Translationeel onderzoek naar de rol van “A Disintegrin And Metalloprotease 19” (ADAM-19) en de purinerge receptor P2Y6 in de pathogenese van COPD
Liesbeth RENNEBOOG
Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen
Promotor: Prof. Dr. Brusselle Vakgroep Inwendige Ziekten Dienst Longziekten Universiteit Gent – UZ Gent
Academiejaar 2010-2011
Translationeel onderzoek naar de rol van “A Disintegrin And Metalloprotease 19” (ADAM-19) en de purinerge receptor P2Y6 in de pathogenese van COPD
Liesbeth RENNEBOOG
Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen
Promotor: Prof. Dr. Guy Brusselle Vakgroep Inwendige Ziekten Dienst Longziekten Universiteit Gent – UZ Gent
Academiejaar 2010-2011
Voorwoord Graag had ik van dit voorwoord gebruik gemaakt om enkele mensen te bedanken.
Als eerste wil ik mijn promotor, Prof. Dr. G. Brusselle, bedanken voor het aanreiken van dit interessante onderwerp, het geven van suggesties voor het experimentele werk en het nalezen en verbeteren.
Verder gaat mijn dank uit naar mijn begeleider, Dr. Ken Bracke, voor de begeleiding gedurende het volledige proces van deze masterproef en de kennis en vaardigheden die je me hebt bijgebracht.
Daarnaast had ik graag alle leden van het labo, Dr. Tania Maes, Nele, Sharen, Ellen, Fien, Smitha, Anouck, Indra, Greet, Marie-Rose, Evelyn en Christelle bedankt voor alle raad en hulp die ik van jullie heb gekregen. In het bijzonder bedank ik Lisa voor de fijne samenwerking omtrent ADAM19, Eliane voor alle ‘tips en tricks’ in verband met de muizen, Katleen voor het opnemen van de beeldjes en Ann voor het beantwoorden van al mijn vragen, het maken van de foto’s, het in orde brengen van alle paperassen en de bijstand bij de immuunkleuringen.
Bedankt ook Marlies voor alle thesisconversaties en het nalezen van deze scriptie.
Een speciale dank gaat uit naar mijn ouders. Zij gaven me de kans deze studies aan te vatten en waren een grote steun.
Ten slotte had ik graag mijn familie, vrienden, ploeggenoten en Ina bedankt voor het luisterend oor, de motivatie en de fijne momenten van ontspanning.
Lijst met gebruikte afkortingen ADAM AP
A Disintegrin And Metallopeptidase Alkalische Fosfatase
APC
Antigen Presenterende Cel
ASL
Airway Surface Liquid
ATP
Adenosinetrifosfaat
BAL
Bronchoalveolaire Lavage
BSA
Bovine Serum Albumine
cAMP
Cyclisch Adenosinemonofosfaat
cDNA
Complementary DNA
CFTR
Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator
COPD
Chronic Obstructive Pulmonary Disease
DAMP
Damage-associated Molecular Pattern
DC
Dendritische Cel
DNA
Desoxyribonucleïnezuur
dNTP
Deoxyribonucleotide
ECM
Extracellulaire Matrix
EDTA
Ethyleendiaminetetraacetaat
EGFR
Epidermal Growth Factor Receptor
ELISA
Enzyme-linked Immunosorbent Assay
ErbB
v-erb-b2 Erythroblastische Leukemie Viraal Oncogeen Homoloog
FEV1
Forced Expiratory Volume
FVC
Forced Vital Capacity
GOLD
Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease
HBEC
Human Bronchial Epithelial Cell
HBSS
Hank’s Balanced Salt Solution
HIF-1
Hypoxia-inducible Factor 1
HPRT1 HRP
Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase 1 Horse Radish Peroxidase
ICS
Inhaled Corticosteroïds
IgG
Immunoglobuline G
IgG2a IHC
Immunoglobuline G2a Immunohistochemische Kleuring
IL
Interleukine
IP3
Inositoltrifosfaat
IQR
Interquartile Range
Jak1
Janus Kinase 1
MAPK MMP mRNA NE NRG-1 NRG1β1 OVA PAMP
Mitogen-activated Protein Kinases Matrix Metalloprotease Messenger RNA Neutrofiele Elastase Neureguline-1 Neureguline-1β1 Ovalbumine Pathogen-associated Molecular Pattern
PBS
Phosphate Buffered Saline
PLC
Fosfolipase C
PRR
Pattern Recognition Receptor
q-PCR
Real-time Polymerase Chain Reaction
RNA
Ribonucleïnezuur
ROS
Reactive Oxygen Species
SNP
Single Nucleotide Polymorphism
SPDEF
SAM Pointed Domain-containing Ets Transcription Factor
TLR
Toll-like Receptor
TMB
Tetramethylbenzidine
TRANCE UDP WHO
Tumor Necrosis Factor-related Activation-induced Cytokine Uridinedifosfaat World Health Organization
Inhoudsopgave
Samenvatting .............................................................................................................................. 1 1.
Inleiding .............................................................................................................................. 2 1.1
COPD........................................................................................................................... 2
1.1.1
Definitie en epidemiologie ................................................................................... 2
1.1.2
Diagnose en classificatie ...................................................................................... 3
1.1.3
Susceptibiliteit ...................................................................................................... 4
1.1.4
Inflammatie, emfyseem en luchtweghermodellering bij COPD .......................... 4
1.1.5
COPD is een systeemaandoening ......................................................................... 6
1.1.6
Behandeling .......................................................................................................... 6
1.2
Mucus .......................................................................................................................... 6
1.2.1
Samenstelling en functie ...................................................................................... 6
1.2.2
Productie en secretie van mucines........................................................................ 6
1.2.3
Regulatie van de productie van mucines .............................................................. 7
1.2.4
Mucus en COPD................................................................................................... 8
1.3
ADAM19 ..................................................................................................................... 9
1.4
P2Y6-receptor ............................................................................................................ 10
2.
Doelstelling ....................................................................................................................... 13
3.
Materiaal en methoden ...................................................................................................... 14 3.1
3.1.1
Muizen ................................................................................................................ 14
3.1.2
Rookblootstelling ............................................................................................... 14
3.1.3
Kenmerken van COPD ....................................................................................... 14
3.2
Isolatie materiaal........................................................................................................ 14
3.2.1
Isolatie materiaal uit het muismodel .................................................................. 14
3.2.2
Isolatie humaan materiaal................................................................................... 15
3.3
RT-PCR ..................................................................................................................... 15
3.3.1
RNA-extractie .................................................................................................... 15
3.3.2
cDNA-synthese .................................................................................................. 16
3.3.3
Real-time PCR.................................................................................................... 17
3.4
4.
Muismodel voor COPD ............................................................................................. 14
Immunohistochemische kleuring (IHC) .................................................................... 19
3.4.1
ADAM19 ............................................................................................................ 19
3.4.2
P2Y6 purinerge receptor .................................................................................... 20
3.5
ELISA ........................................................................................................................ 21
3.6
Statistische analyse .................................................................................................... 21
Resultaten .......................................................................................................................... 23
4.1
4.1.1
mRNA-expressie ................................................................................................ 23
4.1.2
Eiwitexpressie .................................................................................................... 25
4.1.3
Bepaling van de neureguline-1-concentratie ...................................................... 28
4.2
5.
ADAM19 ................................................................................................................... 23
Mucus ........................................................................................................................ 28
4.2.1
Expressie van de mucines Muc5ac en Muc5b ................................................... 28
4.2.2
Secretie van mucines: expressie van de P2Y6-receptor ..................................... 29
Bespreking ........................................................................................................................ 33
Algemeen besluit ...................................................................................................................... 34 Referentielijst ........................................................................................................................... 36
0
Samenvatting
Samenvatting Chronisch obstructief longlijden (COPD) is een aandoening die gekenmerkt wordt door pulmonale inflammatie, destructie van het longparenchym en hermodellering van de kleine luchtwegen. De belangrijkste risicofactor voor het ontwikkelen van COPD is het roken van sigaretten.
In deze masterproef werd de expressie van A Disintegrin And Metallopeptidase 19 (ADAM19) onderzocht in een muismodel voor COPD en in humaan longweefsel afkomstig van niet-rokers, rokers zonder COPD en COPD-patiënten. ADAM19 werd gelokaliseerd in de bronchiale gladde spierlaag en in de gladde spierlaag en het endotheel van bloedvaten. Ook werd expressie gezien in het alveolaire epitheel waar deze expressie bij de mens sterker bleek te zijn dan bij de muis. Er werd op eiwitniveau een significante toename van ADAM19expressie gezien in de luchtwegwand van muizen die gedurende één maand aan sigarettenrook werden blootgesteld.
Mucushypersecretie is een belangrijke eigenschap van COPD. Dit veroorzaakt obstructie van de kleine luchtwegen. De belangrijkste componenten van mucus zijn water, dat de hoofdcomponent vormt, en mucines. Muc5ac is een belangrijk mucine in de luchtwegen. Na één maand rookblootstelling is de expressie ervan in muizen met de helft gestegen. Na zes maanden rookblootstelling is deze expressie twee tot drie maal verhoogd. In de regulatie van de productie van dit mucine lijkt de Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) een belangrijke rol te spelen. Een ligand van deze receptor is neureguline-1 (NRG-1). Expressie van NRG-1 was significant hoger in het bronchoalveolaire lavagevocht van muizen die één maand aan rook werden blootgesteld.
De regulatie van productie en secretie van mucines gebeurt onafhankelijk van elkaar. Mucinesecretie wordt gereguleerd door nucleotide agonisten via P2Y purinerge receptoren. Expressie van een van deze receptoren, de P2Y6-receptor, bleek zeer sterk, tot 10 maal, verhoogd te zijn in het bronchiale epitheel van de longen van patiënten die lijden aan zeer ernstig COPD.
