Tight junction és adherens junction fehérjék expressziójának vizsgálata epeúti karcinóma mintákon
Doktori értekezés
Németh Zsuzsanna, MSc Semmelweis Egyetem Patológiai Doktori Iskola
Témavezető: Dr. Kiss András, PhD, egyetemi docens Hivatalos bírálók:
Dr. Herszényi László, PhD Dr. Bogner Barna, PhD
Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Kovalszky Ilona, DSc, egyetemi tanár Szigorlati bizottság tagjai:
Dr. Simon Károly, PhD, osztályvezető főorvos Dr. Paku Sándor, PhD
Budapest 2010
TARTALOMJEGYZÉK
TARTALOMJEGYZÉK .................................................................................................. 2 RÖVIDÍTÉSEK................................................................................................................ 5 I. BEVEZETÉS ................................................................................................................ 8 I.1. SEJTKAPCSOLÓ STRUKTÚRÁK ........................................................................ 10 I.1.1. Tight junction ........................................................................................................ 11 I.1.1.1. Claudinok ........................................................................................................... 13 I.1.1.2. Occludin ............................................................................................................. 16 I.1.1.3. ZO-1 ................................................................................................................... 17 I.1.2. Adherens junction ................................................................................................. 19 I.1.3. TJ és AJ szerepe a daganatok kialakulásában ....................................................... 20 I.2. EPEÚTI KARCINÓMÁK........................................................................................ 21 II. CÉLKITŰZÉSEK ...................................................................................................... 26 III. ANYAG, MÓDSZER............................................................................................... 27 III.1. Szövettani minták .................................................................................................. 27 III.2. mRNS minták ........................................................................................................ 28 III.3. Fehérje minták ....................................................................................................... 28 III.4. Sejtvonalak ............................................................................................................ 28 III.5. Szöveti multiblokk (TMA) .................................................................................... 29 III.6. Immunhisztokémiai módszer................................................................................. 30 III.7. Immuncitokémia DAB előhívással........................................................................ 31 III.8. Fluoreszcens immunhisztokémia / immuncitokémia ............................................ 32 III. 9. Real-time RT PCR................................................................................................ 33
2
III.9.1. RNS izolálás (Trizollal)...................................................................................... 33 III.9.2. cDNS készítés..................................................................................................... 34 III.9.3. real-time PCR ..................................................................................................... 35 III.10. Western-blot ........................................................................................................ 36 III.10.1. Fehérje izolálás (szövetből) .............................................................................. 36 III.10.2 Fehérje izolálás (sejtvonalkból)......................................................................... 37 III.10.3. Fehérje előkezelése........................................................................................... 37 III.10.4. Fehérjék szeparálása SDS-PAGE módszerrel .................................................. 37 III.10.5. Blottolás............................................................................................................ 38 III.10.6. Immunjelölés .................................................................................................... 38 III.10.7. Előhívás ............................................................................................................ 38 III.11. ELISA módszer ................................................................................................... 39 III.11.1. Normál ELISA.................................................................................................. 39 III.11.2. Szendvics ELISA.............................................................................................. 39 III.11.3. Fluoreszcens normál ELISA............................................................................. 40 III.11.4. Fluoreszcens szendvics ELISA ........................................................................ 41 III.12. Szemikvantitatív analízis..................................................................................... 41 III.13. Statisztikai analízis .............................................................................................. 43 IV. EREDMÉNYEK ...................................................................................................... 44 IV.1. A claudinok expressziós profiljának meghatározása az epeút különböző szakaszain normál mintákban és epeúti daganatokban................................................... 44 IV.2. A claudinok differenciál diagnosztikai szerepét befolyásoló eredmények ........... 57
3
IV.3. ZO-1, occludin és E-cadherin expressziós profiljának meghatározása az epeút különböző szakaszain normál mintákban és epeúti daganatokban................................. 59 IV.4. ZO-1, occludin és E-cadherin differenciál diagnosztikai szerepe az epeúti tumoroknál...................................................................................................................... 64 IV.5. ELISA módszer beállítása claudin-1 és -4 fehérjékre. .......................................... 65 V. MEGBESZÉLÉS ....................................................................................................... 73 VI. AZ ÉRTEKEZÉS ÚJ EREDMÉNYEI, RÖVID ÖSSZEFOGLALÁS .................... 90 VII. KÖVETKEZTETÉSEK .......................................................................................... 92 VIII. ÖSSZEFOGLALÁS .............................................................................................. 94 IX. ABSTRACT ............................................................................................................. 95 X. IRODALOMJEGYZÉK ............................................................................................ 96 XI. SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE................................................................... 117 XII. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS .............................................................................. 119 XIII. FÜGGELÉK ........................................................................................................ 120 1.melléklet .................................................................................................................... 120 2. melléklet ................................................................................................................... 121
4
RÖVIDÍTÉSEK ACC
acute calculous cholecystitis
AFP
alpha-fetoprotein
AJ
adherens junction
AJC
apical junctional complex
aPKC
atypical protein kinase C
BSA
bovine serum albumin
CC
cholangiocarcinoma
CD
Cluster of Differentiation
CIN
cervical intraepithelial neoplasia
CK
citokeratin
CEA
carcinoembrional antigen
CPE
Clostridium perfringens enterotoxin
CRC
colorectalis carcinoma
DAB
diamino-benzidin
DAPI
4',6-diamidino-2-phenylindole
DEPC
diethyl-pirocarbonate
EBDC
extrahepatic bile duct carcinoma
ECL
enhanced chemiluminescence
EGFR
epidermal growth factor
ELISA
enzyme linked immunosorbent assay
EOC
epithelial ovarian carcinoma
FFPE
formalin-fixed, paraffin-embedded
GAPDH
glyceraldehyd-3- phosphate -dehydrogenase
GBC
gallbladder carcinoma
HBV
hepatitis B virus
HE
hematoxylin-eosin
HCC
hepatocelluláris carcinoma
5
HCV
hepatitis C virus
HEPES
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid
HRP
horse raddish peroxidase
HSA
hepatocyte specific antigen
IBDC
intrahepatic bile duct carcinoma
IBS
irritable bowel syndrome
IHC
immunohistochemistry
JAM
junctional adhesion molecule
MAGUK
membrane associated guanylate kinase
MUPP1
Multi-PDZ domain Protein 1
NEBD
normal intrahepatic bile duct
NGB
normal gallbladder
NIBD
normal intrahepatic bile duct
OD
optical density
PAB
primer antibody
PAR
protease-activated receptor
PATJ
PALS1-associated TJ protein
PBS
phosphate buffer salin
PDZ
PSD95/Dlg/ZO-1
PKC
protein kinase C
pNPP
para-nitrophenyl-phosphate
PVDF
polyvinylidene fluoride
RA
retinoic acid
RT
room temperature/reverz transcriptase
RTK
receptor tirozin-kináz
SA
streptavidin
SAB
secondary antibody
SA-HRP
streptavidin-horseradish peroxidase
6
SDS-PAGE
sodium dodecyl sulphate – polyacrylamid gel electrophoresis
SEER
Surveillance Epidemiology and End Results
SJ
septate junction
TER
transepithelial resistance
TJ
tight junction
TMA
tissue microarray
TPA/PA
tetradecanoyl phorbol acetate
UC
ulcerative colitis
USPC
uterine serous papillay carcinoma
VHL
von Hippel-Lindau gén
WNV
West Nile Virus
ZO-1/-2/-3
zonula occludens-1/-2/-3
7
I. BEVEZETÉS
Elektronmikroszkópos vizsgálatok eredményei alapján az 1960-70-es évek vége óta tudunk a sejtkapcsoló struktúrákról: az epithel és endothel sejteket egymáshoz kapcsoló fehérje komplexek, melyek a sejtek apikális, lumen felőli oldalán, gyűrűszerűen zárják el a szervezet belső terét – a sejtek közötti teret - a környezettől. A betegségek egy jelentős csoportjában (daganatok és terjedésük) játszott szerepükről, e betegségek és e fehérjék kifejeződésének összefüggéseiről azonban csak az utóbbi tíz év kutatási eredményei alapján kaphatunk teljesebb képet, bár számos részlet még napjainkban is megválaszolásra vár. A komplexeket felépítő fehérjecsoportok és alkotó elemeik leírását, valamint e struktúrák szerepének, működésének vizsgálatát számos kutatás tűzte ki céljául. A tight junction (TJ) és adherens junction (AJ) fehérjék eltérő expresszióját írták le nemcsak különböző normál szövetekben, hanem a különböző gyulladásos és eltérő szövetből származó daganatos elváltozásokban is. A kutatási eredmények ezen túlmenően számos esetben szignifikáns különbséget írtak le a TJ-t és AJ-t felépítő fehérjék - valamint az őket kódoló mRNS-ek – expressziói között összehasonlítva az egészséges és elváltozást mutató patológiai mintákat. Jelenlegi ismereteink szerint a sejtkapcsoló struktúrák nagyobb részének nem egyszerű fizikai barrier biztosítása a feladata, vagyis a belső rendszer elhatárolása a környezettől, hanem a környezettel történő kommunikációban hasonlóképpen szerepet kap. Így a TJ és AJ fehérjék a sejt polaritásának kialakítása -, és a paracelluláris diffúzió mellett (ahol az ionok, kisebb molekulák áramlását szabályozzák és modulálják) a továbbítandó információk (és így szignálútvonalak) valós, ill. feltételezhető résztvevői is; és mint az E-cadherin esetében, jelenlétük önmagában is jelként funkcionálhat a sejt számára. Az epeúti daganatok általában az idősebb korosztályt érintő betegségek közé tartoznak. Kialakulásuk a nyugati országokban, ill. Kínában, Koreában és Thaiföld északi területein eltérő okokra vezethető vissza, azonban az intrahepatikus cholangiocarcinoma (IBDC) incidenciája és mortalitása szemben az extrahepatikus (EBDC) és epehólyag
8
rákokkal (GBC), világszerte emelkedő tendenciát mutat a Surveillance Epidemiology and End Results (SEER) adatai alapján. Az intrahepatikus cholangiocarcinoma e betegség-csoport agresszívebb elváltozása; gyorsan beterjed a szövet mélyebb rétegeibe, így a hatékony, gyors és megfelelő terápiás beavatkozások hiánya miatt többnyire halálos kimenetelű. Az epeút különböző szakaszain (kivéve a normál epehólyag claudin-1, -2, -3, és -4 fehérje kifejeződését) a claudin fehérjék kifejeződését más munkacsoportok eddig még nem vizsgálták. Intézetünkben egy megelőző tanulmány alapján ismert volt, hogy az epeúti rákok claudin-4 expressziója szignifikánsan magasabb, mint hepatocelluláris carcinomában (HCC). Ez az eredmény nem csak a diagnosztika számára jelentős. Irodalmi adatok támasztják alá, hogy a claudin-3 és -4 természetes receptora a Clostridium perfringens (CPE) Gram-pozitív baktérium toxinjának, mely sajátság miatt e két fehérje jelenléte az őket expresszáló daganatoknál terápiás konzekvenciákat von maga után. A fenti eredmények ismeretében célul tűztem ki, hogy az epeút egyes szakaszain nemcsak a claudin fehérjék, de más a TJ és AJ komplexeket felépítő fehérjék kifejeződését is megvizsgáljam normál és daganatos elváltozást mutató szövettani mintákban.
9
I.1. SEJTKAPCSOLÓ STRUKTÚRÁK
Szervezetünket a külső, és belső környezettől a test külső, és belső felszínét borító sejtek, epithel és endothel sejtek határolják el. E sejtek egymáshoz különböző felépítésű és funkciójú adhéziós molekula-komplexekkel kapcsolódnak egymáshoz. A sejtmembrán apikális oldala felől a bazális oldal felé haladva, négy kapcsoló struktúra figyelhető meg: tight junction (TJ), adherens junction (AJ), gap junction (GJ) és desmosoma (DS), amint az 1. ábrán látható. A gap junction esetében a másik három kapcsoló struktútától eltérően citoplazmatikus híd is létrejön az érintkező sejtek között, így ez a kapcsolódás mind szerkezetében, mind működésében jelentősen eltér az előbbi háromtól. (Odland 1958; Farquhar és Palade 1963,Staehelin 1973, 1974; Tsukita 1999, 2001; Schneeberger, 2004).
1. ábra A hámsejteket egymáshoz kapcsoló (adhéziós) molekula-komplexek lokalizációja. Az apikális oldal felől a bazális oldal felé haladva a sejtek membránján a TJ („szűk” kapcsolat), az AJ („összetartó” kapcsolat), a GJ (rés kapcsolat) és a dezmoszóma helyezkedik el (Tsukita 2001).
10
I.1.1. Tight junction Az emberi szervezetben az endothel és epithel sejteket két, egymástól funkcionálisan és biokémiailag is különböző, polarizált membrán domén épít fel, határukon húzódik a TJ (Balda 1998). A TJ területén az epithel sejtek egymással kapcsolódó felszínei között lévő, átlagosan 15 nm széles rés teljesen hiányozhat, innen kapta a nevét is (tight – „szűk” kapcsolat). A sejtmembránban övszerűen körbefutó, ill. „kissing point”-ként megjelenő komplex (Furuse 1998; Tsukita 1999) kialakulására többféle elképzelés is létezik: történhet a sejtek bazális, vagy apikális oldala felől, esetleg mindkét oldali, ill. helyspecifikus fehérjebeépülés révén; a folyamat részleteiben azonban még nem teljesen ismert (Balda 1998; González-Mariscal 2003). Összeszerelődésében, és lebomlásában azonban a ZO molekulák és az AJ szerepe is elengedhetetlen. Ebben a komplexben a membránok közötti kapcsolatot az claudin, occludin és JAM fehérjék hozzák létre. A TJ a gerincesek (Vertebrata) és a zsákállatok (Tunicata) törzsére jellemző membrán komponens; alacsonyabb rendűeknél hasonló funkciójú (analóg) adhéziós komplexként, a septate junction ismert (Green C.R 1978; Tepass 2003; Janssens, 2004; Miyoshi 2005). A TJ felépítésében résztvevő fehérjéket két nagyobb csoportba szokás sorolni a membránhoz viszonyított elhelyezkedésük alapján. A transzmembrán fehérjék (claudinok, occludin, JAM) a sejthártyába ágyazottan, míg a plaque fehérjék (többek között a membrane associated guanylate kinase (MAGUK) homológ fehérjék, mint ZO1,-2,-3; vagy az ismertebb MUPP1, és PATJ fehérjék), ahogy a nevük is utal rá, a membrán felszíne alatt közvetlenül kapcsolódnak az adhéziós komplexhez 1. táblázat. A transzmembrán fehérjék képezik a komplex nélkülözhetetlen elemeit, összetételük is eltér a különböző sejt típusokban. Így a myelin rétegeket összetartó TJ-t az OSP, TSPAN-3 és P0 fehérjék, míg az epithel és endothel sejteket a claudinok, occludin, JAM és CAR molekulák építik fel. A cortikális (vagy plaque) fehérjék ezzel szemben szélesebb körben fordulnak elő. A TJ e plaque fehérjék révén lép kapcsolatban a sejtváz elemeivel, és vesz részt a szignálútvonalak jeltovábbításában. A 2. ábra e fehérjék egy részének kapcsolatát mutatja egymással, a sejtváz elemeivel és a membránt átérő TJ fehérjékkel (González-Mariscal 2003, Ebnet 2008a, 2008b).
11
1. táblázat A TJ fehérjék csoportosítása. (González-Mariscal 2003)
A tight junction fehérjék Transzmembrán fehérjék Tetraspan fehérjék
epithel/endothel Claudinok Occludin
Ig szupercsaládba tartozó fehérjék
JAM CAR
P0
MAGUK MAGI PAR Cingulin Symplekin 7H6 antigen/barmontin Rab fehérjék
MUPP1 AF-6/Afadin PATJ Pilt JEAP huASH1 trimer G fehérjék
myelin OSP/claudin11 PMP22/gas-3 OAP-1/TSPAN-3
Plaque fehérjék PDZ-doménnel rendelkező fehérjék
PDZ-domén nélküli fehérjék
2. ábra A TJ fehérje komplexeinek a proliferációban és sejtmotilitásban játszott szerepe már ismert (Clayburgh 2004; Ebnet 2008b).
12
A PDZ-tartalmú plaque fehérjék (legfontosabb a ZO-1, -2, -3) kulcsfontosságúak a TJ transzmembrán fehérjéinek toborzásában és kihorgonyzásában egyaránt, emellett a több PDZ-domainnel rendelkező plaque fehérjék lehetővé teszik, hogy a sejtváz, a szignál molekulák valamint az integráns fehérjék a plazma membrán specifikus régiójánál kapcsolatba kerülhessenek egymással. A TJ-nek azonban nemcsak mechanikai kapcsolat kialakítása a feladata. Részt vesz a sejtek közötti (paracelluláris) diffúzióban: megszabva ezzel milyen és mennyi oldott részecske juthat át a sejtek közötti térbe; a sejtek polaritásának kialakításában; a sejtproliferációban és a szignálútvonalak révén a transzkripciós folyamatok szabályozásában egyaránt (Rodriguez-Boulan and Nelson, 1989; Gumbiner 1993; Anderson and Van Itallie 1995; Balda 2003; Schneeberger 2004; Cheung 2005; Ivanov 2005; Miyoshi and Takai 2005; Higashi 2007). I.1.1.1. Claudinok A claudinok a TJ kialakulásához és megfelelő működéséhez nélkülözhetetlenek (Gumbiner 1987; Furuse 1998; Tsukita 1999; Morita 1999), a fehérjecsaládnak jelenleg 24 tagja ismert. Szerkezetük alapján a transzmembrán fehérjék közé soroljuk őket a négy membránt átérő fehérjerégiójuknak köszönhetően. Egy rövid N-terminális -, és egy hosszabb C-terminális szakasz, valamint két extracelluláris hurok jellemzi a csoportba tartozó, 18-27 kDa súlyú molekulákat (Chiba 2007; Schneeberger 2004). A C-terminális aminosav (V-Valin) nagymértékben megegyezik a csoport tagjainál; a PDZ-kötő domén kialakításában vesz részt, mellyel a PDZ-doménnel rendelkező plaque fehérjékhez képesek kapcsolódni. Az extracelluláris domének vírus, ill. toxin-receptorokként funkcionálhatnak, és az ionok szelektív transzportjában vesznek részt. A 3. ábra az említett aminosavak, és funkcionális fehérje-részletek helyzetét szemlélteti a molekulában (González-Mariscal 2003; Miyoshi 2005). Ezek az adhéziós molekulák nem igényelnek Ca2+-iont a szomszédos sejtek közötti kapcsolat kialakításához (Kubota 1999). Az adhéziós komplex claudin összetétele befolyásolja a paracelluláris ion/töltés áramlást a transepithelial rezisztencia (TER) megváltozása révén (Anderson 1995; Amasheh 2002). A claudinok különböző szervekre jellemző expressziós mintázatát (pl. vastagbél, hasnyálmirigy, emlő, nyelőcső, prosztata) számos tanulmány részletesen
13
tárgyalja. A 4. ábrán látható klaszter-analízis e különbségeket mutatja be (Swisshelm 2005; Hewitt 2006; Borka 2007; Chiba 2007).
3. ábra A claudinok sematikus molekulaszerkezete. A négy transzmembrán domén, az extracelluláris domének, melyek receptor funkciót tölthetnek be, valamint az intracelluláris régiók, melyek további fehérjékkel kapcsolódhatnak. (Chiba 2007)
4. ábra Különböző normál és tumoros szövetek claudin mRNS expressziós mintázata. A sötétebb színek a magasabb, a világosabbak az alacsonyabb expressziót jelölik a színskálában (Hewitt 2006).
14
Azt azonban, hogy e fehérje molekulák az egyes emberi szövetek működését hogyan befolyásolják, hogy hogyan járulnak hozzá a sejtek megfelelő belső környezetének kialakításához, részleteiben még nem ismerjük. Egy-egy cikk tesz csak említést a kísérleti eredmények tükrében arra vonatkozóan, hogy egy adott claudin mely kation, vagy anion membránon történő átjutásáért lehet felelős. Ennek alapján a claudinok különböző szervekre, szövetekre vonatkozó speciális funkciójának megismeréséhez még további vizsgálatok szükségesek. Néhány cikk számol csak be tényekkel megalapozottan arról (és ezek is az egér vese elvezetőrendszerét tanulmányozva), hogy eltérő claudin fehérje expresszió köthető a különböző funkciójú elvezetőcsatornarészekhez: másként fogalmazva, a vese csatorna-rendszere a megfelelő működéshez eltérő claudin mintázatot igényel a különböző szakaszokon ld. 5. ábra (Kiuchi-Saishin 2002; Li 2004).
5. ábra Az egérvese elvezető rendszere. Különböző szakaszain, funkciótól függően, a claudin fehérjék különböző expressziója figyelhető meg (Kiuchi-Saishin 2002). Cld claudin
15
I.1.1.2. Occludin Az TJ felépítésében részt vevő elsőként azonosított molekula az occludin. Tetraspan fehérje-szerkezete eltér a claudinokétól: a két extracelluláris hurok azonos méretű (bár az első közel 61%-át tyrosin és glycin teszi ki), szemben a claudinokkal, ahol az Nterminális véghez közelebbi loop jóval több aminosavat tartamaz (Furuse 1993; Miyoshi 2005). 60-65 kDa súlyú fehérje, jelenleg egy splice variánsát ismerjük, melynek szöveti előfordulása megegyezik az occludinéval. A két variáns eltérését a 6. ábra mutatja (Muresan 2000; Schneeberger 2004; Hartsock 2007). A foszforilált forma a plazma membránban a TJ részeként fordul elő, nem foszforilált állapotban a bazolaterális membránban, vagy citoplazmatikus vezikulumok membránjában van jelen (Sakakibara 1997). Foszforilálásában számos kináz vehet rész, így a protein kináz C (PKC) klasszikus és phorbol észterre (PA) nem érzékeny, atipikus (aPKC) formája is. Emlős epithel sejtekben túltermelődése együttjár az epithel réteg ellenállásának (TER) növekedésével (Mitic 2001, Schneeberger 2004). Karboxi-terminális vége közvetlenül is, vagy köztes fehérjéken keresztül, mint a membrán asszociált guanilát kináz homológ ZO-1, -3 perifériás TJ fehérjék, képes az F-actin-hoz kötődni (Furuse 1994; Haskins 1998; Wittchen 1999).
6. ábra Az occludin splice variánsai. Occludin 1B, tartalmaz egy 198 bp-nyi insert szekvenciát. Az occludin egy hosszabb formája ez, mely feltehetően alternatív splicing réven keletkezik. (Muresan 2000)
16
I.1.1.3. ZO-1 A ZO-1 fehérjét, a Drosophila fejlődésében szerepet játszó egyik tumor szupresszor gén (Dlg- disc large) homológjának termékét 1993-ban két munkacsoportnak is sikerült kimutatni (Itoh 1993; Willott 1993). A molekula 210-225 kDa molekulasúlyú fehérje, mely epithel és endothel sejtekben közvetlenül a plazma membrán alatt, TJ-t nem formáló sejtekben (pl. a fibroblasztok) diszperzen a citoplazmában és a cadherin alapú AJ-nál halmozódik fel. Három alternatív splicing variánsát ismerjük, előfordulásuk és szerepük eltérő. Szekvenciájában több nukleáris export szignál található, ami a plazma membrán és a sejtmag közötti szállítódására (shuttle-re) utal (Islas 2002). A MAGUK fehérjékhez hasonlóan PDZ, SH3 és GK doménekkel rendelkezik. A 7. ábra ezeknek a funkcionális egységeknek a helyét szemlélteti a ZO-1 molekulában, és más PDZtartalmú fehérjékben. A PDZ (PSD95/Dlg/ZO-1) domén 80-90 aminosavból álló fehérje alegység, mely számos fehérje (claudin, JAM, ZO-2,-3) karboxi-terminális végének specifikus régióival képes kapcsolatba lépni. A ZO-1 a másik két fontos funkcionális alegységével, a GK és az SH3 doménjével további fehérjékhez kapcsolódhat; így az előbbivel az occludinhoz, utóbbi doménjével a ZONAB, ZAK fehérjékhez, továbbá az aktin citoskeletonhoz, az AF-6, CAR, cingulin molekulákhoz is (González-Mariscal 2003; Clayburgh 2004). Így transzmembrán, plaque és citoszkeletális fehérjékkel egyaránt képes molekuláris kapcsolatot kialakítani; az aktin sejtváz újrarendeződésében ennek következtében fontos szerepet kap (González-Mariscal 2007). A fehérjék kapcsolódását a 2. ábra mutatja. SH3 doménjével a sejtciklust szabályozó fehérjék promóteréhez kapcsolódó ZONABhoz kötődik. Fordított expresszióját figyelték meg e két molekulának konfluens és szóródó sejteken egyaránt (González-Mariscal 2003, 2007).
17
7. ábra A TJ felépítésében résztvevő PDZ domént tartalmazó fehérjék. A PDZ domének ovális formával, más jellemző régiók ettől eltérő sematikus ábrázolással láthatók. A feltüntetett régiókhoz kapcsolódó fehérjéket a megfelelő régiók alatti felirat jelzi (González-Mariscal 2003).
18
I.1.2. Adherens junction Az apikális kapcsoló struktúra (AJC) másik részvevője az AJ, lokalizációja a gerincesek törzsében a TJ-től bazálisan, míg alacsonyabb rendűeknél (Drosophila, C. elegans) a legapikálisabban, az epithel sejtek laterális membránjában „legfelül” található. A TJ-től eltérően az ionok (és más molekulák) áramlását nem képes befolyásolni, így pusztán mechanikai kapcsolatot alakít ki az érintkező sejtek között. Fő alkotó elemei a klasszikus cadherinek; kalciumfüggő, homofil sejt-sejt kapcsolat kialakítására képesek, elsőként a gerincesekben írták le jelenlétüket (Gallin 1998). E fehérjék a citoplazmatikus
cateninekkel
komplexet
képezve
kapcsolódnak
az
aktin
citoszkeletonhoz ld. 8. ábra. A stabil adhézióhoz ez elengedhetetlen (Tepass 2003, Ebnet 2008a).
8. ábra A cadherinek fehérjekapcsolatai. Citoplazmatikus fehérje láncukkal kapcsolódnak a β-catenin és p120 catenin fehérjékkel (Ebnet 2008a).
A sejtek közötti kapcsolatok, és később a polaritás kialakulásához elsőként a pontszerű AJ kapcsolatoknak (benne E-cadherin-, nektin-, JAM molekulákkal) kell létrejönni. Ezt követően a laterális membránhoz helyeződik át az occludin, ZO-1 és PAR komplex, továbbá a claudinok. A PAR komplex aktivációja (9. ábra) – benne az aPKC-vel - nélkülözhetetlen a sejtvázfehérjék polimerizálódásához, és stabilitásának kialakulásához (Ebnet 2008b).
19
I.1.3. TJ és AJ szerepe a daganatok kialakulásában A sejt-sejt kapcsolatok eltűnését számos cikk összefüggésbe hozza a daganatok kialakulásával (Soini 2005a; Swisshelm 2005; Morin 2005; Kominsky 2006; Soini 2006a; Soini 2006b; Oliveira and Morgado-Diaz 2007; Nishino 2008). E kapcsolatok eltűnése beindítja a sejtváz átrendeződését, a fenotípus megváltozását, mivel olyan jeleket továbbít a sejtet irányító, működési információkat tartalmazó genetikai állománynak, mely a sejtnek az „új”, kapcsolatok nélküli környezetben való túlélését teszi lehetővé. A normál és daganatos szöveti elváltozások eltérő TJ expressziójáról számol be a 4. ábrát magában foglaló cikk mellett számos, az intézetünkben íródott cikk is (Halasz 2006; Lódi 2006; Sobel 2006; Borka 2007; Németh 2009). A TJ fehérje expresszió mértéke bizonyos esetben a betegség kimenetelét is befolyásolja (Kominsky 2003; Heinzelmann-Schwarz 2004; Swisshelm 2005; Kim 2008; Kleinberg 2008; Huang 2009). Több vizsgálat eredménye szerint nemcsak diagnosztikus markerként, de lehetséges terápiás célpontként is felhasználható egyes claudin fehérjék (claudin-3 és claudin-4) túltermelődése a daganatos szövetben (Kleinberg 2008). Az AJ szerepe a daganatok kialakulásában elsőként a transzkripciós faktorokhoz kötődő β-catenin proliferációban játszott szerepével vált ismertté (Moon 2004, Luo 2007).
9. ábra A PAR komplex eltérő felépítése a TJ és AJ adhéziós komplexekben. A felépítésben mutatkozó különbség szerepe AJ-ben még nem ismert (Ebnet 2008b).
