés). A követés első egy évében 41 beteg került kórházba úgy, hogy a felvétel oka a szívelégtelenség dekompenzációja volt. Ezen kívül 12 egyéb cardiovascularis esemény történt: 10 esetben akut coronaria szindróma, melyet akut PCI vagy CABG követett, 1-1 betegnél pulmonális embólia vagy stroke. A követési idő alatt történt továbbá 2 femoralis bypass műtét, 2 műbillentyű és 14 biventrikuláris pacemaker beültetés. 16 betegnél fordult elő kombinált végpont, rehospitalizáció, majd halál. Az időfüggő analíziseknél itt az elsőként bekövetkezett eseményt vettük figyelembe. Az egy évnyi követés alatt elhunytak 16,7 százalékánál, 6 egyénnél történt cardiovascularis esemény. A 3. táblázatban láthatóak a követés alatt kialakuló események alapján alkotott betegcsoportok klinikai és laboratóriumi adatai. Kétszer két csoport készült az összhalálozás illetve az 1 éves követés alatt bekövetkező halál vagy a szívelégtelenség progressziója miatti rehospitalizáció (együttesen „esemény”) szerint. A két-két csoport közötti különbségekben lényegi eltérés nincs.

58

3. táblázat: Egyéves követés idő alatt bekövetkező események szerint bontott csoportok klinikai és laboratóriumi adatai. A táblázat első felében a klinikai események (halál, szívelégtelenség progresszió miatti rehospitalizáció) előfordulása, a második részben az összhalálozás szerepelnek. A medián (interkvartilis tartomány), az esetszám és a százalék látható, a p-értéket a folyamatos változóknál Mann-Whitney teszt, a kategorikus változóknál Paerson teszt segítségével határoztuk meg. A adatok az 1. táblázattal azonos mértékegységekben vannak megadva.

Kor Nem NYHA I/IIIII/IV Ödéma BMI Szívf. Sziszt. vp. Diaszt. vp. BK-EF NT-proBNP MR-proADM CT-proET-1 Nátrium Kreatinin GFR Húgysav Koleszterin Bilirubin GOT GPT ALP γGT LDH Ősszfehérje Albumin Prealbumin CRP Hgb RDW Thromboc. TNF-RI TNF-RII TNF-α IL-6 ADAMTS13 ADAMTS 13/VWF VWF:Ag sHsp70

Eseménymentes Eseményes (n=77) (n=117) Median Interkvart.tart. Median Interkvart.tart. vagy n vagy % vagy n vagy % 69,45 (58,71–77,4) 69,30 (61,3–75,97) 87 74,4 58 75,3 34/424/2129/36-30/5 5/27-45/22 35/6 35/17 39 33,3 42 54,5 26,65 (24,4–30,63) 26,81 (24,1–31,9) 78 (67–90) 80 (70–92) 128 (115–140) 120 (110–130) 80 (70–80) 75 (60–80) 36 (30–41) 31 (23–38,5) 0,49 (0,32–1,25) 1,10 (0,57–2,33) 0,88 (0,70–1,15) 1,35 (0,95–1,77) 102 (69,1–133) 143 (91,1–204) 141 (139–143) 138 (135–141) 92 (75–112) 109 (89–166) 71 (55–91) 55 (35–76) 408,5 (348,5–487) 445 (370–588) 4,2 (3,58–5,04) 4,0 (3,2–4,77) 12,3 (8,4–19,36) 14,6 (9,9–22) 24 (18–33) 23 (19–31,5) 23 (17–36) 23 (16–34) 77 (63–100) 88 (69–117) 57,5 (28,5–109) 79 (38–140) 205 (172–231) 211 (192–263) 72 (67–77) 71 (67–76) 41 (39–44) 40 (38–43) 0,23 (0,17–0,27) 0,20 (0,16–0,27) 5,36 (2,9–11,3) 7,77 (3,24–16,2) 143 (132–154) 138 (123,5–152) 14,1 (13,4–15,3) 14,9 (13,9–16,7) 194 (161–231) 196,5 (163,5–231) 5,31 (3,65–7,38) 7,49 (4,39–11,01) 3,82 (2,84–5,05) 4,54 (3,06–6,15) 2,16 (1,37–3,47) 2,89 (1,94–4,88) 8,90 (4,71–15,20) 11,79 (7,97–17,12) 79,18 (61,4–95,23) 70,57 (48,4–94,87) 0,81

Túlélő (n=158)

Halott (n=36)

0,003 0,901 0,472 0,002 0,041 0,001 <0,0001 <0,0001 <0,0001 <0,0001 <0,0001 <0,0001 0,080 0,104 0,133 0,690 0,656 0,044 0,041 0,061 0,393 0,223 0,302 0,077 0,096 0,002 0,899 0,005 0,029 0,020 0,003 0,049

Median vagy n 69,06 118 38/5554/11 56 27,17 78 122 80 35 0,60 0,95 103,0 141 95,5 68,5 415 4,16 12,6 23 23 77 59 205 72 41 0,23 6,2 142 14,3 196 5,41 3,82 2,32 8,94 76,83

<0,001

0,71

(0,46–0,96)

0,46

108,52 0,31

(82,1–138,6) (0,24–0,45)

160,28 0,52

p-érték 0,947 0,880 <0,0001

(0,50–1,00)

0,53

(0,27–0,76)

104,68 (79,3–134,8) 0,31 (0,25–0,43)

138,5 0,40

(94,7–175,7) <0,001 (0,27–0,64) 0,016

59

Interkvart.tart. Median vagy % vagy n

Interkvart.tart. vagy %

p-érték

(58,99–76,6) 74,7

(63,1–79,34) 75,0

0,306 0,969

0/22-44/33

<0,0001

35,4 (24,54–31,1) (68–91) (115–140) (70–80) (29–41) (0,36–1,26) (0,74–1,33) (75,2–145) (138–143) (78–115) (48–85) (349–488) (3,59–5,11) (8,7–19,2) (18–33) (17–36) (63–100) (30–115) (177–233) (67–77) (39–44) (0,18–0,27) (3,1–12,4) (132–154) (13,6–15,3) (165–231) (3,66–7,88) (2,82–5,07) (1,41–3,57) (5,18–14,12) (58,78–94,9)

71,36 27 0/816/12 25 25,38 80 120 70 27 2,01 1,47 167,00 138 112,5 46 497,5 3,95 17,3 25 25,5 96,5 100 214 69,5 39 0,19 7,9 137,5 15,9 192,5 8,92 5,12 3,00 16,77 66,02

69,4 (22,7–28,14) (70–87,5) (100–130) (60–80) (22–35) (0,94–3,67) (0,98–2,5) (108–211,5) (134–140) (79,5–205,5) (28,5–76) (358–672) (2,95–4,27) (10,7–32,0) (20,5–32) (13,5–34) (72,5–145) (40,5–142,5) (201–286,5) (63,5–76) (34,5–43) (0,14–0,26) (2,8–23,3) (120,5–153) (14,5–17,6) (138–230,5) (5,57–13,55) (3,99–7,03) (1,69–4,75) (11,0–27,63) (45,0–96,62)

<0,001 0,022 0,856 0,017 0,008 <0,001 <0,0001 <0,0001 <0,001 0,001 0,014 0,010 0,037 0,011 0,011 0,431 0,657 0,001 0,029 0,013 0,129 0,004 0,012 0,316 0,235 <0,0001 0,707 0,004 0,001 0,120 <0,001 0,176

(0,22–0,61)

0,001

25/35-34/7

(117,6–182) <0,0001 (0,31–0,89) <0,001

Az irodalmi adatok alapján vártnak megfelelő eredményeket kaptunk: az eseményes csoportokba klinikailag súlyosabb betegek kerültek, mind a klinikai tünetek (NYHA stádiumok, bal kamrai ejekciós frakció (BK-EF), perifériás ödéma), mind a laboratóriumi súlyossági markerek (NT-proBNP, MR-proADM, CT-proET-1) alapján. Az eseményes csoportokban szignifikánsan magasabb volt a gyulladásos paraméterek (TNF-α, IL-6, szolúbilis TNF receptorok) szintje, rosszabb volt a vesefunkció (kreatinin, GFR), magasabb volt a VWF, a szolúbilis Hsp70 koncentrációja és az RDW. A csoportok között nem mutatkozott különbség a nem és az életkor tekintetében.

5.2. Vazoaktív peptidek szerepének vizsgálata szívelégtelenségben 5.2.1. MR-proADM, CT-proET-1, NT-proBNP és a szívelégtelenség súlyossága A vizsgált betegpopulációban az NT-proBNP átlaga 1,364 pmol/ml (SD 1,791), az MRproADM-é 1,24 nmol/l (SD 0,8), míg a CT-proET-1 átlaga 123,9 pmol/l (SD 68,5) volt. A súlyosabb stádiumú betegekben szignifikánsan magasabb volt mindhárom vazoaktív fehérje szintje, mint a kevésbé súlyos betegekben (2. táblázat). A koncentrációk a négy NYHA stádiumban a betegség súlyosságával párhuzamosan emelkedtek (12. ábra). A post-hoc tesztek alapján a különböző NYHA stádiumokban mért koncentrációk szignifikánsan különböznek, kivéve az NT-proBNP esetén az I-II illetve a III-IV stádiumok között, az MR-proADM-nél az I és a II között, míg az CT-proET-1 esetében az I-II és a II-III stádiumok között. Amennyiben a betegeket a vazoaktív peptidek szintje alapján külön-külön három csoportra bontjuk, a legmagasabb tercilisbe eső betegek esetében (NT-proBNP>1250 fmol/ml, MR-proADM>1,28nmol/l, CT-proET-1>141pmol/l) több, mint ötszörös annak a kockázata, hogy súlyosabb betegségben szenvednek, mint a legalacsonyabb tercilisbe eső betegek esetében (NT-proBNP<840 fmol/ml, MR-proADM<0,84nmol/l, CT-proET1< 88,8 pmol/l).

60

4,5

9000

NT-proBNP (fmol/ml)

7000

KW-H=41,5635; p<0,00001 Median

25%-75%

4,0

Non-Outlier Range

3,5

MR-proADM (nmol/l)

8000

6000 5000 4000 3000 2000

Median

25%-75%

Non-Outlier Range

3,0 2,5 2,0 1,5

1000

1,0

0

0,5

-1000

KW-H=59,9115; p<0,00001

0,0

1

2

3

4

1

NYHA stádiumok

2

3

4

NYHA stádiumok

350

KW-H=42,7736; p<0,00001 300

CT-proET-1 (pmol/l)

Median

25%-75%

Non-Outlier Range

250 200 150 100 50 0 1

2

3

4

NYHA stádiumok

12. ábra: Az NT-proBNP, az MD-proADM és a CT-proET-1-szintek alakulása a különböző NYHA stádiumokban. A p értékek Kruskal-Wallis ANOVA teszt eredményei.

A relatív rizikó a három peptid közül az MR-proADM estében a legnagyobb, 8,09-szeres (95% CI 3,59-18,2), az NT-proBNP-nél és a CT-proET-1-nél 5,43 (CI 2,5011,80) illetve 5,71 (CI 2,61-12,51). Ezek az összefüggések mindhárom esetben akkor is szignifikánsak maradtak, ha többváltozós modellekben a nemre, az életkorra, a perifériás ödéma jelenlétére, az ischaemiás etiológiára, a BMI-re, a nátrium, a kreatinin és az albumin szintre adjusztáltunk. Az illesztet modellekre vonatkozó relatív rizikó és a 95%-os CI leolvasható az 13. ábráról.

61

3.35 (1.27-8.84)

NT-proBNP 3.44 (1.34-8.33)

CT-proET-1 3.20 (1.10-9.32)

MR-proADM 0.0

1.0

2.5

5.0

7.5

10.0

Relatív rizikó [95% CI]

az alacsony tercilis a magashoz viszonyítva az alacsony tercilis a középsőhöz viszonyítva 13. ábra: Többváltozós, nemre, életkorra, perifériás ödéma jelenlétére, ischaemiás etiológiára, BMI-re, nátrium, kreatinin és albumin szintre illesztett modellek, melyek a magas vazoaktív peptid szintek esetén az előrehaladott szívelégtelenség (NYHA III-IV) fennállásának relatív rizikóját mutatják.

5.2.2. NT-proBNP, CT-proET-1 és MR-proADM biológiai összefüggései szívelégtelenségben A vazoaktív peptidek és a NYHA stádiumok összefüggéseit a különböző klinikai és laboratóriumi változókkal a 4. táblázat tartalmazza. A három vizsgált fehérje erősen korrelált egymással és a NYHA stádiumokkal (p minden esetben <0,0001). Csak az NTproBNP mutatott összefüggést a testtömeg-indexszel (BMI) és a nemmel. Az ödémák jelenlétével az MR-proADM, a bal kamrai ejekciós frakcióval és az echocardiographián meghatározott véna cava inferior átmérővel (IVC) az NT-proBNP mutatta a legszorosabb összefüggést. Mind a négy vizsgált tényező szorosan korrelált a szérum kreatinin szinttel. A MR-proADM igen szoros pozitív korrelációt mutatott a gyulladásos cytokinekkel (TNF-α, sTNF receptorok, IL-6) és a CRP-vel, míg a negatív akut fázis fehérjékkel negatívan korrelált. A CT-proET-1 is erős összefüggést mutatott a gyulladásos markerekkel, az NT-proBNP esetében voltak a leggyengébbek, bár még mindig erősen szignifikánsak, a korrelációs együtthatók.

62

4. táblázat: A NYHA stádiumok és a vazoaktív peptid szitnek Spearman rank korrelációja a betegséget jellemző klinikai és laboratóriumi paraméterekkel (ns – nem szignifikáns). A korrelációs koeficiensek (r) és a p-érték kerültek feltüntetésre.

Kor Nem BMI Perifériás ödéma NT-proBNP MR-proADM CT-proET-1 BK-EF Kreatinin Albumin CRP TNF-alpha TNF-RI TNF-RII IL-6

NYHA r P 0,15 0,037 0,06 Ns -0,06 Ns 0,23 0,001 0,44 <0,0001 0,55 <0,0001 0,41 <0,0001 -0,26 <0,001 0,25 <0,001 -0,29 <0,0001 0,19 0,008 0,22 0,003 0,30 <0,0001 0,32 <0,0001 0,20 0,014

NT-proBNP r p 0,17 0,002 -0,13 0,027 -0,35 <0,0001 0,24 0,001 0,58 0,43 -0,34 0,24 -0,47 0,14 0,16 0,36 0,30 0,30

<0,0001 <0,0001 <0,0001 <0,001 <0,0001 ns 0,025 <0,0001 0,0001 0,0001

MR-proADM r P 0,34 <0,0001 -0,06 Ns -0,06 Ns 0,42 <0,0001 0,58 <0,0001 0,77 -0,18 0,62 -0,45 0,31 0,31 0,59 0,53 0,48

<0,0001 0,011 <0,0001 <0,0001 <0,0001 <0,0001 <0,0001 <0,0001 <0,0001

CT-proET-1 r p 0,26 <0,0001 -0,06 ns -0,09 ns 0,40 <0,0001 0,43 <0,0001 0,77 <0,0001 -0,14 0,40 -0,32 0,27 0,20 0,52 0,34 0,42

ns <0,0001 <0,0001 0,0001 0,005 <0,0001 <0,0001 <0,0001

5.2.3. Az MR-proADM és a CT-proET-1 összefüggése a gyulladásos markerekkel Az erős primer összefüggések alapján hasznosnak tűnt a vazoaktív fehérjék és a gyulladásos paraméterek részletesebb vizsgálata. Ezen analízisekből a gyulladásos társbetegségek miatt 8 beteget kizártunk, így az esetszám 186 lett. A primer összefüggéseket esetlegesen torzító tényezők kiküszöbölésére többváltozós lineáris regressziós modelleket építettünk a logaritmikusan transzformált változókból. Az analízisben illesztettünk a betegség súlyosságát jellemző paraméterekre (bal kamrai ejekciós frakcióra, NT-proBNP), az ion és vízháztartás jellemzőire (nátrium, perifériás ödéma jelenléte), a vesefunkcióra (kreatinin) és olyan alap klinikai változókra, mint az életkor, a nem, a testtömeg-index és a diasztolés vérnyomás. Az eredmények az 5. táblázatban láthatóak.

63

5. táblázat: A gyulladásos markerek és a vazoaktív fehérjék közötti lineáris regressziós modellek, melyek korra, nemre, bal kamrai ejekciós frakcióra, NT-proBNP-re, testtömegindexre, perifériás ödéma jelenlétére, diasztolés vérnyomásra, nátrium és kreatinin szintre illesztettek. A béta és (p-értékek) kerültek feltüntetésre.

Log albumin Log CRP Log TNF-alpha Log TNF-RI Log TNF-RII Log IL-6

Log MR-proADM -0,22 (<0,0001) 0,20 (<0,0001) 0,07 (0,078) 0,21 (<0,0001) 0,13 (0,008) 0,19 (<0,0001)

Log CT-proET-1 -0,05 (0,451) 0,18 (0,004) 0,06 (0,353) 0,24 (0,0007) -0,01 (0,901) 0,14 (0,047)

A MR-proADM az illesztett modellekben is szignifikánsan korrelált az albumin, CRP, szolúbilis TNF-RI, -RII és az IL-6 szintekkel. A CT-proET-1 esetében kevésbé szoros, de markáns összefüggés mutatkozott a modellekben a CRP, a sTNF-RI és az IL-6 koncentrációkkal.

5.2.4. Az MR-proADM és a CT-proET-1 prognosztikai értéke szívelégtelenségben A kiindulási mintákban mért vazoaktív peptid szintek egyéves követés idő alatti eseményekre vonatkozó prediktív értékének meghatározásához elsőként ROC analízist végeztünk. Két vágópontot határoztunk meg az egyéves követési idő alatti halálozás („egyéves túlélés”) és a halálozás vagy rehospitalizáció („egyéves eseménymentes túlélés”) vizsgálatához. A legjobb specificitás (spec.) és szenzitivitás (szenz.) értékek, valamint az őket meghatározó vágópontok a 6. táblázatban láthatóak. A három peptid ROC görbéi a 14. ábrán láthatóak. 6. táblázat: A legjobb szenzitivitás és specificitás értékek valamint a hozzájuk tartozó vágópontok az egyéves túlélés és az egyéves eseménymentes túlélés előrejelzésekor

CT-proET-1(pmol/l) MR-proADM (nmol/l) NT-proBNP (fmol/l)

Egyéves túlélés Vágópont Spec. Szenz. 169 85,4 50 1,18 69,4 72,2 882,8 63,7 77,8

64

Egyéves eseménymentes túlélés vágópont Spec. Szenz. 137 78,6 55,8 1,3 82,9 55,8 656,9 60,7 71,4

Egyéves eseménymentes túlélés 100

80 Szenzitivitás

Szenzitivitás

Egyéves túlélés 100

60 40 20

80 60

CT-proET-1 MR-proADM NT-proBNP

40 20 0

0

0

0

20 40 60 80 100 100-Specificitás

20 40 60 80 100 100-Specificitás

14. ábra : CT-proET-1, MR-proADM és NT-proBNP ROC görbéi az egyéves túlélés illetve az egyéves eseménymentes túlélés prognosztikájára. Eseménynek számít a halálozás vagy a szívelégtelenség progressziója miatti kórházi felvétel.

A 3 vazoaktív peptid ROC görbéi mind a két végpont esetén szinte egymás mellett futnak. Összehasonlításképpen meghatároztuk a görbe alatti területet (7. táblázat). A túlélés szempontjából az NT-proBNP, míg a kombinált végpontnál az MRproADM tűnt a legjobb markernek, azonban a különbségek egyik esetben sem voltak szignifikánsak (p>0,1 mind a 6 összehasonlításnál, nem feltüntetett adat). 7. táblázat: A 6. Ábrán látható ROC görbék adatai. A görbe alatti terület (AUC), a standard error (SE) és a 95%-os konfidencia intervallum (CI) kerültek feltüntetésre.

CT-proET-1 MR-proADM NT-proBNP

Egyéves túlélés AUC SE 95% CI 0,706 0,052 0,636-0,769 0,732 0,051 0,664-0,793 0,767 0,049 0,701-0,825

Egyéves eseménymentes túlélés AUC SE 95% CI 0,686 0,040 0,615-0,750 0,733 0,038 0,664-0,793 0,679 0,040 0,609-0,744

A következő lépésben Cox regressziós analízis segítségével vizsgáltuk az MRproADM és a CT-proET-1 prediktív értékét a halálozás és a rehospitalizáció tekintetében. A többváltozós modellekben a főbb klinikai adatokra, a diasztolés vérnyomásra, a testtömeg-indexre, életkorra, nátrium, hemoglobin szintre és a glomerulus filtrációs rátára illesztettünk, a változókat az interkvartilis tartományra normalizáltuk. A magas MR-proADM esetén a halálozásra számított hazard ratio 1,52 (95% CI 1,235-1,871), míg a kombinált végpont (halálozás vagy rehospitalizáció) esetében 1,497 (CI 1,232-1,819), a p-érték mindkét esetben <0,0001. Ez azt jelenti,

hogy felvételkor az átlagosan magas MR-proADM-szinttel rendelkező betegeknek másfélszer akkora az esélyük arra, hogy az elkövetkező egy évben valamilyen klinikai eseményük lesz (halál vagy rehospitalizáció), mint azoknak a betegeknek, akiknek átlagosan alacsony az MR-proADM-szintjük. Ha a modellekhez a „gold standarként” ismert NT-proBNP-t is hozzáadjuk, a halálozás esetében az MR-proADM határérték szignifikanciát mutat (HR 1,524, CI 1,055-2,199) p=0,025. A halálozás vagy ismételt kórházi felvétel esetében azonban az NT-proBNP mellett is erős, szignifikáns prediktor marad (HR 1,316 (CI 1,046-1,654) p=0,019). A kombinált végpontra vonatkozó részletes adatok a 8. táblázatban láthatóak. 8. táblázat: A magas MR-proADM prediktív értéke többváltozós Cox modellekben (főbb klinikai változókkal (A panel), a főbb klinikai változókkal és az NT-proBNP-vel kiegészítve (B panel)) a mortalitás és a rehospitalizáció tekintetében. A Hazard Ratio (HR) interkvartilis tartományra standardizált, a konfidencia intervallum (CI) 95%-os, a likelihood ratio χ2 és pértékek vannak feltüntetve.

A. MR-proADM GFR BMI Diasztolés vérny, Nátrium Hemoglobin Kor

HR 1,497 1,017 1,239 0,852 0,791 0,889 1,001

CI 1,232-1,819 0,790-1,452 0,948-1,618 0,701-1,036 0,578-1,081 0,671-1,179 0,823-1,217

χ2 16,46 0,197 2,471 2,570 2,164 0,666 0,000

p-érték <0,0001 0,658 0,116 0,109 0,791 0,414 0,994

MR-proADM NT-proBNP GFR BMI Diasztolés vérny, Nátrium Hemoglobin Kor

HR 1,316 1,170 1,053 1,361 0,899 0,766 0,857 0,993

CI 1,046-1,654 1,023-1,339 0,777-1,428 1,028-1,803 0,735-1,100 0,559-1,050 0,645-1,138 0,813-1,213

χ2 5,515 5,219 0,111 4,635 0,301 2,744 1,135 0,005

p-érték 0,019 0,022 0,739 0,031 0,899 0,098 0,287 0,945

B,

A CT-proET-1 önálló vazoaktív fehérjeként szintén szignifikáns prediktív értéket adott, mind a halálozás, mind a kombinált végpont esetében (HR 1,694 (CI 1,226-2,342, p=0,001 illetve 1,431 (CI 1,122-1,825, p=0,004)). Az NT-proBNP modellbe kerülésekor azonban a CT-proET-1-nek nincs szignifikáns additív értéke a kombinált végpontoknál (HR 1,264 (CI 0,958-1,668, p=0,098). A mortalitás

66

előrejelzésekor azonban, ha gyengébben is, de továbbra is szignifikáns marad (HR 1,457 (CI 1,005-2,113), p=0,047) (9. táblázat). 9. táblázat: A magas CT-proET-1 prediktív értéke többváltozós Cox modellekben (főbb klinikai változókkal (A panel), a főbb klinikai változókkal és az NT-proBNP-vel kiegészítve (B panel)) a mortalitás tekintetében. A Hazard Ratio (HR) interkvartilis tartományra standardizált, a konfidencia intervallum (CI) 95%-os, a likelihood ratio χ2 és p-értékek vannak feltüntetve.