1
Inleiding
1. Inleiding 1.1 1.1.1
COPD Definitie en epidemiologie
Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD) is een aandoening die in 2002 de vijfde grootste doodsoorzaak ter wereld vormde. [1]
GOLD, Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease, definieert COPD als volgt: “COPD is een te voorkomen en behandelbare ziektetoestand met enkele belangrijke extrapulmonale effecten die kunnen bijdragen aan de ernst van de ziekte. De pulmonale component van de aandoening wordt gekenmerkt door een luchtwegvernauwing die niet volledig reversibel is. Deze vernauwing is meestal progressief en geassocieerd met een abnormale inflammatoire respons van de longen na blootstelling aan schadelijke partikels of gassen.” [2] De luchtwegvernauwing wordt enerzijds veroorzaakt door obstructieve bronchiolitis en anderzijds door het verlies aan elasticiteit als gevolg van vernietiging van het longparenchym (emfyseem). [3] Ook luchtweghermodellering en systemische inflammatie werden aangetoond bij patiënten met COPD. [4]
De voornaamste risicofactoren voor de ontwikkeling van COPD zijn het roken van sigaretten en blootstelling aan rook afkomstig van biomassa brandstoffen. [5] Vroeger was de ziekte meer voorkomend bij mannen, maar als gevolg van het stijgende tabaksgebruik bij vrouwen in het Westen en het hogere risico voor vrouwen op blootstelling aan luchtvervuiling binnenshuis door verwarmen en/of koken met biomassa brandstoffen, treft de ziekte evenveel mannen als vrouwen. [1] Volgens schattingen van de World Health Organization (WHO) lijden 80 miljoen mensen aan milde tot ernstige COPD. In 2005 veroorzaakte COPD meer dan 3 miljoen sterfgevallen, wat overeenkomt met 5% van het globale aantal doden. Er wordt geschat dat het aantal dodelijke slachtoffers de komende 10 jaar met meer dan 30% zal stijgen en dat de aandoening zo tegen 2030 de derde grootste doodsoorzaak ter wereld zal vormen. Bijna 90% van alle COPD-sterftes komen voor in landen met lage en gemiddelde inkomens. Daarnaast is de ziekte ook een belangrijke veroorzaker van chronische arbeidsongeschiktheid. Dit alles zorgt ervoor dat COPD wereldwijd een grote sociale en economische last vormt. [1]
2
Inleiding 1.1.2
Diagnose en classificatie
De diagnose van COPD wordt vastgesteld aan de hand van de verhouding van de éénsecondewaarde (FEV1)-waarde ten opzichte van de geforceerde vitale capaciteit (FVC)waarde. Deze longfunctieparameters worden verkregen in een spirometrisch onderzoek. De FEV1/FVC-ratio (Tiffeneau-index) is een indicator voor luchtwegobstructie die onafhankelijk is van de grootte van de longen. Deze verhouding is groter dan of gelijk aan 80% in gezonde personen en neemt af met stijgende leeftijd. Roken is een belangrijke oorzaak van versnelde longfunctie-afname (Figuur 1). Er is sprake van COPD wanneer de waarde voor de verhouding FEV1/FVC kleiner is dan 70%. [2]
Figuur 1. Afname van de FEV1. (figuur aangepast van Fletcher C, Peto R. The Natural History of Chronic Airflow Obstruction. British Medical Journal. 1977;1:1645-1648. [6]) Roken zorgt bij personen vatbaar voor de effecten van roken, voor een versnelde afname van de longfunctie, hier uitgedrukt met behulp van de éénsecondewaarde (FEV1). [6]
Classificatie van COPD op basis van het criterium ernst gebeurt met behulp van de FEV1waarde. GOLD classificeert COPD-patiënten in vier stadia: mild (I), matig (II), ernstig (III) en zeer ernstig (IV) (Tabel 1). [2]
3
Inleiding
Tabel 1. Classificatie van COPD (aangepast van [2]) Stadia
Kenmerken
Stadium I - Mild
FEV1/FVC < 0.70 FEV1 ≥ 80% van de voorspelde waarde
Stadium II - Matig
FEV1/FVC < 0.70 50 % ≤ FEV1 < 80% van de voorspelde waarde
Stadium III - Ernstig
FEV1/FVC < 0.70 30 % ≤ FEV1 < 50% van de voorspelde waarde
Stadium IV - Zeer Ernstig
FEV1/FVC < 0.70 FEV1 < 30% van de voorspelde waarde of FEV1 < 50% van de voorspelde waarde en chronisch respiratoir falen
1.1.3
Susceptibiliteit
Het risico voor het ontwikkelen van COPD is afhankelijk van de duur van de blootstelling aan sigarettenrook en van de hoeveelheid, maar de vatbaarheid voor de ziekte is zeer variabel in de populatie: slechts 15-20% van de rokers ontwikkelen COPD (Figuur 1). Dit suggereert dat genetische factoren hierin betrokken zijn. [5] Reeds geruime tijd is bekend dat α1antitrypsinedeficiëntie een risicofactor is voor het ontwikkelen van de aandoening. Recent werden verscheidene nieuwe onafhankelijke loci, significant geassocieerd aan de FEV1- en/of FEV1/FVC-waarden, geïdentificeerd in meta-analyses van verscheidene genome-wide association studies in meer dan 20 000 Europese patiënten, gebruikmakend van ongeveer 2 534 500 Single Nucleotide Polymorphisms (SNP’s) en gecorrigeerd voor rookstatus. [7] 1.1.4
Inflammatie, emfyseem en luchtweghermodellering bij COPD
De moleculaire en cellulaire mechanismes verantwoordelijk voor de ontwikkeling van COPD zijn niet goed gekend. Wel is reeds aangetoond dat langdurige blootstelling aan sigarettenrook leidt tot een inflammatie van de long waarbij inflammatoire cellen zoals macrofagen, neutrofielen, dendritische cellen (DC’s) en CD8+ T-lymfocyten naar de luchtwegen en het longweefsel worden aangetrokken. [4] Er worden verhoogde aantallen neutrofielen en macrofagen, belangrijke cellen van het aangeboren immuunsysteem, gevonden in het bronchoalveolaire lavagevocht (BAL-vocht) en in het sputum, alsook in biopsieën van luchtwegen en longweefsel van COPD-patiënten. Ook het aantal B- en T-lymfocyten, 4
Inleiding typische cellen van het verworven immuunsysteem, is verhoogd in de luchtwegen en longen van deze patiënten. [8] Verscheidene chemo- en cytokines kunnen een belangrijke rol spelen in de aantrekking en activering van deze inflammatoire cellen. [9] In patiënten met ernstige tot zeer ernstige COPD zijn lymfefollikels aanwezig in de peribronchiale wand. In een COPD-muismodel werd een significante verhoging in het aantal peribronchiale follikels waargenomen na langdurige blootstelling aan sigarettenrook. [4] Neutrofielen, macrofagen, CD8+ T-lymfocyten en DC’s kunnen proteases secreteren die de extracellulaire matrix (ECM) van de longen beschadigen wanneer ze de concentratie van hun inhibitoren (antiproteases) overstijgen. Onvolledig herstel van het elastine en de andere bestanddelen
van
de
ECM
resulteert
in
pulmonair
emfyseem.
Dit
wordt
de
protease/antiprotease-onevenwichtshypothese genoemd. Directe aanleiding voor deze hypothese was de ontdekking van het verhoogde risico op pulmonair emfyseem bij rokers met een α1-antitrypsinedeficiëntie en het feit dat intratracheale toediening van papaïne, een plantaardig protease, emfyseem veroorzaakte in proefdieren. Vele andere proteases worden sindsdien gelinkt aan COPD of pulmonair emfyseem, onder andere neutrofiele elastase (NE), serine proteases, cysteïne proteases en matrix metalloproteases (MMP’s). [3]
De luchtweghermodellering is gekenmerkt door fibrose in de perifere wand van kleine luchtwegen of bronchiolen. Dit zou een gevolg kunnen zijn van een opregulatie van genen betrokken in ECM afzetting in de luchtwegen. Het zijn vooral de respiratoire bronchiolen die luchtweghermodellering ondergaan. Deze vormen de overgang tussen de luchtwegen en de alveolaire ruimtes en hebben zowel luchttransport- als gasuitwisselingsfuncties. [10] Figuur 2 geeft een overzicht van de pathogenese van COPD. [11]
5
Inleiding
Figuur 2. Pathogenese van COPD. (aangepast van Chung KF, Adcock IM. Multifaceted mechanisms in COPD: inflammation, immunity, and tissue repair and destruction. European Respiratory Journal. 2008;31(6):1334-1356. [11])
1.1.5
COPD is een systeemaandoening
COPD geeft naast pulmonale effecten, ook aanleiding tot verscheidene extrapulmonale of systemische effecten zoals skeletspierdysfunctie, cardiovasculaire aandoeningen, osteoporose en diabetes. Er wordt aangenomen dat bij deze aandoeningen, net zoals bij COPD, inflammatie aan de basis ligt van de pathogenese. COPD patiënten hebben significant verhoogde niveaus van verschillende circulerende inflammatoire merkers, die de aanwezigheid van een systemische inflammatie aanduiden. [12, 13] 1.1.6
Behandeling
Huidige therapie van COPD is, naast stoppen met roken, gelimiteerd tot symptomatische behandeling met behulp van bronchodilatatoren en/of inhalatiecorticosteroïden. Deze medicijnen beïnvloeden het natuurlijke verloop van de ziekte niet, noch voorkomen ze het onderliggende inflammatoire proces.
6
Inleiding 1.2 1.2.1
Mucus Samenstelling en functie
Mucus is een extracellulaire gel waarin water (97%) en mucines, dit zijn zeer geglycosyleerde eiwitten, de belangrijkste componenten vormen. Daarnaast zijn ook andere eiwitten, zouten, lipiden en cellulaire debris aanwezig in mucus. Mucus houdt ingeademde toxines vast en transporteert hen uit de longen door middel van twee mechanismen, het hoestmechanisme en de ciliaire klaring. Een deficiënte mucusbarrière geeft bijgevolg aanleiding tot meer kwetsbare longen. Excessieve mucus of verminderde klaring worden daarentegen gezien in de pathogenese van alle veel voorkomende luchtwegaandoeningen zoals COPD en astma. [14] Mucushypersecretie wordt in verband gebracht met meer frequente en langdurige infecties, afname van longfunctie en verhoogde morbiditeit en mortaliteit bij COPD-patiënten. [15] 1.2.2
Productie en secretie van mucines
Het oppervlakte-epitheel van intrapulmonaire luchtwegen is opgebouwd uit twee celtypes: gecilieerde en secretoire cellen. Secretoire cellen secreteren, zowel constitutief als geïnduceerd, mucines, maar ook antimicrobiële, immunomodulerende en beschermende molecules die allen kunnen ingebouwd worden in mucus. In de grote luchtwegen dragen submucosale klieren bij tot de secretie van mucines en water. Deze klieren zijn opgebouwd uit proximaal gelegen muceuze en distaal gelegen sereuze cellen. Muceuze cellen secreteren mucines, terwijl sereuze cellen proteoglycanen en antimicrobiële eiwitten loslaten. Deze klieren kunnen bij ziekte fors toenemen in volume. [14]
Mucines worden gecodeerd door 17 genen in het humane genoom. Zeven ervan worden gesecreteerd, de andere mucines zijn membraangebonden. Vijf gesecreteerde mucines hebben terminale cysteïnerijke domeinen die disulfidebindingen kunnen aangaan en zo polymeren kunnen vormen, wat belangrijk is voor een gel. Twee van deze, MUC5AC en MUC5B, worden sterk geëxpresseerd in de luchtwegen. Muc5ac wordt bij gezonde personen vooral geproduceerd in de proximale luchtwegen door een type secretoire cellen, de gobletcellen. Muc5b wordt doorheen alle luchtwegen gesecreteerd door zowel secretoire cellen als submucosale klieren. Een MUC5B-deletie bij muizen leidt tot lethale longinflammatie, terwijl muizen met een MUC5AC-deletie gezond zijn. Hieruit zou de hypothese kunnen gesteld worden dat Muc5b zorgt voor een basis barrière en klaring bij mens en muis, terwijl Muc5ac bij de mens de proximale barrière en klaring zou kunnen verhogen. [14] 7
Inleiding 1.2.3
Regulatie van de productie van mucines
De productie van Muc5ac is sterk geregeld op transcriptioneel en translationeel niveau, wat interessant kan zijn voor klinische toepassingen. Een belangrijke rol lijkt weggelegd voor signallering via receptoren van de Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR)-familie, ook gekend als ErbB-receptoren (v-erb-b2 erythroblastische leukemie viraal oncogeen homoloog), aangezien hun inhibitoren Muc5ac-opregulatie door verscheidene stimuli op transcriptioneel en translationeel vlak verhinderen. Tot deze stimuli behoren onder andere virussen, interleukines 4, 9, 17, 23 en acroleïne, een component van sigarettenrook. Deze zijn allen volledig of partieel werkzaam via het T-helper-2-cytokine IL-13 (Figuur 3). De regulatie van Muc5b-expressie is minder gekend. [14]
Kettle
et
al.
