Tipizálási módszerek alkalmazása methicillin-rezisztens Staphylococcus aureus (MRSA) törzsek molekuláris epidemiológiai vizsgálatai során Ungvári Erika, Tóth Ákos Magyar Infektológiai és Klinikai Mikrobiológiai Társaság Tudományos Ülése 2009. március 12.
Az MRSA törzsek epidemiológiai vizsgálata során használt tipizálási módszerek I. FENOTIPIZÁLÁSI MÓDSZEREK
Antibiotikum érzékenységi vizsgálatok Fágtipizálás (nemzetközi alap és kiegészítő fágsorozatok)
II. GENOTIPIZÁLÁSI MÓDSZEREK
Plazmid analizáló módszerek (plazmid profil, plazmid RFLP) Kromoszómális RFLP Hibridizáció-alapú tipizáló technikák (ribotipizálás, Tn554, IS256, mecA) PCR-alapú tipizáló technikák (spa, coa PCR-RFLP, RS-PCR, AP-PCR, RAPD,SCCmec (2004) PFGE (pulzáltatott mezejű gélelektroforézis) (2002) Szekvencia-alapú tipizáló eljárások (MLST,spa-tipizálás) (2006)
PFGE Pulzáltatott mezejű gélelektroforézis I. A genomiális DNS izolálása II.
Restrikciós emésztés S. aureus (MRSA) esetén SmaI.enzim
III.
Elektroforézis CHEF-DRII. készülék HARMONY protokoll
A PFGE alkalmazási területei
I. Lokálisan, kórházi szinten: járványok kivizsgálására
D típus D6 altípus
A típus A2 altípus
II. Regionálisan, országosan: epidémiás klónok azonosítása időbeli, térbeli nyomonkövetésére D PFGE típus (n=122) - EMRSA-15 klón (ST22-MRSA-IV)
2003 óta 11 altípus (D1-D11) – 2005 óta egyre gyakoribb!! Leggyakoribb altípusok: D2 (n=46), D6 (n=31) Fágkép: Alap fágkép: 75 MRSA fágkép: 629, gyakran NT Antibiogram: Ox, Da (számos esetben iDa), E, Cip Legtöbb altípus: Bács-Kiskun (n=21): D1, D2, D3, D4, D9 Ritka altípusok: Szabolcs-Szatmár-Bereg (n=11): D1 járvány!
SCCmec tipizálás
(Staphylococcal Cassette Chromosome mec)
SCCmec tipizálás Methicillin rezisztencia kódolása Komplex mobilis genetikai elem
ccr gén komplex (cassette
chromosome recombinase): ccrAB type 1, 2, 3, 4 ccrC
mec gén komplex:
class A, B és C
5 típus (I-V.) ill. számos altípus
spa (S. aureus Protein A gén) tipizálás
Frenay et al. 1996, Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. Shopsin et al. 1999, J. Clin. Microbiol.
SLST (single locus sequence typing)
spa gén polymorph X régiójának szekvencia tipizálása
Ridom Staph Type szoftver SZEKVENCIA SZERKESZTÉS
http://www.ridom.de
Harmsen et al. 2003, J. Clin. Microbiol.
Ridom Staph Type szoftver ADATBÁZIS
Harmsen et al. 2003, J. Clin. Microbiol.
Ridom Staph Type szoftver BURP – KLASZTER ANALÍZIS
spa-CC002
Harmsen et al. 2003, J. Clin. Microbiol.
A nemzeti MRSA PFGE adatbázis bemutatása 2001 és 2008 között
608 törzs PFGE mintázata (PFGE típus/altípus)
Izolátumok azonosító és származási adatai : (mintatípus; izolálás helye; izolálás ideje) járványok során izolált törzsek: n=199 hemokultúrából izolált törzsek vizsgálata: n=314 CA-MRSA gyanús törzsek: n=74 (23 PVL+ törzs) hVISA gyanús törzsek: n=21 (4 eset-5 törzs) Egyéb tipizálási eredmények: Antibiogram, fágkép CA-MRSA törzsek és epidémiás klónok reprezentánsai esetén: SCCmec típus, spa-típus, agr-típus, toxingén profil szekvencia típus (ST)
MRSA törzsek PFGE típusainak megoszlása 2001 és 2008 között
Az epidémiás PFGE típusok földrajzi megoszlása
Az epidémiás PFGE típusok földrajzi megoszlása
MRSA törzsek molekuláris tipizálási eredményei (2001-2008) Az MRSA törzsek 83,5%-a 4 típus) tartozott.
epidémiás PFGE típusba (A – D
3 pandémiás MRSA klón elterjedése mutatható ki hazánkban: (i) New York /Japán (ST5-II) (A/C PFGE típus) (43,8%) (ii) Dél-Német (ST228-I) (B PFGE típus) (19,7%) (iii) EMRSA-15 (ST22-IV) (D PFGE típus) (20%) Míg 2001-2005 közötti időszakban a New York/Japán és a DélNémet klón együttes dominanciája volt jellemző, 2006 óta az EMRSA-15 klón előretörése figyelhető meg A New York/Japán és a Dél-Német klón gyakorlatilag az egész ország területén elterjedt. A New York/Japán klón C PFGE típusú törzsei az Észak-alföldi és Észak-magyarországi régiókban, míg az EMRSA-15 klón törzsei az Észak-, és Dél-alföldi régiókban fordulnak elő leggyakrabban.
Köszönetnyilvánítás Hajbel-Vékony Gabriella, technikai asszisztens, OEK, FMEO Torma Andrea, technikai asszisztens, OEK Bakteriológia O. ÁNTSZ hálózatban és a különböző kórházak laboratóriumaiban dolgozó munkatársaknak a törzsek beküldéséért.
