Fakulta Biomedicínckého inženýrství v Kladně,ČVUT Studijní program: Biomedicíncká a klinická technika Studijní obor: Biomedicíncká a klinická technika
Týmový projekt Organizace, vybavení a zprovoznění experimentální laboratoře tkáňových kultur Martin Tlučhoř Vedoucí práce: RNDr. Taťána Jarošíková, CSc. Mgr. Elena Filová, PhD.
Akademický rok: 2011/2012
Prohlášení o samostatném vypracování seminární práce: Prohlašuji, že jsem tento týmový projekt vypracoval samostatně pouze s použitím uvedených zdrojů. V Kladně podpisy:
Poděkování Rádi bychom poděkovali všem, kteří nám s tímto projektem pomáhali, jimiž byli: Mgr. Filová Eva, Ph.D., Prof. Evžen Amler, PhD, RNDr. Taťána Jarošíková, CSc. , Mgr. Elena Filová, PhD
II
III
Anotace: Cílem našeho projektu bylo poznat prostory, do kterých jsme následně navrhli vybavení laboratoře tkáňových kultur, seznámit se se zásadami práce v biochemické laboratoři pro tkáňové inženýrství a z toho vyplývající principy pro zařízení nových laboratorních prostor. Následně jsme se seznámili s vlastní tematikou experimentálního výzkumu: „Využití konfokální mikroskopie v tkáňovém inženýrství šlach“ a posléze zpracovat a vyhodnotit snímky z konfokálního mikroskopu.
IV
Obsah:
1. Úvod
6
2. Teoretický úvod do problematiky
7
2.1 Tkáňové inženýrství
7
2.2 Laboratoř – prostory
7
2.3 Laboratorní technika, vybavení
8
2.3.1 Vzduchotechnika
8
2.3.2 Návrh zařízení jednotlivých laboratoří
10
2.3.3 Stoly
11 12
3. Konfokální mikroskop 3.1 Rozlišovací schopnost
13
3.2 Uložení konfokálního mikroskopu v laboratoři
13
3.3 Pozorování povrchů ve skutečných barvách
14
3.4 SHG snímkování
14
4. Vyhodnocování SHG snímků
15
5. Výsledky SHG snímkování
16
6. Závěr
19
7. Seznam literatury
20
7.1Literární zdroje
20
7.2 Internetové zdroje
20
V
1. ÚVOD Téma našeho týmového projektu: „Organizace, vybavení a zprovoznění experimentální laboratoře tkáňových kultur“, nás nejvíce zaujalo z možných nabízených témat. Předem jsme měli jasno, v jakém oboru budeme vybírat a když jsme zjistili, že toto zadání má i svou praktickou část a to že fyzicky pomůžeme s realizací velmi složité laboratoře, byli jsme jasně rozhodnuti. Téma mého dílčího projektu se nazývá „Využití konfokální mikroskopie v tkáňovém inženýrství šlach“. Zde jsem se zabýval konfokálním mikroskopem a zpracováním SHG snímků.
6
2. TEORETICKÝ ÚVOD DO PROBLEMATIKY
2.1 Tkáňové inženýrství Tkáňové inženýrství je interdisciplinární obor, který aplikuje zákonitosti a metody inženýrství a přírodních věd na vývoj biologických náhrad sloužících k obnově, zachování nebo zlepšení funkcí tkání. Zabývá se vývojem a využitím arteficiálně připravených molekul, buněk, tkání a orgánů k obnově nebo náhradě defektní nebo poraněné části těla. V současnosti sledujeme jeho rychlý pokrok zejména v souvislosti s výzkumem kmenových buněk, který vedl dokonce ke vzniku nového oboru nazývaného regenerativní či reparativní medicína. V laboratoři je nutné pracovat ve striktně aseptickém prostředí! (4)
2.2 Laboratoř - prostory: Letohradská Laboratoř bude sloužit k in vitro testům na buňkových kulturách a výrobě nanovláken zvlákňováním.
Obr.1. Plán místností plánované laboratoře.