identificeerden
neureguline-1β1
(NRG1β1)
als
een
regulator
van
gobletcelvorming in primaire culturen van humane bronchiale epitheliale cellen (HBECs). Dit eiwit is lid van de neureguline groeifactorfamilie, die bestaat uit vier leden: NRG1-4. NRG1 heeft minstens 15 isovormen als gevolg van alternatieve splicing. NRG1β1 verhoogde de expressie van Muc5ac en Muc5b-eiwitten op een tijds- en dosisafhankelijke manier in deze HBEC-culturen. Ze onderzochten ook de rol van NRG1β1 in gobletcelvorming in vivo met behulp van een ovalbumine (OVA)-muismodel, een model waarbij gobletcellen snel verschijnen na één enkele of multipele ovalbuminechallenges. Naast een significante stijging van beide mucines, werd ook een stijging van NRG1β1 gevonden in het BAL-vocht van deze muizen. In een andere studie werd in bronchiale biopsieën van patiënten met COPD een stijging van NRG1 gevonden, maar er werd geen verband met mucus onderzocht. [15]
8
Inleiding
Figuur 3. Productie Muc5ac. Fahy JV, Dickey BF. Airway Mucus Function and Dysfunction. The New England Journal of Medicine. 2010;363(23):2233-2247. [14] IL-13 bindt op een receptor die de IL-4Rαsubunit bevat, en activeert zo het Janus kinase 1 (Jak1), wat leidt tot de fosforylatie van Stat6. Activatie van Stat6 leidt dan tot een verhoogde expressie van SPDEF (SAM pointed domain-containing Ets transcription factor), welke meerdere genen betrokken in mucusmetaplasie opreguleert, en inihibeert de expressie van Foxa2, een transcriptiefactor die Muc5ac negatief reguleert. Binding van verschillende liganden, waaronder EGF (Epidermal Growth Factor), TGF-α, amphireguline en neureguline, aan ErbB-receptoren leidt tot activatie van MAPK (mitogen-activated protein kinases) of HIF-1 (hypoxia-inducible factor 1). Muc5ac bevat een geconserveerde HIF-1-bindingssite. [14]
1.2.4
Mucus en COPD
Obstructie van de kleine luchtwegen door mucus is karakteristiek voor COPD. Deze obstructie correleert met veranderingen in de expressie van de mucinegenen, het aantal en de grootte van gobletcellen, expansie van submucosale klieren en de occlusie van kleine luchtwegen met mucus. De invloed van sigarettenrook op mucus is nog niet volledig gekend, maar activatie van ErbB-receptoren, verminderde functie van de CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator), negatieve effecten op structuur en functie van cilia en proïnflammatoire effecten die mucineproductie verhogen en mucushydratatie en –klaring verlagen zouden betrokken zijn. [14]
9
Inleiding
1.3
ADAM19
Een gen waarvoor in de studie van Hancock et al. een significante associatie werd aangetoond tussen SNP’s en FEV1/FVC-waarden, is het ADAM19-gen. Een van deze SNP’s geeft aanleiding tot een missense mutatie, de andere SNP’s zijn gelegen in intronen of 3’onvertaalde regio’s. [7]
ADAM19 (A Disintegrin And Metallopeptidase 19) is een lid van de ADAM(A Disintegrin And Metalloprotease)-familie. Dit zijn membraanverankerde glycoproteïnes, opgebouwd uit een prodomein, een metalloproteïnasedomein, een disintegrinedomein, een cysteïnerijke regio, een Epidermal-Growth Factor repeat, een transmembranair domein en een cytoplasmatisch gedeelte (Figuur 4). [16]
ADAM’s zijn betrokken in de regulatie van membraanfusie en cel-cel- en celmatrixinteracties via de binding van specifieke integrines aan het disintegrinedomein. Het is ook reeds aangetoond dat ADAM’s een rol spelen in “shedding”, dit is het losknippen van een substraat
van
de
celmembraan,
van
de
ectodomeinen
van
proproteïnes
zoals
membraanverankerde cytokines en groeifactoren, via hun metalloproteïnasedomein. [17] ADAM33 werd recent gelinkt aan bronchiale hyperreactiviteit en versnelde achteruitgang van de longfunctie. [18] ADAM17, ook gekend als het TNFα-converting enzyme (TACE), knipt onder andere membraangebonden Tumor Necrosis Factor-α (TNFα), waardoor dit los komt van de celmembraan en actief wordt. TNFα is een proïnflammatoir cytokine en een belangrijke mediator van het immuunsysteem. In het longweefsel van ratten blootgesteld aan tabak in een COPD model werd een verhoogde ADAM17-productie gezien in vergelijking met controledieren. [19]
Figuur 4. Structuur van ADAM. Paulissen G, Rocks N, Gueders MM, Crahay C, Quesada-Calvo F, Bekaert S, Hacha J, El Hour M, Foidart J-M, Noel A, Cataldo DD. Role of ADAM and ADAMTS metalloproteinases in airway diseases. Respiratory Research. 2009;10(1):127. [16] ADAMs zijn opgebouwd uit een prodomein, een cleavage site, een metalloproteïnasedomein, een disintegrinedomein, een cysteïnerijke regio (Cys-rich), een Epidermal-growth factor repeat (EGF-like), een transmembranair domein (TM) en een cytoplasmatisch gedeelte.
10
Inleiding Ook ADAM19 is in staat TNF-α los te knippen van de celmembraan. Daarnaast is ADAM19 verantwoordelijk voor shedding van het tumor necrosis factor-related activation-induced cytokine (TRANCE, ook gekend als RANK ligand), dat ook een immunomodulerende rol heeft, naast een belangrijke rol in de differentiatie en functie van osteoclasten. [20, 21] Andere gekende substraten van ADAM19 zijn neuregulines, waaronder NRG1β1, en c-kit ligand (ook gekend als stem cell factor), dat onder andere migratie, maturatie, proliferatie en activatie van mastcellen in vivo reguleert. Zeer recent werd c-kit gebruikt als een merker voor stamcellen van de humane long. [22] ADAM19 kan deze substraten ook losknippen van de membraan (“shedding”). [20, 23, 24] Colokalisatie van ADAM19 en ADAM17 werd aangetoond.
In een immunohistochemische kleuring van humaan longweefsel werd gezien dat ADAM19 voornamelijk voorkomt in bronchiaal glad spierweefsel en in bronchiale en alveolaire epitheliale cellen. [17] mRNA van ADAM19 is abundant in long-, bot- en hartweefsel. SNP’s in het ADAM19gen werden ook geassocieerd met een verminderde botdensiteit (osteoporose). [25] 1.4
P2Y6-receptor
De P2Y6-receptor is lid van de familie van de purinerge receptoren, die in twee groepen kunnen worden gesplitst: P2X- en P2Y-receptoren. Terwijl P2X-receptoren enkel door ATP geactiveerd kunnen worden, bestaat de P2Y-receptorgroep uit acht G-proteïnegekoppelde receptoren die worden geactiveerd door ATP, ADP, UTP, UDP en UDP-suikers uit het extracellulaire milieu. [26] Extracellulaire nucleotiden fungeren als Damage Associated Molecular Patterns (DAMP’s) en induceren de Antigen Presenterende Cellen (APC’s) tot het initiëren van de aangeboren immuniteit door het triggeren van de secretie van proïnflammatoire cytokines (Figuur 5). [27] In verschillende epithelia, waaronder humaan gastrointestinaal, respiratoir en renaal epitheel, wordt door stimulatie van P2Y-receptoren transepitheliaal ionentransport geactiveerd. P2Y-receptoren worden geëxpresseerd in de apicale en/of basolaterale membranen van praktisch elk gepolariseerd epitheel om het transport van vocht en elektrolyten te reguleren. [26, 28]
11
Inleiding De P2Y6-receptor heeft UDP als agonist, wordt aan de apicale en basolaterale zijde van humane epitheliale luchtwegcellen geëxpresseerd en is net als de P2Y2-receptor gekoppeld aan het G-proteïne Gq en fosfolipase C. [29] P2Y6-receptorexpressie werd ook aangetoond op humane monocyten. [30]
Figuur 10. Afferente en efferente component van het aangeboren immuunsysteem. (aangepast van Brusselle GG, Joos GJ, Bracke KR. New insights into the immunology of COPD. The Lancet. 2011; In Press [27]) Sigarettenrook activeert epitheliale cellen, macrofagen en neutrofielen door het triggeren van Pattern Recognition Receptors (PRR’s) zoals Toll-like receptoren (TLR’s) en purinerge receptoren (bv P2Y2, P2Y6, P2X7). Dit kan ofwel op een directe manier gebeuren via bestanddelen van sigarettenrook of indirect via release van Damage-associated Molecular Patterns (DAMP’s) door apoptotische of necrotische cellen. Virale en bacteriële luchtweginfecties kunnen chronische inflammatie bij COPD versterken door het triggeren van PRR’s via Pathogen-associated Molecular Patterns (PAMP’s). Door het triggeren van PRR’s worden de cellen van het aangeboren immuunsysteem geactiveerd en secreteren ze proïnflammatoire cytokines en chemokines, Reactive Oxygen Species (ROS) en proteolytische enzymen (neutrofiele elastase en matrix metalloproteases). [27]
In het luchtwegepitheel is de P2Y2 receptor de predominante receptor gekoppeld aan fosfolipase C (PLC) en calciumsignaalcascade. Binding van ATP en UTP, uit de airway surface liquid (ASL) in het lumen, leidt uiteindelijk tot verhoging van de intracellulaire calciumconcentraties. Als gevolg hiervan wordt de calciumafhankelijke chloorsecretie geactiveerd en de natriumreabsorptie geïnhibeerd. Regulatie van chloorsecretie en natriumreabsorptie is noodzakelijk om de samenstelling en de dikte van de ASL, die de mucusklaring beïnvloedt, te behouden. [26] Daarnaast bevordert activering van P2Y2receptor ook ciliaire klaring en mucinesecretie. [29]
12
Inleiding De moleculaire mechanismes betrokken in de activering van chloorsecretie via de P2Y6receptor in het humane respiratoire epitheel zijn nog niet volledig gekend. Naast fosfolipase C (PLC),
inositoltrifosfaat
(IP3)
en
calciumsignaleringspathways,
worden
ook
calciumonafhankelijke mechanismen gesuggereerd, zoals het cAMP-afhankelijke CFTR chloorkanaal (Figuur 6). [26]
Figuur 6. Gesuggereerd model voor Cl- secretie door apicale en basolaterale P2Y6-receptoren. (aangepast van Wong AM, Chow AW, Au SC, Wong Cc, Ko Wh. Apical versus Basolateral P2Y6 Receptor-Mediated Cl- Secretion in Immortalized Bronchial Epithelia. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 2008;40(6):733-745. [26])
13
Doelstelling
2. Doelstelling Het verder ontrafelen van de moleculaire en cellulaire mechanismes die leiden tot COPD, kan aanleiding geven tot identificatie van nieuwe therapeutische targets en een efficiënte behandeling van deze ziekte in tegenstelling tot de huidige symptomatische therapie. Eén van de karakteristieken van de aandoening is mucushypersecretie, wat enerzijds resulteert in een chronische hoest en anderzijds bijdraagt tot kortademigheid door de obstructie van kleine luchtwegen. Daarom worden in deze masterproef de onderliggende moleculaire en cellulaire mechanismen onderzocht die aanleiding geven tot mucusproductie en mucussecretie en dit zowel in een muismodel voor COPD als in humaan longweefsel.
