THE EFFECT OF PLATELET RICH PLASMA ON MESENCHYMAL STEM CELLs (MSCs) DIFERENTIATION INTO CHONDROBLAST I Gde Adi Widiastana*, Dwikora Novembri Utomo** * Resident of Orthopaedic &Traumatologi Dept, Dr. Soetomo General Hospital, Airlangga Univ. School of Medicine, Surabaya **Staff of Orthopaedic &Traumatologi Dept, Dr. Soetomo General Hospital, Airlangga Univ. School of Medicine, Surabaya
Forewords: Analyzed whether adding platelet rich plasma to mesenchymal stem cell culture on growth media and chondrogenic media had any effect on stem cell’s proliferation and diferentiation into chondroblast. Aims: Find out the effect of platelet rich plasma on mesenchymal stem cell’s diferentiation and proliferation into chondroblast on invitro media. Methods: Randomized control group post test only design. Blood was taken from the rabbit’s vein to be processed into platelet rich plasma (PRP). Mesenchymal Stem Cell (MSC) was harvested from the bone marrow of the rabbit to be cultured. The MSC’s culture were divided into three groups of modification. The first group was combination of MSC added with Complete Culture Medium (CCM) and Chondrogenic Diferentation Medium (CDM) without PRP as control group.The second group had the same combination as the first group with extra 5% PRP. The third group had the same combination as the first group with extra 10% PRP. The results were evaluated in the following 21 days. Results: The group that received extra 5% PRP had significant increase of chondroblast count compared to the group without PRP addition (p=0,033). The same result also occured on the groups that received extra 10% PRP compared to the group without PRP addition (p=0,028). There were no significant diferences between both the second and the third groupchondroblast count (p=0,203). Conclusions: There was a significant effect of platelet rich plasma on mesenchymal stem cell’s diferentiation and proliferation into chondroblast on invitro media
Keywords : Chondroblast, Complete Culture Medium, Chondrogenic Differentiation Medium, Mesenchymal Stem Cell, Platelet Rich Plasma
PENDAHULUAN Kartilago atau tulang rawan adalah suatu jaringan yang kuat, bersifat semi transparan, elastik dan fleksibel, yang terdiri dari kondrosit
dan kondroblas yang tersebar di antara material lipoprotein, dan diperkuat oleh serat-serat kolagen. Bagian luar dari kartilago dilapisi oleh serabut membran yang tebal dan kuat yang
disebut sebagai perikondrium. Pada
lambatnya proliferasi kondrosit jika
kartilago tidak ditemukan pembuluh
dibandingkan dengan jaringan parut
darah dan saraf, sehingga jika terjadi
(Buckwalter, 1997).
kerusakan maka akan sulit terjadi penyembuhan.
Kartilago
Beberapa cara untuk melakukan
sendi
penanganan terhadap kerusakan tulang
mempunyai beberapa fungsi, antara
rawan sendi antara lain: Traditional
lain: sebagai penutup permukaan sendi,
Palliative
mengurangi gesekan antar tulang di
bone marrow stimulation techniques
sendi sehingga mencegah kerusakan,
(microfractures),
dan juga berperan sebagai penahan
autologous
goncangan (Vinther, 2003).
osteochondral
Degenerasi dan cedera pada tulang
rawan
meningkat
sendi
cenderung
chondroplasty),
osteochondral transplantation, allograft
transplantation,
cell-based
(Autologous
therapy
Chondrocytes
oleh
Implantation (ACI), Matrix Induced
meningkatnya angka harapan hidup
Chondrocytes Implantation (MACI),
dan meningkatnya angka kejadian
Mesenchymal
trauma. Secara alami tulang rawan
implantation) (Gobbi, 2009 ; Getgood
sendi akan mengalami degenerasi dan
et al, 2009).
regenerasi.
disebabkan
(lavage,
Proses
stem
cells
(MSCs)
penyembuhan
Kemajuan di bidang kedokteran
kartilago diatur oleh kondrosit yang
meliputi kedokteran molekuler, biologi
memproduksi
molekuler,
matriks
ekstraseluler
rekayasa
jaringan
dan
proteoglikan dan kolagen. Beberapa
genetik telah membuka cakrawala baru
respons terhadap penyembuhan luka
dalam penanganan berbagai macam
pada kartilago tidak akan diganti
kondisi
dengan tipe kolagen dan preoteoglikan
muskuloskeletal.
