Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik

Masarykova univerzita v Brně Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Oddělení fyziologie a anatomie rostlin

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik

Bc. Lucie Bakalová

Diplomová práce

Vedoucí diplomové práce: Doc. RNDr. Marie Kummerová, CSc.

Brno, Česká republika, 2008

Děkuji vedoucí diplomové práce Doc. RNDr. Marii Kummerové, CSc. za odborné vedení, podnětnou kritiku a především za ochotu a obětavou pomoc při realizaci mé diplomové práce.


OBSAH Obsah..................................................................................................................................3 Abstrakt...............................................................................................................................6 I. Úvod................................................................................................................................8 II. Přehled literatury............................................................................................................9 2.1. Toxicita kovů a jejich sloučenin..............................................................................9 2.1.1. Kadmium.......................................................................................................9 2.1.2. Zinek.............................................................................................................10 2.2. Znečištění životního prostředí................................................................................11 2.2.1. Atmosféra......................................................................................................12 2.2.2. Hydrosféra.....................................................................................................13 2.2.3. Půda...............................................................................................................14 2.2.4. Znečištění životního prostředí kadmiem.......................................................16 2.2.5. Znečištění životního prostředí zinkem..........................................................18 2.3. Kontaminace rostlin kadmiem a zinkem................................................................19 2.3.1. Mechanizmy příjmu kadmia.........................................................................19 2.3.2. Mimokořenový příjem kadmia.....................................................................20 2.3.3. Interakce........................................................................................................20 2.3.4. Obsah a distribuce kadmia v rostlinách........................................................22 2.3.5. Mechanizmy příjmu zinku............................................................................22 2.3.6. Obsah a distribuce zinku v rostlinách...........................................................23 2.3.7. Interakce kadmia a zinku..............................................................................24 2.4. Fyziologické účinky kadmia a zinku......................................................................26 2.4.1. Symptomy fytotoxicity kadmia.....................................................................26 2.4.2. Genotoxické, cytotoxické a histologické změny vyvolané kadmiem...........26 2.4.3. Vliv kadmia na fyziologické procesy...........................................................27 2.4.3.1. Vliv kadmia na aktivitu enzymů a metabolické procesy.................27 2.4.3.2. Vliv kadmia na fotosyntézu.............................................................28 2.4.3.3. Vliv kadmia na respiraci..................................................................30 2.4.3.4. Vliv kadmia na vodní provoz...........................................................31 2.4.3.5. Vliv kadmia na růst rostlin...............................................................31 2.4.4. Fyziologické účinky zinku............................................................................31

3

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik 2.4.4.1. Nedostatek a nadbytek zinku...........................................................32 2.5 Obranné mechanizmy rostlin...................................................................................34 2.5.1. Obranné mechanizmy rostlin proti těžkým kovům.......................................37 2.5.1.1. Imobilizace.......................................................................................37 2.5.1.2. Exkluze............................................................................................38 2.5.1.3. Syntéza fytochelatinů.......................................................................38 2.5.1.4. Kompartmentace..............................................................................39 2.5.1.5 Stresové proteiny..............................................................................39 2.6. Citlivost rostlin jako testovacích druhů..................................................................40 2.7. Typy testů fytotoxicity............................................................................................44 2.8. Výhody a nevýhody testů fytotoxicity....................................................................49 2.9. Aplikace testů fytotoxicity......................................................................................52 2.9.1. Biomonitoring polutantů...............................................................................52 2.9.2. Hodnocení environmentální mutagenity.......................................................52 2.9.3. Hodnocení toxicity chemických látek...........................................................53 2.9.4. Biomonitoring odpadních vod......................................................................54 2.9.5. Hodnocení kvality sedimentů.......................................................................55 2.9.6. Hodnocení bioremediace..............................................................................56 2.10. Fytoremediace......................................................................................................58 2.10.1. Enzymy, účastnící se degradačních a detoxikačních reakcí v buňce..........59 2.10.2. Využití fytoremediace v praxi.....................................................................60 2.11. Klíčení semen........................................................................................................61 2.11.1. Biochemické změny při klíčení...................................................................62 2.11.2. Klíčivost semen...........................................................................................62 2.11.3. Vnější podmínky klíčení.............................................................................63 2.11.3.1. Voda................................................................................................63 2.11.3.2. Kyslík.............................................................................................63 2.11.3.3. Teplota............................................................................................63 2.11.3.4. Světlo.............................................................................................63 2.11.4. Vnitřní podmínky klíčení............................................................................64 2.11.4.1. Nepropustnost povrchových vrstev pro vodu................................64 2.11.4.2. Nepropustnost povrchových vrstev pro plyny...............................64 2.11.4.3. Mechanická pevnost testy..............................................................64 2.11.4.4. Nevyvinutost embrya.....................................................................65 4

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik 2.11.4.5. Vysoký obsah inhibičních látek v semenech a plodech a hormonální regulace klíčení........................................................65 2.11.4.6. Vlivy mateřské rostliny..................................................................65 2.11.5. Chemické a fyzikální ovlivnění klíčení rostlin...........................................66 III. Materiál a metody.........................................................................................................67 3.1. Rostlinný materiál...................................................................................................67 3.1.1. Heřmánek pravý (Matricaria recutita L.).....................................................67 3.1.2. Třezalka tečkovaná (Hypericum perforatum L.)..........................................68 3.2. Experiment..............................................................................................................70 3.2.1. Test klíčivosti semen....................................................................................71 3.2.1.1. Kultivace.......................................................................................71 3.2.1.2. Hodnocení testu klíčivosti semen a statistické hodnocení dat......71 3.2.2. Test elongace kořene.....................................................................................72 3.2.2.1. Kultivace.......................................................................................72 3.2.2.2. Hodnocení testu elongace kořene a statistické hodnocení dat......72 IV. Výsledky.......................................................................................................................73 4.1. Heřmánek pravý (Matricaria recutita L.)...............................................................73 4.1.1. Klíčivost semen.............................................................................................73 4.1.2. Délka kořene.................................................................................................73 4.1.3. Délka nadzemní části....................................................................................74 4.2. Třezalka tečkovaná (Hypericum perforatum L.)....................................................75 4.1.1. Klíčivost semen.............................................................................................75 4.1.2. Délka kořene................................................................................................75 4.1.3. Délka nadzemní části....................................................................................75 V. Diskuze...........................................................................................................................103 VI. Závěr.............................................................................................................................109 VII. Seznam použité literatury............................................................................................110 VIII. Internetové zdroje......................................................................................................131 IX. Využití experimentální práce v učitelské praxi.............................................................132

5


ABSTRAKT U rostlin heřmánku pravého (Matricaria recutita L.) a třezalky tečkované (Hypericum perforatum L.), které byly kultivovány na světle a ve tmě v Hoaglandově živném roztoku (kontrola), v roztocích se zvyšující se koncentrací zinku (12, 60, 120, 180 μM), v roztoku s 12 μM kadmia a v roztocích s kombinací obou prvků (12 μM Zn + 12 μM Cd ,60 μM Zn + 12 μM Cd, 120 μM Zn + 12 μM Cd, 180 μM Zn + 12 μM Cd), byla hodnocena klíčivost semen a růst klíčních rostlin délkou kořene a nadzemní části. Získané výsledky dokládají významnou inhibici klíčivosti semen, růstu kořene i nadzemní části klíčních rostlin heřmánku a třezalky, které byly vystaveny působení vyšších koncentrací zinku (120, 180 μM), 12 μM Cd a jejich kombinacím (120 μM Zn + 12 μM Cd, 180 μM Zn + 12 μM Cd). Stimulační efekt na klíčivost semen, růst kořene a nadzemní části klíčních rostlin vykazovala kombinace 12 μM Zn s 12 μM Cd a zvláště 60 μM Zn s 12 μM Cd. Výsledky naznačují možný meliorativní vliv zinku na příjem kadmia, pokud je zinek aplikován v přibližně pětinásobné koncentraci. Oba rostlinné druhy (heřmánek pravý, třezalka tečkovaná) reagovaly velmi podobně na stejné zatížení prostředí. Nebyla prokázána rozdílná citlivost mezi testem klíčivosti semen a testem elongace kořene.

Klíčová slova: heřmánek pravý (Matricaria recutita L.), třezalka tečkovaná (Hypericum perforatum L.), test klíčivosti semen, test elongace kořene, kadmium, zinek, antagonismus, synergismus.

6


ABSTRACT The effect of increasing concentration of zinc 12, 60, 120, 180 μM), 12 μM cadmium and their combination (12 μM Zn + 12 μM Cd ,60 μM Zn + 12 μM Cd, 120 μM Zn + 12 μM Cd, 180 μM Zn + 12 μM Cd) on growth and development of camomile (Matricaria recutita L.) and klamath weed (Hypericum perforatum L.) was investigated. We observed germiability, root length and length of above-ground part of plant. Results illustrate the significant inhibition of germiability, reduction of root length and reduction of above-ground part of plant by higher concentration of zinc (120, 180 μM), 12 μM cadmium and their combination (120 μM Zn + 12 μM Cd, 180 μM Zn + 12 μM Cd) at camomile and klamath weed. The concentrations 12 μM Zn + 12 μM Cd and 60 μM Zn + 12 μM Cd stimulated germiability, root length and length of above-ground part of plant. Providing that zinc is applied in approximately fivefold concentration potential meliorative effect of zinc on cadmium uptake was observed. Both plant species (camomile and klamath weed) reacted similary on identical charge of environment. Between test of seed germination and test of root elongation wasn't approved any difference sensitivity.

Keywords: camomile (Matricaria recutita L.), klamath weed (Hypericum perforatum L.), test of seed germination, test of root elongation, cadmium, zinc, synergism, antagonism.

7


I. ÚVOD

Základními složkami vodních a suchozemských ekosystémů jsou vodní a suchozemské vyšší rostliny a řasy. Produkují kyslík a organické látky, na kterých jsou závislé ostatní organizmy (Benenati, 1990). Organizmům, jako jsou bezobratlí, hmyz, ryby, obojživelníci, plazi, ptáci a savci, poskytují rostliny nejen potravu, ale také ochranu (Freemark a Boutin, 1994a). Klíčové postavení rostlin v potravním řetězci a jejich schopnost bioakumulovat chemické látky může mít nepříznivé důsledky pro organizmy na vyšších úrovních potravního řetězce. Rostliny mají rovněž nezastupitelnou roli v procesech cyklů živin a ve stabilizaci půd a sedimentů. Funkce a struktura vodních a suchozemských ekosystémů může být ovlivněna působením toxických látek – xenobiotik. Mezi tyto látky, označované také jako cizorodé látky, rizikové látky, kontaminanty či polutanty, řadíme oxidy dusíku, oxid siřičitý, oxid uhličitý, polétavé prachy, toxické kovy, organické sloučeniny (např. pesticidy, PCBs, PCDDs, PCDFs, PAHs), radionuklidy apod. Vlivem jejich negativního působení, zesíleného akumulací v životním prostředí, může dojít ke změnám v četnosti a distribuci rostlinných druhů, ke snížení primární produkce, k vyčerpání kyslíku, ke zhoršení schopnosti fixovat dusík (Kapustka et al., 1995), ke zvýšení povrchového odtoku a půdní erozi, případně až k degradaci přírodního prostředí. Při hodnocení těchto rizik hraje klíčovou roli enviromentální monitoring a laboratorní testy fytotoxicity (Freemark a Boutin, 1994a), prováděné například na zelených řasách, okřehku a dvouděložných rostlinách. Testy fytotoxicity jsou významným ekotoxikologickým ukazatelem stupně znečištění prostředí. Na rozdíl od monitoringu poskytují fytotoxická data informace o vlivu jednotlivých xenobiotik nebo jejich směsí, umožňují posoudit vliv spolupůsobení vnějších a vnitřních faktorů a citlivost jednotlivých rostlinných druhů. Koncentrace toxikantu lze aplikovat tak, aby překlenovaly přírodní a antropogenní zatížení. I když jsou získaná data důležitá pro hodnocení a predikci environmentálních rizik a nezbytná pro tvorbu kritérií přijímaných regulačních opatření, jsou doposud nedostatečně aplikována např. k stanovení toxicity komerčních chemikálií, městských a průmyslových odpadů atd. Výsledky testů mohou být kromě výše uvedených skutečností využity k hodnocení účinnosti biočistících technologií (při následných rekultivacích), k monitorování průběhu degradace – detoxikace kontaminovaných půd, vod a sedimentů.

8


II. PŘEHLED LITERATURY

2.1. Toxicita kovů a jejich sloučenin

2.1.1. Kadmium Kadmium se do organizmů živočichů dostává vdechováním, spolu s prachovými částicemi nebo trávicí soustavou. Hlavním zdrojem kontaminace živočichů včetně člověka je

akumulace

kadmia

v rostlinných

pletivech

a

následně

v potravním

řetězci.

Bioobohacování potravního řetězce kadmiem je vyšší než u jiných toxických kovů a to především díky jeho vyšší toxicitě, vyšší mobilitě v prostředí a delší době zadržení v organizmu (Gil et al., 1995). Při inhalaci záleží na velikosti vdechovaných částic. Velké částice jsou zachyceny už v horních cestách dýchacích a nedostanou se až do plic, odkud je Cd dobře absorbováno do organizmu. Celkově se podle odhadů inhalační expozicí absorbuje u člověka 10 až 60% Cd. U orální expozice je stupeň absorpce ovlivněn množstvím přijatého Cd (čím vyšší dávka, tím klesá podíl absorbovaného Cd; proces vykazuje známky nasycení). Absorpce je snížena v přítomnosti kationtů některých kovů (Zn2+, Ca2+, Mg2+, Cr3+), což vysvětluje pozorovanou zvýšenou absorpci Cd při jejich nedostatku. Absorpce Cd dále závisí na formě přijímané potravy (nejvyšší je z mléka a z vody), na věku a pohlaví. Celkově se stupeň absorpce odhaduje pro orální expozici na 1 až 6%. Kadmium je kumulativním jedem, jeho obsah v organizmu se věkem zvyšuje a hromadí se zejména v ledvinách a v játrech, kde může vyvolat závažná poškození. K dalším negativním účinkům na lidské zdraví patří změny v imunitním systému nebo poškození kostí (osteomalacie, osteoporosa). Základní způsob vylučování u člověka je močí, nicméně vylučování je velice pomalé (u savců 7 - 40 let), protože většina Cd se nachází přímo ve tkáních, ve kterých je pevně vázáno na methalothionein nebo jinou sloučeninu. Podle Mezinárodní agentury pro výzkum rakoviny (IARC) patří kadmium do skupiny látek s označením 2A – pravděpodobně karcinogenní pro člověka.

9

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik 2.2.2. Zinek Zinek je v malém množství nepostradatelný jak pro živočichy včetně člověka tak pro rostliny. Kontroluje metabolické funkce a činnost enzymatických systémů. Lidské tělo obsahuje asi 2 g zinku. Doporučená denní dávka pro dospělého člověka je 15 mg na den. V případě nedostatku zinku se zvyšuje příjem olova a kadmia organizmem a naopak užívání zinku vede ke snížení obsahu těchto kovů v těle. Zinek tedy představuje jistou ochranu proti škodlivým účinkům znečištěného životního prostředí. Nízké množství zinku v těle se může projevit také v podobě neuropsychických abnormalit, dermatitid a poškození imunitního systému. Vysoká koncentrace zinku v těle může vést ke zdravotním problémům. Inhalace par oxidu zinečnatého vede k tzv. horečce z kovů (únava, bolesti hlavy, kašel, vysoké teploty, bílkoviny v moči).

10


2.2. Znečištění životního prostředí Dlouhodobým a významným problémem je kontaminace ovzduší, půd, vod a sedimentů xenobiotiky. Tyto látky, často označované i jako cizorodé látky, rizikové látky, kontaminanty nebo polutanty, nejsou přirozenou složkou životního prostředí, ale byly uměle syntetizovány člověkem. Řada těchto sloučenin ještě donedávna patřila díky svým výhodným fyzikálně-chemickým vlastnostem mezi látky průmyslově významné. Mnohem později bylo zjištěno, že se jedná o perzistentní a toxické látky, které se hromadí v životním prostředí, mohou pronikat do potravních řetězců a tak ohrožovat lidské zdraví. Mezi hlavní sloučeniny, které dnes negativně působí na životní prostředí, je možno zařadit oxidy dusíku, oxid siřičitý, oxid uhelnatý, polétavé prachy, toxické kovy, organické sloučeniny (např. pesticidy, PCBs, PAHs, dioxiny), radionuklidy apod. ,,Těžké“ kovy jsou definovány jako prvky, jejichž specifická hmotnost je větší než 5,0 g.cm-3. Jedná se o následující prvky: La, Ce, Pr, Zr, Hf, Th, V, Nb, Ta, Cr, Mo, W, U, Mn, Re, Fe, Co, Ni, Rh, Ru, Pd, Os, Ir, Pt, Cu, Ag, Au, Zn, Cd, Hg, Ga, In, Tl, Ge, Sn, Pb, As, Sb, Bi, Te. Pojem „těžké kovy“ není zcela ustálený, neboť běžně používané hmotnostní kritérium neplatí pro kovy jako je hliník nebo selen. Proto je vhodnějším označením pojem ,,toxické kovy“. Vzhledem k širokému a stoupajícímu uplatnění kovů a jejich sloučenin v průmyslu vzrůstá i jejich hromadění v přírodě a to především proto, že tvoří nedegradovatelný odpad s vysokým bioakumulačním potenciálem. Mnohé z kovů jsou však v malých koncentracích důležité nebo dokonce nepostradatelné pro živé organizmy. Jsou součástí metaloenzymů (karboxyláza obsahuje Mg, kataláza a peroxidáza Fe, superoxiddismutáza a laktáza Cu). Kovy na jedné straně katalyzují v malých množstvích důležité biochemické reakce v organizmech, na straně druhé vyvolávají vážná onemocnění a poškození různých orgánů. Za mimořádně nebezpečné je třeba považovat zejména ty kovy, které se váží na –SH skupiny enzymů nebo na aminokyseliny (Hg, Pb, Cd, As, Se a další). Při bioakumulaci kovů často dochází ke změnám fyzikálně-chemických vlastností, například k redukci nebo oxidaci (As, Mn, Se, Te), ale i k metylaci (Hg, Cd, Pb, Sn, Te), čímž se významně mění jejich toxicita. Ve směsích se toxické účinky jednotlivých kovů mohou vzájemně zesilovat (synergismus; např. Ni + Zn, Hg + Cu), ale také zeslabovat (antagonismus; např. Se + Cd, Se + Hg).

11

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik 2.2.1. Atmosféra Atmosféra je rezervoár řady plynů, par, pevných partikulí a nabitých částic. Přes malou hmotnost způsobenou plynným složením má atmosféra značnou pohyblivost, takže dochází ke snadné disperzi a distribuci látek. Zdrojem znečištění atmosféry toxickými kovy jsou především průmyslová centra, doprava, hutnický průmysl, spalovací procesy a domácí topeniště. Mezi kovy, u kterých byly stanoveny imisní limity (tabulka 1) a jejichž obsah v ovzduší je monitorován, patří As, Cd, Ni, Pb. Z monitoringu kovů v ovzduší je patrné, že za posledních několik let došlo k snížení emisí Pb, Cd, Hg (tabulka 2). Výrazné snížení emisí Pb bylo způsobeno postupným snižováním a od 1. 1. 2001 úplným zastavením prodeje olovnatého benzínu. K opakovanému překročení imisních limitů dochází pouze u As a Cd v lokalitě Tanvald.

Tabulka 1 Imisní limity vybraných toxických kovů v České Republice Prvek

Imisní limit (μg.m-3)

As

6

Cd

5

Ni

20

Pb

500

Tabulka 2 Vývoj emisí toxických kovů v letech 1990 – 2004 v České Republice Rok

Pb (t.rok-1)

Cd (t.rok-1)

Hg (t.rok-1)

1990

241,4

4,3

7,5

1995

203,7

3,6

7,4

2000

105,7

2,9

3,8

2001

46,7

2,6

3,3

2002

47,2

2,7

2,8

2003

47,2

2,3

1,8

2004

36,6

2,4

2,1

Zdroj: Zpráva o životním prostředí 2005

12

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik 2.2.2. Hydrosféra Hlavním zdrojem znečištění toxickými kovy jsou odpadní vody z těžby a zpracování rud a splachy z polí. Dalším zdrojem jsou atmosférické srážky znečištěné exhalacemi, které vznikají při spalování fosilních paliv a výfukovými plyny motorových vozidel. Ve vodě jsou kovy (zejména Pb, Hg, Cd) přítomny buď jako kationty, anionty nebo ve formě komplexních anorganických a organických sloučenin. Anorganické a organické nerozpustné nebo méně rozpustné komplexy jsou zpravidla méně toxické než ionty. Distribuce výskytu různých chemických forem kovů ve vodách závisí na chemickém složení vody, zejména na hodnotě pH a obsahu některých aniontů, které mohou tvořit stabilnější komplexní sloučeniny (Reczynska-Dutka, 1986). Od roku 1989 došlo k zlepšení kvality vod v ČR až o 70%. Může za to zejména pokles vypouštěných odpadních vod v důsledku rozšíření sítě čističek odpadních vod. Přesto zůstává silně znečištěna asi 1/3 toků. Jedná se především o řeky s menší vodnatostí v blízkosti významných průmyslových závodů (Labe pod Lysou nad Labem a pod Štětín (papírna) a Lovosicemi (Lovochemie), úsek Vltavy pod Lužnicí (nádrž Orlík), úsek Odry pod Jičínkou a Moravy pod Uherským Hradištěm). Koncentrace toxických kovů vykazují na všech sledovaných profilech klesající trend. Ojediněle jsou limity koncentrací překračovány také na řece Litavce, na Nise nebo na Střele v Borku.

Tabulka 3 Přípustné hodnoty obsahu toxických kovů v odpadních vodách vypouštěných z vybraných průmyslových odvětví v České Republice Těžba a zpracování rud Prvek As

Obsah (mg l-1) 0,50

Cu

1,00

Fe

5,00

Pb

0,50

Zn

3,00

13

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik Barevná metalurgie Prvek

Obsah (mg l-1)

Al

3,00

Cr

0,50

Cu

0,50

Hg

0,10

Ni

0,50

Pb

0,50

Spalování odpadů Prvek

Obsah (mg l-1)

As

0,15

Cd

0,05

Cr

0,50

Cu

0,50

Hg

0,03

Ni

0,50

Pb

0,20

Tl

0,05

Zn

1,50

Zdroj: Nařízení vlády č. 61/2003 Sb.

2.2.3. Půda Cizorodé látky se mohou dostávat do půdy zemědělskou činností (hnojiva, čistírenské kaly). V poslední době výrazně stouplo množství kovů, které se do půdy dostávají imisemi (Angelova et al., 2004). Velkým problémem jsou také kyselé deště, zvyšující dostupnost toxických kovů pro rostliny (Kastori et al., 1992). Půda, na rozdíl od ovzduší a vody, zůstává zdrojem některých toxických kovů desítky a stovky let i po odstranění zdroje znečištění, neboť toxické kovy jsou v porovnání s většinou organických látek v biologických systémech nedegradabilní a hromadí se v povrchových vrstvách půdy a v sedimentech toků. Mohou vstupovat do různých článků potravních řetězců. Mnohé druhy nižších a vyšších rostlin specificky reagují již na nízké koncentrace toxických látek v prostředí a slouží na monitorování výskytu xenobiotik. 14

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik Stanovení obsahu rizikových prvků v půdě se provádí ve výluhu 2M HNO3 a od roku 1998 i v extraktu lučavky královské. Maximální přípustné hodnoty obsahu rizikových prvků v půdě jsou uvedeny v tabulkách 4 a 5. V současné době dochází u analyzovaných prvků k překročení platných limitních hodnot především u lehkých půd (Cd – o 8,7%, Cr – o 7,6% a Ni – o 3,9%). Nejvyšší procento nadlimitních vzorků u ostatních půdních druhů bylo zjištěno u As a to v 4,6% případů.

Tabulka 4 Maximálně přípustné hodnoty obsahu rizikových prvků v půdách (výluh roztokem 2 M HNO3 při poměru půdy k vyluhovadlu 1 : 10) v České Republice Prvek As Be Cd Co Cr Cu Hg Mo Ni Pb V Zn

Obsah v lehkých půdách (mg.kg-1) 4,5 2,0 0,4 10,0 40,0 30,0 -5,0 15,0 50,0 20,0 50,0

Tabulka 5 Maximálně přípustné hodnoty lučavkou královskou) v České Republice Prvek As Be Cd Prvek Co Cr Cu Hg Mo Ni Pb V

Obsah v ostatních půdách (mg.kg-1) 4,5 2,0 1,0 25,0 40,0 50,0 -5,0 25,0 70,0 50,0 100,0

obsahu rizikových prvků v půdách (rozklad

Obsah v lehkých půdách (mg.kg-1) 30,0 7,0 0,4 Obsah v lehkých půdách

Obsah v ostatních půdách (mg.kg-1) 30,0 7,0 1,0 Obsah v ostatních půdách

(mg.kg-1) 25,0 100,0 60,0 0,6 5,0 60,0 100,0 150,0

(mg.kg-1) 50,0 200,0 100,0 0,8 5,0 80,0 140,0 220,0

15

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik Zn

130,0

200,0

Zdroj: Vyhláška č.13/1994 Sb.

2.2.4. Znečištění životního prostředí kadmiem Mezi přirozené zdroje kadmia v životním prostředí patří vulkanická činnost, lesní požáry nebo mořský aerosol. Zdrojem znečištění ovzduší kadmiem jsou průmyslové oblasti, spalování uhlí, odpadu a pohonných hmot. Z globálního hlediska hlavním zdrojem aerosolů kadmia jsou spalovací procesy, při nichž vzniká především CdO a následuje CdS, CdCl2, CdSO4 (http://www.piscac.cz/ETD/). Částice z ovzduší obsahující kadmium dopadají na povrch půd a rostlin jednak jako prach (suchá depozice), nebo spolu s deštěm a sněhem (mokrá depozice). Suchá depozice ulpívá na povrchu listů, dochází k zneprůchodnění průduchů a tím i k ovlivnění procesů fotosyntézy, transpirace a respirace. Kyselé deště s pH nižším než 3 a vysokým obsahem iontů hrají důležitou roli v cyklaci a recyklaci kadmia v různých ekosystémech, neboť ovlivňují jeho rozpustnost a dostupnost pro rostliny. Nepřímo se kadmium dostává do atmosféry větrnou erozí kontaminované půdy po aplikaci čistírenských kalů a hnojení fosfáty. Od počátku 90. let došlo k poklesu průměrných ročních koncentrací Cd v České Republice. K překročení imisního limitu 5 mg. m3 dochází pouze v oblasti měst Tanvald

a

Jablonec nad Nisou. V obou městech se nachází průmyslové závody, používající kadmium během výrobního procesu (sklárny – barvení skla). Hlavním zdrojem znečištění vod jsou odpadní vody z těžby a zpracování rud, z hutí, válcoven, z povrchové úpravy kovů, z chemického, textilního a fotografického průmyslu a ze zemědělství (fosfátová hnojiva). Kadmium se může vyluhovat také z potrubí vyrobeného z plastů, protože bývá součástí jejich stabilizátorů. Z ovzduší se kadmium dostává do vod prostřednictvím srážek znečištěných exhalacemi. Kadmium se ve vodě vyskytuje především ve formě Cd2+ · 6H2O a případně v iontovém komplexu s některými částicemi (OH−, Cl−, (SO4)

2−

, huminovou kyselinou).

Vzhledem k toxicitě kadmia musí být jeho obsah přísně sledován. Nejvyšší mezní hodnota kadmia v pitné vodě stanovená v zákoně č 258/2000 Sb., který byl novelizován zákonem 320/2002 Sb., zákonem 274/2003 Sb. a vyhláškou 187/2005 Sb., je 5,0 µg.dm−3. Pro povrchové vody je limit stanoven nařízením vlády ČR č. 61/2003 Sb. na 1,0 µg.dm−3. 16

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik Lidská aktivita je příčinou zvýšeného obsahu kadmia v půdách a následné v zemědělských plodinách.

Některá průmyslová fosforečná hnojiva mohou obsahovat

stopová množství kadmia ve vysoce rozpustných a pro rostliny přijatelných formách. Nemusí jít jen o hnojiva průmyslová, ale i hnojiva statková vyráběná buď z kontaminované slámy nebo i ze zeleného hnojení pěstovaného na půdách s vysokým obsahem toxických kovů. Důležitým zdrojem kadmia jsou také čistírenské kaly, vzniklé při biologickém čištění odpadních vod z průmyslu prostřednictvím bakterií. Kvůli vysokému obsahu dusíku se používají v zemědělství na zvýšení úrodnosti půd. Musí být ovšem přísně monitorován obsah toxických kovů. Limity stanovené vyhláškou č. 382/2001 Sb. udávají mezní hodnotu pro obsah kadmia 5,0 mg.kg−1 sušiny. Přirozený obsah kadmia v půdě se mění podle matečné horniny, rychlostí zvětrávání a následného transportu. Dle odhadů Wagnera (1993), nekontaminované půdní roztoky obsahují koncentrace kadmia v rozsahu 0,04 až 0,32 µM. Půdní roztoky, které mají koncentraci kadmia v rozmezí 0,32 až 1,0 µM, jsou označeny za mírně znečištěné. V půdním roztoku obsahujícím koncentraci kadmia vyšší jak 35 µM jsou schopné růst pouze Cd-hyperakumulující druhy. U vyšších rostlin se jedná například o zástupce z rodu Brassicaceae penízek modravý (Thlaspi caerulescens J. et C. Presl) (Brown et al. 1995). Průměrný obsah Cd v půdách se pohybuje v rozmezí 0,01 až 1,1 mg.kg−1. V půdách ČR je (mimo zdroj kontaminace) běžný obsah kadmia 0,2 až 1,5 mg.kg−1. Kadmium se v půdě kumuluje nejvíce ve vrstvě 0 – 5 cm a s přibývající hloubkou jeho koncentrace klesá.

V půdě existují následující formy kadmia (Bruemmer et al., 1986): • rozpuštěné ve vodě • výměnné • organicky vázané • vázané na oxidy Fe a Mn • ve formě definovaných sloučenin (karbonáty, fosforečnany, sulfidy) • vázané ve struktuře silikátů (tzv. reziduální frakce) Převládající forma kadmia v půdním roztoku rozhoduje o jeho mobilitě a dostupnosti pro rostliny (Angelova et al., 2004). Sloučeniny toxických kovů v dusičnanové formě jsou méně toxické oproti formám chloridovým nebo síranovým. Na dostupnosti kadmia pro rostliny může mít vliv i převládající forma dusíku v půdním roztoku. Wu et al (1989) zjistili,

17

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik že dostupnost kadmia byla snižována přídavkem (NO3)−, zatímco se prudce zvyšovala v přítomnosti (NH4)+.