A. CT-proET-1 GFR BMI Diasztolés vérny. Nátrium Hemoglobin Kor

HR 1,649 1,127 0,661 0,712 0,672 0,693 1,015

CI 1,226-2,342 0,777-1,633 0,433-1,008 0,543-0,935 0,456-0,991 0,481-0,997 0,779-1,323

χ2 10,191 0,397 3,705 5,996 4,018 3,906 0,012

p-érték 0,001 0,529 0,054 0,014 0,045 0,048 0,912

CT-proET-1 NT-proBNP GFR BMI Diasztolés vérny. Nátrium Hemoglobin Kor

HR 1,457 1,220 1,235 0,778 0,782 0,676 0,670 0,998

CI 1,005-2,113 1,059-1,406 0,871-1,751 0,505-1,199 0,597-1,025 0,460-0,994 0,468-0,959 0,760-1,309

χ2 3,945 7,583 1,401 1,293 3,170 3,968 4,792 0,000

p-érték 0,047 0,006 0,237 0,255 0,075 0,046 0,029 0,987

B.

5.3. sHsp70 szint és a Hsp70 gén polimorfizmusok szívelégtelenségben 5.3.1. A sHsp70 szint és a szívelégtelenség súlyossága Vizsgálatunkban a szívelégtelenségben szenvedő betegekben az átlagos szérum Hsp70 koncentráció 0,549 ng/ml (SD 0,949) volt. Az előrehaladottabb, NYHA III-IV stádiumú betegekben szignifikánsan magasabb a Hsp70 szint, mint a kevésbé előrehaladott állapotú betegekben (NYHA I-II) (2. táblázat). A különböző NYHA stádiumokkal jelzett progresszióval párhuzamosan növekedtek a sHsp70 szintek (15. ábra, A panel), a csoportok szignifikánsan eltértek egymástól (Kruskal-Wallis ANOVA teszt, p=0,0046). A csoportokat külön-külön összehasonlító poszt-hoc analízis eredményei szerint a

67

NYHA I csoporthoz képest a NYHA III és IV-es csoportokban szignifikánsan magasabb a szolúbilis Hsp70 szintje (Dunnet test p<0,05). Egy változós logisztikus regressziós analízisek szerint a legmagasabb sHsp70 kvartilisba tartozó betegeknek (sHsp70>0,521 ng/ml) több, mint kétszer nagyobb az esélyük arra, hogy a súlyosabb NYHA III-IV csoportba tartozzanak (OR 2,26; 95% CI 1,17-4,39, p=0,015). Az összefüggés több változós modellben vizsgálva, a korra, nemre, szérum nátrium, kreatinin, albumin szintre és a testtömeg-indexre történő illesztés után is szignifikáns (OR 2,56; 95% CI 1,21-5,38 ). Érdekes módon a súlyosságot jelző NTproBNP szintre történő illesztés után jelentősen csökkent a rizikó, de még épp a szignifikáns tartományban maradt (OR 2,21; 95% CI 1,01-4,81 p=0,045).

1,2

2,15

KW-H=13,0133; p=0,0046

r=0,232; p=0,0012

2,10

Median

25%-75%

Non-Outlier Range

2,05

log sHsp70 (ng/ml)

sHsp70 (ng/ml)

1,0

0,8

0,6

0,4

2,00 1,95 1,90 1,85 1,80 1,75

0,2

1,70 1,65 -1,2 -1,1

0,0 1

2

3

4

-1,0

NYHA stádiumok

A,

-0,9

-0,8

-0,7

-0,6

-0,5

-0,4

-0,3

-0,2

log NT-proBNP (fmol/ml)

B,

3

r=-0,3153; p=0,00001

log sHsp70 (ng/ml)

2

1

0

-1

-2

-3 5

C,

10

15

20

25

30

35

40

45

50

BK-EF (%)

15. ábra: A szérum Hsp70 szintek a különböző NYHA stádiumokban (A panel). A logaritmikusan transzformál sHsp70 szintek korrelációja a súlyossági ’gold standardnak’ számító NT-proBNP-vel (B panel) és a bal kamrai ejekciós frakcióval (BK-EF) (C panel).

Mivel a NYHA klasszifikáció a tüneteken alapszik, melyek bizonyos esetekben nem kellőképpen objektívek, a sHsp70 és a betegség súlyossága közötti összefüggést az NT-proBNP és a bal kamrai ejekciós frakció segítségével is analizáltuk. A 15. ábra B és

68

C paneljén látható, hogy mind a két súlyossági marker korrelált a sHsp70 szintjével, a p-érték mind a két esetben kisebb volt, mint 0,01.

5.3.2. A Hsp70 gén polimorfizmusa szívelégtelenségben A populációban sem a HspA1B, sem a HspA1L polimorfizmusának allél frekvenciája nem tért el szignifikánsan a Hardy-Weinberg eloszlástól (p=0,84 illetve 0,27). A különböző genotípusok aránya és az allél frekvenciák a 10. táblázatban láthatóak. A HspA1B (1267) G allélt a betegek 33 százaléka hordozta, a HspA1L (2437) C allél a betegek 11,8 százalékában volt megtalálható. 10. táblázat: A HspA1B és a HspA1L genotípusainak eloszlása és az allél frekvenciák a vizsgált szívelégtelen populációban. Az értékek az összpopuláció százalékos arányában vannak megadva. HspA1B AA (0) 43,3% HspA1L TT (0) 77,3% AG (1) 45,4% TC (1) 18,1% GG (2) 9,8% CC (2) 2,6% A 67% T 88,2% G 33% C 11,8%

A betegeket a HspA1B G allél illetve a HspA1L C allél hordozása alapján két-két csoportba osztottuk. A betegcsoportok között nem találtunk lényeges különbséget a sHsp70 szint, a betegség súlyossága, a nem és az életkor tekintetében (11. táblázat). 11. táblázat: A HspA1B G allél és a HspA1L C allél hordozók és nem hordozók klinikai összehasonlítása. Az esetszámot (%) tüntettük fel, a p-érték Mann-Whitney és Pearson χ2 teszt eredményei. HspA1B AA AG, GG p-érték n 84 107 sHsp70 (ng/ml) 0,37 (0,29-0,54) 0,31 (0,24-0,52) 0,058 Férfi nem (%) 64 (76,2%) 78 (72,9%) 0,605 Életkor (év) 72,2 (65,2-76,9) 66,9 (57,1-77,4) 0,039 NYHA (I/II/III/IV) 15/23/35/11 23/38/34/12 0,440 NYHA (%) 17,9/27,4/41,7/13,1 21,5/35,5/31,8/12 HspA1L n sHsp70 (ng/ml) Férfi nem (%) Életkor (év) NYHA (I/II/III/IV) NYHA (%)

TT 150 0,31 (0,24-0,52) 109 (72,7%) 70,0 (59,8-77,3) 28/48/57/17 18,7/32/38/11,3

69

CT, CC 40 0,40 (0,28-0,58) 32 (80%) 67,9 (59,1-77,0) 10/12/12/6 25/30/30/15

p-érték 0,102 0,346 0,668 0,664

A sHsp70 szint és a szívelégtelenség súlyossága között megfigyelt összefüggés miatt a Hsp70 gén polimorfizmusok és a fehérje koncentráció között fennálló kapcsolatot a NYHA stádiumok függvényében faktoriális ANOVA teszt segítségével is megvizsgáltuk. Eredményeink szerint a HspA1B (1267) G allél hordozása esetén az előrehaladott szívelégtelenségben (NYHA IV.) jelentősen magasabb sHsp70 szint figyelhető meg (16. ábra). A Dunnet post-hoc teszt eredménye szerint a HspA1B G allélt nem hordozó (vagy hordozó) NYHA I stádiumba tartozó betegek és a G allélt hordozó NYHA IV stádiumú betegek sHsp70 szintjei között szignifikáns különbség van (p<0,0001). A HspA1L (2437) C vagy T allél hordozása esetén nem figyeltünk meg hasonló összefüggést (nem bemutatott adat). F=4,0821, p=0,00778 3,0

sHsp70 (ng/ml)

2,5

HspA1B AA HspA1B AG, GG

2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 -0,5

1

2

3

4

NYHA stádiumok

16. ábra: A sHsp70 szint alakulása a HspA1B G allél hordozás és a betegség előrehaladottsági stádiumainak függvényében. Az ábrán a faktoriális ANOVA eredményeként az LS (least squares) átlag és a p-érték került feltüntetésre.

5.3.3. A sHsp70 szint és a Hsp70 gén polimorfizmus összefüggése a betegség kimenetével Az eseményes és az eseménymentes, illetve az egyéves követést túlélő és nem túlélő csoportok között szignifikáns különbség mutatkozott a sHsp70 szintjében (3. táblázat) Az eseményes csoportban mindkét végpont esetén magasabb volt a bevételi sHsp70 szint, mint az eseménymentes betegekben. A követési idő alatt eseményes és nem eseményes betegek között nem volt eltérés a HspA1B és a HspA1L polimorfizmusok

70

allélhordozása között (nem bemutatott adat). A sHsp70 szintnek a betegség súlyossága és a HspA1B gén G allél hordozás függvényében mutatott összefüggése miatt ilyen kontextusban is vizsgáltuk a polimorfizmus és a mortalitás kapcsolatát. Eredményeink szerint szignifikánsan magasabb sHsp70 szint mérhető azokban a NYHA IV stádiumú betegekben, akik hordozzák a HspA1B G allélt és az egyéves követési idő alatt meghalnak (17.ábra).

sHSP70 (ng/ml)

F=3,6820, p=0,02712 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 -0,5 -1,0

HspA1B AA HspA1B AG, GG

1

2

3

4

1

2

3

4

NYHA stádiumok

NYHA stádiumok

Egy éves követés után élők

Egy éves követés alatt meghaltak

17. ábra: A sHsp70 szint alakulása a HspA1B G allél hordozás, a bevételi NYHA stádiumok és az egyéves követési idő alatti mortalitás függvényében. Az ábrán a faktoriális ANOVA eredményeként az LS (least squares) átlag, és a p-érték van feltüntetve.

A Cox regressziós analízis során azonban a sHsp70-nek sem a halálozás, sem a halálozás és a rehospitalizáció tekintetében nem volt szignifikáns prediktív értéke (nem bemutatott adat.)

5.3.4. A sHsp70 biológiai összefüggései A sHsp70 szint és a klinikai illetve laboratóriumi paraméterek korrelációját vizsgálva (12. táblázat) szignifikáns pozitív összefüggést találtunk a sHsp70 koncentráció és a máj károsodás markerei (γGT, GOT, GPT, bilirubin) között. Ez a kapcsolat kiváltképp a súlyos stádiumú betegekben volt erős. Az anémia és a vashiány markerei (RDW, hemoglobin szint), illetve a sHsp70 koncentrációja között egyik betegpopulációban sem sikerült összefüggést kimutatni. Érdekes módon, a várttal ellentétben a gyulladásos markerek (CRP, TNF-α, IL-6) sem korreláltak a sHsp70 szintjével, mint ahogy a vesefunkcióra utaló kreatinin szint sem. Szintén nem találtunk összefüggést a sHsp70

71

koncentráció és a szív funkciót jellemző paraméterek (vérnyomás, szívfrekvencia) és a betegség fennállásának ideje között (nem bemutatott adat). 12. táblázat: A sHsp70 összefüggései a klinikai változókkal az egész betegpopulációban, a súlyos és a kevésbé súlyos betegekben. A Spearman rank korrelációs koefficiens és a p-érték került feltüntetésre.

Nátrium Kreatinin GOT GPT γGT LDH Albumin CRP TNF-α IL-6 Hgb RDW

összes beteg (n=194) r p-érték -0,16 (0,022) 0,03 (0,667) 0,25 (<0,001) 0,18 (0,014) 0,039 (<0,0001) 0,24 (<0,001) -0,09 (0,020) 0,14 (0,058) 0,05 (0,494) 0,16 (0,049) 0,07 (0,329) 0,16 (0,571)

NYHA I-II (n=101) r p-érték -0,11 (0,287) -0,12 (0,228) 0,15 (0,136) 0,13 (0,205) 0,27 (0,006) 0,21 (0,033) -0,08 (0,046) 0,05 (0,607) -0,11 (0,275) 0,07 (0,531) 0,179 (0,007) 0,177 (0,074)

NYHA III-IV (n=93) R p-érték -0,10 (0,317) 0,07 (0,473) 0,38 (<0,001) 0,29 (0,006) 0,46 (<0,0001) 0,24 (0,018) -0,06 (0,567) 0,20 (0,059) 0,15 (0,140) 0,18 (0,118) 0,07 (0,527) 0,05 (0,665)

5.4. Az ADAMTS13 és a VWF szerepe szívelégtelenségben Technikai okokból az ADAMTS13 aktivitással és a VWF:Ag szinttel kapcsolatos analízisek egy véletlenszerűen kiválasztott 152 fős alcsoport mérési eredményeiből készültek.

5.4.1. ADAMTS13 aktivitás és VWF:Ag szint a szívelégtelenség súlyosságának függvényében Eredményeink szerint az ADAMTS13 aktivitás átlaga a vizsgált szívelégtelenekben 76,69% (SD 27,64%). Az érték az egészséges véradókban mért átlagos aktivitás százalékában van megadva, így jól látható, hogy a szívelégtelenek többségében csökkent az ADAMTS13 aktivitása. A VWF:Ag szint a szívelégtelenekben 126,12% (SD 62,83%) volt. A koncentráció meghatározásából adódóan, a 100%-nál nagyobb érték arra utal, hogy a betegekben magasabb a fehérje szintje, mint az egészséges véradókban. Az előrehaladott (NYHA III-IV stádium) állapotú betegekben szignifikánsan alacsonyabb volt az ADAMTS13 aktivitás és magasabb a VWF:Ag szint mint a kevésbé súlyos betegekben (NYHA I-II) (2. táblázat). A 18. ábra első paneljén látható, hogy az

72

alacsony ADAMTS13 aktivitás és a magas VWF:Ag szint a szívelégtelenség súlyosbodásával párhuzamosan szignifikánsan fokozódott (Kruskal-Wallis ANOVA, p=0.009 az ADAMTS13 és p=0.0003 a VWF esetében). Ennek megfelelően az ADAMTS13/VWF hányados is csökkent a NYHA stádiumok előreheladtával. Míg NYHA I-ben a medián 0,8, a IV. stádiumban 0,28 volt. Az összefüggést megerősítendő az 18. ábra B és C paneljén az ADAMTS13 aktivitás illetve a VWF:Ag koncentráció és az objektív módon mérhető, legelterjedtebb súlyossági marker, az NT-proBNP szint közötti szoros korrelációt ábrázoltuk (p mindkét esetben <0,0001).

C

A

2.8

B

1.00

200

200

150 125 0.50 100 75

Hányados

Aktivitás (%)

0.75

0.25

50 25 0

0.00 1

2

3

2.4

log vWF:Ag

ADAMTS13 aktivitásty (%)

2.6

175

100

1.8

1.4

1

NYHA súlyossági osztályok

2.0

1.6

0

4

2.2

2

3

4

5

log NT-proBNP (fmol/ml)

1

2

3

4

5

log NT-proBNP (fmol/ml)

18. ábra: A panel: Az ADAMTS13 aktivitás (■), a VWF:Ag (▲) szint és az ADAMTS13/VWF hányados (vonal) alakulása a NYHA funkcionális stádiumok függvényében. A Kruskal-Wallis ANOVA eredményei: ADAMTS13 F=3.98, p=0.009; VWF:Ag F=6.59, p=0.0003. B és C panel: Az ADAMTS13 aktivitás és a VWF:Ag szint korrelációja az NTproBNP koncentrációkkal. Spearman rank korreláció: ADAMTS13 r=-0.46, p<0.0001, VWF r=0.31, p<0.001.

5.4.2. Az ADAMTS13 és a VWF hányados prediktív értéke szívelégtelenségben A kiindulási VWF:Ag szint és az ADAMTS13/VWF hányados szignifkánsan magasabb illetve

alacsonyabb

volt

az

eseményes

(halál

vagy kombinált

halál

vagy

rehospitalizáció) csoportokban, mint az eseménymentes túlélők között. Az ADAMTS13 aktivitás az eseményes csoportban kisebb volt, de a különbség nem volt jelentős a csoportok között, habár a kombinált végpontnál gyenge, de szignifikáns eltérést találtunk (3. táblázat).

73

Egyváltozós modellekben az alacsony ADAMTS13 aktivitás, a magas VWF:Ag szint és a kettő hányadosa szignifikáns prediktorai voltak a rehospitalizációnak és a mortalitásnak (nem bemutatott adat). A többváltozós Cox regressziós modellekben a lényeges klinikai változókra (kor, testtömeg-index, szérum nátrium szint, diasztolés vérnyomás, szívfrekvencia, hemoglobin szint és glomeruláris filtrációs ráta) illesztett modellekben a standardizált hazard ratio VWF:Ag esetén 1,378 (95% CI 1,091-1,740) (nem bemutatott adat), ADAMTS13/VWF hányados esetében 0,515 (95% CI 0,3460,767) volt (13. táblázat). 13. táblázat: Az alacsony ADAMTS13/VWF hányados prediktív értéke többváltozós Cox modellekben a mortalitás és a rehospitalizáció tekintetében. A Hazard Ratio (HR) interkvartilis tartományra standardizált, a konfidencia intervallum (CI) 95%-os, a likelihood ratio χ2 és pértéke került feltüntetésre.

ADAMTS13/VWF GFR Szívfrekvencia BMI Diasztolés vérny, Nátrium Hemoglobin Kor

HR 0,515 1,227 0,966 0,932 0,760 0,809 0,822 1,121

CI 0,346-0,767 0,892-1,687 0,753-1,240 0,740-1,174 0,589-0,981 0,616-1,061 0,662-1,021 0,864-1,454

χ2 12,487 1,439 0,073 0,363 4,500 2,237 3,026 0,732

p-érték <0,0001 0,230 0,787 0,547 0,034 0,135 0,082 0,390

Az ADAMTS13/VWF esetében a χ2 közel kétszer akkora, mint önállóan a VWF-é (12,487 vs. 6,706), ami arra utal, hogy a hányados prediktív értékéhez a VWF-n kívül az ADAMTS13 is jelentősen hozzájárul. Az ADAMTS13 aktivitás prediktív értéke a többváltozós illesztett modellekben nem volt szignifikáns (nem feltüntetett adat), ami arra utal, hogy a súlyossággal való primer összefüggése nem független a vizsgált lényeges klinikai változóktól, de ez kovariáns hatás eredménye is lehet. A követési idő alatt a 152 beteg közül 12-nél regisztráltunk thromboemboliás vagy cardiovascularis szövődményt: 9 alkalommal akut coronaria szindróma alakult ki (7 esetben percutan coronaria intervenció, 1 esetben sürgős bypass műtét, 1 esetben pedig konzervatív kezelés történt). Egy betegnél stent reocclusio történt, 1 paciens kapott tüdőemboliát, kettőnél volt szükség műbillentyű beültetésre és 1 esetben femoropopliteális bypass műtétet végeztek. A fent felsorolt 12 eseményes és a 138 thromboemboliás szövődmény nélküli beteg alkotta betegcsoportok ADAMTS13 aktivitását, VWF szintjét és a kettő hányadosát a 14. táblázat tartalmazza. A

74

szövődményes csoport tagjainál a vizsgálatba vételkor szignifikánsan alacsonyabb volt az ADAMTS13 szintje, míg a VWF tekintetében nem volt különbség a szövődményes csoporthoz képest. Az alacsony esetszám sajnos nem tette lehetővé a további (adjusztált) analízisek kivitelezését. 14. táblázat: A követési idő alatt kialakult thromboemboliás és cardiovascularis szövődmények alapján két csoportra osztott betegek jellemzése. A mediánt (interkvartilis tartományt) tüntettük fel, a két csoportot Mann-Whitney teszttel hasonlítottuk össze.

(n) ADAMTS13 akt. VWF:Ag ADAMTS13/VWF

Thromboemboliás/vascularis szövődmény nélküli követés (n=138) 76,8 (59,1-96,2) 113,8 (84,6-150,8) 0,68 (0,46-0,93)

Thromboemboliás/vascularis szövődmény a követés alatt p-érték (n=12) 52,4 (40,3-80,9) 0,012 126,8 (93,9-152,6) 0,439 0,43 (0,30-0,63) 0,044

5.4.3. Az ADAMTS13 aktivitás és a VWF:Ag biológiai összefüggései A 15. táblázatban láthatóak az ADAMTS13 aktivitásnak, a VWF antigénnek és a kettő hányadosának klinikai változókkal mutatott összefüggései. Mind a három változó szignifikánsan korrelált a betegség súlyosságát jellemző paraméterekkel (NYHA stádiumok, NT-proBNP, a perifériás ödéma jelenléte). Szintén szignifikáns összefüggést találtunk az ADAMTS13 aktivitás és a máj szintetikus kapacitását jelző változók (albumin, összfehérje), valamint az endothel diszfunkció markerei (CT-proET-1) között. A várttal ellentétben azonban az ADAMTS13 aktivitás nem mutatott összefüggést a gyulladásos markerekkel és a májenzimekkel. A VWF:Ag szorosan korrelált a vese funkciós paraméterekkel és a gyulladásos markerekkel. A két vizsgált változó hányadosa ugyanazoknak az útvonalaknak a markereivel korrelált, mint az ADAMTS13. A fent említett szoros összefüggések akkor is szignifikánsak maradtak, ha a szignifikancia határát jelentő p értéket a Bonferroni szabálynak megfelelően csökkentettük (0,05/45=0,0011).

75

15. táblázat: ADAMTS13 aktivitás, VWF:Ag, hányadosuk és a jelentősebb klinikai változók közötti Spearman rank korreláció

Kor NYHA NT-proBNP CT-proET-1 BMI Nátrium Kreatinin Bilirubin Albumin HGB Thrombocyta CRP Összfehérje ADAMTS13 VWF

ADAMTS13 r p-érték -0,27 0,0009 -0,23 0,005 -0,44 <0,0001 -0,29 <0,001 0,25 0,002 0,003 0,97 -0,18 0,023 -0,20 0,013 0,25 0,003 0,14 0,09 0,06 0,30 -0,14 0,09 0,28 <0,001 -0,17

VWF:Ag r p-érték 0,24 0,004 0,37 <0,0001 0,31 <0,001 0,26 <0,001 0,08 0,36 -0,20 0,015 0,41 <0,0001 0,08 0,35 -0,37 <0,0001 -0,03 0,72 -0,05 0,55 0,30 <0,001 -0,12 0,13 -0,17 0,042

0,042

ADAMTS13/ VWF r p-érték -0,32 <0,0001 -0,35 <0,0001 -0,48 <0,0001 -0,36 <0,0001 0,07 0,40 0,10 0,22 -0,39 <0,0001 -0,18 0,023 0,40 <0,0001 0,09 0,25 0,09 0,29 -0,28 <0,001 0,27 <0,001 0,71 <0,0001 -0,77 <0,0001

Az ADAMTS13 aktivitás, a VWF szint és kettőjük hányadosa nem különbözött szignifikánsan a thrombocyta aggregációgátlót vagy kumarin származékot szedő és az ilyen készítményet nem szedő betegek esetében (nem bemutatott adat).

76

6. Megbeszélés A szívelégtelenség az egyik legjelentősebb közegészségügyi probléma a fejlett társadalmakban. Intenzív kutatások ellenére az új terápiás próbálkozások sorra kudarcot vallanak, a betegség mortalitása továbbra is magas. A betegséget jellemző ördögi körök közül ígéretes beavatkozási pont lehet a gyulladás gátlása, az antithromoboticus terápia és a vazoaktív fehérjék szintjének módosítása. Fokozott az érdeklődés a prognosztikai markerek és markerkombinációk iránt is, melyek a betegség lefolyásának megbecslésén kívül segítséget nyújthatnak a patomechanizmus megértésében, valamint a klinikai gyakorlatban a differenciáldiagnózisban, a kórházi

felvétel

szükségességének

megítélésében és a terápia irányításában. A fenti törekvések megvalósításához elengedhetetlen az említett útvonalak és biomarkerek in vivo tanulmányozása, a pontos prognosztikai értékük és biológiai kapcsolataik ismerete. Ezt elősegítendő prospektív, követéses klinikai vizsgálatot végeztünk egy igen részletesen jellemzett krónikus szívelégtelenségben szenvedő betegcsoport bevonásával. A tanulmány során a gyulladásos markerekre, a vazoaktív peptidekre, a stresszválaszra és az endothel diszfunkcióra fektettük a hangsúlyt. A betegekről gyűjtött adatok részletgazdagsága lehetővé tette a vizsgált markerekkel összefüggő klinikai és laboratóriumi paraméterek azonosítását, a biológiai kapcsolatok és az érdeklődés középpontjában álló útvonalak közötti kapcsolódási pontok tanulmányozását. A prognosztikai érték vizsgálatánál a mortalitáson kívül olyan „puha” végpontokat is figyelembe vettünk, mint a betegség progressziója miatti rehospitalizáció, vagy a thromboemboliás szövődmények kialakulása. A vizsgált biomarkerek ígéretes prognosztikai faktorok, melyek önállóan vagy markerkombinációk tagjaiként jelentős szerepet tölthetnek be a szívelégtelen betegek gondozásában.