1) Aangezien gekend is dat ADAM19, een gen waarvoor in de studie van Hancock et al. een significante associatie werd aangetoond tussen SNP’s en FEV1/FVC-waarden, in staat is neuregulines, waaronder NRG1β1, los te knippen van de membraan, kan ADAM19 via de EGF (ErbB)-receptorsignalisatie betrokken zijn bij de hyperproductie van Muc5ac in de pathogenese van COPD. Neureguline-1 is immers een ligand voor de EGFR. [7, 15, 24] Dit wordt onderzocht door ADAM19-expressie na te gaan op mRNA- en eiwitniveau. Ook de expressie van de mucines Muc5ac en Muc5b op mRNA-niveau wordt onderzocht. Daarnaast wordt via een enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)-test nagegaan of de concentratie neureguline-1 verhoogd is in het BAL-vocht bij het COPD-muismodel.
2) De expressie van de purinerge P2Y6-receptor wordt nagegaan aan de hand van immunohistochemische kleuring van humane longweefselcoupes, aangezien deze receptor een rol in de mucussecretie kan hebben.
14
Materiaal en methoden
3. Materiaal en methoden 3.1 3.1.1
Muismodel voor COPD Muizen
Voor het muismodel wordt gebruik gemaakt van mannelijke C57BL/6 muizen. Deze worden gehuisvest in steriele kooien met filter en krijgen voedsel en water ad libitum. 3.1.2
Rookblootstelling
Muizen worden vier maal per dag, met telkens een half uur interval, blootgesteld aan de rook van vijf sigaretten met behulp van een rooktoestel en een rookkamer. Hiervoor worden gestandaardiseerde onderzoekssigaretten (Reference Cigarette 3R4F zonder filter, University of Kentucky Tobacco and Health Research Foundation, Lexington, USA) gebruikt. Door toediening van perslucht wordt in de rookkamer een optimale sigarettenrook/lucht-ratio van 1/6 bekomen. Deze blootstelling gebeurt vijf dagen per week en wordt vier weken (subacuut model) of 24 weken (chronisch model) aangehouden. Controlegroepen worden blootgesteld aan lucht. 3.1.3
Kenmerken van COPD
Zowel subacute als chronische blootstelling leidt tot inflammatie in bronchoalveolair lavage (BAL)–vocht en longparenchym met een verhoogde accumulatie van macrofagen, neutrofielen, T-lymfocyten en dendritische cellen. Bij chronische blootstelling is er ook vorming van peribronchiale lymfefollikels, luchtweghermodellering en ontwikkeling van pulmonaal emfyseem.
3.2 3.2.1
Isolatie materiaal Isolatie materiaal uit het muismodel
Vierentwintig uur na laatste rookblootstelling worden de muizen gewogen en gedood door een intraperitoneaal geïnjecteerde overdosis Nembutal (Safoni, Libourne, Frankrijk), waarna bloed gecollecteerd wordt uit de retro-orbitale plexus. Na blootlegging van de trachea, wordt hierin een canule gebracht waarlangs de longen worden gelaveerd. Hiervoor wordt eerst drie keer 300 µl Hank’s balanced salt solution (HBSS) (Lonza, Basel, Zwitserland) met 1% Bovine Serum Albumine (BSA) (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA) gebruikt. 15
Materiaal en methoden Vervolgens worden de longen gelaveerd met drie maal 1 ml HBSS waaraan ethyleendiaminetetraacetaat (EDTA) (Sigma-Aldrich) werd toegevoegd, wat ervoor zorgt dat cellen gemakkelijker loskomen.
Wanneer het BAL-vocht gecollecteerd is, worden de longen gespoeld. Hiertoe wordt een knipje gemaakt in het linkeratrium waarlangs een infuus met fysiologische oplossing (0,9% NaCl) wordt ingebracht die de longen, via de pulmonale circulatie, spoelt. Na het plaatsen van een klemmetje tussen de linker- en rechterlong, wordt de rechterlong gereseceerd. De middelste longkwab wordt gebruikt voor RNA-isolatie en wordt bewaard in RNAlater (Qiagen, Hilden, Duitsland) bij -80°C.
De linkerlong wordt gefixeerd door infusie van 2 ml 4% paraformaldehyde via de tracheale canule met behulp van een pomp, wordt nadien uit de borstkas gesneden en overgebracht in een buisje met fixatief (4% paraformaldehyde). De long fixeert dan 2 uur verder op een rotor bij kamertemperatuur. Door het weefsel te fixeren worden stofwisselingsprocessen ten einde gebracht. Vervolgens wordt het longweefsel in Phosphate Buffered Saline (PBS) (Lonza) gebracht en 2 uur gespoeld, waarna het in PBS kan worden opgeslagen bij 4°C. Deze gefixeerde long kan dan ingebed worden in paraffine om op deze manier langer bewaard te kunnen worden en in coupes te kunnen worden gesneden. Het longweefsel wordt dan eerst met behulp van een stijgende reeks alcoholbaden ontwaterd, waarna het in xyleen wordt gebracht. Ten slotte worden hiervan 3 µm coupes gesneden met een microtoom. 3.2.2
Isolatie humaan materiaal
Humaan longweefsel werd verkregen van patiënten die een operatie ter behandeling van longkanker of een longtransplantatie ondergingen. Het gebruikte longweefsel werd zo ver mogelijk van de tumor genomen. Een deel van het longweefsel wordt gebruikt voor RNAisolatie en wordt, net als bij de muis, bewaard in RNAlater (Qiagen). Het overige longweefsel wordt overgebracht in een buisje met fixatief en fixeert bij kamertemperatuur 4 uur op een rotor. Nadien ondergaat het dezelfde behandeling als het gefixeerde longweefsel van de muis.
16
Materiaal en methoden 3.3 3.3.1
RT-PCR RNA-extractie
Uit het longweefsel bewaard in de RNAlater-oplossing, wordt de totale hoeveelheid RNA geëxtraheerd. Na omzetting tot cDNA kan men via real-time Polymerase Chain Reaction (qPCR) de hoeveelheid mRNA bepalen van ADAM19 en de mucines Muc5ac en Muc5b. Voor RNA-extractie wordt gebruikt gemaakt van de miRNeasy Mini-kit (Qiagen). In dit systeem binden alle RNA-moleculen aan een selectief silicamembraan met behulp van een zoutrijk buffersysteem. Dit systeem bevat twee buffers, buffer RWT en buffer RPE.
De eerste stap in RNA-extractie is het homogeniseren en lyseren van het longweefsel. Hiertoe wordt de longkwab overgebracht in een buisje dat 700 µl QIAzol lysis reagent bevat, waarna het weefsel verkleind en gehomogeniseerd wordt met behulp van een mixer. Na vijf minuten rust op kamertemperatuur wordt 140 µl chloroform aan het buisje toegevoegd. Dit mengsel moet 15 seconden krachtig geschud worden en wordt enkele minuten op kamertemperatuur gerust. Hierna wordt het homogenaat gecentrifugeerd gedurende 15 minuten op 4°C bij 12000 g. Na centrifugatie is het staal in drie verschillende fases opgedeeld. De bovenste waterige fase wordt in een nieuw buisje gebracht samen met 525 µl ethanol (100%), waarna 700µl hiervan op een RNeasy Mini-kolom, geplaatst in een opvangbuisje, wordt gebracht en dit gecentrifugeerd wordt gedurende 15 seconden op kamertemperatuur bij 8000 g (10000 toeren per minuut). De flowthrough wordt weggegooid. Deze stap kan worden herhaald tot wanneer het volledige staal over de kolom gepasseerd is. Ethanol verzekert een optimale bindingsomgeving voor het membraan van de kolom. Vervolgens wordt de kolom gewassen door het toevoegen van 700 µl RWT-buffer op de kolom waarna dit gedurende 15 seconden en bij 8000 g gecentrifugeerd wordt. Wanneer de resterende RWT-buffer uit de kolom verwijderd is, wordt 500 µl RPE-buffer op de kolom gepipetteerd. De kolom wordt dan opnieuw gewassen door centrifugatie gedurende 15 seconden bij 8000 g. Deze stap wordt herhaald, maar dan wordt gecentrigueerd gedurende twee minuten, waardoor resterende ethanol verwijderd wordt. Ten slotte wordt de kolom overgebracht naar een nieuw opvangbuisje alvorens er 50 µl RNase-vrij water rechtstreeks op het kolommembraan wordt gepipetteerd. Na centrifugatie gedurende 1 minuut bij 8000 g, komt het RNA los van het membraan en elueert in het buisje. De concentratie van het RNA wordt bepaald met behulp van spectrofotometrie (NanoDrop, Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA).