2.2.5. Znečištění životního prostředí zinkem Mezi zdroje znečištění prostředí zinkem patří pokovování, pigmenty do barviv a keramických glazur, zemědělství a komunální odpad. Ve vodách zinek často doprovází kadmium. Nejvyšší mezní hodnota zinku v pitné vodě stanovené v zákoně č 258/2000 Sb., který byl novelizován zákonem 320/2002 Sb., zákonem 274/2003 Sb. a vyhláškou 187/2005 Sb., je 5,0 mg.dm−3. Pro povrchové vody je limit stanoven nařízením vlády ČR č. 61/2003 Sb. na 200,0 µg.dm−3. Obsah zinku se v půdě pohybuje od 10 do 300 ppm. Z půdního roztoku je pro rostlinu přístupno často méně než 1 ppm. Zinek se v půdě vyskytuje v minerálech, Zn-sulfidu, Znoxidu, Zn-karbonátu, Zn-fosfátu atd. Je absorbován na oxidy železa nebo se vyskytuje ve formě chelátových komplexů. Rostliny jsou schopny přijímat zinek ve formě Zn2+, chelátu a nevylučuje se i možnost příjmu ve formě (ZnCl)+, (Zn(NH3)4)2+ nebo z alkalických půd ve formě (ZnO3)2-. Přídavek zinku (400 – 500 μg.g-1) často snižuje příjem kadmia rostlinami (Smith et Giller, 1992). Limity stanovené vyhláškou č. 382/2001 Sb. udávají mezní hodnotu pro obsah zinku 2500 mg.kg−1. K překročení těchto hodnot dochází především v oblastech průmyslových závodů.

2.3. Kontaminace rostlin kadmiem a zinkem 2.3.1. Mechanizmy příjmu kadmia Kadmium je rostlinami přijímáno převážně kořeny, existuje však i mimokořenový příjem kadmia přímo z atmosféry prostřednictvím znečištěného povrchu listů. Příjem kadmia kořeny rostlin je v lineární závislosti na koncentraci iontu Cd2+ V živném roztoku (Domažlická et Opatrný, 1989). Pohyb kadmia ke kořenům se děje difúzí a hromadným tokem. V bezprostřední blízkosti kořenů dochází k chelataci kovu organickými kyselinami vylučovanými rostlinou, zvyšuje se difuzní gradient a urychluje příjem prvku (Mullins et Sommers, 1986). Mechanizmy příjmu kadmia buňkami kořene:

18

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik •

výměnná absorpce - kadmium je snadno zaměnitelné s kovy tranzitního typu (Zn, Cu). Při výměnné absorpci kationty reagují se záporně nabitými částmi střední lamely buněčných stěn, které jsou pektinové povahy (Wolterbeek, 1987);

•

ireverzibilní nemetabolická fixace v buněčné stěně - tento mechanizmus příjmu kadmia představuje do určité míry bariéru vstupu do cytoplazmy buněk a redukuje tak jeho toxické působení;

•

difúze - dlouhou dobu označená jako zdroj hromadění kadmia v rostlinách. Cutler et Rainds (1974) aktivní příjem nepředpokládali, ale již v roce 1987 Checkai el

al. zjistili při sledování kinetiky příjmu nízkých koncentrací kadmia absorpční izotermy charakteristické pro metabolicky zprostředkovaný příjem. V současné době se předpokládá, že příjem iontů kadmia je uskutečňován v kompetici s některými transmembránovými přenašeči prvků jako je draslík (K), vápník (Ca), hořčík (Mg), železo (Fe), mangan (Mn), měď (Cu), zinek (Zn), nikl (Ni) (Basic et al., 2006). Příjem kadmia a jiných kovů rostlinami může být ovlivněn také mykorrhizou. Ektomykorrhizní symbióza může hrát rozhodující roli v ochraně kořenů rostlin před vlivem toxických kovů. Byla zjištěna velká druhová specifila i velká specifita vůči jednotlivým kovům. Například ektomykorrhizní houba čechratka podvinutá (Paxillus involutus Batsch) „brání vstupu" zinku a tím snižuje jeho obsah v borovici lesní (Pinus silvestris L.), zatímco jiný druh houby, plesňák zemní (Thelephora terrestris Ehrh.), „zadržuje" zinku málo a tím dochází ke zvýšení obsahu Zn v pletivech hostitele (Hall, 2002). Byl prokázán také vliv dalších typů mykorrhizy na příjem zinku. Například arbuskulární mykorrhizní kolonizace kořenů jetele lučního (Trifolium pratense L.) zvyšuje absorpci Zn a jeho akumulaci v kořenech (Chen et al., 2003). Mechanizmus, který využívají houby na buněčné úrovni k toleranci vůči kovům, je patrně podobný mechanizmům, které používají vyšší rostliny. Jde především o zabudování kovů do extracelulárních sloučenin nebo vakuolární kompartmentaci. Rozdíly v mechanizmech exkluze mezi jednotlivými druhy hub jsou zřejmě dány významnými rozdíly mezi specifickými interakcemi houba/rostlina. Měcháč písečný (Pisolithus tinctorius Pers.), tolerující Cu a Zn, akumuluje tyto kovy v extrahyfovém slizu, zatímco čechratka podvinutá (Paxillus involutus Batsch) Cd akumuluje v buněčných stěnách a ve vakuole (Hall, 2002). Rostliny z čeledi vřesovcovité (Ericaceae) zabudovává kovy v mykorrhizních kořenech na karboxylové skupiny v prostoru mezi houbou a hostitelem. Jak již bylo dříve řečeno, procesy příjmu kadmia závisí na koncentraci iontu v prostředí, jeho formě a době působení, hodnotě pH prostředí (Florijn et Van Beusichem, 1993), obsahu organických a dalších komplexotvorných látek, interakci s dalšími prvky, 19

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik podmínkách prostředí (teplota půdy, obsah vody, oxido-redukční potenciál) a také v neposlední řadě na druhu rostliny. Vliv organických kyselin na dostupnost kadmia byl studován u rostlin pšenice seté (Triticum aestivum L.). Bylo prokázáno statisticky významné zvýšení akumulace kadmia v přítomnosti zvyšujících se koncentrací organických kyselin. Interakcí kadmia a organických kyselin vznikají, dle autora, komplexy, které jsou mobilní a pro rostliny přístupné. Z výsledků je patrno, že aminokyseliny jsou méně efektivní v mobilizaci kadmia ve srovnání s karboxylovými kyselinami (Nigam et al., 2000). 2.3.2. Mimokořenový příjem kadmia Při studiu mimokořenového příjmu kadmia bylo zjištěno, že povrchová kontaminace rostlin zvyšuje obsah kadmia v rostlinách o 0,02 - 0,40 μg Cd g-1 sušiny, což je 20 – 60% z celkového obsahu kadmia v rostlinách. Harrisson et Chirgawi (1989) se zabývali transportem kadmia do zeleniny v polních podmínkách. Prokázali, že 69-94% kadmia se do rostlin dostává z půdy, zbytek spadem atmosférických nečistot. Při použití aerosolu Cd(NO 3)2 bylo prokázáno, že dochází k transportu kadmia do orgánů a částí rostlin, které nebyly kontaminovány aerosolem (kořen mrkve, vnitřní listy salátu), což dokazuje mimokořenový příjem kadmia a jeho následnou translokaci. Nízký příjem toxických kovů z ovzduší mají především obiloviny a luskoviny, zatímco vysoký příjem je u trav a jetelovin. 2.3.3. Interakce Toxické kovy způsobují změny v obsahu ostatních prvků v rostlině. Mohou vyvolávat také nadměrné hromadění nebo výdej prvku. Zvláště kadmium může interferovat s nezbytnými základními živinami například kompeticí v příjmu a tím narušovat výživu rostlin (Brune et Dietz, 1995). Zvýšené koncentrace kadmia (0,3 a 1,0 mg dm-3) v živném roztoku způsobily u rostlin bobu obecného (Faba vulgaris Moench.) a hrachu setého (Pisum sativum L.) snížení obsahu K, u rostlin rýže seté (Oryza sativa L.) a kukuřice seté (Zea mays L.) snížení obsahu Mg. V kořenech pokusných rostlin byl vlivem kadmia zvýšen obsah Cu a Mo (Obata et Umebayashi, 1997). Změny v obsahu jednotlivých prvků byly zjištěny i u dřevin. Například zvýšený obsah kadmia v lesních půdách (100 mg kg-1) snížil u klíčních rostlin borovice lesní (Pinus sylvestris L.) obsah

K v jehlicích a Ca ve stonku (Kim et al., 2003).

Důležitou roli v příjmu živin má aktivita H +/ATP-áz. Kadmium v koncentraci 10 až 100 μM působí inhibičně na H+/ATP-ázovou aktivitu plazmatické membrány, což ovlivňuje příjem a výdej mnoha prvků (Pavlovkin et al., 2006). Dle autora může kadmium ovlivňoval i

20

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik jiné membránové proteiny než je H+/ATP-áza a K+- transportní kanál. Může reagovat také s fosfáty, které jsou součástí fosfolipidové membrány. Příjem kovů rostlinami může být ovlivněn rovněž prostřednictvím interakce s některými mikroelementy. Řada prací je věnována studiu interakce kadmia a zinku a to zejména vzhledem k jejich chemické příbuznosti. Z výsledků vyplynulo, že přídavek zinku do živného prostředí snižuje příjem kadmia rostlinami (Hart et al., 2005), ovšem výjimkou nejsou ani názory, že mechanizmy příjmu kadmia a zinku jsou na sobě nezávisle. Při nízkých koncentracích obou prvků se předpokládá, že interakce Cd a Zn je založena na jevu kompetitivní inhibice, kdy kadmium a zinek soutěží nejen o vazebná místa v půdě, ale i o podobná aktivní centra přenašečů; ionty obou kovů mají přibližně stejnou elektronegativitu, liší se však iontovým poloměrem (Zn2+ = 0,074 nm, Cd2- = 0,097 nm), což by mohla být jedna z příčin, proč se rostliny vyznačují selektivitou pro zinek (Abdel-Sabour et al., 1988). Pokud koncentrace jednoho prvku překročí kritickou hranici toxicity je převažující synergismus, i když koncentrace jednoho prvku je netoxická (Sharma et Agrawal, 2006). Aplikace nízkých dávek zinku redukovala akumulaci kadmia v nadzemních částech rostlin sojového bobu (Glycine max L.) o 40-50%, oproti rostlinám, které byly vystaveny pouze působení kadmia. Při aplikaci vysokých dávek zinku do půd, které byly kontaminovány kadmiem, byl prokázán zvýšený příjem a akumulace kadmia

v nadzemních částech až o 42%. U těchto rostlin bylo

zjištěno snížení obsahu zinku přibližně o 35%. Nízká koncentrace kadmia neovlivnila akumulaci zinku v pletivech testovaných rostlin (Shute et Macfie, 2006). V současné době je meliorativnímu působení zinku na fytotoxicitu způsobenou kadmiem věnována značná pozornost.

2.3.4. Obsah a distribuce kadmia v rostlinách Přijaté kadmium může být transportováno do xylémových částí svazku cévního apoplastickou nebo symplastickou cestou, v komplexu s několika ligandy jako jsou organické kyseliny a pravděpodobně fytochelatiny (Sanità di Toppi et Gabbrielli, 1999). Nejvyšším obsahem kadmia se zpravidla vyznačují pletiva kořenů (60-88%), následují listy (15%), stonky (10-15%), plody a zásobní orgány. Nejnižší obsah Cd mají semena (Král'ová et Masarovičová, 2003). U některých druhů rostlin je však uváděn nejvyšší obsah kadmia v listech, např. u rodu tabák (Nicotiana), což je z hygienického a komerčního hlediska zcela nežádoucí (Clarke et Brennan, 1989). Mench et al. (1989) uvádějí, že u tabáku selského (Nicotiana rustica L.) je do listů transportováno 75% přijatého kadmia a u tabáku virginskeho 21

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik (Nicotiana tabacum L.) dokonce 81%. U rostlin kukuřice seté (Zea mays) se kadmium v kořenech vázalo především na pektinové části buněčné stěny, kdežto u rostlin fazolu obecného (Phaseolus vulgaris L.) a bobu setého (Vicia faba L.) bylo kadmium akumulováno především ve vakuole, jádře, plastidech a cytoplazmě (Vazquez et al., 1992). Vazba kadmia s cheláty v buňce přispívá k detoxikaci a omezení jeho transportu v rostlině. Změny v xylému vyvolané kadmiem, případné blokování jeho částí, může přispívat k omezení transportu živin z kořenů do nadzemních částí (Gussarsson, 1994). Stupeň tolerance rostlin ke kadmiu a míra schopnosti tento prvek akumulovat závisí na rostlinném druhu. Rostlinné čeledi lze rozdělit do tří skupin (Cibulka et al., 1991): •

s nízkou akumulací kadmia - bobovité (Fabaceae);

•

se střední

akumulací

kadmia - lipnicovílé (Poaceae),

liliovité (Liliaceae),

tykvovité (Cucurbitaceae); •

s vysokou akumulací kadmia - brukvovité (Brassicaceae), lilkovité (Solanaceae), hvězdnicovité (Asteraceae). Stejný autor rozdělil také zeleninu podle akumulace toxických kovů v jedlých částech:

•

velmi nízký příjem - luskoviny, meloun, okurka, rajče;

•

nízký příjem - zelí, kukuřice, brokolice, květák, růžičková kapusta, celer;

•

střední příjem - kapusta, řepa, ředkvička, hořčice, brambory;

•

vysoký příjem - salát, špenát, řeřicha, mrkev.

2.3.5. Mechanizmy příjmu zinku Příjem zinku je aktivní proces. V průběhu času vykazuje příjem a akumulace zinku hyperbolickou saturační křivku: rychlé lineární zvýšení po dodání zinku je následováno pomalým zvyšováním až ustálením maximální rychlosti příjmu a akumulace (Yang et al., 2006). Transport zinku do rostliny je zprostředkován skupinou ZIP transportérů, které jsou kódovány skupinou ZNT genů. Členy této rodiny jsou transportéry ZRT1 a ZRT2, které reprezentují vysoko- a nízkoafinitní Zn2+ přenašeče. Geny ZIP 1 a ZIP3 jsou exprimovány hlavně v kořenech při začínajícím nedostatku zinku, což naznačuje jejich roli v příjmu prvku z půdy. Čtvrtý gen ZIP4 je transkribován jak v kořenech, tak v nadzemní části a pouze při deficienci zinku. Dodatečné studie na kvasinkách prokázaly přítomnost dalšího transportéru s označením IRT1. Ten má široký substrátový rozsah a může transportovat Mn 2+, Zn2+ a patrně také Cd 2+ (Clemens, 2001).

22

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik Na příjem zinku a jeho následnou akumulaci v rostlinách má vliv také forma, v jaké je zinek přítomný v půdě. U rostlin kukuřice seté (Zea mays L.) byl studován vliv tří různých rozpustných zinečnatých hnojiv na obsah kadmia v rostlinných orgánech. Všechna hnojiva snižovala obsah kadmia v nadzemní části ve srovnání s variantou bez přídavku zinku. Výsledky pokusu prokázaly variabilitu mezi jednotlivými formami dostupného zinku. Zvláště u varianty s přídavkem zinku ve formě Zn(NO3)2 byla koncentrace kadmia

v nadzemní části

nejnižší. Nebyl prokázán statisticky významný rozdíl mezi vlivem zinku aplikovaným ve formě ZnSO4 a ZnCl2. V kořenech byla nejnižší koncentrace kadmia zjištěna po přidání zinku ve formě ZnCl2 a nejvyšší po přídavku ZnSO4 (Zhang et Song, 2006). Také u zinku byl prokázán jeho mimokořenový příjem. U rostlin pšenice seté (Triticum aestivum L.) byl 65Zn aplikován foliálně a byla sledována jeho následná translokace. U rostlin pšenice s deficitem zinku bylo 40% 65Zn z listů transportováno do kořenu a zbytek zůstával v nadzemní části. U rostlin s dostatkem zinku v živném roztoku bylo do kořenů transportováno pouze okolo 25% foliálně přijatého zinku (Erenoglu et al., 2002). 2.3.6. Obsah a distribuce zinku v rostlinách Obsah zinku v sušině rostlin se pohybuje v průměru od 20 do 100 μg g -1. Hodnota 20 μg g-1 může být považována za kritickou a při obsahu od 10 do 20 μg g-1 se může hovořit o latentním respektive i akutním nedostatku zinku. Když je obsah zinku nižší než l0 μg g-1, ve většině případů jsou na rostlinách patrné morfologické symptomy deficitu. Za toxický obsah zinku v půdě je považována hodnota 300 μg g-1 (Florián, 2004). Mezi rostlinné čeledi, které akumulují vysoká množství zinku (až 12 000 μg g-1), patří hvozdíkovilé (Caryophyllaceae), hvězdnicovité (Asteraceae), lipnicovité (Poaceae), routovité (Rutacceae) a violkovité (Violaceae). Pohyblivost zinku v rostlinách je nízká. V rostlinách jsou specifické látky chelátové povahy, které váží Zn2+, a tyto komplexy jsou poté transportovány. Translokace zinku ovlivňují četné ekologické faktory - teplota, světlo, přítomnost fosfátu, železa atd. (Cibulka et al., 1991). Zinek se v rostlinách ve větší míře akumuluje v meristematických pletivech, v kořenech a v mladých listech, kde je především uložen v žilnatině a abaxiální epidermis (Page et Feller, 2005). Nejvyšší obsah zinku je v chloroplastech, a to až 2-3krát vyšší než

v celém

listu. Rozdílný obsah zinku v listech různého stáří je z větší části vysvětlován růstem rostlin (Chardonnens et al., 1999). Brune et al. (1994) kultivovali rostliny ječmene setého (Hordeum vulgare L.) v hydroponické kultuře se zvyšující se koncentrací zinku. Při nízkých koncentracích zinku v roztoku (2 μM) byl detekován nejvyšší obsah zinku v cytoplasmě 23

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik protoplastu mezofylových buněk. Při vysoké koncentraci zinku v médiu (400 μM) se obsah zinku výrazně a přednostně zvýšil v apoplastu a v menší míře i ve vakuolách. Subcelulární distribuce zinku v listech u dvou ekotypů (hyperakumulujícího a nehyperakumulujícího) Sedum alfredii (Hance) byla buněčná stěna > rozpustná frakce > organely. V listech hyperakumulující variety bylo v buněčné stěně a rozpustné frakci zjištěno 91-94% z celkového zinku a v organelách pouze 6-9%. U nehyperakumulující variety bylo v organelách obsaženo přibližně 20-26% zinku (Li et al., 2006). Pomocí autometalografie byla stanovena ultrastrukturální lokalizace zinku u tolerantní rostliny trávničky přímořské (Armeria maritima Mill.). V kořenech byl zinek uložen jak extra-, tak intercelulárně. Zinek byl zjištěn v buněčných stěnách rhizodermálních a vnějších kortikálních buněk. Intracelulárně byl zinek uložen ve vakuolách rhizodermálních, vnějších kortikálních a endodermálních buněk a buňkách xylémových cév. V listech byl zinek uložen v buněčných stěnách všech buněk, v xylémových cévách a ve vakuolách transferových, parenchymatických buněk (Heumann, 2002). Výsledky obou těchto experimentů naznačují, že buněčná stěna a vakuolární kompartmentace hrají velice důležitou roli v toleranci a hyperakumulaci zinku. 2.3.7. Interakce kadmia a zinku Padesáti procentní inhibice růstu rostlin byla zjištěna při kultivaci rostlin v živném roztoku s 30 μM Cd a 600 μM Zn. Zinek se akumuloval jak v kořenech, tak i v listech, kadmium především v kořenech, v listech až při vyšších koncentracích (400 μM) (Brune et Dietz, 1995). I u rostliny penízku modravého (Thlaspi caerulescens J. et C. Presl) byly zjištěny rozdíly v distribuci Cd a Zn. Kadmium se hromadilo zejména v apoplastu, kdežto zinek byl lokalizován především ve vakuolách (Van Steveninck et al., 1994). Distribuce kadmia a zinku byla ovlivněna stářím rostliny a typu rostlinného orgánu. V mladých listech se hromadilo větší množství kadmia než ve starých, ale u zinku právě staré listy obsahovaly nejvyšší koncentrace (Perronnet et al., 2003). Hypotéza vytvořena v 70tých letech 20. století uvádějící, že hladina kadmia v rostlinách je částečně regulována poměrem Cd:Zn, se zdá být pravdivá. Bylo prokázáno, že hromadění kadmia v rostlině závisí na koncentraci kadmia v půdě. Obsah (650 μg g-1) zinku v půdě způsobil snížení obsahu kadmia v listech. Omezení aplikace zinku do půdy mělo za následek snížení výnosu až o 25% (McKenna et al., 1993). Interakce kadmia a zinku byla prokázána i u rostlin produkující sekundární metabolity. Přídavek zinku snižuje akumulaci Cd v rostlinách heřmánku pravého (Chamomilla recutitaL.), přídavek 50 mg Zn/kg půdy snížil koncentraci Cd v nadzemní části o 10% a v

24

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik anthodiích o 37%. Další zvyšování obsahu Zn v půdě (300 mg Zn/kg půdy) vedlo k průkaznému snížení akumulace Cd v nadzemním části o 18% (Grejtovský et al., 2006). U jedenáctidenních rostlin pšenice tvrdé (Triticum durum Desf.) byl sledován vliv různých koncentrací zinku (0; 0,1; 1; 5 μM) na retranslokaci kadmia 109Cd z listů do kořene. Z výsledků je zřejmý inhibiční vliv zvyšující se koncentrace zinku na floémem zprostředkovaný transport kadmia (Cakmak et al., 2000). Zvýšený obsah zinku v půdách kontaminovaných kadmiem může tedy vést ke snížení obsahu tohoto toxického kovu v obilovinách. Ovšem při aplikaci dusíkatých a fosfátových hnojiv bylo pozorováno zvýšení koncentrací kadmia v pletivech a snížení obsahu zinku v listech a stoncích (Choudhary el al., 1994). Fosfor a zinek vykazují komplikovanou interakci při příjmu do rostliny. Se zvyšující se koncentrací zinku se významné snižuje množství kadmia v nadzemní části. Tyto výsledky naznačují, že Zn může inhibovat translokaci Cd z kořenů do nadzemní části. Za přítomnosti fosforu se koncentrace Cd v nadzemní části zvyšovala

a v kořenech snižovala. Interakce Zn

a P měla průkazný vliv na akumulaci Cd jak v kořenech, tak v nadzemních částech (Zhao et al, 2005).

2.4. Fyziologické účinky kadmia a zinku 2.4.1. Symptomy fytotoxicity kadmia Kadmium je pro rostliny jedním z nejvíce toxických kovů. Symptomy fytotoxicity se projevují v koncentracích mnohem nižších než u jiných toxických kovů. Primárním místem toxického působení kadmia jsou buněčné membrány a enzymy. Jejich poškození je příčinou četných sekundárních změn. Je ovlivněn příjem minerálních živin, navozen vodní stres, inhibována fotosyntéza a v neposlední řadě nastávají změny v akumulaci asimilálů. Byly zaznamenány strukturální a ultrastruklurální změny.

25

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik Mezi nejčastěji uváděné symptomy fylotoxicity kadmia patří hnědnutí kořenových vlásků, případně kořenových špiček. U ozdobnice čínské (Miscanthus sinensis N. J. Andersson) po tříměsíčním působení 6 μM Cd bylz zjištěny změny kořenového systému. Kořeny byly kratší a tlustší, celý kořenový systém byl hustší a celkově kompaktnější (Scebba et al., 2006). U nadzemních částí byla patrná chloróza listů, červenohnedé zbarvení listové žilnatiny a výskyt fialovohnědých skvrn na listech, v extrémních případech dochází k usychání a opadu listů. Výskyt chloróz bývá spojován buď s inhibicí biosyntézy chlorofylů, s fyziologickou deficiencí železa nebo s kadmiem indukovaným poklesem obsahu hořčíku. Příčinou výskytu červenohnědých skvrn na listech některých rostlin jsou pravděpodobně změny v metabolizmu fenolů a fenolických látek (Barceló et al., 1986). U ječmene setého (Hordeum sativum L.), který byl kultivován s Cd (10-6 mol l-1) v živném roztoku bylo prokázáno snížení obsahu flavonoidů ve všech rostlinných částech. Významný pokles byl zjištěn zejména v kořenech (Lachman el al., 2005). 2.4.2. Genotoxické, cytologické a histologické změny vyvolané kadmiem Vlivem kadmia dochází k inhibici dělení buněk. Vysoké koncentrace kadmia snižují mitotický index a způsobují zpoždění mitózy (Unyayar et al., 2006). Cytotoxický účinek se projevuje též výskytem chromozómových aberací, tvorbou anafázních mostů, lepivostí chromozómů a c-mitózou (Liu et al., 2003). Kadmium způsobuje změny v ultraslrukluře mitochondrií. Je vchlipována vnitřní membrána a jsou vytvářeny nefunkční fosfolipidové struktury. Na kristách vznikají zduření či se tvoří ,,puchýřky“ (Shi et al., 2000). Rozsáhlé strukturální změny byly zjištěny též v chloroplastech. Byl změněn tvar plastidů, dezintegrován vnitřní membránový systém a zvýšen počet plastoglobulů (Barceló et al., 1988). Působení kadmia se projevuje i na jiných buněčných organclách. Po aplikaci kadmia do prostředí byly v buňkách listů vodní rostliny Hydrilla verticillata (L.f.) zjištěny ultrastrukturální změny. Byl prokázán rozklad diktyozómů, dezintegrace endoplazmatického retikula, redukce počtu ribozomů, aglutinace chromatinu v jádře. Dále byla narušena struktura jaderné membrány, omezena funkčnost plazmodezmat. Vysoké koncentrace kadmia zapříčinily odloučení protoplastu od buněčné stěny a odumření buňky (Shi et al., 2000). Krycí pletiva rostlin kontaminovaných kadmiem se vyznačují redukovanou velikostí epidermálních buněk, redukcí intercelulárních prostor, zvýšeným výskytem trichomů a trvalým uzavřením svěracích buněk průduchů.

26


2.4.3. Vliv kadmia na fyziologické procesy 2.4.3.1. Vliv kadmia na aktivitu enzymů a metabolické procesy Toxický vliv kovů je v mnoha případech nepřímý. Toxické kovy ovlivňují aktivitu enzymů a metabolické procesy, například pentózo-fosfátový cyklus, mitochondriální respiraci, fotosyntézu, syntézu chlorofylů a ATP. U rostlin slunečnice (Helianthus annuus L.) rostoucích v přítomnosti kadmia byla sledována aktivita antioxidačních enzymu v kořenech. Přítomnost kovů v prostředí a následně v rostlině indukovala snížení aktivity antioxidačních enzymů (kataláza, glutationreduktáza). Aktivita superoxiddismutázy ovlivněna nebyla (Gallego et al., 1999). Snížení aktivity superoxiddismutázy prokázal Zhang et al. (2003) u rostlin okurky seté (Cucumis sativus L.). Nízká aktivita těchto enzymů může být, dle autorů, příčinou zvýšení obsahu volných radikálů jako důsledek oxidace lipidů. Zřejmě je vyvolán oxidační stres, přestože kadmium není redoxaktivním kationtem. Aktivita katalázy, askorbátperoxidázy a superoxiddismutázy byla nízkými koncentracemi Cd stimulována, vysokými inhibována. Ovlivnění enzymatické aktivity bylo u kořenů ozdobnice čínské (Miscanthus sinensis N. J. Andersson) pozorováno již po 4 týdenní kultivaci, v litech až po 8 týdnech (Scebba et al., 2006). Přídavek kadmia do roztoků s klíčními rostlinami okurky seté (Cucumis sativus L.) způsobil změny aktivity enzymů účastnících se asimilace (NO3)-. Kadmium přednostně reaguje s -SH skupinami proteinů. Nitrátredukláza (NR) je enzym, obsahující -SH skupinu, a proto kadmium může vyvolat inhibici nitrátreduktázy. Zjištěné snížení příjmu (NO 3)- je dle autora možná jednou z další příčin poklesu aktivity NR v kořenech a v dělohách. Aktivita NR byla více ovlivněna příjmem (NO3)- z vnějšího prostředí než koncentrací (NO3)- v pletivu rostlin (Burzynski, 1990). Prvky, jako je zinek a kadmium, mohou potenciálně inhibovat nodulaci u rostlin. Příkladem je jetel plazivý (Trifolium repens L.). Při nízkých koncentracích zinku byla pozorována již po jedné hodině iniciální kolonizace kořenů pokusných rostlin bakteriemi Rhizobium leguminosarum. Při vysokých koncentracích Zn nebyla ani po 12 hodinách kolonizace pozorována. Kadmium působí mnohem toxičtěji než zinek. Tyto výsledky naznačují, že proces nodulace je ovlivnitelný toxickými kovy (El-Kenawy et al., 1997). U rostlin hrachu setého (Pisum sativum L.) bylo zaznamenáno snížení fixace dusíku a obsahu leghemoglobinu v hlízkách rostlin vystavených vlivu kadmia. Nízká nitrogenázová aktivita byla doprovázena významným snížením obsahu manganu v hlízkách. Kadmium tedy 27

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik vytlačuje mangan z metabolických míst. Při zvýšené koncentraci kadmia v prostředí byl zaznamenán zvýšený transport manganu z kořenů do nadzemních čáslí. Autoři předpokládají že, přítomnost kadmia může způsobit snížení aktivity těch enzymů, které mají Mn 2+ v aktivních centrech (Hernandez et al., 1995). Interakce těchto dvou prvků byla zjištěna i při příjmu a distribuci. Mangan aplikovaný ve formě MnSO4 významně snižuje toxické působení kadmia u klíčních rostlin kukuřice. Jeho vliv je závislý na koncentraci. Odstranění toxicity 10 μM Cd bylo u kořenů pozorováno při poměru Mn/Cd 20:1 (Pal'ove-Balang et al., 2006). Gil et al. (1995) sledovali u rajčete jedlého (Lycopersicon esculentum L.) vliv kadmia (0, 15, 30 mg dm-3) na aktivitu ribuloso-l,5-bisfosfátkarboxylázy (RUBISCO). RUBISCO je významnou složkou chloroplastu, reprezentuje 40-60% rozpustných proteinů v chloroplastu. Snížení jeho množství by vedlo ke kolapsu rostlinného metabolizmu. Interakce mezi kadmiem a proteiny (RUBISCO) se uskutečňuje prostřednictvím -SH skupin, které jsou obsaženy v nízkých koncentracích ve stabilizátorech kvartérních struktur. Zvýšená koncentrace kadmia v prostředí snižuje obsah rozpustných proteinů. Pokles obsahu rozpustných proteinů při koncentraci 15 mg dm-3 Cd byl asi o 60% a 30 mg dm-3 Cd byl 83%. 2.4.3.2. Vliv kadmia na fotosyntézu Kadmium má inhibiční vliv na fotosyntetický aparát. Jednou z příčin inhibice může být uzavření průduchu nebo vzrůstající odpor průduchů a listového mezofylu k příjmu CO 2. Dle Weigela (1985) kadmium způsobuje inhibici fixace oxidu uhličitého v temnostní fázi fotosyntézy. Příčiny je možné hledat v poklesu tvorby konečných produktů světelné fáze (ATP, NADPH2), což souvisí se snížením aktivity PSII a inhibicí necyklické fosforylace. Autor nevylučuje i přímou inhibici aktivity enzymů Calvinova cyklu. U rostlin okurky seté (Cucumis sativus L.) byl vliv kovů na potenciální kvantový výtěžek PSII (Fv/Fm) zanedbatelný. Autoři předpokládají redukovaný požadavek na ATP a NADPH v temnostní fázi fotosyntézy, který je způsoben regulací PSII (Burzynski et Klobus, 2004). Zvýšené koncentrace kadmia v prostředí způsobují v chloroplastech ultrastrukturální změny. Chloroplasty rostlin mají redukovaný objem a vyskytují se v menším počtu na jednotku listové plochy než u rostlin pěstovaných za nepřítomnosti kadmia (Klobus et Buczek, 1985). Barceló et al. (1988) dávají změny chloroplastů (zejména nepravidelný tvar plastidů a deformaci tylakoidního systému) do souvislosti s vodním stresem navozeným uzavřením stomat, které je indukováno kadmiem. Jedním z uváděných symptomů poškození chloroplastů rostlin kadmiem je degradace acyllipidů v tylakoidních membránách (zejména fosfatidylcholinu a fosfatidylglycerolu) spojených s funkcí fotosystému II (PSII) a inhibice 28