6.1. Vazoaktív peptidek 6.1.1. A vazoaktív peptidek és a szívelégtelenség súlyossága Az ADM és az ET-1 biológiai hatásai, termelésüknek szabályozása felveti annak a lehetőségét, hogy a két fehérje hasznos biomarker lehet a szívelégtelenség diagnosztikájában és a betegkövetésben. Ezt alátámasztja, hogy szintjük a betegség

77

progressziójával párhuzamosan emelkedik és szorosan korrelál a betegség egyéb súlyossági markereivel. Új metodikai fejlesztések lehetővé tették az ADM és az ET-1szint megbízható mérését [141, 175], így utat nyitottak a további vizsgálatoknak. A korábbi eredményekkel összhangban igazoltuk, hogy a két vazoaktív peptid a magyar betegpopulációban is összefügg a betegség súlyosságát klinikai szinten jelző NYHA stádiumokkal. Továbbá, eredményeink szerint az MR-proADM és a CT-proET-1 szoros korrelációt mutat a „gold standard”-ként elfogadott súlyossági markerrel, az NTproBNP-vel, és a bal kamrai ejekciós frakcióval. Bemutattuk továbbá, hogy a magas MR-proADM és CT-proET-1-szint akkor is kapcsolatot mutat a súlyosabb stádiumokkal, ha a statisztikai elemzés során a betegséget jellemző egyéb klinikai és laboratóriumi paraméterekre, a nemre, korra, testtömeg-indexre, és az ion-, vese- és májfunkcióra, illesztett többváltozós analízist végeztünk.

6.1.2. A vazoaktív peptidek biológiai összefüggései Az MR-proADM és a CT-proET-1 szoros korrelációja az NT-proBNP-vel, a NYHA stádiumokkal és a szívelégtelenség tüneteivel arra utalnak, hogy hasznos biomarkerek lehetnek. A biomarkerek funkciójának és esetleges korlátaik megértéséhez feltétlenül szükséges annak ismerte, hogy in vivo milyen biológiai korrelációkkal rendelkeznek. Így lehetségessé válik a betegek között olyan alcsoportok meghatározása, melyekben kevésbé hasznosak, vagy akár megbízhatóbbak a biomarkerek. Ismert, hogy az NT-proBNP szint egészséges egyénekben többváltozós modellekben is korrelál a testtömeg-indexszel, a nemmel és az életkorral [341]. Később felismerték,

hogy

az

NT-proBNP

szintje

relatíve

alacsonyabb

a

túlsúlyos

szívelégtelenekben, mint a normális testsúlyúakban, ezért bizonyos BMI felett más vágópontot javasolnak a szívelégtelenség diagnózisához [342, 343]. A csökkent szint egyik oka lehet, hogy a BNP lebomlásáért felelős neutrális endopeptidáz a zsírszövetben expresszálódik, azonban az NT-proBNP esetében ez nem ad kellő magyarázatot. Valószínűleg a csökkent szintézis is szerepet játszik az alacsonyabb koncentrációban [342]. Az utóbbi időben felmerült, hogy az ADM egy a zsírszövetben is termelődő bioaktív vegyület („adipokin”), ezáltal a BMI független prediktora az MR-proADMszintnek [344] és obezitás esetén koncentrációja emelkedik [163]. Az ET-1-ről pedig kimutatták, hogy fogyás esetén a BMI-vel párhuzamosan csökken a koncentrációja

78

[345]. Az életkor és a vazoaktív peptidek közötti korreláció szintén ismert [120, 346, 347]. Saját vizsgálatunk eredményei szerint az NT-proBNP szint korrelál az életkorral, a testtömeg-indexszel és nemmel. Ezzel ellentétben, az MR-proADM és a CT-proET-1 nem mutatott korrelációt sem a BMI-vel, sem a nemmel. A vazoaktív peptidek a diuretikus és natriuretikus hatásuk miatt szerepet játszhatnak a renális homeosztázisban. Vizsgálatunk során szoros korrelációt találtunk a vazoaktív peptidek és a vesefunkciót jellemző kreatinin szint között. Ismert, hogy krónikus veseelégtelenségben a GFR-rel párhuzamosan az NT-proBNP szintje is megemelkedik. Irodalmi adatok szerint az NT-proBNP 15-20%-a a vesén át ürül, krónikus veseelégtelenségben ezáltal a BNP szintje nő [348, 349]. Az MR-proADM és a kreatinin összefüggéséről kevesebbet tudunk, ismert azonban, hogy az MR-proADM a vesékben is termelődik, és krónikus veseelégtelenségben a GFR csökkenésével szinkronban emelkedik a koncentrációja [350]. A CT-proET-1 és a vesefunkció kapcsolatáról nem rendelkezünk adatokkal, az azonban ismert, hogy a magas keratinin szint magas big-ET-1-szinttel párosul szívelégtelenekben, melynek egyik lehetséges oka, hogy a big-ET-1 részben a vesén keresztül ürül [351]. Fontos megjegyezni, hogy a veseelégtelenség a volumenterhelés révén a vazoaktív fehérjék termelését is fokozza. A gyulladásos markerek és a vazoaktív fehérjék igen szoros primer, pozitív korrelációt mutattak, a köztük lévő összefüggéseket részletesen, a betegség súlyosságától statisztikai módszerekkel függetlenítve vizsgáltuk.

6.1.3. Az MR-proADM, a CT-proET-1 és a gyulladás kapcsolata Az ADM szerteágazó hatásai kiterjednek az immunrendszerben betöltött fontos szerepére is. Az ADM–kötő fehérje a komplement regulációban részt vevő H faktor, az ADM és prohormonjai antimikrobiális hatássál rendelkeznek és szabályozzák a cytokinek termelését és viszont: a cytokinek hatással vannak az ADM-szintjére [165]. Eredményeink szerint az ADM priméren és többváltozós illesztett modellekben is szoros

pozitív

korrelációt

mutatott

a pro-inflammatorikus

IL-6-tal.

Hasonló

összefüggéseket találtak más betegcsoportokban, például perifériás érbetegségben [198], az érelmeszesedés fokozott kockázatának kitett betegekben [352], májcirrózisban szenvedőkben [353] és nagyobb sebészeti beavatkozáson átesett betegekben [354]. A TNF-α és az ADM közötti összefüggés eltűnt a szérum kreatinin szintre történő illesztés

79

után, ami arra utal, hogy a két változó között csak indirekt kapcsolat áll fent. Legjobb tudásunk szerint a leírt szoros negatív összefüggés az albumin és a szignifikáns pozitív összefüggés a CRP és a szolúbilis TNF receptorok és az MR-proADM között újdonságnak számít a cardiovascularis betegségben. Az összefüggések arra utalnak, hogy az ADM direkt módon kapcsolatban áll az akut fázis reakcióval. Ezt számos in vitro és állatmodell kísérlet is alátámasztja [165]. Az ADM fokozza az IL-6 termelést egér fibroblast sejtvonalon és up-regulálja az LPS indukálta TNF-α és IL-6 termelést macrophagokban, de csökkenti a TNF-α szekréciót Swiss 3T3 sejtekben. Úgy tűnik, hogy az ADM sejttípustól és kórállapottól függően fokozza vagy mérsékli a gyulladást [355]. Ezzel párhuzamosan a gyulladásos cytokinek is hatással lehetnek az ADM kiválasztására. Valószínű, hogy a TNF-α fokozza az ADM termelését patkány ér simaizomsejteken és nem myocyta szívsejteken, miközben az IL-6 fokozza az ADM expresszióját gyomor epithelsejteken. Keveset lehet tudni a szolubilis TNF receptorok szabályozásáról és az in vivo funkciójukról a vazoregulációs folyamatokban. Egyre több adat támasztja alá, hogy az ET-1 proinflammatorikus hatással is rendelkezik és számos gyulladásos betegség patomechanizmusában részt vesz, például az érelmeszesedés, a gyulladásos légúti betegségek, az ischaemia és reperfúzió okozta cystitis és a vírusos myocarditis kialakulásában [356] is szerepe lehet. Eredményeink is alátámasztják az ET-1 és a gyulladásos folyamatok közötti direkt kapcsolatot. A többszörösen összetett modellekben az ET-1-szint a szívelégtelenség súlyosságától függetlenül korrelált az IL-6, a szolúbilis TNF receptorok és a CRP szintjével. Hasonló összefüggéseket már leírtak az ET-1 és a CRP között szeptikus betegekben [357], és mérsékelt korrelációt találtak a TNF-α és a big-ET-1 között szívelégtelenségben [358]. A szívben az ET-1 fokozhatja a myocardialis gyulladást azáltal, hogy fokozza a leukocyták beáramlását, stimulálja az adhéziós molekulák termelését és növeli a cytokinek (IL-6, TNF-α, IL-1) kiválasztását. A szív fibrotikus átalakulását is kiválthatja azáltal, hogy aktiválja a fibrosist kiváltó cytokin, a TGF-β termelését, amely a kollagén termelés stimulálása és a fibroblast proliferáció fokozása miatt fontos szerepet játszik az extracelluláris mátrix átépülésében [359]. Ezen kívül az ET-1 a cardiomyocytákra kifejtett trophicus hatása révén közvetlenül is felelős a remodellingért [356]. Egy ET-1 termelő transzgenikus egér modellben azt találták, hogy a szív specifikus ET-1 fokozott termelése elegendő stimulus a szív hypertrophia, kamradilatáció, a szív diszfunkció

80

kialakulásához és ezáltal a szívelégtelenség és a halál bekövetkeztéhez [360]. A szolúbilis TNF receptorokkal mutatott különösen erős összefüggés magyarázata nem ismert, az ET-1 és a TNF receptorok leválása közötti kapcsolatot még nem vizsgálták. Elképzelhető, hogy az ET-1 a szíven belül lokálisan autokrin vagy parakrin módon hat, ezáltal létezhet emelkedett myocardialis ET-1-szint a szérum ET-1 koncentráció növekedése nélkül is [360]. Vizsgálatunk során korrelációt találtunk az NT-proBNP és a szolúbilis TNF receptorok, az IL-6 és az albumin koncentráció között. Eredményeink összhangban állnak számos független munkacsoport adataival [110, 361, 362].

A szív direkt cytokin termelése

RAAS / adrenerg R. GI-R átjutó baktériumok Gyulladás/ cytokine k

Kontraktilis diszfunkció

szív e légte le nség prorgre sszió

Apoptózis

Myocardiális hipertrófia

Kölcsönös reguláció

Hipoxia / ischaemia RAAS / adrenerg R.

Mechanikus áramlási stressz

ADM ET-1

ET-1 -vazokonstruktív -szívben remodelling fokozó (fibrózis/hipertrófia) -antidiuretikus/ antinatriuretikus

ADM: - vazodilatatív

-antihipertenzív -diuretikus/ natriuretikus -növeli a kardiális output-ot -antiapoptotikus

19. ábra: A szívelégtelenség progressziójával emelkedik a cytokinek koncentrációja, fokozódik a szisztémás gyulladás és ezzel párhuzamosan nő a vazoaktív peptidek termelése. Mindkét folyamat visszahat az alapbetegségre, tovább fokozza a progressziót. Feltételezhető ezen kívül, hogy a gyulladásos folyamatok és a vazoaktív peptidek közvetlenül is befolyásolják egymást.

81

A gyulladásos markerek és a vazoaktív fehérjék közötti kapcsolatot számos nem kizárólagos mechanizmus magyarázhatja. Elképzelhető egy indirekt összefüggés, hiszen mindkét folyamat ismert módon aktiválódik a betegség progressziója során. Fontos azonban megjegyezni, hogy a gyulladás és az ADM illetve ET-1 közötti kapcsolat a betegség

súlyosságát

jelző

vizsgált

klinikai

paraméterektől

független,

tehát

valószínűsíthető egy direkt, molekuláris interakción alapuló összefüggés. A klinikai vizsgálatunk eredményeit alátámasztják korábbi tanulmányok, melyek leírják, hogy a cytokinek fokozzák a vazoaktív peptidek termelést [165, 356] és a magas vazoaktív peptid szint is szabályozhatja a cytokin produkciót [165, 360] (19.ábra). Hipotézisünk bizonyítására további in vitro és állatmodelles kísérletek szükségesek. Amennyiben a kölcsönös direkt reguláció valóban fennáll a vazoaktív peptidek és a gyulladásos folyamatok között, akkor ez egy lényeges útvonal lehet a szívelégtelenség progressziójában, és esetlegesen új terápiás célpontként is szolgálhat a későbbiekben.

6.1.4. Az MR-proADM és a CT-proET-1 prognosztikus értéke szívelégtelenségben Eredményeink szerint az MR-proADM és a CT-proET-1 is jelentős prognosztikai értékkel bír szívelégtelenségben. A két vazoaktív peptid magas szintje körülbelül másfélszeres kockázatot jelent az egy év alatt bekövetkező halálozásra vagy a betegség progressziója miatti kórházi felvételre az alacsony koncentrációval rendelkező betegekhez képest. A legideálisabb vágópontok alkalmazása mellett számított szenzitivitás és specificitás értékek mind a CT-proET-1 és az MR-proADM esetében - a halálozás illetve a halálozást és a rehospitalizációt magába foglaló kombinált végpont tekintetében is - megegyeztek a „gold standardnak” tekintett NT-proBNP specificitás és szenzitivitás értékeivel. A ROC-görbe alatti területek alapján az MR-proADM a kombinált végpont, míg az NT-proBNP a halálozás előrejelzésében volt jobb, azonban a különbségek nem voltak szignifikánsak. A Cox regressziós analízisek szerint az MR-proADM és a CT-proET-1 is független előrejelzője a halálozásnak, vagy a rehospitalizációnak. A statisztikai modellek szerint az MR-proADM a kombinált végpont előrejelzésekor az NT-proBNPtől függetlenül additív módon is rendelkezik szignifikáns prediktív értékkel. A halálozás

82

előrejelzésekor azonban az MR-proADM prediktív értéke az NT-proBNP mellett elveszíti független prediktív erejét. A CT-proET-1 esetében fordított a helyzet. Az ET-1 a halálozás előrejelzésében az NT-proBNP-től független prediktor, a magas CT-proET1-szinttel járó rizikó (hazard ratio) magasabb, mint a magas NT-proBNP-jé. Korábbi vizsgálatok is ismertek a fentiekre vonatkozóan, melyek szerint az ADM és az ET-1 is jelentős prediktív értékkel rendelkezik szívelégtelenségben. Egyes eredmények arra utalnak, hogy az ET-1 a BNP-től függetlenül is előrejelez [363], míg mások cáfolták ezt [364]. A különböző eredmények hátterében az ET-1 meghatározás metodikai problémái is állhattak. Legjobb tudásunk szerint a CT-proET-1 és az MRproADM szívelégtelenségben megfigyelhető prognosztikai jelentőségét eddig rajtunk kívül, egy munkacsoport vizsgálta [158]. Eredményeik szerint a magas MR-proADM és a magas NT-proBNP közül normalizálástól függően hol az egyik, hol a másik marker jelent nagyobb rizikót a mortalitásra. Együttes alkalmazásukkor az MR-proADM hatása dominál. Érdekes módon a magas CT-proET-1 a Cox regressziós analízisben, a szerzők interpretálása

szerint

negatív

prediktív

értékkel

rendelkezik.

Az

eredmény

reprodukálhatóságát kétségessé teszi, hogy a primer korreláció a mortalitás és a CTproET-1-szint között pozitív, illetve a Kaplan-Meier analízis is arra utal, hogy a magas CT-proET-1 koncentráció kedvezőtlenebb túlélési eséllyel párosul [158]. Az ellentmondások feloldására mindenképpen szükségesek a további vizsgálatok. A munkacsoport

a

rehospitalizációt

nem

vizsgálta,

így

eredményeink

primer

megfigyelésnek tekinthetők ezen a területen.

6.2. Hsp70 és genetikai polimorfizmusai A szívelégtelenségben kialakuló szövet- és sejtkárosodás a szervezet részéről egy komplex stresszválasz kialakulásához vezet. Ebből kiindulva azt feltételeztük, hogy a stresszválasz egyik jól ismert marekere, a szolúbilis Hsp70 (sHsp70), potenciálisan jó prognosztikai

markere

összefüggésekből

lehet

a

betegségnek.

következtethetünk

az

A

eredetileg

vizsgálatunkban intracelluláris

megfigyelt

stresszfehérje

extracelluláris térbe kerülésének útvonalaira. Tanulmányoztuk a Hsp70 genetikai polimorfizmusának a betegség súlyosságával és az extracelluláris Hsp70 szinttel mutatott összefüggését is.

83

6.2.1. sHsp70 szintje szívelégtelenségben Az irodalomban eddig két tanulmány jelent meg, amely a sHsp70 szintet írja le krónikus szívelégtelenségben. Eredményeink tökéletes összhangban állnak Genth-Zotz [279] illetve Giannessi [365] és munkatársaiknak eredményeivel, mely szerint a sHsp70 koncentrációja az etiológiától függetlenül összefügg a betegség súlyosságával, valamint a sHsp70 és a TNF-

szintek nem korrelálnak. Eredményeink szerint a sHsp70 szint

szignifikáns összefüggést mutat a betegség súlyossági markerének számító NTproBNP-vel és a szív pumpafunkcióját jellemző bal kamrai ejekciós frakcióval, amely direkt összefüggésre utal a stresszfehérje szint és a szív funkciója között. A logisztikus regressziós modellben a súlyosság és a sHsp70 szint közötti összefüggés a vese- és májfunkció, a gyulladás és az ionháztartás markereitől, a nemtől, a kortól, a test tömeg indextől függetlenül fennállt. A legmagasabb kvartilisbe tartozó sHsp70 szinttel (>0,521 ng/ml) bíró betegeknek több, mint két és félszeres eséllyel volt előrehaladott a betegsége (NYHA III-IV), mint az alacsony sHsp70 szintű betegeknek.

6.2.2. A sHsp70 szint emelkedés lehetséges okai A szérumban kimutatható Hsp70 forrása nem ismert, sem patológiás állapotokban, sem az egészséges egyéneknél. A lehetséges eredet meghatározására a sHsp70 és a laboratóriumi változók összefüggését vizsgáltuk krónikus szívelégtelenségben, amelyet a folyamatosan fennálló hipoxia és hipoperfúzió miatt a krónikus, többszervi diszfunkció modell betegségének tekintettünk. Eredményeink szerint a sHsp70 koncentráció szoros pozitív összefüggést mutatott a GOT, GPT, GT, szérum bilirubin szinttel, amely arra utalhat, hogy a sHsp70 forrása a máj. Májsejt sérülés markerein kívül az LDH-val is szoros korreláció mutatkozott, amely felveti a sejtsérülés és az sHsp70 közötti kapcsolat lehetőségét. Ezzel ellentétben a gyulladásos cytokinek és az akut fázis fehérjék nem korreláltak a sHsp70 szintjével. A sHsp70 szint valamint a kreatinin és GFR közötti összefüggés hiánya arra utal, hogy a sHsp70 szint nem a vesefunkció romlása és a csökkent clerance miatt emelkedett a súlyosan szívelégtelen betegek között. A megemelkedett sHsp70 szint és a májkárosodás közötti összefüggést kutatócsoportunk más kórképekben, preeclapsiában [278] és HELLP szindrómában [278] is igazolta. Tőlünk függetlenül Febbraio és munkacsoportja [271] is bizonyította, hogy a sHsp70 szorosan korrelál a szöveti sérüléssel intenzív fizikai aktivitás után.

84

Mindemellett egyik betegpopulációban sem találtak összefüggést a stressz fehérje és a gyulladásos markerek szintje között. A sHsp70 keringésbe kerülésének mechanizmusától függetlenül a sHsp70-nek lehetnek pro-inflammatorikus hatásai, azáltal, hogy a monocytákat aktiválva fokozzák a gyulladás keltő cytokinek (IL-1 , IL-6, TNF- ) termelését [366] és aktiválják a komplement rendszert [268]. Lehetséges az is, hogy a sHsp70 védő funkciót tölt be. Állatmodlellekben a Hsp70 fokozott expressziója védelmet nyújt a szív ischaemia károsító hatása ellen [367] és a mechanikus stressz okozta sérülést is mérsékli azáltal, hogy gátolja a cardiomyocyták Fas-mediálta apoptózisát. [368]. Elképzelhető, hogy vizsgálatunkban kovariáns hatás fedte el a gyulladás és a sHsp70 közötti korrelációt. Eredményeink azonban inkább arra utalnak, hogy szívelégtelenségben a sHsp70 nem tölt be lényeges szerepet a szisztémás gyulladást jellemző

cytokinek

koncentráció

növekedésében.

Megfigyeléseink

szerint

a

preeclampsiás és HELLP-es betegcsoportokhoz hasonlóan a szívelégtelenségben is a sHsp70 sokkal inkább a sejtszétesés és a szöveti sérülés markere.

6.2.3. A HspA1B és HspA1L polimorfizmusa Egyre több a bizonyíték, hogy a HspA1B (+1267) polimorfizmusa összefügg bizonyos kórképekben a betegség súlyosságával, például Crohn betegségben [234] vagy akut pancreatitisben [235]. Legjobb tudásunk szerint elsőként vizsgáltuk a polimorfizmus és a szívelégtelenség súlyossága közötti kapcsolatot. A kórképek lefolyása és a polimorfizmus közötti összefüggés háttere nem egyértelmű, jelen vizsgálat során elsőként tanulmányoztuk a HspA1B A(1267)G alléljeinek hatását a sHsp70 szintre. Eredményeink szerint a A HspA1B (1267) G allél frekvenciája nem különbözött a súlyos és kevésbé súlyos betegek, valamint a követés alatt eseménymentes vagy eseményt elszenvedett betegek között. A sHsp70 szint és a G allél között primer kapcsolatot nem találtunk. Vizsgálataink szerint azonban a G allélt hordozó, súlyos stádiumba tartozó betegekben, és főleg azok között, akik a követési idő alatt meghaltak, jelentősen magasabb a bevételi sHsp70 szint. Ezt úgy is lefordíthatjuk, hogy a HspA1B G allélt hordozó csoport súlyos szívelégtelenség, vagyis a betegség okozta fokozottabb „stressz” esetén magasabb sHsp70 szinttel jellemezhető, mint a G allélt nem hordozók. Még fontosabb, hogy két egyformán HspA1B G allélt hordozó és ugyan annyira súlyos

85

beteg (NYHA IV) közül, annak az egyénnek, akinek a sHsp70 szintje magas, sokkal rosszabb az esélye az egyéves túlélésre. Két lehetséges magyarázata van megfigyeléseinknek. A HspA1B része a 8.1-es ősi haplotípusnak, ezáltal a G allél kapcsoltságban állhat a TNF2 alléllel [238, 369, 370], amely így a gyulladásos inger esetén kifejezettebb TNF válaszhoz vezethet. Ez a fokozott

gyulladásos

reakció

pedig

előidézheti

a

sHsp70

felszabadulását.