20
I.2. EPEÚTI KARCINÓMÁK Munkámban az epeúti karcinómákat kialakulásuk helye szerint csoportosítottam: intrahepatikus-, extrahepatikus-, ill. epehólyag karcinóma mintákat vizsgáltam. A szakirodalom az extrahepatikus karcinóma további alcsoportjaiként hiláris/Klatskin, és disztális kiindulásút is megkülönböztet (Demols 2007; Kakar and Ferrell 2007; Ishak 1994; Khan 2005; Blechacz and Gores 2008a, 2008b). Az első cholangiocarcinomás (CC) esetről Durand-Fardel számolt be 1840-ben (Olnes 2004). A cholangiocarcinomákat a tumor morfológiája, és növekedési mintázata – szöveti eloszlása- alapján további csoportokba sorolják: a csomókat kialakító (nodular), az epeutak környezetét infiltráló (periductal-infiltrating) valamint az epeutakba terjedő (intraductal-growing) elváltozásokat a 10. ábra szemlélteti (Demols 2007). Ellentétben az extrhepatikus epeúti rákokkal (EBDC), az intrahepatikus cholangiocarcinoma (IBDC) a csoport agresszívebb elváltozása, gyorsan beterjed a környező májba, vér- és nyirokerekbe, így máj-, tüdő- és peritoneális áttéteket alakíthat ki. Akár egy, akár több
10. ábra A cholangiocarcinoma osztályozása. A cholangiocarcinomakat eredésük alapján két csoportra szokták osztani: intrahepatikus – (IBDC), és extrahepatikus (EBDC) epeúti tumorokra. Mindkét csoportot morfológiai sajátságok szerint további alcsoportokra szokták bontani: csomókat formáló, periductalis infiltráló-, valamint intraductális növekedésű formákra (Patel 2006).
21
gócú, képe a metasztázisokét utánozhatja; nehéz diagnosztizálni, és általában halálos kimenetelűek, mivel a hatékony, nem-sebészeti terápiás lehetőségek hiányoznak (Khan 2005; Demols 2007). A hepatocelluláris carcinoma után a CC a második leggyakoribb primer májrák (Leong 2007). Elsősorban az idősebb korosztály megbetegedése; mindkét nemet azonos arányban érinti. E daganatok 5-10%-a intrahepatikus cholangiocarcinoma, mely világszerte emelkedő tendenciát mutat, bár ennek oka nem ismert (Patel T 2001, 2002; Obama 2005; Khan 2005). Az esetek 60-70%-ában hiláris, ill. 20-30%-ában disztális extrahepatikus epeúti rák diagnosztizálható (Demols 2007). Az
epehólyag
karcinóma
a
gastrointestinális
traktus
ötödik
leggyakoribb
megbetegedése, nagyobb arányban érinti a 40-50 év feletti nőket, mint a férfiakat (Kakar and Ferrell 2007; Lewis 2007). Egy epidemiológiai- és végpont elemzési felmérés (SEER) adatai alapján az IBDC előfordulásával ellentétben az EBDC és GBC incidenciája és mortalitása csökkenő tendenciát mutat; a 11. ábrán látható (Taylor-Robinson 2001; Khan 2005; Bonney 2008).
A
B
11. ábra A Surveillance Epidemiology and End Results (SEER) életkorral standardizált mortalitási rátái. Az intrahepatikus cholangiocarcinoma (A), valamint az extrahepatikus cholanciocarconoma és epehólyag rákok (B) esetében (Khan 2005).
22
E daganatok kialakulásának főbb tényezői eltérőek a nyugati országokban, ill. Kínában, Koreában és Thaiföld északi területein. Míg Európában és az Egyesült Államokban meghatározóbb a krónikus gyulladás, vagy az epeelfolyás rendellenessége miatt megfigyelhető károsodása az epeúti sejteknek (Mosconi 2009; Yachimski 2008), addig az ázsiai területeken a féregfertőzés és hepatolithiasis a fő kiváltója ezen megbetegedéseknek (Mahli and Gores 2006; Leong 2007). Jelentős rizikó faktor a primer sklerotizáló cholangitis, az ulceratív cholitis (Broome 1995; Bajor 2001; Burak 2004), a Caroli-szindróma, továbbá tízszer nagyobb valószínűséggel fordul elő epeúti karcinóma a nem epeúti eredetű cirrhosis mellett, mint az átlag populációban (Terada 1994; Leong 2007). Több szerző vizsgálatai alapján a HCV tumorindukáló hatása a biliaris elvezető rendszerben jelentősebb, mint a hepatitis B vírusé (HBV) (Yamamoto 2004; Khan 2005; Chen 2005; Aishima 2008). Az epeút malignus átalakulásának folyamata, a többi daganatos elváltozáshoz hasonlóan számos molekuláris és genetikai változással jár együtt. Az epigenetikai változások normálistól eltérő felhalmozódása is megfigyelhető, mely a tumorszuppresszor génekre (p53, p16, p27, SMAD4) is hatással van. Gátlódik az apoptózis (bcl-2 fehérjecsalád), gyulladás esetén ez együtt jár a növekedést és túlélést elősegítő citokinek, ill. chemokinek termelődésével (Khan 2005; Mahli és Gores 2006; Leong 2007). Számos onkogén: K-ras, cyclin D1, Akt, Mcl-1, c-myc és növekedési-faktor függő útvonal (EGFR) aktiválódik (Demols 2007; Mosconi 2009). Kutatási eredményekre alapozva a cholangiocarcinoma lehetséges diagnosztikus markereinek széles skáláját mutatják be az e témában íródott cikkek. A korai diagnosztizálásához azonban megfelelően érzékeny és specifikus markerre lenne szükség. Az AFP pozitivitás jelentőségét IBDC eseteknél Zhou és munkatársai abban látják, hogy a szérum pozitv betegek túlélése jobb, mint a negatív értékekkel rendelkező társaiké (Zhou 2008b). Japán kutatók az Opisthorchis viverrini-vel fertőzőtt személyekben az általa okozott gyulladást teszik felelőssé a cholangiocarcinoma kialakulásáért. E gyulladás során felszabaduló reaktív oxigéngyökök mennyiségére a következményeként jelentkező DNS károsodásból, a javító mechanizmusok által (endonukleázok) kivágott módosult nukleotidok mennyiségéből kövekeztenek. Az 8oxodG molekula megjelenik a vizeletben, és mennyisége korrelál a DNS károsodás
23
mértékével, valamint a tumor progresszió fokával. Ezért a prognózis szempontjából hatékony markernek tartják (Thanan 2008). Huang és munkatársai a glycin Nmethyltransferase csökkent expresszióját tartják megfelelő prognosztikus markernek az epeúti karcinómáknál (Huang 2008). A citokeratin-7, -8, -18, -19, és -20 ismert markereken túl a keratin-903 kifejeződése független prognosztikus faktor a CC-ban szenvedő betegeknél. Zhou alkalmas molekuláris, valamint prognosztikus markernek tartja az extrahepatikus epeúti minták vizsgálatánál a LAPTM4B-35 lizoszóma-kapcsolt transzmembrán fehérje kifejeződését. Véleményét munkacsoportjának eredményeire alapozza: az általuk vizsgált 81 darab EBDC minta 72%-át pozitívnak, a nem tumoros epeúti hámot negatívnak találták (Zhou 2008a). A MUC6 és a trefoil factor family-2 molekulák főként prognosztikai jelentőséggel bírnak (Thuwajit 2008). Briggs egy rendszerezett összefoglalása 13 csoportba sorolja a cholangiocarcinoma prognosztikus molekuláris markereit: 1. tumorszuppresszor gének (p53, DPC4/Smad4, Rb, p73); 2. onkogének (k-ras, KIT/CD117); 3. apoptózist szabályozók (bcl-2/bax, DAP-kináz, Fas/FasL, survivin); 4. sejtciklus szabályozók (ciklin, ciklin-függő kinázok, ciklinfüggő kináz gátlók/(KIP/CIP), INK4 család); 5. proliferációs index számolásához szükséges fehérjék (ki-67, MIB-1, PCNA); 6. növekedési faktorok és receptoraik (EGFR család, tenascin, CCN fehérjék); 7. sejt invázióval és metasztázis képzéssel kapcsolatos fehérjék (cadherinek, syndecan-1, CEACAM6, CD24, CD44, MMP7); 8. angiogenezisben részt vevő fehérjék (VEGF-C); 9. mucinok (MUC1, MUC2, MUC4, MUC5AC); 10. szérum markerek (CA-19-9, CEA, bilirubin, CRP, sziálsav); 11. Sialyl Lewis
antigének
a
szövetben;
12.
genetikai
faktorok
(kromoszóma
instabilitás/aneuploidia, heterozigotaság elvesztése/ mikroszatellita intabilitás, DNSjavítás/MGMT, genotípus/GNAS1 T393C); 12. egyéb markerek (citokeratinok, neuroendokrin differenciáció, a beteg immunválaszkészsége/CD83/CD1a/CD8/CD4, szekretoros pankreász tripszin gátló/PSTI, ciklooxigenáz-2) (Briggs 2008). A MUC1 és a MUC5AC a HCC-CC differenciál diagnosztikájában használható, mivel a HCC nem termeli, a CC minták 70%-, valamint 50%-ban fejezik ki ezeket a fehérjéket. Kutatási eredmények alapján a GLUT-1 és a P63 fehérjék neve is felmerült, mint megfelelő differenciál diagnosztikus marker (Bonney 2008). A p53, bcl-2, bax és p16 fehérjék szignifikánsan eltérő mennyiségét figyelték meg IBDC és EBDC mintákban.
24
Ennek alapján arra a következtetésre jutnak a szerzők, hogy a két tumor típus fenotípusa „helyspecifikus” sajátságokat mutat, mely jegyek a diagnosztikus munkát segíthetnék (Karamitopoulou 2008). Nishino és munkatársai IBDC és EBDC mintákból általuk készített SAGE (serial expression of gene analysis) könyvtárak és az NCBI adatbázisában található további 16 nem máj tumorból készült SAGE könyvtár összevetésével, a kapott eredményeket hitelesítő vizsgálatokkal (real- time RT-PCR, immunoblot, immunohistochemical analysis) három az IBDC-re specifikus markert azonosított. E három fehérje, a biglycan, az inzulin-like growth factor-binding protein 5 és a claudin-4 nemcsak specifikus, de a diszkriminancia analízis eredménye szerint ezen fehérjék kombinált alkalmazása az intrahepatikus epeúti rákok HCC-től és adenokarcinóma áttétektől való megkülönböztetésében is jó eredménnyel használható (Nishino 2008). Intézetünkben két évvel korábban már Lódi és munkatársai ugyanerre a következtetésre
jutottak
normál
máj,
HCC
és
epeúti
minták
claudin-4
immunhisztokémiai-, és real-time RT-PCR vizsgálatának eredményeként (Lódi 2006). Egy másik cikk e három fehérje azonnali felhasználhatóságát a metasztatikus májdaganatok és a primer májrákok elkülönítésére megkérdőjelezi a vizsgálatban használt alacsony mintaszámok és a módszer kivitelezésében tapasztalt hiányosságok miatt. Ellenben nem zárja ki az eredmények diagnosztikus jelentőségét sem, amennyiben további vizsgálatokkal ezek megerősítést nyernek (Blechacz 2008a). Jelenleg a patológiai gyakorlatban rendelkezésünkre álló diagnosztikus markerek a CC vagy HCC, ill. a CC vagy metasztázis kérdések eldöntéséhez önmagukban nem, csak egymást kiegészítve használhatók. Lehetővé teszik többnyire az említett elváltozások azonosítását, de nem minden esetben jár ez gyors és egzakt eredménnyel. Az epeúti normál és tumoros sejtek citokeratin (CK) 7 pozitívak. Így a többnyire CK7-/CK20HCC-től, valamint a CK7-/CK20+ colorectalis metasztázistól való elkülönítésre használják, bár nem eléggé specifikus, mivel más daganatok, mint a pancreas tumorok, hasonlóan pozitívak CK7-re nézve. A HSA a hepatocyta sejtek markere; a CD34 antitesttel együtt a mindkét esetben negatív reakciót adó cholangiocarcinomát, ill. metasztázisokat különböztetik meg a HCC-től. Más markerek, mint az alfa-fetoprotein (AFP), a fenti elváltozások szétválasztásában csak korlátozottan használhatók. (Leong 1998, 2007; Rullier 2000; Zhou 2008b).
25
II. CÉLKITŰZÉSEK
A szakirodalom alapján feltételeztük, hogy a claudinok a humán epeút különböző szakaszain eltérő mértékben fejeződnek ki. Kiválasztottam azokat a claudinokat, melyeknek az irodalmi háttere a későbbi értékeléshez elegendő alapot adhatott. Célom volt: 1.
A claudin-1, -2, -3, -4, -7, -8 és -10 fehérje és mRNS expressziós profiljának meghatározása (lehetőség szerint az eredmények funkcionális értelmezéseis) az epeút különböző szakaszain normál-, és epeúti karcinóma mintákban.
2.
A claudinok differenciál diagnosztikai szerepének vizsgálata epeúti tumorokban.
Ismert volt, hogy az E-cadherin kifejeződése gátlódik daganatos átalakulások során. A fenti vizsgálatok alapján tudtuk, hogy a TJ-t felépítő claudinok kifejeződése az AJ-tól eltérő változást mutat. Ezek alapján célul tűztem ki, hogy a nem claudin-családba tartozó TJ fehérjék közül az occludin integráns transzmembrán fehérje és a ZO-1 perifériás fehérje kifejeződését is megvizsgáljam. Célom volt: 3.
Meghatározni a ZO-1, occludin és E-cadherin expressziós profilját az epeút különböző szakaszain normál-, és epeúti karcinóma mintákban.
4.
Meghatározni a ZO-1, occludin és E-cadherin fehérjék differenciál diagnosztikai szerepét epeúti tumorokban.
Az szakirodalom alapján a claudin-1 és claudin-4 fehérjék mennyisége a testnedvekben (szerózus váladék, vér) is megváltozik daganatos elváltozások megjelenésével. 5.
Célom volt a claudin-1 és a claudin-4 fehérje kimutatására alkalmas ELISA módszer beállítása, mely kiegészítő vagy önálló diagnosztikus eszközként is felhasználható.
26
III. ANYAG, MÓDSZER
III.1. Szövettani minták Immunhisztokémiai vizsgálataimhoz a SE II. sz. Patológiai Intézetben 2001-2007 évben beérkezett formalin fixált, paraffinba ágyazott (FFPE) epeúti mintákat használtam fel. 62 db epeúti tumort (11 IBDC, 17 EBDC, 34 GBC) és 57 db normál epeúti részletet (12 IBDC, 12 EBDC, 33 GBC) vizsgáltam. A minták kiválasztása a rutin diagnosztika során készített hematoxylin (H) – eosin (E) metszetek, valamint a kiadott kórszövettani- és immunhisztokémiai leletek alapján történt. A csoportokba a WHO szabályainak megfelelően jól differenciált (G1), közepesen differenciált (G2) és gyengén differenciált (G3) minták kerültek 2. táblázat. 2. táblázat A vizsgálatban szereplő karcinóma minták WHO szerinti csoportjai (Hamilton 2000; Guzman and Chejfec 2007). IBDC-intrahepatikus epeúti tumor, EBDC – extrahepatikus epeúti tumor, GBC- epehólyag tumor
Csoportok
G1
G2
G3
IBDC
1/11
6/11
4/11
EBDC
0/17
12/17
5/17
GBC
1/34
19/34
14/34
A kiválasztott betegek a sebészeti beavatkozás előtt nem részesültek sem kemoterápiás, sem radioterápiás kezelésben. Az átlagéletkor 65 év, a férfi/nő arány 24/38 volt. A kontrollként használt normál minták a patológiai mintavétel során a szövetből indított normál területek gyulladást nem mutató szövettani részleteiből származtak. A vizsgálatokat a Semmelweis Egyetem Etikai Bizottságának Engedélyével végeztük (#172/2003).
27
III.2. mRNS minták RNS szintű vizsgálataimhoz a SE II. sz. Patológiai Intézetben 2001-2007 évben beérkezett, fagyasztott szövettani mintákat használtam fel: összesen 11 epeúti tumor (3 intrahepatikus, 1 extrahepatikus, 7 epehólyag tumor), 8 normál epeúti minta (5 intrahepatikus, 1 extrahepatikus, 2 normál epehólyag; továbbá 2 intrahepatikus-, 1 extrahepatikus-, ill. 3 db epehólyag daganatot környező ép szövet).
III.3. Fehérje minták Az ELISA módszer beállításához használt fehérje minták az SE II. sz. Patológiai Intézetben 2001-2007 évben beérkezett HCC és CRC esetek fagyasztott szövettani mintáiból és Schirmacher professzor úr jóvoltából, Heidelbergből származó HuH7, HepG2, Hep3B, PLC, T47D, HT29, valamint Dr. Jeney Csaba jóvoltából a GenoID Kft.-től származó HeLa sejtvonalakból izolált összfehérje oldatok voltak.
III.4. Sejtvonalak A felhasznált sejtvonalak egy együttműködés keretében Heidelbergből, az egyetem patológia intézetéből származtak. A vizsgálatok egy részét Németországban végeztem. A felhasznált sejtek az amerikai (ATCC) szövetbankból származtak. Hepatocelluláris karcinóma sejtvonalakkal (HuH7, HepG2, Hep3B, PLC), egy ductális emlő karcinóma sejtvonallal (T47D), egy kolorektális karcinóma sejtvonallal (HT29) és egy cervix karcinóma sejtvonallal (HeLa) dolgoztam. A sejtvonalakat a heidelbergi intézet által használt alacsony glükóz tartalmú (1500 mg/l) RPMI, ill. Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) tápoldatokat felhasználva tenyésztettük 10% fetal bowine serummal (FBS), 100 IU/ml penicillin és 100 µg/ml streptomycin hozzáadását követően. A sejteket subkonfluens, ill. konfluens növekedési
28
fázisig tenyésztettük 37 ºC-on, 5% CO2 koncentráció mellett nedves kamrában. A sejteket fluoreszcens festéshez 6-, ill. 12-lyukú plate-eket használva 10-10 db 1 cm átmérőjű kerek fedőlemezekre növesztettük. Fehérjeizoláláshoz 10 cm átmérőjű edényekben konfluens vagy subkonfluens állapotig tenyésztettük a sejteket. A lízis puffer megfelelő térfogatainak kimérése előtt az elhasznált tápot a sejtekről leöntöttük, majd a sejteket 1x PBS-ben háromszor átmostuk. Ezután a lízispuffert a sejtekre pipettázva lizáltuk a sejteket. A médiumot, FBS-t a Gibco, trypsin-EDTA-, és penicillin/streptomycin oldatot a Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) cégektől rendeltük.
III.5. Szöveti multiblokk (tissue microarray/TMA) Minden minta esetén a reprezentatív tumor régiók kijelöléséhez a rutin diagnosztikában felhasznált HE metszeteket használtam. A kiválasztott területeket 2 mm átmérőjű mintavételi „tű”-vel (Tissue Micro-Array Builder; Histopathology, Pécs, Magyarország) a donor blokkokból a 24 mintahelyet tartalmazó recipiens blokkba helyeztem át, minden egyes mintánál duplikátumokat felhasználva. A multiblokkokat ez után 56 fokon 5 percig inkubáltam, hogy a szövethengerek (core-ok) a recipiens blokk paraffinjával megfelelő mértékben összeolvadhassanak. Összesen 15 multiblokk készült – 3-3 db NIBD (normál intrahepatikus epeúti), NEBD (normál extrahepatikus epeúti) és NGB (normál epehólyag) blokk, 2 db IBDC, 1 EBDC, 3 GBC blokk. Mindegyik blokkba helyeztem HCC mintát, valamint 2-3 kontroll mintát a megfelelő típusú szövetből: tumoros blokknál normál kontrollt, normál blokknál tumoros kontrollt használtam.
29
III.6. Immunhisztokémiai módszer A 3-5 µm metszetek (multiblokkokból) deparaffinálását követően claudin-1, -2, -3, -4, 7, -8, -10, ZO-1, occludin, E-cadherin és citokeratin-7 immunhisztokémiai vizsgálatok készültek automatizált immunfestéssel (a beállítást claudin-8, és -10 esetén magam végeztem). A deparaffinálást követően a metszeteket 3x5 percig PBS (pH 7.4) pufferben mostuk, majd citrát alapú feltáró oldattal (Target Retrieval Solution cat# S1699, DAKO, Glostrup, Denmark) 30 percig mikrohullámú sütőben feltártuk az antigéneket. A primer antitestek hígításai és adatai, valamint a használt pozitív kontrollok a 3. táblázatban láthatók. A ZO-1 és occludin esetében az antigén feltárást 3. táblázat A primer antitestek és a használt pozitív kontrollok. (Zymed Inc, San Francisco, CA, USA; DAKO, Glostrup, Denmark)
Antitest neve
Hígítás
Pozitív kontroll
Faj és klonalitás
Cég
Catalog No.
claudin-1 claudin-2 claudin-3 claudin-4 claudin-7 claudin-8 claudin-10 ZO-1 Occludin E-cadherin CK 7
1:100 1:80 1:80 1:100 1:80 1:80 1:60 1:100 1:100 1:120 1:300
normal hámszövet normál vastagbél normal vastagbél normal vastagbél normál emlő normál vese normal vese normál vékonybél normál vékonybél emlő duktális karc. normál epeút
rabbit polyclonal mouse monoclonal rabbit polyclonal mouse monoclonal rabbit polyclonal rabbit monoclonal rabbit polyclonal rabbit polyclonal rabbit polyclonal mouse monoclonal mouse monoclonal
Zymed Zymed Zymed Zymed Zymed Zymed Zymed Zymed Zymed DAKO DAKO
18-7362 18-7363 34-1700 18-7341 34-9100 40-2600 38-8400 40-2300 71-1500 M3612 M7018
követően a mintákat 0.1 mg/mL koncentrációjú pronase E-vel (Sigma P5147) emésztettem 5, ill 3 percig az optimális fehérje detektálás végett. Az immunreakciókat automatizált immunfestő berendezéssel (Ventana ES; Ventana Medical Systems Inc., Tucson, AZ, USA) végeztük. A reagenseket és a másodlagos antitestet Ventana Detection Kit (iView DAB Detection Kit, cat# 760-091, Ventana) tartalmazta; felhasználásuk a gyártó ajánlása szerint történt 4. táblázat.
30
4. táblázat Az automatizált immunhisztokémiai reakciók lépései. (PAB: primer antitest; SAB: szekunder antitest; RT: szobahőmérséklet; SA-HRP: streptavidin-HRP komplex; DAB: diamino-benzidin)
Módszer főbb lépései
Reagens neve / idő
Catalog No.
Deparaffinálás
xylol 2x10’ alkohol (10, 70, 50%) 3x5’ Target Retrieval Solution 200W, 30’ Inhibitor (3% H2O2) PAB (10% BSA-ban hígítva) 42ºC, 32’ Biotinylated Ig (foszfát pufferben) SA-HRP DAB (0,2% DAB- 2g/L; 5% PEG) H2O2 (0,04%-0,08%) Copper (0,04% H2O2; copper sulfate) Hematoxylin Blueing Reagent alkohol (96%) 3x10’ xylol 2x10’ Mounting medium (Sakura)
S1699 253-2187 A2153-50G 253-2188 253-2189 253-2190 253-2191 253-2192 760221 760237
Feltárás Blokkolás Jelölés
Előhívás
Víztelenítés Lefedés
1408
III.7. Immuncitokémia DAB előhívással A sejtek tripszines felszedése után az emésztési reakciót blokkoltuk 6x-os tápoldat mennyiséggel. Centrifugálás (600G, 10 perc), majd a tápoldat leszívása után mostuk a sejteket 1x PBS-ben. 500-500 µl mennyiségeket cytospinnel (1000G, 10 perc) tárgylemezekre vittünk fel. Metanol (-20 ºC, 10 perc) – acetonos (-20 ºC, 3 perc) fixálás után a mintákat az immunhisztokémiai módszernél leírtak (4. táblázat 4. lépésétől kezdődően) alapján jelöltük, és előhívtuk. A primer claudin-1 antitestet (mouse monoclonal antibody, Abnova, Cat: H00009076-M01) 1:10000 hígításban használtuk.
31
III.8. Fluoreszcens immunhisztokémia / immuncitokémia Azoknál az eseteknél, ahol a detektálandó fehérjék kismértékű expressziója a hagyományos immunhisztokémiai módszer beállítása során nem adott biztos támpontot, a vizsgálni kívánt fehérje tényleges jelenlétét fluoreszcens immunhisztokémiai módszerrel ellenőriztem. Fluoreszcens immuncitokémiai eljárást használtam az ELISA módszerhez használt sejtvonal-kontrolloknál a TJ- és AJ- komplexek fehérje expresszióinak detektálására 5. táblázat.
5. táblázat Fagyasztott minták és sejtvonalak festése fluoreszcens immunhisztokémiai / immuncitokémiai eljárással – protokollok. SAB hígítások (Alexa 488, 568; Cat. No. A21202, A11036): 250x. (PAB: primer antitest; SAB: szekunder antitest; RT: szobahőmérséklet; DAPI: 4,6-diaminido-2-phenilindol)
Módszer főbb lépései
Fagyasztott minták IF festése
Sejtvonalak IF festése
Fixálás
-20 ºC-os metanol -20 ºC-os aceton nincs
-20 ºC-os metanol 10’ -20 ºC-os aceton átmosás 1xPBS mosás 10’ 3%BSA RT, 30’ nincs PAB (megfelelő hígításban), 1%BSA-ban RT, 60’ 1xPBS mosás RT, 3x5’ SAB (megfelelő hígításban), 1%BSA-ban RT, 30’ 1xPBS mosás RT, 3x5’ lefedés DAPI-s fluorescens fedőanyaggal (Vectaschield Mounting medium) megfelelő hullámhosszú (gerjesztési max.) megvilágítást követően konfokális mikroszkóppal
Blokkolás Jelölés
Detektálás
10’ átmosás
1xPBS mosás 5’ PAB (megfelelő hígításban), 1%BSA-ban RT, 60’ 1xPBS mosás RT, 3x5’ SAB (megfelelő hígításban), 1%BSA-ban RT, 30’ 1xPBS mosás RT, 3x5’ lefedés DAPI-s fluorescens fedőanyaggal (Vectaschield Mounting medium) megfelelő hullámhosszú (gerjesztési max.) megvilágítást követően konfokális mikroszkóppal
32
III. 9. Real-time RT PCR A fehérje expressziós vizsgálatokkal párhuzamosan a szabályozási szint megállapítása érdekében mRNS expressziós vizsgálatokat szoktunk végezni. A megfelelő RNS minőség érdekében fagyasztott mintákkal dolgozunk, nem paraffinba ágyazott anyagokkal. Vizsgálataim megkezdésekor csak kevés számú fagyasztott minta állt rendelkezésemre a 3 normál és a 3 tumoros csoportból. A patológiai mintavétel során makrodisszekált mintákkal dolgoztunk. Epeúti tumoros és normál mintákból mRNS-t izoláltam trizollal, majd koncentrációmérést követően 1:1 arányú cDNS-re történő átírást végeztem. A kapott cDNS-ek felhasználásával valósidejű PCR módszerrel detektáltam a termékek referencia génhez (β-actin) viszonyított mennyiségét a normál és epeúti daganatokból származó mintákban. III.9.1. RNS izolálás (Trizollal) Egyenként 5-20 mg szövetdarabot a II. Pathológiai Intézet szövetbankjából származó fagyasztott mintákból kimetszettem. Ezt követően 1 ml trizol reagenst (Invitrogen Cat. No. 15596-026) adtam mindegyik vizsgálandó mintához. A mintákat sterilizált és DEPC-es vízzel átmosott homogenizátorral 1-2 percig homogenizáltam. A minták között a homogenizátor fejét DEPC-es vízzel 2-3-szor átmostam a szennyeződés elávolítása végett. A fázisok szétválasztásához a mintákat a trizollal 15 percig szobahőmérsékleten inkubáltam, majd mindegyik mintához ml-enként 200 ul -20 ºC-os CHCl3 –ot (Reanal Cat.:16900-1-08-65)
adva
a
mintákat
1
percig
vortexeltem.
3
perces
o
szobahőmérsékleten történő inkubálást követően 2-8 C-on max. 12000g sebességgel 15 percig centrifugáltam az mintákat. A felső fázist óvatosan leszívtam, és új, sterilizált centrifugacsőbe tettem. A minták tisztítása végett ismételt -20 ºC-os CHCl3 hozzáadását (1:1 arányban) követően 1 percig vortexeltem az oldatokat, majd centrifugáltam ismét 2-8oC-on max. 12000g sebességgel 2 percig.