7
Místnosti: 1) Vstupní hala 2) Kancelář 3) Laboratoř č. 1 4) Laboratoř č. 2 5) Obytná místnost 6) Koupelna 7) Chodba- šatna 9) Chodba - umývárna 10) WC 11) Technická místnost 12) Laboratoř č. 3 13) Laboratoř č. 4 14) Laboratoř č. 5
2.3 Laboratorní technika, vybavení: Součástí laboratorní techniky jsou: Boxy laminárního proudění vzduchu, vodní lázeň, mini centrifuga, chlazená centrifuga, CO2 inkubátory, lednice, mrazáky, mikroskop pipety, laboratorní sklo a nádobí, UV lampa, autokláv, horkovzdušný sterilizátor, zdroj čisté vody (demineralizované nebo deionizované), kancelářská výpočetní technika, Spektrofotometr (Elisa Reader), konfokální mikroskop - rastrující.
2.3.1 Vzduchotechnika „Čistý prostor“ (ČP) je prostor s definovanou kvalitou vnitřního prostředí vyjádřenou počtem částic pevného aerosolu o daných velikostech částic. Požadavky na jednotlivé „třídy čistoty“ jsou dány v ČSN EN 14644-1 Čisté prostory a příslušné řízené prostředí- Část 1: Klasifikace čistoty vzduchu (převzata v angličtině) Požadavky na třídy čistoty definované počtem částic pevného aerosolu jsou v Příloze vyhlášky – viz tab. 1 HEPA filtr tento typ vzduchového filtru je schopen ze vzduchu s minimálně 99,97% účinností odstranit částice o velikosti 300 nanometrů (částice této velikosti jsou pro HEPA filtry nejobtížněji filtrovatelné). Větší a menší částice jsou filtrovány s ještě vyšší účinností. 8
Kontrola funkčních vlastností boxů probíhá podle vyhlášky č. 84/2008 Sb. v souladu s ČSN EN 12469 Kritéria účinnosti MBB. Provádí se následující zkoušky: 1) Účinnost filtrů – jsou použity absolutní filtry (HEPA, ULPA) nejméně třídy H 14, filtry jsou na přívodu vzduchu do boxů i na odtahu- provádí se tzv. defektoskopie filtrů a těsnění konstrukčních spojů – zkušebním aerosolem. Počet částic se měří počítači částic nebo aerosolovými fotometry. 2) Vizualizace proudění – kouřovou zkouškou nebo vodní mlhou 3) Proudění vzduchu – vzduchový výkon
Obr. 2: Tabulka s jednotlivými stupni čistoty.
Klimatizace:
S úzkými tolerancemi teploty, vlhkosti a čistotě prostoru laboratoře jsou vyráběny speciální klimatizační zařízení, které musí vyhovět zvláštním nárokům na stabilitu teploty, vlhkosti a množství prachových částic a bakterií v laboratořích a přesné výrobě v mikroelektronice, optice, farmacii, jakož i operačních sálů a podobně. Klimatizační systémy
pro laboratoře mohou být rozděleny do dvou kategorií: konstantního objemu (CV) a kategorie variabilního objemu vzduchu (VAV). Konstantní objem vzduchu (CV) je ten, který vyčerpá konstantní množství vzduchu z digestoře, zatímco ve stejnou dobu dodává konstantní objem vzduchu do laboratoře.
9
Variabilní objem vzduchu (VAV) mění množství vzduchu vyčerpaného a dodávaného do laboratoře, na základě používání digestoře. VAV systémy se liší v měření množství vzduchu, které má být vyčerpáno. Některé systémy, využívají snímací zařízení, které je vestavěné do boční stěny krytu. Jak se objem vzduchu zvětší, senzor aktivuje a zvyšuje intenzitu výfuku. Snížení objemu vzduchu má za následek snížení výfukových plynů. (14, 15)
Využití přetlaku ve vzduchotechnice:
Zabrání vniku kontaminace do čistých prostorů, vháněním přefiltrovaného dekontaminovaného vzduchu. Mikroskopicky spočívá význam vysokého tlaku v možnosti měnit meziatomové vzdálenosti i při relativně malých změnách vnitřní tepelné energie. Vysokých tlaků se dosahuje soustředěním velkých energií do malého objemu. Postupy se tradičně dělí na dynamické a statické (12).