Kutatócsoportunk nem közölt eredményei szerint a TNF2 -308-as polimorfizmusa valóban kapcsoltságot mutat a HspA1B polimorfizmussal (Pearson Chi test p=0,014), azonban a TNF2 -308 és a sHsp70 szint (Kruskal-Wallis teszt p=0,436), illetve a TNF-α és a sHsp70 szint között (Spearman rank korreláció p=0,494) nem találtunk szignifikáns összefüggést. Nem szabad azonban azt sem figyelmen kívül hagyni, hogy a Hsp70 eredendően intracelluláris fehérje, és nem ismert, hogy a szérumban mért Hsp70 szint tükrözi-e a sejten belüli Hsp70 koncentrációt. Elképzelhető tehát, hogy az összefüggés intracelluláris szinten fennáll, azonban mi ezt a szérum Hsp70 mérésével nem észleljük. Másodsorban annak a lehetőségét sem lehet kizárni, hogy a HspA1B polimorfizmusnak direkt hatása van a specifikus mRNS szintre, bár az irodalmi adatok igen ellentmondásosak ezen a téren. 2-es típusú cukorbetegségben és atherosclerosisban szenvedő betegekben pozitív [225], egy másik 2-es típusú cukorbetegeket vizsgáló munkacsoport szerint negatív [223] összefüggés állt fenn az mRNS szint és a G allél hordozása között, míg egészséges önkéntesekben [224] nem találtak összefüggést. Ha azonban az mRNS szintjén keresztül a polimorfizmus mégis hatással van az intracelluláris Hsp70 szintre, akkor elképzelhető, hogy a polimorfizmus és az extracelluláris sHsp70 közötti összefüggés csak akkor jut érvényre, ha valamilyen szöveti károsodás fennállásával a sejten belüli Hsp70 a keringésbe kerül. Ezt a hipotézist tökéletesen alátámasztja a jelen vizsgálatban talált szoros korreláció a sHsp70 és a sejt szétesés markerei (például LDH, γ-GT) között, illetve az a megfigyelés, hogy a genotípus és a sHsp70 között a súlyos betegekben fennállt a korreláció. A vizsgálatunk jellegéből adódóan azonban ilyen messzemenő következtetéseket nem tudunk teljes biztonsággal levonni, ezért további funkcionális genetikai vizsgálatok szükségesek a kérdés pontos tisztázására. A HspA1L C(2437T) allélhordozása és a betegség súlyossága, kimenetele és a sHsp70 szint között nem találtunk szignifikáns korrelációt. Sok egyéb kórkép esetén

86

szintén nem mutatkozott érdemleges összefüggés a polimorfizmus és a betegség lefolyás között [239, 242, 243, 245, 246], annak ellenére, hogy a HspA1B polimorfizmussal

ellentétben

ez

a

nukleotidcsere

az

aminosav

szekvencia

módosulásával is jár.

6.3. ADAMTS13 aktivitás és VWF:Ag szint A krónikus szívelégtelenség progressziója során a Virchow triász mindhárom eleme teljesül, a betegekben növekszik a thromboemboliás szövődmények rizikója. Az ebből adódó komplikációk, az életminőséget rontó társbetegségek és a folyamat mortalitásban betöltött szerepe alulbecsült és kevéssé ismert területe a szívelégtelenségnek.

6.3.1. Az ADAMTS13 aktivitás Legjobb tudásunk szerint elsőként figyeltük meg, hogy az ADAMTS13 aktivitása csökkent szívelégtelenségben. Eredményeink szerint az aktivitáscsökkenés mértéke szorosan korrelál a betegség súlyosságát jelző funkcionális stádiumbeosztással és a szívelégtelenség ismert súlyossági markereivel. Irodalmi adatok alapján több lehetséges oka lehet a szívelégtelenekben megfigyelt aktivitáscsökkenésnek. Vizsgálatunk során az ADAMTS13 aktivitás és a klinikai, valamint laboratóriumi paraméterek közötti korrelációk elemzésével próbáltuk megkeresni a legvalószínűbb mechanizmusokat. Ismert, hogy az ADAMTS13-t elsősorban a máj termeli [310, 371]. Krónikus szívelégtelenségben a hepatikus pangás illetve a betegségben leírt malnutrició miatt csökken a máj szintetikus kapacitása. A csökkent ADAMTS13 aktivitás hátterében állhat tehát a máj korlátozott fehérje termelő képessége, ezt alátámasztja a vizsgálatunkban megfigyelt szoros korreláció az ADAMTS13 aktivitás valamint az albumin és az összfehérje szint között. Az ADAMTS13 másik forrása az endothelsejt [372], ezáltal a szívelégtelenségben megfigyelhető krónikus endothel aktiváció is felelős lehet a csökkent aktivitásért. Erre utal a vizsgálatunkban talált szoros reverz összefüggés az endothelin-1 és az ADAMTS13 aktivitás között. Az endothel sérülés következtében megnövekszik az UL-VWF szekréciója [287, 291]. Ismert, hogy a magas szubsztrát szint következtében fokozódhat az ADAMTS13 fogyása [373], az aktivitáscsökkenés hátterében így consumptio is állhat.

87

Irodalmi adatok alapján számos egyéb lehetséges mechanizmust is számításba vettünk. In vitro vizsgálatok eredményei szerint az ADAMTS13-t gátolják a gyulladásos cytokinek, főként az IL-6 és a TNF-α. Eredményeink szerint azonban az említett gyulladásos markerek és az ADAMTS13 aktivitás között nem volt összefüggés. A gyulladás szerepét az akut fázis fehérjék szempontjából is elemeztük, itt sem találtunk jelentős korrelációt. Elsődlegesen összefüggés mutatkozott a szérum kreatinin, az életkor és az ADAMTS13 aktivitás között, azonban többszörös regressziós modellekben a kapcsolat másodlagosnak tűnt. Egy paciensnél sem észleltük a disszeminált intravascularis coagulatio klinikai képét (DIC), ezt alátámasztja a betegpopulációban mért fiziológiás fibrinogén szint is (nem bemutatott adat). Ezáltal a DIC-re jellemző trombin és plazmin által okozott ADAMTS13 inaktiválás sem valószínű. Eredményeink alapján arra következtettünk, hogy a szívelégtelenségben megfigyelt alacsony ADAMTS13 aktivitás hátterében az enzim fokozott felhasználása és következményes konzumpciója, valamint a csökkent termelés állhat. Az utóbbiért a máj szintetikus kapacitásának csökkenése és az endothel diszfunkció is felelhet. Az ADAMTS13 aktivitás szabályozása ezen három útvonal révén integratív módon képes jellemezni a szívelégtelenség progressziójából fennálló komplex folyamatokat. Ezen kívül a proteáz biológiai funkciójából adódóan önmaga is szerepet játszhat a betegség lefolyásában.

Az

ADAMTS13

aktivitás

ezáltal

hasznos

biomarker

lehet

szívelégtelenségben.

6.3.2. Az ADAMTS13/VWF hányados változásának klinikai jelentősége A szívelégtelenségben észlelt ADAMTS13 csökkenés mértéke hasonló az AMI akut fázisában és a pitvarfibrillációban mért változáshoz. Az aktivitás átlaga megfelel az egészségesekben mért érték 75 százalékának, míg a TTP kialakulásához jelentősen csökkent (<10%) aktivitás szükséges [331]. Betegeink értékei nem ebben a tartományban mozogtak, ennek megfelelően a populációban nem észleltünk ennek megfelelő klinikai tünetek, nem volt alacsony a thrombocytaszám. A vizsgálatunkban, érdekes módon, egy betegnél extrém alacsony értéket mértünk, az illető anamnézisében nem szerepelt TTP vagy alacsony vérlemezkeszám. Egy holland munkacsoport is beszámolt egy ilyen esetről, egy 45 éves AMI-n átesett férfinél ismételten 5 százaléknál

88

kisebb ADAMTS13 aktivitást mértek, TTP-s tüneteket itt sem tapasztaltak [331]. Feltételezhető, hogy az ADAMTS13 hiány önmagában nem elegendő a thromboticus szövődmények kialakulásához. ADAMTS13 hiányos egér modellekben adrenalin stimulációra, kollagénre és megfelelő áramlási erőre volt szükség a thromboticus microangiopathiák kialakuláshoz [374]. Humán vizsgálatokban is megfigyelték, hogy a TTP relapszusok kialakulásához gyakran szükséges valamilyen egyéb eltérés, például fertőzés, mely stimulálja az endotheliumot [375, 376]. Feltételezhető tehát, hogy nem önállóan a két fehérje szintjének, hanem az ADAMTS13 és a VWF közötti egyensúlynak van a klinikai jelentősége. Jelentős endothelialis aktiváció mellett kis fokú ADAMTS13 aktivitás változásnak is lehet következménye [331]. Vizsgálatunk során, ennek megfelelően, az VWF antigén és az ADAMTS13 aktivitás hányadosának összefüggéseit és prognosztikai értékét tanulmányoztuk. Eredményeink szerint a betegség lefolyása során az ADAMTS13 aktivitása és a VWF koncentráció ellentétes irányú elmozdulása a véralvadás fokozódására hajlamosíthat. A hányados értéke szignifikánsan különbözött a thromboemboliás szövődményeket elszenvedő és ezektől mentes betegek között. Vizsgálatunkban az ADAMTS13/VWF hányados változása prediktív értékkel bírt a mortalitás és a betegség progressziója tekintetében. Vizsgálatunk során a hányados prognosztikai értéke nagyobb volt, mint a VWF-nak önállóan, az ADAMTS13 aktivitás a predikció tekintetében additív értékkel bírt. A megfigyelt összefüggések hátterében állhat ok-okozati összefüggés: a hányados növekedése, a két fehérje közti egyensúly elveszítése, vagyis a magas VWF antigén és az alacsony ADAMTS13 aktivitás növelheti a vérrögképződésre való hajlamot és fokozott véralvadáshoz vezethet, mely a thromboemboliás betegségek rizikó növekedéséhez vezethet. Ez a hatás nem csak a puha végpontoknak tekinthető szív és érrendszeri eseményekben, hanem a mortalitásban is jelentkezhet, hiszen a hirtelen szívhalál hátterében nem kizárólagosan malignus ritmuszavar állhat. Lehetséges azonban, hogy az ADAMTS13/VWF hányados előrejelző képessége a szerteágazó biológiai kapcsolatokból adódik. Az érték közvetett módon képet adhat a tápláltságról, a máj és a vese állapotáról, a gyulladás mértékéről és az endothel diszfunkcióról. Csupa olyan tényezőről, mely leírt és bizonyított hatással bír a betegség progressziójára és a mortalitásra.

89

Eredményeink megerősítéséhez további multicentrikus, nagy esetszámú validáló vizsgálatok szükségesek. Vizsgálatunk korlátozott értékű volt a thromboemboliás események alacsony száma miatt, így messzemenő következtetéseket ezen a téren nem vonhattunk le megbízhatóan. A további vizsgálatok nagy jelentőségűek, hiszen az VWF-ADAMTS13 tengely új terápiás célpont lehet a thromboemboliás szövődmények megelőzésében. Korábban is ismert tény [329, 377], melyet jelen vizsgálatunk is megerősített, hogy a thrombocytaaggregációt gátló készítmények – az aszpirin és a ticlopidine – nincsenek hatással a plazma VWF és ADAMTS13 szintjére. A közelmúltban Chauhan és munkatársai leírták, hogy rekombináns ADAMTS13 infúzió gátolta a trombus növekedését az ADAMTS13 hiányos egér érsérülése esetén [378]. Elképzelhető tehát, hogy a jövőben várható rekombináns ADAMTS13 készítmények nemcsak a TTP, hanem a cardiovascularis betegségek kezelésében és megelőzésében is szerephez jutnak [329].

6.4. Kitekintés A megfigyeléses klinikai vizsgálatok sajnálatos korláta, hogy a különböző hatások egyéb stimulusoktól függetlenül történő értékelésére csak gondos vizsgálattervezéssel és statisztikai módszerekkel van lehetőség, esetleges ok-okozati összefüggések direkt módon nem bizonyíthatóak. Azonban a klinikai vizsgálatok szépsége is ebben rejlik, hiszen nem csak egy-egy kiragadott útvonal, vagy hatás tanulmányozható, hanem megfelelő mennyiségű adat birtokában, integratív módon, az egész rendszer. Saját vizsgálatunk előnye is a betegminta részletes jellemzettségében rejlik, amely a klinikai és biológiai kapcsolatok széles körű tanulmányozását tette lehetővé. Jelen dolgozat, terjedelme miatt nem alkalmas minden vizsgált összefüggés bemutatására, munkám során a klinikailag legrelevánsabb kapcsolatokra koncentráltam. A kapott új eredmények validálásához további tanulmányok szükségesek. Vizsgálatunk kétségtelen hátránya, hogy egy centrumból kerültek ki a betegek, illetve néhány vonatkozásban az esetszám nem volt elegendően magas a további érdekes analízisekhez, bizonyos alcsoportok önálló vizsgálatához. A kis esetszám és azonos kezelési centrum viszont biztosította a diagnózisok, a kezelési módok és a szubjektív tünetek homológ megítélését,

a mintakezelés egységességét.

Eredményeinket

gondolatébresztőnek tartjuk, amelyek segíthetnek a további kutatási irányvonalak

90

meghatározásában.

A

biológiai

asszociációk

terén

felismert

összefüggések

alátámasztásához sejtes illetve állatmodelles kísérletekre lehet szükség. Vizsgálatunk során

opcionálisan

prognosztikai

faktorként

azonosított

változók

klinikai

hasznosságának megítéléséhez további nagy esetszámú, validáló vizsgálatokra van szükség.

91

7. Következtetések 1, A magas MR-proADM és a magas CT-proET-1 az eddig széles körben használt NTproBNP szinttel azonos prediktív értékkel rendelkezik a halálozás valamint a halálozást és rehospitalizációt magába foglaló kombinált végpont előrejelzésekor. A CT-proET-1 a mortalitás, az MR-proADM a kombinált végpont tekintetében rendelkezik az NTproBNP-nél magasabb prediktív értékkel. Mindkét vazoaktív peptid hasznos, új prognosztikai marker lehet. 2, Az MR-proADM és a CT-proET-1-szintek szoros összefüggést mutatnak a szívelégtelenség súlyosságát jellemző változókkal, ezáltal alkalmas biomarkernek tűnnek. További vizsgálatokat követően, az NT-proBNP-hez hasonlóan segíthetik a betegség diagnózisát, a betegek követését és a terápia irányítását. Az életkorral, a vesefunkcióval, és esetlegesen a testtömeg-indexszel mutatott összefüggésük azonban óvatosságra int általánosított felhasználásukat illetően. 3, Az MR-proADM és a CT-proET-1 a szívelégtelenség súlyosságát jellemző klinikai tényezőktől függetlenül is szoros összefüggést mutat a szisztémás gyulladás markereivel. A vazoaktív fehérjék és a gyulladásos folyamatok között fennálló kölcsönös reguláció jelentős szereppel bírhat a szívelégtelenség progressziójában. 4, A szérum Hsp70 koncentrációja a szívelégtelenség progressziójával korreláló módon emelkedik a betegségben, a súlyosság független markere. Azonban a mortalitás és a morbiditás szempontjából nem rendelkezik prediktív értékkel.

5, A HspA1B A(1267)G, valamint a HspA1L C(2437)T genetikai polimorfizmusok nem mutatnak összefüggést a szívelégtelenség súlyosságával és a betegség kimenetelével. Nincsen primer összefüggés a sHsp70 szint és a két polimorfizmus allélgyakorisága között, azonban a HspA1B (+1267) G allél hordozása és az előrehaladott szívelégtelenség szignifikánsan magasabb sHsp70 szinttel jár, mint az egyéb konstellációk.

92

6, Szívelégtelenségben a sHsp70 szint nem mutat szoros korrelációt a gyulladásos paraméterekkel, azonban szignifikáns összefüggés áll fenn a sejt- és szövetsérülésre utaló változókkal. A sHsp70 a sejt integritás károsodásának markere lehet. 7, A VWF szintje krónikus szívelégtelenség esetén megemelkedik, míg az VWF hasító proteáz, az ADAMTS13, aktivitása csökken az egészségesekhez képest. Ezáltal a két komponens közötti kényes egyensúly felborul, az ADAMTS13 aktivitás és a VWF hányadosa a betegség progressziójával párhuzamosan jelentősen csökken. Mind a két változó és hányadosuk szoros korrelációban áll a betegség súlyosságát jelző paraméterekkel. 8, A szívelégtelenségben az ADAMTS13 aktivitás legerősebben a máj szintetikus kapacitását jellemző paraméterekkel mutat korrelációt, de nem állt erős kapcsolatban az akut-fázis fehérjékkel, amely arra utalhat, hogy a betegségben a fehérje termelésének károsodása vezethet az aktivitás csökkenéséhez. A VWF a gyulladás és az endothel diszfunkció markereivel függ össze a legerősebben. 9, Szívelégtelenségben az alacsony ADAMTS13/VWF hányados szignifikáns és független prediktora a mortalitásnak és a rehospitalizációnak, prediktív értéke meghaladja a VWF-ét. A thromboemboliás szövődményeket elszenvedő betegekben szignifikánsan alacsonyabb az ADAMTS13 aktivitása. Eredményeink arra utalnak, hogy az ADAMTS13 aktivitás és a VWF szint változása szerepet játszhat a szívelégtelenségben megfigyelhető thromboemboliás szövődmények kialakulásában.

93

8. Összefoglalás A krónikus szívelégtelenség patomechanizmusában jelentős szerepet játszik a neurohormonális rendszer aktivációja, a szisztémás gyulladás kialakulása és az endothelialis diszfunkció. A három útvonalnak számos kapcsolódási pontja ismert, az ezeket jellemző paraméterek hasznos prognosztikus markerek lehetnek. A közelmúlt metodikai újításai lehetővé tették a vazoaktív hatásokkal rendelkező adrenomedullin (ADM) és endotelin-1 (ET-1) szintjének megbízható meghatározását. Sejtes kísérletek arra utalnak, hogy szoros kapcsolat áll fent a vazoaktív peptidek és az inflammatorikus folyamatok között, habár arról, hogy in vivo, szívelégtelenségben, a súlyosságtól függetlenül

létezik-e

összefüggés,

nem

rendelkezünk

adatokkal.

A

70kDa

hősokkfehérjék (Hsp70) ősi intracelluláris molekulák, azonban stressz válasz esetén a keringésben is megtalálhatóak (sHsp70). Genetikai polimorfizmusuk összefüggést mutat számos kórkép súlyosságával, ám az allélhordozás és a sHsp70 szint közötti viszony nem ismert. A von Willebrand faktor (VWF) az endothel diszfunkció markere. Szívelégtelenségben szintje nő, hasító proteáza, az ADAMTS13 aktivitásáról nincs adatunk. A két fehérje aktivitása közötti egyensúly felborulása előrejelezheti a thromboemboliás szövődményeket és a mortalitást. Célunk volt, hogy szívelégtelenek követéses kohorsz vizsgálatával mortalitási és morbiditási markereket és markerkombinációkat keressünk, illetve tanulmányozzuk ezen paraméterek kapcsolatát klinikai és laboratórium változókkal. Eredményeink szerint a magas MR-proADM és a magas CT-proET-1 az NTproBNP szinttel azonos prediktív értékkel rendelkezik a halálozás valamint a halálozást és rehospitalizációt magába foglaló kombinált végpont előrejelzésekor. Mindkét vazoaktív fehérje a szívelégtelenség súlyosságától függetlenül szoros összefüggést mutatott a szisztémás gyulladás markereivel. A feltételezett kölcsönös reguláció jelentős szereppel bírhat a szívelégtelenség progressziójában. A sHsp70 szintje a betegség súlyosságával korrelálva megemelkedik, nincsen jelentős prognosztikus érétke, azonban szoros összefüggést mutat a sejtszétesés markereivel. A HspA1B (1267) G allél hordozása súlyos betegekben magas sHsp70 szinttel jár. A szívelégtelenekben szignifikánsan csökkent az ADAMTS13 aktivitás, az alacsony ADAMTS13/VWF hányados a mortalitás és a morbiditás független előrejelzője, összefüggést mutat a szívelégtelenségben kialakuló thromboemboliás szövődményekkel.

94

Summary Activation of the neurohormonal system, chronic inflammation and endothelial dysfunction are playing role in the pathomechanism of chronic heart failure. The parameters describing the three connected pathways are potential prognostic markers. New methodological developments provide reliable measurement of the plasma levels of the vasoactive adrenomedullin (ADM) and endothelin-1 (ET-1). According to earlier results there is a strong relationship between the vasoactive peptides and the inflammatory mechanisms, although it is not known whether the relationship exists in vivo, in chronic heart failure patients independently form the severity of the disease. Heat shock proteins with 70kDa are ancient intracellular molecules, but during stress response they can be found in the circulation (sHsp70). Their genetic polymorphism shows correlation with the severity of several diseases, but the relationship between the alleles and the sHsp70 levels are not known. Von Willebrand faktor (VWF) is a marker of the endothelial dysfunction. Its level increases in chronic heart failure patients, but there is no data about the activity of its cleaving protease, the ADAMTS13. The imbalance between the two proteins may predict the thromboembolic complications and the mortality. We aimed to perform a prospective clinical cohort with chronic heart failure patients to find prognostic mortality and morbidity markers, and to study the relation of these markers with clinical and laboratory parameters. According to our results high MR-proADM levels and high CT-proET-1 levels had similar predictive value to NT-proBNP in mortality and morbidity analysis. The two studied vasoactive peptides showed a strong positive correlation with the markers of inflammation, independently of the severity of the disease. The supposed mutual regulation may play a crucial role in the progression of heart failure. The sHSp70 level was higher in patients with severer disease, while its prognostic value were not significant, it showed strong positive correlation with the markers of the failure of cell integrity. Carrying the G allel of HspA1B (1267) is connected with high sHsp70 levels in patients with severer disease. In chronic heart failure the ADAMTS13 protease activity was significantly decreased, while the VWF antigen level was increased. The low ADAMTS13/VWF ratio is an independent predictor of mortality and showed correlation with thromboembolic complications in chronic heart failure patients.

95

9. Irodalomjegyzék 1.

Swedberg K, Cleland J, Dargie H, Drexler H, Follath F, Komajda M, Tavazzi L, Smiseth OA, Gavazzi A, Haverich A, Hoes A, Jaarsma T, Korewicki J, Levy S, Linde C, Lopez-Sendon JL, Nieminen MS, Pierard L, Remme WJ. [Guidelines for the Diagnosis and Treatment of Chronic Heart Failure: executive summary (update 2005)]. Rev Esp Cardiol 2005;58:1062-92.

2.

Czuriga I. Szívelégtelenség Medicina Könyvkiadó Rt., 2006.

3.

Dickstein K, Cohen-Solal A, Filippatos G, McMurray JJ, Ponikowski P, PooleWilson PA, Stromberg A, van Veldhuisen DJ, Atar D, Hoes AW, Keren A, Mebazaa A, Nieminen M, Priori SG, Swedberg K, Vahanian A, Camm J, De Caterina R, Dean V, Dickstein K, Filippatos G, Funck-Brentano C, Hellemans I, Kristensen SD, McGregor K, Sechtem U, Silber S, Tendera M, Widimsky P, Zamorano JL, Tendera M, Auricchio A, Bax J, Bohm M, Corra U, della Bella P, Elliott PM, Follath F, Gheorghiade M, Hasin Y, Hernborg A, Jaarsma T, Komajda M, Kornowski R, Piepoli M, Prendergast B, Tavazzi L, Vachiery JL, Verheugt FW, Zamorano JL, Zannad F. ESC guidelines for the diagnosis and treatment of acute and chronic heart failure 2008: the Task Force for the diagnosis and treatment of acute and chronic heart failure 2008 of the European Society of Cardiology. Developed in collaboration with the Heart Failure Association of the ESC (HFA) and endorsed by the European Society of Intensive Care Medicine (ESICM). Eur J Heart Fail 2008;10:933-89.

4.

Mosterd A, Hoes AW. Clinical epidemiology of heart failure. Heart 2007;93:1137-46.

5.

Mosterd A, Hoes AW, de Bruyne MC, Deckers JW, Linker DT, Hofman A, Grobbee DE. Prevalence of heart failure and left ventricular dysfunction in the general population; The Rotterdam Study. Eur Heart J 1999;20:447-55.

6.

Stewart S, MacIntyre K, Hole DJ, Capewell S, McMurray JJ. More 'malignant' than cancer? Five-year survival following a first admission for heart failure. Eur J Heart Fail 2001;3:315-22.

7.

Klatsky AL, Chartier D, Udaltsova N, Gronningen S, Brar S, Friedman GD, Lundstrom RJ. Alcohol drinking and risk of hospitalization for heart failure with and without associated coronary artery disease. Am J Cardiol 2005;96:346-51.

96

8.

McMurray J, Pfeffer MA. New therapeutic options in congestive heart failure: Part II. Circulation 2002;105:2223-8.

9.

McMurray J, Pfeffer MA. New therapeutic options in congestive heart failure: Part I. Circulation 2002;105:2099-106.

10.

Ruffolo RR, Jr., Feuerstein GZ. Neurohormonal activation, oxygen free radicals, and apoptosis in the pathogenesis of congestive heart failure. J Cardiovasc Pharmacol 1998;32 Suppl 1:S22-30.

11.

Willenbrock R, Philipp S, Mitrovic V, Dietz R. Neurohumoral blockade in CHF management. J Renin Angiotensin Aldosterone Syst 2000;1 Suppl 1:24-30.

12.

Diez J, Ertl G. A translational approach to myocardial remodelling. Cardiovasc Res 2009;81:409-11.

13.

Anker SD, Al-Nasser FO. Chronic heart failure as a metabolic disorder. Heart Fail Monit 2000;1:42-9.

14.

Anker SD, Rauchhaus M. Insights into the pathogenesis of chronic heart failure: immune activation and cachexia. Curr Opin Cardiol 1999;14:211-6.

15.