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik syntézy některých polypeptidů tylakoidních membrán, což se v konečném důsledku odráží ve změnách molekulární struktury a funkci chlorofyl a/b proteinového komplexu PSII (Krupa, 1988). Dlouhodobá expozice rostlin kadmiem ovlivňuje obsah chlorofylů. Snížení obsahu fotosyntetických pigmentů bylo prokázáno pomocí fluorescenčních metod i u nižších rostlin. U zelené řasy Chlorella vulgaris se po expozici 12 μM Cd snížil celkový obsah chlorofylů a karotenoidů. Významnější snížení bylo prokázáno u chlorofylu b. Snížení by mohlo být důsledkem buď enzymatické degradace těchto pigmentů nebo důsledkem inhibice jejich biosyntézy. Inhibice biosyntézy chlorofylů by tak mohla představovat jedno z primárních míst toxického působení kadmia na růst rostlin (Azevedo et al., 2005). Inhibice světelné fáze fotosyntézy kadmiem je omezená pouze na PSII. Místem inhibice aktivity PSII je pravděpodobně OEC komplex (Oxygen evolving center). Ke snížení jeho aktivity může docházet, jak je uvedeno výše, i rozkladem lipidů tylakoidních membrán. Inhibice OEC komplexu může být závislá také na interakci kadmia s ionty vápníku (Faller et al., 2005). Chloroplasty špenátu setého (Spinacia oleracea L.) kultivované 30 minut za přítomnosti 0, 15, 30, 60 mM CdCl2 vykazovaly při všech koncentracích inhibici aktivity PSII. Míra inhibice korelovala s koncentrací kadmia v prostředí (Nováková et al., 2004). Kadmium se v buňkách váže na fosfor. Jelikož jeho koncentrace je za přirozených podmínek v rostlinách velice nízká a fosforečnany toxických kovů jsou silně nerozpustné, dochází tím k deficienci anorganického fosforu. Anorganický fosfor je nutný pro syntézu ATP. Při jeho nedostatku je blokována jeho syntéza a s ní spojené metabolické cesty (Husaini et Rai, 1991). 2.4.3.3. Vliv kadmia na respiraci rostlin Expozice rostlin nízkými koncentracemi kadmia respiraci stimuluje. Příčinou stimulačního působení kadmia je pravděpodobné snížená fotofosforylace, která není schopna zásobit rostlinu dostatečným množstvím ATP, a proto se dočasně zvyšuje požadavek na tvorbu ATP cestou oxidativní fosforylace. Vyšší koncentrace kadmia působí na respiraci inhibičně. Snížená rychlost temnostní respirace kořenů byla prokázána u třezalky tečkované (Hypericum perforatum L.) již při koncentraci 12 μM Cd v živném roztoku (Králóvá et al., 2000). Podobné výsledky byly získány se zinkem. Jestliže se koncentrace zinku v prostředí pohybovala kolem 1,5 mM, byla respirace stimulována. Po překročení koncentrace 5 mM byla inhibována. Jestliže byl zinek přidán k rostlinám mořského salátu (Ulva lactuca L.) se

29

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik zablokovanou cytochromovou cestou, respirace byla částečně obnovena. Obdobné výsledky byly získány i pro Cd. Stimulační účinek Cd na respiraci byl potlačen až po zablokování alternativní respirační cesty pomocí kyseliny salicylhydroxamové (SHAM). Tyto výsledky naznačují, že kadmium nebo zinek v nízkých koncentracích stimulují příjem kyslíku přes alternativní respirační cestu (Webster et Gadd, 1996). Mnohé práce zabývající se interferencí kadmia s respiračním metabolizmem konstatují, že inhibice je pravděpodobně spojena se „zásahy" kadmia do Krebsova cyklu. Za primární místo působení kadmia je považován sukcinátdehydrogenazový komplex, méně citlivá je oxidace NADH a malátu. Aktivita malátdehydrogenázy, peroxidázy a fosfázy je dokonce nízkými koncentracemi kadmia stimulována. Předpokládá se, že podstatou těchto jevů je interakce kovu se sulfhydrylovými skupinami cysteinu nebo skupinami imidazolovými v případě histidinu (Zhao et al., 2005). 2.4.3.4. Vliv kadmia na vodní provoz rostlin Příčiny poklesu rychlosti transpirace a obsahu vody v rostlině jsou vysvětlovány sníženou otevřeností průduchů (Hagemayer et al., 1986). Již nízké koncentrace kadmia zvýšily počet nedokonale vyvinutých průduchů. Takové průduchy mají malou aperturu nebo jsou uzavřené, pravděpodobně postrádají funkční uzavírací mechanizmus. U rostlin rostoucích v přítomnosti kadmia byl počet průduchů na jednotku listové plochy vyšší, zatímco velikost průduchů se snížila. Přímý vliv kadmia na otevřenost průduchů může být způsoben změnami toku K+ přes plazmatickou membránu (Barceló et Poschenrieder, 1990). Příčinou vadnutí rostlin může být také redukce podílu xylému na vedení vody ve stonku, redukovaný průměr trachejí nebo ucpávání elementů xylému produkty degradace buněčných stěn (Kovačevič et al., 1999). Snížení relativního obsahu vody při snížené transpiraci ukazuje, že vysoké koncentrace kadmia pravděpodobně snižují příjem a transport vody rostlinou. Tato hypotéza je v souladu s výsledky, které dokládají, že kadmium ovlivňuje růst kořenů, snižuje tvorbu kořenových vlásků a zapříčiňuje strukturální změny, které vedou ke zvýšení odporu toku vody do a uvnitř kořenů (Kastori et al., 1992). 2.4.3.5. Vliv kadmia na růst rostlin Kovy přijaté rostlinami vyvolávají řadu metabolických změn, které se odrážejí ve snížení růstu. Nízké koncentrace kadmia v prostředí mají na tvorbu biomasy stimulační účinky (Arduini et al., 2004). Tato stimulace byla popsána také u řepy obecné (Beta vulgaris L.), rajčete jedlého (Lycopersicon esculentum L.), ředkve seté (Raphanus sativus L.), hrachu 30

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik setého (Pisum sativum L.) (Liu et. al., 2003). Vyšší koncentrace kadmia mv živném roztoku inhibují zejména růst kořenů rostlin, ale i nadzemních částí a iniciují tvorbu laterálních kořenů (Šottníková et al., 2003). Míra ovlivnění růstu rostlin, které jsou kultivovány za přítomnosti rozdílných koncentrací kovů je různá. U rostlin ječmene bylo prokázáno snížení biomasy kořenů pří koncentraci 10 μM Cd o 32%. Při současné aplikaci 400 μM Zn bylo zaznamenáno snížení pouze o 25%. Snížení biomasy nadzemní části bylo nižší než u kořenů, pouze 11% (Brune et Dietz, 1995). U heřmánku pravého (Matricaria recutita L.) a třezalky tečkované (Hypericum perforatum L.) nejvýznamnější redukce růstových parametrů byla prokázána při samostatné aplikaci 120 μM Cd a 240 μM Zn. Pokud byly stejné koncentrace obou kovů aplikovány současně, redukce růstových parametrů byla nižší. Je možné předpokládat, že kořeny rostlin mají omezený počet vazebných míst pro kovy. Při vysokých koncentracích kovů jsou vazebná místa plně saturována a další přídavek kovu již nevede k dalšímu zvyšování obsahu těchto kovů v rostlinách (Králóvá et Masarovičová, 2003). Klíční rostliny okurky seté (Cucumis sativus L.) byly na několik dní vystaveny nízkým koncentracím kadmia a olova. Poté byla koncentrace těchto kovů v živném roztoku zvýšena. Adaptace rostlin na nízké koncentrace kadmia a olova jim umožnila tolerovat vysoké koncentrace tčehto kovu bez významnějšího snížení růstu (Talanova et al., 2000). 2.4.4. Fyziologické účinky zinku Zinek má důležitou úlohu v metabolizmu rostliny, protože se podílí na aktivaci mnoha enzymů a zabezpečuje také vazbu mezi enzymem a substrátem. Předpokládá se, že zinek má nejvyšší afinitu ke karboxylovým, sulfhydrylovým a aminoskupinám proteinů. Ovlivňuje také aktivitu mnoha enzymů glycidového metabolizmu, včetně RUBISCO, a je důležitý při syntéze bílkovin i fotosyntetických pigmentů (Pandey et al., 2002). Kationt Zn2+ má hlavní roli v aktivaci klíčových enzymů Calvinova cyklu, v rovnováze mezi CO2 a O2 a v inhibici fotosyntézy, která je lokalizována v tylakoidních membránách chloroplastu (Rout et Das, 2003). Je součástí mnoha enzymů jako je alkalická fosfatáza, alkoholdehydrogenáza, fosfolipáza, karboxypeptidáza a RNA-polymeráza. Velmi významným enzymem, na jehož skladbě se zinek podílí, je karbonátdehydratáza, který je důležitý zvláště pro C4 rostliny. Jeho aktivita ve stromatu chloroplastu zabezpečuje hodnotu pH. Současně s mědí se zinek podílí na skladbě enzymu superoxidismutázy, kde má patrně strukturní funkci.

31

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik 2.4.4.1. Nedostatek a nadbytek zinku Hladina deficitu zinku v rostlinách není přesně známa. Nejtypičtější morfologické symptomy nedostatku zinku jsou ty, které jsou způsobeny nedostatečným množstvím fytohormonu auxinu (IAA). Byla zjištěna souvislost mezi zinkem a tímto fytohormonem. Zinek sice není bezprostředně nutný k syntéze IAA, ale je nezbytný k syntéze tryptofanu, výchozí látky pro syntézu IAA. Symptomy nedostatku zinku jsou pozorovány častěji u víceletých než u jednoletých rostlin. Jedná se především o inhibici prodlužovacího růstu, zkrácení internodií, tvorbu malých úzkých a drobných listů a výskyt chloróz, zvláště kolem střední žilky (Cibulka et al., 1991). U rostlin kávovníku arabského (Coffea arabica L.), které byly kultivovány bez přídavku zinku, byl zjištěn zvýšený počet kořenů a jejich průměr. U těchto rostlin byla prokázána zvýšená tloušťka epidermis, kortexu a středního válce. Průměr xylémových cév se však snížil. Zvýšení průměru kortexu kořene a středního válce poskytuje zvětšení povrchu pro příjem živin (Rosolem et al., 2005). Rostliny s počáteční deficiencí Zn vykazovaly vyšší aktivitu nespecifických peroxidáz, askorbátperoxidáz a glutationreduktáz (Sharma et al., 2004). Citlivost jednotlivých rostlinných druhů na nedostatek zinku je různá. Ze zemědělských plodin patří k nejcitlivějším: kukuřice setá (Zea mays L.), len setý (Linum usitatissimum L.), bob setý (Vicia faba L.), cibule kuchyňská (Allium cepa L.), rajče jedlé (Lycopersicon esculentum L.) a k nejodolnějším oves setý (Avena sativa L.), ječmen setý (Hordeum vulgare L.) a rýže setá (Oryza sativa L.). U víceletých rostlin se nedostatek zinku nejčastěji projevuje na jabloních (Malus), hrušních (Pinus), broskvoních (Persicaa), vinné révě (Vitis vinifera L.) a citrusových plodech. Odolnost jednotlivých rostlinných druhů k nadbytku zinku je velmi rozdílná. Symptomy se objevují tehdy, když jeho obsah v sušině je vyšší než-li 300-500 ppm. Nadbytek zinku vyvolává specifické fyziologické a morfologické změny, jako je inhibice fotosyntézy, zmenšení kořenového systému, ztloustnutí kořenů, zakrslost nadzemní části, zvlnění a stáčení mladých listů, odumírání špiček listů a vznik chloróz. Zinek v nadměrných koncentracích působí na rostliny cytotoxicky. Změny jsou pozorovány zejména v jádrech buněk kořenové špičky, kde chromatin je vysoce kondenzovaný. U některých kortikálních buněk je zeslabena jaderná membrána a je zvýšen počet jadérek. Cytoplazma se stává bezstrukturní a dochází k desintegraci buněčných organel a zvětšováni vakuoly. Vysoké koncentrace zinku narušují mitochondriální strukturu, což má za následek nedostatek energie (Rout et Das, 2003). Bylo studováno oxidační poškození primárních listů fazolu obecného (Phaseolus vulgaris L.) po přijetí toxického (subletálního) množství zinku kořeny. Bylo zaznamenáno 32

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik zvýšení membránových produktů oxidace v důsledku aktivace enzymu lipoxigenázy. Přestože ionty zinku nemají vysokou redoxní aktivitu, způsobují degradaci nenasycených mastných kyselin oxidací, o čemž svědčí akumulace lipidových produktů oxidace. Zinek zvýšil produkci H2O2, který buněčný antioxidační systém nebyl schopen odstranit. Proto může být zinek příčinou oxidačního poškození (Weckx et Clijsters, 1997). Vzniklé aktivní formy kyslíku mohou mít za následek genotoxicitu. Vápněním a aplikací vyšších dávek fosforečných hnojiv je v mnoha případech možné snížit akumulaci zinku v rostlinách.

2.5. Obranné mechanizmy rostlin Technický pokrok a prudký rozvoj průmyslu v druhé polovině dvacátého století se negativně projevil ve zhoršujícím se stavu životního prostředí. Značné znečištění ovzduší, půd, voda sedimentů začalo ohrožovat samou podstatu života na Zemi. Živé organizmy reagují citlivě na měnící se životní prostředí, ve kterém si po dlouhá staletí vytvářely podmínky k dynamickému růstu. Řada z nich již vyhynula a další se ocitají na seznamu kriticky ohrožených.

33

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik Rostliny nemají možnost aktivního pohybu a úniku z prostředí, ve kterém rostou. Jejich vysoce uspořádané struktury se stálou výměnou molekul, atomů a iontů jsou charakterizovány neustálými složitými přeměnami a představují otevřený heterogenní systém. Ten však bývá často narušován různými stresovými faktory (abiotickými a biotickými), zejména při extrémním působení různých fyzikálních a chemických činitelů (tabulka 6). Rostliny disponují souborem mechanizmů, který jim umožňuje bránit se proti nepříznivým vlivům vnějšího prostředí. Různě vyvinuté ochranné struktury (například ztlustlá kutikula na listech, výrazná impregnace buněčných stěn, rezervoáry vody a snadno rozložitelných organických látek tlumící jejich nedostatek) pomáhají předcházek stresu. Představují pasivní způsob ochrany a mají dlouhodobý charakter. Mechanizmy aktivní odolnosti (napřílad tvorba stresových proteinů, fytohormonů – tabulka 7) omezují negativní dopad stresorů až po jejich průnik k plazmatické membráně buněk a do symplastu. Dochází ke spuštění řetězce změn (stresová reakce), který lze rozdělit do několika fází (poplachová, restituční, fáze rezistence, vyčerpání). Průběh stresové reakce a její konečný výsledek závisí jak na intenzitě a délce působení stresového faktoru na danou rostlinu, tak i na geneticky vázaných předpokladech odpovědi (adaptační schopnost). Přechodné zvýšení odolnosti získané pod vlivem stresoru (aklimatizace) může být založeno na změnách rychlých (tvorba specifických metabolitů) i trvalejších (změny v tvorbě nových orgánů a jejich vnitřní struktuře).

Tabulka 6 Přehled nejdůležitějších stresových faktorů rostlin Abiotické faktory 1) Fyzikální: - mechanické účinky větru - nadměrné záření - extrémní teploty 2) Chemické: - nedostatek vody - nedostatek kyslíku - nedostatek živin v půdě - nadbytek iontů solí a vodíku v půdě - přítomnost toxických látek v prostředí 34

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik Biotické faktory - herbivorní živočichové - patogenní organizmy - vzájemné ovlivňování (alelopatie, parazitizmus)

Tabulka 7 Příklady vlivu některých stresových faktorů a obranné mechanizmy rostlin proti jejich působení Účinek na rostliny Mráz - dehydratace buněčného obsahu - mechanické poškození buněčné stěny - mechanické poškození plazmalemy

Obranné mechanizmy - utlumení buněčných funkcí - zamezení vzniku ledu uvnitř buňky snížením bodu tuhnutí tvorbou osmoticky aktivních látek

Nízká teplota - změny struktury a fyzikálně-chemických - tvorba stresových proteinů vlastností membrán (cold-induced proteins) - zastavení selektivního a aktivního transportu - zvýšení podílu nenasycených mastných - zastavení osmotických procesů kyselin v lipidové vrstvě membrán - změny struktury cytoskeletu Účinek na rostliny Obranné mechanizmy Vysoká teplota - změny struktury a fyzikálně-chemických vlastností membrán - změny strukruty a funkce proteinů, enzymů Nedostatek vody (vodní stres) - změny vzhledu rostliny (vadnutí listů) - zpomalení růstu - změny aktivity enzymů - snížení rychlosti fotosyntézy a transpirace Nedostatek kyslíku v půdě - inhibice aerobních procesů - start anaerobních procesů (fermentace)

Toxické látky v prostředí (toxické kovy) - inaktivace enzymů - inhibice dělení a dlouživého růstu buněk - vliv na fotosyntézu

- tvorba stresových proteinů (heat-shock proteins)

- tvorba kyseliny abscisové (uzavření průduchů) - tvorba prolinu, některých metabolitů (cukry) - tvorba stresových hormonů (dehydration-induced proteins) - tvorba stresových proteinů (anaerobic stress proteins) - změny koncentrace fytohormonů - adaptace (rychlý transport O2 do kořenů difuzí a hromadným tokem, účinné vylučování produktů fermentace) - znesnadnění vstupu do cytosolu (sorpce na pektinové látky) - tvorba stresových proteinů - tvorba fytochelatinů

35

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik Patogenní organizmy - účinek dle typu patogenu

- tvorba stresových proteinů (pathogenesis-related proteins) - tvorba sekundárních metabolitů (fytoncidy) - tvorba ochranných nekróz - zvýšená tvorba kalózy

2.5.1. Obranné mechanizmy rostlin proti těžkým kovům Kontaminace půd má selekční vliv na evoluci rostlin. Rostliny rostoucí v prostředí znečištěném kovy jsou často geneticky odlišné oproti populacím stejného druhu v lokalitách bez přítomnosti toxických kovů nebo s jejich nízkou koncentrací (Ye et al., 2003). Stupeň odolnosti rostlin vůči kovům závisí na typu kovu, míře jeho toxicity, půdních podmínkách daného prostředí a v neposlední řadě na stupni ontogeneze rostliny. V raných stádiích nemají rostliny dostatečně vyvinuty obranné mechanismy proti vstupu kovů do jejich vnitřního prostředí. Endodermis mladých rostlin má výrazně menší schopnost zabránit transportu kovů z kořenů do nadzemních částí oproti endodermis dospělých rostlin. Rostliny reagují na stres vyvolaný kadmiem několika obrannými mechanizmy, které jsou obdobné i pro jiné toxické kovy. Tvorba fytochelatinů a vakuolární kompartmentace představují „první linii“ mechanizmů působících proti Cd stresu. „Druhou linii“ tvoří syntéza stresových proteinů, produkce ethylénu a peroxidáz. Je velmi obtížné stanovit hranici mezi oběma skupinami mechanizmů (Sanitá di Toppi et Gabbrielli, 1999). Ačkoliv existují důkazy, že mykorrhiza (zvláště ektomykorrhiza) může být důležitým mechanizmem obrany, většina studií nebere v úvahu její roli v toleranci rostlin vůči toxickým kovům. Je obtížné dokázat zvýšení tolerance vyšší rostliny vůči kovu díky mykorrhize, neboť tolerance může být závislá jak na druhu symbionta, tak na druhu hostitele a v neposlední řadě 36

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik i na druhu kovu. Mechanizmy, které využívají symbiotické houby na buněčné úrovni, jsou patrně podobné těm, které využívají vyšší rostliny. Kovy jsou zabudovány do extracelulárních materiálů a významná je i vakuolární kompartmentace (Hall, 2002). 2.5.1.1. Imobilizace První bariéru vůči iontům kadmia na úrovni kořene představuje imobilizace prostřednictvím buněčných stěn a extracelulárních látek (sliz, kalóza). V kořenech a listech fazolu obecného (Phaseolus vulgaris L.) jsou ionty kadmia nejčastěji vázány na pektiny a histidické skupiny buněčné stěny (Sanitá di Toppi et Gabbrielli, 1999). Do buněčných stěn přednostně zabudovávají ionty kadmia například penízek modravý (Thlaspi caerulescens J. et C. Presl) a tařice (Alyssum bertolonii Desv.) (Boominathan et al., 2003).

2.5.1.2. Exkluze Exkluze je charakterizována jako vyloučení kovu z buňky. U iontů kadmia může zabránit jejich vstupu do cytosolu přes plazmatickou membránu. V případě vstupu Cd přes plazmalemu se tento proces pravděpodobně realizuje prostřednictvím Ca kanálků (Rivetta et al., 1997). Ionty kadmia však mohou být v kompetici pro transmembránové přenašeče i s ionty K, Mg, Fe, Mn, Cu, Zn a Ni. Při vyšších koncentracích Cd může dojít až k poškození plazmatické membrány. 2.5.1.3. Syntéza fytochelatinů Indukce tvorby fytochelatinů je obecnou odpovědí vyšších rostlin na působení toxických kovů. Pouze některé ionty toxických kovů však mají schopnost tvořit s fytochelatiny stabilní komplexy (Leopold et al., 1999). Fytochelatiny hrají důležitou roli při detoxikaci arsenu a kadmia (s kadmiem tvoří různé komplexy s molekulovou hmotností okolo 2500 nebo 3600). Nedokáží však z rostlinného organizmu odstranit nadbytek niklu, selenu a zinku (Hall, 2002). Současnými studiemi byl zjištěn odlišný způsob tvorby komplexů fytochelatin/kadmium a fytochelatin/zinek. Elektronová absorpční spektrometrie prokázala, že kademnaté ionty spolu s fytochelatiny tvoří čtyřstěn pomocí čtyř thiolových skupin a několik atomů síry spojuje jednotlivé atomy Cd, což má za následek vytvoření komplexu. Tvorba komplexu se zinečnatými ionty je založena výhradně na poměru 1:1 (Kobayashi et Yoshimura, 2006). Fytochelatiny jsou

syntetizovány z glutationu pomocí enzymu

37

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik fytochelatinsyntázy. Jejich strukturu vyjadřuje vzorec (γ-Glu-Cys)n-Gly, kde n je počet jednotek γ-Glu-Cys (n = 2-11). Indukce a schopnost vazby toxických kovů s fytochelatiny byla studována u silenky nadmuté (Silene vulgaris Moench.), která je tolerantní k toxickým kovům, a na buněčných suspenzích rajčete (Lycopersicon esculentum L.), které je k toxickým kovům senzitivní. Aplikace mědi a kadmia na celé rostliny silenky a rajčete a na buněčnou suspenzi navodila tvorbu komplexů toxický kov – fytochelatin. Zinek a olovo tvořily pouze komplexy s nižší molekulovou hmotností. Dle autorů hraje vazba toxických kovů s fytochelatiny pouze přechodnou roli v detoxikaci toxických kovů. Po sedmi až čtrnácti dnech od aplikace toxického kovu do živného roztoku silenky nebyly v kořenech komplexy fytochelatinů s toxickými kovy detekovatelné (Leopold et al., 1999). Byly objeveny sloučeniny podobné, ale ne identické s fytochelatiny. Souhrnně se nazývají izo-fytochelatiny. Do této skupiny náleží: •

homo-fytochelatiny, odvozené od homo-glutationu. Jsou produkovány několika zástupci řádu Fabales. Pro homo-fytochelatiny je charakteristická záměna glycinu za β-alanin na místě konečné aminokyseliny (Grill et al., 1986);

•

hydroxylmetyl-fytochelatiny, nalezené u některých jednoděložných rostlin, zvláště u řádu Poaceae. Tento typ fytochelatinů obsahuje místo glycinu aminokyselinu serin (Klapheck et al., 1994);

•

izo-fytochelatiny, obsahující místo aminokyseliny glycinu kyselinu glutamovou, byly nalezeny u kukuřice seté (Zea mays) (Meuwly et al., 1992).

2.5.1.4. Kompartmentace Vakuolární kompartmentace hraje významnou roli v detoxikaci a toleranci rostlin vůči kadmiu zvláště u přirozených hyperakumulátorů, neboť redukuje obsah iontů kadmia v cytoplazmě. Přítomnost kadmia stimuluje v rostlinách syntézu fytochelatinů, které s kovem tvoří komplexy. Tyto komplexy jsou transportovány pomocí specifických přenašečů přes tonoplast proti koncentračnímu gradientu. Pokud jsou přítomné volné ionty Cd2+, vstupují do vakuoly pravděpodobně pomocí antiportu Cd2+/2H+ (Hall, 2002). Uvnitř vakuoly v důsledku kyselého pH komplexy disociují a kadmium je zabudováno do organických kyselin (citrát, malát, oxalát) (Saber et al., 1999). Ve vakuole je kadmium akumulováno v koncentracích mnohonásobně vyšších než v cytoplazmě.

38

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik 2.5.1.5. Stresové proteiny Vlivem přítomnosti toxických kovů v prostředí je u rostlin iniciována syntéza stresových proteinů, zvaných také hsp proteiny (heat shock proteins). Studium buněčných suspenzí Lycopersicon peruvianum (L.) prokázalo, že hsp proteiny s velkou molekulovou hmotností (hsp 70) reagují na stres způsobený kadmiem. Hsp 70 se vyskytoval jak v jádře a cytoplazmě, tak v plazmatické membráně. Výsledky naznačují, že hsp 70 může chránit membrány před poškozením kadmiem (Hall, 2002). Bylo prokázáno, že DNA kadmiem stresových buněk tvoří specifické mRNA transkripty, které regulují syntézu stresových proteinů. Stresové proteiny mohou opravovat proteiny poškozené kadmiem a částečně mohou uplatnit ochranný vliv na membrány (Sanitá di Toppi et Gabrielli, 1999).

2.6. Citlivost rostlin jako testovacích organizmů

Rostliny byly dlouhou dobu považovány za méně citlivé na přítomnost toxických látek než živočichové. V důsledku toho často výsledky testů s bezobratlými a rybami nahrazovaly testování s rostlinnými druhy. V současné době se tento přístup nedoporučuje, protože byla prokázána rozdílná citlivost testovacích druhů (Lewis, 1995). Citlivost testovacích druhů na toxické látky je určena: •

typem toxické látky: při testu citlivosti organizmů na přítomnost Cd, Cu a Zn bylo pořadí testovaných druhů dle klesající senzitivity následující: řasy > Daphnia > bakterie > semena rostlin > žížaly (Thomas et al., 1986). Pořadí citlivosti na herbicidy však bylo: semena rostlin >> řasy = bakterie > Daphnia >>

žížaly. Dle výše

uvedených autorů patří k nejcitlivějším druhům zemědělských plodin kukuřice setá (Zea mays L.), len setý (Linum usitatissimum L.), bob setý (Vicia faba L.), cibule kuchyňská (Allium cepa L.) a rajče jedlé (Lycopersicon esculentum L.). K nejodolnějším je řazen oves setý (Avena sativa L.), ječmen setý (Hordeum vulgare L.) a rýže setá (Oryza sativa L.); •

faktory, jako například: koncentrací, dobou expozice, rostlinným druhem, stupněm ontogeneze a v neposlední řadě adaptací testovacích organizmů na přítomnost toxických látek. Bylo zjištěno, že okřehek (Lemna perpusilla Torr.) byl v kalových 39

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik nádržích obsahujících popílek nejpočetnějším druhem (Clark et al., 1981). Lze předpokládat, že okřehek je tolerantní vůči zvýšeným koncentracím kovů. Avšak laboratorními testy bylo prokázáno, že stejný druh okřehku byl stejně citlivý na přítomnost kovů jako jiné testované druhy. Rozdíly v citlivosti okřehku mezi in situ a laboratorními podmínkami mohou dle autora souviset s jeho adaptací na chronické a subletální hladiny toxických látek v nádržích. Adaptace na přítomnost toxických látek byla také zjištěna u řas (Wang, 1987). •

enviromentálními podmínkami: obsah organické hmoty, pH, teplota prostředí, interakce toxických látek s ligandy (Wang, 1987). Bylo zjištěno, že hrotnatka obecná (Daphnia pulex Leydig) a běžný druh okřehku - okřehek menší (Lemna minor L.) reagovaly odlišně na stejný obsah glykofosfátu v substrátu (Hartman et Martin, 1984). Obecně se toxicita mnohých látek zvyšuje s narůstající intenzitou světla a teplotou. U některých látek toxicita klesá se vzrůstající hodnotou pH;

•

typem testovací metody: semena salátu hlávkového (Lactuca sativa L.) byla promývána testovacím roztokem nebo umístěna na fitrační papír, který obsahoval roztok s ionty Ag+ (Ratsch et Johndro, 1986). Uvedení autoři zjistili, že hodnoty EC50 (Effect Concentration; koncentrace, která způsobí 50% inhibici elongace kořene vzhledem ke kontrole) se lišily při použití těchto testovacích metod až o dva řády v důsledku adsorbce iontů Ag+ použitým filtračním papírem. Ionty se tak stávají nedostupnými a tím je snížena jejich toxicita. V důsledku fotodegradačních procesů byl zjištěn pokles toxicity kalových odpadních vod exponovaných světlem ve srovnání s tmou (Walsh et al., 1991). Při testování toxicity odpadních vod z koksáren na světle byl zjištěn nárůst toxicity následkem fotosenzitivních procesů;

Srovnáním citlivosti různých druhů rostlin a živočichů bylo zjištěno, že citlivost je ovlivněna nejen výše uvedenými faktory, ale je i druhově specifická a to nejen mezi různými taxonomickými skupinami, ale i v rámci jednotlivých tříd (Fletcher et al., 1990; Freemark et al., 1990). Dle Kapustky et al. (1995) byla nejcitlivějším druhem ze skupiny rostlin testovaných na zvýšenou kontaminaci půd As, Cd, Cu, Pb a Zn tolice vojtěška (Medicago sativa L.), po ní následovala pšenice obecná (Triticum aestivum L.) a salát hlávkový (Lactuca sativa L.). V jiné studii (Thomas et al., 1986) jsou řasy uváděny jako citlivější organizmy na toxické účinky kovů než vyšší rostliny, jejich citlivost k herbicidům je však nižší. Podle Sutera et al. (1983) mohou taxonomické rozdíly vykazovat dokonce větší variabilitu na chemické zatížení než samotné podmínky testu (laboratorní nebo polní). US EPA (U.S. Environmental Protection Agency) například vyžaduje testování 10 rostlinných 40

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik druhů z 6 tříd, OECD (Organization for Economic Cooperation and Development) alespoň 3 druhů ze tří tříd. Extrapolace výsledků na jiný druh tedy vyžaduje maximální opatrnost. Doporučené druhy rostlin uvádí US EPA, OECD, Wang (1991) a Fletcher (1991) a US FDA (U.S. Food and Drug Administration). Patří k nim především Lactuca sativa (L.), Cucumis sativus (L.), Glycine max (L.), Zea mays (L.), Avena sativa (L.), Lolium perenne (L.), Daucus carota (L.) (tabulka 8).