17
Materiaal en methoden 3.3.2
cDNA-synthese
cDNA-synthese gebeurt met behulp van de Transcriptor Universal cDNA Master-kit (Roche, Basel, Zwitserland). Van elk RNA-staal wordt 1000 ng template RNA aangelengd met RNase-vrij H2O tot 15 µl. Vervolgens wordt aan elke staal 1 µl Transcriptor Universal Reverse Transcriptase (Roche) en 4 µl Transcriptor Universal Reaction Buffer (Roche) toegevoegd. Deze mix wordt kort gecentrifugeerd, waarna de cDNA-synthese wordt uitgevoerd door een heatblock. Dit gebeurt in verschillende stappen. Als eerste gebeurt primer annealing bij 25°C gedurende 5 minuten. Vervolgens grijpt de reverse transcription fase plaats bij 55°C gedurende 10 minuten. Ten slotte denatureren de RNA-DNA heteroduplexen bij 85°C gedurende 5 minuten.
Er wordt een pool gemaakt voor het maken van een verdunningsreeks. Dit is nodig om een standaardcurve te kunnen opstellen bij de real-time PCR (q-PCR). Hiervoor wordt 5 µl cDNA uit elk staal bij elkaar gevoegd. Het resterende cDNA wordt 1/10 verdund door het toevoegen van 135 µl RNase-vrij H2O. Dit cDNA kan bij -20°C worden bewaard. 3.3.3
Real-time PCR
Als eerste wordt een verdunningsreeks gemaakt voor de standaardcurve met behulp van de pool cDNA. Volgende verdunningen worden gemaakt: 1/5, 1/10, 1/20, 1/40 en 1/80. Nadien wordt de q-PCR-mix gemaakt. Deze bestaat uit de Light Cycler 480 Probe Master mix (Roche) en de Assay-on-Demand mix (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). De Master mix bevat DNA polymerase, dNTP’s en buffer, de Assay-on-Demand mix bevat specifieke primers en TaqMan-probes voor het te testen gen. De mRNA-expressie van Muc5ac, Muc5b en ADAM19 wordt genormaliseerd door middel van de expressiewaarden van een huishoudgen, hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1). Een huishoudgen is een gen dat ongeacht de behandeling (dus ook ongeacht rookblootstelling) in dezelfde mate tot expressie komt.
In alle wells wordt de q-PCR-mix gepipetteerd. Aan twee wells wordt H2O toegevoegd, dit zijn de blanco’s. Aan de daaropvolgende wells wordt de verdunningsreeks toegevoegd, dit gebeurt in tweevoud. Aan de andere wells wordt telkens het 1/10 verdunde cDNA toegevoegd (Figuur 7). Deze plaat wordt in het Light Cycler 480-apparaat (Roche) gebracht waar ze drie verschillende stappen ondergaat. In de eerste fase wordt de plaat verhit bij 95°C gedurende 10 18
Materiaal en methoden minuten, wat “hot-start” DNA polymerase activeert. De tweede fase, die 50 maal herhaald wordt, bestaat uit een denaturatiefase bij 95°C gedurende 10 seconden en een annealing- en extensiefase bij 60°C gedurende 15 seconden. In de annealingsfase binden de primers specifiek aan het te amplificeren cDNA-fragment. In de extensiefase worden de primers door het Taq polymerase geëlongeerd waarbij het cDNA als template functioneert. Dit gebeurt exponentieel tot wanneer een limiet bereikt wordt. Dit wordt de plateaufase genoemd. De vierde en laatste fase vindt plaats bij 40°C en wordt 30 seconden aangehouden.
A B C D E F G H
1 Bl St1 St7 St13 St17 St23 St29
2 Bl St1 St7 St13 St17 St23 St29
3 S1/5 St2 St8 St14 St18 St24 St30
4 S1/5 St2 St8 St14 St18 St24 St30
5 S1/10 St3 St9 St15 St19 St25 St31
6 S1/10 St3 St9 St15 St19 St25 St31
7 S1/20 St4 St10 St16 St20 St26 St32
8 S1/20 St4 St10 St16 St20 St26 St32
9 S1/40 St5 St11
10 S1/40 St5 St11
11 S1/80 St6 St12
12 S1/80 St6 St12
St21 St27
St21 St27
St22 St28
St22 St28
Figuur 7. Voorbeeld indeling 96-wellplaat bij q-PCR. In wells A1 en A2 bevinden zich de blanco’s. Wells 3 tot en met 12 vormen de verdunningsreeks die gebruikt wordt voor het opstellen van de standaardcurve. De overige wells worden gevuld met cDNA uit de overeenkomstige stalen.
q-PCR is een techniek die wordt gebruikt voor simultane amplificatie en kwantificatie van een doelwit DNA molecule. Deze is hier Muc5ac, Muc5b, ADAM19 of het huishoudgen HPRT. Door middel van fluorescentie wordt de relatieve expressie van genen bepaald. In dit onderzoek werd gebruik gemaakt van de TaqMan-probes (Figuur 8). Hierbij zorgt de 5’-3’ exonuclease-activiteit van het Taq-polymerase voor klieving van een dubbelgelabelde probe tijdens hybridisatie aan de targetsequentie. Aan het 5’-einde van de probe is een fluorofoor covalent gebonden aan een oligonucleotide en aan het 3’-einde is op dezelfde wijze een quenchermolecule gebonden. De quenchermolecule vangt de fluorescentie uitgezonden door de fluorofoor als het ware op wanneer ze zich binnen een bepaalde afstand van elkaar bevinden. Bij klieving van de probe komt de fluorofoor vrij van de quenchermolecule en kan de fluorescentie opgevangen worden door de sensoren van het Light Cycler-apparaat. De gedetecteerde hoeveelheid fluorescentie is dus proportioneel aan de hoeveelheid gekliefd fluorofoor. De Ct-waarde, dit is de cyclus waarin de fluorescentie een bepaalde drempelwaarde overschrijdt is omgekeerd evenredig met het expressieniveau van het geteste gen.
19
Materiaal en methoden
Figuur 8. Werkingsmechanisme van de TaqMan-probe. (Applied Biosystems)
3.4 3.4.1
Immunohistochemische kleuring (IHC) ADAM19
ADAM19-molecules worden in de longweefselcoupes gevisualiseerd met behulp van een immunohistochemische kleuring. Hiervoor wordt gebruik gemaakt van een anti-ADAM19 monoklonaal antilichaam (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA).
Een eerste stap is het deparaffineren van de coupes. Deze worden 5 minuten in Ultraclear (Klinipath, Geel, België) gedompeld in een incubatie-oven bij 37°C. Deze stap wordt drie keer herhaald. Nadien worden de coupes voor vijf minuten eerst tweemaal in 100% ethanol (Klinipath), dan tweemaal in 96% ethanol en ten slotte in gedestilleerd water gebracht. Voor het vrijkomen van de antigenische epitopen wordt vervolgens een antigen retrieval stap uitgevoerd. De coupes worden gedurende 10 minuten in een 78°C-warme citraatoplossing geïncubeerd. Na afkoeling en wasstappen in gedestilleerd water en PBS (Lonza) worden de coupes gedurende 30 minuten geïncubeerd met Boehringer blocking agent (Roche) waaraan 0,3% Triton (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) is toegevoegd. Dit vermindert hydrofobe achtergrondkleuring. Triton is een detergent dat zorgt voor een betere spreiding en maakt celmembranen permeabel waardoor het antilichaam optimaal kan binden.
20
Materiaal en methoden Vervolgens worden de coupes overnacht (voor de humane coupes) of gedurende 1 uur (voor de muiscoupes) geïncubeerd met het primaire rat anti-muis monoklonaal anti-ADAM19 antilichaam (R&D Systems) in een 1/300 verdunning (voor de humane coupes) of een 1/100 verdunning (voor de muiscoupes). Controlecoupes worden geïncubeerd met isotype rat IgG2a (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA).
Visualisatie gebeurt na een aantal wasstappen in PBS met behulp van de Rat on Mouse Alkaline Phosphatase (AP) Polymer Kit (Biocare Medical, Concord, CA, USA). Hiervoor worden de coupes eerst met Rat Probe geïncubeerd, waarna incubatie met rat polymeer AP volgt. Beide incubaties duren 15 minuten. Ten slotte worden de coupes aangekleurd met de Dako Fuchsin+ kit (Dako, Glostrup, Denemarken) waaraan 6,4 µl levamisole (Sigma) werd toegevoegd. Als gevolg van enzymatische activiteit van het AP ontstaat er een rode kleuring waar ADAM19 gelokaliseerd is. Ten slotte volgt tegenkleuring met haematoxyline (Mayer’s Haematoxyline, Sigma) en 5 minuten spoelen met kraantjeswater. Afdekken van de coupes gebeurt met Aquatex (Merck, Darmstadt, Duitsland).
Aankleuring van ADAM19 in de luchtwegwand in longen afkomstig van muizen al dan niet blootgesteld aan rook, werd gekwantificeerd met behulp van AxioVision Image Analysis software (Carl Zeiss, Zaventem, België). Deze software berekent de aangekleurde oppervlakte tussen de basale membraan en de buitenzijde van de luchtweg. Deze waarde wordt dan genormaliseerd ten opzichte van de lengte van de basale membraan. Van elke muis werden meerdere beelden opgenomen en gekwantificeerd, waarna het gemiddelde werd genomen. 3.4.2
P2Y6 purinerge receptor
Na het deparaffineren van de coupes (zie 4.1), wordt een antigen retrievalstap uitgevoerd door de coupes te incuberen in een verwarmde trypsine-oplossing. Na afkoeling en wasstappen in gedestilleerd water en PBS (Lonza), worden de coupes gedurende 10 minuten geïncubeerd met een PBS-oplossing waaraan 3% waterstofperoxide (Merck) werd toegevoegd. Er wordt opnieuw gewassen met PBS. Vervolgens worden de coupes geïncubeerd met Boehringer blocking agent (Roche) waaraan 0,3% Triton (Sigma-Aldrich) is toegevoegd. In een volgende stap worden de coupes geïncubeerd met het primair anti-P2Y6R-antilichaam (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) of het konijn IgG-isotype (Abcam, Cambridge, UK). Dit gedurende 24 uur bij kamertemperatuur. Nadien worden de coupes gewassen met PBS en geïncubeerd gedurende 30 minuten met geit-anti-konijn IgG dat polygeconjugeerd is met het 21
Materiaal en methoden enzyme Horse Radish Peroxidase (HRP). Na een nieuwe wasstap met PBS, wordt de P2Y6receptor gevisualiseerd met behulp van DAB+ substraat (Dako). Dit substraat wordt voor 15 minuten op de coupes gebracht. Tegenkleuring gebeurt met haematoxyline (Sigma) gedurende 15 seconden. Na 5 minuten spoelen met kraantjeswater worden de coupes gedehydrateerd en afgedekt met mounting medium (Prosan, Merelbeke, België).