Schrier RW, Martin PY. Recent advances in the understanding of water metabolism in heart failure. Adv Exp Med Biol 1998;449:415-26.

16.

Lip GY, Gibbs CR. Does heart failure confer a hypercoagulable state? Virchow's triad revisited. J Am Coll Cardiol 1999;33:1424-6.

17.

Sherlock S. The liver in heart failure; relation of anatomical, functional, and circulatory changes. Br Heart J 1951;13:273-93.

18.

Groenveld HF, Januzzi JL, Damman K, van Wijngaarden J, Hillege HL, van Veldhuisen DJ, van der Meer P. Anemia and mortality in heart failure patients a systematic review and meta-analysis. J Am Coll Cardiol 2008;52:818-27.

19.

Braunwald E, Bristow MR. Congestive heart failure: fifty years of progress. Circulation 2000;102:IV14-23.

20.

Mann DL. Mechanisms and models in heart failure: A combinatorial approach. Circulation 1999;100:999-1008.

21.

Lainscak M, Anker SD. Prognostic factors in chronic heart failure. A review of serum biomarkers, metabolic changes, symptoms, and scoring systems. Herz 2009;34:141-7.

97

22.

Maisel A, Mueller C, Adams K, Jr., Anker SD, Aspromonte N, Cleland JG, Cohen-Solal A, Dahlstrom U, DeMaria A, Di Somma S, Filippatos GS, Fonarow GC, Jourdain P, Komajda M, Liu PP, McDonagh T, McDonald K, Mebazaa A, Nieminen MS, Peacock WF, Tubaro M, Valle R, Vanderhyden M, Yancy CW, Zannad F, Braunwald E. State of the art: using natriuretic peptide levels in clinical practice. Eur J Heart Fail 2008;10:824-39.

23.

Troughton RW, Richards AM. BNP for clinical monitoring of heart failure. Heart Fail Clin 2006;2:333-43.

24.

Peacock WF, Mueller C, Disomma S, Maisel A. Emergency department perspectives on B-type natriuretic peptide utility. Congest Heart Fail 2008;14:17-20.

25.

Jourdain P, Jondeau G, Funck F, Gueffet P, Le Helloco A, Donal E, Aupetit JF, Aumont MC, Galinier M, Eicher JC, Cohen-Solal A, Juilliere Y. Plasma brain natriuretic peptide-guided therapy to improve outcome in heart failure: the STARS-BNP Multicenter Study. J Am Coll Cardiol 2007;49:1733-9.

26.

Lainchbury JG, Troughton RW, Frampton CM, Yandle TG, Hamid A, Nicholls MG, Richards AM. NTproBNP-guided drug treatment for chronic heart failure: design and methods in the "BATTLESCARRED" trial. Eur J Heart Fail 2006;8:532-8.

27.

Rauchhaus M, Doehner W, Francis DP, Davos C, Kemp M, Liebenthal C, Niebauer J, Hooper J, Volk HD, Coats AJ, Anker SD. Plasma cytokine parameters and mortality in patients with chronic heart failure. Circulation 2000;102:3060-7.

28.

Anker SD, Coats AJ. How to RECOVER from RENAISSANCE? The significance of the results of RECOVER, RENAISSANCE, RENEWAL and ATTACH. Int J Cardiol 2002;86:123-30.

29.

Torre-Amione G, Anker SD, Bourge RC, Colucci WS, Greenberg BH, Hildebrandt P, Keren A, Motro M, Moye LA, Otterstad JE, Pratt CM, Ponikowski P, Rouleau JL, Sestier F, Winkelmann BR, Young JB. Results of a non-specific immunomodulation therapy in chronic heart failure (ACCLAIM trial): a placebo-controlled randomised trial. Lancet 2008;371:228-36.

98

30.

Anker SD, Doehner W, Rauchhaus M, Sharma R, Francis D, Knosalla C, Davos CH, Cicoira M, Shamim W, Kemp M, Segal R, Osterziel KJ, Leyva F, Hetzer R, Ponikowski P, Coats AJ. Uric acid and survival in chronic heart failure: validation and application in metabolic, functional, and hemodynamic staging. Circulation 2003;107:1991-7.

31.

Anker SD, Ponikowski P, Varney S, Chua TP, Clark AL, Webb-Peploe KM, Harrington D, Kox WJ, Poole-Wilson PA, Coats AJ. Wasting as independent risk factor for mortality in chronic heart failure. Lancet 1997;349:1050-3.

32.

Anker SD, Negassa A, Coats AJ, Afzal R, Poole-Wilson PA, Cohn JN, Yusuf S. Prognostic importance of weight loss in chronic heart failure and the effect of treatment with angiotensin-converting-enzyme inhibitors: an observational study. Lancet 2003;361:1077-83.

33.

Doehner W, Rauchhaus M, Ponikowski P, Godsland IF, von Haehling S, Okonko DO, Leyva F, Proudler AJ, Coats AJ, Anker SD. Impaired insulin sensitivity as an independent risk factor for mortality in patients with stable chronic heart failure. J Am Coll Cardiol 2005;46:1019-26.

34.

Rauchhaus M, Clark AL, Doehner W, Davos C, Bolger A, Sharma R, Coats AJ, Anker SD. The relationship between cholesterol and survival in patients with chronic heart failure. J Am Coll Cardiol 2003;42:1933-40.

35.

Davos CH, Doehner W, Rauchhaus M, Cicoira M, Francis DP, Coats AJ, Clark AL, Anker SD. Body mass and survival in patients with chronic heart failure without cachexia: the importance of obesity. J Card Fail 2003;9:29-35.

36.

Steinborn W, Doehner W, Anker SD. Anemia in chronic heart failure-frequency and prognostic impact. Clin Nephrol 2003;60 Suppl 1:S103-7.

37.

Sharma R, Francis DP, Pitt B, Poole-Wilson PA, Coats AJ, Anker SD. Haemoglobin predicts survival in patients with chronic heart failure: a substudy of the ELITE II trial. Eur Heart J 2004;25:1021-8.

38.

Förhécz Z, Gombos T, Borgulya G, Pozsonyi Z, Prohászka Z, Jánoskuti L. Red cell distribution width in heart failure: Prediction of clinical events and relationship with markers of ineffective erythropoiesis, inflammation, renal function and nutritional state Am Heart J 2009.

99

39.

Aaronson KD, Schwartz JS, Chen TM, Wong KL, Goin JE, Mancini DM. Development and prospective validation of a clinical index to predict survival in ambulatory patients referred for cardiac transplant evaluation. Circulation 1997;95:2660-7.

40.

Levy WC, Mozaffarian D, Linker DT, Sutradhar SC, Anker SD, Cropp AB, Anand I, Maggioni A, Burton P, Sullivan MD, Pitt B, Poole-Wilson PA, Mann DL, Packer M. The Seattle Heart Failure Model: prediction of survival in heart failure. Circulation 2006;113:1424-33.

41.

May HT, Horne BD, Levy WC, Kfoury AG, Rasmusson KD, Linker DT, Mozaffarian D, Anderson JL, Renlund DG. Validation of the Seattle Heart Failure Model in a community-based heart failure population and enhancement by adding B-type natriuretic peptide. Am J Cardiol 2007;100:697-700.

42.

Levine B, Kalman J, Mayer L, Fillit HM, Packer M. Elevated circulating levels of tumor necrosis factor in severe chronic heart failure. N Engl J Med 1990;323:236-41.

43.

Aukrust P, Ueland T, Lien E, Bendtzen K, Muller F, Andreassen AK, Nordoy I, Aass H, Espevik T, Simonsen S, Froland SS, Gullestad L. Cytokine network in congestive heart failure secondary to ischemic or idiopathic dilated cardiomyopathy. Am J Cardiol 1999;83:376-82.

44.

Mallat Z, Heymes C, Corbaz A, Logeart D, Alouani S, Cohen-Solal A, Seidler T, Hasenfuss G, Chvatchko Y, Shah AM, Tedgui A. Evidence for altered interleukin 18 (IL)-18 pathway in human heart failure. Faseb J 2004;18:1752-4.

45.

Torre-Amione G, Kapadia S, Benedict C, Oral H, Young JB, Mann DL. Proinflammatory cytokine levels in patients with depressed left ventricular ejection fraction: a report from the Studies of Left Ventricular Dysfunction (SOLVD). J Am Coll Cardiol 1996;27:1201-6.

46.

Aukrust P, Ueland T, Muller F, Andreassen AK, Nordoy I, Aas H, Kjekshus J, Simonsen S, Froland SS, Gullestad L. Elevated circulating levels of C-C chemokines in patients with congestive heart failure. Circulation 1998;97:113643.

100

47.

Damas JK, Gullestad L, Ueland T, Solum NO, Simonsen S, Froland SS, Aukrust P. CXC-chemokines, a new group of cytokines in congestive heart failure-possible role of platelets and monocytes. Cardiovasc Res 2000;45:428-36.

48.

Deswal A, Petersen NJ, Feldman AM, Young JB, White BG, Mann DL. Cytokines and cytokine receptors in advanced heart failure: an analysis of the cytokine

database

from

the

Vesnarinone

trial

(VEST).

Circulation

2001;103:2055-9. 49.

Hirota H, Izumi M, Hamaguchi T, Sugiyama S, Murakami E, Kunisada K, Fujio Y, Oshima Y, Nakaoka Y, Yamauchi-Takihara K. Circulating interleukin-6 family cytokines and their receptors in patients with congestive heart failure. Heart Vessels 2004;19:237-41.

50.

Pye M, Rae AP, Cobbe SM. Study of serum C-reactive protein concentration in cardiac failure. Br Heart J 1990;63:228-30.

51.

Steele IC, Nugent AM, Maguire S, Hoper M, Campbell G, Halliday MI, Nicholls DP. Cytokine profile in chronic cardiac failure. Eur J Clin Invest 1996;26:1018-22.

52.

Kaneko K, Kanda T, Yamauchi Y, Hasegawa A, Iwasaki T, Arai M, Suzuki T, Kobayashi I, Nagai R. C-Reactive protein in dilated cardiomyopathy. Cardiology 1999;91:215-9.

53.

Ishikawa C, Tsutamoto T, Fujii M, Sakai H, Tanaka T, Horie M. Prediction of mortality by high-sensitivity C-reactive protein and brain natriuretic peptide in patients with dilated cardiomyopathy. Circ J 2006;70:857-63.

54.

Yndestad A, Damas JK, Oie E, Ueland T, Gullestad L, Aukrust P. Systemic inflammation in heart failure--the whys and wherefores. Heart Fail Rev 2006;11:83-92.

55.

Tsutamoto T, Wada A, Ohnishi M, Tsutsui T, Ishii C, Ohno K, Fujii M, Matsumoto T, Yamamoto T, Takayama T, Dohke T, Horie M. Transcardiac increase in tumor necrosis factor-alpha and left ventricular end-diastolic volume in patients with dilated cardiomyopathy. Eur J Heart Fail 2004;6:173-80.

56.

Ueland T, Aukrust P, Yndestad A, Otterdal K, Froland SS, Dickstein K, Kjekshus J, Gullestad L, Damas JK. Soluble CD40 ligand in acute and chronic heart failure. Eur Heart J 2005;26:1101-7.

101

57.

Torre-Amione G, Kapadia S, Lee J, Durand JB, Bies RD, Young JB, Mann DL. Tumor necrosis factor-alpha and tumor necrosis factor receptors in the failing human heart. Circulation 1996;93:704-11.

58.

Eiken HG, Oie E, Damas JK, Yndestad A, Bjerkeli V, Aass H, Simonsen S, Geiran OR, Tonnessen T, Christensen G, Froland SS, Gullestad L, Attramadal H, Aukrust P. Myocardial gene expression of leukaemia inhibitory factor, interleukin-6 and glycoprotein 130 in end-stage human heart failure. Eur J Clin Invest 2001;31:389-97.

59.

Yasojima K, Schwab C, McGeer EG, McGeer PL. Human heart generates complement proteins that are upregulated and activated after myocardial infarction. Circ Res 1998;83:860-9.

60.

Prabhu SD, Chandrasekar B, Murray DR, Freeman GL. beta-adrenergic blockade in developing heart failure: effects on myocardial inflammatory cytokines, nitric oxide, and remodeling. Circulation 2000;101:2103-9.

61.

Shioi T, Matsumori A, Kihara Y, Inoko M, Ono K, Iwanaga Y, Yamada T, Iwasaki A, Matsushima K, Sasayama S. Increased expression of interleukin-1 beta and monocyte chemotactic and activating factor/monocyte chemoattractant protein-1 in the hypertrophied and failing heart with pressure overload. Circ Res 1997;81:664-71.

62.

Anker SD, Egerer KR, Volk HD, Kox WJ, Poole-Wilson PA, Coats AJ. Elevated soluble CD14 receptors and altered cytokines in chronic heart failure. Am J Cardiol 1997;79:1426-30.

63.

Krack A, Richartz BM, Gastmann A, Greim K, Lotze U, Anker SD, Figulla HR. Studies on intragastric PCO2 at rest and during exercise as a marker of intestinal perfusion in patients with chronic heart failure. Eur J Heart Fail 2004;6:403-7.

64.

Sandek A, Bauditz J, Swidsinski A, Buhner S, Weber-Eibel J, von Haehling S, Schroedl W, Karhausen T, Doehner W, Rauchhaus M, Poole-Wilson P, Volk HD, Lochs H, Anker SD. Altered intestinal function in patients with chronic heart failure. J Am Coll Cardiol 2007;50:1561-9.

65.

Niebauer J, Volk HD, Kemp M, Dominguez M, Schumann RR, Rauchhaus M, Poole-Wilson PA, Coats AJ, Anker SD. Endotoxin and immune activation in chronic heart failure: a prospective cohort study. Lancet 1999;353:1838-42.

102

66.

Peschel T, Schonauer M, Thiele H, Anker SD, Schuler G, Niebauer J. Invasive assessment of bacterial endotoxin and inflammatory cytokines in patients with acute heart failure. Eur J Heart Fail 2003;5:609-14.

67.

Wei GC, Sirois MG, Qu R, Liu P, Rouleau JL. Subacute and chronic effects of quinapril on cardiac cytokine expression, remodeling, and function after myocardial infarction in the rat. J Cardiovasc Pharmacol 2002;39:842-50.

68.

Brasier AR, Recinos A, 3rd, Eledrisi MS. Vascular inflammation and the reninangiotensin system. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2002;22:1257-66.

69.

Joffe HV, Adler GK. Effect of aldosterone and mineralocorticoid receptor blockade on vascular inflammation. Heart Fail Rev 2005;10:31-7.

70.

Sun Y, Zhang J, Lu L, Chen SS, Quinn MT, Weber KT. Aldosterone-induced inflammation in the rat heart : role of oxidative stress. Am J Pathol 2002;161:1773-81.

71.

Ahokas RA, Warrington KJ, Gerling IC, Sun Y, Wodi LA, Herring PA, Lu L, Bhattacharya SK, Postlethwaite AE, Weber KT. Aldosteronism and peripheral blood mononuclear cell activation: a neuroendocrine-immune interface. Circ Res 2003;93:e124-35.

72.

Sonder SU, Mikkelsen M, Rieneck K, Hedegaard CJ, Bendtzen K. Effects of spironolactone on human blood mononuclear cells: mineralocorticoid receptor independent effects on gene expression and late apoptosis induction. Br J Pharmacol 2006;148:46-53.

73.

Grassi G, Seravalle G, Bertinieri G, Turri C, Stella ML, Scopelliti F, Mancia G. Sympathetic and reflex abnormalities in heart failure secondary to ischaemic or idiopathic dilated cardiomyopathy. Clin Sci (Lond) 2001;101:141-6.

74.

Grassi G, Seravalle G, Cattaneo BM, Lanfranchi A, Vailati S, Giannattasio C, Del Bo A, Sala C, Bolla GB, Pozzi M. Sympathetic activation and loss of reflex sympathetic control in mild congestive heart failure. Circulation 1995;92:320611.

75.

Werner C, Werdan K, Ponicke K, Brodde OE. Impaired beta-adrenergic control of immune function in patients with chronic heart failure: reversal by beta1blocker treatment. Basic Res Cardiol 2001;96:290-8.

103

76.

Muller-Werdan U, Werdan K. Immune modulation by catecholamines--a potential mechanism of cytokine release in heart failure? Herz 2000;25:271-3.

77.

Suzuki K, Nakaji S, Yamada M, Totsuka M, Sato K, Sugawara K. Systemic inflammatory response to exhaustive exercise. Cytokine kinetics. Exerc Immunol Rev 2002;8:6-48.

78.

Tracey KJ. The inflammatory reflex. Nature 2002;420:853-9.

79.

Wang H, Yu M, Ochani M, Amella CA, Tanovic M, Susarla S, Li JH, Wang H, Yang H, Ulloa L, Al-Abed Y, Czura CJ, Tracey KJ. Nicotinic acetylcholine receptor alpha7 subunit is an essential regulator of inflammation. Nature 2003;421:384-8.

80.

Bernik TR, Friedman SG, Ochani M, DiRaimo R, Ulloa L, Yang H, Sudan S, Czura CJ, Ivanova SM, Tracey KJ. Pharmacological stimulation of the cholinergic antiinflammatory pathway. J Exp Med 2002;195:781-8.

81.

Eckberg DL, Drabinsky M, Braunwald E. Defective cardiac parasympathetic control in patients with heart disease. N Engl J Med 1971;285:877-83.

82.

Ponikowski P, Anker SD, Chua TP, Szelemej R, Piepoli M, Adamopoulos S, Webb-Peploe K, Harrington D, Banasiak W, Wrabec K, Coats AJ. Depressed heart rate variability as an independent predictor of death in chronic congestive heart failure secondary to ischemic or idiopathic dilated cardiomyopathy. Am J Cardiol 1997;79:1645-50.

83.

Jankowska EA, Ponikowski P, Piepoli MF, Banasiak W, Anker SD, PooleWilson PA. Autonomic imbalance and immune activation in chronic heart failure - pathophysiological links. Cardiovasc Res 2006;70:434-45.

84.

Yndestad A, Damas JK, Oie E, Ueland T, Gullestad L, Aukrust P. Role of inflammation in the progression of heart failure. Curr Cardiol Rep 2007;9:23641.

85.

Heymans S, Hirsch E, Anker SD, Aukrust P, Balligand JL, Cohen-Tervaert JW, Drexler H, Filippatos G, Felix SB, Gullestad L, Hilfiker-Kleiner D, Janssens S, Latini R, Neubauer G, Paulus WJ, Pieske B, Ponikowski P, Schroen B, Schultheiss HP, Tschope C, Van Bilsen M, Zannad F, McMurray J, Shah AM. Inflammation as a therapeutic target in heart failure? A scientific statement from

104

the Translational Research Committee of the Heart Failure Association of the European Society of Cardiology. Eur J Heart Fail 2009;11:119-29. 86.

Aggarwal BB. Signalling pathways of the TNF superfamily: a double-edged sword. Nat Rev Immunol 2003;3:745-56.

87.

Vilcek J, Lee TH. Tumor necrosis factor. New insights into the molecular mechanisms of its multiple actions. J Biol Chem 1991;266:7313-6.

88.

Ruddle NH. Tumor necrosis factor (TNF-alpha) and lymphotoxin (TNF-beta). Curr Opin Immunol 1992;4:327-32.

89.

Kriegler M, Perez C, DeFay K, Albert I, Lu SD. A novel form of TNF/cachectin is a cell surface cytotoxic transmembrane protein: ramifications for the complex physiology of TNF. Cell 1988;53:45-53.

90.

Luettig B, Decker T, Lohmann-Matthes ML. Evidence for the existence of two forms of membrane tumor necrosis factor: an integral protein and a molecule attached to its receptor. J Immunol 1989;143:4034-8.

91.

Oliff A. The role of tumor necrosis factor (cachectin) in cachexia. Cell 1988;54:141-2.

92.

Tracey KJ, Fong Y, Hesse DG, Manogue KR, Lee AT, Kuo GC, Lowry SF, Cerami A. Anti-cachectin/TNF monoclonal antibodies prevent septic shock during lethal bacteraemia. Nature 1987;330:662-4.

93.

Waage A, Halstensen A, Espevik T. Association between tumour necrosis factor in serum and fatal outcome in patients with meningococcal disease. Lancet 1987;1:355-7.

94.

Pujol-Borrell R, Todd I, Doshi M, Bottazzo GF, Sutton R, Gray D, Adolf GR, Feldmann M. HLA class II induction in human islet cells by interferon-gamma plus tumour necrosis factor or lymphotoxin. Nature 1987;326:304-6.

95.

Sharief MK, Hentges R. Association between tumor necrosis factor-alpha and disease progression in patients with multiple sclerosis. N Engl J Med 1991;325:467-72.

96.

Kunkel SL, Strieter RM, Chensue SW, Campbell DA, Remick DG. The role of TNF in diverse pathologic processes. Biotherapy 1991;3:135-41.

105

97.

von Haehling S, Jankowska EA, Anker SD. Tumour necrosis factor-alpha and the failing heart--pathophysiology and therapeutic implications. Basic Res Cardiol 2004;99:18-28.

98.

Dembic Z, Loetscher H, Gubler U, Pan YC, Lahm HW, Gentz R, Brockhaus M, Lesslauer W. Two human TNF receptors have similar extracellular, but distinct intracellular, domain sequences. Cytokine 1990;2:231-7.

99.

Tartaglia LA, Goeddel DV. Two TNF receptors. Immunol Today 1992;13:1513.

100.

Hotamisligil GS, Arner P, Caro JF, Atkinson RL, Spiegelman BM. Increased adipose tissue expression of tumor necrosis factor-alpha in human obesity and insulin resistance. J Clin Invest 1995;95:2409-15.

101.

Mohamed-Ali V, Goodrick S, Bulmer K, Holly JM, Yudkin JS, Coppack SW. Production of soluble tumor necrosis factor receptors by human subcutaneous adipose tissue in vivo. Am J Physiol 1999;277:E971-5.

102.

Winzen R, Wallach D, Kemper O, Resch K, Holtmann H. Selective upregulation of the 75-kDa tumor necrosis factor (TNF) receptor and its mRNA by TNF and IL-1. J Immunol 1993;150:4346-53.

103.

Tannenbaum CS, Major JA, Hamilton TA. IFN-gamma and lipopolysaccharide differentially modulate expression of tumor necrosis factor receptor mRNA in murine peritoneal macrophages. J Immunol 1993;151:6833-9.

104.

Engelmann H, Novick D, Wallach D. Two tumor necrosis factor-binding proteins purified from human urine. Evidence for immunological crossreactivity with cell surface tumor necrosis factor receptors. J Biol Chem 1990;265:1531-6.

105.

Aderka D, Engelmann H, Shemer-Avni Y, Hornik V, Galil A, Sarov B, Wallach D. Variation in serum levels of the soluble TNF receptors among healthy individuals. Lymphokine Cytokine Res 1992;11:157-9.

106.

Aderka D, Engelmann H, Maor Y, Brakebusch C, Wallach D. Stabilization of the bioactivity of tumor necrosis factor by its soluble receptors. J Exp Med 1992;175:323-9.

107.

Sugita S, Takase H, Taguchi C, Mochizuki M. The role of soluble TNF receptors for TNF-alpha in uveitis. Invest Ophthalmol Vis Sci 2007;48:3246-52.

106

108.

Klimiuk PA, Sierakowski S, Latosiewicz R, Cylwik JP, Cylwik B, Skowronski J, Chwiecko J. Circulating tumour necrosis factor alpha and soluble tumour necrosis factor receptors in patients with different patterns of rheumatoid synovitis. Ann Rheum Dis 2003;62:472-5.

109.

Ferrari R, Bachetti T, Confortini R, Opasich C, Febo O, Corti A, Cassani G, Visioli O. Tumor necrosis factor soluble receptors in patients with various degrees of congestive heart failure. Circulation 1995;92:1479-86.

110.

Nozaki N, Yamaguchi S, Shirakabe M, Nakamura H, Tomoike H. Soluble tumor necrosis factor receptors are elevated in relation to severity of congestive heart failure. Jpn Circ J 1997;61:657-64.

111.

Testa M, Yeh M, Lee P, Fanelli R, Loperfido F, Berman JW, LeJemtel TH. Circulating levels of cytokines and their endogenous modulators in patients with mild to severe congestive heart failure due to coronary artery disease or hypertension. J Am Coll Cardiol 1996;28:964-71.

112.

Nozaki N, Yamaguchi S, Yamaoka M, Okuyama M, Nakamura H, Tomoike H. Enhanced expression and shedding of tumor necrosis factor (TNF) receptors from mononuclear leukocytes in human heart failure. J Mol Cell Cardiol 1998;30:2003-12.

113.