yang sesuai dan akan menyebabkan
kemampuan untuk
fungsi yang abnormal. Terutama pada
kultur mesenchymal stem cells (MSCs)
kartilago artikular, jika terjadi cedera
telah membuka wacana baru dalam
maka akan sulit untuk regenerasi
pengobatan defek tulang rawan sendi.
karena lambatnya aktivitas mitotik dari
Mesenchymal
kondrosit dan jaringan yang avaskular.
adalah sel multipoten yang dapat
Meskipun dalam kondisi yang ideal,
berdeferensiasi ke dalam beberapa sel
proses perbaikan kerusakan tulang
selama proses penyembuhan cedera
rawan sendi
jaringan. MSCs dapat berdeferensiasi
masih sulit karena
kelainan Sebagai
stem
sistem contoh
mengisolasi dan
cells
(MSCs)
menjadi
collagen,
osteoblast
dipengaruhi oleh TGF-β1, 2, dan 3.
tulang,
kondrosit
Selama proses diferensiasi, dengan
pembentuk
MSC
pembentuk tulang rawan sendi dan
pengaruh
lainnya. Sel itu secara bersama-sama
mensitesis aggrecan,
mempunyai
fibromodulin,
kemampuan
untuk
TGF-β,
akan
link protein,
decorin
meregenerasi kerusakan jaringan yang
chondroadherin,
disebabkan oleh cedera, perubahan
dari matriks kartilago (Russel, 2010).
degenerasi, dan osteoartritis (Vinther, 2003).
Pada
komponen
dan
perkembangan
normal
terbaru
diketahui bahwa growth factor ternyata Diferensiasi
berbagai
jaringan
MSC
menjadi
seperti
tulang,
memegang peranan penting dalam melakukan
regenerasi
jaringan
kartilago dan lemak telah dipelajari
termasuk tulang rawan sendi. Tetapi,
oleh banyak laboratorium. Seperti telah
penjelasan tentang bekerjanya senyawa
dijelaskan sebelumnya, stimulus dan
ini pada kondrosit belum dipaparkan
lingkungan
akan
secara utuh, namun nampaknya hal ini
menentukan diferensiasi MSC menjadi
berhubungan dengan tempat reseptor
sel yang spesifik (Guilak, 2006).
sel
Diferensiasi MSC menjadi kondroblas
bertanggung jawab. Beberapa growth
atau disebut diferensiasi kondroblastik
factor yang sangat berpengaruh dalam
terjadi bila MSC ditumbuhkan pada
tulang
media dengan kondisi yang memenuhi
transforming growth factor-beta (TGF-
syarat tertentu yaitu dalam medium
β), platelet derived growth factor
nutrisi
(PDGF) dan insulin growth factor
yang
yang
tepat
bebas
serum
dan
mengandung komponen TGF-β. Bila
permukaan
pada
rawan
sel
sendi
yang
adalah
(IGF) dan lain-lain (Mankin, 1995).
kondisi ini terpenuhi, MSC akan
Platelet rich plasma selama ini
kehilangan morfologi fibroblastiknya
banyak
dan mulai mengrekspresikan berbagai
intraartikular. Diduga bahan ini dapat
macam
matriks
memperbaiki kerusakan tulang rawan
ekstraseluler. Proses ini melibatkan
karena PRP mengandung berbagai
biosintesis
dan
macam growth factor yang sama
diikuti dengan perubahan morfologi
seperti yang diperlukan oleh MSCs
sel. Pada proses awal kondrogenesis
untuk
terdapat
kondroblas. Salah satu growth factor
struktur
komponen
glikosaminoglikan
perubahan
progresif
kondrotinsulfat
dari yang
digunakan
pada
berdiferensiasi
injeksi
menjadi
penting yang diperlukan adalah TGF-β
Differentiation
Medium
(CDM),
(Guilak, 2006).
medium selanjutnya diganti setiap 3
Tujuan penelitian ini adalah
hari dilakukan inkubasi selama 21 hari
untuk mengetahui pengaruh platelet
dalam suatu inkubator dengan suhu 37◦
rich plasma terhadap mesenchymal
C dengan CO2 5%.
stem cells yang dikultur dengan media pertumbuhan.
Dianalisis
apakah
Pada kultur MSCs diberikan tiga perlakuan yaitu perlakuan pertama,
platelet rich plasma dapat berfungsi
Mesenchymal
seperti
ditambahkan
media
menyebabkan proliferasi
dari
kondrogenik
yang
diferensiasi
dan
MSCs
menjadi
kondroblas.
