Test PD-L1 IHC 22C3 pharmdx slouží jako pomůcka k identifikaci pacientů s NSCLC vhodných k léčbě přípravkem KEYTRUDA (pembrolizumab)

PD-L1 IHC 22C3 pharmDx SK006 50 testů pro použití s přístrojem Autostainer Link 48 Použití k určenému účelu Pro diagnostiku in vitro. PD-L1 IHC 22C3 pharmDx je kvantitativní imunohistochemický test využívající monoklonální myší protilátku Anti-PD-L1, klon 22C3 k detekci proteinu PD-L1 v řezech tkání s nemalobuněčným karcinomem plic (NSCLC), fixovaných ve formalinu a zalitých v parafínu (FFPE), pomocí vizualizačního systému EnVision FLEX na přístroji Autostainer Link 48. Exprese proteinu PD-L1 se stanovuje za použití skóre pro vyjádření procentuálního podílu nádorových buněk (Tumor Proportion Score, TPS), což je procento životaschopných nádorových buněk, které vykazují částečné nebo kompletní zbarvení membrány. Test PD-L1 IHC 22C3 pharmDx slouží jako pomůcka k identifikaci pacientů s NSCLC vhodných k léčbě přípravkem KEYTRUDA® (pembrolizumab). Souhrn a výklad Vazba ligandů PD-1, PD-L1 a PD-L2 k receptoru PD-1 na T-buňkách inhibuje proliferaci T-buněk a produkci cytokinů. Up regulace ligandů PD-1 se vyskytuje u některých nádorů a signalizuje, že prostřednictvím této dráhy lze přispět k inhibici aktivních T-buněk imunitního dozoru nádorů. Přípravek KEYTRUDA je humanizovaná monoklonální protilátka, která se váže na receptor PD-1 a blokuje jeho interakci s PD-L1 a PD-L2, uvolňuje inhibici imunitní odpovědi, zprostředkovanou po dráze PD-1, včetně protinádorové imunitní odpovědi. Na modelech syngenních myších nádorů vedlo blokování aktivity PD-1 ke snížení růstu nádoru (1). Princip metody Test PD-L1 IHC 22C3 pharmDx obsahuje optimalizovaná činidla a protokol nutný k dokončení postupu IHC barvení vzorků FFPE pomocí přístroje Autostainer Link 48. Po inkubaci s primární monoklonální protilátkou proti PD-L1 nebo činidlem pro negativní kontrolu (Negative Control Reagent, NCR) se vzorky inkubují se specifickou protilátkou proti hostitelskému druhu primární protilátky, a pak se vzorky inkubují s vizualizačním činidlem připraveným k okamžitému použití, které obsahuje molekuly sekundárních protilátek a molekuly křenové peroxidázy navázané na společný hlavní řetězec dextranového polymeru. Enzymatická přeměna následně přidaného chromogenu vede k vytvoření viditelného reakčního produktu v místě protilátky. Barva chromogenní reakce je zesílena chromogenním činidlem. Vzorek může být poté kontrastně podbarven a překryt krycím sklíčkem. Výsledky se interpretují pomocí světelného mikroskopu. Dodané materiály Každá souprava obsahuje 19,5 ml primární protilátky proti PD-L1 (přibližně 3 µg/ml proteinové koncentrace) a obsahuje činidla nezbytná pro 50 testů v až 15 samostatných sériích. Materiály uvedené níže vystačí pro 50 testů (50 sklíček inkubovaných s primární protilátkou proti PD-L1 a 50 sklíček inkubovaných s odpovídajícím činidlem pro negativní kontrolu, celkem 100 sklíček). Počet testů vychází z použití 2 × 150 µl každého činidla na sklíčko s výjimkou DAB+ a roztoku Target Retrieval Solution. Souprava obsahuje dostatečné množství materiálů pro až 15 samostatných sérií barvení. Množství 1 × 34,5 ml

Popis Peroxidase-Blocking Reagent

PEROXIDASE-BLOCKING REAGENT Pufrovaný roztok obsahující peroxid vodíku, detergent a 0,015 mol/l azidu sodného. 1 × 19,5 ml

Primární protilátka: Monoklonální myší Anti-PD-L1, klon 22C3

MONOCLONAL MOUSE ANTI-PD-L1 CLONE 22C3 Monoklonální myší (IgG1) anti-PD-L1 v pufrovaném proteinovém stabilizačním roztoku s 0,015 mol/l azidu sodného. 1 × 15 ml