Využití nízkého tlaku v laboratořích: Nízkého tlaku se obvykle používá v GMO laboratořích 2. Kategorie (GMO = geneticky modifikované organizmy). Jde zde o prostory s podtlakovou technikou, která vytváří podtlak 50 Pa, a proto je zde nutné dodržovat pravidla. Je zde nutné za sebou za sebou zavírat dveře a dodržovat čistotu. Místnost musí být na vstupu i výstupu chráněna HEPA filtry - v případě výpadku elektrického proudu se potrubí uzavře klapkami (13).
2.3.2 Návrh zařízení jednotlivých laboratoří
Místnost č. 9. - Na buněčné kultury s čistým vzduchem a HEPA filtrem
2x laminární box - 2x 1630 W, Mikroskop - 200W, 1x chladnička s mrazákem, 2x inkubátor - 2x440 W, 1x PC, Centrifuga 100 W, 2 x sterilizační přístroj - 2x 110W, Vodní lázeň 1200 W
Menší místnost s mikroskopem - chlazení
10
Mikroskop - 500 W + záložní zdroj k mikroskopu 900W, 2x PC, Elisa reader 40 W Musí být vývod vzduchu z mikroskopu ven z budovy - jinak by se navýšilo teplo o dalších 2000 W.
2.3.3 Stoly
Nesterilní místnost
1. Stůl pevný, pracovní deska: 290cm (d) x 80 cm (š) x 85 cm (v). Pracovní deska musí vzadu přečnívat o 10 cm (kvůli potrubí při stěně), kovová konstrukce bude alespoň o 10 cm vzadu po celé délce. Pod stolem budou 2 skříňky 90cm široké (s jednou policí uvnitř)-vlevo. Napravo od nich budou pod stolem 2 police nad sebou 90cm široké bez dvířek
2. Stůl pevný, pracovní deska: 145cm x 80 cm (š) x 85cm (v). V levém zadním rohu bude v desce výřez 40cm (hloubka) x 50cm (délka). Musíme s tím počítat u konstrukce, kvůli výběžku ve stěně. 1 skříňka 90 cm s 1 policí uprostřed a dvířky-budou vpravo pod stolem.
3. Stůl pevný, pracovní deska: 190 cm x 80 cm (š) x 85cm (v) - bez skříněk. Vzadu bude deska přečnívat o 24 cm kvůli topení na stěně. Vzadu tak po celé délce stolu bude mřížka pro teplý vzduch z radiátoru.
4. Stůl se dvěma dřezy hlubokými uprostřed: hloubka dřezů 40 cm, deska 200 cm x 60cm (š) x 85cm (v). Pod stolem skříňka bez police 2x 90cm.
Sterilní
místnost
5. Stůl pevný s dřezem, pracovní deska: 200cm x 60cm (š) x 85cm (v), dřez bude v levé části. Vpravo musí pracovní deska přečnívat o 10 cm oproti železné konstrukci, ta bude vpravo kratší. 6. Stůl pevný, pracovní deska: 90 cm (d) x 85 cm (š) x 85 cm (v), pod stolem skříňka s poličkou. Speciální stůl pod konfokální mikroskop bude cca 120 cm dlouhý, 80-90 cm široký a 80 cm vysoký.
11
3. Konfokální mikroskop Jedná se o typ světelného mikroskopu, který má vyšší rozlišovací schopnost než klasické světelné mikroskopy využívající bílé světlo, protože využívá detekci světla o jedné určité vlnové délce - tedy laseru. Konfokálním mikroskopem je možné vytvořit 3D obraz preparátu poskládáním a seřazením různých nasnímaných rovin řezu. Mezi nejčastěji používaný laser patří argon-kryptonový. Provoz konfokálního mikroskopu s tímto typem laseru je však drahý, převážně kvůli drahému doplňování, které je nutné provádět již po 500 hodinách používání (5).