Medium
Stem
(MSCs)
Complete
(CCM)
Condrosit
Cell
Culture
ditambah
Differentiation
dengan Medium
(CDM) tanpa PRP sebagai kontrol. Perlakuan kedua, Mesenchymal Stem
METODOLOGI PENELITIAN
Cell (MSCs) ditambahkan
Complete
Culture Medium (CCM) ditambah Penelitian
ini
adalah
dengan
Condrosit
Differentiation
eksperimental murni dengan rancangan
Medium (CDM) ditambahkan 5% PRP
penelitian Rancangan Acak Kelompok
dan pada medium ketiga Mesenchymal
(RAK).
Stem
Dilakukan
pengukuran
Cell
(MSCs)
ditambahkan
variabel pada hewan coba hanya
Complete Culture Medium (CCM)
setelah diberikan perlakuan (Pratiknya,
ditambah
2008).
Differentiation Sampel penelitian ini hewan
dengan
ditambahkan
Condrosit
Medium 10%
PRP.
(CDM) Setelah
kelinci putih New Zealand jantan.
dilakukan
Diambil
kelinci
media secara berkala, maka dilakukan
tersebut untuk dibuat platelet rich
harvesting pada hari ke-21. Kemudian
plasma
diukur
di lakukan pencucian pada masing-
Kemudian
masing media kultur dan diferensiasi
darah
(PRP),
konsentrasi
vena
dari
kemudian
plateletnya.
kultur
dan
penggantian
dilakukan kultur Mesenchimal Stem
kondroblas
Cell (MSCs) yang diambil dari Bone
melakukan
Marrow kelinci, ditumbuhkan pada
Histopatologis,
media
jumlah kondroblas yang terbentuk per-
Complete
Culture
Medium
(CCM) ditambah dengan Chondrosite
diketahui
dengan pemeriksaan
yaitu
menghitung
lapang pandang mikroskop.
ALUR PENELITIAN 21 Hari
P
MSCs + CCM
S
CDM +Tanpa PRP
Ganti med/3 hr
Histopatologis
CDM+ 5% PRP
Ganti med/3 hr
Penghitungan jumlah sel (kondroblas)
Ganti med/3 hr hr
CDM+ 10% PRP
MSCs didapatkan peningkatan jumlah
PEMBAHASAN Mesenchymal stem cells (MSC)
kondroblas
yang
dapat diisolasi dari banyak jaringan di
signifikan.
Platelet
tubuh. Saat ini, potensi sel ini pada
mengandung berbagai macam growth
proses
factor
perbaikan
jaringan
dan
regenerasi
musculoskeletal
sedang
yang
diperlukan
terbentuk rich
sama oleh
seperti MSCs
secara plasma
yang untuk
dipelajari oleh banyak kelompok. MSC
berdiferensiasi
ini
untuk
Salah satu growth factor penting yang
dengan
diperlukan adalah TGF-β (Guilak,
memiliki
berdiferensiasi
potensi sesuai
lingkungannya. Sel ini tidak memiliki
menjadi kondroblas.
2006).
karakteristik jaringan yang spesifik
Platelet rich plasma (PRP) adalah
tetapi di bawah stimulus yang tepat sel
autoloug product yang diproduksi dari
ini bisa berdiferensiasi menjadi sel
whole blood melalui proses centrifuge
yang spesifik (Barry, 2001).
gradient
yang
tinggi
mempunyai
Pada penelitian ini didapatkan
konsentrasi platelet yang tinggi dalam
bahwa
penambahan
volume plasma yang rendah. Platelet
platelet rich plasma (PRP) pada kultur
rich plasma berfungsi mempercepat
hasil
dengan
regenerasi endotelial, epitelial, dan
growth
epidermal, menstimuli angiogenesis,
derived angiogenesis factor (PDAF),
merangsang
collagen,
insulin growth factor-1 (IGF-1), dan
mempercepat penyembuhan jaringan
platelet factor-4 (PF-4). Faktor-faktor
lunak, menurunkan jaringan parut pada
pertumbuhan
kulit, mempercepat respon homeostasis
regenerasi kartilago
pada
efek
Peran dari PRP pada diferensiasi
luka
kondroblas telah ditunjukkan pada
yang disebabkan oleh glukokortikoid
studi in vitro yang dilakukan oleh
Tingginya konsentrasi lekosit pada
Weibrech. Weibrech mengamati efek
platelet rich plasma menambah efek
mitogenik
anti mikrobal. Selain itu platelet rich
kondroblas. Annunziata dan Lucarelli
plasma
menunjukkan
sintesa
cedera,
melawan
penghambatan
penyembuhan
dikenalkan
sebagai
suatu
factor
(PDEGF),
ini
dari
platelet-
berperan
dalam
(Song, 2006).