Činidlo pro negativní kontrolu

ČINIDLO PRO NEGATIVNÍ Monoklonální myší kontrolní IgG protilátka v pufrovaném proteinovém stabilizačním roztoku s 0,015 mol/l azidu sodného. 1 × 34,5 ml

Mouse LINKER

LINKER, ANTI-MOUSE Králičí sekundární protilátka proti myším imunoglobulinům v pufrovaném proteinovém stabilizačním roztoku s 0,015 mol/l azidu sodného. 1 × 34,5 ml

Visualization Reagent-HRP

VISUALIZATION REAGENT-HRP Dextran spolu s molekulami peroxidázy a molekulami kozích sekundárních protilátek proti králičím a myších imunoglobulinům v pufrovaném proteinovém stabilizačním roztoku a antimikrobiální látce. P03928CZ_03/SK00621-2/2016.11 p. 1/14

15 × 7,2 ml

DAB+ Substrate Buffer

DAB+ SUBSTRATE BUFFER Pufrovaný roztok obsahující peroxid vodíku a antimikrobiální látku. 1 × 5 ml

Chromogen DAB+

CHROMOGEN DAB+ 3,3’-diaminobenzidin tetrahydrochlorid v organickém rozpouštědle. 1 × 34,5 ml

DAB Enhancer

DAB ENHANCER Síran měďnatý ve vodě. 6 × 30 ml

Roztok EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low pH, 50x

EnVision™ FLEX Roztok TARGET RETRIEVAL SOLUTION LOW pH (50X) Pufrovaný roztok, pH 6,1, obsahující detergent a antimikrobiální látku. 15 sklíček

Kontrolní sklíčka PD-L1 IHC 22C3 pharmDx

KONTROLNÍ SKLÍČKA

XXXXX

PD-L1 IHC 22C3 pharmDx

Na každém sklíčku jsou části dvou peletovaných buněčných linií fixovaných ve formalinu a zalitých v parafínu: NCIH226* se střední expresí PD-L1 a MCF-7 s negativní expresí PD-L1.

MCF-7: PD-L1 negativní NCI-H226: PD-L1 pozitivní

*Dr. AF Gazdarovi a Dr. JD Minnovi z NIH za jejich přínos ve vývoji NCI-H226 (číslo ATCC: CRL-5826™) (2). Poznámka: Všechna obsažená činidla jsou vytvořena speciálně pro použití s touto soupravou. Aby bylo možné test provést podle uvedeného postupu, nelze používat žádné náhrady kromě roztoku EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low pH, 50x (kód K8005). PD-L1IHC 22C3 pharmDx byl uzpůsoben pro použití s přístrojem Autostainer Link 48. Podrobnější informace viz návod k použití přístroje Autostainer Link 48 a PT Další potřebné materiály, které nejsou součástí dodávky Modul pro předběžné zpracování vzorků PT Link Pre-treatment Module (kód PT100/PT101) Přístroj Autostainer Link 48 (kód AS480) Pufr EnVision FLEX Wash Buffer, 20x (kód K8007) Hematoxylin (kód K8008) Destilovaná nebo deionizovaná voda (v kvalitě činidla) Časovač Pozitivní a negativní tkáně pro kontrolu zpracování (viz část Kontrola kvality) Mikroskopická sklíčka: Sklíčka Dako FLEX IHC Microscope Slides (kód K8020) nebo kontrolní sklíčka Fisherbrand Superfrost Plus Krycí sklíčka Trvalé uzavírací médium a pomocná činidla potřebná pro vytvoření mikroskopického preparátu pod krycími sklíčky Světelný mikroskop (zvětšení objektivu 4x–40x) Bezpečnostní opatření 1. Pro diagnostiku in vitro. 2. Určeno pro profesionální uživatele. 3. Tento výrobek obsahuje azid sodný (NaN3), který je v čisté formě vysoce toxický. Přestože koncentrace azidu sodného ve výrobku se neklasifikuje jako nebezpečná, může usazenina NaN3 reagovat s olovem a mědí v odpadním potrubí a vytvářet vysoce explozivní azidy kovů. Při likvidaci splachujte dostatečným množstvím vody, aby nedocházelo k usazování azidů kovů v potrubí (3). 4. Primární protilátka, činidlo pro negativní kontrolu, Linker a vizualizační činidlo obsahuje materiál zvířecího původu. 5. Vzorky před a po fixaci a všechny jim vystavené materiály by měly být považovány za potenciálně infekční a mělo by se s nimi nakládat s náležitou opatrností (4). 6. Inkubační časy, teploty nebo metody jiné než ty uvedené, mohou vést k chybným výsledkům. 7. Činidla jsou optimálně naředěna. Další ředění může vést ke ztrátě barvení protilátky. 8. Vizualizační činidlo, tekutý chromogen DAB+ a připravený roztok substrát-chromogen DAB+ mohou být negativně ovlivněny, pokud jsou vystaveny intenzivnímu světlu. Neuchovávejte komponenty systému a neprovádějte barvení za silného světla, jako je například přímé sluneční světlo. 9. Rezidua parafínu mohou vést k falešně negativním výsledkům. 10. Použití objemů činidel jiných než doporučených může vést ke ztrátě viditelné imunoreaktivity PD-L1. 11. Výsledky z malých studií prokázaly stejný dynamický rozsah exprese PD-L1 u párů vzorků primárního i metastázujícího NSCLC. Je možné, že exprese PD-L1 u primárních nádorů v porovnání s metastázujícími oblastmi se může u stejného pacienta lišit. 12. Velké řezy tkání mohou vyžadovat 3 × 150 µl činidla.