Gwechenberger M, Mendoza LH, Youker KA, Frangogiannis NG, Smith CW, Michael LH, Entman ML. Cardiac myocytes produce interleukin-6 in culture and in viable border zone of reperfused infarctions. Circulation 1999;99:546-51.

114.

Kaneko K, Kanda T, Yokoyama T, Nakazato Y, Iwasaki T, Kobayashi I, Nagai R. Expression of interleukin-6 in the ventricles and coronary arteries of patients with myocardial infarction. Res Commun Mol Pathol Pharmacol 1997;97:3-12.

115.

Kanda T, Takahashi T. Interleukin-6 and cardiovascular diseases. Jpn Heart J 2004;45:183-93.

116.

Verma S, Li SH, Badiwala MV, Weisel RD, Fedak PW, Li RK, Dhillon B, Mickle DA. Endothelin antagonism and interleukin-6 inhibition attenuate the proatherogenic effects of C-reactive protein. Circulation 2002;105:1890-6.

117.

Yudkin JS, Kumari M, Humphries SE, Mohamed-Ali V. Inflammation, obesity, stress and coronary heart disease: is interleukin-6 the link? Atherosclerosis 2000;148:209-14.

107

118.

van der Wal AC, Becker AE, van der Loos CM, Das PK. Site of intimal rupture or erosion of thrombosed coronary atherosclerotic plaques is characterized by an inflammatory process irrespective of the dominant plaque morphology. Circulation 1994;89:36-44.

119.

Rajavashisth TB, Xu XP, Jovinge S, Meisel S, Xu XO, Chai NN, Fishbein MC, Kaul S, Cercek B, Sharifi B, Shah PK. Membrane type 1 matrix metalloproteinase expression in human atherosclerotic plaques: evidence for activation by proinflammatory mediators. Circulation 1999;99:3103-9.

120.

Raymond RJ, Dehmer GJ, Theoharides TC, Deliargyris EN. Elevated interleukin-6 levels in patients with asymptomatic left ventricular systolic dysfunction. Am Heart J 2001;141:435-8.

121.

Tsutamoto T, Hisanaga T, Wada A, Maeda K, Ohnishi M, Fukai D, Mabuchi N, Sawaki M, Kinoshita M. Interleukin-6 spillover in the peripheral circulation increases with the severity of heart failure, and the high plasma level of interleukin-6 is an important prognostic predictor in patients with congestive heart failure. J Am Coll Cardiol 1998;31:391-8.

122.

Kubota T, Miyagishima M, Alvarez RJ, Kormos R, Rosenblum WD, Demetris AJ, Semigran MJ, Dec GW, Holubkov R, McTiernan CF, Mann DL, Feldman AM, McNamara DM. Expression of proinflammatory cytokines in the failing human heart: comparison of recent-onset and end-stage congestive heart failure. J Heart Lung Transplant 2000;19:819-24.

123.

Prabhu SD. Cytokine-induced modulation of cardiac function. Circ Res 2004;95:1140-53.

124.

Bozkurt B, Kribbs SB, Clubb FJ, Jr., Michael LH, Didenko VV, Hornsby PJ, Seta Y, Oral H, Spinale FG, Mann DL. Pathophysiologically relevant concentrations of tumor necrosis factor-alpha promote progressive left ventricular dysfunction and remodeling in rats. Circulation 1998;97:1382-91.

125.

Kumar A, Haery C, Parrillo JE. Myocardial dysfunction in septic shock. Crit Care Clin 2000;16:251-87.

126.

Hoesel LM, Niederbichler AD, Ward PA. Complement-related molecular events in sepsis leading to heart failure. Mol Immunol 2007;44:95-102.

108

127.

Jobe LJ, Melendez GC, Levick SP, Du Y, Brower GL, Janicki JS. TNF-alpha inhibition attenuates adverse myocardial remodeling in a rat model of volume overload. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2009;297:H1462-8.

128.

Wilson EM, Diwan A, Spinale FG, Mann DL. Duality of innate stress responses in cardiac injury, repair, and remodeling. J Mol Cell Cardiol 2004;37:801-11.

129.

Rutschow S, Li J, Schultheiss HP, Pauschinger M. Myocardial proteases and matrix remodeling in inflammatory heart disease. Cardiovasc Res 2006;69:64656.

130.

Bradham WS, Bozkurt B, Gunasinghe H, Mann D, Spinale FG. Tumor necrosis factor-alpha and myocardial remodeling in progression of heart failure: a current perspective. Cardiovasc Res 2002;53:822-30.

131.

Kang PM, Izumo S. Apoptosis in heart: basic mechanisms and implications in cardiovascular diseases. Trends Mol Med 2003;9:177-82.

132.

Kaur K, Sharma AK, Dhingra S, Singal PK. Interplay of TNF-alpha and IL-10 in regulating oxidative stress in isolated adult cardiac myocytes. J Mol Cell Cardiol 2006;41:1023-30.

133.

Okonko DO, Anker SD. Anemia in chronic heart failure: pathogenetic mechanisms. J Card Fail 2004;10:S5-9.

134.

Ganz T. Hepcidin in iron metabolism. Curr Opin Hematol 2004;11:251-4.

135.

Anker SD, Sharma R. The syndrome of cardiac cachexia. Int J Cardiol 2002;85:51-66.

136.

Sharma R, Anker SD. Cytokines, apoptosis and cachexia: the potential for TNF antagonism. Int J Cardiol 2002;85:161-71.

137.

Felker GM, Petersen JW, Mark DB. Natriuretic peptides in the diagnosis and management of heart failure. Cmaj 2006;175:611-7.

138.

Mukoyama M, Nakao K, Hosoda K, Suga S, Saito Y, Ogawa Y, Shirakami G, Jougasaki M, Obata K, Yasue H, et al. Brain natriuretic peptide as a novel cardiac hormone in humans. Evidence for an exquisite dual natriuretic peptide system, atrial natriuretic peptide and brain natriuretic peptide. J Clin Invest 1991;87:1402-12.

139.

Hobbs FD, Davis RC, Roalfe AK, Hare R, Davies MK, Kenkre JE. Reliability of N-terminal pro-brain natriuretic peptide assay in diagnosis of heart failure:

109

cohort study in representative and high risk community populations. Bmj 2002;324:1498. 140.

Kedzierski RM, Yanagisawa M. Endothelin system: the double-edged sword in health and disease. Annu Rev Pharmacol Toxicol 2001;41:851-76.

141.

Papassotiriou J, Morgenthaler NG, Struck J, Alonso C, Bergmann A. Immunoluminometric assay for measurement of the C-terminal endothelin-1 precursor fragment in human plasma. Clin Chem 2006;52:1144-51.

142.

Kuwaki T, Ling GY, Onodera M, Ishii T, Nakamura A, Ju KH, Cao WH, Kumada M, Kurihara H, Kurihara Y, Yazaki Y, Ohuchi T, Yanagisawa M, Fukuda Y. Endothelin in the central control of cardiovascular and respiratory functions. Clin Exp Pharmacol Physiol 1999;26:989-94.

143.

Fukuroda T, Fujikawa T, Ozaki S, Ishikawa K, Yano M, Nishikibe M. Clearance of circulating endothelin-1 by ETB receptors in rats. Biochem Biophys Res Commun 1994;199:1461-5.

144.

Luscher TF, Barton M. Endothelins and endothelin receptor antagonists: therapeutic considerations for a novel class of cardiovascular drugs. Circulation 2000;102:2434-40.

145.

Lipa JE, Neligan PC, Perreault TM, Baribeau J, Levine RH, Knowlton RJ, Pang CY. Vasoconstrictor effect of endothelin-1 in human skin: role of ETA and ETB receptors. Am J Physiol 1999;276:H359-67.

146.

Brunner F, Bras-Silva C, Cerdeira AS, Leite-Moreira AF. Cardiovascular endothelins: essential regulators of cardiovascular homeostasis. Pharmacol Ther 2006;111:508-31.

147.

Clouthier DE, Hosoda K, Richardson JA, Williams SC, Yanagisawa H, Kuwaki T, Kumada M, Hammer RE, Yanagisawa M. Cranial and cardiac neural crest defects in endothelin-A receptor-deficient mice. Development 1998;125:813-24.

148.

Dhaun N, Goddard J, Webb DJ. The endothelin system and its antagonism in chronic kidney disease. J Am Soc Nephrol 2006;17:943-55.

149.

Kirkby NS, Hadoke PW, Bagnall AJ, Webb DJ. The endothelin system as a therapeutic target in cardiovascular disease: great expectations or bleak house? Br J Pharmacol 2008;153:1105-19.

110

150.

Miyauchi T, Yanagisawa M, Tomizawa T, Sugishita Y, Suzuki N, Fujino M, Ajisaka R, Goto K, Masaki T. Increased plasma concentrations of endothelin-1 and big endothelin-1 in acute myocardial infarction. Lancet 1989;2:53-4.

151.

Omland T, Lie RT, Aakvaag A, Aarsland T, Dickstein K. Plasma endothelin determination as a prognostic indicator of 1-year mortality after acute myocardial infarction. Circulation 1994;89:1573-9.

152.

Wei CM, Lerman A, Rodeheffer RJ, McGregor CG, Brandt RR, Wright S, Heublein DM, Kao PC, Edwards WD, Burnett JC, Jr. Endothelin in human congestive heart failure. Circulation 1994;89:1580-6.

153.

Staniloae C, Dupuis J, White M, Gosselin G, Dyrda I, Bois M, Crepeau J, Bonan R, Caron A, Lavoie J. Reduced pulmonary clearance of endothelin in congestive heart failure: a marker of secondary pulmonary hypertension. J Card Fail 2004;10:427-32.

154.

Tsutamoto T, Hisanaga T, Fukai D, Wada A, Maeda Y, Maeda K, Kinoshita M. Prognostic value of plasma soluble intercellular adhesion molecule-1 and endothelin-1 concentration in patients with chronic congestive heart failure. Am J Cardiol 1995;76:803-8.

155.

Pousset F, Masson F, Chavirovskaia O, Isnard R, Carayon A, Golmard JL, Lechat P, Thomas D, Komajda M. Plasma adrenomedullin, a new independent predictor of prognosis in patients with chronic heart failure. Eur Heart J 2000;21:1009-14.

156.

Pacher R, Stanek B, Hulsmann M, Koller-Strametz J, Berger R, Schuller M, Hartter E, Ogris E, Frey B, Heinz G, Maurer G. Prognostic impact of big endothelin-1 plasma concentrations compared with invasive hemodynamic evaluation in severe heart failure. J Am Coll Cardiol 1996;27:633-41.

157.

Gardner RS, Chong V, Morton I, McDonagh TA. N-terminal brain natriuretic peptide is a more powerful predictor of mortality than endothelin-1, adrenomedullin and tumour necrosis factor-alpha in patients referred for consideration of cardiac transplantation. Eur J Heart Fail 2005;7:253-60.

158.

Adlbrecht C, Hulsmann M, Strunk G, Berger R, Mortl D, Struck J, Morgenthaler NG, Bergmann A, Jakowitsch J, Maurer G, Lang IM, Pacher R. Prognostic

111

value

of

plasma

midregional

pro-adrenomedullin

and

C-terminal-pro-

endothelin-1 in chronic heart failure outpatients. Eur J Heart Fail 2009. 159.

Barton M, Yanagisawa M. Endothelin: 20 years from discovery to therapy. Can J Physiol Pharmacol 2008;86:485-98.

160.

Kelland NF, Webb DJ. Clinical trials of endothelin antagonists in heart failure: a question of dose? Exp Biol Med (Maywood) 2006;231:696-9.

161.

Kitamura K, Kangawa K, Kawamoto M, Ichiki Y, Nakamura S, Matsuo H, Eto T. Adrenomedullin: a novel hypotensive peptide isolated from human pheochromocytoma. Biochem Biophys Res Commun 1993;192:553-60.

162.

Kitamura K, Sakata J, Kangawa K, Kojima M, Matsuo H, Eto T. Cloning and characterization of cDNA encoding a precursor for human adrenomedullin. Biochem Biophys Res Commun 1993;194:720-5.

163.

Li Y, Jiang C, Wang X, Zhang Y, Shibahara S, Takahashi K. Adrenomedullin is a novel adipokine: adrenomedullin in adipocytes and adipose tissues. Peptides 2007;28:1129-43.

164.

Marshall JC. Neutrophils in the pathogenesis of sepsis. Crit Care Med 2005;33:S502-5.

165.

Zudaire E, Portal-Nunez S, Cuttitta F. The central role of adrenomedullin in host defense. J Leukoc Biol 2006;80:237-44.

166.

Chosa E, Hamada H, Kitamura K, Eto T, Tajima N. Increased plasma and joint tissue adrenomedullin concentrations in patients with rheumatoid arthritis compared to those with osteoarthritis. J Rheumatol 2003;30:2553-6.

167.

Lopez J, Martinez A. Cell and molecular biology of the multifunctional peptide, adrenomedullin. Int Rev Cytol 2002;221:1-92.

168.

Sandner P, Hofbauer KH, Tinel H, Kurtz A, Thiesson HC, Ottosen PD, Walter S, Skott O, Jensen BL. Expression of adrenomedullin in hypoxic and ischemic rat kidneys and human kidneys with arterial stenosis. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2004;286:R942-51.

169.

Ishimitsu T, Ono H, Minami J, Matsuoka H. Pathophysiologic and therapeutic implications of adrenomedullin in cardiovascular disorders. Pharmacol Ther 2006;111:909-27.

112

170.

Sugo S, Minamino N, Shoji H, Kangawa K, Kitamura K, Eto T, Matsuo H. Interleukin-1, tumor necrosis factor and lipopolysaccharide additively stimulate production of adrenomedullin in vascular smooth muscle cells. Biochem Biophys Res Commun 1995;207:25-32.

171.

Hofbauer KH, Schoof E, Kurtz A, Sandner P. Inflammatory cytokines stimulate adrenomedullin expression through nitric oxide-dependent and -independent pathways. Hypertension 2002;39:161-7.

172.

Zudaire E, Martinez A, Garayoa M, Pio R, Kaur G, Woolhiser MR, Metcalfe DD, Hook WA, Siraganian RP, Guise TA, Chirgwin JM, Cuttitta F. Adrenomedullin is a cross-talk molecule that regulates tumor and mast cell function during human carcinogenesis. Am J Pathol 2006;168:280-91.

173.

Hirano S, Imamura T, Onitsuka H, Matsuo T, Kitamura K, Koiwaya Y, Eto T. Rapid increase in cardiac adrenomedullin gene expression caused by acute pressure overload: effect of the renin-angiotensin system on gene expression. Circ J 2002;66:397-402.

174.

Sugo S, Minamino N, Shoji H, Kangawa K, Matsuo H. Effects of vasoactive substances and cAMP related compounds on adrenomedullin production in cultured vascular smooth muscle cells. FEBS Lett 1995;369:311-4.

175.

Morgenthaler NG, Struck J, Alonso C, Bergmann A. Measurement of midregional proadrenomedullin in plasma with an immunoluminometric assay. Clin Chem 2005;51:1823-9.

176.

Hirata Y, Hayakawa H, Suzuki Y, Suzuki E, Ikenouchi H, Kohmoto O, Kimura K, Kitamura K, Eto T, Kangawa K, et al. Mechanisms of adrenomedullininduced vasodilation in the rat kidney. Hypertension 1995;25:790-5.

177.

Lainchbury JG, Troughton RW, Lewis LK, Yandle TG, Richards AM, Nicholls MG. Hemodynamic, hormonal, and renal effects of short-term adrenomedullin infusion in healthy volunteers. J Clin Endocrinol Metab 2000;85:1016-20.

178.

Ihara T, Ikeda U, Tate Y, Ishibashi S, Shimada K. Positive inotropic effects of adrenomedullin on rat papillary muscle. Eur J Pharmacol 2000;390:167-72.

179.

Jougasaki M, Aarhus LL, Heublein DM, Sandberg SM, Burnett JC, Jr. Role of prostaglandins and renal nerves in the renal actions of adrenomedullin. Am J Physiol 1997;272:F260-6.

113

180.

Shichiri M, Fukai N, Ozawa N, Iwasaki H, Hirata Y. Adrenomedullin is an autocrine/paracrine growth factor for rat vascular smooth muscle cells. Regul Pept 2003;112:167-73.

181.

Kato H, Shichiri M, Marumo F, Hirata Y. Adrenomedullin as an autocrine/paracrine apoptosis survival factor for rat endothelial cells. Endocrinology 1997;138:2615-20.

182.

Shimosawa T, Shibagaki Y, Ishibashi K, Kitamura K, Kangawa K, Kato S, Ando K, Fujita T. Adrenomedullin, an endogenous peptide, counteracts cardiovascular damage. Circulation 2002;105:106-11.

183.

Martinez A, Weaver C, Lopez J, Bhathena SJ, Elsasser TH, Miller MJ, Moody TW, Unsworth EJ, Cuttitta F. Regulation of insulin secretion and blood glucose metabolism by adrenomedullin. Endocrinology 1996;137:2626-32.

184.

Pio R, Martinez A, Unsworth EJ, Kowalak JA, Bengoechea JA, Zipfel PF, Elsasser TH, Cuttitta F. Complement factor H is a serum-binding protein for adrenomedullin, and the resulting complex modulates the bioactivities of both partners. J Biol Chem 2001;276:12292-300.

185.

Martinez A, Oh HR, Unsworth EJ, Bregonzio C, Saavedra JM, StetlerStevenson

WG,

Cuttitta

F.

Matrix

metalloproteinase-2

cleavage

of

adrenomedullin produces a vasoconstrictor out of a vasodilator. Biochem J 2004;383:413-8. 186.

Allaker RP, Zihni C, Kapas S. An investigation into the antimicrobial effects of adrenomedullin on members of the skin, oral, respiratory tract and gut microflora. FEMS Immunol Med Microbiol 1999;23:289-93.

187.

McLachlan JL, Smith AJ, Bujalska IJ, Cooper PR. Gene expression profiling of pulpal tissue reveals the molecular complexity of dental caries. Biochim Biophys Acta 2005;1741:271-81.

188.

Wong LY, Cheung BM, Li YY, Tang F. Adrenomedullin is both proinflammatory and antiinflammatory: its effects on gene expression and secretion of cytokines and macrophage migration inhibitory factor in NR8383 macrophage cell line. Endocrinology 2005;146:1321-7.

114

189.

Kohno M, Hanehira T, Kano H, Horio T, Yokokawa K, Ikeda M, Minami M, Yasunari K, Yoshikawa J. Plasma adrenomedullin concentrations in essential hypertension. Hypertension 1996;27:102-7.

190.

Ishimitsu T, Nishikimi T, Saito Y, Kitamura K, Eto T, Kangawa K, Matsuo H, Omae T, Matsuoka H. Plasma levels of adrenomedullin, a newly identified hypotensive peptide, in patients with hypertension and renal failure. J Clin Invest 1994;94:2158-61.

191.

Nagaya N, Okumura H, Uematsu M, Shimizu W, Ono F, Shirai M, Mori H, Miyatake K, Kangawa K. Repeated inhalation of adrenomedullin ameliorates pulmonary hypertension and survival in monocrotaline rats. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2003;285:H2125-31.

192.

Yoshitomi Y, Nishikimi T, Kojima S, Kuramochi M, Takishita S, Matsuoka H, Miyata A, Matsuo H, Kangawa K. Plasma levels of adrenomedullin in patients with acute myocardial infarction. Clin Sci (Lond) 1998;94:135-9.

193.

Miyao Y, Nishikimi T, Goto Y, Miyazaki S, Daikoku S, Morii I, Matsumoto T, Takishita S, Miyata A, Matsuo H, Kangawa K, Nonogi H. Increased plasma adrenomedullin levels in patients with acute myocardial infarction in proportion to the clinical severity. Heart 1998;79:39-44.

194.

Katayama T, Nakashima H, Furudono S, Honda Y, Suzuki S, Yano K. Evaluation of neurohumoral activation (adrenomedullin, BNP, catecholamines, etc.) in patients with acute myocardial infarction. Intern Med 2004;43:1015-22.

195.

Khan SQ, O'Brien RJ, Struck J, Quinn P, Morgenthaler N, Squire I, Davies J, Bergmann A, Ng LL. Prognostic value of midregional pro-adrenomedullin in patients with acute myocardial infarction: the LAMP (Leicester Acute Myocardial Infarction Peptide) study. J Am Coll Cardiol 2007;49:1525-32.

196.

Hosomi N, Ohyama H, Takahashi T, Shinomiya K, Naya T, Ban CR, Osaka K, Kohno M, Koziol JA. Plasma adrenomedullin and carotid atherosclerosis in atherothrombotic ischemic stroke. J Hypertens 2004;22:1945-51.

197.

Shinomiya K, Ohmori K, Ohyama H, Hosomi N, Takahashi T, Osaka K, Kohno M. Association of plasma adrenomedullin with carotid atherosclerosis in chronic ischemic stroke. Peptides 2001;22:1873-80.

115

198.

Suzuki Y, Horio T, Hayashi T, Nonogi H, Kitamura K, Eto T, Kangawa K, Kawano Y. Plasma adrenomedullin concentration is increased in patients with peripheral arterial occlusive disease associated with vascular inflammation. Regul Pept 2004;118:99-104.

199.

Nishida H, Horio T, Suzuki Y, Iwashima Y, Kamide K, Kangawa K, Kawano Y. Plasma adrenomedullin as an independent predictor of future cardiovascular events in high-risk patients: comparison with C-reactive protein and adiponectin. Peptides 2008;29:599-605.

200.

Jougasaki M, Wei CM, McKinley LJ, Burnett JC, Jr. Elevation of circulating and ventricular adrenomedullin in human congestive heart failure. Circulation 1995;92:286-9.

201.

Etoh T, Kato J, Takenaga M, Imamura T, Kitamura K, Koiwaya Y, Eto T. Differential hormonal profiles of adrenomedullin and proadrenomedullin Nterminal 20 peptide in patients with heart failure and effect of treatment on their plasma levels. Clin Cardiol 1999;22:113-7.

202.

Hirayama N, Kitamura K, Imamura T, Kato J, Koiwaya Y, Tsuji T, Kangawa K, Eto T. Molecular forms of circulating adrenomedullin in patients with congestive heart failure. J Endocrinol 1999;160:297-303.

203.

Nishikimi T, Saito Y, Kitamura K, Ishimitsu T, Eto T, Kangawa K, Matsuo H, Omae T, Matsuoka H. Increased plasma levels of adrenomedullin in patients with heart failure. J Am Coll Cardiol 1995;26:1424-31.

204.

Kato J, Kobayashi K, Etoh T, Tanaka M, Kitamura K, Imamura T, Koiwaya Y, Kangawa K, Eto T. Plasma adrenomedullin concentration in patients with heart failure. J Clin Endocrinol Metab 1996;81:180-3.

205.

Kobayashi K, Kitamura K, Etoh T, Nagatomo Y, Takenaga M, Ishikawa T, Imamura T, Koiwaya Y, Eto T. Increased plasma adrenomedullin levels in chronic congestive heart failure. Am Heart J 1996;131:994-8.

206.

Gegenhuber A, Struck J, Dieplinger B, Poelz W, Pacher R, Morgenthaler NG, Bergmann A, Haltmayer M, Mueller T. Comparative evaluation of B-type natriuretic peptide, mid-regional pro-A-type natriuretic peptide, mid-regional pro-adrenomedullin, and Copeptin to predict 1-year mortality in patients with acute destabilized heart failure. J Card Fail 2007;13:42-9.

116

207.

Rademaker MT, Cameron VA, Charles CJ, Lainchbury JG, Nicholls MG, Richards AM. Adrenomedullin and heart failure. Regul Pept 2003;112:51-60.

208.

Nishikimi T, Shibasaki I, Iida H, Asakawa H, Matsushita Y, Mori H, Mochizuki Y, Okamura Y, Horinaka S, Kangawa K, Shimada K, Matsuoka H. Molecular forms of adrenomedullin in pericardial fluid and plasma in patients with ischaemic heart disease. Clin Sci (Lond) 2002;102:669-77.

209.

Richards AM, Doughty R, Nicholls MG, MacMahon S, Sharpe N, Murphy J, Espiner EA, Frampton C, Yandle TG. Plasma N-terminal pro-brain natriuretic peptide and adrenomedullin: prognostic utility and prediction of benefit from carvedilol in chronic ischemic left ventricular dysfunction. Australia-New Zealand Heart Failure Group. J Am Coll Cardiol 2001;37:1781-7.

210.

Anker SD. Midregional pro-Adrenomedullin (proADM) vs BNP and NTproBNP as Prognosticator in Heart Failure Patients: Results of the BACH Multinational Trial. American Heart Association, Scientific Sessions 2008 2008;2008. nov. 11.