Tabulka 8 Druhy doporučené US EPA, OECD a US FDA pro testy fytotoxicity Latinský název

Čeleď US EPA

Lactuca sativa (L.)

Asteraceae

salát hlávkový

Brassica oleracea (L.)

Brassicaceae

brukev zelná

Cucumis sativus (L.)

Cucurbitaceae

okurka setá

Glycine max (L.)

Fabaceae

sója luštinatá

Phaseolus vulgaris (L.)

Fabaceae

fazol obecný

Allium cepa (L.)

Liliaceae

cibule kuchyňská

Zea mays (L.)

Poaceae

kukuřice setá

Avena sativa (L.)

Poaceae

oves setý

Lolium perenne (L.) Lycopersicon esculentum (L.) Daucus carota (L.)

Poaceae

jílek vytrvalý

Solanaceae

lilek rajče (rajče jedlé)

Apiaceae

mrkev obecná OECD

Lactuca sativa (L.)

Asteraceae

salát hlávkový

Lepidium sativum (L.)

Brassicaceae

řeřicha setá

Raphanus sativus (L.)

Brassicaceae

ředkev setá

Brassica napus (L.)

Brassicaceae

brukev řepka (řepka setá)

Brassica rapa (L.)

Brassicaceae

brukev řepák

Trifolium pratense (L.)

Fabaceae

jetel luční

Vicia sativa (L.)

Fabaceae

vikev setá

41

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik Avena sativa (L.)

Poaceae

oves setý

Oryza sativa (L.)

Poaceae

rýže setá

Lolium perenne (L.)

Poaceae

jílek vytrvalý

Sorghum bicolor (L.)

Poaceae

čirok obecný

Triticum aestivum (L.)

Poaceae

pšenice setá

Latinský název

Čeleď US EFA

Lactuca sativa (L.)

Asteraceae

salát hlávkový

Brassica oleracea (L.)

Brassicaceae

brukev zelná

Cucumis sativus (L.)

Cucurbitaceae

okurka setá

Glycine max (L.)

Fabaceae

sója luštinatá

Phaseolus vulgaris (L.)

Fabaceae

fazol obecný

Triticum aestivum (L.)

Poaceae

pšenice obecná

Zea mays (L.)

Poaceae

kukuřice setá

Avena sativa (L.)

Poaceae

oves setý

Lolium perenne (L.)

Poaceae

jílek vytrvalý

Lycopersicon esculentum (L.) Solanaceae

lilek rajče (rajče jedlé)

Daucus carota (L.)

mrkev obecná

Apiaceae

42


2.7. Typy testů fytotoxicity Při hodnocení toxicity chemických látek a jejich účinků na strukturu a funkci ekosystémů jsou používány testy fytotoxicity (tabulka 9). Velkou předností těchto testů je jejich jednoduchost, variabilita, materiálová a ekonomická nenáročnost. V průběhu posledních dvaceti let zařadila většina významných enviromentálních agentur testy fytotoxicity jako součást enviromentálního monitoringu a hodnocení rizik. US EPA požaduje při testování toxicity pesticidů sadu tří testů, včetně testu s řasami (Freemark et Boutin, 1994b). OECD doporučuje tříúrovňový testovací systém: test se sladkovodními druhy řas, test růstu okřehku (Lemna sp.), test klíčivosti a elongace kořene. Z rozhodnutí EEC (European Economic Community)

musí v současnosti členské země při registraci

chemických sloučenin požadovat i test růstu řas. V současné době existuje mnoho dalších organizací vyvíjejících společné směrnice pro testy fytotoxicity. ISO (International Standarts Organization) využívá standardních testovacích protokolů pro testování chemikálií. ASMT (American Society for Testing and Materials) pro testování doporučila testovací metody s okřehkem menším (Lemna minor L.) a test klíčivosti semen vyšších rostlin. ASMT a Plant Toxicology Subcommitte uplatňuje například tyto fytotesty: test klíčivosti semen a test elongace kořene, testy toxicity a genotoxicity, testy reprodukce a řadu dalších. Agentura SMC (The Standart Methods Committe) spojila úsilí s APHA (American Public Health Association), AWWA (American Water Works Association) a WPCF (Water Pollution Cotrol Federation) a navrhly testování s okřehkem menším (Lemna minor L.) a test klíčivosti a elongace kořene vodních rostlin a rostlin žijících v zamokřených půdách. Později bylo pro testování sladkovodního prostředí

43

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik doporučeno proso seté (Panicum miliaceum L.), rýže setá (Oryza sativa L.) a řeřicha setá (Lepidium sativum L.). Pro laboratorní testy vodního prostředí se využívají okřehek hrbatý a okřehek menší (Lemna gibba L. a Lemna minor L.). Metodologie testů a jejich výsledky byly posouzeny Wangem (1990, 1991). Existující protokoly doporučují používat různé druhy zemědělských plodin. Jejich výběr se ale liší dle agentury. Například US EPA, US FDA a OECD doporučují zejména následující rostlinné druhy: brukev zelnou (Brassica oleracea L.), salát hlávkový (Lactuca sativa L.), oves setý (Avena sativa L.) a jílek vytrvalý (Lolium perenne L.). V devadesátých letech minulého století byl vytvořen komplex polních testů, testů v mikrokosmu a mezokosmu, které k testování toxicity využívají vodní a suchozemské rostliny (Freemark et al., 1990). Metody testování vodních systémů v mikrokosmu byly již standardizovány a lze je tedy považovat za reprodukovatelné, citlivé a srovnatelné s výsledky polních testů. U metod testů se suchozemskými rostlinami ke standardizaci doposud nedošlo. Byly sestaveny metody polních testů a testů ve vodním mezokosmu, ale je nezbytný jejich detailnější výzkum. Polní studie fytotoxicity nejsou zcela běžně používány a nejsou ani považovány za vhodné ke standardizaci (Leeuwen, 1990). Pro suchozemské prostředí jsou využívány zejména tyto laboratorní testy: test klíčivosti semen, test elongace kořene a test růstu klíčních rostlin (Freemark et al., 1990; Fletcher et Ratsch, 1991). Klíčivost a růst kořene jsou kritické etapy ve vývoji rostlin a vykazují citlivou odezvu na expozici chemických látek (Ratsch, 1983). Elongace kořene je obecně inhibována nižšími koncentracemi toxických sloučenin než proces klíčení (Baud-Grasset, 1990). V prvních etapách ontogeneze, jako je klíčení a růst kořene, jsou aktivovány mechanismy mobilizace a transformace zásobních látek a metabolické procesy související s přechodem heterotrofie na autotrofii. V tomto relativně krátkém období rostlina doposud nedisponuje dostatečnými detoxikačními schopnostmi, a proto nedochází v průběhu testů k významné degradaci a eliminaci testované sloučeniny (Kummerová et al., 1997). Výsledky jsou vyjadřovány procentuální změnou klíčivosti nebo elongace kořene (stimulace, inhibice) oproti kontrole. Standartním vyjádřením je: •

EC50 (Effect Concentration) – koncentrace xenobiotika, způsobující 50% snížení růstu, vyjádřené např. délkou kořene nebo hmotností biomasy kořene;

•

LC50 (Letal Concentration) – koncentrace xenobiotika, která je letální pro 50% semen;

44


LOEC (Lowest Observed Effect Concentration) – nejnižší aplikovaná koncentrace testovaného vzorku, při které je zjištěna odezva (tzn. je to nejnižší testovaná koncentrace, při které hodnoty klíčivosti a elongace kořene jsou signifikantně rozdílné oproti kontrole);

•

NOEC (No Observed Efferct Concentration) – nejvyšší aplikovaná koncentrace testovaného vzorku, při které není zjištěna žádná odezva (tzn. je to nejvyšší testovaná koncentrace, při které hodnoty klíčivosti a elongace kořene nejsou signifikantně rozdílné oproti kontrole).

Přesnost stanovení NOEC, LOEC do jisté míry závisí na jemnosti dělení koncentračního gradientu použitého při testu. Test klíčivosti semen a test elongace kořene byl použit mnoha autory k hodnocení vlivu řady xenobiotik. Pro hodnocení vlivu zvyšující se koncentrace benzo(a)pyrenu a pro posouzení jeho interakce s humátem sodným a vlivu acidity prostředí na růst kořene a hypokotylu salátu hlávkového (Lactuca sativa L.) byl použit test elongace kořene (Kummerová et al., 1995). Stejný test byl použit i pro hodnocení vlivu fluorantenu (Kummerová et al., 1994). V některých studiích byly použity modifikace této metodiky. Pro hodnocení fotoindukované toxicity tří PAHs (antracen, benzo(a)pyren a fluoranten) na řepku setou (Brassica napus L.) byl uplatněn test klíčivosti semen a test růstu klíčních rostlin (Ren et al., 1996), ve kterém byla hodnocena celková délka kořene a hypokotylu, čerstvá hmotnost kořenů a stonku a obsah chlorofylů. Feng et al. (1996) studovali účinky substituovaných anilinů a fenolů na elongaci kořene čínského zelí (Brassica chinensis L.) a stanovili hodnotu EC50. Z výsledků testu vyplývá, že čínské zelí je pro svou vysokou citlivost vhodným druhem pro testování toxicity organických sloučenin. Na základě výsledků testu elongace kořene a hypokotylu klíčních rostlin salátu hlávkového (Lactuca sativa L.) byla hodnocena aktivita světlem aktivovaných inhibitorů (rose bengal a fluoren-9-one) (Tsao a Eto, 1996). Toxicita půdy kontaminované As, Cd, Cu, Pb a Zn byla hodnocena testem klíčivosti a testem elongace kořene, který prokázal citlivější odezvu na přítomnost toxických kovů (Kapustka et al., 1995). Pořadí citlivosti testovaných druhů bylo: tolice vojtěška (Medicago sativa L.), salát hlávkový (Lactuca sativa L.) a pšenice obecná (Triticum aestivum L.). Test klíčivosti semen salátu hlávkového (Lactuca sativa L.) byl použit i pro posouzení subletální toxicity účinků odpadních vod z ropných rafinerií (Sherry et al., 1997). Test elongace kořene (Cucumis sativus L.) byl použit pro hodnocení fytotoxicity extraktů

45

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik z podzolické půdy, které byly získány různými extrakčními metodami (Steen et al., 1994). Kořeny klíčních rostlin byly houbovité a nahnědlé, vedlejší kořeny a rhiziny zcela chyběly. Délka hlavního kořene byla významně redukována. Test elongace kořene je často hodnocen jako jednoduchý a vysoce reprodukovatelný screening sedimentů, půd a čistírenských kalů (Hiley, 1994). Dle Hileyho (1994) má následující výhody: •

elongace kořene patří mezi raná stádia vývoje rostliny a není tedy nutné nákladné předpěstování testovaných rostlin. Agentura Yorkshire Water Services požaduje uvedený test pro posouzení toxicity recyklovaných materiálů (kaly, sedimenty) (Hiley et Metcalfe, 1994);

•

použitý rozdrcený křemen je inertní; v testech s řasami a okřehkem hrbatým (Lemna gibba L.) mohou složky media interagovat se složkami testovaných látek a důsledkem toho může být pokles nebo nárůst hodnot toxicity testované látky (Urquhart et Chalk, 1979-82);

•

test je citlivý na organické a anorganické kontaminanty (herbicidy, dichlorfenol a toxické kovy). Kořen rostlin reaguje citlivěji pravděpodobně z důvodu těsné blízkosti meristematických pletiv a toxikantu. V neposlední řadě test elongace kořene umožňuje testovat komplexní směsi a předpovědět jejich účinky. Test klíčivosti semen a test elongace kořene (Lactuca sativa L., Avena sativa L.) byl

použit pro hodnocení účinnosti bioremediace půdy, která byla silně kontaminovaná polychlorovanými bifenyly (Meier et al., 1996). Při hodnocení účinnosti detoxikace půd kontaminovaných PAHs (např. fluoranten) byl po aplikaci hub degradujících lignin použit test klíčivosti semen: salátu hlávkového (Lactuca sativa L.), ovsa setého (Avena sativa L.) a prosa setého (Panicum miliaceum L.); a test elongace kořene (Baud-Grasset et al., 1993). Výběr vyšších rostlin pro uvedené testy byl dle autorů podmíněn tím, že vegetace je dominantní biologickou složkou suchozemských ekosystémů, na níž se odráží toxicita nebezpečných odpadů ze skádek. Vzhledem k tomu, že toxicita může být specifická pro daný rostlinný druh, byly pro hodnocení testu vybrány druhy z různých čeledí. Testem klíčivosti semen byla hodnocena u půdních vzorků přímá toxicita půd, testem elongace kořene byla hodnocena nepřímá toxicita remediované půdy. Výsledky testů prokázaly: •

nejnižší citlivost semen ovsa (Avena sativa L.);

•

stejnou citlivost klíčních rostlin prosa (Panicum miliaceum L.) a salátu (Lactuca sativa L.) v testech elongace kořene;

46


nejvyšší citlivost semen salátu (Lactuca sativa L.) na přítomnost PAHs (test klíčivosti semen), avšak nižší citlivost k metabolitům PAHs než u semen prosa (Panicum miliaceum L.);

•

nejvhodnějším druhem pro test klíčivosti semen a test elongace kořene bylo proso (Panicum miliaceum L.);

•

výraznou detoxikaci půd po aplikaci hub a odstranění původních sloučenin aplikovanými houbami;

•

menší citlivost testu elongace kořene ve srovnání s testem klíčivosti semen v důsledku nedostatečné extrakce sloučenin z půdy do vodní fáze z důvodu jejich nízké rozpustnosti ve vodě;

•

použitelnost obou testů při environmentálním monitoringu a hodnocení účinnosti technologií při remediaci kontaminovaných půd. Při interpretaci výsledků, získaných rozdílnými metodickými postupy, by však neměly

být opomenuty následující skutečnosti: •

citlivost rostlinného organizmu vůči příslušné xenobiotické sloučenině musí být posuzována komplexně, tzn. s ohledem na typ toxické látky, podmínky prostředí (např. koncentrace, doba expozice), použitou metodu a řadu dalších faktorů;

•

výsledky získané pro určitý rostlinný druh nelze zcela jednoznačně extrapolovat na jiné druhy vzhledem k možné rozdílné citlivosti různých rostlinných druhů a genotypů vůči jednotlivým sloučeninám;

•

pro objektivní posouzení rizikovosti xenobiotické sloučeniny je nutné hodnotit v příslušných testech fytotoxicity více parametrů (např. elongace kořene, enzymatická aktivita, rychlost fotosyntézy, rychlost růstu);

•

nezbytnost správné interpretace při reprodukci výsledků laboratorních testů na přirozené podmínky (např. mikrobiální aktivita, pH, obsah organické hmoty, obsah živin);

•

výsledky testů by měly být posuzovány v časovém kontinuu a s ohledem na interakci mezi jednotlivými druhy.

Tabulka 9 Používané testy fytotoxicity Test

Měřená odezva

elongace kořene

délka kořene

enzymatický test

aktivita enzymů 47

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik fyziologické testy

rychlost fotosyntézy, rychlost respirace

klíčivost semen

procento vyklíčených semen

produkce biomasy

sušina

růst klíčních rostlin

výška rostlin, velikost listové plochy

životní cyklus

výška rostliny, sušina, počet květů, plodů a semen

2.8. Výhody a nevýhody testů fytotoxicity Testy fytotoxicity jsou součástí komplexu testů, kterými lze posoudit toxicitu chemických látek (např.: pesticidů, herbicidů, odpadních vod) nebo oblastí s nebezpečným odpadem. Testy toxicity s rostlinami, především test klíčivosti semen, test elongace kořene a test růstu klíčních rostlin, mají na rozdíl od testů s živočichy několik výhod. Například semena rostlin jsou získávána ve velkém množství a lze je uchovat po dobu jednoho roku

i

déle. Náklady pro verifikaci testu jsou tedy minimální. Vzorky vod s nízkou hodnotou rozpuštěného kyslíku (odpadní nebo podzemní vody), nevyžadují při testech fytotoxicity provzdušnění. Vzorky vod s vysokým stupněm kalnosti (turbidity) není nutné filtrovat, avšak při testech s řasami, Daphnia a rybami musí být vzorky přefiltrovány. Testy klíčivosti a elongace kořene nevyžadují v kontrolním roztoku (destilovaná voda) přítomnost živin, které by mohly být absorbovány rostlinným materiálem a interagovat s ním. Vědecké poznatky o fytotoxických účincích látek jsou založeny na testech s druhy sladkovodních řas (Lewis, 1995). Neumožňují se však zcela zodpovědně vyjádřit k vlivu toxikantu na vyšší rostliny (Swanson et al., 1991). K dalším úskalím testů fytotoxicity náleží: výběr rostlinného druhu resp. genotypu, kultivační podmínky, testovací metody (laboratorní mikrokosmos, mezokosmos a polní testy), měřená odezva (klíčivost semen, růst rostlin, biochemické a fyziologické procesy) a v neposlední řadě cesta expozice. Některé výhody a nevýhody testů fytotoxicity jsou uvedeny v tabulce 10.

48


Tabulka 10 Výhody a nevýhody testů fytotoxicity (test klíčivosti semen, test elongace kořene, test růstu klíčních rostlin) v porovnání s testy toxicity s živočichy (Wang a Freemark, 1995) Výhody Různá testovací média - lze testovat vzorky ovzduší, vody, odpodních vod, vzorky půd a sedimentů Různý druh měřené odezvy - biomasa a s ní související indikátory růstu (např. výška rostliny, listová plocha, obsah chlorofylů) Produkce kyslíku rostlinami - není nutná aerace vzorků kapalin Vzorky testovaných semen - snadná dostupnost a dostatečný počet semen pro testování Barva a kalnost - kapalné vzorky nemusí být fitrovány Udržování kultivace - minimální finanční náklady Požadavky na světelné podmínky (osvětlení) - závisí na typu hodnoceného parametru (např. hodnocení fotodegradovatelných nebo fotosenzitivních sloučenin) Použití destilované vody jako kontrolního vzorku - není nutné přidávat do kontrolního vzorku vody živiny Toxicita - uplatění testů pro testování fytotoxicity chemických látek Typ testu - testy jsou vodné pro laboratorní monitoring, testování ve skleníku a při in situ biomonitoringu 49


Nevýhody Databáze - nedostatečné informace o fytotoxicitě chemických látek Expozice toxických látek - nutnost dlouhodobé expozice Toxické účinky - v závislosti na koncentraci mohou být účinky testované látky stimulující nebo inhibující Půdní faktory - vliv půdních faktorů na růst rostlin a toxicitu látek

50


2.9. Aplikace testů fytotoxicity Testy fytotoxicity se využívaly již na počátku 20. stol., ale velmi sporadicky. Teprve v roce 1970 byly vytvořeny testovací metody, které se i v současnosti používají ke stanovení toxických

účinků

komerčně

vyráběných

chemických

látek

(především

pesticidů),

nebezpečných odpadů (zvláště průmyslových a městských odpadních vod), kontaminovaných sedimentů a výluhů. Současným trendem v ekotoxikologii je výběr vhodných testovacích organizmů z různých trofických úrovní: bakterie, řasy, rostliny, bezobratlí a obratlovci. Tento postup je nezbytný pro hodnocení neznámých kontaminantů, komplexních směsí nebo nebezpečných odpadů, neboť některé nebezpečné látky mohou mít negativní vliv na organizmy z různých trofických úrovní. V posledních letech uplatnění testů fytotoxicity nabývá na významu. K častějšímu použití přispívá zejména vzrůstající počet environmentálních regulačních opatření, které požadují provedení testů (Freemark et Boutin, 1994b).

2.9.1. Biomonitoring polutantů Rostliny jako ,,plíce Země“ pročišťují vzduch. Proto se mohou zvláště vyšší rostliny uplatnit při rozsáhlém a dlouhodobém monitoringu vzdušných polutantů (např.: radionuklidy, kyselý déšť a ozon) v regionálním, kontinentálním nebo globálním měřítku (Weinstein et al., 1990). Pro určení kvality vzduchu uvnitř objektů (indoor air) se využívá jako účinný biomonitor rod Tradescantia. Použití rostlin jako biofiltrů při hodnocení kvality vzduchu by mohlo mít značný význam při komerčních a environmentálních aplikacích kontaminantů. 2.9.2. Hodnocení environmentální mutagenity U řas a vyšších rostlin byla zjištěna aktivace promutagenů v mutageny podobnými mechanismy jako u savců (Plewa, 1991). US EPA Gene-Tox databáze určila 91% shodu výsledků získaných z testů s rostlinami a z testů se savci (Sandhu et al., 1991). Jak již bylo výše uvedeno, testy fytotoxicity jsou z environmentálních testovacích systémů nejjednodušší a finančně nejméně náročné. Kromě toho rostliny přednostně přijímají a akumulují významné kontaminanty prostředí. Mnoho rostlinných druhů, především zemědělské plodiny, je běžně exponováno vysokými dávkami různých chemických látek, z nichž některé jsou 51

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik mutageny nebo promutageny. Rostlinami se následně mohou dostávat do potravního řetězce a tak ohrožovat i lidské zdraví. 2.9.3. Hodnocení toxicity chemických látek Nepříznivé účinky pesticidů a herbicidů se projevují při jejich akumulaci v rostlinách, následkem celosvětově rozšířené a neustále se zvyšující aplikace těchto ochranných prostředků v prostředí. Kontaminace těmito látkami je i v současnosti považována za jednu z hlavních příčin úbytku vodní vegetace (Pimental et al., 1991). Z tohoto důvodu hrají testy fytotoxicity klíčovou úlohu v předpovědi účinků herbicidů na vodní ekosystémy. Fytotoxické účinky se mohou projevit také i na neošetřených půdách, kde může dojít ke změně rostlinného společenstva (Freemark et Boutin, 1994a) a následně přes toxické vlivy chemických látek na rostliny může být ovlivněna divoká zvěř. Z kapitoly Aplikace testů fytotoxicity je patrno, že jsou údaje o fytotoxicitě požadovány při registraci a přeregistrování komerčně vyráběných chemických látek. Při hodnocení toxicity různých pesticidů bylo použito 68 druhů řas (Swanson et al., 1991) a 52 druhů při hodnocení fytotoxicity detergentních surfaktanů (Lewis, 1990). Laboratorní a polní testy s řasami byly využity pro hodnocení účinků herbicidů (Larsen et al., 1986), surfaktanů (Lewis et Hamm, 1986), kovů (Spencer et Greene, 1981) a ropných produktů (Gaur et Singh, 1991). Při určování fytotoxicity různých chemických látek mají důležitou roli i testy s okřehem hrbatým a okřehkem menším (Lemna gibba L., Lemna minor L.). Tyto rostlinné druhy byly vybrány pro svoji vhodnou velikost, snadnou kultivaci a krátkou reprodukční dobu. Okřehek menší (Lemna minor L.) byl v porovnání s vybranými druhy živočichů citlivější na přítomnost některých kovů (Wang, 1986), odpadních vod (Taraldsen et NorbergKing, 1990) a pesticidů (Alexander et Hughes, 1993), ale méně citlivý na surfaktanty (Bishops et Perry, 1981) a některé organické látky (Cowgill et al., 1991). Uvedený rostlinný druh byl použit i při hodnocení toxicity fenantrenu a jeho hlavního fotoproduktu fenantrenchinonu (McConkey et al., 1997). Z druhů vyšších rostlin bývá při hodnocení toxicity pesticidů nejčastěji používán stolístek klasnatý (Myriophyllum spicatum L.) a zejména proso seté (Panicum miliaceum L.), které má pro experimenty vhodné vlastnosti (Wang, 1992). Řada prací dokládá schopnost vyšších rostlin akumulovat kovy (Tripathi et Chandra, 1991) a pesticidy (Hinman et Klaine, 1992). U rodu Hydrilla byla popsána metoda měření příjmu pesticidů ze sedimentů (Hinman et Klaine, 1992). Problematice účinků neutrálních organických látek, akrylátů, benzotriazolů,

52

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik polykationtových polymerů, surfaktantů, pesticidů a kovů na růst a fotosyntézu rostlin se věnuje mnoho autorů (např. Alexander et Hughes, 1993). 2.9.4. Biomonitoring odpadních vod Biomonitoring odpadních vod se stal součástí hodnocení kvality vod. Pevné nebo kapalné složky efluentů, které nemusí být toxické pro korýše a ryby, mohou po vypuštění do vodního toku poškodit nebo usmrtit vodní vegetaci (Mayes et al., 1987). Submerzní druhy rostlin se při testování toxicity odpadních vod jeví jako citlivější a mají i menší schopnost konkurovat tolerantnějším druhům (Dickman et al., 1983). Proto mohou odpadní vody výrazně ovlivňovat četnost a distribuci rostlinných druhů v oblastech zasažených efluenty. Negativní působení odpadních vod na vegetaci může být demonstrováno pouze příslušnými testy fytotoxicity a rozsáhlým biomonitoringem. Testy toxicity s řasami, používané State and Federal Regulators and Consulting Laboratories při biomonitoringu, jsou společně s testy s Daphnia a rybami součástí základní sady testů hodnotících toxicitu odpadních vod, která je požadována příslušnými zákony. US EPA (Weber et al., 1989) doporučuje použít pro stanovení toxicity městských a průmyslových odpadních vod test s zelenou řasou Selenastrum capricornutum (Printz). Některé druhy řas (Claesson, 1984), okřehku (např.: Lemna gibba L., Lemna minor L.) (Taraldsen a Norberg-King, 1990) a vyšších rostlin (např.: Lactuca sativa L.) (Sherry et al., 1997) byly použity i při stanovení fytotoxických účinků odpadních vod z domácností, textilních a papírenských závodů, z továren na výrobu pesticidů, z těžby nerostných surovin a z rafinerií. Ve většině případů vykazovaly testované druhy rostlin citlivější odezvu na toxické účinky odpadních vod než testované druhy živočichů. Při ,,ekologickém dozoru“ se používají vyšší rostliny jako in situ bioindikátoři kvality vod

díky

schopnosti

akumulovat

chemické látky (kovy, pesticidy), což potvrdily i

laboratorní a polní testy (Hinman a Klaine, 1992). Dalším důvodem výběru vyšších rostlin pro biomonitoring vod je jejich imobilita a vysoké procento zastoupení vyšších rostlin v ekosystému mokřad. Úroveň a kvalita testů by mohla být dle některých autorů (Taraldsen a Norberg-King, 1990; Walsh et al., 1991) zvýšena začleněním i jiných druhů vyšších rostlin jako je např.: rdest hřebenitý (Potamogeton pectinatus L.), šípatka střelolistá (Sagittaria sagittifolia L.), orobinec širokolistý (Typha latifolia L.) a vodní mor kanadský (Elodea canadensis Michx.). K posouzení fytotoxicity chemických látek a odpadních vod je využíván rovněž test klíčivosti semen a test elongace kořene různých druhů suchozemských a vodních rostlin. Pro 53

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik testy toxicity se semeny suchozemských rostlin je standardizováno několik testovacích metod (US EPA, 1982; OECD, 1984; US FDA, 1987). Výsledky těchto testů mají regulační význam (Wang, 1991). Semena vodních rostlin (tabulka 11) jsou při testech exponována po dobu 5 dní buď v testovaném vzorku, nebo na filtračním papíře s roztokem toxikantu. Účinky na klíčení semen a elongaci kořene jsou vyjádřovány hodnotami EC50 a NOEC. Světelné a teplotní podmínky experimentu jsou druhově specifické. Používání biologických testů a bioindikátorů, předpovídajících negativní účinky chemických látek na populace a společenstva, může být přínosem pro vývoj technologií snižujících škodlivost odpadních vod a pro tvorbu ekologicky významných opatření.

Tabulka 11 Přehled druhů vodních rostlin, jejichž semena se používají v testech klíčivosti Mořská voda Atriplex patula (L.) Spartina alterniflora (Loisel.) Sladká voda Echinochloa walteri (Pursh) A. Heller Echinochloa crus-galli (L.) Leersia oryzoides (L.) Sw. Nelumbo lutea (Willd.) Oryza sativa (L.) Rorippa nasturtium-aquaticum (L.) Hayek Zizania aquatica (L.)

2.9.5. Hodnocení kvality sedimentů Submerzní a emergentní druhy vyšších rostlin jsou kontaminanty exponovány přes kořenový systém a nadzemní části. Proto mohou být použity při hodnocení kvality vod nebo sedimentů. Stupeň příjmu chemické látky závisí: na rostlinném druhu, analyzovaném rostlinném orgánu a environmentálních faktorech (pH, teplota, přítomnost dalších toxikantů, množství organické hmoty a v neposlední řadě obsah jílu v sedimentech). Kontaminované sedimenty mohou ovlivnit vodní rostliny několika způsoby: inhibicí růstu kořene a nadzemní části, poškozením listů v důsledku transformace chemických látek,

54

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik redukcí produkce semen. V řadě studií s cévnatými rostlinami byla hodnocena toxicita kovů (Kay et al., 1984), herbicidů (Hinman et Klaine, 1992), surfaktantů (Huber et al., 1987) a chloridů (Watkins et Hammerschlag, 1984). Byly sledovány následující parametry: aktivita peroxidázy, obsah chlorofylů, rychlost fotosyntézy a rychlost růstu. Nejčastěji doporučovaným druhem pro testování kvality sedimentů je okřehek (Lemna gibba L., Lemna minor L.) (APHA et al., 1992). V jiné studii se okřehek uplatnil při stanovení toxicity reziduí uhlí a kontaminovaných sedimentů (Jenner et Janssen-Mommen, 1993). Vedle okřehku jsou pro hodnocení toxicity vod a sedimentů doporučovány: rod Hydrilla, salát hlávkový (Lactuca sativa L.), proso seté (Panicum miliaceum L.) a rýže setá (Oryza sativa L.) (Lewis, 1995). 2.9.6. Hodnocení bioremediace Testy fytotoxicity jsou často zařazovány do komplexu testů hodnotících kontaminaci určité oblasti. V poslední době se zvyšuje zájem o začlenění těchto testů do ekologického hodnocení míst s nebezpečným odpadem a jejich použití při rozhodování o remediačních opatřeních (,,vyčištění“) (DeSesso, 1995), která zaznamenávají v poslední době velký rozvoj. Jedná se o jeden z alternativních způsobů odstraňování xenobiotik z kontaminovaných půd. Je ekonomicky méně náročný než fyzikálně-chemické postupy odstraňování cizorodých látek a jeho velkým kladem je i přirozenost pro ekosystémy, neboť jsou k dekontaminaci využity zelené rostliny (Kučerová et al., 1999). Druhy rostlin, používané pro fytoremediaci půd, jsou uvedeny v tabulce 12. Testy fytotoxicity hodnotí toxický účinek všech kontaminantů, včetně nedefinovaných sloučenin a toxických produktů vzniklých v průběhu remediačního procesu. Získané výsledky se v současné době uplatňují při monitoringu kontaminace a remediace daného místa a slouží ke zhodnocení nových remediačních technologií kontaminovaných vod a sedimentů v oblastech s výskytem nebezpečných odpadů (Lambolez et al., 1994). Druh zelené řasy Selenastrum capricornutum (Printz) má nezastupitelnou úlohu při stanovení toxicity ropných produktů po remediaci a výluhů nebezpečných odpadů (Greene et al., 1988). Například účinnost remediace půdy kontaminované PCBs byla hodnocena testem klíčivosti semen a testem elongace kořene salátu hlávkového (Lactuca sativa I.) a ovsa setého (Avena sativa L.) (Meier et al., 1996). Zmíněné testy se uplatnily i při hodnocení celkové redukce toxicity půdy po remediaci houbami, protože míru toxicity chemických sloučenin ve vzorcích nelze vždy spolehlivě určit chemickými analýzami a odstranění původních sloučenin nemusí indikovat

55

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik detoxikaci půdy (Baud-Grasset et al., 1993). Z výsledků testů vyplývá, že je nezbytné zahrnout stanovení toxicity chemických látek do procesu hodnocení remediačních technologií a jejich modifikací. Další informace o využití rostlin pro remediaci jsou uvedeny v kapitole Fytoremediace.