33
Az RNS kicsapásához a felső vizes fázist új csőbe tettem. Hozzáadtam 500 ul -20 ºC-os izopropil alkoholt (Merck Cat. No. 100995.1000), vortexeltem 1 percig, majd 10 percig inkubáltam
szobahőmérsékleten.
Ezután
2-8oC-on
max.
12000g
sebességgel
centrifugáltam 10 percig. Az RNS a cső fenekén fehér csapadék formájában általában láthatóvá vált. A felülúszót óvatosan leöntöttem róla. Az RNS mosását 1ml 75% -20 ºC-os etanol (Merck Cat. 1.00983.2500) hozzáadásával végeztem. Ezután 1 percig vortexeltem a mintát, majd centrifugáltam 5 percig 2-8oC-on max. 7500g sebességgel. Az RNS újrafeloldásához lepipettáztam a felülúszót. 5-10 percig hagytam az etanolt elpárologni, kerülve a teljes kiszáradást. Ezután 100 ul RNáz-mentes vízben (Eppendorf Cat. No. 0032006159) feloldottam a csapadékot. Az OD mérést Nanodrop 1000 (Wilmington, DE) spektrofotométerrel 260/280 nm hullámhosszt alkalmazó protokollal végeztem. III.9.2. cDNS készítés A kapott mRNS mintákból 2.5 µg-ot tartalmazó térfogatokat, az alábbi reagenseket (ABI), és ultradesztillált vizet a leírtak szerint összemérve (végtérfogat 50 µl) 0.2 ml-es eppendorf csőbe pipettáztam. A reakció paraméterei szerint beállított Eppendorf készülékkel cDNS készítettem (6. táblázat). 6. táblázat A cDNS protokoll (reagensek, mennyiségük, reakció paraméterek).
Reagensek
Cég
RT puffer (10x) RT Random primer (10x) dNTP mix (25x) 100 µM 20 U/µl Rnase Inhibitor Multi Sribe RevTranscr. dH2O mRNS (2.5 µg)
ABI
Térfogat µl –ben (50µl-hez)
ABI ABI ABI ABI Eppendorf
34
Reakció paraméterek
5
25 ºC
10’
5 2 2.5 2.5 33-x x
37 ºC 85 ºC 4 ºC
120’ 5” ∞
III.9.3. real-time PCR Az elkészült cDNS-ek 2-2 µl-nyi, valamint a PCR puffert, primereket (7. táblázat), enzimet, nukleotidokat, ultradesztillált vizet tartalmazó mix 23-23 µl-nyi térfogatát 96 lyukú plate-re raktam. A reakció paramétereinek megfelelően beállított ABI Prism 7000 real-time PCR készüléken történt a DNS termékek felszaporítása (8. táblázat). 7. táblázat A real-time PCR reakció során használt primerek.
Név
Forward szekvencia 5’- 3’irányban
claudin-1
GCGCGATATTTCTTCTT GCAGG (588-609) claudin-2 CTCCCTGGCCTGCATT ATCTC (599-619) claudin-3 CTGCTCTGCTGCTCGT GTCC (732-751) claudin-4 GGCTGCTTTGCTGCAA CTGTC (875-895) claudin-7 CATCGTGGCAGGTCTT GCC (811-829) claudin-8 CCAATGCCATCATCA GAGATTTCT (497-520) claudin-10 TGGATGTTCCCTATAT GCAAACAA (623-646) CCTGGCACCCAGCACA β-actin AT (1030-1047)
Reverz szekvencia 5’- 3’irányban
Termék hossz Gén száma (GI szám)
TTCGTACCTGGCATTGA CTGG (700-680) ACCTGCTACCGCCACTC TGT (689-670) TTAGACGTAGTCCTTGC GGTCGTAG (860-836) GAGCCGTGGCACCTTAC ACG (982-963) GATGGCAGGGCCAAACT CATAC (928-907) GTGGTCCATCCTAAGTA GAGAGCTTCT (587-561) AAACAGAGCGGCTCCTA ATTCA (713-692) GGGCCGGACTCGTCATA C (1173-1156)
113
21536297
91
38455423
129
21536298
108
34335232
118
153792185
91
40788010
91
38570071
144
5016088
Annak ellenőrzésére, hogy valóban a kívánt amplikonokat eredményezte a PCR reakciónk, a reakciókat követően olvadáspont analízist végeztünk, és amennyiben az analízis megerősítette a várt eredményt, akkor használtuk fel az adatainkat további elemzés céljára.
35
8. táblázat A real-time PCR összemérési protokoll.
Reagensek
Cég
Sybr Green Master Mix 25 µM primer Forward 25 µM primer Reverz dH2O cDNS minták
ABI Csertex Csertex Eppendorf
Térfogat µl –ben (50µl-hez)
12.5 0.2 0.2 10.1 2
Reakció paraméterek
1. 95 ºC 2’ 2. 95 ºC 20” 3. 60, ill. 63 ºC 30” 4. 72 ºC 1’ 2-4. lépés 40x (40 ciklus) Olvadáspont analízis: 60-99 ºC között
III.10. Western-blot A vizsgálathoz normál és daganatos epeúti fagyasztott szövetek, valamint sejtvonalak összfehérje lizátumait használtuk. III.10.1. Fehérje izolálás (szövetből) 100 mg szövetmintát 1 ml puffer mixben homogenizátorral homogénné tettem. A puffer mix az izoláló pufferből (100 mM NaCl (Sigma S 9625) - 1,17g; 2 mM EDTA (GIBCO 15576-028) - 0,148g; 50 mM TRIS (GIBCO 05504-020) - 1,21g; desztillál vízzel 200 ml-re kiegészítve), inhibitor koktélból (a végkoncentráció 0,05%-a), 10%-os SDS-ből (végkoncentráció 1%-a) valamint Triton-X 100 oldatból (végkonenrtáció 0,1%-a) állt. Az puffer mix alkotóinak a sejtek líziséhez, a fehérjebontó enzimek gátlásához, valamint a fehérjék számára biztosítandó környezethez szükséges összetevőket kellett tartalmaznia. Ezt követően a kapott elegyet 30 percig 13000 fordulaton 4°C hőmérsékleten centrifugáltam. A felülúszót lepipettáztam (ebben található az izolált összfehérje), és új steril centrifugacsőbe tettem. A fehérje koncentrációját Nanodrop 1000 (Wilmington, DE) spektrofotométerrel mértem le 280 nm hullámhosszt alkalmazó mérési protokollt használva.
36
III.10.2 Fehérje izolálás (sejtvonalkból) A 250 ml-es flaskában tenyésztett sejteket az izolálást megelőzően jégre ültettem. Miután a médiumot leöntöttem, a sejteket 2-szer 5 ml 1x-es PBS-el alaposan átmostam, hogy a médiumot teljesen eltávolítsam. A maradék folyadékot a flaska egyik sarkába gyűjtve leszívtam, és a sejteket visszatettem a jégre. Ezután sejtekre 1 ml a fentiek alapján összállított lízis puffer mértem, majd a sejteket a flaska sarka felé steril kaparóval összekapartam, és alaposan összkevertem fel-le pipettázás segítségével. A sejt szuszpenziókat jégre helyezett, felcímkézett eppendorf csőbe helyeztem. Előre 4°C-ra lehűtött centrifugán 14000 rpm-en 5-10 percig centrifugáltam a szuszpenziót. A felülúszót ismét lepipettáztam, és új steril centirugacsőbe helyeztem. Az így kapott oldat fehérje-koncentrációját Nanodrop 1000 (Wilmingto, DE) spektrofotométerrel mértem le 280 nm hullámhosszt alkalmazó mérési protokollt használva.
III.10.3. Fehérje előkezelése A 20 µg-nyi mennyiséget tartalmazó fehérjeoldat-részeket 4x Treatment pufferrel 3:1 arányban összekevertem. A Treatment puffer (glicerin-3 ml; β-merkaptoetanol -2 ml; brómfenolkék (0,1%)- 10 ul; SDS – 2 g; Tris-HCl (pH 6,8) – 303 mg; desztillált víz – 10 ml-ig kiegészíteni) a fehérjék méret szerinti szeparálását megakadályozó, a másodlagos és harmadlagos szerkezetet fenntartó kötések felszakítását, valamint a fehérjék azonos töltésűvé alakítását teszi lehetővé. A mintákat ezután 20 µl térfogatra fiziológiás sóoldattal egészítettem ki, majd 5-7 perces 100 ºC-on történő hődenaturáció után jégre helyeztem. III.10.4. Fehérjék szeparálása SDS-PAGE módszerrel A gyűjtő (stacking)-, szeparáló gél (7,5%-os occludin és claudinokhoz, 15%-os ZO-1 és E-cadherinhez) és a futtató puffer elkészítése után (Függelék: 8. melléklete), a futtatókádba állított, pufferrel feltöltött és kimosott zsebekbe mértem 20-20 µg fehérjét tartalmazó, már a futtatáshoz előkezelt max. 20 µl fehérje-oldatokat. Az elektroforézis 150V-on 5 percig, majd 125 V-on, jégen 1,5 h-ig tartott.
37
III.10.5. Blottolás A blottoló szendvics (szivacs, szűrópapír, gél, membrán, szűrőpapír, szivacs) a PVDF membrán aktiválása (1-3 perc metanolban), és a rétegek legalább 5 percig transzfer pufferben (Függelék: 8. melléklete) történő áztatása után került a blottoló kamrába. A blottolás a transzfer pufferrel történő feltöltés után 360-400 mA állandó áramerősség, folyamatos puffer kevertetés és vízhűtés mellett zajlott.
III.10.6. Immunjelölés A normál immunhisztokémiai reakciókhoz hasonlóan mosást (3 x 5 perc, RT), majd blokkolást (1 óra, RT) követően mosási lépésekkel elválasztott elsődleges (PAB - 1:250, 90 perc, RT) és másodlagos-HRP konjugált (SAB – 1:4000/2000, 60 perc, RT) antitestekkel történő inkubáció során jelöltük a detektálni kívánt fehérjéket. Mosó oldat összetétele:
Blokkoló oldat összetétele:
10x TBS
50 ml
Zsírmentes tejpor
2,50 g
Tween-20 (0,1%)
500 µl
10x TBS
5,0 ml
Deszt. víz
ad 500 ml
Tween-20
50 µl
Deszt. víz
ad 50 ml
Deszt. víz
ad 50 ml
III.10.7. Előhívás ECL-plusz (GE Healthcare, Amersham ECL Plus Blotting Detection System, Cat. No. RPN 2132) A és B oldatának 40:1 arányú elegyét elkészítve (0,1 ml/cm2 membrán) a megfelelő mennyiségeket a membránokra öntöttük a mosási lépést követően. 1-7 percig inkubáltuk a blott papírt az AB oldat keverékével; az erősített kemilumineszcens reakció lezajlása mintától függően különböző időt vett igénybe. Ezt követően a fényjelet röntgenfilmen rögzítettük. Mosás, fixálás és szárítás után értékeltük az eredményeket.
38
III.11. ELISA módszer A claudin-1, és -4 ELISA beállítások során öt ELISA protokoll került kidolgozásra. Részletes leírásukat a Függelék 9. melléklete tartalmazza. III.11.1. Normál ELISA Az ELISA plate-ek felszínét a detektálandó fehérjével vontam be úgy, hogy a minták 100x-os hígításaiból (PBS-ben hígítottam) 100-100 µl-nyi térfogatokat vittem fel a plate-ekre két-két párhuzamos méréssel számolva. A plate-eket PCR fóliával lefedve +4 °C-on 24 órán keresztül inkubáltam. A mintákat másnap eltávolítva a lyukakból a felszínt 200-200 µl 1x-es mosó-oldattal (10x mosó-oldat: Tween20 és TRIS alapú puffer tömény oldata) 3-szor átmostam. Az aspecifikus reakciók elkerülése érdekében a blokkoláshoz 100-100 µl 3% BSA-oldatot (1x mosóban hígított) használtam. PCR fóliával lefedve 30 percig 37 °C-on inkubáltam a plate-ket. Ezt követően a fent leírtak szerint végeztem a mosási lépéseket, majd az elsődleges antitest megfelelő hígításaiból (1x konjugáló oldatban oldva - 10x konjugáló oldat: Tween20 és BSA tartalmú TRIS alapú puffer tömény oldata) 50 µl mennyiségét vittem fel a megfelelő lyukakba. PCR fóliával lefedve 30 percig 37 °C-on, vagy 24 óráig 4 °C inkubáltam a plate-eket. Majd mosást követően a másodlagos antitestest megfelelő hígításaiból (konjugáló oldatban oldva; DAKO, Polyclonal Swine Anti-Rabbit Immunglobulin / HRP-s; Cat. No. P0399) 50 µl mennyiséggel PCR fóliával lefedve 30 percig 37 °C-on inkubáltam. Mosást követően 100-100 µl TMB (Sigma) szubsztrátot pipettáztam a mintákra, 5-10 percet vártam a reakció kifejlődéséig, majd EIA reader-rel 360 nm-en leolvastam a jelek intázitási értékeit. III.11.2. Szendvics ELISA Az ELISA plate-ek felszínét az elsődleges antitestek egyikével (két különböző fajból származó elsődleges antitest szükséges a szendvics ELISA-hoz) vontam be úgy, az antitest 0,5-0,5 µg mennyiségeit (PBS-ben hígítva) 50-50 µl térfogatokban vittem fel a plate –re. PCR fóliával lefedve 24 órán keresztül inkubáltam a platet +4 °C-on.
39
200-200 µl 1x-es mosó-oldattal 3-szori mosást követően 100-100 µl 3% BSA–oldattal (mosóban hígítva) blokkoltam a plate-ek felületét 30 percig 37 °C-on lefedés mellett. A mosási lépések után a vizsgálandó antigén (fehérje) megfelelő hígítású (PBS-ben hígított) oldataival szobahőmérsékleten 30 percig 37°C-on lefedve inkubáltam a plateet. Majd ismételt mosási lépések után a megfelelő hígítású elsődleges antitest 50-50 µl térfogatait (konjugáló oldatban oldva) a plate lefedése után 37 °C-on 30percig hagytam aplate-eken. Mosást követően kerültek rá a másodlagos antitest 50-50 µl térfogatai megfelelő hígításban (konjugáló oldatban oldva; DAKO, Polyclonal Swine Anti-Rabbit Immunglobulin/HRP-s; Cat. No.: P0399). 37 °C-on 30 percet hagytam kialakulni az antitestek között létrejövő kötéseket. 3-szori mosást követően 100-100 µl TMB szubsztrát színreakció változását (5-10 perc a reakció kifejlődése) detektáltam EIA reader-rel 360 nm hullámhosszon.
III.11.3. Fluoreszcens normál ELISA
Az ELISA platek felszínét rekombináns claudin-4 antigén (kontroll fehérje) 12-tagú felező hígításával vontam be (Abnova H00001364-P01 full-length recombinant CLDN4; 85ng/µl). A lyukakba felvitt legnagyobb mennység 85 ng volt 200 µl karbonát-bikarbonát pufferben hígítva. Lefóliázva 4ºC-on 24 óráig inkubáltam a plateet. 6 mosási lépést követően (mosás: 200-200 µl PBST - Tween-20 0,1%) 200-200 µl 3% BSA-oldattal (hígítva PBST-ben: Tween-20 1%) 1 óráig 37ºC-on lefóliázva hagytam a plate-et. Mosásokat követően került rá a primer antitest 1:250 hígítása (Zymed, klón 3E2C1 Cat.:18-7341, monoklonális mouse anti-claudin4; hígítva 0,3% BSA tartalmú PBST-ben - Tween20 0,1%) Az inkubációs idő 2 óráig tartott 37ºC-on lefóliázás mellett. Mosások után a másodlagos antitest (Dako, HRP konjugált antimouse IgG; hígítva 0,3% BSA tartalmú PBST-ben - Tween20 0,1%) 1:1000 hígítása került a plate-re 1 óráig 37ºC-on. A plate lefedése PCR fóliával történt. Mosási lépések után került rá a fluoreszcens szubsztrát 135-135 µl-nyi mennyisége (össztevők: H2O; Tris pH=9,0; Citrát puffer; HPPA; H2O2). 30 perces rázatás után a reakció leállítása 6565 µl glicinnel történt. Detektálás EIA reader-rel (324 nm excitáció, 410 nm emisszó).
40
III.11.4. Fluoreszcens szendvics ELISA A plate-ek felszínét az egyik elsődleges ellenanyaggal vontam be. Egy-egy lyukba 100µl 0,5µg antitest-oldat került. Az inkubálás 24 órán keresztül +4 °C-on PCR fóliával történő lefedést követően történt. 200-200 µl 1x-es mosó-oldattal 3x mostam a plateeket, majd 3% BSA (mosóban hígítva; 100-100 µl) blikkoltam 30 percig 37 °C-on PCR fóliával
lefedés
mellett.
Mosást
követően
PBS-ben
megfelelően
hígított
antigén/fehérjeoldatok 100-100 µl térfogatát vittem fel a plate-ekre; szobahőmérsékleten lefedve 60 percig 37°C-on inkubáltam. Mosásokat követően elsődleges antitest megfelelő hígításai 100-100 µl térfogatban kerültek a plate-ekre (Zymed, konjugáló oldatban oldva). Az inkubálás 60 percig 37 °C-on lefedve zajlott. Mosási lépések után a másodlagos antitest megfelelő hígítását (konjugáló oldatban oldva) 100-100 µl-ben a plate-ekre pipettázva 60 percig 37 °C-on hagytam az oldatokt a plate-eken. Mosások után fluoreszcen szubsztátot használva (ld. fent) szobahőmérsékleten 30 perces rázatás mellett történt az előhívás. A reakció leállítása 65 µl glicinnel történt. A detektálás 324 nm-es megvilágítás után 410 nm hullámhosszon történt EIA reader segítségével. III.12. Szemikvantitatív analízis Az elkészült immunhisztokémiai reakciók után a metszeteket Mirax Midi Scannerrel (3DHISTECH; Budapest, Magyarország) digitalizáltuk. A core-ok (2 mm-es átmérőjű szövethengerek, melyek a szöveti multiblokkba, ill. a metszetekre kerültek) kiértékelése ezek után két szempont figyelembe vételével történt: vizsgáltuk az immunreakció intenzitását, ill. azt, hogy a reprezentatív területen a sejtek hány százaléka ad pozitív reakciót. Az intenzitási adatokat négy kategóriába soroltuk: reakciót nem adó (0), gyenge- (1), közepesen erős-(2) és erős (3) reakciót mutató eseteket különítettünk el. Azoknál a mintáknál, ahol kevert tumor fordult elő, a normál és tumoros sejteket elkülönülten értékeltük. Az intenzitás és pozitivitás értékelését egy patológus kollégámmal közösen végeztük. Egy-egy fehérje immunhisztokémiai jelölése az összes mintán egy időben készült – ezzel biztosítottuk az azonos, standardizált reakció körülményeket. Az intenzitási értékek megállapításához kiválasztottuk a reakció-
41
sorozatokból a leggyengébb és legerősebb reakciót mutató mintákat. Ezek, és a velük azonos erősségű reakciót adó minták kapták az 1-es és 3-as értékeket. A többi minta került a 2-es értékkel jelzett csoportba. A pozitivitási értékek megállapításánál a pozitív reakciót adó mintáknál meg kellett becsülni, hogy a reprezentatív sejtek hány százaléka mutat pozitív immunhisztokémiai reakciót. Kevert tumorok esetén természetesen csak azokat a sejteket vizsgáltuk az értékelés során, amelyek a vizsgálat tárgyát képezték. Így tumoros minta esetén, ha normál fenotípusú epeúti sejtek is voltak a szövetben, csak a neoplasztikus sejteket vettük figyelembe az értékelésnél. A 12. ábrán szemléltetem a fent leírtakat.
12. ábra A szemikvantitatív értékelés szemléltetése két példa segítségével. A kép A. (CK-7 festés) részén a mintában normál sejtek is láthatók (normál epeút); ezeket az értékelésnél figyelmen kívül hagyjuk. 3-as intenzitási értéket kapna - a minta azt az intenzitási értéket kapja, ami a sejtek nagyobbik részében fordul elő. Itt a sejtek 100%- a pozitív, bár kb. 30% 2-es intenzitású. A pozitivitási érték ennek megfelelően 100%. Az ábra B. részén (Cl1) a sejtek 1-es erősségűek, vagy nem mutatnak pozitivitást. Ilyen esetben az intenzitási érték 1-es, a pozitivitási érték pedig kb. 50%.
42
III.13. Statisztikai analízis A statisztikai elemzés SPSS 15.0 software-rel (SPSS, Chicago, IL) történt. A vizsgálatba bevont epeúti tumor-csoportok páronkénti összehasonlításánál (NIBDIBDC, NEBD-EBDC, NGB-GBC, IBDC-EBDC, IBDC-GBC, EBDC-GBC) MannWhitney tesztet alkalmaztunk p < 0.05 valószínűségi értékeket tekintve szignifikánsnak; további korrekciós módszerként a Bonferroni-Holmes tesztet használtuk. Az immunhisztokémiai reakció intenzitása és pozitivitása közötti korrelációt Spearman-féle rang korrelációval számoltuk, p < 0.01 értékeket tekintve szignifikánsnak. A vizsgált hat minta csoport egymástól történő elkülöníthetőségét a fent említett két szempont szerint diszkriminancia analízissel vizsgáltuk. A túlélési adatokat a GraphPad Prism v5.01 programmal értékeltem. Az mRNS szintek statisztikai elemzését Pfaffl cikke alapján, annak egy újabb verziójával a REST-384-beta-v2 software-rel végeztük (Pfaffl 2002). A módszer alapja, hogy a referencia génekre normalizált Ct (termék „feltörési” ciklusszám) értékeket számolja ki két általunk összehasonlítani kívánt csoportnál (∆Ct, a módszer a lemért eredményeink alapján még random generál újakat – és kb. csoportonként 2000 adatból számol eredményt). Ezek után a ciklusonkénti termékduplázódást alapul véve (megfelelő hatékonyság esetén) a különbségeket (∆∆Ct) a 2 hatványkitevőjébe írva, további számolással kapjuk a két vizsgált csoportunk között számolt kiindulási mRNS koncentráció különbséget.
43
IV. EREDMÉNYEK IV.1. A claudinok expressziós profiljának meghatározása az epeút különböző szakaszain normál mintákban és epeúti daganatokban Az immunreakciók jellemzése A claudin-1, -3, -4, -8, és -10 fehérje a normál epeúti hámon, a megfelelő kontrol szövetekkel összhangban membrán reakciót mutatott a vizsgált csoportok TMA metszetein. A claudin-2 mind a kontrol, mind a normál hámszöveten citoplazmatikus és membrán reakciót is mutatott, szemben a claudin-7 fehérje expresszióval, ahol a kontrol epitheliumtól eltérően a normál epehólyag mintáknál citoplazmatikus reakciót is megfigyeltünk. A claudin-3, -8 és -10 gyakran megfigyelhető apikális reakciói az epeúti hámokon csak a claudin-8 esetén mutattak teljesen azonos elhelyezkedést a kontrol szövetben látott reakciókkal. A többi claudin membrán reakciója főként apikális és laterális reakciót mutatott (9. táblázat). A tumoros mintáknál hasonló megfigyeléseket tettünk, azonban a claudin-8 és -10 immunreakció a neoplasztikus sejtek egy részén a teljes felszínre kiterjedt, a claudin-10-nél citoplazmatikus festődést is mutatott. A claudin-1, -3, és -10 fehérjéknek a tumort körülzáró elhelyezkedését találtuk számos mintában (hasonlóan, mint az agrin fehérje kifejeződésénél). 9. táblázat A vizsgált claudin fehérjék lokalizációja az immunhisztokémiai reakciókban. Cldn: claudin; A: apikális-; AL: apikolaterális-; BL: bazolaterális-; B: bazális expresszió; *:citoplazmatikus is
A Cldn1 Cldn2* Cldn3 Cldn4 Cldn7 Cldn8 Cldn10
+ + + + + + +
Immunreakció lokalizációja normál minták esetében tumoros minták esetében AL BL B A AL BL + + + + + + +
+ + + + + -
+ + -
44
+ + + + + +*
+ + + + + +*
+ + + + +*
B + + + + + +*
A 13. ábra a claudin-1, -2, -3, -4, -7, -8, -10 fehérjék egyes csoportokra legjellemzőbb immunhisztokémiai reakcióit mutatja. A legfelső, különálló sorban a folyó szövegben említett apikális, apikolaterális, bazolaterális, bazális és citoplazmatikus reakciók jelentését szemléltetem – természetesen a szövetek nem ismerik a tudomány által tematikusan felépített nomenklatúrát, így ezek „tiszta” formái a mintákban csak ritkán láthatók. Az „apikális” csak a sejtek lumen felőli részén (maximálisan az érintkező sejtek találkozásáig tart) található; a claudin-8, és -10 reakciók ezt szépen mutatják (valamint ZO-1, occludin ld. később is). A „laterális” reakció két formája, az apikolaterális és a bazolaterális, az apikális ill. bazális részek felőli régiókat jelentik ezek a reakciók egy-egy mintán többnyire együtt fordultak elő. Szép példa erre a claudin-7 immunhisztokémiai reakció a normál epehólyagon. „Bazális” reakciót normál szöveteknél ritkán figyeltem meg. A legfelső sorban az emlő mintán készült Cl7 immunreakció ezzel szemben jól szemlélteti a reakció megjelenési helyét (bár gyenge laterális reakció is kíséri). Mintáim között ez a kifejeződés döntően a tumoros szövetekben volt látható. A claudin-1 normál mintában mutatott döntően laterális és apikális reakciói a tumoros mintákban kiegészültek a bazális (esetenként megfigyelhető citoplazmatikus) reakciókkal is. A claudin-2 döntően citoplazmatikus kifejeződése normál szöveteken membrán reakciót is mutatott. A claudin-3 a normál intra- és extrahepatikus epeutakban gyenge, de egyértelmű apikális reakciókat, a normál epehólyagban jól látható apikkális és laterális reakciókat adott. A tumoros szövetekben e fehérje kifejeződésének helye nem változott lényegesen. A claudin-4, a claudin-1 fehérjéhez hasonlóan, az apikális és laterális reakció dominanciájával, de nem túl erőteljesen fejeződött ki a normál intra- és extrahepatikus epeutakon. A normál epehólyagban a nagy fehérjemennyiség miatt citoplazmatikusnak tűnő reakció látható. A daganatos mintáknál kifejeződése a bazális régióban is megfigyelhető. A claudin-7 apikális és laterális megjelenése a normál mintákon, „módosult” a tumorokban (ha kifejeződött a fehérje), gyakran a sejteket teljesen körbefogó elhelyezkedéssé alakult. A claudin-8 és -10 egyértelmű apikális reakciói (az előbbi gyenge kifejeződése miatt csak nagyobb nagyítás mellett értékelhető megfelelően) mind a normál, mind a tumoros mintákon láthatók. Daganatos mintáknál azonban a tipikus reakció mellett az egész sejtfelszínre kiterjedő, ill. citoplazmatikus lokalizációt is mutatott e két fehérje.
45
13. ábra A claudin fehérjék lokalizációja az immunhisztokémiai reakciókban. Az ábra felső tábláján a különböző immunlokalizációk képei láthatóak. Az alsó táblán a hétféle claudin legjellemzőbb lokalizációit tüntettem fel a 6 db epeúti minta-csoportban. Cl: claudin; NIBD/NEBD: normál intra/extrahepatikus epeút; NGB: normál epehólyag; IBDC/EBDC: intra/extrahepatikus epeúti tumor; GBC: epehólyag tumor.
46
Az immunreakciók kiértékelése Az immunreakciókat két szempont szerint értékeltük: a reakció intenzitását négy fokozattal (negatív, gyenge, közepesen erős és erős reakció) jellemeztük, míg a reakció pozitivitását a pozitív sejtek százalékában adtuk meg. Mindkét vizsgálat összefoglaló eredménye a 14. ábrán látható.
14. ábra Az immunhisztokémiai reakciók két szempontú analízisének eredménye. Normál-Tumoros összehasonlítás (fent). Tumor csoportok összehasonlítása (lent). A színkódok az ábra mellet vannak feltüntetve. Int: intenzitás, Pos%: pozitivitás, *: 0.01
47
normál szövetek leginkább a claudin-2, -3 és -4, a normál és daganatos szövetek mindegyik, míg a daganatos csoportok a claudin-7 kivételével az összes fehérje kifejeződésében jelentős eltérést mutatnak egymástól. A normál-karcinóma reláció adta a legtöbb szignifikáns eredményt (szám szerint 14-et a 21 összehasonlításból), és 11 esetben
jelentősebb
(p<0.001)
a
különbség.