Kwantificatie van de P2Y6 aankleuring in het epitheel van luchtwegen uit humane longen gebeurt met behulp van AxioVision Image Analysis software (Carl Zeiss). Deze software berekent hier de aangekleurde oppervlakte tussen de apicale zijde van het bronchiale epitheel (omtrek van het lumen) en de basale membraan. Deze waarde wordt dan genormaliseerd ten opzichte van de omtrek van de basale membraan. Van elke patiënt werden meerdere beelden opgenomen en gekwantificeerd, waarna het gemiddelde werd genomen.
3.5
ELISA
Ter bepaling van de hoeveelheid neureguline-1 (NRG-1) in BAL-vocht van de muis werd gebruikt gemaakt van een enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)-kit voor NRG-1 (Uscn Life Science Inc., Wuhan, China). Deze kit bevat een microplaat die geprecoated werd met een monoklonaal anti-NRG1 antilichaam specifiek voor de muis. De standaarden (aanwezig in de kit), blanco en stalen worden vervolgens in de wells van de microplaat gebracht. Als standaarden werd een verdunningsreeks gemaakt van een standaardoplossing volgens de instructies van de kit. Na 2 uur incubatie bij 37°C in de incubatie-oven, wordt de vloeistof uit elke well verwijderd, hierdoor worden ongebonden antigenen verwijderd. Vervolgens wordt een biotinegeconjugeerd polyclonaal anti-NRG1 antilichaam toegevoegd aan elke well, waarna een incubatie volgt van 1 uur bij 37°C. Na een aantal wasstappen wordt alle vloeistof uit de microplaat verwijderd en avidinegeconjugeerd HRP toegevoegd aan elke well waarna deze geïncubeerd wordt gedurende 30 minuten bij 37°C. Na deze incubatie ondergaat de microplaat opnieuw enkele wasstappen. Ten slotte wordt het substraat in elke well gebracht. Dit substraat is tetramethylbenzidine (TMB). Door activiteit van het HRPenzyme worden de wells blauw gekleurd wanneer deze NRG1 bevatten. Deze reactie wordt dan stopgezet met een zwavelzuurbevattende oplossing waardoor de blauwe kleur in geel verandert. Deze kleur wordt vervolgens gemeten met behulp van een spectrofotometer bij een golflengte van 450 nm. De concentratie van NRG1 in de stalen wordt dan bepaald aan de hand van de standaardcurve waarin de absorbantiewaarden van de verdunningsreeks werden uitgezet ten opzichte van de concentratie. 22
3.6
Statistische analyse
De verkregen data wordt statistisch geanalyseerd met behulp van de Sigma Stat software (SPSS Inc, Chicago, USA). De gegevens worden aan niet-parametrische tests onderworpen. De Kruskall-Wallis test is een niet-parametrische test die de gemiddelden van drie of meer groepen met elkaar vergelijkt. De Mann-Whitney test is een niet-parametrische test die de verdeling van twee groepen met elkaar vergelijkt. Een p-waarde kleiner dan 0.05 wordt significant beschouwd. Ook wordt gebruik gemaakt van de Fisher’s exact test voor de analyse van tabellen met twee rijen en twee kolommen.
23
Resultaten
4. Resultaten 4.1 4.1.1
ADAM19 mRNA-expressie
a) Muismodel De mRNA-expressie van ADAM19 in het longweefsel van muizen al dan niet blootgesteld aan sigarettenrook gedurende 1 maand of 6 maanden werd nagegaan. Per groep werd uit 5 muizen RNA geëxtraheerd uit totaal longweefsel. De PCR’s tonen zowel na 1 als 6 maand een lichte daling in ADAM19 expressie in de rookblootgestelde muizen ten opzichte van de aan luchtblootgestelde controle. Deze verschillen zijn echter niet statistisch significant (Figuur 9).
ADAM19
mRNA expressie
2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 1m air
1m smoke
6m air
6m smoke
Figuur 9. mRNA-hoeveelheden van ADAM19 uit het totaal longweefsel van muizen uit het COPDmuismodel. Er wordt geen signficant verschil waargenomen tussen aan lucht- of rookblootgestelde muizen.
b) Humaan ADAM19-expressie op mRNA-niveau werd ook onderzocht in humaan longweefsel onderverdeeld in 3 groepen: niet-rokers, rokers zonder COPD en patiënten met COPD. Weefsel werd verkregen van 57 individuen, van wie de relevante gegevens opgelijst staan in Tabel 2.
24
Resultaten Nooit gerookt
Rokers
COPD
10
18
29
3/7 #
12/6 #
26/3 #
61 (50-70)
61 (52-69)
67 (59-72)
-
7/11
17/12
0 (0-0)
35 (19-46)*
40 (30-55)*
FEV1 (L)
2,6 (2,0-3,0)
3,2 (2,7-3,5)
2 (1,8-2,6)§
FEV1 (% voorspelde waarde)
103 (84-104)
108 (93-113)
66 (55-77)*§
77 (73-84)
77 (71-81)
56 (51-61)*§
0/10 #
0/18 #
11/18 #
Aantal Verhouding geslacht (mannelijk/vrouwelijk) Leeftijd (jaren) Huidig-roker / Ex-roker Rookgeschiedenis (pakjaren)
FEV1 / FVC (%) ICS (ja/nee)
Tabel 2. Patiënteigenschappen. De FEV1- en FVC-waarden werden gemeten na gebruik van een bronchodilator. ICS staat voor geïnhaleerde corticosteroïden (inhaled corticosteroids). De waarden zijn weergegeven als mediaan-waarden (IQR, interquartile range). * p< 0.05 vs nooit gerookt (Mann-Whitney-test); § p<0.05 vs rokers (Mann-Whitney-test); # p<0.001 (Fisher’s exact test)
Zoals te zien is in Figuur 10 wordt er geen statistisch significant verschil in de expressie van ADAM19 op mRNA-niveau waargenomen tussen de verschillende patiëntengroepen.
ADAM19
mRNA expressie
4
3
2
1
et C O PD ro ke rm
C O PD on de r ro ke rz
ni et -r ok er
0
Figuur 10. mRNA-expressie van ADAM19 in humaan longweefsel. mRNA-hoeveelheden van ADAM19 bij de verschillende groepen. Er wordt geen significant verschil waargenomen. De uitgezette waarden zijn een verhouding van de ADAM19-expressie ten opzichte van de Hprt1-expressie. HPRT1 is een huishoudgen, dat ongeacht de behandeling altijd en in dezelfde mate tot expressie komt.
25
Resultaten 4.1.2
Eiwitexpressie
a) Muismodel ADAM19-proteïne werd met behulp van immuunkleuring aangetoond in longweefselcoupes uit het COPD-muismodel. De coupes zijn afkomstig van de muizen waarvoor ook mRNAexpressie onderzocht werd. Aankleuring wordt vastgesteld ter hoogte van de bronchiale gladde spierlaag, de gladde spierlaag van bloedvaten en het endotheel. Ook is er lichte aankleuring te zien ter hoogte van het bronchiale en alveolaire epitheel (Figuur 11).
Figuur 11. Immunohistochemische kleuring van ADAM19 in longweefsel van C57BL/6 muizen. ADAM19aankleuring in longweefselcoupes afkomstig van muizen blootgesteld aan rook (A) of lucht (B) gedurende 1 maand en van muizen chronisch (6 maanden) blootgesteld aan rook (C) of lucht (D). Aankleuring gebeurde met behulp van een antilichaam specifiek voor ADAM19.
26
Resultaten Vervolgens werd de ADAM19-eiwitexpressie in de luchtwegwand gekwantificeerd. Deze is significant verhoogd na 1 maand rookblootstelling (Figuur 12A). Bij de chronische proef is er een lichte stijging op te merken die weliswaar niet statistisch significant is (Figuur 12B).
Figuur 12. ADAM19-eiwitexpressie. ADAM19-eiwitexpressie in longweefselcoupes afkomstig van muizen blootgesteld aan lucht of rook gedurende 1 maand (A) of 6 maand (B) wordt weergegeven. Dit werd gemeten met behulp van Image Analysis Software en wordt uitgezet in oppervlakte van de aankleuring (genormaliseerd voor de lengte van de basale membraan). Het gemiddelde in elke groep wordt getoond. ** p<0.01
b) Humaan Vervolgens werd de lokalisatie van ADAM19 bestudeerd in humaan longweefsel op eiwitniveau. Hiervoor werden longweefselcoupes gebruikt afkomstig van een niet-roker (Figuur 13), een roker zonder COPD (Figuur 14), een ex-roker met mild tot matig COPD (GOLD stadium I-II) (Figuur 15) en een ex-roker die lijdt aan ernstig tot zeer ernstig COPD (GOLD stadium IV) (Figuur 16).
Figuur 13. Immunohistochemische kleuring van ADAM19 op humaan longweefsel van een niet-roker. Rode aankleuring van ADAM19 in glad spierweefsel, endotheel en alveolair epitheel (13A). Geen aankleuring bij de isotypecontrole (13B).
27
Resultaten
Figuur 14. Immunohistochemische kleuring van ADAM19 op humaan longweefsel van een roker zonder COPD. Rode aankleuring van ADAM19 in glad spierweefsel, endotheel en alveolair epitheel (14A). Geen aankleuring bij de isotypecontrole (14B).
Figuur 15. Immunohistochemische kleuring van ADAM19 op humaan longweefsel van een ex-roker met COPD I-II. Rode aankleuring van ADAM19 in glad spierweefsel, endotheel en alveolair epitheel (15A). Ook hier geen aankleuring bij de isotypecontrole (15B).
Figuur 16. Immunohistochemische kleuring van ADAM19 op humaan longweefsel van een ex-roker met COPD IV. Rode aankleuring van ADAM19 in het endotheel en alveolair epitheel (16A). Geen aankleuring bij de isotypecontrole (16B).
28
Resultaten Net als bij de coupes afkomstig van het muismodel wordt sterke ADAM19-aankleuring aangetroffen in bronchiaal glad spierweefsel en in het gladde spierweefsel en endotheel van bloedvaten. Er is ook aankleuring van het alveolair epitheel. Dit lijkt bij de mens sterker te zijn dan bij de muis. In figuren 13 en 16 worden koolstofpartikels waargenomen, deze zijn een gevolg van roken en/of luchtvervuiling. Er is geen kwantificatie gebeurd van de aankleuring, maar met het blote oog kunnen er geen grote verschillen waargenomen worden. 4.1.3
Bepaling van de neureguline-1-concentratie
Met behulp van de ELISA-techniek wordt de hoeveelheid neureguline-1, een substraat van ADAM19 en ligand van de EGFR, in het BAL-vocht van muizen bepaald. Er wordt een statistisch significante stijging waargenomen tussen de groep die 1 maand werd blootgesteld aan lucht en de groep die 1 maand rookblootstelling onderging. Tussen de groepen die chronisch werden blootgesteld, is er geen significant verschil (Figuur 17).