Tabulka 12 Druhy rostlin využívané k fytoremediaci půd Rostlinný druh

Typ kontaminantu

tolice vojtěška (Medicago sativa L.)

chlorované organické sloučeniny

rod Salicaceae (Populus L.)

atrazinové a dusíkaté polutanty

stolístek klasnatý (Myriophyllum L.)

trinitrotoluen

mrkev obecná (Daucus carota L.)

dichloro-difenyltrichloroethan

cukina obecná (Cucurbita pepo L.)

dibenzofurany

dýně obecná (Cucurbita pepo L.)

dibenzofurany

borovice lesní (Pinus silvestris L.)

trichlorethylen

ořešák černý (Juglans nigra L.)

PCBs

javor červený (Acer rubrum L.)

PCBs

javor curový (Acer saccarum L.)

PCBs

56


2.10. Fytoremediace U vyšších rostlin existují dvě základní strategie ve vztahu k toxickým kovům. Rostliny typu „metal excluders“ účinně zabraňují vstupu kovů do kořenů a nadzemních částí. Rostliny typu „metal non-excluders“ hromadí kovy v nadzemních částech. Do této skupiny patří indikátory

(obsah

kovu

v půdě

je

ekvivalentní

obsahu

kovu

v

rostlině)

a

hyperakumulátory (hromadí v nadzemních částech vyšší koncentrace kovů než jaké jsou v půdě) (Tlustoš et al., 2006). Hyperakumulační schopnost některých rostlin může být východiskem pro řešení remediace půd kontaminovaných toxickými kovy. Tyto rostliny jsou schopny extrahovat kovy z kontaminované půdy a uložit je ve svých nadzemních orgánech (Masarovičová et al., 2002). Užití zelených rostlin k akumulaci nebo odstraňování kontaminantů životního prostředí se

nazývá

fytoremediace.

fytovolatilizaci

a

Ta

fytostabilizaci.

zahrnuje

fytoextrakci,

Fytoextrakce,

též

fytodegradaci, nazývaná

rhizofiltraci,

fytoakumulace

či

fytodekontaminace, představuje příjem a transport toxických kovů z půdy a jejich akumulaci v kořenech a nadzemních částech. Kontaminované rostliny jsou po sklizni uloženy na bezpečné úložiště nebo zpracovány termálně či chemicky. Při fytodegradaci rostlina kontaminanty přemění a zabuduje do svých struktur. Rhizofiltrace se využívá především u kontaminovaných vodních ekosystémů, kdy kořeny rostlin absorbují toxické kovy a koncentrují je. Fytovolatilizace je způsob dekontaminace, kdy rostlina přijímá kontaminant z půdy a tranportuje ho do listů. Zde je zřejmě změněn na těkavou a méně toxickou formu. Fytostabilizace je definována jako využití rostlin k transformaci kovů v půdě na méně toxické formy, přičemž nedochází k jejich odstraňování z půdy. Rostliny produkují metabolity, které následně vysráží kov, čímž se zabrání jeho dalšímu pohybu (Masarovičová et al., 2002). Fytostabilizaci lze využít při zajištění a přípravě kontaminované oblasti před dekontaminací nebo při regulaci průtoku kontaminované vody půdním sedimentem a při jejím zadržování v problémové oblasti. Aplikace rostlin v kontaminovaných oblastech má řadu výhod (Kučerová et al., 1999): •

dochází až k mineralizaci organických sloučenin;

•

je vhodná pro různé typy kontaminantů;

•

nízké náklady;

•

energie je získávána ze slunečního záření; 57


minimálně poškozuje okolí;

•

estetický přínos;

•

je dobře přijímána veřejností.

Nevýhody fytoremediace: •

je pomalejší než běžné fyzikálně-chemické metody;

•

je možné negativní ovlivnění průběhu dekontaminace změnou životních podmínek (kyslík, voda, živiny);

•

je možný vliv dalších faktorů (například struktura půdního profilu, pH, koncentrace solí a polutantů, přítomnost dalších toxinů);

•

u biologických metod nedochází ke 100% odstranění polutantů. K fytoremediaci půd se využívají druhy, které mají dobré předpoklady pro růst a

detoxikaci kontaminovaného prostředí. Jedná se o vysokou specifickou strategii a vysoký podíl příjmu plynoucí z existence Cd-specifických transportních kanálů nebo přenašečů v membránách kořenových buněk (Schwartz et al., 2003). Ke skupině hyperakumulátorům, které se využívají pro remediační účely, patří víceleté trávy s hlubokým kořenovým systémem nebo dřeviny rodu vrba (Salix) a topol (Populus). Perspektivní mohou být i rostliny, produkující sekundární metabolity, například třezalka tečkovaná (Hypericum perforatum L.) nebo heřmánek pravý (Matricaria recutita L.) (Masarovičová et al., 2002). 2.10.1. Enzymy, účastnící se degradačních a detoxikačních reakcí v buňce Již před několika lety bylo dokázáno, že rostliny obsahují enzymy podobné enzymovým systémům v játrech, hlavním místě metabolizace xenobiotik u savců. Byly detekovány O-glukosyl a O-malonyltransferázy, a N-glukosyl a N-malonyltransferázy se specifitou k chemickým látkám používaným jako změkčovadlo plastických hmot. Detoxikační funkci, mimo jiné, plní i enzymy označované souhrnně jako cytochrom P-450. V praxi byly některé rostlinné enzymy použity při dekontaminaci polutantů obsahujících fenolické sloučeniny (Kučerová et al., 1999). Detoxikační efekt byl zprostředkován kořenovými peroxidázami obsaženými v rostlinném pletivu. Tyto oxidoreduktázy byly schopné oxidovat fenol a aromatické aminy na volné radikály nebo na chinony. Oxidační produkty se vázaly mezi sebou a výsledkem byly ve vodě nerozpustné oligomery, které se v půdním prostředí vázaly na humus. Vznik oligomerů byl doprovázen detoxikačním efektem. Zpětné uvolňování dekontaminovaných polutantů z oligomerů nebo humusu probíhá ve velmi malém měřítku. Kořenové peroxidázy jsou v současné době nejstudovanějšími enzymy

58

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik užívanými při dekontaminaci. Kromě nich jsou dobře prozkoumány izoenzymy glutation–Stransferázy se specifitou k určitým herbicidům a pšeničné esterázy, jejichž substrátem může být změkčovadlo plastů (například bis(ethylhexyl)ftalát). Nevýhodou enzymatických metod je jejich ekonomická náročnost, především kvůli požadované 70–100% čistotě enzymů.

2.10.2. Využití fytoremediace v praxi Každá oblast, kontaminovaná určitým typem anorganických nebo organických látek, vyžaduje jiný typ rostliny nebo větší počet rostlinných druhů ve skupině. Velmi výhodné pro fytoremediaci jsou stromy z rodu Salicaceae (topoly a vrby), které jsou odolné a velmi rychle rostou. Byly použity vzorky hybridních topolů (Populus deltoides nigra L., DN 34), které mají upravený kořenový systém pro růst do velkých hloubek. V období sucha dosahují kořeny až k hladině spodní vody a tvoří hustou síť, která slouží k odběru vody. Topoly zajišťují půdní prosakování a snižují migraci polutantů. V Oregonu byly topoly vysázeny na městských plochách s cílem snížit hladinu prašnosti. Po třech letech byla hladina prašnosti výrazně snížena a navíc byla půda zbavena kontaminantů. Obecně se zdají být topoly vhodné pro remediaci, ale vyšší koncentrace kovů, solí nebo amonných sloučenin jsou pro ně toxické. Vodní hyacinty byly použity jako součást programu pro čištění užitkové vody před vypouštěním do řek. Jedním ze zavedených způsobů fytoremediace je užití mrkve (Daucus carota L.) pro absorpci dichloro-difenyltrichloroethanu. Při odstraňování lipofilních polutantů byly při testech na polích použity cukina (Cucurbita pepo L.), dýně (Cucurbita pepo L.) a okurka (Cucumis sativus L.). Cukina a dýně vykazovaly vysokou schopnost akumulace dibenzofuranů z půdy, okurky pak vyšší schopnost absorpce ze vzduchu.

59


2.11. Klíčení semen Klíčení je obnovení metabolické aktivity semen vedoucí k prodlužování buněk radikuly a hypokotylu embrya (zárodku). Proces vývoje embrya se nazývá embryogeneze. Embryo vzniká z oplozené (diploidní) vaječné buňky (zygoty). Ta se nejprve příčně rozdělí na menší buňku apikální a větší bazální, které se pak dále dělí. Dalším dělením, jehož postup je charakteristický pro určité systematické skupiny, vzniká vlastní embryo a suspenzor (Luxová, 1974). Z anatomického hlediska tvoří zárodek drobné tenkostěnné meristematické buňky s mezibuněčnými prostory. Hlavní výživné pletivo embrya krytosemenných rostlin (endosperm) se vyvíjí v zárodečném vaku až po oplození, kdy také vzniká z integumentů vajíčka osemení (testa). Ve zralých semenech je zárodek u jednotlivých rostlinných druhů na různém stupni diferenciace. U většiny krytosemenných se skládá z radikuly, hypokotylu, děloh a plumuly. V ontogenezi rostlin představuje semeno embryonální stádium (Erdelská, 1971). Se zráním semene souvisí složité strukturální změny osemení, spojené se syntézou celulózy, ligninů, suberinu, kutinu a dalších látek. Tyto látky propůjčí osemení značnou mechanickou i chemickou odolnost a podmiňují tak ochranu zárodku a jeho živých pletiv (Luxová, 1974). Přijmem vody do koloidního systému semen (bobtnání) je narušen klid semen (dormance). Dochází k aktivaci dýchání, stupňuje se enzymatická aktivita. Ta je nezbytná k mobilizaci látek uložených v endospermu, dělohách, popř. v perispermu a využívaných pro výživu klíčícího embrya. Poté dochází k růstu radikuly embrya skrze prasklou testu. Kořínek roste zprvu prodlužováním buněk vytvořených v embryu. Teprve poté začíná mitotická aktivita v kořenovém systému (Antipova et Obroucheva, 1994). Růst kořínku po určitou dobu inhibuje růst nadzemní části. U dvouděložných rostlin je klíčení buď nadzemní (epigeické) nebo podzemní (hypogeické). U trav (jednoděložné rostliny) jedna děloha zakrněla v tzv. epiblast. Za vlastní dělohu je považován štítek (scutellum). Slouží k čerpání živin z endospermu a pro metabolismus hormonů. Plumula je u trav krytá kápovitým primárním listem (koleoptilí). Během klíčení je auxin z endospermu obilek transportován do štítku, kde je převeden do inaktivní (vázané) formy. Ve vrcholu koleoptile dochází k opětovné aktivaci vázané formy auxinu, která pak proudí bazipetálně, přičemž vyvolává růst prodlužovací zóny pod vrcholem.

60

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik 2.11.1. Biochemické změny při klíčení S příjmem vody do semene dochází k zvýšení intenzity dýchání. V prvních etapách klíčení (do 24-36 hod.) převažuje u všech semen anaerobní typ dýchání. Po 24-36 hodinách od začátku klíčení probíhá aerobní systém citrátového cyklu (vznik ATP oxidační fosforylací). Vizuálnímu klíčení semen předchází aktivace mitochondriálních systémů. Současně probíhá enzymatická mobilizace zásobních látek semen a translokace látek do zárodku. Nejčastější zásobní látkou je škrob. Na jeho štěpení se podílí amylázy (α, β), fosforylázy nebo maltáza. Syntéza α-amylázy souvisí s účinkem kyseliny giberelové. Gibereliny jsou endogenními regulátory klíčení semen. V embryu semene se gibereliny hromadí ve vázané (inaktivní) formě. Po inhibici se uvolní z vázané formy a embryo začíná syntetizovat kyselinu giberelovou de novo. U ječmene difundují gibereliny do aleuronové vrstvy endospermu, ve které indukují tvorbu α-amylázy a dalších hydrolytických enzymů (Jacobsen et al., 1995). Hydrolytické enzymy přecházejí do endospermu, kde odbourávají zásobní cukry a bílkoviny. Indukce α-amylázy je účinně inhibována kyselinou abscisovou. Ta indukuje syntézu proteinového inhibitoru α-amylázy. Bílkoviny jsou zásobními látkami u některých semen. Obsahují značné množství glutaminu, argininu a asparaginu. Jsou štěpeny proteázami a vzniklé jednodušší sloučeniny pak peptidázami na aminokyseliny a amidy. 2.11.2. Klíčivost semen Klíčivostí se rozumí počet klíčících semen schopných dalšího vývoje. Podle normy se v určených dnech stanoví nejprve energie (rychlost) klíčení a poté vlastní klíčivost. Vyjadřuje se nejčastěji v procentech. Semena ztrácejí i v optimálních podmínkách po určité době životnost, neboť dochází k degradaci DNA. K optimálním podmínkám skladování patří kromě snížení obsahu vody i snížení teploty. Ztráta klíčivosti semen během doby skladování souvisí především s poruchami transkripce a translace nukleových kyselin a tím i s poklesem enzymatické aktivity.

61

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik 2.11.3. Vnější podmínky klíčení 2.11.3.1. Voda Je nezbytná pro zbobtnání semen. Testa je pro vodu nejvíce prostupná kolem hila. Příjem vody se zvyšuje se vzestupem teploty. Největší stupeň hydratace je v embryu. Jakmile obsah vody v embryu dosáhne více jak 60%, začnou se aktivovat metabolické systémy. Příjem vody souvisí také s transportem organických sloučenin ze zásobních částí semen. Když pak kořínek embrya prorazí osemení, dojde k dalšímu zvýšení rychlosti přijmu vody. Hranice mezi fyzikálním procesem bobtnání semen a jejich biochemicko-fyziologickou aktivitou není ostrá. Syntéza RNA začíná např. v embryu pšenice již za 30 minut po začátku bobtnání (Hess, 1983). Na proces klíčení mohou nepříznivě působit některé retardanty, vysoká koncentrace solí v půdě a v neposlední řadě toxické kovy.

2.11.3.2. Kyslík Je nezbytnou podmínkou klíčení, neboť energie potřebná pro proces klíčení se získává při oxidační fosforylaci. Jen bažinné rostliny mohou klíčit téměř bez kyslíku. Jejich klíční rostliny jsou schopny využít energie glykolýzy.

2.11.3.3.Teplota U teploty rozlišujeme kardinální teplotní body (minimum, optimum, maximum). Teplomilné rostliny mají tyto body (zvláště minimum) posunuty výše. Většina semen klíčí v laboratorních podmínkách při konstantní teplotě. Semena některých druhů však nejsou schopná klíčit bez kolísání teplot, které je v přírodě obvyklé. Teplota potřebná pro klíčení semen se uplatňuje i při chladové stratifikaci, při níž dochází k odbourání inhibičních látek podílejících se na dormanci semen.

2.11.3.4. Světlo Světlo většinou není podmínkou klíčení. Některá semena však klíčí rychleji na světle než ve tmě. Podle toho rozdělujeme druhy na kladně fotoblastické (světlo klíčení stimuluje) a záporně (světlo klíčení inhibuje) fotoblastické. Kladně fotoblastická semena nemívají dostatek zásobních látek a klíční rostliny proto musí rychle dosáhnout podmínek, které jsou vhodné pro jejich autotrofní existenci. Negativní reakce na světlo se může uplatnit v případě, kdy 62

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik nejsou vhodné podmínky pro klíčení (dostatečná půdní vlhkost) ve větších hloubkách pod povrchem půdy, např. u druhů v aridních oblastech. Pozitivně fotoblastická reakce se může projevovat v požadavku na dlouhou fotoperiodu při klíčení a negativně fotoblastická reakce v požadavku na krátkou fotoperiodu při klíčení. Klíčení v zásadě ovlivňuje červená a modrá oblast viditelného záření. Význam modré složky je při klíčení menší než význam červené složky. Fytochrom (červená oblast viditelného záření) působí při klíčení prostřednictvím stimulace biosyntézy fytohormonů, zvláště giberelinů. 2.11.4. Vnitřní podmínky klíčení 2.11.4.1. Nepropustnost povrchových vrstev pro vodu Rozhodující překážkou klíčení je vrstva palisádového sklerenchymu, jež znemožňuje prostupnost vody testou. To je typické pro čeleď bobovité (Fabaceae), slézovité (Malvaceae), svlačcovité (Convolvulaceae) a kokoticovité (Cuscutaceae). Nebobtnající („tvrdá“) semena tvoří u jetele (Trifolium) až 38% osiva, u vojtěšky (Medicago) až 53% osiva. Nebobtnavá semena vojtěšky jsou schopna v optimálních podmínkách z jedné třetiny vyklíčit během prvních 2 měsíců, další třetina do 6 měsíců a zbytek až během dalších několika let. Bobtnavá semena a semena tvrdá nemají žádné patrné rozdíly ve struktuře testy. U tvrdých semen je možné navodit bobtnání narušením palisádového sklerenchymu a to chemicky (např. kyselinou sírovou) nebo mechanicky pískem či rozbitým sklem (skarifikace). V přirozených podmínkách může jít o narušení činností mikroorganizmů. 2.11.4.2. Nepropustnost povrchových vrstev pro plyny V některých případech jsou vnější vrstvy semene (endosperm, nucellus, testa) či plodu (perikarp) nepropustné pro kyslík a oxid uhličitý, takže embryo není schopno růst. Osemení neprůchodné pro plyny má např. jasan (Fraxinus) nebo slunečnice (Heliathus), u které perikarp nažek brání klíčení, pokud není vytvořen v bazální části nažky v perikarpu otvor umožňující průnik kyslíku a oxidu uhličitého. U semen některých druhů je nutno dokonce odloupnout celé osemení, aby byla umožněna výměna plynů a tím i klíčení. 2.11.4.3. Mechanická pevnost testy V některých případech testa nemusí bránit zbobtnání, může však být tuhá, takže její

63

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik odpor rostoucí zárodek nemůže překonat. Snížení mechanické pevnosti je možno dosáhnout střídavým vysušováním a zavlažováním semen. 2.11.4.4. Nevyvinutost embrya Někdy semena neklíčí ani za příznivých vnějších podmínek, neboť ještě nemají dobře vyvinuté embryo. Např. u jinanu (Ginkgo) probíhá oplození až v semenech odpadlých ze stromu. Po skončení dodatečného vývinu embrya nesmějí semena zaschnout. 2.11.4.5. Vysoký obsah inhibičních látek v semenech a plodech a hormonální regulace klíčení Přirozené inhibiční látky jsou často obsaženy v dužině plodů; např. rajče (Lycopersicon). Bez jejich přítomnosti by mohlo dojít k předčasnému klíčení. Může jít o různé látky: kyselinu abscisovou, fenolické látky, kumarin, skopolenin. Inhibiční látky jsou obsaženy i v suchých plodech (u kmínu, fenyklu), kde zpomalují klíčení. Je možné je vyplavit vodou nebo je adsorbovat na aktivní uhlí. U zárodků peckovin a jádrovin (především růžovitých) je předstupněm inhibitoru amygdalin, obsahující kyanovodík. Při bobtnání semen je molekula amygdazinu štěpena β-glukozidázou a následně oxynitrilázami. Během procesu se uvolňuje kyanovodík, který díky nepropustnosti endospermu pro plyny blokuje klíčení až do zetlení endospermu. Při studiu úlohy hormonů při regulaci klíčení se ukázalo, že přítomnost giberelinů je nezbytná pro klíčení, přítomnost kyseliny abscisové zase na zavedení dormance v průběhu zrání semene. Zásahy rušící dormanci (teplota) zvyšují především citlivost ke giberelinům, aniž musí docházet ke zvýšení jejich biosyntézy. Stupeň dormance není závislý na aktuální hladiny ABA, ale na jejím dřívějším působení v průběhu zrání. 2.11.4.6. Vlivy mateřské rostliny Klíčení semen může být ovlivněno i podmínkami, za kterých se semena vyvíjela na mateřské rostlině. Například pozicí zrajícího semene v rámci květenství, květu nebo plodu, dále stářím mateřské rostliny v době indukce kvetení a stářím mateřské rostliny v době zrání semene. Výrazně se na následné klíčivosti podílejí vnější podmínky působící na mateřskou rostlinu během zrání. Patří k nim především: teplota, vodní stres, délka dne a kvalita slunečního záření. Tyto vlivy se fyziologicky projevují v různé míře nepropustností semenných obalů nebo různou hladinou inhibičních či stimulačních látek. Často je charakter klíčení spojen s heterokarpií (vznik semen s rozdílnými vlastnostmi na téže rostlině nebo 64

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik v rámci téhož druhu, ale za různých podmínek pěstování). Většina uváděných vlivů mateřské rostliny, projevující se rozdílnou dobou i rychlostí klíčení, má adaptační charakter. Omezuje rizika spojená s hromadným klíčením v extrémních podmínkách. 2.11.5. Chemické a fyzikální ovlivnění klíčení semen Pokusy s ovlivněním klíčení semen jejich zbobtnáním v roztocích auxinových regulátorů ukázaly na pozitivní účinek auxinu na klíčení a další růst u kořenové zeleniny, což je možné vysvětlit zásahem do embryonálních korelací (Šebánek, 1956). Také aplikace kyseliny giberelové nebo abscisové na semena může na klíčení působit pozitivně v souvislosti s účinkem těchto fytohormonů na rušení endogenní dormance semen. U některých rostlinných druhů byla zjištěna počáteční stimulace růstu klíčních rostlin z osiva ozářeného laserem (paprskem z oblasti blízké červenému záření). Klíčení je pravděpodobně ovlivněno interakcí s aktivním fytochromem. Také radioaktivní záření může podle velikosti dávky ovlivnit klíčivost. Existují i údaje o možnosti pozitivního ovlivnění klíčení semen po jejich vystavení účinkům magnetického pole. Reakce při tom závisí na intenzitě pole v době působení.

Cílem diplomové práce je posouzení vhodnosti testů fytotoxicity (test klíčivosti semen, test elongace kořene) pro stanovení množství zinku, které by omezilo toxické působení kadmia u heřmánku pravého (Matricaria recutita L., cv. Lutea) a třezalky tečkované (Hypericum perforatum L.). Oba rostlinné druhy patří mezi akumulátory toxických kovů.

65


III. MATERIÁL A METODY 3.1. Rostlinný materiál Pro pokus byla použita semena heřmánku pravého (Matricaria recutita L., cv. Lutea) a třezalky tečkované (Hypericum perforatum L.).

3.1.1. Heřmánek pravý (Matricaria recutita L.) Čeleď: hvězdnicovité (Asteraceae) Heřmánek pravý je běžně rozšířená léčivá bylina s aromatickou vůní, 15 až 40 cm vysoká. Její latinský název je odvozen z řeckého chamai = nízko a mélon = jablko (pravděpodobně dle kulovitých terčů v úboru). Lodyha heřmánku je vzpřímená, často bohatě větvená, nesoucí přisedlé, střídavé, 3 – 5 cm dlouhé listy v obryse kopinatého tvaru, dvakrát až třikrát zpeřené s úzkými, překrývajícími se nitkovitými a špičatě končícími lístky. Dlouze stopkaté úbory, 1,5 až 5 cm široké, tvoří řídký okolík a jsou obklopené pohárkovitým zeleným zákrovem s okrajově vrstevnatými šupinami. Květní lůžko a aromatickou vůní je bezplevkaté, kuželovitě vyklenuté a duté, čímž se bylina liší od příbuzných druhů, například od heřmánkovce nevonného (Matricaria maritima L). Květní terč tvoří středové, žluté, trubkovité květy s pěti zuby a obvodové, bílé, samičí květy, paprsčitě uspořádané, s jazykovitou korunou v době plného rozkvětu šikmo skloněnou ke stopce. Heřmánek kvete od května do září na nejrůznějších místech (rumiště, úhory, pole okolí cest). Plody jsou 1 – 2 mm dlouhé, žebernaté nažky bez chmýru. Heřmánek pravý pochází z Asie. Dnes je rozšířený po celé Evropě, jako polní plevel byl zavlečen i do Severní Ameriky a Austrálie. Jinak je to významná kulturní plodina, pěstovaná pro své léčivé účinky (ve střední a jihovýchodní Evropě, severní Africe). Sbírá se především květ, přesněji rozkvetlé (ale nepřekvetlé) květní lůžko (Flos chamomillae vulgaris) se stopkou maximálně do 2 cm. Úbory se sbírají ručně nebo pomocí speciálních hřebenů. Umělé sušení nasbíraných květů se provádí při teplotách do 40°C, aby nedošlo ke ztrátám silic. Takto si droga zachová svou typickou vůni, přírodní barvu a nedrolí se. K obsahovým látkám heřmánku patří silice (až 1,5%) s modře zbarvenými azulény (bisabolon, chamazulén, farnesen), které se vyznačují protizánětlivými, protikřečovými a bolesti tlumícími účinky.

66

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik Mezi další významné látky patří flavonoidy (apigenin se spasmotickým účinkem), slizy, hořčiny, cholin, kumariny, karotenoidy. Zatím byla zjištěna přítomnost více než sta účinných látek. Přesto se předpokládá, že jejich seznam ještě není konečný. Užití heřmánku je široké a všestranné. Heřmánek je nejen silně působícím spasmolytikem, dezinfekcí, ale má i sedativní účinek na psychiku, pomáhá proti bolestem. Zlepšuje odchod nahromaděných střevních plynů, uvolňuje křeče, zabraňuje množení choroboplodných zárodků. Používá se zevně k obkladům a koupelím na rány a popáleniny, při nadýmání, poruše trávení způsobené převahou kvasných pochodů ve střevě, při nosním kataru, jako kloktadlo při zánětech v ústech, dásních. Místně je droga indikována při hemeroidech, zánětu prsní žlázy a bércových vředech. Také bylo prokázáno po užití drogy uvolnění vyššího množství žluči. Na druhou stranu může heřmánek působit na organizmus i negativně. Známé jsou alergické odezvy na tuto bylinu, včetně nejtěžší alergické reakce – anafylaktického šoku. Proto se nedoporučuje používat produkty s heřmánkem u pacientů zvýšeně citlivých na jakoukoliv rostlinu z čeledi hvězdnicovitých a u žen v době těhotenství a kojení. Vysoké dávky mohou ovlivňovat existující léčbu zvýšené srážlivosti krve. Nejobvyklejší formou sušeného heřmánku jsou čaje a čajové směsi, pozitivně působící na zažívání. Své místo má heřmánek i v kosmetice a při výrobě homeopatických přípravků (zde se zpracovává čerstvá kvetoucí nať, která se upravuje s použitím lihu). Masti s chamazulénem urychlují hojení a zamezují tvorbě nadměrných jizev, extrakt z heřmánku je součástí mnohých pleťových a vlasových přípravků. 3.1.2. Třezalka tečkovaná (Hypericum perforatum L.) Čeleď: třezalkovité (Hypericaceae) Třezalka tečkovaná je víceletá vytrvalá bylina, dorůstající výšky 40 – 60 cm. Název této rostliny pochází pravděpodobně z řeckého hyper = nad a rikón = představa. České pojmenování je odvozeno od staroslověnského trjezati = rozdrásat, rozpíchat, což se vztahuje k listům rostliny, které díky přítomnosti tečkovitých siličných nádržek vypadají jako propíchané. Lodyha třezalky je zpravidla vystoupavá až přímá, většinou nevětvená s vyniklými hlavními lištami, s úžlabními výhonky v horní polovině lodyhy kvetoucími. Listy jsou vstřícné, přisedlé nebo krátce řapíkaté, nejčastěji podlouhlé nebo vejčité, s okrajem slabě až silně vyvinutým. V pletivech listů se nachází siličné nádržky a žlázky, které jsou viditelné v podobě velkých teček. Černé tečky obsahují látku hypericin, popřípadě pseudohypericin, 67

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik světlé nádržky jsou naplněny silicemi. Proti světlu na listech prosvítají nespojené hlavní žilky. Květy mají 15 – 30 mm v průměru a tvoří bohaté vrcholičnaté květenství. Kališní lístky jsou úzce trojúhelníkovité či široce čárkovité, celokrajné, dlouze zašpičatělé, často s krátkou vláskovitou špičkou, u níž jsou jemně zubaté. Výrazně nesouměrné zlatožluté korunní lístky mají na jedné straně zubatý okraj, ve špičce jsou pak žlaznatě tečkované a čárkovité. Třezalka kvete od května do září. Plodem je tobolka se souměrně uspořádanými jedním nebo dvěma podélnými žebry a několika vystouplými nádržkami na každé polovině chlopně. Semena mají hnědou až černou barvu. Třezalku tečkovanou bychom našli na prosluněných stráních, sušších loukách, pastvinách, úhorech, skalách, pasekách, na okrajích cest. Vyhledává chudé silikátové či skalní substráty. V mírném pásu je celosvětově rozšířená. Známá je už od dob starověku pro své léčivé účinky. Hlavním nositelem fyziologických účinků drogy je červenofialové barvivo hypericin (náleží k nafto-dianthronům). Mezi další obsahové látky patří třísloviny, glykosidy hyperin, katechol, rutin a peflavit s účinkem vitamínu P, organické kyseliny, provitamin A, vitamin C. Pro léčebné účely se sbírá kvetoucí nať (Herba hyperici) a to hned po rozkvětu. Třezalka působí jako antibiotikum, podporuje látkovou výměnu, léčí většinu ekzémů. Dále odstraňuje otoky, pomáhá při chorobách plic, slinivky břišní i jater, léčí žaludek a dvanácterník či gynekologické potíže. Zevně i vnitřně je pak vhodná k léčení ran, pohmožděnin, zlomenin, ale také i naraženin. Působí sedativně, takže se osvědčila při léčbě úzkosti, neklidu, psychickém napětí, neurastenii, panice, depresi apod. Na druhou stranu působí rostlina u býložravců po požití většího množství natě zvýšenou citlivost ke slunečnímu záření, což se může projevit záněty zejména u nepigmentovaných míst kůže. Také by neměla být podávána lidem, kteří trpí těžkou cukrovkou, alergií na pyl, velmi nízkým tlakem a těm, u nichž byl zjištěn metastazující nádor. Nejčastější formou aplikace léčivky je nálev, který se pije 2x až 4x denně. Nejúčinnější formou je však tinktura, osvědčil se i lihovodný roztok nebo vinný odvar. Macerací v olivovém nebo slunečnicovém oleji se získá velmi dobrý masážní olej, který se může použít i k léčbě popálenin (např. od slunce), zanícených ran nebo hemeroidů.