A
karcinómás
csoportok
összehasonlításában 10 eset mutatott szignifikáns eltérést, a szignifikancia értékek alacsonyabbak (0.05
A
pozitivitási
értékek
tekintetében
a
claudin-4
fehérje
immunhisztokémiai értékeinél mutatkozik a legkisebb ingadozás. A claudin-7 fehérjénél megfigyelhető jelentős expressziós különbséget a normál és tumoros minták között nemcsak a 16., de a 13. és 14. ábrák is érzékelhetővé teszik. A claudin-8 esetén a viszonylag egységes intenzitási értékeket mutató ábra feltehetően a gyenge immunreakciónak is köszönhető, mely kevesebb lehetőséget adott a különbségtételre. A pozitivitási értékeknél ez a tendencia már nem látszik, hiszen ott a reakció megléte és hiánya ábrázolódik, aminek eldöntése nem ütközött észlelési nehézségekbe. A megelőző
48
15. ábra A claudin fehérjék immunhisztokémiai vizsgálatain alapuló szemikvantitatív értékelés eredményei. A. táblán a függőleges tengely értékei az intenzitási kategóriákat mutatják (0, 1, 2, 3). B. táblán a függőleges tengely értékei a pozitív sejtek százalékos arányát mutatják (1-100%-ig). NIBD/NEBD: normál intra/extrahepatikus epeút; NGB: normál epehólyag; IBDC/EBDC: intra/extrahepatikus epeúti tumor; GBC: epehólyag tumor. NIBD/NEBD: normál intra/extrahepatikus epeút; NGB: normál epehólyag; IBDC/EBDC: intra/extrahepatikus epeúti tumor; GBC: epehólyag tumor; median: vízsztintes vonal a pontok között/pontokon
49
16. ábra A claudin fehérjék immunhisztokémiai vizsgálatain alapuló szemikvantitatív értékelés eredményei. A. táblán a függőleges tengely értékei az intenzitási kategóriákat mutatják (0, 1, 2, 3). B. táblán a függőleges tengely értékei a pozitív sejtek százalékos arányát mutatják (1-100%-ig). NIBD/NEBD: normál intra/extrahepatikus epeút; NGB: normál epehólyag; IBDC/EBDC: intra/extrahepatikus epeúti tumor; GBC: epehólyag tumor. NIBD/NEBD: normál intra/extrahepatikus epeút; NGB: normál epehólyag; IBDC/EBDC: intra/extrahepatikus epeúti tumor; GBC: epehólyag tumor; median: vízsztintes vonal a pontok között/pontokon
50
ábrákon (13., 14.) a claudin-10 fehérje kifejeződésénél látható igen jelentős változás a 16. ábrán is a legjelentősebb változásként jelenik meg az összes többi fehérje expressziós változáshoz viszonyítva. A 15. és 16. ábrák alapján elmondható, hogy az összes általam vizsgált fehérje kifejeződése a daganatos mintákban jelentősen lecsökken a normál mintákban tapasztalthoz képest. Ez alól a megállapítás alól csak a claudin-4 fehérje kivétel, ahol az extrahepatikus epeúti tumorokban a fehérje átlagos expressziója nemhogy csökkent, de emelkedett is a megfelelő normál csoport mintaátlagához viszonyítva. A diszkriminancia analízis az alkalmazott claudin-1, -2, -3, -4, -7, -8 és -10 immunreakciók összes intenzitási és pozitivitási adatainak felhasználásával készült. Az értékelési algoritmus eredményét 17. ábra szemlélteti. A három tumor és három normál mintacsoport mindegyike külön színnel és jellel látható az ábrán. Az egyes „pontok” az értékeléskor felhasznált mintákat jelölik. Mivel hasonló értékekkel (azonos intenzitási és pozitivitási értékkel) különböző minták is rendelkeztek, ezért itt eltérően a 15. és 16. ábrától, egy-egy pont nem feltétlenül egy-egy mintát, hanem adott specifikációjú mintát/kat reprezentál. Az ábrán látott pontok, ill. csoportok valójában (matematikailag) egy több dimenziós térben helyezkednek el. Ebből a térből a mi két, ún. főkomponensünk (a pontok helyzetét leginkább meghatározó, jelen esetben az intentitási és pozitivitási sajátságok) tengelyei mentén létrehozott sík került kiemelésre, tulajdonképpen ez a 17. ábra. A pontok és így a csoportok helyzetét is az ábrán a minták értékei, és ennek megfelelően a többdimenziós térben kialakított, egymáshoz viszonyított helyzetük határozza meg. A fent leírtakból következik, hogy abban az esetben, ha a csoport nem rendelkezik a tagokat „összetartó” tulajdonságokkal (ha az egyes claudinok kifejeződése nem jellemző a csoportra), a csoporttagok összekeveredve a tér bármely térrészében megtalálhatók, és nem „sajátítanak” ki maguknak egy-egy a többi csoporttól viszonylag jól elhatárolható „térfogatot”, térrészt az ábrán (a 25. ábrán a meghúzott súlypontvonalakkal kirajzolódó egybefolyó területek ezt jól érzékeltetik). Ennek értelmében a 17. ábrán látható eredményünk azt igazolja, hogy a claudinok expressziója a hat csoport mindegyikére specifikus, ezért láthatók az elkülönült térrészek.
51
17. ábra A diszkriminancia analízis eredménye. A hat vizsgált csoport (NIBD, NEBD, NGB, IBDC, BDC, GBC) jól elkülöníthető egymástól a claudin-1, -2, -3, -4, -7, -8 és 10 immunreakciók intenzitási és pozitivitási adatai alapján.
A karcinóma minták és a megfelelő normál szövet összehasonlítása A legtöbb normál minta - karcinóma minta összehasonlításban a vizsgált claudinok expressziója intenzívebben és/vagy a sejtek nagyobb százalékában mutatott pozitív reakciót a normál mintáknál 14A ábra, szemben a daganatos elváltozással. A 18. és 19. ábra a claudin-2, -3 és -10 fehérjéknél ezt jól szemlélteti. Számos claudin fehérje legalább egy vizsgálati paraméter tekintetében szignifikánsan alacsonyabb expressziót mutatott a tumor csoportoknál. A claudin-3, -7, -8 és -10 az IBDC-ben, a claudin-1, -8 és -10 az EBDC-ben, valamint claudin-1, -2, -3, -7, -8, és -10 a GBC-ben csökkent jelentősen. Másként megközelítve a kérdést a claudin-2 csak a GBC-ben, a claudin-1, -3 és -7 két tumor csoportban; a claudin-8 és -10 mind a három tumor csoportban szignifikánsan alacsonyabb értéket mutatott a megfelelő normál mintákkal összevetve.
52
18. ábra A claudin-2 és -3 immunreakció a NGB, GBC, NIBD és IBDC csoportokban. A claudin-2 a normál epehólyag hámban expresszálódott a legintenzívebben, és szignifikánsan lecsökkent a mennyisége a GBC-ben a NGB-hez viszonyítva. A claudin3 erősen expresszálódott a normál epehólyag hámban, de gyenge kifejeződését figyelhettük meg a normál intrahepatikus epeutakban. Szignifikáns csökkenést találtunk a claudin-3 pozitivitásban az epehólyag- és az intrahepatikus epeúti karcinómákban összevetve a megfelelő normál régiókkal. Bar: 50 µm A legtöbb claudint érintő fehérje expresszió csökkenés az epehólyag karcinómában volt látható, a claudin-4 kivételével az összes többi vizsgált fehérje csökkent immunreakciót mutatott a normál epehólyaghámhoz képest. Ez részben azzal a ténnyel is magyarázható, hogy a legerősebb claudin expresszió a normál minták között az epehólyaghámban volt megfigyelhető. A claudin-4, mint kivétel, expressziója nem csökkent az általunk kiválasztott epeúti tumor csoportokban, sőt, erőteljesebb kifejeződést találtunk az EBDC-ben a NEDB-hez viszonyítva. A daganatok esetében a claudin-8 és -10 expresszió lokalizációja is megváltozott. A sejtek polaritás nélküli
53
mintázatot adtak, ha kifejeződtek: számos esetben a sejt teljes felszínén expresszálódtak. Ez a jelenség más claudinoknál is megfigyelhető volt, de kevésbé szembetűnően, mint ebben a két esetben, mivel e fehérjéknél a normál- és kontroll mintákon az expresszió főként az apikális régióra korlátozódott. A citokeratin-7 immunreakció, mint epeúti hám marker, a legtöbb claudinhoz hasonlóan szintén csökkenést mutatott a daganatos szöveti mintákban, különösen a rosszul differenciált területeken (24. ábra).
19. ábra Claudin-10 immunreakció a NEBD, NGB, NIBD, EBDC, GBC és IBDC csoportokban. Claudin-10 szignifikánsan csökkent minden megfelelő normál vs. karcinóma összehasonlításban, bár relatíve erősen expresszálódott az IBDC csoportban az EBDC és a GBC csoporthoz viszonyítva. Bar: 50 µm Különbség a daganat típusok között A tumor csoportokról általánosan elmondható, hogy alacsony fehérje expressziót mutattak a claudin-3, -7, -8 és -10 reakciók, szemben a claudin-1, -2 és -4 reakciókkal.
54
Ez utóbbi fehérjék egy-egy tumor csoportban erőteljesebben fejeződtek ki. Szignifikáns különbséget találtunk legalább egy paraméter szempontjából a claudin-1, -2, -3, -4, -8, és -10 fehérjék expresszióinál a különböző kiindulású epeúti tumorok között, ellentétben a claudin-7 fehérjével, ahol az expressziók nem különböztek jelentősen a tumor csoportokban 14B ábra.
20. ábra A claudin-1 és -4 immunreakció EBDC, GBC és IBDC csoportokban. Claudin1 immunreakció intenzívebb volt az IBDC-ben, bár nem szignifikánsan, összehasonlítva az EBDC-vel és GBC-vel. Claudin-4 expresszió az EBDC-ben volt a legkifejezettebb, és szignifikánsan gyengébb expressziót mutatott az IBDC és GBC csoportokban. Bar: 50 µm A legszembetűnőbb különbségeket szemlélteti a 20. ábra, ahol erős claudin-1 reakció figyelhető meg az IBDC-ben szemben az EBDC-vel és GBC-vel; a sejtek szignifikánsan nagyobb százaléka expresszálja e fehérjét IBDC-ben. Továbbá erős
55
claudin-4 expressziót detektáltunk az EBDC-ben szemben az IBDC-vel és GBC-vel. Ez szignifikánsan intenzívebb immunreakciót eredményezett EBDC-ben a másik két tumor csoporttal szemben. A claudin-2 fehérje GBC-ben fejeződik ki legerősebben a három tumor csoport között; mindkét vizsgálati szempontot – intenzitás/pozitivitás figyelembe véve szignifikáns különbséget tapasztaltunk az említett (GBC-EBDC; GBCIBDC) relációkban. Néhány esetben megfigyeltük, hogy ugyanannak a mintának (epehólyag karcinóma) a májba infiltráló szakasza jelentősen erősebb claudin-1 és -10 fehérje expressziót mutatott, mint a nem infiltráló rész.
mRNS expressziós változások Normál epeúti minták közül csak epehólyag,
ill. intahepatikus
epeút
állt
rendelkezésünkre, a statisztikai értékeléshez nem elegendő mennyiségben, így a normáltumoros mRNS expressziós szintű összehasonlításokat mellőztük a vizsgálataink során. Helyettük a tumoros szövetet környező ép szövettel végeztünk összehasonlításokat. Az mRNS expressziós vizsgálatok egyik összehasonlításban sem mutattak szignifikáns különbséget a vizsgált csoportok között (10. táblázat). 10. táblázat Az mRNS expressziós adatok statisztikai elemzésének eredményei. Az eredmények egyike sem szignifikáns. IBDC: intrahepatikus epeúti tumor; EBDC/GBC: extrahepatikus és epehólyag tumor; ITu/IÉp: intrahepatikus tumor ép környezete; EBDC: extrahepatikus epeúti tumor; Etu:/EÉp: extrahepatikus tumor ép környezete; szignifikáns: p< 0,5
Statisztikai elemzés valószínűségi értékei Cl1
Cl2
Cl3
Cl4
Cl7
Cl8
Cl10
IBDC-EBDC/GBC
0,651
0,791
0,275
0,347
0,569
0,468
0,794
IBDC-ITu/IÉp
0,327
0,944
0,932
0,672
0,814
0,754
0,411
EBDC-ETu/EÉp
0,937
0,994
0,584
0,235
0,790
0,372
0,782
Csoportok
56
IV.2. A claudinok differenciál diagnosztikai szerepét befolyásoló eredmények Az
epehólyag
karcinómát
a
cholangiokarcinómáktól
az
immunhisztokémiai
eredményeink alapján a claudin-2 immunreakció intenzitása és pozitivitása alapján lehet elkülöníteni. Közepes vagy erős claudin-2 reakció a sejtek nagyobb, mint 25%-ában, szemben a gyenge vagy negatív claudin-2 expresszióval a sejtek kisebb, mint 25%-án, 85%-os specificitással és 72%-os érzékenységgel elkülöníti a GBC-t az IBDC+EBDC csoporttól (Fisher exact test, p=0.0003). Vizsgálataink szerint a claudin-4 fehérje kifejeződését alapul véve: az erős (3+) claudin4 expressziót mutató EBDC esetek 91%-os szenzitivitás és 80%-os specificitás mellett elkülöníthetők a közepes, gyeng, ill. negatív (2+, 1+, 0) fehérje expressziót mutató IBDC esetektől (Fisher exact test, p=0.02). A claudin-3 imuunnreakció az EBDC esetek 100%-ban, az IBDC minták közel 50%ban, a GBC estek nagyobb, mint 60%-ban pozitív, szemben a negatív reakciót mutató ductalis pancreas tumorokkal. A claudin-7 a cholangiocelluláris minták körülbelül 30%-ban pozitív reakciót ad, erőssége 1+. A túlélési adatok alapján a claudin-10 immunreakció alacsonyabb pozitivitási értékei szignifikánsan (p< 0,01) hosszabb túlélési időt biztosítottak a betegeknek (21. ábra). Ezzel szemben sem a claudin-1, sem a claudin-4 kifejeződése nem mutatott szignifikáns összefüggést a túléléssel. Azonban a két utóbbi fehérjének a normál mintákéval azonos, vagy közel azonos kifejeződése hosszabb (253, ill. 595,5 nap szemben a 246, 154, ill. 124, 110 napokkal) átlagos túlélésű betegcsoportot eredményezett, mint az ettől eltérő fehérje expressziót mutató minták csoportjai. Az mRNS szintű vizsgálatok eredménye a kis mintaszám miatt nem adott lehetőséget a diagnosztikai konzekvenciák levonására.
57
21. ábra A claudin-10 fehérje pozitivitási értékeinek összefüggése a betegek túlélésével. Az ábra az alacsonyabb pozitivitást mutató mintacsoportba tartozó betegeknél mutat hosszabb túlélési időt. Cl10%_0: negatív immunreakciót adó mintacsoport; Cl10%_50: 1-50% pozitivitást mutató mintacsoport; Cl10%_100: 51-100% pozitivitást mutató mintacsoport.
58
IV.3. ZO-1, occludin és E-cadherin expressziós profiljának meghatározása az epeút különböző szakaszain normál mintákban és epeúti daganatokban ZO-1, occludin és E-cadherin expressziós mintázata A ZO-1 és az occludin a membrán apikális felén adott pozitív immunreakciót, míg az Ecadherin
membrán
és
citoplazmatikus
jelölődése
is
előfordult
a
vizsgált
mintacsoportokban (11. táblázat). Míg az acináris struktúrát mutató jól differenciált tumorokban a reakciók többnyire megtartottak voltak, és a membrán apikális felére korlátozódtak, addig a ZO-1 és occludin aberráns diffúz lokalizációját tapasztaltuk a grade 3 tumorokban.
11. táblázat A vizsgált ZO-1, occludin és E-cadherin fehérjék lokalizációja az immunhisztokémiai reakciókban. Cldn: claudin; A:apikális-; AL: apikolaterális-; BL: bazolaterális-; B: bazális expresszió
A ZO-1 Occludin E-cadherin
+ + +
Immunreakció lokalizációja normál minták esetében tumoros minták esetében AL BL B A AL BL +
+
-
+ + +
+
+
B +
Az egyedi esetek intenzitási és pozitivitási adatát a 22. ábra szemlélteti. Az értékelés eredményei alapján látható, hogy a normál minták mindegyike 100%-ban (néhány kivételtől eltekintve) kifejezte mindhárom fehérjét a sejtmembránon. A daganatos mintáknál a pozitív sejtek mennyisége minhárom csoportban jelentősen csökkent. a legnagyobb mértékben a ZO-1 fehérje expressziója csökkent. A normál mintákban a vizsgált fehérjék közepes és erős expressziót mutattak, a karcinóma csoportoknál bár csökkent értékeket kaptunk, mégsem minden csoportnál volt ez jelentős mértékű.
59
22. ábra A ZO-1, occludin és E-cadherin fehérjék immunhisztokémiai vizsgálatain alapuló szemikvantitatív értékelés eredményei. A. táblán a függőleges tengely értékei az intenzitási kategóriákat mutatják (0, 1, 2, 3). B. táblán a függőleges tengely értékei a pozitív sejtek százalékos arányát mutatják (1-100%-ig). NIBD/NEBD: normál intra/extrahepatikus epeút; NGB: normál epehólyag; IBDC/EBDC: intra/extrahepatikus epeúti tumor; GBC: epehólyag tumor. NIBD/NEBD: normál intra/extrahepatikus epeút; NGB: normál epehólyag; IBDC/EBDC: intra/extrahepatikus epeúti tumor; GBC: epehólyag tumor;median: vízsztintes vonal a pontok között/pontokon
60
ZO-1, occludin, E-cadherin és citokeratin-7 fehérje expressziója a vizsgált csoportokban Szignifikáns különbséget a fehérjék kifejeződésében csak a normál vs. karcinóma összehasonlításoknál találtunk 23. ábra. A normál, ill. neoplasztikus csoportokon belül tett összevetések nem eredményeztek jelentős eltérést. Az intenzitás és pozitivitás szignifikáns korrelációt mutatott. A szemikvantitatív analízis adatainak páronkénti (normál vs. tumor; tumorok között) összehasonlításakor kapott statisztikai analízis eredménye a 12. táblázatban látható.
12. táblázat A statisztikai analízis eredményei. A táblázat egyrészt a páronkénti összehasonlítások eredményeit mutatja. Szemlélteti, hogy az összehasonlított két-két csoport különbözősége mennyire jelentős. Másrészt a két vizsgálati szempont közötti korrelációt mutatja. ns: nem szignifikáns; %: pozitivitási százalék; int: intenzitás; Occl.: occludin
ZO-1 Occl. E-cadh.
Változó
NIBDIBDC
NEBDEBDC
int % int % int %
ns <0.001 ns 0.008 ns <0.001
ns 0.001 ns 0.02 ns 0.001
NGB- IBDC- IBDC- EBDCGBC EBDC GBC GBC
ns <0.001 ns <0.001 <0.001 <0.001
ns ns ns ns ns ns
ns ns ns ns ns ns
ns ns ns ns ns ns
korrelációs koefficiens (p érték)
0.379 (<0.001) 0.566 (<0.001) 0.496 (<0.001)
Mind a három vizsgált fehérje a sejtek szignifikánsan alacsonyabb százalékában expresszálódott a tumoros mintákban, mint a megfelelő normál kontrollokban. A ZO-1 fehérje mutatta a legnagyobb mértékű változást.
61
23. ábra ZO-1 (felső panel), occludin (középső panel) és E-cadherin (alsó panel) immunreakciók az NIBD, NEBD, NGB, IBDC, EBDC, GBC csoportokban. A képek a-c: a normál mintákat, d-f: karcinóma mintákat, a és d: intrahepatikus epeutat, b és e: extrahepatikus epeutat, c és f: az epehólyag mintát jelölik. Bar: 50 µm
62
A citokeratin-7 citoplazmatikus epeúti marker kifejeződését a normál és daganatos mintáinkban egyaránt megvizsgáltuk. Eredményeink alapján a citokeratin-7 erős expresszióját figyeltük meg a normál mintákban. Továbbá az expresszió csökkenését detektáltuk a közepesen és rosszul differenciált tumorok egy részében – az összes általunk vizsgált epeúti daganat csoportnál (IBDC, EBDC, GBC) találtunk ilyen eseteket. A kapott eredményeinket a 24. ábra szemlélteti.
24. ábra A citokeratin-7 immunhisztokémiai reakció eredménye. Az első képsor a normál szövetet, a 2-4 képsorok a G1-G2-G3 grádusú tumorokat mutatják a megfelelő normál minták oszlopában. A növekvő grade-del párhuzamos csökkenése a CK-7 markernek az epehólyagból nyert mintáknál a legszembetűnőbb. NIBD: normál intrahepatikus epeút, NEBD: normál extrahepatikus epeút, NGB: normál epehólyag, IBDC: intrahepatikus epeúti tumor, EBDC: extrahepatikus epeúti tumor, GBC: epehólyag tumor, G1: grade 1, G2: grade 2, G3: grade 3
63
IV.4. ZO-1, occludin és E-cadherin differenciál diagnosztikai szerepe az epeúti tumoroknál Sem a diszkriminancia analízis 25. ábra, sem a statisztikai értékelés nem tette lehetővé a tumor csoportok, ill. a normál csoportok egymástól történő elválasztását. Pusztán normál és daganatos mintahalmazt szemléltet a diszkriminancia analízis, ami arra enged következtetni, hogy e három fehérje nem specifikusan, e tumor csoportokra nem jellemző módon változik a daganatos átalakulás során. Továbbá egyértelmű, egymással párhuzamosan csökkenő expressziójuk a daganatokban a dedifferenciáció egy általánosabb folyamatában való részvételükre utalhat.
25. ábra A ZO-1, occludin, E-cadherin diszkriminancia analízisének eredménye. NIBD: normál intrahepatikus epeút, NEBD: normál extrahepatikus epeút, NGB: normál epehólyag, IBDC: intrahepatikus epeúti karcinóma, EBDC: extrahepatikus epeúti karcinóma, GBC: epehólyag karcinóma. A színes vonalak a csoportok „térbeni” átlagát, a csoport centrumát mutatják.
64
IV.5. ELISA módszer beállítása claudin-1 és -4 fehérjékre. Elsőként a claudin-1 ELISA beállítását kezdtük el. Kontroll mintákra lett volna szükségünk nagyobb mennyiségben, így az intézetünkbe érkezett CRC metasztázis mintákból immunhisztokémiai reakcióval kiválasztottuk, melyek fejezik ki a claudin-1 (és a későbbiek miatt a claudin-4) fehérjét legerősebben. Ezeknek a mintáknak a fehérjelizátumaira volt szükségünk a módszerbeállítások elkezdéséhez. Kiválasztottunk három mintát, amelyekkel később dolgoztunk. Első lépésként normál ELISA módszert használva az intézetben használatos claudin-1 specifikus PAB és megfelelő SAB antitestek különböző hígításainak hatását teszteltük a detektáláskor kapott jel erősségére. Minden hígítási verziónál a fehérjelizátumok azonos térfogatainak 10-szeres hígításaival vontuk be a plate felszínét. A mérések eredményei alapján újabb antitesteket próbáltunk ki, hogy a legerősebb jelet eredményező antitest párokat kiválaszthassuk. A mérések során azt tapasztaltuk, hogy a fehérjelizátumokban a detektálható claudin-1 fehérje mennyisége a felolvasztások során jelentősen csökken. Nehézséget okozott az is, hogy ekkor még nem volt kontroll fehérjénk, amihez viszonyítani
tudtuk
volna az
eredményeinket.
Így csak
relatív
mennyiségi
megállapításokat tehettünk. E problémák miatt a továbbiakban két szálon folyt a munka: megpróbáltunk fehérje expressziós rendszerrel claudin-1 fehérjét termeltetni (C-terminális 21 aa részt: citoplazmatikus lokalizációjú, és a legtöbb antitest felismerési helye itt található; ill. a teljes claudin-1 szekvenciát élesztő expressziós rendszerrel kifejeztetni), ill. kerestünk olyan sejtvonalakat, melyek claudin-1 és claudin-4 pozitívak, hogy ne legyen limitáló tényező a meglévő CRC áttétekből származó fehérjelizátumok mennyisége. A sejtvonalakon kifejeződő claudin fehérjék kimutatására immuncitokémiai- és Western blot eljárásokat alkalmaztunk. A citokémiai eljárásokhoz többféle fixálási módszert próbáltunk ki annak eldöntésére, hogy a claudin fehérjék kimutatására melyik a legalkalmasabb.
Eredményeink
szerint
a
metanol–acetonos
fixálás
legmegfelelőbb rögzítési módszer a két citokémiai jelöléshez. Immuncitokémia,
65
volt
a
fluoreszcens immuncitokémia és Western blot módszereket használva azt találtuk, hogy claudin-1 pozitívak a HuH7, PLC, HepG2, Hep3B, T47D, HT29, HeLa; valamint claudin-4 pozitívak a HepG2, T47D és HT29 sejtvonalak (26-30. ábra).
26. ábra T47D és HeLa sejtek claudin-1 fehérje expressziója immuncitokémiai eljárással detektálva. A képeken jól látható, hogy a reakció az önálló sejteknél sokkal inkább homogén, az egész sejt felszínén megjelenik, míg a kapcsolódó sejteknél – bal oldali képen – az érintkező felszínekre korlátozódik. (400x, ill. 600x nagyítás)
27. ábra HuH7, HepG2, sejtvonalakon a claudin-1 immunfluoreszcens jelölése. (200x, ill. 600x nagyítás)
66
fehérje
fluoreszcens
28. ábra T47D és PLC sejtvonalakon a claudin-1 fehérje fluoreszcens immuncitokémiai jelölése. (400x, ill. 200x nagyítás)
29. ábra T47D és HT29 sejtvonalakon a immuncitokémiai jelölése. (400x, ill. 200x nagyítás)
67
claudin-4
fehérje
fluoreszcens
30. ábra A HuH7, PLC, HepG2, Hep3B, T47D, HT29 sejtvonalak claudin-1 és claudin4 fehérje expressziója (a). Aktin kontroll expressziójának (b) kimutatása Western blottal. A sejtvonalak közül a T47D fehérje lizátumából kiindulva teszteltük, hogy milyen coat hígítást tudunk még detektálni (hány sejtnyi fehérje mennyiséget). Az eredményekből arra következtettünk, hogy csak a hátteret „látjuk”; a hígulás nem volt nyomon követhető. Szendvics ELISA módszerrel megprobáltuk kifogni a claudin-1 fehérjénket a sejtlizátumból. A detektálást fluoreszcens előhívásra módosítottuk, és a capture (coatoló), valamint a PAB/SAB antitestek megfelelő párosításaiból kiválasztottuk a legmagasabb emissziós értéket adó beállítást. Ennek felhasználásával hígítási görbét készítettünk az addigra megérkezett rekombináns kontroll fehérjével. A rekombináns fehérjét nem mi állítottuk el, hanem vásároltuk az Abnova cégtől. A hígítási görbénk nem lett elnyújtott görbe, ami azt eredményezte, hogy nem túl széles tartományban (0.3 ng-306 ng-ig kb.) lehet mérni vele a claudin-1 koncentráció változását (31. ábra). A legnagyobb hígítás, amit ki tudtunk mutatni sejtvonalból, 3.000 körüli sejtből származó claudin-1 fehérje mennyisége (13. táblázat).
68
31. ábra A claudin-1 fehérje hígítási görbéje a beállított fluoreszcens szendvics ELISA módszerrel. 13. táblázat A claudin-1 fehérje detektálási értékei különböző kontroll fehérje - és sejt (sejtből kétféle fehérje „kinyerési módszerrel”) mennyiség esetén. E: x1000; Em: emisszió Fehérje/sejt menny.
310 (ng)
76 (ng)
56 E HeLa
5.6 E HeLa
116 E 11.6 E 56 E 5.6 E 76 E HeLa HeLa T47D T47D T47D
7.6 E T47D
Em. 1 Em. 2
2607
6724
2497
1587
2022
1163
5264
2259
13161
1869
1044
2879
7126
2500
1608
2205
1151
5433
2271
7772
2090
1081
NK
A claudin-4 fehérjét detektáló ELISA beállításánál a már meglévő ismeretekre alapozva elsőként fluoreszcens normál ELISA módszert alkalmaztunk. Első feladatként a normál ELISA protokollt felhasználva elkészítettük a kontroll fehérje hígítási görbéjét (kék görbe, 32. ábra), majd a továbbiakban szendvics ELISA módszerrel, megkerestük a legjobb coat hígítási-, és antitest pár variáció beállítást (sárga görbe, 32. ábra). A hígításigörbe alapján a mintáinkban minimálisan 0.3 ng claudin-4-nek kell jelen lenni a fehérje kimutatásához. A minta mennyiségi mérése adott tartományban így lehetővé vált. Ellenőriznünk kellett azonban, hogy valóban a claudin-4 fehérjéket detektáljuk a mintáinkban. A meglévő CRC metasztázis - és biológiai kontrollként használt HCC
69
32. ábra A claudin-4 kontroll fehérje hígítási görbéi a különböző beállítások alkalmával. mintákból származó fehérjelizátumokat, valamint néhány vérmintát felhasználva vizsgáltuk a claudin-4 fehérje mennyiségét ELISA (v2) protokollt alkalmazva. Ezen eredményünket Western-blot módszerrel is alátámasztottuk (33. ábra).