Figuur 17. Bepaling van de concentratie van Neureguline-1 (NRG-1) in BAL-vocht van C57BL/6 muizen. De hoeveelheid NRG-1 in het BAL-vocht afkomstig van muizen blootgesteld aan lucht of rook gedurende 1 maand of 6 maanden wordt weergegeven. * p<0.05
4.2
4.2.1
Mucus Expressie van de mucines Muc5ac en Muc5b
De mRNA-expressie van Muc5ac en Muc5b in het longweefsel van muizen al dan niet blootgesteld aan sigarettenrook gedurende 1 maand of 6 maanden wordt nagegaan. Hiervoor wordt RNA geëxtraheerd uit totaal longweefsel van 8 muizen per groep.
29
Resultaten Er wordt significant meer Muc5ac op mRNA-niveau geëxpresseerd in de groep die 1 maand rookblootstelling onderging in vergelijking met de aan luchtblootgestelde muizen. Dit verschil is nog meer uitgesproken wanneer de chronisch blootgestelde groepen worden vergeleken. Het baselineniveau van Muc5ac-expressie is constant wanneer men de acute en chronische controlegroep bekijkt (Figuur 18).
Figuur 18. Expressie van Muc5ac op mRNA-niveau in longweefsel van C57BL/6 muizen. De uitgezette waarden zijn een verhouding van de Muc5ac-expressie ten opzichte van de Hprt1-expressie. HPRT1 is een huishoudgen, dat ongeacht de behandeling altijd en in dezelfde mate tot expressie komt.
Vervolgens wordt op dezelfde manier de expressie van Muc5b onderzocht. Er wordt geen statistisch significant verschil tussen de verschillende groepen waargenomen (Figuur 19).
Figuur 19. Expressie van Muc5b op mRNA-niveau in longweefsel van C57/BL6 muizen. De uitgezette waarden zijn opnieuw een verhouding van de Muc5b-expressie ten opzichte van de Hprt1-expressie.
30
Resultaten 4.2.2 Ten
Secretie van mucines: expressie van de P2Y6-receptor
slotte
wordt
de
expressie
van
de
P2Y6-receptor
bestudeerd
op
humane
longweefselcoupes van 87 patiënten aan de hand van een immunohistochemische kleuring (Tabel 4). Aankleuring werd vastgesteld ter hoogte van het bronchiale epitheel (Figuur 2023). Van elke coupe worden meerdere luchtwegen opgenomen en geanalyseerd.
Niet-roker
Roker zonder COPD
(Ex)-roker met COPD I-II
Ex-roker met COPD II-IV
Aantal
11
27
37
12
Verhouding geslacht (mannelijk/vrouwelijk)
3/8
20/7 #
36/1 #
8/4
60 (51-69)
59 (52-69)
67 (58-72)
55(51-59)
0 (0-0)
25 (20-44)*
41 (25-60)*
34(29-39)*
FEV1 (% voorspeld)
103 (92-118)
102 (91-113)
80 (69-87)*§
24(16-27)*§°
FEV1 (L)
2,6 (2,1-3,1)
3,2 (2,6-3,6)
2,6 (2-2,9)§
0,6(0,6-0,7)*§°
76 (74-83)
76 (71-81)
60 (55-64)*§
33(27-39)*§°
Leeftijd (in jaren) Rookgeschiedenis (pakjaren)
FEV1 / FVC (%)
Tabel 4. Patiënteigenschappen. De FEV1- en FVC-waarden werden gemeten na gebruik van een bronchodilator. De waarden zijn weergegeven als mediaan-waarden (IQR, interquartile range). * p< 0.0001 vs niet-roker (Mann-Whitney-test); § p<0.0001 vs roker zonder COPD (Mann-Whitney-test); ° p<0.0001 vs roker met COPD I-II (Mann-Whitney-test); # p<0.001 (Fisher’s exact test)
Vervolgens wordt de expressie van P2Y6R in het luchtwegepitheel gekwantificeerd met behulp van de Image Analyzer (Carl Zeiss). De expressie van P2Y6R is in bronchiaal epitheel van patiënten met COPD stadium IV is zeer sterk verhoogd ten opzichte van de expressie in alle andere groepen die werden onderzocht (Figuur 24). Ook is de expressie van P2Y6R omgekeerd evenredig met de waarde van de éénsecondewaarde (uitgedrukt in % van de verwachte waarde) (Figuur 25).
31
Resultaten
Figuur 20. IHC van de P2Y6-receptor bij een niet-roker. Bruine aankleuring van P2Y6R in bronchiaal epitheel (20B). Geen aankleuring bij de isotypecontrole (20A).
Figuur 21 IHC van de P2Y6-receptor bij een roker zonder COPD. Bruine aankleuring van P2Y6R in bronchiaal epitheel (21B). Geen aankleuring bij de isotypecontrole (21A).
Figuur 22. IHC van de P2Y6-receptor bij een patiënt met COPD I-II. Bruine aankleuring van P2Y6R in bronchiaal epitheel (22B). Geen aankleuring bij de isotypecontrole (22A).
Figuur 23. IHC van de P2Y6-receptor bij een patiënt met COPD IV. Zeer sterke bruine aankleuring van P2Y6R in bronchiaal epitheel (23B). Geen aankleuring bij de isotypecontrole (23A).
32
Resultaten
Figuur 24. Kwantificatie van P2Y6R-expressie in humaan bronchiaal epitheel. Expressie wordt uitgedrukt in aankleuringsoppervlakte genormaliseerd ten opzichte van de lengte van de basale membraan. De y-as is logaritmisch weergegeven. ** p< 0.01; *** p< 0.001
Figuur 25. Relatie tussen P2Y6R-expressie en de éénsecondewaarde. R² geeft de sterkte weer van de lineaire regressie.
33
Bespreking
5. Bespreking Blootstelling aan sigarettenrook is de belangrijkste risicofactor voor het ontwikkelen van COPD, een aandoening die gekarakteriseerd wordt door pulmonale inflammatie, destructie van het longparenchym en hermodellering van de kleine luchtwegen. Een gen waarvoor in de studie van Hancock et al. een significante associatie werd aangetoond tussen SNP’s in dit gen en een verminderde longfunctie, is het ADAM19-gen. [7] Daarom werd in deze masterproef de expressie van ADAM19 nagegaan in een muismodel voor COPD en in humaan longweefsel afkomstig van niet-rokers, rokers zonder COPD en COPD-patiënten. ADAM19 werd gelokaliseerd ter hoogte van de bronchiale gladde spierlaag en in de gladde spierlaag en het endotheel van bloedvaten. Expressie werd ook gezien in het alveolaire epitheel waar deze expressie humaan sterker blijkt te zijn dan bij de muis. In de muis werd ook lichte aankleuring van het bronchiale epitheel gezien. In tegenstelling tot de bevindingen van Dijkstra et al. is aankleuring van humaan bronchiaal epitheel hier afwezig. [17] Rookblootstelling, zowel één maand als zes maanden, heeft geen effect op de hoeveelheid ADAM19 mRNA die werd geëxpresseerd in het COPD muismodel. Naar analogie hiermee, zien we ook geen verschil in ADAM19 mRNA-expressie tussen niet-rokers, rokers en COPD-patiënten. Op basis van deze mRNA-resultaten lijkt ADAM19 geen rol te spelen in het ziekteproces van COPD. Op eiwitniveau is er echter een toename van ADAM19-expressie in de luchtwegwand van muizen die gedurende 1 maand aan sigarettenrook zijn blootgesteld. Het feit dat dit verschil op mRNA-niveau niet wordt weergegeven kan een gevolg zijn van het gebruik van RNA afkomstig van totaal longweefsel voor de bepaling van het expressieniveau. Door totaal longweefsel te gebruiken zal een verschil van RNA-expressie in de luchtwegwand moeilijker aangetoond kunnen worden.
Een belangrijke eigenschap van COPD is mucushypersecretie, dat obstructie van kleine luchtwegen veroorzaakt. Deze obstructie correleert onder andere met veranderingen in de expressie van de mucinegenen. Mucines vormen, naast de hoofdcomponent water, de belangrijkste bouwstenen van mucus. Belangrijke mucines in de luchtwegen zijn Muc5ac en Muc5b. Productie van Muc5ac kan humaan tot 200 keer verhogen bij bijvoorbeeld allergie, terwijl deze van Muc5b slechts matig verhoogt (3 tot 10 maal). In de luchtwegen van gezonde muizen, die overeenstemmen met de humane distale luchtwegen, wordt bijna geen Muc5ac geproduceerd. [14] Hier zien we dat op mRNA-niveau de expressie van Muc5ac geassocieerd is met rookblootstelling. Reeds na 1 maand roken is deze expressie met de helft gestegen en transcripten van het mucine Muc5ac zijn twee tot drie maal verhoogd na zes maanden 34
Algemeen besluit rookblootstelling. Dit is in overeenstemming met de bevindingen van Caramori et al. die aan de hand van immunohistochemische kleuring een verhoogde Muc5ac-expressie hebben aangetoond in de bronchiale submucosale klieren van COPD-patiënten. [31]
De Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) lijkt een belangrijke rol te spelen in de regulatie van de productie van Muc5ac, maar dit werkingsmechanisme is nog niet volledig gekend. [14] Een ligand van EGFR is neureguline-1. Neureguline-1 kan onder andere door ADAM19 van de celmembraan worden geknipt en hierdoor geactiveerd worden. Expressie van dit substraat werd onderzocht in het BAL-vocht van muizen uit het COPD-model, omdat dit vocht de geactiveerde vorm bevat. Deze eiwitexpressie van neureguline-1 is significant hoger in muizen die één maand aan rook werden blootgesteld. In het chronische model wordt slechts een lichte verhoging gezien van de hoeveelheid neureguline-1 na zes maanden roken.
Na één maand roken is de expressie van Muc5ac met de helft gestegen. Hoewel neureguline-1 slechts licht stijgt bij chronische blootstelling, zijn transcripten van het mucine Muc5ac twee tot drie maal verhoogd na zes maanden rookblootstelling. Dit suggereert dat er op lange termijn ook andere liganden van EGFR of andere mechanismes betrokken kunnen zijn in de regulatie van de productie van Muc5ac.