Rozdělení konfokálních mikroskopů: - rastrovací konfokální mikroskop - nejčastěji používaný - konfokální mikroskop s rotujícím diskem Základním principem rastrovacího konfokálního mikroskopu je to, že netvoří obraz vcelku, najednou, ale bod po bodu, řádkováním. Pomocí řádkování jsou tedy snímány optické body v rovině XY a díky přesnému definovanému posuvu objektivu v ose Z, i jednotlivé optické řezy. Konfokální obrazy jsou vždy zaostřené a představují jednotlivé optické řezy vzorkem. Složení trojrozměrných obrazů vychází z možnosti postupného snímání desítek až stovek optických řezů v ose Z (5). Laserový paprsek, který tedy představuje bodový zdroj světla, je fokusován na clonku. Potom prochází objektivem až na vzorek, kde je obraz clonky fokusován do bodu, jehož průměr odpovídá difrakční mezi, které se též říká rozlišovací mez. Přes stejný objektiv jde zpětně i světlo na vzorku odražené či rozptýlené nebo také fluorescence. Sekundární světlo putující zpět prochází opět clonkou, jejíž bodový obraz je s pomocí děliče paprsků lokalizován před fotonásobič (photomultiplier), kde je umístěna druhá konfokální bodová clonka, která filtruje světlo pocházející z oblasti mimo ohniskovou rovinu mikroskopu. Obraz celé zaostřené roviny lze pak získat rastrováním bod po bodu některým z těchto postupů: - rozmítáním laserového paprsku - příčným posuvem objektivu před vzorkem - posuvem objektivu nad vzorkem (5) Konfokálního mikroskop nevytváří kompletní optický obraz celého vzorku. Pro vybudování obrazu je nezbytné, aby skenování bodové sondy bylo provedeno přes celkové 12
zorné pole. To lze provést pomocí snímání vzorku přes paprsek (tzv. fáze skenování) nebo v MRC-600 (konkrétní typ konf. mikroskopu), skenování paprsku na pevný vzorek (paprsek skenování). Obraz je generován elektronicky ze sériového signálu z fotonásobiče výstupu (3). Výhody konfokálního mikroskopu: Jednou z hlavních a nejdůležitějších výhod tohoto typu mikroskopu je ta skutečnost, že objekt, který je umístěn mimo rovinu ostrosti nezpůsobí rozostření, ale pouze není zobrazen. Dále získáním 3D obrazu po počítačovém zpracování vzniká větší hloubka ostrosti. Přesnější kvantitativní měření - nejsou zkreslena hloubkou.
3.1 Rozlišovací schopnost: Při použití objektivu o NA (numerická apertura) cca 1,3 a s využitím modrozelené čáry argon-kryptonového laseru o vlnové délce λ = 488 nm, by odpovídala tloušťka optických řezů asi 0,4 mikrometru. Dále při maximálním průměru konfokální clonky odpovídajícímu 1/4 průměru centrálního maxima Airyho kroužku, lze tvrdit, že rozlišovací schopnost konfokálního mikroskopu je přibližně 1,4x lepší než klasického mikroskopu o téže numerické apertury objektivu. Numerická apertura (NA) má vliv na rozlišovací schopnost mikroskopu a je dána vztahem: (1)
A = n · sinα,
n - index lomu prostředí mezi preparátem a frontální čočkou objektivu α - polovina otvorového úhlu objektiv, pozn. pro úhel α= 90° je sin α = 1, v praxi tohoto stavu však nelze dosáhnout, aby polovina otvorového objektivu měla uvedenou hodnotu. Maximální hodnota NA, pokud prostředí mezi preparátem a objektivem tvoří vzduch, je pro úhel α = 70° , sin α = 0,94. (6)
3.2 Uložení konfokálního mikroskopu v laboratoři: Aby nedocházelo k přenosu vibrací a ani k nepatrnému pohybu konfokálního mikroskopu, musí být přišroubován na pevné podložce. Nejčastěji se používají celokovové stoly, kde vlastní mikroskop je připevněn několika šrouby na masivní kovovou desku a tím je mu zabráněno i v sebemenším pohybu. Méně často se používají kovové desky, které jsou připevněné na robustním podstavci, který je vylitý z betonu. Druhá varianta je levnější. Jelikož má celá konstrukce stolu vyšší hmotnost než u celokovového provedení, tak lépe 13
zabraňuje přenášeným pohybům. Avšak hlavní důvod, proč se více používají celokovové stoly než ty s betonovým podstavcem je ten, že kvůli jejich velké hmotnosti je téměř nemožné je umisťovat do vyšších pater budov, jednak kvůli snížené nosnosti stropu a také kvůli špatné manipulaci s nimi (např. na schodišti).