68


3.2. Experiment Byly provedeny dva experimenty. V prvním experimentu byla sledována interakce mezi zvyšující se koncentrací Zn (12, 60, 120, 180 μM) a přídavkem Cd (12 μM) na klíčení semen, růst kořene a nadzemní části klíčních rostlin heřmánku pravého (Matricaria recutita L., cv. Lutea), kultivovaných na světle a ve tmě. V druhém experimentu byl sledován vliv zvyšující se koncentrace Zn (12, 60, 120, 180 μM) a přídavku Cd (12 μM) na klíčení semen, růst kořene a nadzemní části klíčních rostlin třezalky tečkované (Hypericum perforatum L.), kultivovaných na světle a ve tmě. Základním (kontrolním) roztokem u obou experimentů byl Hoaglandův živný roztok (tabulka 13). Jednotlivé kultivační roztoky se lišily obsahem zinku (12, 60, 120, 180 μM) a kadmia (12 μM). Varianty kultivačních roztoků jsou uvedeny v tabulce 14. Zinek byl dodán ve formě Zn(NO3)2 a kadmium ve formě Cd(NO3)2.

Tabulka 13 Složení Hoaglandova živného roztoku (pH 5,0) Koncentrace (g l-1) 0,136 0,506 0,821 0,120 0,005 Koncentrace (mg l-1) 0,611 0,388 0,200 0,100 0,040

Sloučenina KH2PO4 KNO3 Ca(NO3)2 . 4 H2O MgSO4 . 7 H2O Citran železitý Mikroelementy dle Arnona H3BO3 MnCl2 . 4 H2O ZnSO4 . 7 H2O CuSO4 . 5 H2O Na2MoO4

Tabulka 14 Varianty kultivačních roztoků Hoagland Hoagland Hoagland

+ + +

0 μM Zn 12 μM Zn 60 μM Zn

69

+ + +

0 μM Cd 0 μM Cd 0 μM Cd

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik Hoagland Hoagland Hoagland Hoagland Hoagland Hoagland Hoagland

+ + + + + + +

120 μM Zn 180 μM Zn 0 μM Zn 12 μM Zn 60 μM Zn 120 μM Zn 180 μM Zn

+ + + + + + +

0 μM Cd 0 μM Cd 12 μM Cd 12 μM Cd 12 μM Cd 12 μM Cd 12 μM Cd

3.2.1.Test klíčivosti semen 3.2.1.1. Kultivace Při kultivaci bylo postupováno následovně. Do Petriho misek o průměru 5 cm byl vložen disk filtračního papíru. Misky byly opatřeny označením varianty (Tabulka 2). Poté bylo do misek napipetováno po 0,8 ml příslušného kultivačního roztoku. Pro kontrolu byl použit Hoaglandův roztok. Semena heřmánku pravého (Matricaria recutita L., cv. Lutea) byla po 2 hodinové imbibici v destilované vodě umístěna po deseti na filtrační papír v Petriho miskách tak, aby se vzájemně nedotýkala. Každá pokusná varianta byla reprezentována 5 miskami. Uzavřené Petriho misky byly utěsněny parafínovou fólií. Klíčení semen probíhalo v termostatu po dobu 7 dní na světle nebo ve tmě za podmínek: teplota 25 ± 2°C, vzdušná vlhkost 70 – 80%, fotoperioda 16/8 hod. Kultivace semen třezalky tečkované (Hypericum perforatum L.) byla prováděna dle výše uvedeného postupu. Klíčení semen probíhalo v termostatu po dobu 8 dní na světle nebo tmě za stejných kultivačních podmínek jako u heřmánku. 3.2.1.2. Hodnocení testu klíčivosti semen a statistické hodnocení dat Po uplynutí doby kultivace byl zjištěn počet vyklíčených semen u každé varianty. Účinek kultivačních roztoků na klíčivost semen byl srovnán s kontrolou. Získaná data byla testována jednocestnou analýzou rozptylu (one-way ANOVA). Homogenita rozptylů byla testována Cochranovým C testem a Bartlettovým χ2 testem. Normalita reziduí byla hodnocena grafem „normal probability“. Rozdíly mezi průměry hodnot klíčivosti byly testovány Tukey testem (P≤ 0,05). Data byla hodnocena v programu Statistica 6 (StatSoft, Inc. ®), tabelárně zpracována v programu MS World a graficky v programu MS Excel (Microsoft ®). 3.2.2. Test elongace kořene

70

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik 3.2.2.1. Kultivace Při kultivaci byly použity Petriho misky o průměru 5 cm. Po vložení disku filtračního papíru byly misky označeny jednotlivými variantami (Tabulka 2). Poté bylo do misek napipetováno po 0,8 ml příslušného kultivačního roztoku. Pro kontrolu byl použit Hoaglandův roztok. Semena heřmánku pravého (Matricaria recutita L., cv. Lutea) byla po 2 hodinové imbibici v destilované vodě umístěna po deseti na filtrační papír v Petriho miskách tak, aby se vzájemně nedotýkala. Každá pokusná varianta byla reprezentována 5 miskami. Uzavřené Petriho misky byly utěsněny parafínovou fólií. Růst klíčních rostlin probíhal v termostatu po dobu 7 dní na světle nebo ve tmě za podmínek: teplota 25 ± 2°C, vzdušná vlhkost 70 – 80%, fotoperioda 16/8 hod. Kultivace semen třezalky tečkované (Hypericum perforatum L.) byla prováděna dle výše uvedeného postupu. Růst klíčních rostlin probíhal v termostatu po dobu 8 dní na světle nebo ve tmě za stejných kultivačních podmínek jako u heřmánku. 3.2.2.2. Hodnocení testu elongace kořene a statistické hodnocení dat Po uplynutí doby kultivace byla u klíčních rostlin v každé variantě zjištěna pomocí milimetrového pravítka délka kořene a nadzemní části. Účinek kultivačních roztoků na vývoj kořene a nadzemní části byl srovnán s kontrolou. Pro statistické zhodnocení získaných dat byla použita jednocestná analýza rozptylu (one-way ANOVA) jako u testu klíčivosti semen.

IV. VÝSLEDKY U rostlin heřmánku pravého (Matricaria recutita L.) a třezalky tečkované (Hypericum perforatum), které byly kultivovány na světle a ve tmě v Hoaglandově živném roztoku (kontrola), v roztocích se zvyšující se koncentrací zinku (12, 60, 120, 180 μM), v roztoku s 12 μM kadmia a v roztocích s kombinací obou prvků (12 μM Zn + 12 μM Cd, 60 μM Zn +

71

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik 12 μM Cd, 120 μM Zn + 12 μM Cd, 180 μM Zn + 12 μM Cd) byla hodnocena klíčivost semen a růst klíčních rostlin délkou kořene a nadzemní části.

4.1. Heřmánek pravý (Matricaria recutita L.) 4.1.1. Klíčivost semen Z hodnot uvedených v tabulce 1 (světlo) a 2 (tma) a jejich grafického znázornění (Obr. 1 a 2) je zřejmé, že se zvyšující se koncentrací zinku (12, 60, 120, 180 μM) v živném roztoku se snižovalo procento vyklíčených semen. Významný pokles klíčivosti semen byl zaznamenán u heřmánku vlivem koncentrace 180 μM Zn v prostředí. Hodnoty klíčivosti byly působením 12 μM Cd v roztoku nižší než 120 μM Zn, avšak vyšší v porovnání s působením 180 μM Zn. Zvýšená klíčivost semen heřmánku zaznamenaná vlivem spolupůsobení zinku a kadmia (60 μM Zn + 12 μM Cd) nebyla statisticky významná, stejně jako pokles klíčivosti semen kultivovaných v živných roztocích s vyššími koncentracemi Zn (120, 180 μM) a přídavkem 12 μM Cd. 4.1.2. Délka kořene Z hodnot uvedených v tabulce 3 (světlo) a 4 (tma) a jejich grafického znázornění (Obr. 3 a 4) je patrné, že koncentrace 12 μM Zn v živném roztoku v porovnání s kontrolou významně stimulovala růst kořene klíčních rostlin. Se zvyšující se koncentrací zinku (12, 60, 120, 180 μM) v živném roztoku se snižovala délka kořene. Významná redukce délky kořene byla zaznamenána vlivem koncentrace 120 a 180 μM Zn v živném roztoku. Hodnoty délky kořene heřmánku, který byl kultivován v živném roztoku s 12 μM Cd, byly nižší než vlivem působení 120 μM Zn, avšak vyšší v porovnání s roztokem se 180 μM Zn. Z hodnot délky kořenů rostlin kultivovaných v roztocích se zvyšující se koncentrací zinku (12, 60, 120, 180 μM) a 12 μM kadmia je patrné možné snížení toxického vlivu 12 μM kadmia přídavkem 60 μM Zn. Zvýšené koncentrace zinku v živných roztocích (120, 180 μM) spolu s 12 μM Cd snížily délku kořene. 4.1.3. Délka nadzemní části Z tabulky 5 (světlo) a jejího grafického znázornění (Obr. 5) je zřejmé, že se zvyšující se koncentrací zinku (12, 60, 120, 180 μM) v živném roztoku se u klíčních rostlin snižovala délka nadzemní části. Délka nadzemní části klíčních rostlin kultivovaných v roztoku s 12 μM

72

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik Cd byla srovnatelná s délkou nadzemní části rostlin kultivovaných za přítomnosti 120 μM Zn. Redukce délky nadzemní části byla zjištěna u klíčních rostlin rostoucích v roztocích se zinkem a kadmiem (12 μM Zn + 12 μM Cd, 60 μM Zn + 12 μM Cd, 120 μM Zn + 12 μM Cd, 180 μM Zn + 12 μM Cd) s výjimkou 60 μM Zn + 12 μM Cd. Hodnoty uvedené v tabulce 6 (tma) a graficky znázorněné na obrázku 6 dokládají, že se zvyšujícím se obsahem zinku (12, 60, 120, 180 μM) v kultivačních roztocích se snižovala délka nadzemní části. Zvýšená hodnota délky nadzemní části vlivem koncentrace 12 μM Zn v živném roztoku oproti kontrole nebyla statisticky významná. Hodnoty délky nadzemní části heřmánku, který

byl kultivován v živném roztoku s 12 μM Cd, byly nižší než vlivem

působení 120 μM Zn, avšak vyšší v porovnání s roztokem se 180 μM Zn. U klíčních rostlin kultivovaných v roztocích se zvyšující se koncentrací zinku (12, 60, 120, 180 μM) a 12 μM kadmia byly zjištěny vyšší hodnoty délky nadzemní části vlivem koncentrace 60 μM Zn + 12 μM Cd. Koncentrace 120 a 180 μM Zn spolu s 12 μM Cd snížily délku nadzemní části.

4.2. Třezalka tečkovaná (Hypericum perforatum L.) 4.2.1. Klíčivost semen Z hodnot klíčivosti semen třezalky na světle (tabulka 7) a jejich grafického znázornění (Obr. 7) je patrné, že se zvyšující se koncentrací zinku (12, 60, 120, 180 μM) se snižovalo procento vyklíčených semen. Hodnoty klíčivosti byly působením 12 μM Cd v roztoku nižší než vlivem 120 μM Zn, avšak vyšší v porovnání s působením 180 μM Zn. Pokles klíčivosti 73

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik semen kultivovaných v živném roztoku s vyššími koncentracemi zinku (120, 180 μM) a přídavkem 12 μM Cd nebyl statisticky významný. Z hodnot uvedených v tabulce 8 (tma) a z jejich grafického znázornění (Obr. 8) je zřejmé, že se procento vyklíčených semen třezalky snižovalo se zvyšující se koncentrací zinku (12, 60, 120, 180 μM) v živném roztoku. Hodnoty klíčivosti byly působením 12 μM Cd v roztoku nižší než vlivem 120 μM Zn, avšak vyšší v porovnání s působením 180 μM Zn. Zvýšená klíčivost semen zaznamenaná vlivem spolupůsobení zinku a kadmia (60 μM Zn + 12 μM Cd) nebyla statisticky významná, stejně jako pokles klíčivosti semen kultivovaných v živném roztoku s vyššími koncentracemi Zn (120, 180 μM) a přídavkem 12 μM Cd. 4.2.2. Délka kořene Hodnoty uvedené v tabulce 9 (světlo) a 10 (tma) a jejich grafické znázornění (Obr. 9 a 10) dokládají, že koncentrace 12 μM Zn v živném roztoku v porovnání s kontrolou významně stimulovala růst kořene klíčních rostlin. Se zvyšující se koncentrací zinku (12, 60, 120, 180 μM) v živném roztoku se snižovala délka kořene. Významná redukce délky kořene byla prokázána již u koncentrace 120 μM Zn v prostředí. Hodnoty délky kořene třezalky, která byla kultivována v živném roztoku s 12 μM Cd, byly nižší než vlivem působení 120 μM Zn, avšak vyšší v porovnání s roztokem se 180 μM

Zn. Z hodnot délky kořene rostlin

kultivovaných v roztocích se zvyšující se koncentrací zinku (12, 60, 120, 180 μM) a 12 μM kadmia je patrné možné snížení toxického vlivu 12 μM kadmia přídavkem 60 μM Zn. Zvýšené koncentrace zinku v živném roztoku (120, 180 μM) spolu s 12 μM Cd snížily délku kořene. 4.2.3. Délka nadzemní části Z hodnot uvedených v tabulkách 11 (světlo) a 12 (tma) a znázorněných na obrázcích 11 a 12 je zřejmé, že koncentrace 12 μM Zn v živném roztoku v porovnání s kontrolou významně stimulovala růst nadzemní části klíčních rostlin. Se zvyšující se koncentrací zinku (12, 60, 120, 180 μM) v živném roztoku se snižovala délka nadzemní části. Významná redukce délky nadzemní části byla zaznamenána u koncentrace 120 a 180 μM Zn v živném roztoku. Hodnoty délky nadzemní části třezalky, která byla kultivována v živném roztoku s 12 μM Cd, byly nižší než vlivem působení 120 μM Zn, avšak vyšší v porovnání s roztokem se 180 μM Zn. Významné snížení délky nadzemní části bylo prokázáno také u klíčních rostlin, které byly kultivovány v roztocích se zvyšující se koncentrací zinku (12, 60, 120, 180 μM) a

74

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik přídavkem 12 μM kadmia s výjimkou 60 μM Zn + 12 μM Cd, u níž byl zjištěno zvýšení hodnot délky nadzemní části.

4.3. Seznam tabulek Tabulka 1

Klíčivost heřmánku pravého (Matricaria recutita L.) - světlo

Tabulka 2

Klíčivost heřmánku pravého (Matricaria recutita L.) - tma

Tabulka 3

Délka kořene heřmánku pravého (Matricaria recutita L.) – světlo

75

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik Tabulka 4

Délka kořene heřmánku pravého (Matricaria recutita L.) – tma

Tabulka 5

Délka nadzemní části heřmánku pravého (Matricaria recutita L.) – světlo

Tabulka 6

Délka nadzemní části heřmánku pravého (Matricaria recutita L.) – tma

Tabulka 7

Klíčivost třezalky tečkované (Hypericum perforatum L.) - světlo

Tabulka 8

Klíčivost třezalky tečkované (Hypericum perforatum L.) - tma

Tabulka 9

Délka kořene třezalky tečkované (Hypericum perforatum L.) – světlo

Tabulka 10

Délka kořene třezalky tečkované (Hypericum perforatum L.) – tma

Tabulka 11

Délka nadzemní části třezalky tečkované (Hypericum perforatum L.) – světlo

Tabulka 12

Délka nadzemní části třezalky tečkované (Hypericum perforatum L.) – tma

76


Tabulka 1 Klíčivost semen heřmánku pravého (Matricaria chamomilla L., cv. Lutea) kultivovného na světle v Hoaglandově roztoku se zvyšující se koncentrací zinku a přídavkem kadmia (12µM). Varianta Zn (μM) Cd (μM)

Klíčivost (%)

0 12 60 120 180

+ + + + +

0 0 0 0 0

60,00 ± 8,94 a 53,33 ± 5,16 ab 51,67 ± 7,53 ab 48,33 ± 9,83 ab 38,33 ± 7,53 b

0 12 60 120 180

+ + + + +

12 12 12 12 12

40,00 ± 6,32 b 46,67 ± 5,16 ab 50,00 ± 8,94 ab 48,33 ± 7,53 ab 45,00 ± 5,48 ab

Hodnoty označené stejným písmenem se statisticky významně neliší (Tukey HSD test, P ≤ 0,05).

77


Tabulka 2 Klíčivost semen heřmánku pravého (Matricaria chamomilla L., cv. Lutea) kultivovného ve tmě v Hoaglandově roztoku se zvyšující se koncentrací zinku a přídavkem kadmia (12µM). Varianta Zn (μM) Cd (μM)

Klíčivost (%)

0 12 60 120 180

+ + + + +

0 0 0 0 0

61,67 ± 7,53 a 55,00 ± 5,48 ab 51,67 ± 7,53 ab 50,00 ± 8,94 ab 40,00 ± 6,32 b

0 12 60 120 180

+ + + + +

12 12 12 12 12

43,33 ± 8,16 b 48,33 ± 4,08 ab 53,33 ± 8,16 ab 50,00 ± 6,32 ab 48,33 ± 4,08 ab


78


Tabulka 3 Délka kořene heřmánku pravého (Matricaria chamomilla L., cv. Lutea) kultivovného na světle v Hoaglandově roztoku se zvyšující se koncentrací zinku a přídavkem kadmia (12µM). Varianta Zn (μM) Cd (μM)

Délka kořene (mm)

0 12 60 120 180

+ + + + +

0 0 0 0 0

12,30 ± 2,75 ab 13,45 ± 2,91 a 10,80 ± 1,20 abc 10,05 ± 2,19 bc 9,40 ± 1,90 c

0 12 60 120 180

+ + + + +

12 12 12 12 12

9,55 ± 2,65 bc 10,00 ± 2,18 bc 12,30 ± 0,98 ab 11,20 ± 1,85 abc 10,80 ± 2,19 abc


79


Tabulka 4 Délka kořene heřmánku pravého (Matricaria chamomilla L., cv. Lutea) kultivovného ve tmě v Hoaglandově roztoku se zvyšující se koncentrací zinku a přídavkem kadmia (12µM). Varianta Zn (μM) Cd (μM)

Délka kořene (mm)

0 12 60 120 180

+ + + + +

0 0 0 0 0

5,50 ± 0,53 ab 5,90 ± 0,74 a 5,40 ± 1,07 abc 4,40 ± 0,84 bcd 4,10 ± 1,10 cd

0 12 60 120 180

+ + + + +

12 12 12 12 12

4,20 ± 0,42 bcd 4,40 ± 0,52 bcd 4,70 ± 0,48 abcd 4,10 ± 0,32 cd 3,90 ± 0,88 d


80


Tabulka 5 Délka nadzemní části heřmánku pravého (Matricaria chamomilla L., cv. Lutea) kultivovného na světle v Hoaglandově roztoku se zvyšující se koncentrací zinku a přídavkem kadmia (12µM). Varianta Zn (μM) Cd (μM)

Délka nadzemní části (mm)

0 12 60 120 180

+ + + + +

0 0 0 0 0

3,35 ± 0,49 a 3,20 ± 0,41 ab 3,00 ± 0,32 abc 2,90 ± 0,31 abc 2,85 ± 0,37 abc

0 12 60 120 180

+ + + + +

12 12 12 12 12

2,90 ± 0,31 abc 2,85 ± 0,37 abc 3,10 ± 0,31 abc 2,80 ± 0,41 bc 2,60 ± 0,50 c


81

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik Tabulka 6 Délka nadzemní části heřmánku pravého (Matricaria chamomilla L., cv. Lutea) kultivovného ve tmě v Hoaglandově roztoku se zvyšující se koncentrací zinku a přídavkem kadmia (12µM). Varianta Zn (μM) Cd (μM)


0 12 60 120 180

+ + + + +

0 0 0 0 0

13,83 ± 0,75 a 14,17 ± 2,32 a 13,50 ± 1,37 a 12,50 ± 1,05 a 11,33 ± 1,75 a

0 12 60 120 180

+ + + + +

12 12 12 12 12

11,50 ± 2,17 a 12,83 ± 2,14 a 13,83 ± 0,75 a 12,67 ± 2,07 a 12,00 ± 2,28 a


82


Tabulka 7 Klíčivost semen třezalky tečkované (Hypericum perforatum L.) kultivovné na světle v Hoaglandově roztoku se zvyšující se koncentrací zinku a přídavkem kadmia (12µM). Varianta Zn (μM) Cd (μM)

Klíčivost (%)

0 12 60 120 180

+ + + + +

0 0 0 0 0

93,33 87,00 82,00 87,78 80,00

± 7,07 a ± 14,94 a ± 20,98 a ± 8,33 a ± 17,32 a

0 12 60 120 180

+ + + + +

12 12 12 12 12

86,67 87,50 81,43 76,25 78,89

± 13,23 a ± 7,07 a ± 15,74 a ± 5,18 a ± 9,28 a


83

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik Tabulka 8 Klíčivost semen třezalky tečkované (Hypericum perforatum L.) kultivovné ve tmě v Hoaglandově roztoku se zvyšující se koncentrací zinku a přídavkem kadmia (12µM). Varianta Zn (μM) Cd (μM)

Klíčivost (%)

0 12 60 120 180

+ + + + +

0 0 0 0 0

85,00 ± 14,34 a 82,00 ± 9,19 a 78,00 ± 16,87 a 76,00 ± 18,38 a 72,00 ± 10,33 a

0 12 60 120 180

+ + + + +

12 12 12 12 12

73,00 ± 14,18 a 76,00 ± 13,50 a 80,00 ± 19,44 a 75,00 ± 15,81 a 73,00 ± 9,49 a


84

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik Tabulka 9 Délka kořene třezalky tečkované (Hypericum perforatum L.) kultivovné na světle v Hoaglandově roztoku se zvyšující se koncentrací zinku a přídavkem kadmia (12µM). Varianta Zn (μM) Cd (μM)

Délka kořene (mm)

0 12 60 120 180

+ + + + +

0 0 0 0 0

4,20 ± 0,42 bc 4,40 ± 0,52 c 4,10 ± 0,32 bc 3,80 ± 0,42 abc 3,60 ± 0,52 ab

0 12 60 120 180

+ + + + +

12 12 12 12 12

3,70 ± 0,48 ab 3,80 ± 0,42 abc 4,10 ± 0,32 bc 3,70 ± 0,67 ab 3,40 ± 0,52 a


85

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik Tabulka 10 Délka kořene třezalky tečkované (Hypericum perforatum L.) kultivovné ve tmě v Hoaglandově roztoku se zvyšující se koncentrací zinku a přídavkem kadmia (12µM). Varianta Zn (μM) Cd (μM)

Délka kořene (mm)

0 12 60 120 180

+ + + + +

0 0 0 0 0

2,50 ± 0,53 bc 2,70 ± 0,48 c 2,50 ± 0,71 bc 1,80 ± 0,63 ab 1,60 ± 0,52 a

0 12 60 120 180

+ + + + +

12 12 12 12 12

2,30 ± 0,67 abc 2,40 ± 0,70 abc 2,50 ± 0,71 bc 1,80 ± 0,42 ab 1,60 ± 0,52 a


86

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik Tabulka 11 Délka nadzemní části třezalky tečkované (Hypericum perforatum L.) kultivovné na světle v Hoaglandově roztoku se zvyšující se koncentrací zinku a přídavkem kadmia (12µ M). Varianta Zn (μM) Cd (μM)


0 12 60 120 180

+ + + + +

0 0 0 0 0

5,50 ± 0,53 bc 5,60 ± 0,52 c 5,40 ± 0,52 bc 4,82 ± 0,75 abc 4,70 ± 0,67 ab

0 12 60 120 180

+ + + + +

12 12 12 12 12

4,80 ± 0,63 abc 5,00 ± 0,47 abc 5,40 ± 0,52 bc 4,80 ± 0,42 abc 4,50 ± 0,53 c


87

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik Tabulka 12 Délka nadzemní části třezalky tečkované (Hypericum perforatum L.) kultivovné ve tmě v Hoaglandově roztoku se zvyšující se koncentrací zinku a přídavkem kadmia (12µM). Varianta Zn (μM) Cd (μM)


0 12 60 120 180

+ + + + +

0 0 0 0 0

7,75 ± 0,82 cd 8,60 ± 0,81 d 7,65 ± 0,67 bcd 6,80 ± 0,79 abc 6,00 ± 0,67 a

0 12 60 120 180

+ + + + +

12 12 12 12 12

6,40 ± 0,52 a 6,70 ± 0,82 ab 7,00 ± 0,67 abc 6,70 ± 0,48 ab 6,00 ± 0,67 a


4.4. Seznam obrázků Obr. 1

Klíčivost heřmánku pravého (Matricaria recutita L.) - světlo

Obr. 2

Klíčivost heřmánku pravého (Matricaria recutita L.) - tma

Obr. 3

Délka kořene heřmánku pravého (Matricaria recutita L.) – světlo

88

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik Obr. 4

Délka kořene heřmánku pravého (Matricaria recutita L.) – tma

Obr. 5

Délka nadzemní části heřmánku pravého (Matricaria recutita L.) – světlo

Obr. 6

Délka nadzemní části heřmánku pravého (Matricaria recutita L.) – tma

Obr. 7

Klíčivost třezalky tečkované (Hypericum perforatum L.) - světlo

Obr. 8

Klíčivost třezalky tečkované (Hypericum perforatum L.) - tma

Obr. 9

Délka kořene třezalky tečkované (Hypericum perforatum L.) – světlo

Obr. 10

Délka kořene třezalky tečkované (Hypericum perforatum L.) – tma

Obr. 11

Délka nadzemní části třezalky tečkované (Hypericum perforatum L.) – světlo

Obr. 12

Délka nadzemní části třezalky tečkované (Hypericum perforatum L.) – tma

89


klíčivost semen (%)

80

a

70

ab

ab

60

ab

ab b

50

ab

ab

b

ab

40 30 20 10

Cd 12

Zn 0 18

0

Zn

+

+

12

Cd

Cd

+ 12

Zn

+ 60

Zn 12

12

Cd 12

Cd 12

Zn 0 18

Zn 0 12

Zn 60

Zn 12

ko

nt ro l

a

0

Obr. 1 Klíčivost rostlin heřmánku pravého (Matricaria chamomilla L., cv. Lutea) kultivovaného na světle v Hoaglandově živném roztoku se zvyšující se koncentrací zinku (Zn) a přídavkem kadmia (Cd).

90



80

a

70

ab

60

ab

ab

ab b

50

ab

ab

b

ab

40 30 20 10

Cd 12

Zn 0 18

0

Zn

+

+

12

Cd

Cd

+ 12

Zn

+ 60

Zn 12

12

Cd 12

Cd 12

Zn 0 18

Zn 0 12

Zn 60

Zn 12

ko

nt ro l

a

0

Obr. 2 Klíčivost rostlin heřmánku pravého (Matricaria chamomilla L., cv. Lutea) kultivovaného ve tmě v Hoaglandově živném roztoku se zvyšující se koncentrací zinku (Zn) a přídavkem kadmia (Cd).

91


18

a ab

délka kořene (mm)

16 14 12

ab

bc

bc

abc

c

abc

abc

bc

10 8 6 4 2

Cd

Zn

+

12

Cd 12 0 18

0

Zn

+

+ 12

Zn

+ 60

Zn 12

Cd 12

Cd 12

Cd 12

Zn 0 18

Zn 0 12

Zn 60

Zn 12

ko

nt ro l

a

0

Obr. 3 Délka kořene rostlin heřmánku pravého (Matricaria chamomilla L., cv. Lutea) kultivovaného na světle v Hoaglandově živném roztoku se zvyšující se koncentrací zinku (Zn) a přídavkem kadmia (Cd).

92


8

délka kořene (mm)

7

a

ab

abc

6

cd

bcd

5

abcd

bcd

bcd

d

cd

4 3 2 1

Cd 12

+ Zn 0

18

12

0

Zn

+

12

Cd

Cd

+ Zn

+ 60

Zn 12

12

Cd 12

Cd 12

Zn 0 18

Zn 0 12

Zn 60

Zn 12

ko

nt ro l

a

0

Obr. 4 Délka kořene rostlin heřmánku pravého (Matricaria chamomilla L., cv. Lutea) kultivovaného ve tmě v Hoaglandově živném roztoku se zvyšující se koncentrací zinku (Zn) a přídavkem kadmia (Cd).

93

bc

Cd

c

12

0

Zn

+

+

12

Cd

Cd Zn 0 12

Zn

+

12

Cd 12 + 60

Zn 12

abc

abc

18

abc

Cd

0

Zn

abc

18

0

Zn

abc

12

abc

Zn

Zn 12

nt ro l ko

ab

12

a

60

5 4 4 3 3 2 2 1 1 0

a

délka nadzemní části (mm)


Obr. 5 Délka nadzemní části rostlin heřmánku pravého (Matricaria chamomilla L., cv. Lutea) kultivovaného na světle v Hoaglandově živném roztoku se zvyšující se koncentrací zinku (Zn) a přídavkem kadmia (Cd).

94

a

Cd 12

0

Zn

+ 18

Zn 0

a

+

12

Cd

Cd

+ 12

Zn

+ 60

Zn 12

a

12

Cd 12

Cd 12

Zn

a

a

a

0

Zn

a

0

Zn 60

Zn 12

nt ro l ko

a

18

a a

12

18 16 14 12 10 8 6 4 2 0

a



Obr. 6 Délka nadzemní části rostlin heřmánku pravého (Matricaria chamomilla L., cv. Lutea) kultivovaného ve tmě v Hoaglandově živném roztoku se zvyšující se koncentrací zinku (Zn) a přídavkem kadmia (Cd).

95



120

a

a

a

a

100

a

a

a

a

a

a

80 60 40 20

Cd 12

+ Zn 0

18

12

0

Zn

+

12

Cd

Cd

+

12

Cd Zn 60

12

Zn

+

12

12

Cd

Zn 0 18

Zn 0 12

Zn 60

Zn 12

ko

nt ro l

a

0

Obr. 7 Klíčivost rostlin třezalky tečkované (Hypericum perforatum L.) kultivované na světle v Hoaglandově živném roztoku se zvyšující se koncentrací zinku (Zn) a přídavkem kadmia (Cd).

96



120 a

100

a

a

a

a a

a

a

a

a

80 60 40 20

Cd 12

+ Zn 0

18

12

0

Zn

+

12

Cd

Cd

+ Zn

+ 60

Zn 12

12

Cd 12

Cd 12

Zn 0 18

Zn 0 12

Zn 60

Zn 12

ko

nt ro l

a

0

Obr. 8 Klíčivost rostlin třezalky tečkované (Hypericum perforatum L.) kultivované ve tmě v Hoaglandově živném roztoku se zvyšující se koncentrací zinku (Zn) a přídavkem kadmia (Cd).

97


délka kořene (mm)

6 c

bc

5

bc

abc

ab

bc

abc

ab

ab a

4 3 2 1

Cd

+

12

Cd Zn 0 18

Zn

+

12

12 12

0

Zn

+

+ 60

Zn 12

Cd

Cd 12

Cd 12

Zn 0 18

Zn

12

0

Zn 60

Zn 12

ko

nt ro l

a

0

Obr. 9 Délka kořene rostlin třezalky tečkované (Hypericum perforatum L.) kultivované na světle v Hoaglandově živném roztoku se zvyšující se koncentrací zinku (Zn) a přídavkem kadmia (Cd).

98


3,5 3

délka kořene (mm)

c

bc

bc

bc

abc

abc ab

2,5

ab

a

a

2 1,5 1 0,5

Cd 12

+

18

0

Zn

+

12

Cd

Cd Zn 0 12

Zn

+

+ 60

Zn 12

12

Cd 12

Cd 12

Zn 0 18

Zn 0 12

Zn 60

Zn 12

ko

nt ro l

a

0

Obr. 10 Délka kořene rostlin třezalky tečkované (Hypericum perforatum L.) kultivované ve tmě v Hoaglandově živném roztoku se zvyšující se koncentrací zinku (Zn) a přídavkem kadmia (Cd).