33. ábra A claudin-4 fehérje kimutatása colorectal- (CRC) és hepatocellular (HCC) carcinoma minták fehérjelizátumaiból Western-blottal. A CRC minták az ábra bal oldalán claudin-4 expressziót mutatnak; a biológiai kontrollként használt HCC minták fehérje-lizátumai negatív reakciót adtak. CP: claudin-4 kontroll fehérje (48,73kDa – GST Tag-gel); L (létra): 16, 22, 36, 50, 64, 98 kDa (alulról felfelé).
70
A kapott eredmények megerősítették, hogy specifikus jeleket detektáltunk. (A filmen kapott jelek erőssége azonban nem korrelált – feltehetően a Western protokollból adódóan - az ELISÁ-nál tapasztalt fehérje mennyiségekkel.) Felmerült a továbbiakban az a kérdés, hogy vajon a claudin fehérje teljes mennyiségét sikerül-e kimutatnunk. Ennek vizsgálatára a szövetmintáinkból hígításokat készítve újabb méréseket végeztünk. A mérések során a minták hígulásával (2x, 5x, 10x) a fluoreszcens jel, mintától függő mértékben, jelentősen növekedett; míg a kontroll mintaként használt HCC a háttérnek megfelelő emissziós értékeket mutatott. A vérmintáknál a CRC mintákhoz hasonló emisszióváltozást tapasztaltunk. Az eredmények alapján arra következtettünk, hogy a coat-oláskor felvitt antitest mennyiség egy részéhez a plazma egyéb fehérjéi nem specifikusan kötődnek. Ez alapján megállapítottuk, hogy minden mintából több hígítást készítve, és a tapasztalt eredményeket összevetve lehet a számoláshoz felhasználható értékeket kiválasztani. A szövetből
nyert
fehérjemintákban
az
ismeretlen
antigén
koncentrációjának
megállapítása a továbbiakban interpolációs/extrapolációs módszerrel történt 34. ábra.
34. ábra A minták koncentrációjának megállapítása a kalibrációs/hígítási görbe alapján. Emisszió: a detektált jelek nagysága; Antigén mennyiség: tíz hatványaként ngban megadva; függőleges vonalak a görbe alatt: a minták számított koncentrációit mutatják
71
További kérdésként merül fel, hogy vajon a vérmintákból a claudin teljes mennyisége detektálható-e. A kérdés megválaszolására ismert mennyiségű kontrol claudin-4 fehérjét tettünk olyan vérminták megfelelő térfogataiba ( végső cc. 85ng/ml), melyek feltevéseink szerint nem tartalmazhattak jelentős mennyiségű claudin-4 fehérjét. A vérminták natív, citrátos és kálcium-EDTA-s csőbe lettek levéve, hogy egyben azt is megvizsgálhassuk, vajon a vér tárolási formája befolyásolja-e a mérési eredményeinket. Mindegyik vérvételi csőből 3 állt rendelkezésünkre: 1. az elsőbe a vér levételekor tettünk claudin-4 antigént, 2. a másodikba a centrifugálás után, a felülúszó levételét követően, a felülúszóba, 3. a harmadikba nem tettünk antigént, csak centrifugálást követően a felülúszót levéve, negatív kontrollnak használtuk fel. Az ELISA plate-re felvitt 50-50µl-nyi mintákból 4,25 ng-nyi antigénnek megfelelő emissziós értéket kellett volna mérnünk. Ezzel szemben a méréskor csak fele akkora, vagy kisebb értéket kaptunk. A különböző vérvételi csövekből nyert minták esetén az 1. –ből mindig magasabb értéket kaptunk, mint a 2-ból, a 3.-ban mindhárom esetben közel azonos emisszós értékeket detektáltunk. Az alacsonyabb értékek egyik oka lehet, hogy a vérmintákat hígítatlanul adtuk a plate-hez, így az egyéb fehérjék „árnyékoló” hatása jobban érvényesülhetett. Más felvetés szerint lehet, hogy csak a plazmaban szabadon, más fehérjéhez nem kötődő claudin mennyiségét mutattuk ki. A mintákba vitt kontroll fehérjék egy része ennek értelmében a plazma bizonyos alkotóival lépett reakcióba. A kapott eredmény alapján a bemért ismert mennyiségű antigén teljes mennyiségét egyik mintából sem tudtuk kimutatni. Arra a kérdésünkre tehát, hogy a vérmintákból a claudin fehérjék teljes mennyisége kimutatható-e (nem kötődik-e a fehérje a vér egyéb alkotóihoz, ill. a vérvételi módszerek milyen mértékben befolyásolják a claudin fehérje mennyiségi vizsgálatát) nem sikerült kielégítő választ kapnunk. Ezért a vérmintáknál további vizsgálatokra lenne szükség annak eldöntésére, vajon ki lehet-e mutatni a vérben lévő claudin-4 fehérje teljes mennyiségét.
72
V. MEGBESZÉLÉS A hámsejteket egymáshoz, ill. az extracelluláris mátrixhoz kapcsoló struktúrák szétszerelődését, átalakulását és megváltozását a daganatok kialakulása, fejlődése és progressziója során mára már jelentős mennyiségű cikk eredménye igazolja (Tsukita 1999, 2001; Cheung 2005; Higashi 2007). Míg a TJ plaque fehérjéiről tudjuk, hogy közvetlen szerepet játszanak a sejtek motilitásának szabályozásában az aktin citoszkeleton újrarendezése révén (GonzálezMariscal 2007), a TJ gerincét alkotó claudin fehérje-család konkrét szerepét kevéssé ismerjük. Ennek ellenére hasonló érdeklődésre tarthatnak számot, hiszen jelenlétükkel képesek módosítani az epithelium ion-áteresztőképességét, befolyásolva ezzel a kationok, és kisebb mértékben, az anionok átáramlását a sejtek közötti térben (Hartsock and Nelson 2007), valamint lehetővé teszik a plaque fehérjék kihorgonyzását is. A claudinok expresszió változása zavart okoz a sejtek polaritásában, módosítva ezáltal a lipid-raftok és a membrán fehérje-komponenseinek (receptorok, csatornák, stb.) eloszlását, elhelyezkedését. Az így megnövekedett jelfelfogó felszín megnövelheti az epithel sejtek érzékenységét a környezetükből származó hatásokkal szemben (Schneeberger és Lynch 2004, González-Mariscal 2007). A claudin fehérjecsalád tagjai specifikus expressziót mutatnak normál és patológiás elváltozást mutató szövetekben egyaránt (Swisshelm 2005; Hewitt 2006; ld. bevezetés fejezet), mely sajátságuk alapján akár terápiás célpontként, akár e betegségek kialakulásának, progressziójának markereként is funkcionálhatnak. Az AJ felépítésében szerepet játszó E-cadherin az epithel, valamint az endothel sejtek között Ca2+-ion jelenlétében adhéziós sejt-sejt kapcsolatot alakít ki. Családi öröklődést mutató vastagbél daganatoknál ismerték fel e komplex proliferációban játszott szerepét (Powell 1992; Sparks 1998; Lustig 2003). Az E-cadherin fehérje eltűnése a sejtmembránból, azt az információt küldi a sejtműködést irányító rendszernek a jelátviteli útvonalak révén, hogy megszűnt a kontaktus a környező sejtekkel.
73
A folyamat során a hozzá kapcsolódó β-catenin a citoplazmába, majd sejtmagba transzlokálódik - ahol egy fehérjekomplexben a DNS megfelelő régióihoz kötődik - és a sejtciklust szabályozó gének átíródását indukálja (Robert 2007). Így megfelelő alapot teremt a genetikai hibák felhalmozódásának és a korlátlan növekedésnek.
A claudin fehérjék vizsgálatakor kapott eredmények általános értékelése A vizsgálataim tárgyát képező, az epeút különböző szakaszairól származó szövettani mintákban (függetlenül attól, hogy normál, vagy daganatos szövetről volt szó) a claudin-1, -2, -3, -4, -7 fehérje expresszálódása esetén apikális, apikolaterális és bazolaterális membrán reakciót figyeltünk meg. A claudin-8, és -10 fehérje csak a sejtek apikális membrán régióban volt detektálható (tumoros mintáknál e két fehérje kiterjettebb expressziót mutatott). A claudin-2 citoplazmatikus, a claudin-2 és -3 esetenként bazális membrán reakciót is adott. A claudinok sejten belüli lokalizációja általában a közismert funkciójuknak megfelelően a sejtmembránra korlátozódik. Ezzel szemben a claudin-2 a legtöbb szakirodalmi említésben is citoplazmatikus reakciód adó fehérjeként van említve (Soini 2005a; Laurila 2007, stb.). Ennek oka még nem tisztázott, azonban más claudinok (mint claudin-1, -7, és -10) esetében is leírtak citoplazmatikus reakciót (Inai 2005; Comper 2009). A claudin-1 áthelyeződését a membránból a citoplazmába French és munkatársai a PKC/PKA által kontrolált foszforilációval magyarázzák daganatos mintákon, és kapcsolatba hozzák a sejt metasztázist kialakító képességével (French 2009). A fehérjeképződésben ismert szabályozást figyelembe véve, a citoplazmatikus megjelenés a fokozott expresszió következménye is lehet. Továbbá abban az esetben, ha a fehérje valamilyen okból nem tud a membránba kihelyeződni, vagy – esetleg mutációk miatt – lebomlani, a molekulák rezervoárjára is utalhat (Van Itallie 2004b).
A claudin fehérjék vizsgálatakor a normál mintákban kapott eredmények megvitatása Mindegyik normál minta csoport (NIBD, NEBD, NGB) kifejezte az általunk vizsgált claudinokat. Ez az immunprofil megegyezett a normál pancreas szövetre jellemző
74
mintázattal, ahol a claudin-1, -3, -4 közepesen erős reakciót, míg a claudin-2 és -7 gyenge expressziót mutatott (Hewitt 2006; Borka 2007; Comper 2009). A hasonlóság feltehetően a közös embrionális kialakulásra vezethető vissza. A normál epeút különböző szakaszain megfigyelt claudin expressziókat összehasonlítva a claudin-2, -3 és -4 esetén találtunk szignifikáns különbséget. Mindhárom fehérje erős expressziót mutatott az epehólyagban, ellentétben az intra- és extrahepatikus epeutakban megfigyelt reakcióval. A claudin-2, és 4 fehérjénél NGB-NEBD-NIBD irányban, a claudin-3 fehérjénél NGB-NIBD-NEBD irányban detektáltunk fehérje expresszió csökkenést. A claudin-1,- 7, -8 és -10 mindhárom szakasznál azonos, vagy közel azonos mértékben fejeződőtt ki. Lauriláék csoportja a normál epehólyag hámsejtjeinek claudin-1, -2, -3 és -4 expresszióját szintén kimutatta, azonban az általuk vizsgált mintákban a claudin-2 fehérje csak az epithel sejtek felében adott pozitív immunreakciót (Laurila 2007). A magasabb claudin-2 expresszió a TJ-nek nagyobb ionáteresztő képességet biztosít, másként fogalmazva csökken a hám ion visszatartó képessége (Amasheh 2002, KiuchiSaishin 2002). Ennek révén a megfigyelt magas claudin-2 expresszió az epehólyagban szerepet játszhat az epe végső koncentrációjának kialakításában, hasonló módon, mint ahogy ez a vesében történik, ahol részt vesz a proximális tubulus és a Henle-kacs leszálló ágában zajló reabszorpciós folyamatok létrehozásában (Kiuchi-Saishin 2002). Mind a claudin-3, mind a claudin-4 a hámszövetnek nagyobb rezisztenciát kölcsönöz az ionok áramlásával szemben (Koval 2009; Medigeshi 2009). A Henle-kacs leszálló ága a kationoknak nagyobb átjárhatóságot biztosító szakasz a vese elvezető rendszerében, így az ebben a régióban faj specifikusan expresszálódó claudin-3 és -4 feltehetően a permeabilitás szelektív csökkentéséért felelős (Günzel 2009). MDCK sejtekben a megemelkedett claudin-4 expresszió megnövelte a TER-t, aminek hátterében a Na-ion szelektív permeabilitásának csökkenése állt (Van Itallie 2001). A nyálmirigysejtvonalakban GFP kapcsolt claudin-4 fehérje túltermeltetése szintén növelte a hám két oldala közti elektromos ellenállást; valamint a Tetraodon halaknál megfigyelték az élőhely sókoncentráció-változásával együtt járó szignifikáns claudin-3 expresszió változását is, ahol az alacsonyabb fehérje exprsszió az áteresztőbb hámra volt jellemző
75
(Bagherie-Lachidan 2008, Michikawa 2008). Ezek alapján feltételezhető, hogy az epeút különböző szakaszain az általunk megfigyelt claudin-2, -3 és -4 fehérje expresszió változása az ionok áramlását a lumenből a környező szövetek felé NGB-(NEBD-NIBD) „irányban” egyre kevésbé teszi lehetővé, amivel magyarázható az epeutak említett szakaszainak alapvető működése. A claudin-1 fehérje a cikkek leírásai alapján a család többi tagjától jelentősen eltér, knock-out egér modellben a kísérleti állat kiszáradással járó halálát okozza (Furuse 2002). Ion-szelektivitását feltérképező cikk nem jelent meg, ellenben főként a daganatokkal kapcsolatban említett szerepe mellett más funkcióját is ismerjük: a mutáns génnel rendelkező személyeknél veleszületett szklerotizáló cholangitis szindrómát (NISCH) és ichthyosis klinikai tüneteit diagnosztizálták (Van Itallie 2004a; Hadj-Rabia 2004; Feldmeyer 2006). A claudin-7, -8 és -10 fehérjék elsősorban szintén ion szelektivitásuk révén ismertek a szakirodalomban. A claudin-7 jelenléte az epeutak hámjában feltehetően a Cl--ion retencióját eredményezi, mely a szerves anionok mellett az epe egyik fő szervetlen anion alkotója. A fehérje C-terminálisán elhelyezkedő 206-os szerin foszforilációjával szignifikánsan megemelkedik a hámon átjutó Cl--ionok mennyisége patkányvesében (Tatum 2007). Az epében legnagyobb mennyiségben előforduló kation a Na+-ion, melynek visszaszivárgását az epe utat határoló szövetekbe feltehetően a jelenlévő claudin-8 fehérje akadályozza meg, hasonló módon lezárva a sejtek közötti teret, mint ahogyan ez a vese aldoszteron-érzékeny disztális tubulusában és a distális colonban történik (Coleman 1987; Amasheh 2009). A claudin-10 normál epeúti hámsejteken mutatott lokalizációtól eltérő bazolaterális, ill. citoplazmatikus expressziót is megfigyeltek egér különböző szövetiben, melynek hátterében a szövetek eltérő ion permeabilitását feltételezik (Inai 2005). A fehérje claudin-8-hoz hasonló ion szelektivitását írta le Van Itallie; ennek értelmében valószínűleg a „b” típusú splice variáns található meg az epeutakban, ahol elsősorban a kationok szelektív átjutását teszi lehetővé a hámrétegen (Van Itallie 2006).
76
A claudin fehérjék vizsgálatakor a normál- és tumoros mintákban kapott eredmények összevetésének megvitatása Összehasonlítva a normál és daganatos szövetek immunhisztokémiai vizsgálatával kapott eredményeinket, az epeúti- és epehólyag karcinómák claudin mintázata jelentősen különbözik a normál szövetétől, melyből kialakulnak. A claudin-1, -3, -7, -8 és -10 immunhisztokémiai reakciók intenzitása és/vagy pozitivitása szignifikánsan csökkent (néhány esetben nem változott) a legtöbb karcinómában a megfelelő normál szövethez viszonyítva. A claudin-2 csak az epehólyag karcinómában csökkent szignifikánsan, ha normál kontroll csoportjával hasonlítottuk össze. A claudin-4 expressziójának szignifikáns növekedése a megfelelő normál szövetével összevetve pedig csak az extrahepatikus epeúti karcinóma mintáknál volt megfigyelhető. A fenti eredmények mellett a claudin-1, -4, -8 és -10 aberráns bazális lokalizációját figyeltük meg; főként a glanduláris szerkezetű tumoroknál fordult elő. Az TJ komponensek abnormális elhelyezkedését okozhatja egyszerűen a sejtpolaritás zavara, de jelezheti a karcinogenezis során a sejtek átalakulásának egy fontos lépését is. A daganatok kialakulása, és terjedése a sejtek megnövekedett motilitását, a membrán kapcsolatok fellazulását, az adhéziós fehérjék csökkenését, degradálódását eredményezi a legtöbb tanulmány megfigyelései szerint. Bizonyos tumorok esetében, ill. a daganatfejlődés bizonyos stádiumában azonban e molekulák expressziója éppen ellenkezőleg is változhat, mennyiségük jelentősen emelkedhet a sejtben. Így invazív emlő karcinómánál, valamint tüdő karcinómánál a claudin-1 csökkent expresszióját írták le, míg a fehérje fokozott expressziója jellemzi a colorectalis rákok, papilláris pajzsmirigy daganatok, ill. a cervix karcinóma mintákat (Lee 2005; Sobel 2005; Tőkés 2005; Oliveria 2005; Kinugasa 2007; Chao 2009; Németh 2009). A tüdő adenokarcinómájában a claudin-1 expresszió túltermelődése (melyet fehérje és mRNS szinten egyaránt igazoltak) gátolja a daganatsejtek disszociációját, vagyis a sejtek migrációját, invázióját, metasztázis képzését, így a cikk a fehérje speciális tumorszupresszor szerepére hívja fel a figyelmet (Dhawan 2005; Chao 2009). Ezt a szerepet támasztja alá továbbá, hogy a cervix premalignus elváltozásaiban (cervical intarepithelial neoplasia - CIN) szignifikánsan magasabb expressziót detektáltak, mint cervix karcinómákban (Sobel 2005). A magasabb claudin-1 expresszió pozitív szerepet
77
játszik a túlélésében tüdő adenokarcinómás betegeknél, más esetekben azonban, ahol emelkedett expressziója figyelhető meg a tumorban, vagy az általa termelt váladékban, mint az ovárium karcinómáknál is, éppen ellenkezően, rövidebb túléléssel jár együtt (Kleinberg 2008; Chao 2009). Ettől eltérő összefüggést találtak a vese tumoraiban. Clear cell carcinoma minták nagyobb százalékban negatív claudin-1 immunreakciót mutatnak, míg a papillary renal cell carcinoma esetek 75-80%-ában pozitív az immunreakció. A páciensek túlélése ellentétesen változik a két daganat-típusban: így clear cell carcinomában a claudin-1 pozitív, papillary renal cell carcinomában a negatív reakció
jár
kedvezőtlenebb
következményekkel
(Fritzsche
2008).
Prosztata
adenokarcinómáknál pozitív korrelációt találtak a csökkent claudin-1 expresszió és a magasabb grade között; emellett többváltozós analízist alkalmazva a betegségkiújulás faktorának, független prognosztikus faktornak is bizonyult (Sheehan 2007). Usami és munkatársai nyelőcső laphámkarcinómáját vizsgálva hasonló megállapításokat tesznek; a claudin-1 csökkent termelődése növeli az előfordulását a nyirok-, és vénás ér daganatos inváziójának és a nyirokcsomó metasztázisok kialakulásának. Az előbb említett fehérje expresszió csökkenése a nyelőcső karcinóma sejtvonalakban együtt járt az epithel sejtek mesenchyma-szerű átalakulásával (Usami 2008). Az EMT-ben más szerző is fontos szerepet tulajdonít a claudin-1 fehérjének. A CIIA anti-apoptotikus fehérje HeLa sejtekben növeli az inváziós, és migrációs képességet. RNS interferenciával gátolva a CIIA hatását, a gátlás kivédhetőnek bizonyult claudin-1 specifikus siRNS-sel, vagyis a sejtek a kezelést követően visszanyerték jellemző migrációs fenotípusukat (Han 2009). Ezek alapján az irodalmi adatok alapján az általunk tapasztalt claudin-1 fehérje expresszió csökkenés az epeúti- és epehólyag karcinómák kialakulásának hátterében meghúzódó molekuláris változások egyik aspektusát támaszthatja alá, amit az általunk megfigyelt hám marker (CK) kifejeződésének párhuzamos csökkenése a daganatok differenciáltsági fokával tovább érősíthet. Vizsgálatainkban a claudin-1 kifejeződése nem volt hatással a túlélésre. Továbbá a kisszámú grade 1 csoportba tartozó eset miatt statisztikával alátámasztott prognosztikai megállapításokat sem tehettünk, de a fehérje mennyisége és a tumorok differenciáltsági fokának csökkenése között megfigyelhető összefüggést az elvégzett immunhisztokémiai reakciók éredményei jól szemléltetik.
78
A claudin-7 fehérje csökkenését más, nem epeúti premalignus és malignus elváltozásokban is leítrák. Expressziója csökken ulcerative colitisben (UC), ductális emlőkarcinómában és prosztata adenokarcinómákban, ez utóbbiaknál csökkenése korrelációt mutat a magasabb hisztológiai grade-del is (Kominsky 2003; Park 2007a; Sheehan
2007;
Oshima
2008a).
Hasonlóan
a
nyelőcső
elszarusodó
laphámkarcinómájához, a CRC vénás inváziója, és metasztázis képzésre való hajlandósága korrelációt mutat a claudin-7 csökkent expressziójával (Usami 2006; Khun 2007; Oshima 2008b). A fehérje kifejeződése a cervix-, nyelőcső-, valamint gyomor hámszövetében, és a megfelelő diszplaziás és neoplasztikus elváltozásokban is, hasonló képet mutat, mint a claudin-1 cervixben megfigyelt változása. A kisebb fokú dysplasiák, valamint a Barett-oesophagus minták szignifikánsan több claudin-7 fehérjét termelnek, mint az adenokarcinóma, ill. normál mintáknál tapasztalt mennyiségek (Sobel 2005; Montgomery 2006). Az intesztinális típusú gyomorrák, valamint az epithelial ovarian carcinoma (EOC) minták midegyik fő hisztológiai típusa túltermeli e fehérjét, és a képződő ascitesben megnövekedett mennyisége is kimutatható (Park 2007b; Tassi 2008). A claudin-7 így az epeúti- és epehólyag karcinómák kialakulásában mai ismereteink szerint feltehetően a claudin-1 szerepéhez hasonló feladatokat tölthet be: a tumorszuppressziót, és a már kialakult patológiai elváltozás progresszióját befolyásolhatja. A claudin-8 vesében, a claudin-10 vesében és pancreásban csökkent expressziót mutat a daganatos elváltozásban a megfelelő normál szövethez viszonyítva (Morin 2005; Hewitt 2006). Papilláris pajzsmirigy karcinómában azonban a claudin-10 mRNS túltermelődése figyelhető meg (Aldred 2004). Microarray és quantitative RT-PCR adatok szerint e gén transzkripciós termékének overexpressziója a HCC kiújulásának hasznos molekuláris markere is lehet (Cheung 2005). Az általunk az epeúti tumorokban tapasztalt claudin-8 és -10 fehérje expressziós változások ezek alapján elsősorban arra utalnak, hogy a daganatos elváltozásban az epe kation összetétele jelentősen megváltozik, bár ez a daganatok viszonylag gyors progressziója miatt nem jár olyan klinikai tünettel, ami a korábbi felismerést tenné lehetővé. Bár hasonló adatok nem állnak rendelkezésünkre az epeúti traktusban, Hewitt génexpressziós vizsgálata számos claudin, köztük a claudin-2 mRNS
79
downregulációjáról számol be normál szövettel összevetve több tumorban, mint például a gyomor, vese, máj; ill. pancreas daganatokban (Hewitt 2006). Prosztata adenokarcinómákban fehérje és mRNS szinten is csökkent mennyiségét mutatták ki a nem neoplasztikus kontrollhoz viszonyítva, melynek hátterében a csökkent szintézis mellett a fehérje megváltozott metabolizmusát, ill. megváltozott módosítási folyamatait feltételezik a karcinogenezis során (Väre 2008). Lauriláék csoportja az acute calculous cholecystitis (ACC) mintákban magasabb claudin-2 expressziót találtak, mint a normál epehólyag kontrollokban (Laurila 2007). Aktív UC mintákban is, normál rectum biopsziákhoz hasonlítva, up-regulált claudin-2 fehérje- és mRNS expresszióról számolnak be (Oshima 2008a). Soini és munkatársai megfigyelései szerint az epidermális tumorokban nem a sejtekre jellemző claudin-2 (valamint claudin-3, -4, és 5) fenotípus megváltozása szükséges ahhoz, hogy invazívabb sajátságokkal bírjon a kialakult daganat (Soini 2005b). Eredményeink az epehólyag- és epeúti karcinóma mintákban arra mutatnak, hogy a karcinogenezis során bekövetkező változások a claudin-2 expressziót az epehólyaghámban sokkal jobban befolyásolják, mint az intraés extrahepatikus epeutakban, másként fogalmazva, eltérő folyamatok dominanciájával alakuk ki a tumor a különböző molekuláris hátterű (és -környezetű) sejtekben. Természetesen, mint ez ismert a szakirodalomból is, a sejtek korlátlan szaporodását és a hibás génműködést a genetikai- és környezeti tényezők széles skálája hozhatja létre. Amikor azonban génexpressziós változásokat hasonlítunk össze a különböző szövetekben, szervekben, ezt azért tehetjük, mert feltételezünk egy olyan „általánosabb” (az élő szervezet kisebb vagy nagyobb rendszereiben azonos elven működő) mechanizmust,
amely megmagyarázza a
sejtekben,
szövetekben
bekövetkező
változásokat a karcinogenezis során, és amelynek sajátságait épp ezek alapján a kísérleti eredmények alapján próbáljuk feltérképezi. Könnyen megeshet azonban, hogy sem a módszereink, sem a feltételezésünk nem állja meg a helyét ezeknek a kérdéseknek a megválaszolására; bár jelenleg kétségkívül ezek, ill. hasonló metodikák állnak rendelkezésünkre. A claudin-3 és a claudin-4 fehérje erős expresszióját írták le a prosztata adenokarcinómákban, ahol az immunreakció erőssége a Gleason-féle beosztással mutatott összefüggést: a magasabb grade-ű csoportokban a claudinok alacsonyabb
80
expresszióját detektálták, az alacsonyabb grade pedig a fehérjék erősebb termelődésével járt együtt (Väre 2008). Seehan és munkatársai e fehérjék expressziója és a prosztata tumorok stádiumai, valamint a betegség kiújulása között találtak szignifikáns összefüggést (Seehan 2007). Clear cell renal cell carcinoma mintákban az erősebb clauin-3 és -4 kifejeződés rosszabb túlélési esélyekkel társult (Lechpammer 2008). Colorectal carcinoma minták szintén szignifikánsan nagyobb mértékben expresszálják e két fehérjét (Mees 2009). ACC mintákon azonban a claudin-3, és -4 alacsonyabb mértékben fejeződött ki, mint az AAC és a normál epehólyag mintáiban (Laurila 2007). A tüdő laphám-, és mirigyhám karcinómájában is mindkét fehérje mennyisége szignifikánsan lecsökkent, míg kolorektális karcinóma májáttétei esetén magasabb mRNS expressziót tapasztalták a normál kontrollhoz viszonyítva (Paschoud 2007; Oshima 2008b). UC mintákban a claudin-3 fehérje expressziós szintje a normál szövetben mért értékekhez hasonlítva nem változott, míg a claudin-4 fehérje mennyisége csökkent (Oshima 2008a). Az exocrine pankreász ductális hámjából kiinduló daganatokban a claudin-4 expresszió nem változott jelentősen szemben a claudin-3 fehérjével, ahol negatív immunreakciót figyeltek meg (Borka 2007). Bár Lódi és munkatársai az epeút különböző szakaszainak vizsgálatakor nem az egyes szakaszok claudin-4 expressziójának összahasonlítását tűzték ki célul, munkájukban a normál epeúthoz képest szintén erősebb expressziót figyeltek meg a neoplasztikus szövetekben (Lódi 2006). Az általunk tapasztalt eredmények így az irodalmi adatokkal részben egyezést mutatnak, másrészt a kapott eredményeket nem könnyű magyarázni. A pankreász, kialakulását tekintve az epeutakkal közös progenitor sejtekből alakul ki, mely a normál szövetek claudin mintázatánál megfelelő alapot adott a hasonló fehérje expressziók értelmezésére. A daganatoknál azonban a claudin-3 csökkenését a hámban, és a claudin-4 enyhe csökkenését a GBC csoportban, ill. szignifikánsan magasabb expresszióját az EBDC csoportban a normál szövettel összehasonlítva feltehetően nem lehet pusztán a dagantos folyamat során létrejövő nem szabályozott expressziók következményének tekinteni. Bár a vizsgálatunk eredményei nem teszik lehetővé (célunk nem is ez volt), hogy következtetéseket vonjunk le arra vonatkozóan, hogy miért növekszik a claudin-4 expressziója az extrahepatikus epeúti tumorban, és miért csökken (bár nem jelentősen) az epeút másik két szakaszából kiinduló tumorokban a
81
kontroll szövetekhez képest, a claudin-3 expessziós változása a diagnosztikában, valamint a claudin-4 magas expressziójának ismerete esetleges terápiás célpontként történő felhasználásában lehet hasznos a későbbiekben.