3.3 Pozorování povrchů ve skutečných barvách Další velkou výhodou takového zařízení je možnost využití laserového svazku společně s tradičními mikroskopickými technikami (pozorování ve světlé nebo temném poli, polarizovaném světle), a to jak v režimu video - „živý" obraz, tak i v režimu laserového konfokálního zobrazení. Tento nový konfokální laserový režim je zvláště užitečný pro zvýraznění jemných texturových změn při analýze povrchů. Konfokální mikroskop Lext je první systém, který tak umožňuje získat simultánní zobrazení vzorků ve třech rozměrech a ve skutečných barvách, tím, že kombinuje laserové 3D zobrazení s plno-barevným zobrazením obrazu např. ve světlém poli, což je užitečné zejména při pozorování barevných vzorků (5). CCD je elektronická součástka používaná pro snímání obrazové informace. CCD využívá podobně jako všechny ostatní světlo-citlivé součástky fyzikálního jevu známého jako fotoefekt. Tento jev spočívá v tom, že částice světla foton při nárazu do atomu dokáže přemístit některý z jeho elektronů ze základního do tzv. excitovaného stavu (5).
3.4 SHG snímkování Multifotonová mikroskopie je vyvíjející se technika, poskytující obraz ve vysokém rozlišení, která je úspěšně používána v mnoha oblastech biomedicíny. Při nelineární mikroskopii je možné použít dva různé typy signálů. Jedním z nich je fluorescence, což je jedna z forem luminiscence. Druhým z nich je snímkování nazývané Second-harmonic generation, ve zkratce SHG. (7) Tohoto snímkování se používá při zobrazení různých biologických struktur např. kolagenních tkání jako je kůže, šlacha, sval, chrupavka atd. SHG technologie se dá také použít při zkoumání buněk jater, když je podezření na onemocnění cirhózou jater. SHG signál se používá pří snímkování preparátu v konfokálním mikroskopu. Pro detekci kolagenu se laser v konfokálním mikroskopu ladí na vlnovou délku 860 nm, tedy signál SHG při tomto nastavení má vlnovou délku 430 nm. (7)
14
SHG zobrazení nám umožňuje provádět 3-D rekonstrukce a vizualizace buněk kolagenu v tkáních. Objem kolagenu lze spolehlivě zjistit z tloušťky jednoho vlákna. (7)
3.5 Vyhodnocování snímků šlach: Pomocí programu ImageJ se dají otevřít a dále vyhodnocovat vzniklé SHG snímky šlach králíků. Je zde možné vytvořit graf, kde nám křivka ukazuje jas jednotlivých míst a podle jednotlivých velikostí vykreslených špiček můžeme spočítat množství kolagenních vláken, jejich hustotu a jejich šířku. Vlastní vyhodnocení každého SHG snímku spočívalo v pomyslném rozdělení snímku na devět částí. Každá část se proložila úsečkou o délce 50 μm, která byla vždy kolmá na ty kolagenní vlákna. Pro lepší statistické zpracování jsme prostřední část proložili ještě jednou úsečkou, abychom měli z každého snímku deset měření. Dále jsme vykreslili graf intenzity v místě proloženém každou úsečkou. U tohoto grafu jsme porovnávali výšku a šířku jednotlivých špiček a také jejich počet. Ukázka dvou snímků a grafů je popsána níže.
15
4. Výsledky SHG snímkování
Obr. 3: Snímek šlachy čtyřtýdenního králíka.
Obr. 4: Graf pojednávající o hustotě jednotlivých kolagenních vláken u čtyřtýdenního králíka.