99

7

c

bc

6

bc

abc

bc

abc

abc

ab

abc

c

5 4 3 2 1

Cd 12

Zn 0 18

0

Zn

+

+

12

Cd

Cd

+ 12

Zn

+ 60

Zn 12

12

Cd 12

Cd 12

Zn 0 18

Zn 0 12

Zn 60

12

nt ro l ko

Zn

0

a



Obr. 11 Délka nadzemní části rostlin třezalky tečkované (Hypericum perforatum L.) kultivované na světle v Hoaglandově živném roztoku se zvyšující se koncentrací zinku (Zn) a přídavkem kadmia (Cd).

100

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

d

Cd

+ 0

Zn

+ Zn

a

12

Cd

ab

12

12 0

Zn

+

+ 60

Zn 12

Cd

Cd 12

Cd 12

Zn 0 18

Zn 0 12

Zn 60

12

Zn

a

abc

ab

a

12

abc

nt ro l ko

bcd

18

cd

a



Obr. 12 Délka nadzemní části rostlin třezalky tečkované (Hypericum perforatum L.) kultivované ve tmě v Hoaglandově živném roztoku se zvyšující se koncentrací zinku (Zn) a přídavkem kadmia (Cd).

V. DISKUZE Zejména vlivem narůstající antropogenní aktivity (průmysl, doprava, zemědělství) se v současné době zvyšuje obsah znečišťujících látek v životním prostředí. Tento trend se týká i 101

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik toxických kovů, které se do ovzduší, vod, půd a sedimentů dostávají zejména z průmyslových procesů, z výfukových plynů, z kontaminovaných odpadních vod a hnojiv. Zvyšující se obsah mobilních forem kovů v půdách má negativní vliv na růst a vývoj rostlin. Jedním z prvků, jehož zvýšená a nežádoucí akumulace je v současné době zaznamenávána v půdě i rostlinách, je kadmium. Vedle studia intracelulárních mechanizmů uplatňujících se při detoxikaci kovu v rostlinném organizmu je studována i problematika imobilizace cizorodých prvků v půdě. Proces bioakumulace kadmia závisí na faktorech vnějšího prostředí. K nejdůležitějším náleží koncentrace iontů kadmia v prostředí a jeho forma, pH, interakce s dalšími prvky, obsah organických a jiných komplexotvorných látek, teplota, atd. Příjem kovů rostlinami může být ovlivněn prostřednictvím interakce s některými mikroelementy. Předpokládá se, že společné působení kadmia a zinku je založeno na jevu kompetitivní inhibice. Kadmium patří mezi toxické kovy. Zapojuje se do globálního koloběhu prvků v přírodě. Nejdůležitější transportní cestou v geochemickém koloběhu je atmosféra. Do vod a půd se kadmium dostává atmosférickou depozicí a prostřednictvím odpadních vod a čistírenských kalů, které jsou aplikovány jako hnojiva nebo prostředky pro zlepšení kvality půd. V organizmech nezastává kadmium žádnou funkci, není esenciální. Je vysoce toxické pro rostliny i živočichy. V biochemických procesech organizmů může nahrazovat zinek a narušovat tak funkčnost některých enzymů. Zinek je také řazen mezi toxické kovy. Na rozdíl od kadmia je však pro rostliny esenciální, neboť kontroluje metabolické funkce a činnost enzymových systémů. Při nedostatku zinku se zvyšuje příjem olova a kadmia rostlinou. Zinek tedy působí jako určitá ochrana proti škodlivým účinkům toxických kovů. Za toxický obsah zinku v půdě je považována hodnota 300 μg g-1 suché půdy. Již řadu let je studován vliv interakce zinku a kadmia. Jak již bylo řečeno, interakce zmíněných kovů je založena na jevu kompetitivní inhibice, kdy kadmium a zinek soutěží o vazebná místa v půdě a v příjmovém systému rostliny (Abdel-Sabour et al., 1988). Tato diplomová práce doplňuje a rozšiřuje poznatky o vlivu interakce kadmia a zinku na rostliny na počátku jejich ontogeneze. Mgr. Daniela Baráková se ve své diplomové práci rovněž zabývala vlivem spolupůsobení kadmia a zinku na rostliny heřmánku pravého (Matricaria recutita L.). Hodnotila růst rostlin délkou kořenů, hmotností sušiny kořene a nadzemní části, dále stanovovala obsah fotosyntetických pigmentů, obsah kadmia a zinku v rostlinách, stanovila maximální kvantový výtěžek fluorescence chlorofylu a rychlost celkové respirace. Tato studie dílčím způsobem navazuje na diplomovou práci Mgr. Barákové.

102

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik Vychází i z literárních zdrojů a zabývá se vlivem zvyšující se koncentrace zinku a jeho interakcí s kadmiem na raná stádia vývoje (klíčení, růst klíčních rostlin) heřmánku pravého (Matricaria recutita L.) a třezalky tečkované (Hypericum perforatum L.). Zvolená kocentrační řada zinku simuluje nízké (12, 60 μM) až vyšší (120, 180 μM) zatížení prostředí zinkem. Koncentrace 12 μM Cd je hodnocena jako „střední“ zatížení a náleží k nejčastěji se vyskytující koncentraci kadmia v prostředí. Semena heřmánku klíčí na světle. Růst kořene klíčních rostlin obou rostlinných druhů však probíhá v půdě, tedy ve tmě. Z důvodu simulace reálného prostředí byly testy fytotoxicity (test klíčivosti semen, test elongace kořene) uskutečněny jak na světle, tak i vě tmě. Cílem práce bylo posouzení vhodnosti testů fytotoxicity (test klíčivosti semen, test elongace kořene) pro stanovení množství zinku, které by omezilo toxické působení kadmia u heřmánku a třezalky. Oba rostlinné druhy jsou využívány ve farmacii. Patří však mezi akumulátory toxických kovů, neboť produkují účinné sekundární metabolity.

5.1. Klíčivost semen Po týdenní kultivaci na světle a ve tmě byla hodnocena klíčivost semen heřmánku pravého (Matricaria recutita L.) a třezalky tečkované (Hypericum perforatum L.). Klíčivost semen obou rostlinných druhů, vystavených působení zvyšující se koncentrace zinku (12, 60, 120, 180 μM), 12 μM Cd a jejich kombinacím (12 μM Zn + 12 μM Cd, 60 μM Zn + 12 μM Cd, 120 μM Zn + 12 μM Cd, 180 μM Zn + 12 μM Cd) byla ve srovnání s kontrolou nižší. Se zvyšující se koncentrací zinku (12, 60, 120, 180 μM) se snižovalo procento vyklíčených semen. Významná inhibice klíčivosti semen byla zaznamenána při koncentraci 180 μM Zn, která působila na klíčivost semen značně toxicky. Zinek je pro metabolizmus rostliny velmi důležitý. Podílí se na aktivaci mnoha enzymů a na jejich vazbě se substrátem. Ovlivňuje hromadění sacharidů, jejich transport a aktivuje biosyntézu bílkovin (Rout et Das, 2003). Snížení klíčivosti semen heřmánku a třezalky zvýšenou koncentrací zinku mohlo být způsobeno zejména inhibicí dělení a dlouživého růstu buněk v důsledku toxického působení kovu. Hodnoty klíčivosti semen heřmánku a třezalky kultivovaných v roztoku s 12 μM Cd byly nižší než působením 120 μM Zn. Je zřejmé, že takřka desetinásobně nižší koncentrace kadmia má oproti 120 μM zinku větší toxické účinky na klíčivost semen. Avšak roztok se 180 μM Zn inhiboval klíčivost semen více než roztok s 12 μM Cd.

103

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik Zvýšená klíčivost semen obou rostlinných druhů kultivovaných v roztocích se zvyšující se koncentrací zinku (12, 60 μM) a s přídavkem 12 μM Cd ve srovnání s klíčivostí semen kultivovaných pouze v přítomnosti 12 μM kadmia dokládá možný meliorativní vliv zinku. Mnoho autorů uvádí, že přídavek zinku do půdy má antagonický vliv na příjem kadmia rostlinami (Wolterbeek, 1987; Choudhary et al., 1994). Pokud ale koncentrace jednoho z prvků překročí kritickou hranici toxicity, začne převažovat synergismus, i když je koncentrace jednoho z prvků netoxická (Sharma et Agrawal, 2006). Námi zjištěné výsledky klíčivosti semen heřmánku a třezalky uvedenou skutečnost plně potvrzují. Významné snížení klíčivosti semen bylo zjištěno při spolupůsobení 120 μM Zn + 12 μM Cd a 180 μM Zn + 12 μM Cd. 5.2. Délka kořene Nízké koncentrace kovů v prostředí mohou stimulovat růst kořenů (Arduini et al., 2004). Vyšší hodnoty délek kořene rostlin heřmánku a třezalky kultivovaných na světle a ve tmě v roztoku s nejnižší aplikovanou dávkou zinku (12 μM) prokázaly výše uvedenou skutečnost. Inhibice růstu kořene byla významná při 120 a 180 μM Zn v živném roztoku. Nadbytek zinku vyvolává u rostlin specifické fyziologické a morfologické změny, zejména zmenšuje kořenový systém. Vysoký obsah Zn v živném prostředí působí negativně na příjem P a Fe (www.af.mendelu.cz). Subletální množství zinku může vést k zvýšení produkce H2O2, který antioxidační systém nebude schopen odstranit. Proto může nadbytek zinku vést k oxidačnímu poškození buněk (Weckx et Clijsters, 1997). Koncentrace 12 μM Cd inhibovala více délku kořene heřmánku a třezalky oproti působení 120 μM Zn, avšak méně v porovnání se 180 μM Zn . Inhibice růstu kořene zřejmě souvisí s primární interakcí kadmia a zinku s kořenovým systémem. Uvedenou skutečnost dokládá i prokázaná akumulace obou prvků v tomto orgánu u heřmánku pravého (Baráková, 2007). Nejvíce kadmia se nahromadilo v kořenech, méně v nadzemní části, což bylo pozorováno i u rostlin kultivovaných v roztocích se zvyšující se koncentrací zinku. V další studii byly po tříměsíčním působení 6 μM Cd na ozdobnici čínskou (Miscanthus sinensis) zjištěny změny kořenového systému. Kořeny byly tlustší, avšak kratší (Scebba et al., 2006). Zvyšující se koncentrace zinku (12, 60 μM) s přídavkem 12 μM Cd v porovnání s 12 μM Cd stimulovala růst kořene. Domníváme se, že vyšší hodnoty delék kořenů souvisí pravděpodobně s kompeticí kadmia a zinku na povrchu kořene při jejich příjmu. Wolterbeek (1987) předpokládal, že zinek snížil příjem kadmia kompeticí s jinými kovy na povrchu kořene, kde reverzibilně vázaná frakce kadmia je dle autora snadno neselektivně zaměnitelná

104

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik s kovy tranzitního typu jako je zinek. Růst kořenů je závislý na míře tolerance k toxickým kovům nebo poškození, ke kterému může vlivem stresu dojít, což má za následek snížení absorpčního povrchu kořenů. Snížení délek kořene vlivem koncentrace 120 μM Zn + 12 μM Cd a 180 μM Zn + 12 μM Cd by mohlo být důsledkem synergického působení kadmia a zinku. Toxické spolupůsobení obou kovů pozměňuje funkci katalytických enzymů, poškozuje buněčné membrány a inhibuje růst kořene rostlin. Tyto změny jsou příčinou četných sekundárních jevů, jako je inhibice fotosyntézy, respektive respirace kořenů nebo změny v akumulaci asimilátů atd. (Cibulka et al., 1991). Výše zmíněnou skutečnost potvrzují i výsledky Mgr. Barákové (2007), která hodnotila rychlost celkové respirace kořenů rostlin heřmánku po působení zvyšujících se koncentrací zinku (12, 60, 120, 180 μM), 12 μM Cd a jejich kombinací (12 μM Zn + 12 μM Cd, 60 μM Zn + 12 μM Cd, 120 μM Zn + 12 μM Cd, 180 μM Zn + 12 μM Cd). Rychlost celkové respirace kořenů je ovlivňována řadou abiotických faktorů, které mohou negativně ovlivnit energetický požadavek respirace a rovnováhu mezi přísunem sacharidů do kořenů a jejich následnou spotřebou. Působením toxických kovů je rychlost celkové respirace kořenů většinou inhibována, což ukázal i výše naznačený experiment. Koncentrace 12 μM kadmia a kombinace uvedeného množství kovu se zvyšující se koncentrací zinku (12, 60, 120, 180 μM) prokazatelně inhibovaly celkovou respiraci kořenů, pravděpodobně v důsledku negativního vlivu obou kovů na Krebsův cyklus. Kadmium se váže na sulfhydrilové skupiny enzymů v sukcinátdehydrogenázovém komplexu, čímž dochází k jejich deaktivaci (Davies et al., 1995). 5.3. Délka nadzemní části Snižující se hodnoty délek nadzemní části u klíčních rostlin heřmánku a třezalky ukazují na existenci korelace mezi zvyšující se koncentrací zinku (12, 60, 120, 180 μM) v kultivačním roztoku a zvyšujícím se toxickým účinkem kovu. Zvýšené hodnoty délek nadzemní části u heřmánku (tma) a třezalky (světlo, tma) působením 12 μM Zn ukazují na možný stimulační účinek zinku. Tuto skutečnost potvrzuje i studie vlivu zinku na respiraci rostlin (Králóvá et al., 2000). Při nízké koncentraci zinku (1,5 mM) v půdě byla respirace stimulována, po překročení koncentrace 5 mM Zn byla respirace inhibována. Kadmium o koncentraci 12 μM ovlivnilo stejnou měrou délku nadzemní části klíčních rostlin heřmánku a třezalky jako desetinásobně vyšší koncentrace zinku (120 μM). U rostlin heřmánku pravého bylo zjištěno (Baráková, 2007), že nejvíce kadmia se akumulovalo v nadzemní části rostlin heřmánku rostoucích v roztoku s 12 μM Cd. Kadmium přítomné v rostlině může negativně ovlivnit její metabolizmus a následně růst. U řasy Chlorella

105

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik vulgaris byl po expozici 12 μM Cd snížen obsah chlorofylů a karotenoidů (Králóvá et al., 2000). Syntéza chlorofylů může představovat jedno z primárních míst toxického působení kadmia. Z hodnot délek nadzemních částí rostlin kultivovaných v roztocích se zvyšující se koncentrací zinku (12, 60, 120, 180 μM) a 12 μM Cd je patrné možné snížení toxického vlivu 12 μM Cd přídavkem 60 μM Zn. Ze studie Mgr. Barákové je patrno, že při spolupůsobení 60 μM Zn + 12 μM Cd byl zaznamenán i nižší obsah kadmia v rostlině. Aplikace nízkých dávek zinku redukovala akumulaci kadmia v nadzemních částech rostlin sojového bobu (Glycine max L.) o 40-50%, oproti rostlinám, které byly vystaveny pouze působení kadmia. Naopak přídavek vysokých dávek Zn do půd kontaminovaných kadmiem zvýšil příjem a akumulaci kadmia v nadzemních částech o 42% (Shute et Macfie, 2006). Interakce zinku a kadmia byla prokázána i u rostlin, produkujících sekundární metabolity. Přídavek 50 mg zinku do 1 kg půdy snižil akumulaci kadmia v nadzemních částech heřmánku pravého (Matricaria recutita L.) o 10% a v anthodiích až o 37%. Vysoké koncentrace zinku však měly opačný účinek (Grejtovský et al., 2006). Domníváme se, že synergické působení vysokých koncentrací zinku a kadmia (120 μM Zn + 12 μM Cd, 180 μM Zn + 12 μM Cd) hrálo roli při redukci délek nadzemní části klíčních rostlin heřmánku a třezalky. Výše zmíněnou skutečnost potvrzují i výsledky hodnocení maximálního kvantového výtěžku fluorescence chlorofylu (FV/FM) (Baráková, 2007). Transport elektronů ve fotosystému II patří mezi nejcitlivější fotosyntetické parametry hodnocení působení vlivu stresoru. Hodnota maximálního kvantového výtěžku fluorescence chlorofylu se při působení stresoru obvykle snižuje. Dle autorky snižující se hodnoty (FV/FM) u rostlin heřmánku vystavených působení zinku a kadmia dokládají významný inhibiční účinek vyšších koncentrací zinku (120, 180 μM Zn), 12 μM kadmia a zvláště jejich kombinací. Pokles hodnot maximálního kvantového výtěžku fluorescence chlorofylu (FV/FM) může souviset s poklesem množství fotosyntetických pigmentů v důsledku toxického působení kovů a navozenou degradací acyllipidů tylakoidních membrán a ovlivnění vodu štěpícího komplexu (OEC komplex) (Burzynski et Klobus, 2004).

Výsledky prezentované v této práci se jen dílčím způsobem podílejí na řešení této problematiky. Nutnost jejího dalšího studia souvisí nejen s neustále se zvyšujícícm obsahem kadmia v biosféře, ale především s jeho vysokým stupněm rizikovosti pro člověka. Je zřejmé, že již od počátku ontogenetického vývoje mohou být rostliny negativně ovlivněny zvýšeným 106

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik obsahem kadmia v prostředí. Odezva rostlinných druhů a dokonce jednotlivých rostlinných orgánů na tento kov může být, jak naznačuje tato práce, rozdílná a úzce souvisí s řadou vnějších a vnitřních faktorů.

VI. ZÁVĚR U heřmánku pravého (Matricaria recutita L.) a třezalky tečkované (Hypericum perforatum L.), které byly kultivovány na světle a ve tmě v Hoaglandově živném roztoku

107

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik (kontrola), v roztocích se zvyšující se koncentrací zinku (12, 60, 120, 180 μM), v roztoku s 12 μM kadmia a v roztocích s kombinací obou prvků (12 μM Zn + 12 μM Cd, 60 μM Zn + 12 μM Cd, 120 μM Zn + 12 μM Cd, 180 μM Zn + 12 μM Cd) byla hodnocena klíčivost semen a růst klíčních rostlin délkou kořene a nadzemní části. Se zvyšující se koncentrací zinku (12, 60, 120, 180 μM) se snižovala klíčivost semen heřmánku a třezalky (světlo a tma). Koncentrace 12 μM Cd inhibovala klíčivost semen méně než koncentrace 180 μM Zn. Zvýšená klíčivost semen byla zaznamenaná vlivem spolupůsobení zinku a kadmia (60 μM Zn + 12 μM Cd). Se zvyšující se koncentrací zinku v živných roztocích (120, 180 μM) a přídavkem 12 μM Cd se procento vyklíčených semen snižovalo. Se zvyšující se koncentrací zinku (60, 120, 180 μM) se snižovala délka kořene a nadzemní části klíčních rostlin heřmánku a třezalky (světlo a tma). Koncentrace 12 μM zinku v živném roztoku v porovnání s kontrolou významně stimulovala růst kořene a nadzemní části klíčních rostlin. Koncentrace 12 μM Cd inhibovala růst kořene

a

nadzemní části méně než koncentrace 180 μM Zn. Při spolupůsobení 60 μM Zn + 12 μM Cd byla zaznamenána stimulace růstu kořene a nadzemní části. U obou rostlinných druhů kultivovaných v roztocích se 120 μM Zn + 12 μM Cd a 180 μM Zn + 12 μM Cd byla prokázána inhibice růstu kořene a nadzemní části. Výsledky testu klíčivosti a testu elongace kořene dokládají možný meliorativní účinek zinku (60-120 μM) na toxické působení 12 μM Cd. Oba testy jsou vhodné pro posouzení toxického vlivu toxických kovů na rostliny.

VII. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY Abdel-Sabour M.F., Mortvedt J.J., Kelsoe J.J. (1988). Cadmium-zinc interactions in plants and extractable cadmium and zinc fractions. Soil Science 145: 424-431.

108

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik Angelova V., Ivanov K., Ivanova R. (2004). Effect of chemical forms of lead, cadmium and zinc in polluted soil on their uptake by Tobbaco. Journal of Plant Nutrition. Antipova O.V., Obroucheva N.V. (1994). Abstracts 9th Congress of FESPP. Biol. Plant. (Suppl.) 36: 107. Alexander M., Hughes J. (1993). Sensitivities of five non-target aquatic plant species to various pesticides. Malcolm Pirnie, Inc., Tarrytown, NY, unpublished report.

APHA (1992). Americal Public Health Association, American Water Works Association and Water Pollution Cotrol Federation. Standarts methods for the examination of water and wastewater, 18th ed. Washington, DC.

APHA, AWWA, WPCF (1989). American Public Health Association, American Water Works Association and Water Pollution Cotrol Federation. Standarts methods for the examination of water and wastewater, 18th ed., sec. 8220. Wahington, DC. Arduini I., Masoni A., Mariotti M., Ercoli L. (2004). Low cadmium application increase miscanthus growth and cadmium translocation. Environmental and Experimental Botanny 52: 89-100.

Azevero H., Pintó C.G.G., Fernandes J., Loursipo S., Santos C. (2005). Cadmium effects on sunflower growth and photosynthesis. Journal of Plant Nutrition 28: 2211-2220.

Baráková D. (2007). Růstová odezva Matricaria recutita na společné působení kadmia a zinku. Barcelò J., Poschenrieder C. (1990). Plant water relations as affected by heavy metal stress - a rewiew. Journal of Plant Nutrition 13: 1-37.

109

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik Barcelò J., Poschenrieder C., Andreu I, Gunse B. (1986). Cadmium induced decrease of water-stress resistance in bush bean plants (Phaseolus vulgaris L., cv. Contender) – Effects of Cd on water potential, relative water content, and cell wall elasticity. Journal of Plant Physiology 125: 17-25.

Barcelò J., Vazquez M.D., Poschenrieder C. (1988). Structural and ultrastructural disorders in cadmium treated bush bean plants (Phaseolus vulgaris L.). New Phytologist 108: 37-49.

Bascietto J., Hinckley D., Plafkin J., Slimak M. (1990). Ecotoxicity and ecological risk assessment. Environ. Sci. Technol. 24: 10-15.

Basic N. Keller C., Fontanillas P., Vittoz P., Besnard G., Galland N. (2006). Cadmium hyperaccumulation and reproductive traits in natural Thlaspi caerulescens population. Plant Biology 8: 64-72. Baud-Grasset F. (1990). Ecotoxicologie Terrestre des Produits Chimiques. DAA Thesis. (1) ENSAIA, INPL, Nancy, France; (2) Depártement Sécurité-Environnement, Rhone-Poulenc Indostrialisation, Décines, France.

Baud-Grasset F., Baud-Grasset S., Safferman S.I. (1993). Evaluation of the bioremediation of a contaminated soil with phytotoxicity tests. Chemosphere 26: 1365-1374. Benenati F. (1990). Plants-Keystone to risk assessment. Plants for toxicity assessment 1091: 5-13.

Bishops W.E., Perry R.L. (1981). Development and evaluation of a flow-through growth inhibition test with duckweed (Lemna minor). American Society for Testing and Materials 737: 238-271. Boominathan R., Doran P.M. (2003). Organic acid complexation, heavy metal distribution and the effect of ATPase inhibition in hairz roots of hzperaccumulator plant species. Journal of Biotechnology 101: 131-146.

110


Brown S.L., Chanez R.L., Angle J.S., Baker A.J.M. (1995). Zinc and cadmium uptake by hyperaccumulator Thlaspi caerulescens and metal tolerant Silene vulgaris grown on sludgeamended soils. Environmental Science & Technology 29: 1581-1585.

Brown S.L., Chanez R.L., Angle J.S., Baker A.J.M. (1995). Zinc and cadmium uptake by hyperaccumulator Thlaspi caerulescens grown in nutrient solution. Soil Scince Society of America Journal 59: 125-133.

Bruemmer G.W., Gerth J., Herms U. (1986). Heavy metal species, mobility and availability in soils. Zeitschrift für Pflanzenernahrung und Bodenkunde 149: 382-398.

Brune A., Urbach W., Dietz K.J. (1994). Compartmentation and transport of zinc in barley primary leaves as basic mechanism involved in zinc tolerance. Plant Cell and Environment 17: 153-162. Brune A., Dietz K.J. (1995). A comparative-analysis of element composition of roots and leaves of barley seedlings grown in the presence of toxic cadmium, molybdenum, nickel and zinc concentration. Journal of Plant Nutrition 18: 853-868. Burzynski M. (1990). Activity of some enzymes involved in NO3- assimilation in cucumber seedlings treated with lead or cadmium. Acta Physiologiae 12: 105-109. Burzynski M., Klobus G. (2004). Changes of photosynthetic parameters in cucumber leaves under Cu, Cd and Pb stress. Photosyntetica 42: 505-510. Cairns J.C., Mount D.I. (1990) Aquatic toxicology. Environ. Sci. Technol. 24: 154-161.

Cakmak I., Welch R.M., Erenoglu B., Roemheld V., Norvell W.A., Kochian L.V. (2000). Influence of varied zinc supply on re-translocation of cadmium (209Cd) and rubidium (86Rb) applied on mature leaf of durum wheat seedlings. Plant and Soil 219: 279-284.

111

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik Cibulka J. (1991). Pohyb olova, kadmia a rtuti v biosféře. In. Academia, Praha, Česká Republika: 19-121.

Claesson A. (1984). Use of a mixed algal culture to characterize industrial wastewaters. Ekotoxicol. Environ. Saf. 8: 80-96.

Clark J.R., Van Hassel V.H., Nicholson R.B., Cherry D.S., Cairns J. (1981). Accumulation and depuration of metals by duckweed (Lemna perpusilla). Ecotoxicol. Environ. Saf. 5: 87-96.

Clarke B.Bb., Brennan E. (1989). Differential cadmium accumulation and phytotoxicity in 16 Tobacco cultivars. JAPCA – The Journal of the Air & Wasre management Association 39: 1319-1322.

Clemens S. (2001). Molecular mechanism of plant metal tolerance and homeostasis. Planta 212: 475-486.

Cowgill U.M., Milazzo D.P., Landenberger B.D. (1991): The sensitivity of Lemna gibba and four clones of Lemna minor to eight common chemicals using a 7 day test. Res. J. Water Pollution Co. Fed. 63: 991-998.

Cutler J.M., Raids D.W. (1974). Characterization of Cd uptake by plants tissue. Plant Physiology 54: 67-71. Davies K.L., Davies M.S., Francis D. (1995). The effects of zinc on cell viability and on mitochondrial structure in contrasting cultivars of Fetuca rubra L. – A rapid test for zinc tolerance. Environmental Pollution 88: 109-113. DeSesso J.M. (1995). Guidance for performing ecological assessment at hazardous waste sites. In: J.S. Hughes, G.R. Biddinger et E. Mones (Ed.), Environmental toxicolody and risk assessment: Third Volume. STP 1218. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, PA, pp. 45-60.

112


Dickman M., Prescott C., Kaiser K.L. (1983). Variations in the aquatic vegetation of the Welland River (Ontario Canada) above and below an industrial waste discharge. Great Lakes Res. 9: 317-325.

Domažlická E., Opatrný Z. (1989). The effect of cadmium on potato (Solanum tuberosum L.) shot culture growth. Biologia plantarum 31: 19-27.

El-Kenawy Z.A., Scott angle J., Gewaily E.M., El-Wafai N.A., Van Berkum P., Chaney R.L., Ibekwe M.A. (1997). Zinc and cadmium effects on the early stages of nodilation in white clover. Agronomy Journal 89: 875-880.

Erenoglu B., Nikolic M., Romheld V., Cakmak I. (2002). Uptake and transport of foliar applied zinc (65Zn) in bread and durum wheat cultivars differing in zinc efficiency. Plant and Soil 241: 251-257.

Erdelská O. (1981). Embryológia krytosemenných rastlín. VEDA, Bratislava.

Faller P., Kienzler K., Krieger-Liszkay A. (2005). Mechanism of Cd2+ toxicity: Cd2+ inhibits photoactivation of photosystem. II. by competitive binding to the essential Cd2+ site. Biochemica et Biophysica Acta-bioenergetic 1706: 158-164. Feng L., Wang L.S., Zahoi Y.H., Song B. (1996). Effects of substituted anilines and phenoles on root elongation of Cabbage Seed. Chemosphere 32: 1575-1583. Fleming W.J., Ailstock M.S., Momot J.J., Norman C.M. (1991). Response of sago pondweed, a submerged aquatic macrophyte, to herbicides in three laboratory culture systems. American Society for Testing and Materials 1115: 267-275.

113

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik Fletcher J.S., Johnson F.L., McFarlane J.C. (1990). Influence of greenhouse versus field testing and taxonomic differences on plant sensitivity to chemical treatment. Environ. Toxicol. 9: 769-776.

Fletcher J. (1991). A brief of plant toxicity testing plants for toxicity assessment: second volume. In: J. W. Gorsuch, W. Wnag, M. A. Lewis (Ed.), ASTM STP 1115. American Society for testing and Materials, Philadelphia: 5-11. Fletcher J.S., Ratsch H.C. (1991). Plant tier testing: A workshop to evaluate nontarget plant testing in Subdivision J. Pesticide Guidelines. EPA /600/9-91/041. Corvalis, OR. Florián M. (2004). Obsah zinku v půdách posuzovaný pomocí různých extrakčních činidel. Bulletin odboru agrochemie, půdy a výživy rostlin 12/1: 27-36.

Florijn P.J., Van Beusichem M.L. (1993). Cadmium distribution in maize inbred lines – effects of pH and level of Cd supply. Plant and Soil 153: 79-84.

Freemark K., MacQuarrie P., Swason S., Peterson H. (1990). Development of guidelines for testing pesticide toxicity to non-target plants in Canada. American Society for Testing and Materials 1091: 14-29.

Freemark K., Boutin C. (1994a). Impacts of agricultural herbicide use on terrestrial wildlife in temperate landscapes. A review with special reference to North America. Agricultural Ecosystem Environment. Freemark K., Boutin C. (1994b). Nontarget-plant risk assessment for pesticide registration. Environmental Management 18: 841-854.

Gallego S.M., Benavides M.P., Tomaro M.L. (1999). Effect of cadmium ions on antioxidant defence systém in sunflower cotyledon. Biologia Plantarum 42: 49-55.

114

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik Gaur J.P. Singh A.K. (1991). Regulatory influence of light and temperature on petroleum toxicity to Anabaea dolinum. Environmental Toxicology Water Chemistry 5: 341-350.

Gil J., Moral R., Gomez I., Navarropedreno J., Mataix J. (1995). Effects of cadmium on physiological and nutritional aspects of tomato plants – chlorophyll (a and b) and caroteinoids. Fresenius Environmental Bulletin 4: 430-435.

Gil J., Moral R., Gomez I., Navarropedreno J., Mataix J. (1995). Effects of cadmium on physiological and nutritional aspects of tomato plants – Soluble and RUBOSCO proteins and nutrient evolution. Fresenius Environmental Bulletin 4: 436-440.