A claudin fehérjék vizsgálatakor a tumoros mintákban kapott eredmények megvitatása Összevetve a karcinóma csoportok fehérje expresszióit egymással azt a megállapítást tehetjük, hogy mind a három epeúti tumor szakasznak van a másik kettő csoporthoz viszonyítva erősebb expressziót mutató, csak rá jellemző claudin típusa. A claudin-1 és -10 erős immunreakcióját figyelhettük meg IBDC-ben az EBDC, ill. GBC csoportokhoz képest. A claudin-2 erősebb immunreakciót ad a GBC-ben, mint az IBDC és EBDC csoportban. A claudin-4 intenzitása az EBDC-ben volt a legerősebb. A claudin-1 tumor típusokat elkülönítő szerepéről több szerző is beszámol. A pancreas ductalis és endocrin tumora (Borka 2007), a human hepatoblastoma fetalis és embrionális komponense (Halász 2006), az endometrioid és a serous papilláris endometrium adenocarcinomája (Sobel 2006), továbbá a medulláris és rosszul differenciált karcinóma szemben a pajzsmirigy papilláris és folliculáris karcinómájával (Tzelepi 2008) eltérő mértékben expresszálja e fehérjét. Differenciál diagnózisban játszott szerepét a tüdő daganatok esetében a tüdő adenokarcinómában, valamint a tüdő laphámkarcinómában talált claudin-1 fehérje expresszió különbségre alapozzák. Az előbbi negatív, míg az utóbbi pozitív immunhisztokémiai reakciót eredményez, ami az daganat eltérő fejlődésre és -progressziójára is utalhat (Moldvay 2007; Paschoud 2007; Choi 2009). A claudin-2, -3 és -4 immunhisztokémiai reakciók eredménye alapján szintén jól elkülöníthetők a pancreas tumor-típusai (Borka 2007). A claudin-3 és -4 fehérje expressziója a ritka és rossz prognózisú endometrium daganat, az uterine serous papillay carcinoma (USPC), valamint az endometrium clear cell carcinoma típusában is szignifikánsan magasabb, mint az előbbi szövettani típusoknál jobb prognózisú endometrioid carcinomában (Konecny 2008). A fehérjecsaládba tartozó claudin-4 Lódi és mtsai kutatásai szerint alkalmas az epeúti tumorok HCC-től való egyértelmű elkülönítésére, mivel 100%-ban pozitív immunreakciót ad a normál epeúton, és - még erőteljesebb expressziót – epeúti tumoros mintákon, szemben a 100%-ban negatív HCC-vel (Lódi 2006). Bár többek között oncocytoma és chromophobe renal cell
82
carcinoma esetén a claudin-7 differenciál diagnosztikai markerként használható, az epeúti tumor csoportjaink között mi nem találtunk különbséget a fehérje expressziókban (Osunkoya 2009). A tumor-specifikus claudin expressziós mintázat az epeúti tumorok esetében is segítheti azonban a differenciáldiagnózist. A claudin-3 immunreakció az epeút vizsgált szakaszain eredményeink alapján az esetek nagyobb részében pozitív reakciót ad: az EBDC esetek 100%-ban, az IBDC minták közel 50%-ban, a GBC estek nagyobb, mint 60%-ban pozitív, szemben a negatív ductalis pancreas adenocarcinomákkal (Borka 2007). Az epehólyag karcinómát vizsgálataink alapján a cholangiocarcinomáktól a claudin-2 immunreakció intenzitása és pozitivitása alapján tudtuk elkülöníteni. Közepes vagy erős claudin-2 reakciót tapasztaltunk a sejtek nagyobb, mint 25%-ában; szemben a gyenge vagy negatív claudin-2 expresszióval a sejtek kisebb, mint 25%-án. Ezek alapján a vizsgálati paraméterek
alapján mintáinkat
85%-os specificitással
és 72%-os
érzékenységgel két csoportra lehetett osztani: GBC és közös IBDC+EBDC csoportra. A claudin-4 fehérje kifejeződését alapul véve: az erős claudin-4 expressziót mutató EBDC esetek 91%-os szenzitivitás és 80%-os specificitás mellett elkülöníthetők a közepes, gyenge, ill. negatív fehérje expressziót mutató IBDC esetektől. A diszkriminancia analízisben, ahol az immunreakciók mindkét általunk használt értékelési adatát felhasználtuk, az általunk vizsgált hat minta csoport: normál intrahepatikus epeút, normál extrahepatikus epeút, normál epehólyag, intrahepatikus epeúti karcinóma, extrahepatikus epeúti karcinóma, epehólyag karcinóma, jól elkülöníthető egymástól, ami az adott csoportokra specifikus expressziót feltételez. Ez az eredmény bár a mostani diagnosztikai gyakorlat számára kevéssé használható – mert sem az időbeni, sem a finanszírozási keretek nem teszik lehetővé, hogy minden mintán 6-7-féle claudin immunreakció készüljön a diagnosztikus vizsgálatokhoz -, azonban az elvi háttere adott annak a klasszifikációs algoritmusnak, mellyel a mintákat az immunreakciónál kapott eredményeik alapján a hat csoport valamelyikébe be lehessen sorolni.
83
A ZO-1, occludin ás E-cadherin fehérjék vizsgálatakor kapott eredmények megvitatása Az AJ szerkezetének változásait, valamint a változással járó folyamatokat a daganatok kialakulásában és terjedésében sokkal több cikk tűzte ki céljául napjainkig, mint a TJ vizsgálatát. Ennek megfelelően jóval nagyobb irodalom áll rendelkezésünkre. Jelen dolgozatban főként az elmúlt évek eredményeinek tükrében tárgyalom a vizsgálatunk során tett megfigyeléseinket. Az E-cadherin normál és tumoros mintáinkban is a membrán apikális és laterális felszínein expresszálódott – tumoros minták esetén bazális membrán lokalizációt is mutatott. Ezzel szemben a ZO-1 és occludin fehérjék mind normál, mind a tumoros mintákon apikális reakciót adtak. Epeúti mintákban Laurila munkacsoportja szintén vizsgálta az E-cadherin, ZO-1, és occludin fehérjék expresszióját. Az E-cadherin és ZO-1 fehérjék lokalizációja a normál epehólyag mintákban az általuk megfigyelt eredményekkel megegyeznek, különbség, hogy a mintáikban az E-cadherin citoplazmatikus reakciót is adott. Az occludin esetében is megfigyeltek citoplazmatikus festődést, amit mi nem tapasztaltunk egyik mintacsoportunkban sem (Laurila2007). A normál mintákat a daganatos szövetekkel összehasonlítva a fehérje expressziók tekintetében az epeút mindhárom szakaszánál jelentős csökkenést tapasztaltunk. Az immunreakciók intenzitása csak kevéssé változott, de a sejtek szignifikánsan kisebb százaléka adott pozitív reakciót a vizsgált szövettani mintákon. A legnagyobb mértékű csökkenést a ZO-1 fehérje expresszió változásában tapasztaltuk. Cirrhosissal asszociált HCC minták szignifikánsan kevesebb E-cadherint expresszálnak, mint cirrhosis nélküli, kevésbé agresszív viselkedésű HCC mintacsoprtok, ill. a normál minták (Tretiakova 2009). Prosztata rákok esetén e fehérje csökkent expressziója összefüggést mutatott a magasabb Gleason grade-del (Contreras 2009). Esophagus laphámsejtes karcinómájában (ESCC) ez az adhéziós molekula szignifikánsan alacsonyabb mértékben fejeződött ki, mint a kontroll mintákban. Emellett a tumorok differenciáltsági fokának csökkenésével párhuzamosan csökkent a fehérje mennyisége is a daganatos sejtekben (Peng 2009). A primer invazív emlő karcinómában szenvedő betegek tumoros szöveteiben vizsgálva az E-cadherin fehérje mennyiségét, Park és
84
munkatársai korrelációt találtak a fehérje csökkent mennyisége, és a betegek rövidebb túlélési esélye, valamint a daganatos sejtek megnövekedett metasztázisképző sajátsága között (Park 2007a). Az általunk az epeúti rákokban tapasztalt csökkent E-cadherin expresszió (párhuzamosan az epithel marker csökkenésével) feltételezhetően az epeúti rákoknál is szerepet játszik a daganatok invazivitásának kialakításában, és a betegek túlélését is hátrányosan befolyásolja. Ohtani és munkatársai az TJ fehérje occludin és ZO-1 szignifikáns csökkenését írták le gyomor adenokarcinómákban (Ohtani 2009). A ZO-1 szignifikánsan alacsonyabb expresszióját találták mRNS és fehérje szinten is irritábilis bél-szindrómában (IBS), csökkenése a hám megnövekedett ion-áteresztőképességével járt együtt (Piche 2009). Kleef és munkatársai pancreas ductal carcinoma esetekben a ZO-1 emelkedett mRNS exprsszóját figyelték meg (Kleef 2001). Eredményeik alapján a von Hippel-Lindau (VHL) tumor szuppresszor gén loss of function mutációja előidézi az EMT átalakulás során megfigyelt molekuláris változásokat. Clear cell renal cell karconóma sejtvonalakban in vitro, és sporadikus előfordulása esetén in vivo, csökkent E-cadherin és occludin fehérje expresszióval jár e génműködés kiesése. Az E-cadherin kifejeződésének indukálásával Harten és csoportja azt találta, hogy ez a változás csak az AJ komplex fehérjeszerkezetét és működését állította helyre – a TJ összeszerelődésére, és működésére nem volt hatással (Harten 2009). A normál endometrium mirigyhámszövete, az endometrium hyperplasia, továbbá az endometrioid karcinóma grade 1 tumora teljes mértékben pozitív, apikális occludin immunreakciót mutatott. Nem úgy a high grade endometrioid tumorok, ahol a fehérje expressziója a differenciálság fokával paralell változott. A csökkent fehérje expresszió a fenti eredmények mellett korrelációt mutatott a tumorok myometriumba történő invázójával, ill. metasztatizáló képességével (Tobioka 2004). Az irodalmi adatok szerint azokban a tumorokban, ahol főként az Ecadherin (de esetenként az occludin, ill. ZO-1) csökkenését tapasztalták a betegek túlélése rosszabb volt, így feltételezhető, hogy az E-cadherin szignifikáns csökkenése (mint ezt az EMT-vel foglalkozó cikkek zöme is említi) a dagantfejlődés során a migrációs fenotípus kialakulásában elengedhetetlen lépés. Így az epeúti rákoknál tapasztalt jelentős mértékű expresszió csökkenés magyarázhatja e tumorok gyors progresszióját, és a betegek kedvezőtlen gyógyulási esélyeit.
85
A daganat-csoportok fehérje expressziói között szignifikáns különbséget nem találtunk egyik vizsgált fehérje mennyiségében sem. Lauriláék AAC és ACC mintákat összehasonlítva egymással (valamint normál epehólyaggal) a fehérjék mennyiségében nem találtak szignifikáns különbséget a csoportok között, ahogy mi sem találtunk különbséget e három fehérje tekintetében az általunk vizsgált epeúti szakaszokból eredő adenokarcinómákban (Laurila 2007). Ez talán arra enged következtetni, hogy eltérően a claudin fehérjéktől ez a három fehérje sokkal inkább a karcinogenezist általánosan jellemző folyamatokhoz tartozik, mely események a daganatos átalakulások mindegyikében, ill. nagy részében megfigyelhető; vagyis nem a szövet/sejt-típus specifikus változásairól közvetít számunkra információt. A diszkriminancia analízissel kapott eredményünk alátámasztja a fent említett feltételezést, hiszen ezek a változások nem teszik lehetővé, hogy az epeúti tumor (és normál epeutak) különböző szakaszait megkülönböztethessük egymástól.
A sejtkapcsoló struktúrák szerkezetét befolyásoló, az életmóddal összefüggő hatások megvitatása Végül, bár nem utolsó sorban – hiszen elsőként a daganatok kialakulásának megelőzése a cél - a daganatok kialakulásában fontos környezeti faktorok, életmódbeli sajátságok néhány hatását szeretném megemlíteni. A sejtkapcsoló struktúrák, főként a claudinok hasításán, ill. kifejeződésének szabályozásán keresztül e folyamatok hozzájárulhatnak a karcinogenezis iniciációs- és promóciós lépéseihez. Az aspirin hatását vizsgálva Oshima és munkatársai azt találták, hogy 5 mM aspirin hatására a cludin-7 fehérje mennyisége lecsökken a TER megnövekedése mellett a sejteken, míg a claudin-3, -4, ZO-1 és occludin mennyisége nem változik. A hatás kiváltásában
szerepe
lehet
a p38
MAPK
útvonalnak,
mely aktiválódik
a
gyógyszeradagolás hatására (Oshima 2008c). Telítetlen zsírsavak (linolénsav) a TJ funkcióját, és a paracelluláris Ca transzportot segítik elő; mely folyamat során a humán Caco-2 sejtvonalakban a ZO-1, occludin és claudin-4 upregulációja mellett a claudin-1 down regulációja volt tapasztalható, míg a claudin-2, -3, JAM, ZO-2, és -3 mennyisége nem változott (Murphy 2006). A retinsav (RA) az epithel sejtek differenciációjához szükséges supplement. A-vitamin hiányában a bélhámszövet kialakulása, regenerációja
86
károsodást szenved. Caco-2 sejteket kezelve all-trans-RA-val a TER növekedését, valamint a TJ asszociált fehérjék: occludin, ZO-1, claudin-1, -3, és -4 enyhe mRNS expresszió növekedése mellett, a claudin-2 erőteljes upregulációját figyelték meg, mely ismerten szerepet játszik a paracelluláris iontranszportban (Baltes 2004). A D3 vitamin a colorectális carcinoma sejtvonalak differnciációját (mozgékonyságának csökkenését és osztódóképességének hiányát vagy lassabb osztódását) idézi elő az E-cadherin és ZO-1 fehérje expresszió növelésével a β-catetnin szignál gátlásával, valamint a ZO-1 sejtmagból a citoplazma membránba történő áthelyezésével (Palmer 2001, GonzalezMariscal 2003). A West Nile Virus (WNV) számos sejttípust képes megfertőzni, így többek között a bőr, vese, bél epithel sejtjeit. Infekciója együtt jár a claudin-1, -2, -3, és -4 csökkent expressziójával és csökkent TER kialakulásával (Medigeshi 2009). A gasztrointesztinális traktus képezi az első támadási felületet a táplálékkal együtt a szervezetünkbe jutó toxikus ágensekkel szemben. A deoxynivalenol (DON) egy gombatoxin, ami a gabonafélék szokásos fertőzése, és különböző mérgezési tüneteket produkál. Több faj intesztinális epithel sejtjeiből létrehozott sejtvonalon vizsgálva e toxin hatását, azt tapasztalták, hogy a claudinok csökkenését, a TER csökkenését és a paracelluláris transzport növekedését egyaránt kiváltotta. Ennek ismeretében nem csodálható, ha a DON-nal szennyezett táplálék számos humán és állati betegség kiindulóforrása lehet (Pinton 2009). A házi por atka ürülékében lévő cisztein proteináz allergén Derp1 képes a TJ fehérjék hasítására, így létrehozva a hámsérülést, melyen keresztül az allergén a légutak antigén-prezentáló dendritikus sejtjeivel találkozhat. A környezeti proteázok által történő „kinyitása” a TJ –nek lehetővé teszi, hogy a környezetből más allergének is átjuthassanak a szervezetet védő hámon, ami az allergiás reakciók kezdeti, előérzékenyítő lépésihez, majd a későbbiekben allergiához, pl. asthma kialakulásához vezethet (Wan 1999).
Az ELISA beállítás során nyert eredmények, tapasztalatok megbeszélése Az ELISA módszer gyors, érzékeny, kvantitatív fehérje-koncentrációmérésre alkalmas módszer (Clark 1977). Felhasználhatósága a kutatási projectekben és orvosi diagnosztikában is a beállítás specificitásának mértékétől és szenzitivitásától függ. Bármely oldatban lévő fehérje kimutatására alkalmas lehet, így vérből, és más
87
testfolyadékból is lehetőség nyílik e módszer felhasználásával fehérjék relatív és abszolút mennyiségének a meghatározására (Iannetta 1993; Khan 1998; Schmidt 2002). Amennyiben a specificitás és szenzitivitás, valamint a megismételhetőség megfelelő értékeket ér el, kalibrációs görbe létrehozásával a vizsgálni kívánt fehérjék mennyisége meghatározható. Matematikai számítások segítségével a kapott görbe mérési tartományán belüli fehérje mennyiségek – kedvező esetben a tartományon kívüli is – megállapíthatóak, és az eredmények grafikus ábrázolásával mindenki számára szemléltethetőek lesznek. Az orvosi diagnosztikában mára már számos fehérje mennyiségi változása markerként funkcionál
egy
betegség
meglétének,
lefolyásának
és
gyógyíthatóságának
megállapításánál (Rullier 2000; Orbán 2008). Diagnosztikai szempontból nem hagyható figyelmen kívül, hogy a mintavétel milyen mértékben terheli meg a páciens, ill. beteg szervezetét, esetlegesen milyen későbbi szövődményekkel járhat. A diagnózis felállításának folyamatában döntő jelentőségű, hogy mennyire idő és/vagy költség igényes a használt módszer, így mennyire teszi lehetővé szükség esetén a gyors értékelést a megfelelő beavatkozás, kezelés, ill. terápia megkezdése érdekében. A claudinok markeként történő felhasználását több tanulmány eredménye is alátámasztja, azonban expressziójuk mértékének és különbségeinek meghatározását a cikkek zöme IHC, PCR alapú vagy high-throughput módszerek segítségével végzi (Soini 2005a, 2006a, 2006b; Swisshelm 2005; Lódi 2006; Borka 2007). A claudinok kifejeződésének szabályozása még kevéssé ismert, így jelenleg e gének fehérje termékeinek detektálása adhat közelebbi támpontot annak eldöntésére, vajon érvényre jut-e e fehérjéknek tulajdonított fenotípusos sajátság, vagy sem. Kleinberg 2008-as cikke számol be a claudin-3 és -4 megnövekedett mennyiségéről szerózus váladékokban, ill. ismert az ovárium karcinómák ascites képző tulajdonsága (Elq 1997; Kleinberg 2008; Wu 2008). Ezen túlmenően a daganatok terjedése, szétesése is feltételezi a claudin fehérjék érpályába kerülését – természetesen, nem feltétlen nagy mennyiségben. Mind az ascites, mind a szerózus váladékok, vagy a vér mintaként történő felhasználása claudint túltermelő betegségek esetén, segíthetné e betegségek diagnosztizálását.
88
Az ELISA beállítás során mind a claudin-1, mind a claudin-4 fehérjét kimutató módszer esetén az antigéneket specifikusan detektáló rendszert hoztunk létre. Az módszer két aspektusának beállítását végeztük: a módszer specificitását, ill. a kimutatandó fehérje minimális koncentrációját (érzékenység) teszteltük a beállított módszernél. A
módszer
specificitását
kétféle
módon
bizonyítottuk:
szövetből
nyert
fehérjelizátumaink esetében claudinra negatív biológiai kontrollt (HCC mintákat) használva detektáltuk, hogy a háttértől különböző jelet csak a nem HCC minták esetében tapasztaltunk; ill. ezen eredmények Western blot segítségével további megerősítést nyertek. A claudin expresszió szempontjából kontrollnak tekinthető személyektől nyert vérmintákhoz ismert mennyiségű kontroll claudin fehérjét adva mutattunk ki a fehérje jelenlétét. Negatív kontrollként a tiszta, hozzáadott claudint nem tartalmazó minták szolgáltak. Mivel mindegyik vérminta háttér értékei a kontroll mintáknál detektált értékeknek megfelelők, ill. azokkal közel azonosak voltak, a reakció specifikusnak tekinthető vérminták esetén is. Az érzékenységet hígítási görbe elkészítésével állapítottuk meg. A beállított claudin-1 és a claudin-4 fehérjét detektáló ELISA-módszereknél a kimutatható minimális fehérje koncentráció 0.3 ng/well. Az ELISA módszer kit-ként történő hasznosítását a klinikai minták (vér, ascites stb.) várható fehérje tartalma befolyásolja elsőként. A forgalomban lévő
(nem claudin
specifikus) ELISA kitek általában 1 pg-nyi mennyiség kimutatására alkalmasak, de ennél kevesebb mennyiséget detektáló rendszerek (Abcam) is vásárolhatók. Kiegészítő módszerekkel, nagyobb térfogatú minta bekoncentrálásával az általunk beállított érzékenységi határ is csökkenthető. (Eredményeink alapján, mind az antitestek, mind az antigén kötődését elsősorban az oldatok koncentrációja határozza meg, nem az abszolut mennyisége. Másként fogalmazva, arányosan magasabb detektálási jelet kapunk ha kétszer olyan tömény, de fele térfogatú oldatokat használunk coat-oláskor, ill. mintafelvitelkor, szemben azzal, ha nagyobb térfogatokban visszük ugyanezeket a mennyiségeket a plate-re). Vizsgálati
eredményeink
szövetminták
claudin
alapján
a
mennyiségének
beállított
ELISA
megállapítására.
módszerek
alkalmasak
Vérmintáknál
további
vizsgálatokra lenne szükség annak eldöntésére, vajon ki lehet-e mutatni a vérben lévő claudin-4 fehérje teljes mennyiségét.
89
VI. AZ ÉRTEKEZÉS ÚJ EREDMÉNYEI, RÖVID ÖSSZEFOGLALÁS
Doktori munkámban elsőként írom le a claudin-1, -2, -3, -4, -,7, -8 és -10 fehérjeexpresszió különbségeit a normál és daganatos epeút különböző szakaszain. Eredményeim alapján elmondható, hogy a claudinok csoportspecifikus expressziót mutatnak az epeút különböző szakaszain normál és daganatos elváltozásokban egyaránt, szemben az általam vizsgált többi fehérjével. 1.
a,
Immunhisztokémiai
eredmények
szemikvantitatív
eredménye
alapján
megállapítottam, hogy a claudin-1, -3, -4, -7, -8 és -10 fehérje az epeút különböző szakaszain normál és daganatos szövetmintákban is (amennyiben expresszálódik) apikális és apikolaterális membranózus expressziót mutat. A claudin-2 fehérjére emellett citoplazmatikus expresszió jellemző. A claudin-4 kivételével a daganatos szövetekben a megfelelő normál szövetekhez viszonyítva a vizsgált fehérjék expressziója szignifikánsan alacsonyabbnak bizonyult. b, Az immunhisztokémiai eredményeimben megfigyelt claudin-2, -7, -8 és -10 expresszió értelmezheti az epehólyag hámjának szerepét az epe összetételének kialakításában. 2.
Igazoltam, hogy a claudinok az epeút különböző szakaszain, normál és daganatos szövetben
egyaránt
jellemző,
csoportspecifikus
eltéréseket
mutatnak.
Megfigyeltem, hogy a claudin-3, a ductális pancreas tumoroktól eltérően, az intrahepatikus epeúti rákok nagyobb részén expresszálódik. 3.
Immunhisztokémiai
eredmények
szemikvantitatív
eredménye
alapján
megállapítottam, hogy a ZO-1 és az occludin fehérje apikális, az E-cadherin fehérje apikális, apikolaterális, apikobazális membranózus expressziót mutat (daganatos mintákban bazális kifejeződés is előfordul).
90
4.
Igazoltam, hogy a ZO-1, occludin és E-cadherin expresszió tekintetében az epeút különböző szakaszain a normál hám nem mutat eltérést. Hasonlóképpen, a különböző lokalizációjú daganatos csoportok között sem találtunk eltérést. Azonban azonos lokalizációban a daganatszövetek szignifikánsan alacsonyabb expressziót mutattak a normál szövetekhez képest.
5.
Tehát a TJ különböző alkotóelemeinek kifejeződése eltérően változik mind a normál, mind a daganatos szövetekben.
Kimutattam, hogy a HuH7, PLC, HepG2, Hep3B, T47D, HT29 sejtvonalakon a claudinok fluoreszcens vizsgálatához mely fixálási módszer a legalkalmasabb, és megállapítottam e sejtvonalak claudin-1 és -4 expressziós profilját. Két ELISA protokollt dolgoztam ki, melyek alkalmasak szöveti- és sejtvonalak fehérjelizátumaiból claudin-1 és -4 fehérjék detektálására. 6.
a, Kimutattam, hogy a claudinok sejtvonalon történő kimutatásához a metanolacetonos fixálási módszer a legalkalmasabb. b, Kimutattam, hogy a HuH7, PLC, HepG2, Hep3B, T47D, HT29 sejtvonalak mindegyike kifejezi a claudin-1 fehérjét, míg a claudin -4 fehérje expresszióját csak a HepG2, T47D és HT29 sejtvonalakon tudtam kimutatni. c, Szövetminták - és sejtek fehérje lizátumaiból claudin-1 kimutatására alkalmas (0.3 ng – 306 ng tartományban) ELISA módszert állítottam be. d, Szövetminták fehérje lizátumaiból claudin-4 kimutatására alkalmas (0.3 ng alsó határig) ELISA módszert állítottam be.
91
VII. KÖVETKEZTETÉSEK
Munkám eredményei alapján a következő megállapításokat tehetők: 1.
a, Az általam kimutatott claudin mintázat, elsősorban a claudin-2, -7, -8, -10 az irodalmi adatok ismeretében értelmezheti az ephólyaghám szerepét az epe megfelelő összetételének kialakításában. b,
A
claudinok,
más
általam
vizsgált
fehérjéhez
képest
a
szövetre
csoportspecifikusan jelzik a kapcsoló struktúrák átrendeződését, a hámokra jellemző szoros sejt-sejt kapcsolatok meglazulását az epeúti daganatos átalakulások során. 2.
A claudinok specifikus markerei az epeúti hám különböző szakaszainak normál és daganatos szövettani mintákban. A claudin-3 fehérje expresszió pozitivitása segítheti az epeúti tumorok pancreas daganatoktól történő elkülönítését.
3.
ZO-1, occludin és E-cadherin fehérje a daganatszövetekben szignifikánsan alacsonyabb expressziót mutat a normál szövetekhez képest, de nem mutat csoportspecificikus különbséget az epeúti hámszövet különböző szakaszain a sem normál, sem a daganatos mintacsoportokban.
4.
A ZO-1, és occludin TJ fehérjék expressziója jelentősebben csökken a daganatos folyamatok során, mint a claudin fehérjéknek. A munkám során kapott ZO-1 eredmények ismerete a pankreász duktális karcinoma és epeúti karcinóma differenciáldiagnózisát segítheti.
5.
a, A claudinok fluoreszcens immuncitokémiai jelöléséhez az általam vizsgált sejtvonalakon a legjobb eredményt adó fixálási módszer a metanol-acetonos fixálás.
92
b, HuH7, PLC, HepG2, Hep3B, T47D, HT29 sejtvonalak claudin fehérje expressziós különbségének ismerete a továbbiakban e a továbbiakban alapot teremt kísérleti modellekben történő felhasználásukra. c, A claudin-1 és a claudin-4 fehérjék a beállított ELISA módszerekkel 0.3 ng alsó határig kimutathatóak a szöveti- és sejtek fehérje lizátumaiból.