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 35,80 11,32 33,00 36,78 26,87 16,50 16,03 54,69 Výška 3,54 1,47 1,36 4,74 2,56 1,36 1,47 1,87 Šířka Tab. 1: Naměřené hodnoty jednotlivých výšek a šířek špiček z grafu 1 ve voxelech. 16
9. 22,16 1,02
10. 6,60 1,33
Přepočet: 1 voxel = 0,058 129 μm h = 35,80 · 0,058 129 = 2,08 μm 1. 2. 3. 4. 5. 6. 0,66 1,92 2,14 1,56 0,96 Výška[μm] 2,08 0,21 0,09 0,08 0,28 0,15 0,08 Šířka[μm] Tab. 2:Přepočtené výšky a šířky jednotlivých špiček v μm.
7. 0,93 0,09
8. 3,18 0,11
9. 1,29 0,06
Obr. 5: Snímek šlachy devítiměsíčního králíka (po úpravě jasu).
Obr. 6: Graf pojednávající o hustotě jednotlivých kolagenních vláken u devítiměsíčního králíka. 17
10. 0,38 0,08
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 2,51 2,34 2,50 3,18 13,20 9,85 10,85 2,00 6,18 Výška 5,35 1,07 1,37 0,91 1,26 1,47 4,87 1,36 0,79 1,71 0,45 Šířka Tab. 3: Naměřené hodnoty jednotlivých výšek a šířek špiček z grafu 1 ve voxelech.
1. 2. 3. 4. 5. Výška[μm] 0,311 0,146 0,136 0,145 0,184 0,062 0,080 0,053 0,073 0,085 Šířka[μm] Tab. 4:Přepočtené výšky a šířky jednotlivých špiček v μm.
6. 7. 8. 9. 10. Výška[μm] 0,767 0,572 0,631 0,116 0,359 0,283 0,079 0,046 0,099 0,026 Šířka[μm] Tab. 5:Přepočtené výšky a šířky jednotlivých špiček v μm.
Vyhodnocování délky a šířky jednotlivých kolagenních vláken je prováděno v programu ImageJ. Úprava jasu u některých snímků je zde nutná kvůli tomu, že některé snímky jsou příliš tmavé, tak pro vytvoření grafu je nutné je přisvětlit.
18
6. ZÁVĚR:
Při porovnávání výsledků SHG snímků dvou šlach králíků různého stáří jsme zjistili změny v uspořádání kolagenních vláken. Mění se délka i šířka jednotlivých vláken. Pro celkové porovnání struktury kolagenních vláken je nutné vyhodnocení všech SHG snímků. V budoucnu doufáme, že se nám podaří zrealizovat projekt nové laboratoře, kde budeme moci výzkum dokončit.
19
3. SEZNAM LITERATURY
7.1 Literární zdroje: 1) amler_regenerativni_medicina, 2010. 2) sykova-centrum-icavi, 2008. 3) BIO-RAD MRC-600 Laser Scanning Confocal Imaging System, 1991. 4) Biotechnologie Evžen Amler, Lucie Koláčná. 5). Zásady sterilizace a dezinfekce ve zdravotnických zařízeních, V. Melicherčíková 6) Vymětalová, V., Biologie pro biomedicínské inženýrství, ČVUT, Praha, 2008. 7) ) Filová, Eva, a kol.: Analysis and three-dimensional visualization of collagen in artificial scaffolds using nonlinear microscopy techniques, Journal of Biomedical Optics, 2010.
7.2 Internetové zdroje: 8) http://fyzika.fce.vutbr.cz/file/kusak/konfokalni_mikroskopie.pdf 9) http://sterilpack.com/ 10)http://www.dentalex.cz/produkty/sterilizacni-technika/sterilizatory.html 11) http://www.bmt.cz/ 12) http://www.xray.cz/kryst/difrakce/steinhart/tlaky.htm 13) http://l125lsx.mbu.cas.cz/GMOLab/Pravidla.html 14) http://www.laboratorydesign.com/public/air_conditioning.html 15)www.laka.cz 16) http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp01150.pdf
20