Productie en secretie van mucines worden onafhankelijk van elkaar gereguleerd. Nucleotide agonisten reguleren mucinesecretie via P2Y purinerge receptoren. [32] Lommatzsch et al. toonden hogere concentraties van ATP aan in het BAL-vocht van rokers, terwijl de hoogste concentraties ATP werden aangetroffen in het BAL-vocht van COPD-patiënten. [33] In deze masterproef werd de expressie van een van deze purinerge receptoren, de P2Y6-receptor, gekwantificeerd in het bronchiale epitheel van de longen van niet-rokers, rokers zonder COPD en patiënten met COPD (verschillende stadia). Patiënten met zeer ernstige COPD (GOLD stadium IV) blijken een zeer sterk verhoogde expressie van deze receptor te vertonen. Alle groepen beschouwd, verhoudt de expressie van de P2Y6-receptor zich ook omgekeerd evenredig met de longfunctie. Een gestegen aantal P2Y6-receptoren in het bronchiale epitheel kan dus een van de oorzaken van mucushypersecretie bij COPD vormen. Deze mucushypersecretie werd reeds in verband gebracht met meer frequente en langdurige infecties, afname van longfunctie en verhoogde morbiditeit en mortaliteit bij COPD-patiënten. [15]
35
Algemeen besluit
Algemeen besluit Blootstelling aan sigarettenrook induceert een toename van ADAM19-expressie in de luchtwegwand. Dit membraangebonden eiwit met metalloprotease activiteit heeft onder andere neureguline-1 als substraat. De eiwitexpressie van neureguline-1 is toegenomen in het BAL-vocht van muizen die gedurende één maand blootgesteld werden aan rook. Binding van neureguline-1 op de EGFR geeft aanleiding tot verhoogde productie van Muc5ac.
Secretie van Muc5ac staat onder regulatie van nucleotide-agonisten via de purinerge receptoren. Patiënten met zeer ernstig COPD blijken een zeer sterk verhoogde expressie van de P2Y6-receptor te vertonen in het luchtwegepitheel. Dit kan aanleiding geven tot een verhoogde secretie van Muc5ac. Een overzicht wordt weergegeven in Figuur 26.
Figuur 26. Productie en secretie van Muc5ac. ADAM19 knipt neureguline-1 (NRG-1) los van de celmembraan (shedding). NRG-1 bindt op de Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR). Dit leidt uiteindelijk tot verhoogde productie van Muc5ac. Uridinedifosfaat (UDP) bindt de P2Y6-receptor en reguleert zo mucinesecretie. werd in deze masterproef werd aangetoond bij de mens (oranje pijl) of bij de muis (rode pijl).
36
Referentielijst
Referentielijst 1.
http://www.who.int/respiratory/copd/burden/en/.
2.
GOLD. Global Strategy For The Diagnosis, Management, And Prevention of Chronic
Obstructive Pulmonary Disease (Updated 2010). 2010. 3.
Bracke K, Cataldo D, Maes T, Gueders M, Noël A, Foidart J-M, Brusselle G, Pauwels
RA. Matrix Metalloproteinase-12 and Cathepsin D Expression in Pulmonary Macrophages and Dendritic Cells of Cigarette Smoke-Exposed Mice. International Archives of Allergy and Immunology. 2005;138(2):169-179. 4.
Bracke K, D'hulst A, Maes T, Moerloose KB, Demedts IK, Lebecque S, Joos GF,
Brusselle GG. Cigarette Smoke-Induced Pulmonary Inflammation and Emphysema Are Attenuated in CCR6-Deficient Mice. The Journal of Immunology. 2006;177:4350-4359. 5.
RA Pauwels KR. Burden and Clinical Features of Chronic Obstructive Pulmonary
Disease (COPD). Lancet. 2004;364:613-620. 6.
Fletcher C, Peto R. The Natural History of Chronic Airflow Obstruction. British
Medical Journal. 1977;1:1645-1648. 7.
Hancock DB, Eijgelsheim M, Wilk JB, Gharib SA, Loehr LR, Marciante KD,
Franceschini N, van Durme YMTA, Chen T-h, Barr RG, Schabath MB, Couper DJ, Brusselle GG, Psaty BM, van Duijn CM, Rotter JI, Uitterlinden AG, Hofman A, Punjabi NM, Rivadeneira F, Morrison AC, Enright PL, North KE, Heckbert SR, Lumley T, Stricker BHC, O'Connor GT, London SJ. Meta-analyses of Genome-Wide Association Studies Identify Multiple Loci Associated With Pulmonary Function. Nature Genetics. 2009;42(1):45-52. 8.
Maes T, Bracke KR, Vermaelen KY, Demedts IK, Joos GF, Pauwels RA, Brusselle
GG. Murine TLR4 Is Implicated in Cigarette Smoke-Induced Pulmonary Inflammation. International Archives of Allergy and Immunology. 2006;141(4):354-368. 9.
Bracke KR, D'Hulst AI, Maes T, Demedts IK, Moerloose KB, Kuziel WA, Joos GF,
Brusselle GG. Cigarette Smoke-Induced Pulmonary Inflammation, But Not Airway Remodelling, Is Attenuated In Chemokine Receptor 5-Deficient Mice. Clinical & Experimental Allergy. 2007;37:1467-1479. 10.
Salazar LM, Herrera AM. Fibrotic Response of Tissue Remodeling in COPD. Lung.
2011;189(2):101-109. 11.
Chung KF, Adcock IM. Multifaceted Mechanisms in COPD: Inflammation,
Immunity,
and
Tissue
Repair
and
Destruction.
2008;31(6):1334-1356. 37
European
Respiratory
Journal.
12.
Referentielijst Sinden NJ, Stockley RA. Systemic Inflammation and Comorbidity in COPD: A Result
of 'Overspill' of Inflammatory Mediators From the Lungs? Review of the Evidence. Thorax. 2010;65(10):930-936. 13.
Pauwels NS, Bracke KR, Maes T, Pilette C, Joos GF, Brusselle GG. The Role of
Interleukin-6 in Pulmonary and Systemic Manifestations in a Murine Model of Chronic Obstructive Pulmonary Disease. Experimental Lung Research. 2010;36(8):469-483. 14.
Fahy JV, Dickey BF. Airway Mucus Function and Dysfunction. The New England
Journal of Medicine. 2010;363(23):2233-2247. 15.
Kettle R, Simmons J, Schindler F, Jones P, Dicker T, Dubois G, Giddings J, Van
Heeke G, Jones CE. Regulation of Neuregulin 1 -Induced MUC5AC and MUC5B Expression in Human Airway Epithelium. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 2009;42(4):472-481. 16.
Paulissen G, Rocks N, Gueders MM, Crahay C, Quesada-Calvo F, Bekaert S, Hacha J,
El Hour M, Foidart J-M, Noel A, Cataldo DD. Role of ADAM and ADAMTS Metalloproteinases in Airway Diseases. Respiratory Research. 2009;10(1):127. 17.
Dijkstra A, Postma DS, Noordhoek JA, Lodewijk ME, Kauffman HF, Hacken NHT,
Timens W. Expression of ADAMs (“A Disintegrin And Metalloprotease”) in the Human Lung. Virchows Archiv. 2009;454(4):441-449. 18.
Gosman MME, Boezen HM, Diemen CCv, Snoeck-Stroband JB, Lapperre TS,
Hiemstra PS, Hacken NHTt, Stolk J, Postma DS, Group GS. A Disintegrin And Metalloprotease 33 and Chronic Obstructive Pulmonary Disease Pathophysiology. Thorax. 2007;62:242-247. 19.
Ju CR, Xia XZ, Chen RC. Expressions of Tumor Necrosis Factor-Converting Enzyme
and ErbB3 in Rats With Chronic Obstructive Pulmonary Disease. Chin Med J (Engl). 2007;120(17):1505-10. 20.
Chesneau V. Catalytic Properties of ADAM19. Journal of Biological Chemistry.
2003;278(25):22331-22340. 21.
Tat SK, Pelletier J-P, Velasco CR, Padrines M, Martel-Pelletier J. New Perspective in
Osteoarthritis: The OPG and RANKL System as a Potential Therapeutic Target? The Keio Journal of Medicine. 2008;58(1):29-40. 22.
Kajstura J RM, Hall SR, Hosoda T, D'Amario D, Sanada F, Zheng H, Ogórek B,
Rondon-Clavo C, Ferreira-Martins J, Matsuda A, Arranto C, Goichberg P, Giordano G, Haley KJ, Bardelli S, Rayatzadeh H, Liu X, Quaini F, Liao R, Leri A, Perrella MA, Loscalzo J, Anversa P. Evidence for Human Lung Stem Cells. The New England Journal of Medicine. 38
Referentielijst 2011;364:1795-1806. 23.
Lyman SD, Jacobsen SE. c-Kit Ligand and Flt3 Ligand: Stem/Progenitor Cell Factors
With Overlapping Yet Distinct Activities. Blood. 1998 Feb 15;91(4):1101-34. 24.
Shirakabe K. Roles of Meltrin beta /ADAM19 in the Processing of Neuregulin.
Journal of Biological Chemistry. 2000;276(12):9352-9358. 25.
Styrkarsdottir U, Halldorsson BV, Gretarsdottir S, Gudbjartsson DF, Walters GB,
Ingvarsson T, Jonsdottir T, Saemundsdottir J, Snorradóttir S, Center JR, Nguyen TV, Alexandersen P, Gulcher JR, Eisman JA, Christiansen C, Sigurdsson G, Kong A, Thorsteinsdottir U, Stefansson K. New Sequence Variants Associated With Bone Mineral Density. Nature Genetics. 2008;41(1):15-17. 26.
Wong AM, Chow AW, Au SC, Wong Cc, Ko Wh. Apical versus Basolateral P2Y6
Receptor-Mediated Cl- Secretion in Immortalized Bronchial Epithelia. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 2008;40(6):733-745. 27.
Brusselle GG JG, Bracke KR. New Insights into the Immunology of COPD. The
Lancet. 2011; In Press. 28.
Davis C, Lazarowski E. Coupling of Airway Ciliary Activity and Mucin Secretion to
Mechanical Stresses by Purinergic Signaling. Respiratory Physiology & Neurobiology. 2008;163(1-3):208-213. 29.
Lazarowski ER, Boucher RC. Purinergic Receptors in Airway Epithelia. Current
Opinion in Pharmacology. 2009;9(3):262-267. 30.
Ben Yebdri F, Kukulski F, Tremblay A, Sévigny J. Concomitant Activation of P2Y2
and P2Y6 Receptors on Monocytes is Required for TLR1/2-Induced Neutrophil Migration by Regulating IL-8 Secretion. European Journal of Immunology. 2009;39(10):2885-2894. 31.
Caramori G, Casolari P, Di Gregorio C, Saetta M, Baraldo S, Boschetto P, Ito K,
Fabbri LM, Barnes PJ, Adcock IM, Cavallesco G, Chung KF, Papi A. MUC5AC Expression is Increased in Bronchial Submucosal Glands of Stable COPD Patients. Histopathology. 2009;55(3):321-331. 32.
Davis CW, Dickey BF. Regulated Airway Goblet Cell Mucin Secretion. Annual
Review of Physiology. 2008;70(1):487-512. 33.
Lommatzsch M, Cicko S, Muller T, Lucattelli M, Bratke K, Stoll P, Grimm M, Durk
T, Zissel G, Ferrari D, Di Virgilio F, Sorichter S, Lungarella G, Virchow JC, Idzko M. Extracellular Adenosine Triphosphate and Chronic Obstructive Pulmonary Disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 2010;181(9):928-934.
39