93
VIII. ÖSSZEFOGLALÁS
Disszertációmban a tight junction felépítésében részt vevő claudin-1, -2, -3, -4, -7, -8, 10, occludin, ZO-1 és az adherens junction felépítésében részt vevő E-cadherin kifejeződését vizsgáltam az epeút normál és daganatos mintáiban. A szakirodalmi adatok alapján a claudinok eltérő kifejeződése figyelhető meg normál és daganatos szövetekben, így a differenciál diagnózisban és – más kutatási eredmények tanúsága szerint - a terápiában is hasznos lehet mennyiségük ismerete a normál- és daganatos szövetekben egyaránt. 62 db epeúti tumort és 57 db normál epeúti mintát felhasználva szöveti multiblokkokat készítettem. Az ezekből készült metszeteken szemikvantitatív módszerrel értékeltem az immunhisztokémiai reakciókat. A további elemzésekhez statisztikai
software-eket
használtam.
Munkám
másik
részében
szöveti-
és
sejtvonalakból származó fehérje-oldatok claudin-1 és -4 fehérje mennyiségeit vizsgáltam ELISA módszert használva, melynek célja egy e fehérjéket detektáló, diagnosztikai mérésre is alkalmas módszer kidolgozása volt. Vizsgálataimhoz használt további módszerek: fluoreszcens immunhisztokémia és – citokémia, real-time RT PCR, Western-blot módszer. Doktori munkámban elsőként írom le a claudin-1, -2, -3, -4, -7, -8 és -10 fehérje expresszió különbségeit az epeút különböző szakaszain normál és daganatos mintákban, valamint megállapításokat teszek az occludin, ZO-1 és E-cadherin kifejeződés sajátságaira is. Munkám másik részében claudin-1 és -4 fehérje detektálására alkalmas ELISA módszereket állítottam be. Eredményeim alapján a claudinok csoportspecifikus expressziót mutatnak az epeút különböző szakaszain normál és daganatos mintákban egyaránt, szemben az általam vizsgált többi fehérjével. Továbbá eredményeim alapján a normál epeút szakaszai a claudin-2, -3 és -4, a daganatos szakaszok a claudin-2 és -4 fehérjék expressziójában mutatnak jelentős eltérést. A daganatos minták csoportjai ezen eredmények alapján elkülöníthetők egymástól.
94
IX. ABSTRACT
In my dissertation I studied claudin-1, -2, -3, -4, -7, -8, -10, occludin, ZO-1 and Ecadherin protein expressions in biliary tract cancers. Claudins, occludin and ZO-1 are tight juction proteins, while E-cadherin is localized in adherens junctional complex. Based on the literary data, claudins show differing expression in the normal and neoplastic tissues, thus studies on expression of these proteins could help differential diagnosis and – in accordance with the literature – could be usable in therapy as well. I investigated 62 bile duct tumors and 57 normal tissue samples in tissue microarray panels. Following immunohistochemical reactions, slides were analyzed using semiquantitative methods. Further analyses were carried out with statistical softwares. In the other part of my research I measured the quantity of claudin-1 and -4 proteins in lysates of cell lines and tissue samples by means of ELISA methods, with the aim to develop methods for the detection of these two proteins, possibly suitable in diagnostic procedures as well. Further techniques used were fluorescence immunohistochemistry and -cytochemistry, real-time RT PCR and Western-blot analyses. In my dissertation I demonstrated for the first time the differences of claudin-1, -2, -3, 4, -7, -8, and -10 protein expressions in several part of the biliary tract in normal and cancerous epithelia, moreover I also made observations on the expressions of occludin, ZO-1 and E-cadherin proteins. Furthermore, I demonstrated two ELISA methods for the detection of claudin-1, and -4 proteins. Based on my results, claudins show groupspecific protein expression in the different regions of normal and tumorous biliary tract, as opposed to the other studied proteins. Further, based on my results, the different parts of the normal biliary tract show notable differences in claudin-2, -3, and -4 protein expressions, whereas biliary tract cancers show significant differences in the expression claudins-2 and -4. The cancer samples may be divided into groups based on this evaluation.
95
X. IRODALOMJEGYZÉK Aishima S, Nishihara Y, Tsujita E, Taguchi K, Soejima Y, Taketomi A, Ikeda Y, Maehara Y, Tsuneyoshi M (2008) Biliary neoplasia with extensive intraductal spread associated with liver cirrhosis: a hitherto unreported variant of biliary intraepithelial neoplasia. Hum Pathol 39: 939-947 Aldred MA, Huang Y, Liyanarachchi S, Pellegata NS, Gimm O, Jhiang S, Davuluri RV, de la Chapelle A, Eng C (2004) Papillary and follicular thyroid carcinomas show distinctly different microarray expression profiles and can be distinguished by a minimum of five genes. J Clin Oncol 22(17):3532-3539 Amasheh S, Meiri N, Gitter AH, Schöneberg T, Mankertz J, Schulzke JD, Fromm M (2002) Claudin-2 expression induces cation-selective channels in tight junctions of epithelial cells. J Cell Sci 115:4969–4976 Amasheh S, Milatz S, Krug SM, Bergs M, Amasheh M, Schulzke J-D, Fromm M (2009) NA+ absorption defends from paracellular back-leakage by claudin-8 upregulation. Biochem Biophys Res Commun 378:45-50 Anderson JM, Van Itallie CM (1995) Tight junctions and the molecular basis for regulation of paracellular permeability. Am J Physiol 269:G467–475 Bagherie-Lachidan M, Wright SI, Kelly SP (2008) Claudin-3 tight junction proteins in Tetraodon nigroviridis: cloning, tissue specific expression, and a role in hydromineral
balance.
Am
J
Physiol
Regul
Integr
Comp
Physiol
294(5):R1639-1647 Bajor J, Bero T, Garamszegi M, Grexa E, Anga B, Szilágyi K (2001) Common bile duct tumor in a young woman with ulcerative colitis. Orv Hetil 142:1231–1234 Balda MS, Matter K (1998) Tight junctions. J Cell Sci 111:541–547 Balda MS, Matter K (2003) Epithelial cell adhesion and the regulation of gene expression. TRENDS in Cell Biol. 13(6): 310-318
96
Baltes S, Nau H, Lampen A (2004) All-trans retinoic acid enhances differentiation and influences permeability of intestinal Caco-2 cells under serum-free conditions. Dev Growth Differ 46(6): 503-514 Blechacz B, Gores GJ (2008a) Tumor-specific marker genes for intrahepatic cholangiocarcinoma: utility and mechanistic insight. J Hepatol 49:160–162 Blechacz B. R. A, Gores GJ (2008b) Cholangiocarcinoma. Clin Liv Disease 12, 1: 131150 Bonney G. K, Craven R. A, Prasad R, Melcher A. F, Selby P. J, Banks R. E. (2008) Circulating markers of biliary malignancy: opportunities in proteomics? Lancet Oncol 9: 149-58. Borka K, Kaliszky P, Szabo E, Lotz G, Kupcsulik P, Schaff Zs, Kiss A (2007) Claudin expression in pancreatic endocrine tumors as compared with ductal adenocarcinomas. Virchows Arch 450: 549–557 Briggs CD, Neal CP, Mann CD, Steward WP, Manson MM, Berry DP (2008) Prognostic molecular markers in cholangiocarcinoma: a systematic review. European J Cancer 45: 33-47 Broome U, Lofberg R, Veress B, Eriksson LS. (1995) Primary sclerosing cholangitis and ulcerative colitis: evidence for increased neoplastic potential. Hepatology 22:1404–8 Burak K, Angulo P, Pasha TM, Egan K, Petz J, Lindor KD (2004) Incidence and risk factors for cholangiocarcinoma in primary sclerosing cholangitis. Am J Gastroenterol 99:523–6. Chao YC, Pan SH, Yang SC, Yu SL, Che TF, Lin CW, Tsai MS, Chang GC, Wu CH, Wu YY, Lee YC, Hong TM, Yang PC (2009) Claudin-1 is a metastasis suppressor and correlates wth clinical outcome in lung adenocarcinoma. Am J Respir Crit Care Med 179(2): 123-133
97
Chen RF, Li ZH, Zou SQ, Chen JS (2005) Effect of hepatitis C virus core protein on modulation of cellular proliferation and apoptosis in hilar cholangiocarcinoma. Hepatobiliary Pancreat Dis Int 4:71–74 Cheung ST, Leung KL, Ip YC, Chen X, Fong DY, Ng IO, Fan ST, et al. (2005) Claudin-10 expression level is associated with recurrence of primary hepatocellular carcinoma. Clin Cancer Res 11:551–556 Chiba H, Osanai M, Murata M, Kojima T, Sawada N (2007) Transmembrane proteins of tight junctions. Biochim Biophys Acta 1778:588–600 Choi HJ, Jun KH, Yoo J, Kang SJ, Lee KY (2009) Diagnostic utility of expression of claudins in non-small cell lung cancer: different expression profiles in squamous cell carcinomas and adenocarcinomas. Pathol Res Pract 205(6):409416 Clark MF, Adams AN (1977) Characteristics of the microplate method of EnzymeLinked Immunosorbent Assay for the detection of plant viruses. J Gen Virol 34: 475-483 Clayburgh D. R, Shen L, Turner J. R (2004) A porous defense: the leaky epithelial barrier in intestinal disease. Lab Invest 84: 282-291 Coleman R (1987) Biochemistry of bile secretion. Biochem J 244: 249-261 Comper F, Antonello D, Beghelli S, Gobbo S, Montagna L, Pederzoli P, Chilosi M, Scarpa A (2009) Expression pattern of claudin-5 and -7 distinguishes solidpseudopapillary from pancreatoblastoma, acinar cell and endocrine tumors of the pancreas. Am J Surg Pathol 33: 768-774 Contreras HR, Ledezma RA, Vergara J, Cifuentes F, Barra C, Cabello P, Gallegos I, Morales B, Huidobro C, Castellón EA (2009) The expression syndecan-1 and 2 is associated with Gleason score and epithelial-mesenchymal transition
98
markers, E-cadherin and beta-catenin, in prostate cancer. Urol Oncol (Epub ahead of print) Demols A, Maréchal R, Deviére J, Van Laethem J-L (2007) Biliary tract cancers: from pathogenesis to endoscopic treatment. Best Practice & Res Clin Gastroenterol 21(6):1015-1029 Dhawan P, Singh AB, Deane NG, No YR, Shiou SR, Schmidt C, Neff J, Washington MK, Beauchamp RD (2005) Caludin-1 regulates cellular transformation and metastatic behavior in colon cancer. J Clin Invest 115(7):1765-1776 Ebnet K (2008a) Organization of multiprotein complexes at cell-cell junctions. Histochem Cell Biol. 130:1-20 Ebnet K., Iden S., Gerke V. and Suzuki, A (2008b). Regulation of epithelial and endothelial junctions by PAR proteins. Front Biosci 13:6520-6536 Elq SA, Mayer AR, Carson LF, Twiggs LB, Hill RB, Ramakrishnan S (1997) α-1 Acid glycoprotein is an immunosuppressive factor foun in ascites from ovarian carcinoma. Cancer 80:1448-1456 Farquhar M. G, Palade G. E (1963) Junctional complexes in various epithelia. J Cell Biol 17:375-412 Feldmeyer L, Huber M, Fellmann F, Beckmann JS, Frenk E, Hohl D (2006) Confirmation of the origin of NISCH syndrome. Hum Mutat 27:408-410 French AD, Fiori JL, Camilli TC, Leotlela PD, O’Connell MP, Frank BP, Subaran S, Indig FE, Taub DD, Weeraratna AT (2009) PKC and PKA phosphorilation affect the subcellular localization of claudin-1 in melanoma cells. Int J med Sci 6(2):93-101.
99
Fritzsche FR, Oelrich B, Johannsen M, Kristiansen I, Moch H, Jung K, Kristiansen G (2008) Claudin-1 protein expression is a prognostic marker of patient survival in renal cell carcinanoma. Clin Cancer Res 14(21):7035-7042 Furuse M, Hirase T, Itoh M, Nagafuchi A, Yonemura S, Tsukita S (1993) Occludin: a novel integral membrane protein localizing at tight junction. J Cell Biol 123:1777-1788. Furuse M, Itoh M, Hirase T, Nagafuchi A, Yonemura S, Tsukita S, Tsukita S (1994) Direct association of occludin with ZO-1 and its possible involvement in the localization of occludin at tight junctions. J Cell Biol 127:1617–1626 Furuse M, Fujita K, Hiiragi T, Fujimoto K, Tsukita S (1998) Claudin-1 and -2: novel integral membrane proteins localizing at tight junctions with no sequence similarity to occludin. J Cell Biol 141:1539–1550 Furuse M, Hata M, Furuse K, Yoshida Y, Haratake A, Sugitani Y, Noda T, Kubo A, Tsukita S (2002) Claudin-based tight junctions are crucial for the mammalian epidermal barrier: a lesson from claudin-1-deficient mice. J Cell Biol 156:1099-1111 Gallin W J (1998) Evolution of the „Classical” Cadherin family of cell adhesion molecules in vertebrates. Mol. Biol. Evol. 15 (9): 1099-1107 González-Mariscal L, Betanzos A, Nava P, Jaramillo B.E. (2003) Tight junction proteins. Progress Biophys Mol Biol 81:1-44 González-Mariscal L, Lechuga S, Garay E (2007) Role of tight junctions in cell proliferation and cancer. Prog Histochem Cytochem 42:1–57 Green C.R. Variation of septate junction structure in the invertebrates. In: Sturgess J.M. (szerk.), 9th Int Cong Electron Microsc, Toronto, Vol 2. The Imperial Press, Canada, 1978:338-339
100
Gumbiner B. (1987) Structure, biochemistry, and assembly of epithelial tight junction. Am J Physiol Cell Physiol 253:749-758 Gumbiner BM (1993) Breaking through the tight junction barrier. J Cell Biol 123:1631– 1633 Guzman G, Chejfec G (2007) Tumors of the digestive system. In Damjanov I, Fan F, eds. Cancer Grading Manual. New York, Springer, 43–44 Günzel D, Haisch L, Pfaffenbach S, Krug SM, Milatz S, Amasheh S, Hunziker W, Müller D (2009) Claudin function in the thick ascending limb of Henle’s loop. Ann N Y Acad Sci 1165:152-162 Hadj-Rabia S, Baala L, Vabres P, Hamel-Teillac D, Jacquemin E, Fabre M, Lyonnet S, De Prost Y, Munnich A, Hadchouel M, Smahi A (2004) Claudin-1 gene mutations in neonatal sclerosing cholangitis associated with ichthyosis: a tight junction disease. Gastroenterology 127:1386-1390 Halasz J, Holczbauer A, Paska C, Kovacs M, Benyo G, Verebely T, Schaff Zs, Kiss A (2006) Claudin-1 and claudin-2 differentiate fetal and embryonal components in human hepatoblastoma. Hum Pathol 37:555–561 Hamilton S, Aaltonen L Pathology and genetics of tumours of the digestive system. In: Kleinheus P, Sobin L (eds) World Health Organization classification of tumours. IARC press, Lyon 2000 Han SY, Hwang HS, Chae JS, Yang SJ, Yoon JH, Yeom YI, Choi EJ (2009) Biochem Biophys Res Commun (Epub ahead of print) Harten SK, Shukla D, Barod R, Hergovich A, Balda MS, Matter K, Esteban MA, Maxwell PH (2009) Regulation of renal epithelial tight junctions by the von Hippel-Lindau tumor suppressor gene involves occludin and claudin-1 and is independent of E-cadherin. Mol Biol Cell 20(3):1089-1101
101
Hartsock A, Nelson WJ (2007) Adherens and tight junctions: Structure, function and connections to the actin cytoskeleton. Biochim Biophys Acta 1778:660–669 Haskins J, Gu L, Wittchen E.S, Hibbard J, Stevenson B.R, (1998) ZO-3, a novel member of the MAGUK protein family found at the tight junction, interacts with ZO-1 and occludin. J Cell Biol 141:199–208 Heinzelmann-Schwarz VA, Gardiner-Garden M, Henshall SM, Scurry J, Scolyer RA, Davies MJ, Heinzelmann M, Kalish LH, Bali A, Kench JG, Edwards LS, Vanden Bergh PM, Hacker NF, Sutherland RL, O'Brien PM (2004) Overexpression of the cell adhesion molecules DDR1, Claudin 3, and Ep-CAM in metaplastic ovarian epithelium and ovarian cancer. Clin Cancer Res 10(13):4427-36 Hewitt KJ, Agarwal R, Morin PJ (2006) The claudin gene family: expression in normal and neoplastic tissues. BMC Cancer 6:186 Higashi Y, Suzuki S, Sakaguchi T, Nakamura T, Baba S, Reinecker HC, Nakamura S, et al. (2007) Loss of claudin-1 expression correlates with malignancy of hepatocellular carcinoma. J Surg Res 139:68–76 Huang YC, Chen M, Shyr YM, Su CH, Chen CK, Li A FY, Ho D MT, Chen YM A (2008) Glycine N-methyltransferase is a favorable prognostic marker for human cholangiocarcinoma. J Gastroenterol Hepatol 23(9): 1384-1389 Huang YH, Bao Y, Peng W, Goldberg M, Love K, Bumcrot DA, Cole G, Langer R, Anderson DG, Sawicki JA (2009) Claudin-3 gene silencing with siRNA suppresses ovarian tumor growth and metastasis. Proc Natl Acad Sci USA. 106(9):3426-30 Iannetta PPM, James EK, McHardy PD, Sprent JI, Minchin FR (1993) An ELISA procedure for quantification of relative amounts of intercellular glycoprotein in Legume nodules. Annals of Botany 71:85-90
102
Inai T, Sengoku A, Guan X, Hirose E, Iida H, Shibata J (2005) Heterogeneity in expression and subcellular localisation of tight junction proteins, claudi-10 and -15, examined by RT-PCR and immunfluorescence microscopy. Arch Histol Cytol 68(5): 349-360 Ishak KG, Anthony PP, Sobin LH. Histological typing of tumours of the liver. WHO International Histological Classification of Tumours. Springer Verlag, Berlin 1994. Islas S, Vega J, Ponce L, Gonzalez-Mariscal L (2002) Nuclear localization of the tight junction protein ZO-2 in epithelial cells. Exp. Cell Res. 274:138–148 Ivanov AI, Nusrat A, Parkos CA (2005) Endocytosis of the apical junctional complex: mechanisms and possible roles in regulation of epithelial barriers. Bioessays 27:356–365 Itoh M, Nagafuchi A, Yonemura S, Kitani-Yasuda T, Tsukita S, Tsukita S (1993) The 220-kD protein colocalizing with cadherins in non-epithelial cells is identical to ZO-1, a tight junction-associated protein in epithelial cells: cDNA cloning and immunoelectron microscopy. J Cell Biol 121: 491–502 Janssens B, Chavrier P (2004) Mediterranean views on epithelial polarity. Nat Cell Biol 6:493-496 Kakar S, Ferrell LD (2007) Tumors of the liver, gallbladder and biliary tree. In Fletcher CDM, ed. Diagnostic Histopathology of Tumors. 3rd ed. Philadelphia, Elsevier, 417–462 Karamitopoulou E, Tornillo L, Zlobec I, Cioccari L, Carafa V, Borner M, Schaffner T, Brunner T, Diamantis I, Zimmermann A, Terracciano L (2008) Clinical significance of cell cycle- and apoptosis-related markers in biliary tract cancer: a tissue microarray –based approach revealing a distinctive immunophenotype
103
for intrahepatic and extrahepatic cholangiocarcinoma. Am J Clin Pathol 130(5): 780-786 Khan J, Brennan DM, Bradley N, Gao B, Bruckdorfer R, Jacobs M (1998) 3Nitrotyrosine in the proteins of human plasma determined by an ELISA method. Biochem J 330: 795-801 Khan
SA,
Thomas
HC,
Davidson
BR,
Taylor-Robinson
SD
(2005)
Cholangiocarcinoma. Lancet 366:1303–14 Kim TH, Huh JH, Lee S, Kang H, Kim GI, An HJ (2008) Down-regulation of claudin-2 in breast carcinomas is associated with advanced disease. Histopathology 53(1):48-55 Kinugasa T, Huo Q, Higashi D, Shibaguchi H, Kuroki M, Tanaka T, Futami K, Yamashita Y, Hachimine K, Maekawa S, Nabeshima K, Iwasaki H, Kuroki M (2007) Selective up-regulation of claudin-1 and claudin-2 in colorectal cancer. Anticancer Res 27(6A):3729-3734 Kiuchi-Saishin Y, Gotoh S, Furuse M, Takasuga A, Tano Y, Tsukita S (2002) Differential expression patterns of claudins, tight junction membrane proteins, in mouse nephron segments. J Am Soc Nephrol 13:875–886 Kleef J, Shi X, Bode HP, Hoover K, Shrikhande S, Bryant PJ, Korc M, Büchler MW, Friess H (2001) Altered expression and localization of the tight junction protein ZO-1 in primary and metastatic pancreatic cancer. Pancreas 23(3):259265 Kleinberg L, Holth A, Trope CG, Reich R, Davidson B (2008) Claudin upregulation in ovarian carcinoma effusions is associated with poor survival. Hum Pathol 39(5):747-757 Kominsky SL (2006) Claudins: emerging targets for cancer therapy. Expert Rev Mol Med 8:1–11
104
Kominsky SL, Argani P, Korz D, Evron E, Raman V, Garrett E, Rein A, Sauter G, Kallioniemi OP, Sukumar S (2003) Loss of the tight junction protein claudin-7 correlates with histological grade in both ductal carcinoma in situ and invasive ductal carcinoma of the breast. Oncogene 22(13):2021-33 Konecny GE, Agarwal R, Keeney GA, Winterhoff B, Jones MB, Mariani A, Riehle D, Neuper C, Dowdy SC, Wang HJ, Morin PJ, Podratz KC (2008) Claudin-3 and claudin-4 expression in serous papillary, clear cell, and endometrioid endometrial cancer. Gynecol Oncol 109(2):263-269 Koval M, Ward C, Findley MK, Roser-Page S, Helms MN, Roman J (2009) Extracellular matrix influences alveolar epithelial claudin expression and barrier function. Am J Respir Cell Mol Biol (Epub ahead of print) Kubota K., Furuse M., Sasaki H., Sonoda N., Fujita K., Nagafuchi A., Tsukita S. (1999) Ca2+ independent cell-adhesion activity of claudins, a family of integral membrane proteins localized at tight junctions. Curr. Biol. 9:1035–1038 Kuhn S, Koch M, Nübel T, Ladwein M, Antolovic D, Klingbeil P, Hildebrand D, Moldenhauer G, Langbein L, Franke WW, Weitz J, Zöller M (2007) A complex of EpCAM, claudin-7, CD44 variant isoforms, and tetraspanins promotes colorectal cancer progression. Mol Cancer Res 5(6): 553-567 Laurila JJ, Karttunen T, Koivukangas V, Laurila P, Syrjälä H, Saarnio J, Soini Y, et al. (2007) Tight junction proteins in gallbladder epithelium: different expression in acute acalculous and calculous cholecystitis. J Histochem Cytochem 55:567–573 Lechpammer M, Resnick MB, Sabo E, Yakirevich E, Greaves WO, Sciandra KT, Tavares R, Noble LC, DeLellis RA, Wang LJ (2008) The diagnostic and prognostic utility of claudin expression in renal cell neoplasm. Mod Pathol 21(11):1320-1329
105
Lee JW, Lee SJ, Seo J, Song SY, Ahn G, Park CS, Lee JH, Kim BG, Bae DS (2005) Increased expression of claudin-1 and claudin-7 during the progeression of cervical neoplasia. Gynecol Oncol 97(1):53-59 Leong As-Y, Sormunen RT, Tsui WM- S, Liew CT (1998) Immunostaining for liver cancers. Histopathology 33:318–24 Leong T Y-M, Wannakrairot P, Lee ES, Leong A S-Y. (2007) Pathology of cholangiocarcinoma. Current Diagnostic Pathology 13: 54-64 Lewis JT, Talwalkar JA, Rosen CB, Smyrk TC, Abraham SC (2007) Prevalence and risk factors for gallbladder neoplasia in patients with primary sclerosing cholangitis: evidence for a metaplasiadysplasia-carcinoma sequence. Am J Surg Pathol 31:907–913 Li WY, Huey CL, Yu ASL (2004) Expression of claudin-7 and-8 along the mouse nephron. Am J Physiol Renal Physiol 286:1063-1071 Lódi C, Szabó E, Holczbauer A, Batmunkh E, Szíjártó A, Kupcsulik P, Kovalszky I, et al. (2006) Claudin-4 differentiates biliary tract cancers from hepatocellular carcinomas. Mod Pathol 19: 460–469 Luo J, Chen J, Deng ZL, Luo X, Song WX, Sharff K A, Tang N, Haydon R C, Luu H H, He TC (2007) Wnt signaling and human disease: what are the therapeutic implications? Lab Invest 87: 97-103 Lustig B, Behrens J (2003) The Wnt signaling pathway and its role in tumor development. J Cancer Res Clin Oncol 129(4):199-221 Malhi H, Gores GJ. (2006) Cholangiocarcinoma: Modern advances in understanding a deadly old disease. J Hepatol 45, 856-867
106
Medigeshi GR, Hirsch AJ, Brien JD, Uhrlaub JL, Mason PW, Wiley C, NikolichZugich J, Nelson JA (2009) West nile virus capsid degradation of claudin proteins disrupts epithelial barrier function. J Virol 83(12):6125-6134 Mess ST, Mennigen R, Spieker T, Rijcken E, Senninger N, Haier J, Bruewer M (2009) Expression of tight and adherens junction proteins in ulcerative colitis associated colorectal carcinoma: upregulation of claudin-1, claudin-3-, claudin4 and beta-catenin. J Colorectal Dis 24(4):361-368 Michikawa H, Fujita-Yoshigaki J, Sugiya H (2008) Enhancement barrier function by overexpression of claudin-4 in tight junctions of submandibular gland cells. Cell Tissue Res 334(2):255-264 Mitic L.L, Van Itallie C.M. Occludin and claudins: transmembrane proteins of the tight junction. In: M. Cereijido, J.M. Anderson (szerk.) Tight Junctions. CRC Press, Boca Raton, 2001: 213–230 Miyoshi J, Takai Y (2005) Molecular perspective on tight-junction assembly and epithelial polarity. Adv Drug Deliv Rev 57:815–855 Moldvay J, Jäckel M, Páska C, Soltész I, Schaff Z, Kiss A (2007) Distinct claudin expression profile in histologic subtypes of lung cancer. Lung Cancer 57(2):159-167 Montgomery E, Mamelak AJ, Gibson M, Maitra A, Sheikh S, Amr SS, Yang S, Brock M, Forastiere A, Zhang S, Murphy KM, Berg KD (2006) Overexpression of claudin proteins in esophageal adenocarcinoma and its precursor lesions. Appl Immunohistochem Mol Morph 14(1):24-30 Moon RT, Kohn AD, De Ferrari GV, Kaykas A (2004) Wnt and β-catennin signalling: disease and therapies. Nat Rev Genet 5:691-701 Morin PJ (2005) Claudin proteins in human cancer: promising new targets for diagnosis and therapy. Cancer Res 65:9603–9606
107
Morita K, Furuse M, Fujimoto K, Tsukita S (1999) Claudin multigene family encoding four-transmembrane domain protein components of tight junction strands. Proc Natl Acad Sci USA 96: 511–516 Mosconi S, Bretta G. D, Labianca R, Zampino M. G, Gatta G, Heinemann V. (2009) Cholangiocarcinoma. Crit Rev Oncol/ Hematol 69(3):259-270 Muresan Z, Paul DL, Goodenough DA (2000) Occludin 1B, a variant of the tight junciton protein occludin. Mol Biol Cell 11:627-634 Murphy EF, Jewell C, Hooiveld GJ, Muller M, Cashman KD (2006) Conjugated linoleic acid enhances transepithelial Ca transport in human intestinal-like Caco-2 cells: an insight into molecular changes. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids 74(5):295-301 Németh J, Németh Z, Tátrai P, Péter I, Somorácz A, Szász AM, Kiss A, Schaff Z (2009) High expression of claudin-1 protein in papillary thyroid tumor and its regional lymph node metastasis. Pathol Oncol Res (Epub ahead of print) Nishino R, Honda M, Yamashita T, Takatori H, Minato H, Zen Y, Sasaki M, Takamura H, Horimoto K, Ohta T, Nakanuma Y, Kaneko S (2008) Identification of novel candidate tumour marker genes for intrahepatic cholangiocarcinoma. J Hepatol 49(2): 207–216 Obama K, Ura K, Li M, Katagiri T, Tsunoda T, Nomura A, Satoh S, Nakamura Y, Furukawa Y (2005) Genome-wide analysis of gene expression in human intrahepatic cholangiocarcinoma. Hepatology 41:1339–1348 Odland G.F (1958) The fine structure of interrelationship of cells in the human epidermis. J Biophysic Biochem Cytol 4 (5): 529-538 Ohtani S, Terashima M, Satoh J, Soeta N, Saze Z, Kashimura S, Ohsuka F, Hoshino Y, Kogure M, Gotoh M 2009) Expression of tight-junction-associated proteins in
108
human gastric cancer: downregulation of claudin-4 correlates with tumor agressiveness and survival. Gastric Cancer 12(1):43-51 Oliveira SS, Oliveira IM, Souza W, Morado-Díaz JA (2005) Claudins upregulation in human colorectal cancer. FEBS Letters 579: 6179-6185 Oliveira SS, Morgado-Diaz JA (2007) Claudins: multifunctional players in epithelial tight junctions and their role in cancer. Cell Mol Life Sci 64:17–28 Olnes MJ, Erlich R (2004) A review and update on cholangiocarcinoma. Oncology 66: 167–79. Orbán E, Szabó E, Lotz G, Kupcsulik P, Páska C, Schaff Z, Kiss A (2008) Different expression of occludin and ZO-1 in primary and metastatic liver tumors. Pathol Oncol Res 14(3): 299-306 Oshima T, Miwa H, Joh T (2008a) Changes in the expression of claudins in active ulcerative colitis. J Gastroenterol Hepatol 23 Suppl.2: S146-150 Oshima T, Kunisaki C, Yoshihara K, Yamada R, Yamamoto N, Sato T, Makino H, Yamagishi S, Nagano Y, Fujii S, Shiozawa M, Akaike M, Wada N, Rino Y, Masuda M, Tanaka K, Imada T (2008b) Reduced expression of claudin-7 gene correlates with venous invasion and liver metastatsis in colorectal cancer. Oncol Rep 19(4): 953-959 Oshima T, Miwa H, Joh T (2008c) Aspirin induces gastric epithelial barrier dysfunction by activating p38 MAPK via claudin-7. Am J Physiol Cell Physiol 295(3):C800-806 Osunkoya AO, Cohen C, Lawson D, Picken MM, Amin MB, Young AN (2009) Claudin-7 and claudin-8: immunohistochemical markers for the differential diagnosis of chromophobe renal carcnoma and renal oncocytoma. Hum Pathol 40(2):206-210
109
Palmer HG, Gonzalez-Sancho JM, Espada J, Berciano MT, Puig I, Baulida J, Quintanilla M, Cano A, de Herreros AG, Lafarga M, Munoz A (2001) Vitamin D3 promotes the differentiation of colon carcinoma cells by the induction of Ecadherin and the inhibition of beta-catenin signaling. J Cell Biol 154(2): 369387 Paschoud S, Bongiovanni M, Pache JC, Citi S (2007) Claudin-1 and claudin-5 expression patterns differentiate lung squamous cell carcinomas from adenocarcinomas. Mod Pathol 20(9):947-954 Park D, Karesen R, Axcrona U, Noren T, Sauer T (2007a) Expression pattern of adhesion molecules (E-cadherin, alpha-, beta-, gamma-catenin and claudin-7), their influence on survival in primary breast carcinoma, and their corresponding axillary lymph node metastasis. APMIS 115(1):52-65 Park JY, Park KH, Oh TY, Hong SP, Jeon TJ, Kim CH, Park SW, Chung JB, Song SY, Bang S (2007b) Up-regulated claudin 7 expression in intestinal –type gastric carcinoma. Oncol Rep 18(2):377-382 Patel T (2001) Increasing incidence and mortality of primary intrahepatic cholangiocarcinoma in the United States. Hepatology 33: 1353–57 Patel T (2002) Worldwide trends in mortality from biliary tract malignancies. BMC Cancer 2: 10. Patel T (2006) Cholangiocarcinoma. Nat Clin Pract Gastroenterol Hepatol 3: 33–42 Peng H, Zhong XY, Liu KP, LiSM (2009) Expression and significance of adenomatous polyposis coli, beta-catenin, E-cadherin and cyclin D1 in esophageal squamous cell carcinoma assessed by tissue microarray. Chin J Cancer 28(1):38-41
110
Pfaffl MW, Horgan GW, Dempfle L (2002) Relative expression software tool (REST©) for group-wise comparison and statistical analysis of relative expression results in real-time PCR. Nucl Acid Res 30(9): e36 Piche T, Barbara G, Aubert P, Bruley des Varannes S, Dainese R, Nano JL, Cremon C, Stanghellini V, De Giorgio R, Galmiche JP, Neunlist M (2009) Impared intestinal barrier integrity in the colon of patients with irritable bowel syndrome: involvement of soluble mediators. Gut 58(2):196-201 Pinton P, Nougayréde JP, Del Rio JC, Moreno C, Marin DE, Ferrier L, Bracarense AP, Kolf-Clauw M, Oswald IP (2009) The food contaminant deoxynivalenol, decreases intestinal barrier permeability and reduces claudin expression. Toxicol Appl Pharmacol 237(1):41-48 Powell SM, Zilz N, Beazer-Barclay, Bryan TM, Hamilton SR, Thibodeau SN, Vogelstein B, Kinzler KW (1992) APC mutations occur early during colorectal tumorgenesis. Nature 359:235-237 Robert D M, Slep K C, Peifer M (2007) It takes more than two to tango: dishevelled polimerization and Wnt signaling. Nat Struct Mol Biol 14:463-465 Rodriguez-Boulan E, Nelson WJ (1989) Morphogenesis of the polarized epithelial cell phenotype. Science 245:718–725 Rullier A, Bail B, Fawaz R, Blanc JF, Saric J, Bioulac-Sage P (2000) Cytokeratin 7 and 20 expression in cholangiocarcinomas varies along the biliary tract but still differs from that in colorectal carcinoma metastasis. Am J Surg Pathol 24 (6): 870-876 Sakakibara A, Furuse M, Saitou M, Ando-Akatsuka Y, Tsukita S (1997) Possible involvement of phosporylation of occludin in tight junction formation. J Cell Biol 137:1393-1401
111
Schmidt R, Steinhilber W, Ruppert C, Daum C, Grimminger F, Seeger W, Günther A (2002) An ELISA technique for quantification of surfactant apoprotein (SP)-C in bronchoalveolar lavage fluid. Am J Respir Crit Care Med 165: 470-474 Schneeberger EE, Lynch RD (2004) The tight junction: a multifunctional complex. Am J Physiol Cell Physiol 286:C1213–1228 Sheehan GM, Kallakury BV, Sheehan CE, Fisher HA, Kaufman RP Jr, Ross JS (2007) Loss of claudins-1 and -7 and expression of claudin-3 and -4 correlate with prognostic variables in prostatic adenocarcinomas. Hum Pathol 38(4):564-569. Sobel G, Páska C, Szabó I, Kiss A, Kádár A, Schaff Z (2005) Increased expression of claudins in cervical squamous intraepithelial neoplasia and invasive carcinoma. Hum Pathol 36(2):162-169 Sobel G, Nemeth J, Kiss A, Lotz G, Szabó I, Udvarhelyi N, Schaff ZS, Paska C (2006) Claudin 1 differentiates endometrioid and serous papillary endometrial adenocarcinoma. Gynecol Oncol 103: 591–598 Soini Y (2005a) Expression of claudins 1, 2, 3, 4, 5 and 7 in various types of tumors. Histopathology 46:551–560 Soini Y (2005b) Claudins 2, 3, 4, and 5 in Paget’s disease and breast carcinoma. Hum Pathol 35(12):1531-1536 Soini Y, Kinnula V, Kahlos K, Pääkkö P (2006a) Claudins in differential diagnosis between mesothelioma and metastatic adenocarcinoma of the pleura. J Clin Pathol 59:250–254 Soini Y, Talvensaari-Mattila A (2006b) Expression of claudin 1, 4, 5, and 7 in ovarian tumors of diverse types. Int J Gynecol Pathol 25:330–335 Sparks AB, Morin PJ, Vogelstein B, Kinzler KW (1998) Mutational analysis of the APC/β-catenin/Tcf pathway in colorectal cancer. Cancer Res 58:1130-1134.