PRP
pada
peningkatan
sel
pada
produk autolog darah yang tidak
pertumbuhan dan diferensisasi pada
memiliki
kartilago periodontal yang ditunjukkan
efek
penularan
penyakit
(Fuller, 2002).
oleh
Platelet-rich
aktivitas
(PRP)
alkalinfosfatase dan ekspresi kolagen
mengandung
tipe II. Efek mitogenik dari PRP
banyak komponen faktor pertumbuhan
diduga berhubungan dengan perananan
adalah
factor
sebagai
media
yang
aplikasi
kesehatan.
Plasma
peningkatan
baru
Komponen
di
dunia
pertumbuhan
atau
growth
yang
factors. PRP juga mengandung plasma
terkandung dalam PRP antara lain
dan thrombin yang memiliki efek
adalah platelet-derived growth factor
biologis
(PDGF), transforming growth factor β-
penyembuhan dan regenerasi kartilago
1dan β-2, platelet-derived epidermal
(Guilak, 2006).
yang
berperan
dalam
Media yang digunakan adalah
diberikan perlakuan sehingga bisa
MSC dari kelinci yang dikultur secara
berproliferasi menjadi sel atau jaringan
in vitro untuk diberikan tiga perlakuan
yang
yang beda yaitu pemberian TGF-β1,
berproliferasi menjadi kondroblas pada
PRP dengan kadar lima persen dan
penelitian-penelitian
sepuluh persen. Bahan tersebut akan
sebelumnya digunakan beberapa media
dibiarkan selama jangka waktu tertentu
yaitu high density pellet culture, serum
untuk memberikan kesempatan bagi
free media, dexamethasone, askorbat,
MSC berproliferasi menjadi sel yang
Transforming Growth Factor-β, dan
diharapkan yaitu kondroblas. Hasilnya,
Bone Morphogenic Protein. Dalam
tidak ada perbedaan yang signifikan
perkembangannya
juga
pada
diketahui
signaling
pathway
berperan
pada
ketiga
dalam
kelompok
jumlah
percobaan
kondroblas
yang
dikehendaki
peneliti.
Untuk
in
vitro
sudah
proliferasi
MSC
terbentuk. Hal ini menunjukkan bahwa
menjadi kondroblas
PRP mengandung bahan-bahan yang
WISP-3/Wnt
dibutuhkan MSC untuk berproliferasi
interaksi matriks ekstraselular kartilago
menjadi
sendi dan Sox-9 (Russel, 2010).
kondroblas
(Hardingham,
1997).
signaling,
Induksi MSC memiliki potensi yang
sangat menjadi
besar sel.
untuk
berproliferasi
Penelitian
yaitu
yang
SMAD, MAPK,
proliferasi
menjadi
kondroblas
beberapa
faktor.
MSC
dipengaruhi
Sebagai
contoh,
rekayasa
kondisi kultur yang kondusif bagi
jaringan semakin berkembang pesat
MSC untuk berproliferasi menjadi
setelah
untuk
kondroblas
adalah
mengisolasi MSC dari makhluk hidup
konsentrasi
trombosit
atau hewan coba untuk dikultur dan
tinggi dengan media bebas serum yang
ditemukan
cara
media darah
dengan yang
mengandung protein dan growth factor
dengan
yang spesifik. Kelompok Transforming
homeostasis kartilago sendi manusia.