Greene J.C., Miller W.E., Debacon M., Long M.A., Bartels C.L.(1988). Use of Selenastrum capricornutum to assess the toxicity potencial of surface and ground water contamination toxicity caused by chromium waste. Environ. Toxicol. Chem. 7: 35-39. Grejtovský A., Markušáková K., Eliášová A. (2006). The response of chamomile (Matricaria chamomilla L.) plants to soil zinc supply. Plant, Soil and Environment 52: 1-7

Grill E., Gekeler W., Winnacker E.L., Zenk H.H. (1986). Homo-phytochemilatins are heavy metal-binding peptides of homo-glutathione conteining Fabales. Febs letters 205: 47-50. Gussarsson M. (1994). Cadmium induced alternations in nutrient composition and growth of Betula pendula seedlings – The significance of fine roots as a primary target for cadmium toxicity. Journal of Plant Nutrition 17: 2151-2163. Hagemeyer J., Kahle H., Breckle S.W., Waisel Y. (1986). Cadmium in Fagus sylvatica L. Trees and seedlings – leaching, uptake and interconnection with transpiration. Water, Air and Soil Pollution 29: 37-359. Hall J.L. (2002). Cellularmechanism for heavy metal detoxification and tolerance. Journal of Experimental Botany 53: 1-11. Harris H.J., Sager P.E., Regier H.A., Francis G.R. (1991). Ecotoxicology and ecosystem

115

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik integrity: The great lakes examined. Environ. Sci. Technol. 24: 598-602. Harrison R.M., Chirgawi M.B. (1989). The assessment of air and soil as contributions of some trace-metal to vegetable plants 2. Translocation of atmospheric and laboratory-generated cadmium aerosols to and within vegetable plants. Science of the Total Environment 83: 35-45. Hart J.J., Welch R.M., Norwell W.A., Clarke J.M., Kochian L.V. (2005). Zinc effect on cadmium accumulation and partitioning in near-isogenic lines of durum wheat that differ in grain cadmium concentration. New Phytologist 167: 391-401. Hartman W.A., Martin D.B. (1984). Effect of suspended bentonite clay on the acute toxicity of glyphosphate to Daphnia pulex and Lemna minor. Environ. Contam. Toxicol. 33: 355-361.

Hernandes L.E., Garate A., Karpenaruiz R. (1995). Effect of cadmium on nitrogen-fixing peaplants grown in perlite and vermiculite. Journal of Plant Nutrition 18: 287-303.

Hess D. (1983). Fyziologie rostlin. Academia, Praha, s. 24.

Heumann H.G. (2002). Ultrastructuraal localozation of zinc in zinc-tolerant Armeria martima ssp. Halleri by autometallography. Journal of Plant Physiology 159: 191-203.

Hiley P.D. (1994). The use of barley root elongation in the toxicity testing of sediments, sludges and sewages. In: M.H. Doker, H. Eijackers et F. Heimbach (Ed.), Ecotoxicology of soil organism. Lewis Publishers, London, Tokyo, pp. 191-197.

Hiley P.D., Metcalfe B. (1994). The Yorkshire water standart plant growth trial for toxicity testing of soils, sludge and sediments. In: M.H. Doker, H. Eijackers et F. Heimbach (Ed.), Ecotoxicology of soil organism. Lewis Publishers, London, Tokyo, pp. 185-190.

Hinman M.L., Klaine S.J. (1992). Uptake and translocation of selected organic pesticides by the rooted aquatic plant Hydrilla vertillata. Environ. Sci. Technol. 26: 609-613.

116


Huber W., Zieris F.J., Feind D., Neugebar K. (1987). Ekotoxicological evaluation of environmental chemicals by means of aquatic model. Bundesministerium fűr Forschung and Technologie, research report 03-7314-0, Bonn.

Husaini Y., Rai L.C. (1991). Studies on nitrogen and phosphorus metabolism and the photosynthetic electron-transport systém of nostoc-linckia under cadmium stress. Journal of Plant Physiology 138: 429-435. Chardonnes A.N., ten Bookum W.M., Vellinga S., Schat H., Verklej J.A.C., Ernst W.H.O. (1999). Allocation patterns of zinc and cadmium in heavy metal tolerant and sensitive Silene vulgaris. Journal of Plant Physiology 155: 778-787.

Checkai R.T., Corey R.B., Helmke P.A. (1987). Effect of ironic and complexed metal concentrations on plant uptake of cadmium and micronutrient metals from olution. Plant and Soil 99: 335-345. Chen B.D., Li X.L., Tao H.Q., Christine P., Wong M.H. (2003). The role of arbuscular mycorrhiza in zinc uptake by red clover growing in a calcareous soil spiked with various quantities of zinc. Chemosphere 50: 839-846.

Choudhary M., Bailey L.D., Grant C.A. (1994). Effect of zinc on cadmium concentration in tissue of durum wheat. Canadian Journal of Plant Science 74: 549-552.

Jacobsen J.W., Gubler F., Chandler P.M. (1995). In: Davies P.J. (ed.): Plant hormones. Kluwer Acad. Publ., Dordrecht, 246 Janča J., Zentrich J. A., Herbář léčivých rostlin, 2. díl, 1. vydání Praha: Eminent, 1995. ISBN: 80-8576-04-3

Jenner H.A., Janssen-Mommen J.P.M. (1993). Duckweed Lemna minor as a tool for testing toxicity of coal residues and polluted sediments. Environ. Contam. Toxicol. 25: 3-11.

117

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik Kapustka L.A., Lipton J., Galbraith H., Cacea D., LeJeune K. (1995): Metal and arsenic impacts to soils, vegetation communities and wildlife habitat in southwest Montana uplands contaminated by smelter emissions II. Laboratory phytotoxicity studies. Environ. Toxicol. Chem. 11: 1905-1912.

Kastori R., Petrovič M., Petrovič N. (1992). Effect of excess lead, cadmium copper, and zinc on water relations in sunflower. Journal of Plant Nutrition 15: 2427-2439. Kay S.H., Haller W.T., Garrard L.A. (1984). Effects of heavy metals no water hyacinths (Eichhornia crassipes (Mart.) Solms). Aquatic Toxicol. 5: 117-128. Kim C.G., Bell J.N.B., Power S.A. (2003). Effects of soil cadmium on Pinus silvestris L. seedlings. Plant and soil 257: 443-449.

Klapheck S., Fliegner W., Yimmer I. (1994). Hydroxymethyl-phytochemilatins [(gammaglutamylcysteine)(N)-serine] are metalinduced peptides of the poacae. Plant Physiology 4: 1325-1332. Klobus G., Buczek J. (1985). Chlorophyll content, cells and chloroplast number and cadmium distribution Cd-treated cucumber plants. Acta Physiologiae Plantarum 7: 139-147.

Kobayashi R., Yoshimura E. (2006). Differences in the binding modes of phytochelatin to cadmium (II.) and zinc (II.) ions. Biological trace element research 114: 313-318.

Kovačević G., Kastori R., Merkulov L.J. (1999). Dry matter and leaf structure in young wheat plants as affected by cadmium, lead and nickel. Biologia Plantarum 42: 119-123. Králóvá K., Masarovičová E., Bumbálová A. (2000). Toxic effect of cadmium on hypericum perforatum plants and green alga Chlorela vulgaris. Chemia i Inžynieria Ekologiczna 7: 1999-2005.

Králóvá K., Masarovičová E. (2003). Hypericum perforatum L. and Chamomilla recutita (L.) Rausch. – accumulators of some toxic metals. Pharmazie 58: 359-360.

118


Krupa Z. (1988). Cadmium induced changes in the composition and structure of the light harvesting chlorophyll a/b protein complex II. in radish cotyledons. Physiologia Plantarum 73: 518-524.

Kučerová P., Macková M., Macek T. (1999). Perspektivy fytoremediace při odstraňování organických polutantů a xenobiotik z životního prostředí. Chemické listy 93: 19-26.

Kummerová M., Slovák L., Holoubek I. (1994). Effects of fluoranthene on growth of lettuce. Scripta Fac. Sci. Nad., Masaryk University 24: 53-58.

Kummerová M., Slovák L., Holoubek I. (1995). Phytotoxicity studies of benzo[a]pyrene with Lactuca sativa L.. Toxicol. Environ. Chem. 51: 197-203.

Kummerová M., Slovák L., Holoubek I. (1997). Growth response of spring barley to short or long period exposures to fluoranthene. Toxicol. Environ. Chem. 54: 99-106.

Lachman J., Dudjak J., Miholová D., Kolihová D., Pivec V. (2005). Effect of cadmium on flavonoid content in young barley (Hordeum sativum L.) plants. Plant, Soil and Environment 51: 513-516.

Lambolez L., Vasseur P., Ferard J.F., Gisbert T. (1994). The environmental risks of industrial waste disposal: An experimental approach including acute and chronic toxicity studies. Ecotoxicol. Environ. Saf. 28: 317-328.

Larsen D.P., de Noyelles F., Stay F., Shiroyama T. (1986). Comparisons of single species, microcosm and experimental pond responses to atrazine exposure. Environ. Toxicol. Chem. 5: 179-190.

119

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik Leeuwen van K. (1990). Ecotoxicological effects assessment in the Netherlands recent developments. Environ. Manage. 14: 779-792.

Leopold I., Gunther D., Schmidt J., Neumann D. (1999). Phytochelatins and heavy metal tolerance. Phytochemistry 50: 1323-1328.

Lewis M.A., Hamm B.G. (1986). Environmental modification of the photosynthetic response of lake plankton to surfactants and significance to a laboratory-field comparison. Water Res. 12: 1575-1582.

Lewis M.A. (1990). Chronic toxicities of surfactants and detergent builders to algae: A review and risk assessment. Ekotoxicol. Environ. Saf. 20: 1279-84.

Lewis M.A. (1994). Use of freshwater plants for phytotoxicity testing: A review. Environ. Pollut. 87: 319-336.

Lewis M.A. (1995). Phytotoxicity tests. In: G.M. Rand (Ed.), Fundamental of Aquatic Toxicology, 2nd ed. Taylor & Francis, Washington, DC.

Li T.Q., Yang X.E., Yang J.Y., He Z.L. (2006). Zn accumulation and subcellular distribution in the Zn hyperaccumulator Sedum alfredii Hance. Pedosphere 16: 616-623. Liu D., Jyang W., gao X. (2003). Effects of cadmium on root growth, cell divison and nucleoli in root tip cells of garlic. Biologia plantarum 47: 79-83.

Luxová M. (1974). Zemědělská botanika, Anatomie a morfologie rostlin. SZN, Praha. Masarovičová E., Lunáčková L., Králová K. (2002). Aktuálne problémy vplyvu kovov na rastliny. Biologické listy 67: 253-268.

120

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik Mayes M.A., Hopkins D.L., Dill D.C. (1987). Toxicity of picloram (4-amino-3,5,6trichloropicolinic acid) to life stages of the rainbow trout. Bulletin Environ. Contam. Toxicol. 38: 653-660.

McConkey B.J., Duxbury Ch.L., Dixon D.G., Greenberg B.M. (1997). Toxicity of PAHs photooxidation product to the bacteria Photobacteruim phosphoreum and duckweed Lemna gibba: Effects of phenantrene and its primary photoproduct, phenantrenequinone. Environ. Toxicol. Chem. 5: 892-899.

McKenna I.M., Chaney R.L., Williams F.M. (1993). The effects of cadmium and zinc interactions on the accumulation and tissue distribution of zinc and cadmium in lettuce and spinach. Environmental Pollution 79: 113-120.

Meier J.R., Chang I.W., Jacobs S., Torsela J., Meckes M.C., Smith M.K. (1996). Use of plant and earthworm bioassays to evaluate remediation of soil from a site contamined with polychlorinated biphenyls. Environ. Toxicol. Chem. 5: 928-938.

Mench M., Tancogne J., Gomez A., Juste C. (1989). Cadmium bioavailability to Nicotiana tabacum L., Nicotiana rustica L. and Zea mays L. grown in soil amended or not amended with cadmium nitrate. Biology and fertility of Soil 8: 48-53. Meuwly P., Rauser W.E. (1992). Alternation of thiol pools in roots and shoots of maize seedlings explosed to cadmium – adaptation and developmental cost. Plant Physiology 99: 18. Mullins G.L., Sommers L.E. (1986). Characterization of cadmium and zinc in four soil treated with sewage-sludge. Journal of Environmental Quality 15: 382-387.

Nigam R., Srivastava S., Prakash S., Srivastava M.M. (2000). Effect of organic acids on the availability of cadmium in weat. Chemical Speciation and Bioavailability 12: 125-132.

121

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik Nováková M., Matějová E., Sofrová D. (2004). Cd2+ Effect on photosyntetic aparatus in Synechococcus elongatus and spinach (Spinacia oleracea L.). Photosynthetica 42: 425-430.

Obamata H., Umebayashi M. (1997). Effects of cadmium on mineral nutrient concentrations in plants differing in tolerance for cadmium. Journal of Plnat Nutrition 20: 97-105.

OECD (1984). Organization for Economic Cooperation and Development. Alga growth inhibition test, Test Guideline No. 201. OECD Guidelines for Testing of Chemicals, Paris.

Page V., Feller U. (2005). Selective transport of zinc, manganese, nickel, cobalt and cadmium in the root systém ant transfer to the leaves in young wheat plants. Annals of Botany 96: 425434.

Paľové-balang P., Kiosová A., Pavlovkin J., Mistrík I. (2006). Effect of manganese on cadmium toxicity in maize seedlings. Plant, Soil and Environment 52: 141-147. Pandey N., Pathak G.C., Singh A.K., Sharma C.P. (2002). Enzymic changes in response to zinc nutrition. Journal of Plant Physiology 159: 1151-1153. Pavlovkin J., Luxová M., Mistrikova I., Mistrik I. (2006). Shot- and long-term effects of cadmium on transmembrane electric potential (Em) in maize roots. Biologia 61: 109-114. Perronet K., Schwartz Ch., Morel J.L. (2003). Distribution of cadmium and zinc in hyperacumulator Thlaspi caerulescens Growtn on multicontaminated soil. Plant and Soil 249: 19.25. Pimental D., MaLaughlin L., Zepp A., Lakitan B., Kraus T., Kleinman P., Vancini F., Roach W.J., Graap E., Keeton W.S., Seling G. (1991). Environmental and economic effects of reducting pesticide use. Bio. Science 41: 402-409.

122

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik Plewa M.J. (1991). The biochemical basis of the activation of promutagens by plant cell systems. American Society for Testing and Materials 1115: 287-296.

Ratsch H.C. (1983). Interlabory root elongation testing of toxic substances on selected plant species. EPA/600/3-83/051. U.S. Environmental Protection Agency, Corvallis, OR.

Ratsch H.C., Johndro D. (1986). Comparative toxicity of six test chemicals to lettuce using two root elongation test methods. Environ. Monit. Assess. 6: 267-276.

Reczynska-Dutka M. (1986). Transport of heavy metals in three differently polluted surface waters in Silesia (Southern Poland). Acta Hydrobiologia 28: 279-291.

Ren L., Zeiler L.F., Dixon D.G., Greenberg B.M. (1996). Photoinduced effect of polycyclic aromatic hydrocarbons on Brassica napus (Canola) duing germination and early seedling development. Ecotoxicol. Environ. Saf. 33: 73-80.

Rivietta A., Negrini N., Cocucci M. (1997). Plant Cell. Environment 20: 600.

Rosolem C.A., Sacramento L.V.S., Oliveira D.M.T. (2005). Kinetics of zinc uptake and anatomy of roots and leaves of caffee trees as affected by zinc nutrition. Journal of Plant Nutrition 28: 2101-2112.

Rout G.R., Das P. (2003). Effect of metal toxicity on plant growth and metabolism: I zinc. Agronomie 23: 3-11. Saber N.E., Abdel Moneim A.M., Barakat S.Y. (1999). Role of organic acids in sunflower tolerance to heavy metals. Biologia Plantarum 42: 65-73.

123

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik Sandhu S., deSerres F., Gopalan H.N.B., Grant W.F., Veleminsky J., Becking G.C. (1991). Status report of the international program on chemical safety’s collaborative study on plant test systems. Mutat. Res. 257: 19-25.

Sanità di Toppi L., Gabrielli R. (1999). Response to cadmium in higher plants. Environmental and Experimental Botany 41: 105-130.

Scebba F., Arduini I., Ercoli L., Sebastiani L. (2006). Cadmium effects on groeth and antioxidant enzymes activities in Miscanthus sinensis. Biologia Plantarum 50: 688-692.

Sharma R.K., Agrawal M. (2006). Single and combined effects of cadmium and zinc on carrots: Uptake and bioaccumulation. Journal of Plant Nutrition 29: 1791-1804.

Sharma P.N., Kumar P., Tewari R.K. (2004). Early signs of oxidative stress in wheat plants subjected to zinc deficiency. Journal of Plant Nutrition 27: 451-463.

Sherry J., Scott B., Dutka B. (1997). Use of various acute, sublethal and early life-stage tests to valuate the toxicity of rafinery effluents. Environ. Toxicol. Chem. 11: 2249-2257.

Shi G.X., Du K.H., Xie K.B., Ding X.Y., Chang F.C., Chen G.C. (200). Ultrastructural study of leaf cells damaged from Hg2+ and Cd2+ pollution in Hydrilla verticillata. Acta Botanica Sinica 42: 373-378.

Shute T., Macfie S.M. (2006). Cadmium and zinc accumulation in soybean. A threat to food safety? Science of the Total Environment 371: 63-73.

Schwartz Ch., Echevarria G., Morel J.L. (2003). Phytoextraction of cadmium with Thlaspi caerulescens. Plant and soil 249: 27-35.

124

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik Smith S.R., Giller K.E. (1992). Effective Rhizobium - leguminosarum biovar trifolii present in five soils contaminated with heavy metals from long-term applications of sewage-sludge or metal mine spoil abstract no. 8). Soil Biology & Biochemistry 24: 781-788.

Spencer D.F., Greene R.W. (1981). Effects of nickel on seven species of freshwater algae. Environ. Pollut. 25: 241-247.

Steen A.B., Borén H., Grimvall A. (1994). Phytotoxic organic compounds in spruce forest soil: Chemical analyses combined with seedlings bioassays. In: M.H. Donker, H. Eijackers et F.Heimbach (Ed.), Ecotoxicology of soil organism. Lewis Publishers, London, Tokyo, pp. 163-177.

Suter G.W., Vaughan D.S., Gardner R.H. (1983). Ecological risk assessment. Environ. Toxicol. Chem. 2: 369-378.

Swanson S.M., Rickard C.P., Freemark K.E., MacQuarrie P. (1991). Testing for pesticide toxicity to aquatic plants: Recommendations for test species. American Society for Testing and Materials 1115: 77-97.

Šebánek J. (1956). Acta. Univ. Agric. Brno A (1): 15. Šotníková A., Lunáčková L., Masarovičová E., Lux A., Streško V. (2003). Changes in the rooting and growth of willows and poplars induced by cadmium. Biologia Plantarum 46: 129131. Talanova V.V., Titov A.F., Boeva N.P. (2000). Effect of increasing concentration of lead and cadmium on cucumber seedlings. Biologia Plantarum 43: 441-444.

Taraldsen J.E., Norberg-King T.J. (1990). New method for determining effluent toxicity using duckweed (Lemna minor). Environ. Toxicol. Chem. 9: 761-767.

125

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik Thomas J.M., Cline J.F., McShane M.C., Simpson J.C., Miller W.E., Peterson S.A., Callahan C.A., Greene J.C. (1986). Characterization of chemical waste site contamination and determination of its extent using bioassays. Environ. Toxicol. Chem. 5: 487-501.

Tlustoš P., Száková J., Hrubý J., Hartman I., Najmanová J., Nedělník J., Pavlíková D., Batusta M. (2006). Removal of As, Cd, Pb and Zn from contaminated soil by high biomass producing plants. Plant, Soil and Environment 52: 413-423

Tripathi B.D., Chandra P. (1991). Chromium uptake by Spirodela polyrhiza (L.) in relation to metal chelators and pH. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 47: 764-769.

Tsao R., Eto M. (1996). Light-activated plant growth inhibitory activity of dihydromaricaria ester, rose bengal and fluoren-9-one on lettuce (Lactuca sativa L.). Chemosphere 7: 13071317.

Unyayar S., Celik A., Cekic F.O., Gozel A. (2006). Cadmium induced genotoxicity, cytotoxicity and lipid peroxidation in Allium sativum and Vicia faba. Mutagenesis 21: 77-81.

Urquhart C., Chalk E.C. (1979-82). The use of Lemna minor L. in the testing of sewages and Trade wasres. Intrenal Reports of Yorkshire Water Authority.

US EPA (1982). Environmental Protection Agency. Seed germination/root elongation toxicity test. EG-12 Office of Toxic Substances, Washington, DC.

US FDA (1987). US Food and Drung Administration. Seed germination and root elongation. FDA Environmental Assessment Technical Guide No. 4.06. Center for Food Safety and Applied Nutrition and Center for Veterinary Medicine, US Department of Health and Human Services, Washington, DC.

126

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik Van

Steveninck R.F.M., Barbare A., Fernando D.R., Van Steveninck M.E. (1994). The

binding of zinc, but not cadmium, by phytic acid in roots of crop plants. Plant and Soil 167: 157-164.

Vazquez M.D., Barcelo J., Poschenrieder C. (1992). Ultrastructural effects and localization of low cadmium concentrations in bean roots. New Phytologist 120: 215-226.

Wagner G.J. (1993). Accumulation of cadmium in crop plants and its consequences to human health. Advances in agronomy 51: 173-212.

Walsh G.E., Weber D.E., Simon T.L., Brashers L.K. (1991). Toxicity tests of effluents with marsh plants in water and sediment. Environ. Toxicol. Chem. 10: 517-525.

Wang W. (1986). Toxicity tests of aquatic pollutants by using common duckweed. Environ. Pollut. 11: 1-14.

Wang W. (1987). Factors affecting metal toxicity to (and accumulation by) aquatic organism (overview). Environ. Int. 13: 437-457.

Wang W. (1990). Literature review on duckweed toxicity testing. Environ. Res. 52: 7-22.

Wang W. (1991). Literature review on higher plants for toxicity testing. Water Air Pollut. 59: 381-400.

Wang W.(1992). Use of plant for the assessment of environmental contaminants. Rev. Environ. Contam. Toxicol. 126: 87-127. Wang W., Freemark K. (1995). The use of plants for environmental monitoring and assessment. Ecotoxicol. Environ. Saf. 30: 289-301.

127

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik Watkins C.H., Hammerschlang R.S. (1984). The toxicity of chlorine to a common vascular aquatic plant. Water Res. 18: 1037-1043.

Weber C.I., Peltier W.H., Norberg-King T.J., Horning W.B., Kessler F.A., Menkedick J.R., Neiheisel T.W., Lewis P.A., Klemm D.J., Pickering Q.H., Robinson E.L., Lazorchak J.M., Wymer L.J., Freyberg R.W. (1989). Short-term methods for estimating the chronic toxicity of effluents and receiving waters to freshwater organism. US EPA,

600/4-89/001,

Environmental Monitoring Systems Laboratory, Cincinnati, OH.

Webster E.A., Gadd G.M. (1996). Stimulation of respiration in Ulva lactuca by high concentrations of cadmium and zinc: Evidence for an alternative respiratory pathway. Environmental Toxicology and Water Quality 11: 7-12.

Weckx J.E.J., Clijsters H.M.M. (1997). Yn phytotoxicity induced oxidative stress primary leaves of Phaseolus vulgaris. Plant Physiology and Biochemistry 35: 405-410.

Weigel H.J. (1985). The effect of Cd2+ on photosynthetic reaction of mesophyll protoplasts abstract no. 2). Physiologia Plantarum 63: 192-200.

Weinstein L.H., Laurence J.A., Mandl R.H., Walti K. (1990). Use of native and cultivated plants as bioindicators and biomonitors of pollution. American Society for Testing and Materials 1091: 117-126.

Wolterbeek H.T. (1987). Cation exchange in isolated xylem cell walls of tomato – Cd 2+ and Rb+ exchange in adsorption experiments. Plant Cell and Environment 10: 39-44.

Wu Q.T., Morel J.L., Gucker A. (1989). Effect of nitrogen source on cadmium uptake by plants. Comptes Rendus del Academie des Sciences Serie III – Sciences de la vie – Life Sciences 309: 215-220.

128

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik Yang X.E., Li T.Q., Long X.X., Xiong Y.H., He Z.L., Stoffella P.J. (2006). Dynamics of zinc uptake and accumulation in the hyperaccumulating and nonhyperaccumulating ecotype of Sedum alfredii Hance. Plant and Soil 284: 109-119.

Ye H.B., Yang X.E., He B., Long X.X., Shi W.Y. (2003). Growth response and metal accumulation of Sedum alfredii to Cd/Zn complex-polluted ion levels. Acta Botanica Sinica 45: 1030-1036.

Zhang L., Song F.B. (2006). Effects of forms and rates of zinc fertilizers on cadmium concentrations in two cultivars of maize. Communications in Soil Science and Plant analysis 37: 1905-1916.

Zhang F.Q., Shi W.Y., Jin Y.X., Shen Z.G. (2003). Responce of antioxidative enzymes in cucumber chloroplast to cadmium toxicity. Journal of Plant Nutrition 26: 1779-1788.

Zhao Z.Q., Zhu Y.G., Kneer R., Smith S.E. (2005). Effect of zinc on cadmium toxicity – induced oxidative stress in winter wheat seedlings. Journal of Plant Nutrition 28: 1947-1959.

VIII. INTERNETOVÉ ZDROJE http://www.mze.cz http://www.piskac.cz/ETD http://cs.wikipedia.org/wiki/kadmium

129

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik http:// cs.wikipedia.org/wiki/zinek http://www.uuu.cz/default.asp?ID=678 http://www.khszlin.cz/doc/252-2004.pdf http://hydro.chmi.cz/ojv/htm/pasporty/kovy/kadmium.htm http:// hydro.chmi.cz/ojv/htm/pasporty/kovy/zinek.htm http://www.af.mendelu.cz/agrochem/multitexty(html/agrochemie_pudy/půda_TK.htm http://www.env.cz/AIS/web.nsf/pages/zpravy-o-stavu-zivotniho-prostredi http://www.recetox.muni.cz/projekty/Unido/narodni_inventura_pops.htm http://en.wikipedia.org/wiki/Matricaria http://www.ipm.ucdavis.edu/PMG/WEEDS/mayweed_chamomile.html http://www.ipm.ucdavis.edu/PMG/WEEDS/pineapple_weed.html http://www.gardenorganic.org.uk/organicweeds/weed_information/weed.php?id=51 http://en.wikipedia.org/wiki/Asteraceae http://www.msmt.cz/ http://www.rvp.cz/

IX. VYUŽITÍ EXPERIMENTÁLNÍ PRÁCE V UČITELSKÉ PRAXI

130

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik V posledních letech prochází české školství reformou. Dřívější osnovy nahrazují tzv. Rámcově vzdělávací programy (RVP), podle kterých se nejpozději od 1. září 2009 začne vyučovat na všech základních a středních školách. RVP vycházejí z nové strategie vzdělávání, zdůrazňující klíčové kompetice, jejich provázanost se vzdělávacím obsahem

a uplatnění

získaných vědomostí a dovedností v praktickém životě. Vychází z koncepce celoživotního učení a formulují očekávanou úroveň vzdělání stanovenou pro všechny absolventy jednotlivých etap vzdělávání. Absolvent střední školy by měl v průběhu vzdělávání získat široký vzdělanostní základ, který RVP předpokládají a který mu umožní dále rozvíjet schopnosti a dovednosti při vysokoškolském a dalším studiu. RVP sestavují dle instrukcí MŠMT ČR samotné školy s ohledem na své zaměření a možnosti. Uvádějí v něm mimo jiné i postupy, které budou učitelé využívat k rozvíjení klíčových kompetencí žáků. Na čtyřletých gymnáziích a na vyšším stupni víceletých gymnázií jsou RVP orientačně rozděleny do osmi vzdělávacích oblastí, tvořených jedním nebo více obsahově blízkými vzdělávacími obory: Jazyk a jazyková komunikace (Český jazyk a literatura, Cizí jazyk, Další cizí jazyk); Matematika a její aplikace (Matematika a její aplikace); Člověk a příroda (Fyzika, Chemie, Biologie, Geografie, Geologie); Člověk a společnost (Občanský a společenskovědní základ, Dějepis; Geografie); Člověk a svět práce (Člověk a svět práce); Umění a kultura (Hudební obor, Výtvarný obor); Člověk a zdraví (Výchova ke zdraví, Tělesná výchova); Informatika a informační a komunikační technologie (Informatika a informační a komunikační technologie). Oblast Člověk a příroda učí žáky poznávat různými metodami zákonitosti, jimiž se řídí přírodní procesy. V rámci výuky biologie jsou poznatky z anatomie a fyziologie rostlin součástí samostatného celku Biologie rostlin, která zahrnuje několik kapitol: 1) Morfologie a anatomie rostlin 2) Fyziologie rostlin 3) Systém a evoluce rostlin 4) Rostliny a prostředí V poslední uvedené kapitole (4. kapitola) se studenti seznamují s vlivem biotických a abiotických podmínek prostředí na stavbu a funkci rostlinného těla. Mezi abiotické faktory patří řada cizorodých látek (xenobiotik), především antropogenního původu. Tyto látky (např. oxidy dusíku, oxid siřičitý, oxid uhličitý, toxické kovy, organické sloučeniny) jsou přítomné 131

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik v prostředí, negativně působí nejen na rostliny, ale i na ostatní živé organizmy a jejich akumulací ve složkách prostředí se účinek těchto látek zesiluje. Pro ilustraci vlivu toxických kovů na klíčení a růst rostlin může žákům sloužit experiment a výsledky, uvedené v této práci. Metodika pokusu může být rovněž návodem na provedení obdobného experimentu ve školních podmínkách. Vzhledem k tomu, že jednotlivé etapy ontogeneze vykazují různou citlivost k xenobiotikům, lze pro porovnání provést experiment s interakcí Zn a Cd (kromě semen) také s dospělými rostlinami kultivovanými v roztocích s různou koncentrací kovů. Žáci pak mohou hodnotit, jak se liší vnější vzhled rostlin, kultivovaných v roztoku s Zn a Cd oproti kontrole a jaké změny v rostlinném metabolismu stojí za těmito rozdíly. Mohou zde využít poznatků z kapitoly Morfologie a anatomie rostlin a Fyziologie rostlin. Experiment se svým tématem dotýká současného celosvětového problému znečištění životního prostředí (především antropogenní činností jako je těžba, průmysl, doprava). Patří mezi laboratorní testy fytotoxicity, které spolu s enviromentálním monitoringem hrají klíčovou roli při hodnocení stavu životního prostředí a toxicity cizorodých látek. Pokus lze tedy zařadit i do výuky ekologie a demonstrovat na něm negativní vliv xenobiotik na živé organizmy. Žáci by si měli uvědomit, že ohrožen je také člověk samotný, neboť se cizorodé látky mohou přes potravní řetězce dostat i do lidského těla. Ve výuce chemie lze pokus využít při probírání učiva o zinku a kadmiu. Oba kovy patří mezi d-prvky, mají podobný poloměr a oba jsou přijímány rostlinami. Přesto mají rozdílné vlastnosti, z čehož vychází i jejich odlišný vliv na živé organizmy. Zinek patří mezi esenciální prvky pro rostliny, je součástí mnoha enzymů. Kadmium je silně toxické. Ve směsi mohou být účinky obou kovů v závislosti na jejich koncentraci zesíleny nebo zeslabeny, což studenti odvodí na základě experimentu. V této části diplomové práce jsem chtěla ukázat, jak lze využit můj experiment k vysvětlení či doplnění teorie ve výuce chemie a biologie na středních školách, aby pomohl studentům lépe pochopit probíranou látku a prakticky si ověřit získané poznatky.

132

Testy fytotoxicity a jejich využití pro hodnocení vlivu xenobiotik

Recommend Documents