112
Staehelin L.A (1973) Further observations on the fine structure of freeze-cleaved tight junction. J Cell Sci 13:763-786 Staehelin L.A (1974) Structure and function of intercellular junctions. Int Rev Cytol 39:191-283 Swisshelm K, Macek R, Kubbies M (2005) Role of claudins in tumorigenesis. Adv Drug Deliv Rev 57:919–928 Tassi RA, Bignotti E, Falchetti M, Ravanini M, Calza S, Ravaggi A, Bandiera E, Facchetti F, Pecorelli S, Santin AD (2008) Claudin-7 expression in human epithelial ovarian cancer. Int J Gynecol Cancer 18(6):1262-1271 Tatum R, Zhang Y, Lu Q, Kim K, Jeansonne BG, Chen YH (2007) WNK4 phosphorilate ser(206) of claudin-7 and promotes paracellular Cl(-) permeability. FEBS Lett 581(20):3887-3891 Taylor-Robinson SD, Toledano MB, Arora S, Keegan TJ, Hargreaves S, Beck A, Khan SA, Elliott P, Thomas HC (2001) Increase in mortality rates from intrahepatic cholangiocarcinoma in England and Wales 1968–1998. Gut 48: 816–20 Tepass U. (2003) Claudin complexities at the apical junctional complex. (Chordate claudins are core components of tight junctions. By contrast, VAB-9, a nematode four-pass transmembrane protein related to claudins, localizes to adherens junctions and contributes to cell adhesion and actin–plasma membrane association.) Nat Cell Biol 5 (7): 595-597 Terada T, Kida T, Nakanuma Y, Kurumaya H, Doishita K, Takayanagi N (1994) Intrahepatic cholangiocarcinoma associated with nonbiliary cirrhosis. A clinicopathologic study. J Clin Gastroenterol 18:335–42 Thanan R, Murata M, Pinlaor S, Sithithawom P, Khuntikeo N, Tangkanakul W, Hiraku Y, Oikawa S, Yongvanit P, Kawanishi S (2008) Urinary 8-oxo-7,8-dihydro-2deoxyguanosine in patients with parasite infection and effect of antiparasitic
113
drug in relation to cholangiocarcinogenesis. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 17(3): 518-524 Thuwajit P, Chawengrattanachot W, Thuwajit C, Sripa B, Paupairoj A, Chau-in S (2008) Enhanced expression of mucin 6 glycoprotein in cholangiocarcinoma tissue from patients in Thailand as a prognostic marker for survival. J Gastroenterol Hepatol 23(5): 771-778 Tretiakova NS, Hart J, Shabani-Rad MT, Zhang J, Gao ZH (2009) Distinction of hepatocellular adenoma from hepatocellular carcinoma with and without cirrhosis
using
E-cadherin
and
matrix
metalloproteinase
immunohistochemistry. Mod Pathol 22(8):1113-1120 Tsukita S, Furuse M, Itoh M (1999) Structural and signalling molecules come together at tight junctions. Curr Opin Cell Biol 11: 628–633 Tsukita S, Furuse M, Itoh M. Multifunctional stands in tight junction. (2001) Nat Rev Mol Cell Biol 2:285-293 Tobioka H, Isomura H, Kokai Y, Tokunaga Y, Yamaguchi J, Sawada N (2004) Occludin expression decreases with the progression of human endometrial carcinoma. Hum Pathol 35(2):159-164 Tőkés AM, Kulka J, Paku S, Szik A, Páska C, Novák PK, Szilák L, Kiss A, Bögi K, Schaff Z (2005) Claudin-1, -3 and -4 proteins and mRNA expression in benign and malignant breast lesions: a research study. Breast Cancer Res 7(2): R296305 Tzelepi VN, Tsamandas AC, Vlotinou HD, Vagianos CE, Scopa CD (2008) Tight junctions in thyroid carcinogenesis: diverse expression of claudin-1, claudin-4, claudin-7 and occludin in thyroid neoplasms. Mod Pathol 21:22–30
114
Usami Y, Chiba H, Nakayama F, Ueda J, Matsuda Y, Sawada N, Komori T, Ito A, Yokozaki H (2006) Reduced expression of claudin-7 correlates with invasion and metastatis in squamous cell carcinoma of the esophagus. Hum Pathol 37(5):569-577 Usami Y, Satake S, Nakayama F, Matsumoto M, Ohnuma K, Komori T, Semba S, Ito A, Yokozaki H (2008) Snail-associated epithelial-mesenchymal transition promotes oesophageal squamous cell carcinoma motility and progression. J Pathol 215(3):330-339 Van Itallie C, Rahner C, Anderson JM (2001) Regulated expression of claudin-4 decreases paracellular conductance through a selective decrease in sodium permeability. J Clin Invest 107:1319-1327 Van Itallie CM, Anderson JM (2004a) The role of claudins in determining paracellular charge selectivity. Proc Am Thorac Soc 1:38-41 Van Itallie CM, Colegio OR, Anderson JM (2004b) The cytoplasmic tails of claudins can influence tight junction barrier properties through effects on protein stability. J Membr Biol 199(1):29-38 Van Itallie CM, Rogan S, Yu A, Vidal LS, Holmes J, Anderson JM (2006) Two splice variant of claudin-10 in the kidney create paracellular pores with diferent ion selectivities. Am J Physiol Renal Physiol 291(6): 1288-1299 Väre P, Loikkanen I, Hirvikoski P, Vaarala MH, Soini Y (2008) Low claudin expression is associated with high Gleason grade in prostate adenocarcinoma. Oncol Rep 19(1):25-31 Wan H, Winton HL, Soeller C, Tovey ER, Gruenert DC, Thompson PJ, Stewart GA, Taylor GW, Garrod DR, Cannel MB, Robinson C (1999) Derp 1 facilitates transepithelial allergen delivery by distruption of tight junction. J Clin Invest 104:123-133
115
Willott E, Balda M.S, Fanning A.S, Jameson B, Van Itallie C, Anderson J.M (1993) The tight junction protein ZO-1 is homologous to the Drosophila discs-large tumor suppressor protein of septate junctions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7834–7838 Wittchen E.S, Haskins J, Stevenson B.R. (1999) Protein interactions at the tight junction. Actin has multiple binding partners, and ZO-1 forms independent complexes with ZO-2 and ZO-3. J Biol Chem 274:35179–35185 Wu C, Cipollone J, Maines-Bandiera S, Tan C, Karsan A, Auersperg N, Roskelley CD (2008) The morphogenic function of E-cadherin –mediated adherens junction in epithelial ovarian carcinoma formation and progression. Differentiation 76(2): 193-205 Yachimski P, Pratt D. S. (2008) Cholangiocarcinoma. J Clin Gastroenterol 42, 178-190 Yamamoto S, Kubo S, Hai S, Uenishi T, Yamamoto T, Shuto T, Takemura S, Tanaka H, Yamazaki O, Hirohashi K, Tanaka T (2004) Hepatitis C virus infection as a likely etiology of intrahepatic cholangiocarcinoma. Cancer Sci 95(7):592–595 Zhou L, He XD, Cui QC, Zhou WX, Qu Q, Zhou RL, Rui JA, Yu YC (2008a) Expression of LAPTM4B -35: a novel marker of progression, invasiveness and poor prognosis of extrahepatic cholangiocarcinoma. Cancer Letters 264: 209217 Zhou Y-M, Yang J-M, Li B, Yin Z-F, Xu F, Wang B, Liu P, Li Z-M. (2008b) Clinicopathologic characteristics of intrahepatic cholangiocarcinoma in patients with positive serum a-fetoprotein. World J Gastroenterol 14 (14): 2251-2254
116
XI. SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE
Megjelent közlemények összesített impakt faktora (IF): 9.135 Az értekezés alapjául szolgáló első szerzős közlemények (IF: 4.083): Németh Z, Szász AM, Tátrai P, Németh J, Győrffy H, Somorácz A, Szíjártó A, Kupcsulik P, Kiss A, Schaff Z (2009) Claudin-1, -2, -3, -4, -7, -8, and -10 protein expression in biliary tract cancers. J Histochem Cytochem 57(2):113-121 IF: 2.823 Németh Z, Szász AM, Somorácz A, Tátrai P, Németh J, Győrffy H, Szíjártó A, Kupcsulik P, Kiss A, Schaff Z (2009) Zonula Occludens-1, Occludin, and E-cadherin Protein Expression in Biliary Tract Cancers. Pathol Oncol Res 15(3):533-539 IF:1.260
Az értekezés alapját nem képező társszerzős közlemények (IF:5.052):
Szendrői A, Dinya E, Kardos M, Szász AM, Németh Z, Ats K, Kiss J, Antal I, Romics I, Szendrői M (2009) Prognostic factors and survival of renal clear cell carcinoma patients with bone metastases. Pathol Oncol Res (Epub ahead of print) IF:1.260 Németh J, Németh Z, Tátrai P, Péter I, Somorácz Á, Szász AM, Kiss A, Schaff Zs (2009) High expression of claudin-1 protein in papillary thyroid tumor and its regional lymph node metastasis. Pathol Oncol Res (Epub ahead of print) IF:1.260 Kulka J, Szász AM, Németh Z, Madaras L, Schaff Z, Molnár IA, Tőkés AM (2009) Expression of tight junction protein claudin-4 in Basal-like breast carcinomas. Pathol Oncol Res 15(1):59-64 IF:1.260 Riesz P, Lotz G, Páska C, Szendrôi A, Majoros A, Németh Z, Törzsök P, Szarvas T, Kovalszky I, Schaff Z, Romics I, Kiss A (2007) Detection of bladder cancer from the urine using fluorescence in situ hybridization technique. Pathol Oncol Res 13(3):187-94 IF:1.272
117
Társszerzős könyv:
Halmy L, Németh Z, Halmy E. Magyar Elhízástudományi Bibliográfia. Folpress 2008
Idézhető absztrakt az értekezés témájában:
Németh Z, Szász AM, Somorácz A, Tátrai P, Németh J, Gyorffy H, Szíjártó A, Kupcsulik P, Kiss A, Schaff Z (2009) Zonula Occludens-1, Occludin, and E-cadherin Protein Expression in Biliary Tract Cancers. 44th Annual Meeting of the European Association for the Study of the Liver, Copenhagen, Denmark, April 22-26, 2009. J Hepatol 50 S1: S107-108, 2009
Nem idézhető, nem a disszertáció témájához tartozó absztrakt:
Németh Z (2004) Angiotenzin konvertáló enzim (ACE)-kardiovaszkuláris betegségek kapcsolata. BM Jubileumi Konferencia 2004. november 18-20. Budapest, BM Duna Palota Jubileumi Tudományos Kongresszus programja és az előadások kivonatainak gyűjteménye 2004. 38-39. absztrakt
118
XII. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Köszönetemet szeretném kifejezni Dr. Schaff Zsuzsa Professzor Asszonynak, aki bár az intézetünk vezetője volt a doktori képzésem időszakában, mindig szakított időt számomra, mikor segítségét kérve felkerestem. Köszönöm, hogy több olyan feladattal is megbízott, mellyel gyakorlati és elméleti tudásomat gyarapíthattam. Szeretném megköszönni témavezetőmnek, Dr. Kiss András Docens Úrnak a segítségét, ill. hogy lehetőséget kaptam a doktori munkám elkészítésére; valamint tanulmányi utakon és konferenciákon vehettem részt a támogatásával. Köszönettel tartozom Dr. Jeney Csabának az ELISA módszer beállításában nyújtott segítségéért, Dr. Bodoky Györgynek, aki a túlélési adatok lekérdezésében segített. Külön köszönöm Dr. Hegedűs Balázs építő kritikáját a disszertációm megírása során. Köszönöm Dr. Tátrai Péter munkatársam kitartó segítségét a cikkeim megírásánál. Szeretném megköszönni Pekár Zoltánné Magdinak, a mindig segítőkész és hozzáértő munkáját, Azumah Francisné Erzsinek és Slamodavitz Erikának a körülményekhez mindig alkalmazkodni tudó együttműködését a feladataink elvégzésében. Rigóné Kálé Elvirának a segítségét, hogy cikkeim időben és a megfelelő stílusban a kívánt laphoz eljutottak. Szeretném megköszönni PhD hallgató társaim mindegyikének, hogy munkájukkal, ötleteikkel, tanácsaikkal, tanításukkal és az intézetbe történő bevezetésemmel elősegítették, megalapozták és jelenlétükkel is hozzájárultak a doktori munkám elkészítéséhez. Köszönettel tartozom az intézet minden orvosának, és minden munkatársának, hogy a felmerülő szakmai- és munkámhoz szükséges egyéb kéréseimmel bátran fordulhattam hozzájuk. Végül szeretném itt is megemlíteni, és megköszönni családomnak és barátaimnak a szeretetét és kitartó támogatását a kitűzött célom eléréséhez.
119
XIII. FÜGGELÉK 1.melléklet
A Western-blot módszerhez használt oldatok és reagensek összeállításának adatait tartalmatta az alábbi összefoglalás:
Szeparációs gél:
a gél alsó részét alkotja 20ml (fehérje molekulasúlytól függő gélek készítése)
Akrilamid 20% Deszt. Víz 1,5 M Tris pH=8,8 0,4% SDS TEMED K-perszulfát Stacking gél:
7,5% 7,5 ml 7,5ml
10% 10ml 5ml
12,5% 12,5ml 2,5ml
15% 15ml -
5 ml 15µl 150µl
5ml 15µl 150µl
5ml 15µl 150µl
5ml 15µl 150µl
a gél felső részét alkotja (egyféle gél van)
Akrilamid 20% Deszt.víz 0,5 M Tris pH=6,8 0,4%SDS TEMED K-perszulfát
5ml 1,25 ml 2,5ml 1,25 ml 10 µl 50µl
Futtató puffer összetétele:
Transzfer puffer összetétele:
Tris base (pH 8,3)
3g
Tris base (pH 8,1- 8,5)
3,03 g
Glicin
14,2 g
Glicin
14,4 g
SDS
1g
Metanol
200 ml
Deszt. víz
ad 1L
Deszt. víz
ad 1 L
120
2. melléklet
Az ELISA beállítás során kidolgozott protokollok részletes leírása:
III.11.1. Normál ELISA – Claudin-1-re Coat: 100 µl/well. 100 x-os hígítású fehérjeoldat. (PBS-ben hígítva.) Inkubálás: overnight, +4 °C, PCR fóliával lefedve. Mosás: 200-200 µl 1x-es Mosó-val, 3x Mosó (10x): Tween20-as, TRIS alapú puffer tömény oldata. Blokk: 3% BSA (Mosóban) 100 µl/well. Inkubálás: 30perc, 37 °C, PCR fóliával lefedve. Mosás: ua. Elsődleges antitest: 50 µl/well. Megfelelő hígításban (1x konjugáló oldatban oldva) Inkubálás: 30perc, 37 °C, vagy overnight 4 °C, PCR fóliával lefedve. Konjugáló oldat (10x): Tween20-as, BSA tartalmú, TRIS alapú puffer tömény oldata. Mosás: ua. Másodlagos antitest: 50 µl/well. Megfelelő hígításban – anti-nyúl (DAKO, Polyclonal Swine Anti-Rabbit Immunglobulin / HRP-s; Cat. No. P0399) (konjugáló oldatban oldva). Inkubálás: 30perc, 37 °C, vagy overnight 4 °C, PCR fóliával lefedve. Mosás: ua. Szubsztrát: TMB (Sigma) 100 µl/well. Kék színreakció. Inkubálás: figyelni kell, mert túl lehet hívni. (Kb. 5-10 perc) EIA reader: 360 nm. III.11.2. Szendvics ELISA-Claudin-1-re Coat: 50µl 0,5µg/well antitest (PBS-ben hígítva.) Inkubálás: overnight, +4 °C, PCR fóliával lefedve. Mosás: 200-200 µl 1x-es Mosó-val, 3x
121
Blokk: 3% BSA (Mosóban) 100 µl/well. Inkubálás: 30perc, 37 °C, PCR fóliával lefedve. Mosás: ua. Antigén oldat felvitele: megfelelő hígítású (PBS-ben hígított) fehérjeoldat. RT, 30 perc, 37°C, PCR fólia. Mosás: ua. Elsődleges antitest: 50 µl/well. Megfelelő hígításban (konjugáló oldatban oldva) Inkubálás: 30perc, 37 °C, vagy overnight 4 °C, PCR fóliával lefedve. Mosás: ua. Másodlagos antitest: 50 µl/well. Megfelelő hígításban – anti-nyúl (DAKO, Polyclonal Swine Anti-Rabbit Immunglobulin/HRP-s; Cat. No.: P0399) (konjugáló oldatban oldva). Inkubálás: 30perc, 37 °C, vagy overnight 4 °C, PCR fóliával lefedve. Mosás: ua. Szubsztrát: TMB (Sigma) 100 µl/well. Kék színreakció. Inkubálás: figyelni kell, mert túl lehet hívni. (Kb. 5-10 perc) EIA reader: 360 nm. III.11.3. Fluoreszcens szendvics ELISA-Claudin 1-re Coat: 100µl 0,5µg/well antitest (PBS-ben hígítva) / fekete plate-en – 0,5µl/well antitest 100µl PBS-ben. Inkubálás: overnight, +4 °C, PCR fóliával lefedve. Mosás: 200-200 µl 1x-es Mosó-val, 3x Blokk: 3% BSA (Mosóban) 100 µl/well. Inkubálás: 30perc, 37 °C, PCR fóliával lefedve. Mosás: ua. Antigén oldat felvitele: megfelelő hígítású (PBS-ben hígított) fehérjeoldat (100 µl/well). RT, 60 perc, 37°C, PCR fólia. Mosás: ua.
122
Elsődleges antitest: 100 µl/well. Megfelelő hígításban (Zymed, Rabbit anti Claudin1; Cat.: 18-7362; 1:100, konjugáló oldatban oldva). Inkubálás: 60perc, 37 °C, PCR fóliával lefedve. Mosás: ua. Másodlagos antitest: 100 µl/well. Megfelelő hígításban– anti-nyúl (DAKO, Polyclonal Swine Anti-Rabbit Immunglobulin/HRP-s; Cat.No.: P0399; 1:500, konjugáló oldatban oldva). Inkubálás: 60perc, 37 °C, PCR fóliával lefedve. Mosás: ua. Szubsztrát: 1 plate-re:
135 µl/well 10,2 1,1 ml 2,25 ml 0,084 g +6,8 µl Inkubálás: RT, rázatón, 30’
mlH2O Tris (pH=9,0) Citrát puffer HPPA H2O2
(Reakció leállítása glicinnel: 65 µl/well. Nem feltétlen kell.) EIA reader: Ex: 324 nm, Em: 410 nm. III.11.4. Fluoreszcens normál ELISA – Claudin-4-re Coat: 85 ng/well kontroll fehérje 12-tagú felező hígítása (karbonát-bikarbonát pufferben) Antigén: Abnova H00001364-P01 full-length recombinanat CLDN4; 85ng/µl. Overnight, 4ºC, lefóliázva. (V: 200 µl/well) Mosás: 6x; kézileg; PBST (Tween-20 0,1%)(V: 200 µl/well) Blokk: 3% BSA PBST-ben (Tween-20 1%) 1h, 37ºC, lefóliázva. (V: 200 µl/well) Mosás: ua. PAB: Monoklonális mouse anti-claudin4; 1:250 hígítás - 0,3%BSA PBST (Tween20 0,1%) Zymed klón 3E2C1 Cat.:18-7341; 2h, 37ºC, lefóliázva (V: 100 µl/well) Mosás: ua. SAB: HRP konjugált anti-mouse IgG; 1:1000 hígítás - 0,3%BSA PBST (Tween20 0,1%) 1h, 37ºC, lefóliázva (V: 100 µl/well)
123
Mosás: ua. Előhívás: fluoreszcens detektálás, ld. előbb
III.11.5. Fluoreszcens szendvics ELISA (v2) – Claudin-4-re Coat: Poliklonális rabbit anti-claudin4 (LifespanBioScience, Cat.: LS-C6155/11825) 1,25 µl/well; (karbonát-bikarbonát pufferben) (V: 200 µl/well) Mosás: 6x; kézileg; PBST (Tween20 0,1%)(V: 200 µl/well) Blokk: 3% BSA PBST-ben (Tween20 1%) 1h, 37ºC, lefóliázva. (V: 200 µl/well) Mosás: ua. Antigén: Abnova H00001364-P01 full-length recombinanat CLDN4; 85ng/µl. Minta: HCC minták; CC minták; vérminták; 2h, 4ºC, lefóliázva. (V: 50 µl/well) Mosás: ua. PAB: Monoklonális mouse anti-claudin-4; 1:250 hígítás mindenhol, kivéve D 3-6 well: 1:125 0,3%BSA PBST (Tween20 0,1%) 2h, 37ºC, lefóliázva (V: 50 µl/well) Mosás: ua. SAB: HRP konjugált anti-mouse IgG; 1:1000 hígítás, 0,3%BSA PBST (Tween20 0,1%) Dako Cat:
1h, 37ºC, lefóliázva (V: 50 µl/well)
Mosás: ua. Előhívás: fluoreszcens detektálás, ld. előbb
124