Growth
Factor-β
dan
turunannya
Wnt
juga
terlibat
dalam
Mutasi pada Wnt1-inducible signalling
seperti Bone Morphogenic Protein.
pathway
TGF-β1 awalnya sering digunakan
diasosiasikan
pada
progresive pseudorhematoid dysplasia.
media kultur
penginisiasi
MSC sebagai
protein
3
(WISP-3)
dengan
kelainan
proliferasi
kondroblas,
Pasien dengan kelainan tersebut akan
sekarang
TGF-β3
mengalami kerusakan kartilago sendi
meskipun menunjukkan
hasil
yang
lebih
secara
progresif
seiring
dengan
meyakinkan sebagai inisiator aktivitas
bertambahnya umur disertai kerusakan
proliferasi kondrogenik MSC. Anggota
pada tulang. Protein WISP termasuk
lain dari kelompok TGF-β1 yaitu
dalam kelompok yang sama dengan
BMP-6 mampu meningkatkan ukuran
protein growth factor pada jaringan
dan
karena
ikat yang diregulasi oleh TGF. WISP-3
meningkatkan
diekspresikan pada kartilago sendi dan
produksi matriks proteoglikan. BMP-2
Wnt lain yaitu Wnt 11 diekspresikan
dan BMP-9 juga digunakan dalam
pada
kultur MSC tiga dimensi sebagai
Keduanya mengalami up-regulation
induksi dari proliferasi kondrogenik
pada saat kondrogenesis dari MSC
(Koschell, 2004).
sehingga
berat
media
kemampuannya
kultur
Selain growth factor, terdapat signaling berhubungan
pathway dengan
yang
juga
saat
pertumbuhan
menunjukkan
kartilago.
keterlibatan
signalling Wnt pada diferensiasi MSC menjadi kondroblas (Song, 2004).
aktivitas
Signaling lain yang terlibat
kondrogenik MSC. Wnt dan protein
dalam proses kondrogenesis MSC
signalling lainnya yang berhubungan
adalah p38 mitogen-activated protein
kinase
(p38
MAPK).
Penelitian
menunjukkan MAPK sebagai target dari
TGF
β-1,
BMP-2
PENUTUP Simpulan
dan
growth/diferentiation factor 5 (GDF 5) dalam diferensiasi kondrogenik pada hewan coba tikus. MAPK yang lain, extracellular signal-regulated kinase (ERK) juga meningkat konsentrasi dan aktivitasnya saat TGF-β ditambahkan pada MSC (Barry, 2001).
Pada disimpulkan
penelitian bahwa
ini
platelet
dapat rich
plasma (PRP) berpengaruh terhadap proliferasi
dan
diferensiasi
mesenchymal stem cell (MSC) menjadi chondroblast. Kadar PRP 5% ataupun 10% berpengaruh terhadap diferensiasi MSC menjadi chondroblast.
PRP memiliki banyak growth factor dalam konsentrasi tinggi setelah diaktivasi
thrombin
dan
kalsium.
Saran Perlu
diteliti
lebih
Growth Factor yang dominan antara
peranan
lain platelet derived growth factor
engineering pada binatang coba.
(PDGFaa,
PDGFbb,
PRP
dalam
lanjut
cartilage
PDGFab),
transforming growth factor beta(TGFβ,
DAFTAR PUSTAKA
TGF-β2),
vascularendothelial
growth factor (VEGF), and epithelial growth
factor
(EGF).
Proliferasi
Barry F, Boynton RE, Liu B, Murphy JM.
(2001).
Chondrogenic
kondrogenik terutama dipengaruhi oleh
differentiation of mesenchymal
PDGF, TGF-β1 dan IGF sehingga
stem cells from bone marrow:
ketiga growth factor inilah yang paling
differentiation-dependent
diteliti kaitannya dengan diferensiasi
expression
MSC (Jiang, 2002).
of
gene matrix
components. Experimental Cell Research, 268, 189-200.
Silbermann M. (1994). The in
BreinanHA, Minas T, Hsu H-P, Nehrer S,
Sledge
(1997).
CB,
Effect
autologous
Spector of
Bruns J, Kersten P, Lierse W, Weiss A,
M.
cultured
chondrocytes
on
vitro
influence
culture
of
conditions
potential
of
different on
sheep
the rib
perichondrium to formhyaline-
repair of chondral defects in a
like
canine model. J.Bone Joint Surg.
glueing materials used for in
1997; 79-A:1439-1451.
vivo graft fixation. J. Virchows
Brittberg M, Lindahl A, Nilsson A, Ohlsson C, Isaksson O, Peterson
cartilage.
Evaluation
of
Archiv. 1994; 424:169-175. Buckwalter JA, Mankin HJ. (1997).
L. (1994). Treatment of deep
An
cartilage defects in the knee with
Lecture.J Bone Joint Surg. 1997.
autologous
79-A; 600-11
chondrocyte
transplantation.N. Engl. J. Med. 1994; 331:889-894.
Instructional
Course