211.

Meeran K, O'Shea D, Upton PD, Small CJ, Ghatei MA, Byfield PH, Bloom SR. Circulating adrenomedullin does not regulate systemic blood pressure but increases

plasma prolactin after intravenous

infusion

in

humans:

a

pharmacokinetic study. J Clin Endocrinol Metab 1997;82:95-100. 212.

Troughton RW, Lewis LK, Yandle TG, Richards AM, Nicholls MG. Hemodynamic, hormone, and urinary effects of adrenomedullin infusion in essential hypertension. Hypertension 2000;36:588-93.

213.

Lisy O, Jougasaki M, Schirger JA, Chen HH, Barclay PT, Burnett JC, Jr. Neutral endopeptidase inhibition potentiates the natriuretic actions of adrenomedullin. Am J Physiol 1998;275:F410-4.

214.

Burnett JC, Jr. Vasopeptidase inhibition: a new concept in blood pressure management. J Hypertens Suppl 1999;17:S37-43.

215.

Kostis JB, Packer M, Black HR, Schmieder R, Henry D, Levy E. Omapatrilat and enalapril in patients with hypertension: the Omapatrilat Cardiovascular Treatment vs. Enalapril (OCTAVE) trial. Am J Hypertens 2004;17:103-11.

216.

Packer M, Califf RM, Konstam MA, Krum H, McMurray JJ, Rouleau JL, Swedberg K. Comparison of omapatrilat and enalapril in patients with chronic

117

heart failure: the Omapatrilat Versus Enalapril Randomized Trial of Utility in Reducing Events (OVERTURE). Circulation 2002;106:920-6. 217.

Zanchi A, Maillard M, Burnier M. Recent clinical trials with omapatrilat: new developments. Curr Hypertens Rep 2003;5:346-52.

218.

Welch WJ. How cells respond to stress. Sci Am 1993;268:56-64.

219.

Prohaszka Z, Fust G. Immunological aspects of heat-shock proteins-the optimum stress of life. Mol Immunol 2004;41:29-44.

220.

Kiang JG, Tsokos GC. Heat shock protein 70 kDa: molecular biology, biochemistry, and physiology. Pharmacol Ther 1998;80:183-201.

221.

Tavaria M, Gabriele T, Kola I, Anderson RL. A hitchhiker's guide to the human Hsp70 family. Cell Stress Chaperones 1996;1:23-8.

222.

Zhou F, Wang F, Li F, Yuan J, Zeng H, Wei Q, Tanguay RM, Wu T. Association of hsp70-2 and hsp-hom gene polymorphisms with risk of acute high-altitude illness in a Chinese population. Cell Stress Chaperones 2005;10:349-56.

223.

Pociot F, Ronningen KS, Nerup J. Polymorphic analysis of the human MHClinked heat shock protein 70 (HSP70-2) and HSP70-Hom genes in insulindependent diabetes mellitus (IDDM). Scand J Immunol 1993;38:491-5.

224.

Schroeder S, Reck M, Lehmann LE, Book M, Hoeft A, Stuber F. The Pstl polymorphism of the endotoxin-inducible heat-shock protein 70-2 gene does not affect messenger RNA level in human whole-blood cultures. Intensive Care Med 2000;26:1139-43.

225.

Giacconi R, Caruso C, Lio D, Muti E, Cipriano C, Saba V, Boccoli G, Gasparini N, Malavolta M, Mocchegiani E. 1267 HSP70-2 polymorphism as a risk factor for carotid plaque rupture and cerebral ischaemia in old type 2 diabetesatherosclerotic patients. Mech Ageing Dev 2005;126:866-73.

226.

Kiszel P, Kovacs M, Szalai C, Yang Y, Pozsonyi E, Blasko B, Laki J, Prohaszka Z, Fazakas A, Panczel P, Hosszufalusi N, Rajczy K, Wu YL, Chung EK, Zhou B, Blanchong CA, Vatay A, Yu CY, Fust G. Frequency of carriers of 8.1 ancestral haplotype and its fragments in two Caucasian populations. Immunol Invest 2007;36:307-19.

118

227.

Caruso C, Candore G, Colonna Romano G, Lio D, Bonafe M, Valensin S, Franceschi C. HLA, aging, and longevity: a critical reappraisal. Hum Immunol 2000;61:942-9.

228.

Dawkins RL, Christiansen FT, Kay PH, Garlepp M, McCluskey J, Hollingsworth PN, Zilko PJ. Disease associations with complotypes, supratypes and haplotypes. Immunol Rev 1983;70:1-22.

229.

Smerdel-Ramoya A, Finholt C, Lilleby V, Gilboe IM, Harbo HF, Maslinski S, Forre O, Thorsby E, Lie BA. Systemic lupus erythematosus and the extended major histocompatibility complex--evidence for several predisposing loci. Rheumatology (Oxford) 2005;44:1368-73.

230.

Laki J, Laki I, Nemeth K, Ujhelyi R, Bede O, Endreffy E, Bolbas K, Gyurkovits K, Csiszer E, Solyom E, Dobra G, Halasz A, Pozsonyi E, Rajczy K, Prohaszka Z, Fekete G, Fust G. The 8.1 ancestral MHC haplotype is associated with delayed onset of colonization in cystic fibrosis. Int Immunol 2006;18:1585-90.

231.

Toth EK, Kocsis J, Madaras B, Biro A, Pocsai Z, Fust G, Blasko B, Karadi I, Adany R, Laki J. The 8.1 ancestral MHC haplotype is strongly associated with colorectal cancer risk. Int J Cancer 2007;121:1744-8.

232.

Esaki M, Furuse M, Matsumoto T, Aoyagi K, Jo Y, Yamagata H, Nakano H, Fujishima M. Polymorphism of heat-shock protein gene HSP70-2 in Crohn disease: possible genetic marker for two forms of Crohn disease. Scand J Gastroenterol 1999;34:703-7.

233.

Debler J, Schiemann U, Seybold U, Mussack T, Landauer N, Ladurner R, Gross M. Heat-shock protein HSP70-2 genotypes in patients with Crohn's disease: a more severe clinical course with intestinal complications in presence of the PstIpolymorphism. Eur J Med Res 2003;8:120-4.

234.

Klausz G, Molnar T, Nagy F, Gyulai Z, Boda K, Lonovics J, Mandi Y. Polymorphism of the heat-shock protein gene Hsp70-2, but not polymorphisms of the IL-10 and CD14 genes, is associated with the outcome of Crohn's disease. Scand J Gastroenterol 2005;40:1197-204.

235.

Balog A, Gyulai Z, Boros LG, Farkas G, Takacs T, Lonovics J, Mandi Y. Polymorphism of the TNF-alpha, HSP70-2, and CD14 genes increases susceptibility to severe acute pancreatitis. Pancreas 2005;30:e46-50.

119

236.

Buraczynska M, Swatowski A, Buraczynska K, Dragan M, Ksiazek A. Heatshock protein gene polymorphisms and the risk of nephropathy in patients with Type 2 diabetes. Clin Sci (Lond) 2009;116:81-6.

237.

Giacconi R, Cipriano C, Muti E, Costarelli L, Malavolta M, Caruso C, Lio D, Mocchegiani E. Involvement of -308 TNF-alpha and 1267 Hsp70-2 polymorphisms and zinc status in the susceptibility of coronary artery disease (CAD) in old patients. Biogerontology 2006;7:347-56.

238.

Sfar S, Saad H, Mosbah F, Chouchane L. Association of HSP70-hom genetic variant with prostate cancer risk. Mol Biol Rep 2008;35:459-64.

239.

Aron Y, Busson M, Polla BS, Dusser D, Lockhart A, Swierczewski E, Favatier F. Analysis of hsp70 gene polymorphism in allergic asthma. Allergy 1999;54:165-70.

240.

Schroder O, Schulte KM, Ostermann P, Roher HD, Ekkernkamp A, Laun RA. Heat shock protein 70 genotypes HSPA1B and HSPA1L influence cytokine concentrations and interfere with outcome after major injury. Crit Care Med 2003;31:73-9.

241.

Bogunia-Kubik K, Koscinska K, Suchnicki K, Lange A. HSP70-hom gene single nucleotide (+2763 G/A and +2437 C/T) polymorphisms in sarcoidosis. Int J Immunogenet 2006;33:135-40.

242.

Vinasco J, Beraun Y, Nieto A, Fraile A, Pareja E, Mataran L, Martin J. Heat shock protein 70 gene polymorphisms in rheumatoid arthritis. Tissue Antigens 1997;50:71-3.

243.

Westman P, Partanen J, Leirisalo-Repo M, Koskimies S. HSP70-Hom NcoI polymorphism and HLA-associations in the Finnish population and in patients with ankylosing spondylitis or reactive arthritis. Eur J Immunogenet 1994;21:81-90.

244.

Zee RY, Bates D, Ridker PM. A prospective evaluation of the heat shock protein 70 gene polymorphisms and the risk of stroke. Thromb Haemost 2002;87:622-5.

245.

Pae CU, Kim TS, Kwon OJ, Artioli P, Serretti A, Lee CU, Lee SJ, Lee C, Paik IH, Kim JJ. Polymorphisms of heat shock protein 70 gene (HSPA1A, HSPA1B and HSPA1L) and schizophrenia. Neurosci Res 2005;53:8-13.

120

246.

Wu YR, Wang CK, Chen CM, Hsu Y, Lin SJ, Lin YY, Fung HC, Chang KH, Lee-Chen GJ. Analysis of heat-shock protein 70 gene polymorphisms and the risk of Parkinson's disease. Hum Genet 2004;114:236-41.

247.

Bukau B, Horwich AL. The Hsp70 and Hsp60 chaperone machines. Cell 1998;92:351-66.

248.

Nollen EA, Morimoto RI. Chaperoning signaling pathways: molecular chaperones as stress-sensing 'heat shock' proteins. J Cell Sci 2002;115:2809-16.

249.

Pratt WB, Toft DO. Regulation of signaling protein function and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery. Exp Biol Med (Maywood) 2003;228:111-33.

250.

Wand-Wurttenberger A, Schoel B, Ivanyi J, Kaufmann SH. Surface expression by mononuclear phagocytes of an epitope shared with mycobacterial heat shock protein 60. Eur J Immunol 1991;21:1089-92.

251.

Di Cesare S, Poccia F, Mastino A, Colizzi V. Surface expressed heat-shock proteins by stressed or human immunodeficiency virus (HIV)-infected lymphoid cells represent the target for antibody-dependent cellular cytotoxicity. Immunology 1992;76:341-3.

252.

Multhoff G, Hightower LE. Cell surface expression of heat shock proteins and the immune response. Cell Stress Chaperones 1996;1:167-76.

253.

Bassan M, Zamostiano R, Giladi E, Davidson A, Wollman Y, Pitman J, Hauser J, Brenneman DE, Gozes I. The identification of secreted heat shock 60 -like protein from rat glial cells and a human neuroblastoma cell line. Neurosci Lett 1998;250:37-40.

254.

Child DF, Williams CP, Jones RP, Hudson PR, Jones M, Smith CJ. Heat shock protein studies in type 1 and type 2 diabetes and human islet cell culture. Diabet Med 1995;12:595-9.

255.

Liao DF, Jin ZG, Baas AS, Daum G, Gygi SP, Aebersold R, Berk BC. Purification and identification of secreted oxidative stress-induced factors from vascular smooth muscle cells. J Biol Chem 2000;275:189-96.

256.

Pockley AG, Shepherd J, Corton JM. Detection of heat shock protein 70 (Hsp70) and anti-Hsp70 antibodies in the serum of normal individuals. Immunol Invest 1998;27:367-77.

121

257.

Pockley AG, Bulmer J, Hanks BM, Wright BH. Identification of human heat shock protein 60 (Hsp60) and anti-Hsp60 antibodies in the peripheral circulation of normal individuals. Cell Stress Chaperones 1999;4:29-35.

258.

Basu S, Binder RJ, Suto R, Anderson KM, Srivastava PK. Necrotic but not apoptotic cell death releases heat shock proteins, which deliver a partial maturation signal to dendritic cells and activate the NF-kappa B pathway. Int Immunol 2000;12:1539-46.

259.

Mathew A, Bell A, Johnstone RM. Hsp-70 is closely associated with the transferrin receptor in exosomes from maturing reticulocytes. Biochem J 1995;308 ( Pt 3):823-30.

260.

Bausero MA, Gastpar R, Multhoff G, Asea A. Alternative mechanism by which IFN-gamma enhances tumor recognition: active release of heat shock protein 72. J Immunol 2005;175:2900-12.

261.

Broquet AH, Thomas G, Masliah J, Trugnan G, Bachelet M. Expression of the molecular chaperone Hsp70 in detergent-resistant microdomains correlates with its membrane delivery and release. J Biol Chem 2003;278:21601-6.

262.

Pockley AG. Heat shock proteins as regulators of the immune response. Lancet 2003;362:469-76.

263.

Panjwani NN, Popova L, Srivastava PK. Heat shock proteins gp96 and hsp70 activate the release of nitric oxide by APCs. J Immunol 2002;168:2997-3003.

264.

Asea A. Stress proteins and initiation of immune response: chaperokine activity of hsp72. Exerc Immunol Rev 2005;11:34-45.

265.

Asea A. Hsp70: a chaperokine. Novartis Found Symp 2008;291:173-9; discussion 179-83, 221-4.

266.

Wang Y, Kelly CG, Singh M, McGowan EG, Carrara AS, Bergmeier LA, Lehner T. Stimulation of Th1-polarizing cytokines, C-C chemokines, maturation of dendritic cells, and adjuvant function by the peptide binding fragment of heat shock protein 70. J Immunol 2002;169:2422-9.

267.

Gastpar R, Gehrmann M, Bausero MA, Asea A, Gross C, Schroeder JA, Multhoff G. Heat shock protein 70 surface-positive tumor exosomes stimulate migratory and cytolytic activity of natural killer cells. Cancer Res 2005;65:523847.

122

268.

Prohaszka Z, Singh M, Nagy K, Kiss E, Lakos G, Duba J, Fust G. Heat shock protein 70 is a potent activator of the human complement system. Cell Stress Chaperones 2002;7:17-22.

269.

Lamb JR, Bal V, Mendez-Samperio P, Mehlert A, So A, Rothbard J, Jindal S, Young RA, Young DB. Stress proteins may provide a link between the immune response to infection and autoimmunity. Int Immunol 1989;1:191-6.

270.

Fehrenbach E, Niess AM, Voelker K, Northoff H, Mooren FC. Exercise intensity and duration affect blood soluble HSP72. Int J Sports Med 2005;26:552-7.

271.

Febbraio MA, Ott P, Nielsen HB, Steensberg A, Keller C, Krustrup P, Secher NH, Pedersen BK. Exercise induces hepatosplanchnic release of heat shock protein 72 in humans. J Physiol 2002;544:957-62.

272.

Flohe SB, Bangen JM, Flohe S, Agrawal H, Bergmann K, Schade FU. Origin of immunomodulation after soft tissue trauma: potential involvement of extracellular heat-shock proteins. Shock 2007;27:494-502.

273.

Pittet JF, Lee H, Morabito D, Howard MB, Welch WJ, Mackersie RC. Serum levels of Hsp 72 measured early after trauma correlate with survival. J Trauma 2002;52:611-7; discussion 617.

274.

Wright BH, Corton JM, El-Nahas AM, Wood RF, Pockley AG. Elevated levels of circulating heat shock protein 70 (Hsp70) in peripheral and renal vascular disease. Heart Vessels 2000;15:18-22.

275.

Satoh M, Shimoda Y, Maesawa C, Akatsu T, Ishikawa Y, Minami Y, Hiramori K, Nakamura M. Activated toll-like receptor 4 in monocytes is associated with heart failure after acute myocardial infarction. Int J Cardiol 2006;109:226-34.

276.

Dybdahl B, Slordahl SA, Waage A, Kierulf P, Espevik T, Sundan A. Myocardial ischaemia and the inflammatory response: release of heat shock protein 70 after myocardial infarction. Heart 2005;91:299-304.

277.

Dybdahl B, Wahba A, Lien E, Flo TH, Waage A, Qureshi N, Sellevold OF, Espevik T, Sundan A. Inflammatory response after open heart surgery: release of heat-shock protein 70 and signaling through toll-like receptor-4. Circulation 2002;105:685-90.

123

278.

Madach K, Molvarec A, Rigo J, Jr., Nagy B, Penzes I, Karadi I, Prohaszka Z. Elevated serum 70 kDa heat shock protein level reflects tissue damage and disease severity in the syndrome of hemolysis, elevated liver enzymes, and low platelet count. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 2008;139:133-8.

279.

Genth-Zotz S, Bolger AP, Kalra PR, von Haehling S, Doehner W, Coats AJ, Volk HD, Anker SD. Heat shock protein 70 in patients with chronic heart failure: relation to disease severity and survival. Int J Cardiol 2004;96:397-401.

280.

Griffith GC, Stragnell R, Levinson DC, Moore FJ, Ware AG. A study of the beneficial effects of anticoagulant therapy in congestive heart failure. Ann Intern Med 1952;37:867-87.

281.

Dunkman WB, Johnson GR, Carson PE, Bhat G, Farrell L, Cohn JN. Incidence of thromboembolic events in congestive heart failure. The V-HeFT VA Cooperative Studies Group. Circulation 1993;87:VI94-101.

282.

Lip GY. Intracardiac thrombus formation in cardiac impairment: the role of anticoagulant therapy. Postgrad Med J 1996;72:731-8.

283.

Loh E, Sutton MS, Wun CC, Rouleau JL, Flaker GC, Gottlieb SS, Lamas GA, Moye LA, Goldhaber SZ, Pfeffer MA. Ventricular dysfunction and the risk of stroke after myocardial infarction. N Engl J Med 1997;336:251-7.

284.

Narang R, Cleland JG, Erhardt L, Ball SG, Coats AJ, Cowley AJ, Dargie HJ, Hall AS, Hampton JR, Poole-Wilson PA. Mode of death in chronic heart failure. A request and proposition for more accurate classification. Eur Heart J 1996;17:1390-403.

285.

Cleland JG. Anticoagulant and antiplatelet therapy in heart failure. Curr Opin Cardiol 1997;12:276-87.

286.

Chong AY, Freestone B, Patel J, Lim HS, Hughes E, Blann AD, Lip GY. Endothelial activation, dysfunction, and damage in congestive heart failure and the relation to brain natriuretic peptide and outcomes. Am J Cardiol 2006;97:671-5.

287.

Lip GY, Pearce LA, Chin BS, Conway DS, Hart RG. Effects of congestive heart failure on plasma von Willebrand factor and soluble P-selectin concentrations in patients with non-valvar atrial fibrillation. Heart 2005;91:759-63.

124

288.

Vila V, Martinez-Sales V, Almenar L, Lazaro IS, Villa P, Reganon E. Inflammation, endothelial dysfunction and angiogenesis markers in chronic heart failure patients. Int J Cardiol 2008;130:276-7.

289.

Sbarouni E, Bradshaw A, Andreotti F, Tuddenham E, Oakley CM, Cleland JG. Relationship between hemostatic abnormalities and neuroendocrine activity in heart failure. Am Heart J 1994;127:607-12.

290.

Jafri SM, Ozawa T, Mammen E, Levine TB, Johnson C, Goldstein S. Platelet function, thrombin and fibrinolytic activity in patients with heart failure. Eur Heart J 1993;14:205-12.

291.

Mastroroberto P, Chello M, Perticone F. Elevated circulating levels of von Willebrand factor and D-dimer in patients with heart failure and mechanical prosthesis. Scand J Thorac Cardiovasc Surg 1996;30:77-81.

292.

Reininger AJ. Function of von Willebrand factor in haemostasis and thrombosis. Haemophilia 2008;14 Suppl 5:11-26.

293.

Zimmerman TS, Ratnoff OD, Powell AE. Immunologic differentiation of classic hemophilia (factor 8 deficiency) and von Willebrand's dissase, with observations on combined deficiencies of antihemophilic factor and proaccelerin (factor V) and on an acquired circulating anticoagulant against antihemophilic factor. J Clin Invest 1971;50:244-54.

294.

Ginsburg D, Handin RI, Bonthron DT, Donlon TA, Bruns GA, Latt SA, Orkin SH. Human von Willebrand factor (vWF): isolation of complementary DNA (cDNA) clones and chromosomal localization. Science 1985;228:1401-6.

295.

Weibel ER, Palade GE. New Cytoplasmic Components in Arterial Endothelia. J Cell Biol 1964;23:101-12.

296.

Mayadas T, Wagner DD, Simpson PJ. von Willebrand factor biosynthesis and partitioning between constitutive and regulated pathways of secretion after thrombin stimulation. Blood 1989;73:706-11.

297.

Ribes JA, Francis CW, Wagner DD. Fibrin induces release of von Willebrand factor from endothelial cells. J Clin Invest 1987;79:117-23.

298.

Mayadas TN, Wagner DD. von Willebrand factor biosynthesis and processing. Ann N Y Acad Sci 1991;614:153-66.

125

299.

Harrison RL, McKee PA. Estrogen stimulates von Willebrand factor production by cultured endothelial cells. Blood 1984;63:657-64.

300.

Gralnick HR, McKeown LP, Wilson OM, Williams SB, Elin RJ. von Willebrand factor release induced by endotoxin. J Lab Clin Med 1989;113:118-22.

301.

Hattori R, Hamilton KK, McEver RP, Sims PJ. Complement proteins C5b-9 induce secretion of high molecular weight multimers of endothelial von Willebrand factor and translocation of granule membrane protein GMP-140 to the cell surface. J Biol Chem 1989;264:9053-60.

302.

Wencel-Drake JD, Painter RG, Zimmerman TS, Ginsberg MH. Ultrastructural localization of human platelet thrombospondin, fibrinogen, fibronectin, and von Willebrand factor in frozen thin section. Blood 1985;65:929-38.

303.

Koutts J, Walsh PN, Plow EF, Fenton JW, 2nd, Bouma BN, Zimmerman TS. Active release of human platelet factor VIII-related antigen by adenosine diphosphate, collagen, and thrombin. J Clin Invest 1978;62:1255-63.

304.

Fowler WE, Fretto LJ, Hamilton KK, Erickson HP, McKee PA. Substructure of human von Willebrand factor. J Clin Invest 1985;76:1491-500.

305.

Arya M, Anvari B, Romo GM, Cruz MA, Dong JF, McIntire LV, Moake JL, Lopez JA. Ultralarge multimers of von Willebrand factor form spontaneous high-strength bonds with the platelet glycoprotein Ib-IX complex: studies using optical tweezers. Blood 2002;99:3971-7.

306.

Tsai HM, Nagel RL, Hatcher VB, Sussman, II. Multimeric composition of endothelial cell-derived von Willebrand factor. Blood 1989;73:2074-6.

307.

Moake JL, Rudy CK, Troll JH, Weinstein MJ, Colannino NM, Azocar J, Seder RH, Hong SL, Deykin D. Unusually large plasma factor VIII:von Willebrand factor multimers in chronic relapsing thrombotic thrombocytopenic purpura. N Engl J Med 1982;307:1432-5.

308.

Fernandez MF, Ginsberg MH, Ruggeri ZM, Batlle FJ, Zimmerman TS. Multimeric structure of platelet factor VIII/von Willebrand factor: the presence of larger multimers and their reassociation with thrombin-stimulated platelets. Blood 1982;60:1132-8.

309.

Moake JL, Turner NA, Stathopoulos NA, Nolasco LH, Hellums JD. Involvement of large plasma von Willebrand factor (vWF) multimers and

126

unusually large vWF forms derived from endothelial cells in shear stressinduced platelet aggregation. J Clin Invest 1986;78:1456-61. 310.

Soejima K, Mimura N, Hirashima M, Maeda H, Hamamoto T, Nakagaki T, Nozaki C. A novel human metalloprotease synthesized in the liver and secreted into the blood: possibly, the von Willebrand factor-cleaving protease? J Biochem 2001;130:475-80.

311.

Turner N, Nolasco L, Tao Z, Dong JF, Moake J. Human endothelial cells synthesize and release ADAMTS-13. J Thromb Haemost 2006;4:1396-404.

312.

Padilla A, Moake JL, Bernardo A, Ball C, Wang Y, Arya M, Nolasco L, Turner N, Berndt MC, Anvari B, Lopez JA, Dong JF. P-selectin anchors newly released ultralarge von Willebrand factor multimers to the endothelial cell surface. Blood 2004;103:2150-6.

313.

Moake JL. Thrombotic microangiopathies. N Engl J Med 2002;347:589-600.

314.

Vischer UM. von Willebrand factor, endothelial dysfunction, and cardiovascular disease. J Thromb Haemost 2006;4:1186-93.

315.

Danesh J, Wheeler JG, Hirschfield GM, Eda S, Eiriksdottir G, Rumley A, Lowe GD, Pepys MB, Gudnason V. C-reactive protein and other circulating markers of inflammation in the prediction of coronary heart disease. N Engl J Med 2004;350:1387-97.

316.

Morange PE, Simon C, Alessi MC, Luc G, Arveiler D, Ferrieres J, Amouyel P, Evans A, Ducimetiere P, Juhan-Vague I. Endothelial cell markers and the risk of coronary heart disease: the Prospective Epidemiological Study of Myocardial Infarction (PRIME) study. Circulation 2004;109:1343-8.

317.

Chion CK, Doggen CJ, Crawley JT, Lane DA, Rosendaal FR. ADAMTS13 and von Willebrand factor and the risk of myocardial infarction in men. Blood 2007;109:1998-2000.

318.

Matsukawa M, Kaikita K, Soejima K, Fuchigami S, Nakamura Y, Honda T, Tsujita K, Nagayoshi Y, Kojima S, Shimomura H, Sugiyama S, Fujimoto K, Yoshimura M, Nakagaki T, Ogawa H. Serial changes in von Willebrand factorcleaving protease (ADAMTS13) and prognosis after acute myocardial infarction. Am J Cardiol 2007;100:758-63.

127

319.

Galatius S, Wroblewski H, Sorensen VB, Bie P, Parving HH, Kastrup J. Endothelin and von Willebrand factor as parameters of endothelial function in idiopathic dilated cardiomyopathy: different stimuli for release before and after heart transplantation? Am Heart J 1999;137:549-54.

320.

Chong AY, Freestone B, Lim HS, Kistorp C, Gustafsson F, Hildebrandt P, Lip GY. Plasma von Willebrand factor and soluble E-selectin levels in stable outpatients with systolic heart failure: the Frederiksberg heart failure study. Int J Cardiol 2007;119:80-2.

321.

Kistorp C, Chong AY, Gustafsson F, Galatius S, Raymond I, Faber J, Lip GY, Hildebrandt P. Biomarkers of endothelial dysfunction are elevated and related to prognosis in chronic heart failure patients with diabetes but not in those without diabetes. Eur J Heart Fail 2008;10:380-7.

322.

Chin BS, Conway DS, Chung NA, Blann AD, Gibbs CR, Lip GY. Interleukin-6, tissue factor and von Willebrand factor in acute decompensated heart failure: relationship to treatment and prognosis. Blood Coagul Fibrinolysis 2003;14:51521.

323.

Gibbs CR, Blann AD, Watson RD, Lip GY. Abnormalities of hemorheological, endothelial, and platelet function in patients with chronic heart failure in sinus rhythm: effects of angiotensin-converting enzyme inhibitor and beta-blocker therapy. Circulation 2001;103:1746-51.

324.

Sabelis LW, Senden PJ, Fijnheer R, de Groot PG, Huisveld IA, Mosterd WL, Zonderland ML. Endothelial markers in chronic heart failure: training normalizes exercise-induced vWF release. Eur J Clin Invest 2004;34:583-9.

325.

Libby P. Molecular bases of the acute coronary syndromes. Circulation 1995;91:2844-50.

326.

Thompson SG, Kienast J, Pyke SD, Haverkate F, van de Loo JC. Hemostatic factors and the risk of myocardial infarction or sudden death in patients with angina pectoris. European Concerted Action on Thrombosis and Disabilities Angina Pectoris Study Group. N Engl J Med 1995;332:635-41.

327.

Jansson JH, Nilsson TK, Johnson O. von Willebrand factor in plasma: a novel risk factor for recurrent myocardial infarction and death. Br Heart J 1991;66:351-5.

128

328.

Kaikita K, Soejima K, Matsukawa M, Nakagaki T, Ogawa H. Reduced von Willebrand factor-cleaving protease (ADAMTS13) activity in acute myocardial infarction. J Thromb Haemost 2006;4:2490-3.

329.

Fuchigami S, Kaikita K, Soejima K, Matsukawa M, Honda T, Tsujita K, Nagayoshi Y, Kojima S, Nakagaki T, Sugiyama S, Ogawa H. Changes in plasma von Willebrand factor-cleaving protease (ADAMTS13) levels in patients with unstable angina. Thromb Res 2008;122:618-23.

330.

Horii M, Uemura S, Uemura M, Matsumoto M, Ishizashi H, Imagawa K, Iwama H, Takeda Y, Kawata H, Nakajima T, Fujimura Y, Saito Y. Acute myocardial infarction as a systemic prothrombotic condition evidenced by increased von Willebrand factor protein over ADAMTS13 activity in coronary and systemic circulation. Heart Vessels 2008;23:301-7.

331.

van den Born BJ, van der Hoeven NV, Groot E, Lenting PJ, Meijers JC, Levi M, van Montfrans GA. Association between thrombotic microangiopathy and reduced ADAMTS13 activity in malignant hypertension. Hypertension 2008;51:862-6.

332.

Uemura T, Kaikita K, Yamabe H, Soejima K, Matsukawa M, Fuchigami S, Tanaka Y, Morihisa K, Enomoto K, Sumida H, Sugiyama S, Ogawa H. Changes in plasma von Willebrand factor and ADAMTS13 levels associated with left atrial remodeling in atrial fibrillation. Thromb Res 2008.

333.

EuroQol--a new facility for the measurement of health-related quality of life. The EuroQol Group. Health Policy 1990;16:199-208.

334.

Miller SA, Dykes DD, Polesky HF. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Res 1988;16:1215.

335.

Lewis LK, Smith MW, Yandle TG, Richards AM, Nicholls MG. Adrenomedullin(1-52) measured in human plasma by radioimmunoassay: plasma concentration, adsorption, and storage. Clin Chem 1998;44:571-7.

336.

Rossi GP, Seccia TM, Albertin G, Pessina AC. Measurement of endothelin: clinical and research use. Ann Clin Biochem 2000;37 ( Pt 5):608-26.

337.

Struck J, Tao C, Morgenthaler NG, Bergmann A. Identification of an Adrenomedullin precursor fragment in plasma of sepsis patients. Peptides 2004;25:1369-72.

129

338.

Vargas-Alarcon G, Londono JD, Hernandez-Pacheco G, Gamboa R, Castillo E, Pacheco-Tena C, Cardiel MH, Granados J, Burgos-Vargas R. Heat shock protein 70 gene polymorphisms in Mexican patients with spondyloarthropathies. Ann Rheum Dis 2002;61:48-51.

339.

Milner CM, Campbell RD. Polymorphic analysis of the three MHC-linked HSP70 genes. Immunogenetics 1992;36:357-62.

340.

Kobayashi T, Wada H, Kamikura Y, Matsumoto T, Mori Y, Kaneko T, Nobori T, Matsumoto M, Fujimura Y, Shiku H. Decreased ADAMTS13 activity in plasma from patients with thrombotic thrombocytopenic purpura. Thromb Res 2007;119:447-52.

341.

Raymond I, Groenning BA, Hildebrandt PR, Nilsson JC, Baumann M, Trawinski J, Pedersen F. The influence of age, sex and other variables on the plasma level of N-terminal pro brain natriuretic peptide in a large sample of the general population. Heart 2003;89:745-51.

342.

Bayes-Genis A, DeFilippi C, Januzzi JL, Jr. Understanding amino-terminal proB-type natriuretic peptide in obesity. Am J Cardiol 2008;101:89-94.

343.

Dokainish H, Gonzalez R, Hartley WB, Caldera A, Koshy S, Sengupta R, Lakkis NM. Usefulness of B-type natriuretic peptide levels to predict left ventricular filling pressures in patients with body mass index >35, 31 to 35, and < or =30 kg/m2. Am J Cardiol 2007;100:1166-71.

344.

Vila G, Riedl M, Maier C, Struck J, Morgenthaler NG, Handisurya A, Prager G, Ludvik B, Clodi M, Luger A. Plasma MR-proADM Correlates to BMI and Decreases in Relation to Leptin After Gastric Bypass Surgery. Obesity (Silver Spring) 2009.

345.

Ferri C, Bellini C, Desideri G, Di Francesco L, Baldoncini R, Santucci A, De Mattia G. Plasma endothelin-1 levels in obese hypertensive and normotensive men. Diabetes 1995;44:431-6.

346.

Kato J, Kitamura K, Uemura T, Kuwasako K, Kita T, Kangawa K, Eto T. Plasma levels of adrenomedullin and atrial and brain natriuretic peptides in the general population: their relations to age and pulse pressure. Hypertens Res 2002;25:887-92.

130

347.

Hirai Y, Adachi H, Fujiura Y, Hiratsuka A, Enomoto M, Imaizumi T. Plasma endothelin-1 level is related to renal function and smoking status but not to blood pressure: an epidemiological study. J Hypertens 2004;22:713-8.

348.

Schou M, Gustafsson F, Kistorp CN, Corell P, Kjaer A, Hildebrandt PR. Effects of body mass index and age on N-terminal pro brain natriuretic peptide are associated with glomerular filtration rate in chronic heart failure patients. Clin Chem 2007;53:1928-35.

349.

deFilippi CR, Seliger SL, Maynard S, Christenson RH. Impact of renal disease on natriuretic peptide testing for diagnosing decompensated heart failure and predicting mortality. Clin Chem 2007;53:1511-9.

350.

Dieplinger B, Mueller T, Kollerits B, Struck J, Ritz E, von Eckardstein A, Haltmayer M, Kronenberg F. Pro-A-type natriuretic peptide and proadrenomedullin predict progression of chronic kidney disease: the MMKD Study. Kidney Int 2009;75:408-14.

351.

Masson S, Latini R, Anand IS, Barlera S, Judd D, Salio M, Perticone F, Perini G, Tognoni G, Cohn JN. The prognostic value of big endothelin-1 in more than 2,300 patients with heart failure enrolled in the Valsartan Heart Failure Trial (Val-HeFT). J Card Fail 2006;12:375-80.

352.

Suzuki Y, Horio T, Nonogi H, Hayashi T, Kitamura K, Eto T, Kangawa K, Kawano Y. Adrenomedullin as a sensitive marker for coronary and peripheral arterial complications in patients with atherosclerotic risks. Peptides 2004;25:1321-6.

353.

Genesca J, Gonzalez A, Catalan R, Segura R, Martinez M, Esteban R, Groszmann RJ, Guardia J. Adrenomedullin, a vasodilator peptide implicated in hemodynamic alterations of liver cirrhosis: relationship to nitric oxide. Dig Dis Sci 1999;44:372-6.

354.

Fujioka S. Increased plasma concentration of adrenomedullin during and after major surgery. Surg Today 2001;31:575-9.

355.

Yanagawa B, Nagaya N. Adrenomedullin: molecular mechanisms and its role in cardiac disease. Amino Acids 2007;32:157-64.

131

356.

Yang LL, Arab S, Liu P, Stewart DJ, Husain M. The role of endothelin-1 in myocarditis and inflammatory cardiomyopathy: old lessons and new insights. Can J Physiol Pharmacol 2005;83:47-62.

357.

Piechota M, Banach M, Irzmanski R, Barylski M, Piechota-Urbanska M, Kowalski J, Pawlicki L. Plasma endothelin-1 levels in septic patients. J Intensive Care Med 2007;22:232-9.

358.

Koller-Strametz J, Pacher R, Frey B, Kos T, Woloszczuk W, Stanek B. Circulating tumor necrosis factor-alpha levels in chronic heart failure: relation to its soluble receptor II, interleukin-6, and neurohumoral variables. J Heart Lung Transplant 1998;17:356-62.

359.

Fraccarollo D, Galuppo P, Bauersachs J, Ertl G. Collagen accumulation after myocardial infarction: effects of ETA receptor blockade and implications for early remodeling. Cardiovasc Res 2002;54:559-67.

360.

Yang LL, Gros R, Kabir MG, Sadi A, Gotlieb AI, Husain M, Stewart DJ. Conditional cardiac overexpression of endothelin-1 induces inflammation and dilated cardiomyopathy in mice. Circulation 2004;109:255-61.

361.

Niethammer M, Sieber M, von Haehling S, Anker SD, Munzel T, Horstick G, Genth-Zotz S. Inflammatory pathways in patients with heart failure and preserved ejection fraction. Int J Cardiol 2008;129:111-7.

362.

Emdin M, Passino C, Prontera C, Iervasi A, Ripoli A, Masini S, Zucchelli GC, Clerico A. Cardiac natriuretic hormones, neuro-hormones, thyroid hormones and cytokines in normal subjects and patients with heart failure. Clin Chem Lab Med 2004;42:627-36.

363.

Van Beneden R, Gurne O, Selvais PL, Ahn SA, Robert AR, Ketelslegers JM, Pouleur HG, Rousseau MF. Superiority of big endothelin-1 and endothelin-1 over natriuretic peptides in predicting survival in severe congestive heart failure: a 7-year follow-up study. J Card Fail 2004;10:490-5.

364.

Hulsmann M, Berger R, Sturm B, Bojic A, Woloszczuk W, Bergler-Klein J, Pacher R. Prediction of outcome by neurohumoral activation, the six-minute walk test and the Minnesota Living with Heart Failure Questionnaire in an outpatient cohort with congestive heart failure. Eur Heart J 2002;23:886-91.

132

365.

Giannessi D, Colotti C, Maltinti M, Del Ry S, Prontera C, Turchi S, Labbate A, Neglia D. Circulating heat shock proteins and inflammatory markers in patients with idiopathic left ventricular dysfunction: their relationships with myocardial and microvascular impairment. Cell Stress Chaperones 2007;12:265-74.

366.

Asea A, Kraeft SK, Kurt-Jones EA, Stevenson MA, Chen LB, Finberg RW, Koo GC, Calderwood SK. HSP70 stimulates cytokine production through a CD14dependant pathway, demonstrating its dual role as a chaperone and cytokine. Nat Med 2000;6:435-42.

367.

Trost SU, Omens JH, Karlon WJ, Meyer M, Mestril R, Covell JW, Dillmann WH. Protection against myocardial dysfunction after a brief ischemic period in transgenic mice expressing inducible heat shock protein 70. J Clin Invest 1998;101:855-62.

368.

Zhao Y, Wang W, Qian L. Hsp70 may protect cardiomyocytes from stressinduced injury by inhibiting Fas-mediated apoptosis. Cell Stress Chaperones 2007;12:83-95.

369.

Galley HF, Lowe PR. Fishing in the gene pool. Crit Care Med 2003;31:317-8.

370.

Mestiri S, Bouaouina N, Ahmed SB, Khedhaier A, Jrad BB, Remadi S, Chouchane L. Genetic variation in the tumor necrosis factor-alpha promoter region and in the stress protein hsp70-2: susceptibility and prognostic implications in breast carcinoma. Cancer 2001;91:672-8.

371.

Uemura M, Tatsumi K, Matsumoto M, Fujimoto M, Matsuyama T, Ishikawa M, Iwamoto TA, Mori T, Wanaka A, Fukui H, Fujimura Y. Localization of ADAMTS13 to the stellate cells of human liver. Blood 2005;106:922-4.

372.

Turner NA, Nolasco L, Ruggeri ZM, Moake JL. Endothelial cell ADAMTS-13 and VWF: production, release and VWF string cleavage. Blood 2009.

373.

Mannucci PM, Capoferri C, Canciani MT. Plasma levels of von Willebrand factor regulate ADAMTS-13, its major cleaving protease. Br J Haematol 2004;126:213-8.

374.

Banno F, Kokame K, Okuda T, Honda S, Miyata S, Kato H, Tomiyama Y, Miyata T. Complete deficiency in ADAMTS13 is prothrombotic, but it alone is not sufficient to cause thrombotic thrombocytopenic purpura. Blood 2006;107:3161-6.

133

375.

Vesely SK, George JN, Lammle B, Studt JD, Alberio L, El-Harake MA, Raskob GE. ADAMTS13 activity in thrombotic thrombocytopenic purpura-hemolytic uremic syndrome: relation to presenting features and clinical outcomes in a prospective cohort of 142 patients. Blood 2003;102:60-8.

376.

Cserti CM, Landaw S, Uhl L. Do infections provoke exacerbations and relapses of thrombotic thrombocytopenic purpura? J Clin Apher 2007;22:21-5.

377.

Matsumoto M, Kawaguchi S, Ishizashi H, Yagi H, Iida J, Sakaki T, Fujimura Y. Platelets treated with ticlopidine are less reactive to unusually large von Willebrand factor multimers than are those treated with aspirin under high shear stress. Pathophysiol Haemost Thromb 2005;34:35-40.

378.

Chauhan AK, Motto DG, Lamb CB, Bergmeier W, Dockal M, Plaimauer B, Scheiflinger F, Ginsburg D, Wagner DD. Systemic antithrombotic effects of ADAMTS13. J Exp Med 2006;203:767-76.

134

10. Saját publikációk jegyzéke 10.1. A disszertációhoz kapcsolódó közlemények 1, Gombos T, Förhécz Z, Pozsonyi Z, Jánoskuti L, Prohászka Z. Interaction of serum 70-kDa heat shock protein levels and HspA1B (+1267) gene polymorphism with disease severity in patients with chronic heart failure. Cell Stress Chaperones. 2008 Summer;13(2):199-206. Epub 2008 Feb 22. IF:2,238 (2008) 2, T. Gombos, Z. Förhécz, Z. Pozsonyi, S. Walentin, J. Papassotiriou, J. Kunde, N.G. Morgenthaler, L. Jánoskuti, Z. Prohászka. Adrenomedullin and endothelin-1 are related to inflammation in chronic heart failure Inflamm Res. 2009 Jun;58(6):298-305.

IF: 1,457 (2008)

3, T. Gombos, V. Makó, L. Cervenak, J. Papassotiriou, J. Kunde, J. Hársfalvi, Z. Förhécz, Z. Pozsonyi, G. Borgulya, L. Jánoskuti, Z. Prohászka: Levels of von Willebrand factor antigen and von Willebrand factor cleaving protease (ADAMTS13) activity predict clinical events in chronic heart failure Thromb Haemost 2009 Sep;102(3):573-80.

IF: 3,803 (2008)

10.2. A disszertációtól független közlemények 1, Gombos T, Kertész K, Csíkos A, Söderhamn U, Söderhamn O, Prohászka Z. Nutritional form for the elderly is a reliable and valid instrument for the determination of undernutrition risk, and it is associated with health-related quality of life. Nutrition Research 2008 Feb;28(2):59-65.

IF:0,866 (2008)

2, L. Jakab, J. Laki, K. Sallai, Gy. Temesszentandrási, T. Pozsonyi, L. Kalabay, L. Varga, T. Gombos, B. Blaskó, A. Bíró, H.O. Madsen, J. Radics, P. Gergely, G. Füst, L. Czirják, P. Garred and B. Fekete: Association between early onset and organ manifestations of systemic lupus erythematosus (SLE) and a downregulating promoter polymorphism in the MBL2 gene Clin Immunol. 2007 Dec;125(3):230-6. Epub 2007 Oct 17

IF: 3,551 (2007)

3, Széplaki G, Hirschberg K, Gombos T, Varga L, Prohászka Z, Dósa E, Acsády G, Karádi I, Garred P, Entz L, Füst G. Early complement activation follows eversion

135

carotid endarterectomy and correlates with the time of clamping of the carotid artery. Mol Immunol. 2008 Jun;45(11):3289-94. Epub 2008 Mar 28.

IF:3,555 (2008)

4, Széplaki G, Szegedi R, Hirschberg K, Gombos T, Varga L, Karádi I, Entz L, Széplaki Z, Garred P, Prohászka Z, Füst G. Strong complement activation after acute ischemic stroke is associated with unfavorable outcomes. Atherosclerosis. 2009 May;204(1):315-20. Epub 2008 Aug 14.

IF:4,601 (2008)

5, B. Pazár, P. Gergely Jr, Z.B. Nagy, T. Gombos, É. Pozsonyi, K. Rajczy, Z. Balogh, K. Sevcic, I. Orbán, P. Szodoray, G. Poór. Role of HLA-DRB1 and PTPN22 genes in susceptibility to juvenile idiopathic arthritis in Hungarian patients. Clin Exp Rheumatol. 2008 Nov-Dec;26(6):1146-52.

IF:2,364(2008)

6, Attila Molvarec, János Rigó Jr, Tamás Bőze, Zoltán Derzsy, László Cervenak, Veronika Makó, Tímea Gombos, Zoltán Prohászka. Association of increased plasma von Willebrand factor antigen levels but normal von Willebrand factor cleaving protease (ADAMTS13) activity within preeclampsia Thromb Haemost. 2009 Feb;101(2):305-11.

IF:3,803 (2008)

7, K. Hirschberg, T. Gombos, E. Dósa, A. Somorjai, Á. Szilágyi, G. Szabó, G. Füst, L. Entz: Association between Estrogen Receptor α Gene Polymorphisms and Early Restenosis after Eversion Carotid Endarterectomy and Carotid Stenting Atherosclerosis. 2009 Sep;206(1):186-92. Epub 2009 Jan 29.

IF:4,601 (2008)

8, Gergely P Jr, Pazár B, Nagy ZB, Gombos T, Rajczy K, Balogh Z, Orbán I, Sevcic K, Poór G. Structural Polymorphisms in the Mannose-Binding Lectin Gene Are Associated with Juvenile Idiopathic Arthritis J Rheumatol. 2009 Apr;36(4):843-7. Epub 2009 Mar 13.

IF:3,282 (2008)

9, Zsolt Förhécz; Tímea Gombos; Gábor Borgulya; Zoltán Pozsonyi; Zoltán Prohászka, Lívia Jánoskuti: Red cell distribution width in heart failure: Prediction of clinical events and relationship with markers of ineffective erythropoiesis, inflammation, renal function and nutritional state Am Heart J. 2009 Oct;158(4):659-66. Epub 2009 Aug 26.

IF:4,285 (2008) Összesen: 38,406

136

11. Köszönetnyilvánítás Mindenekelőtt szeretném köszönetemet kifejezni témavezetőmnek, Prohászka Zoltán Professzor Úrnak nem csak azért, hogy munkámat irányította és maximálisan segítette, hanem, hogy megelőlegezett bizalmával egyáltalán lehetővé tette, hogy nekikezdjek. Hálával tartozom, amiért megszerettette velem a kutatói munkát, és általa megismerhettem annak kreatív és izgalmas oldalát. Köszönöm mindemellett a baráti beszélgetéseket és hálás vagyok rokonlelkűségéért. Köszönettel tartozom Füst György Professzor Úrnak, hogy hasznos tanácsaival és értékes észrevételeivel segítette munkámat, hogy mindig példát mutatott optimizmus, kitartás és szorgalom terén valamint, hogy példáján megismerhettem mekkora áldás, ha az ember szereti a munkáját. Hálával tartozom Karádi István Professzor Úrnak a lehetőségért és köszönöm Jánoskuti Lívia Docens Asszonynak, Dr. Förhécz Zsoltnak és Dr. Pozsonyi Zoltánnak és a kardiológiai osztály munkatársainak, hogy a klinikai oldalról megteremtették munkám feltételeit, hogy aktív közreműködésükkel és segítségükkel megvalósulhatott a vizsgálat. Külön köszönöm kollégáimnak, Dr. Szilágyi Ágnesnek, Makó Veronikának, Dr. Széplaki Gábornak valamint Dr. Blaskó Bernadettnek és Dr. Borgulya Gábornak hogy aktívan hozzájárultak a munka megvalósításához. Hálásan köszönöm Szigeti Antalnénak, Dóczy Andrásnénak, Kovács Margitnak és Nagyné Vers Máriának a laborban nyújtott állhatatos és kimeríthetetlen segítséget és Holeczky Rudolfnénak kedvességét és hogy oly sok terhet levett a vállamról. Köszönet illeti Dr. Cervenak Lászlót, Dr. Varga Liliant és Dr. Farkas Henriettet értékes

észrevételeik

és

javaslataik

miatt.

Továbbá

hálával

tartozom

a

Kutatólaboratórium összes munkatárásnak, hogy vidám társaságukban oly gyorsan telhetett az idő: Schäffer Gyulának, Dr. Kiszel Petrának, Bánlaki Zsófiának, Aladzsity Istvánnak, Dr. Doleschall Mártonnak és Dr. Bíró Adriennek. Szeretnék köszönetet mondani a vizsgálatban részvevő betegeknek, hogy önzetlenül vállalták a kellemetlenségeket. Végezetül szeretném hálásan megköszönni a hátteret biztosító barátaimnak és családomnak, különösképpen Szüleimnek, Nagymamának és kiváltképp Férjemnek a sok szeretetet, türelmet, támogatást és bíztatást.

137