P03928CZ_03/SK00621-2/2016.11 p. 2/14

13. Obecně platí, že osoby mladší 18 let s tímto přípravkem nesmějí pracovat. Uživatelé musí být pečlivě proškoleni ve správných pracovních postupech, seznámeni s nebezpečnými vlastnostmi přípravku a nezbytnými bezpečnostními pokyny. Další informace viz bezpečnostní list (Safety Data Sheet, SDS). 14. Používejte odpovídající osobní ochranné prostředky, aby nedošlo k zasažení očí nebo pokožky. 15. Nespotřebované roztoky je nutno likvidovat v souladu s místními a celostátními předpisy. 16. Bezpečnostní list pro profesionální uživatele je k dispozici na vyžádání.

Rizika Chromogen DAB+: 1–5% bifenyl-3,3',4,4'-tetrayltetraammonium-tetrachlorid H350 Může vyvolat rakovinu. H341 Podezření na genetické poškození. P201 Před použitím si obstarejte speciální instrukce. P202 Nepoužívejte, dokud jste si nepřečetli všechny pokyny pro bezpečné zacházení a neporozuměli jim. P280 Používejte ochranné rukavice. Používejte ochranu očí a obličeje. obličejový štít. P308 + P313 PŘI expozici nebo podezření na ni: Vyhledejte lékařskou pomoc. P405 Skladujte uzamčené. P501 Odstraňte obsah a obal v souladu se všemi místními, oblastními, národními a mezinárodními předpisy.

Výstraha Roztok EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low pH (50x): 1–5% kyselina citronová H319 Způsobuje vážné podráždění očí. H411 Toxický pro vodní organismy, s dlouhodobými účinky. P280 Používejte ochranu očí a obličeje. P273 Zabraňte úniku do životního prostředí. P264 Po manipulaci si důkladně omyjte ruce. P305 + P351 + PŘI ZASAŽENÍ OČÍ: Několik minut opatrně oplachujte vodou. Vyjměte kontaktní čočky, jsou-li nasazeny a P338 pokud je lze vyjmout snadno. Pokračujte ve vyplachování. P337 + P313 Přetrvává-li podráždění očí: Vyhledejte lékařskou pomoc. P501 Odstraňte obsah a obal v souladu se všemi místními, oblastními, národními a mezinárodními předpisy. Uchovávání Všechny komponenty PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, včetně kontrolních sklíček, uchovávejte v temnu při teplotě 2–8 °C, pokud je nepoužíváte s přístrojem Autostainer Link 48. Nepoužívejte soupravu po uplynutí doby exspirace vytištěné na vnějším obalu soupravy. Pokud se činidla skladují za jakýchkoli jiných podmínek než uvedených v příbalovém letáku, musí uživatel tyto podmínky ověřit. Nestabilita přípravku se neprojevuje žádnými výraznými známkami, proto by vzorky pozitivní a negativní kontroly měly být vždy zpracovávány spolu se vzorky pacienta. Příprava vzorku Se vzorky se musí manipulovat tak, aby tkáň pro IHC barvení zůstala chráněna. Všechny vzorky tkání by se měly zpracovávat podle standardních metod. Řezy zalité v parafínu Tkáně fixované ve formalinu a zalité v parafínu jsou vhodné pro použití. Alternativní fixativa nebyla validována a mohou vést k nesprávným výsledkům. Doporučuje se vzorek fixovat po dobu 12–72 hodin v 10% neutrálním pufrovaném formalinu (neutral buffered formalin, NBF), nicméně studie s omezeným počtem vzorků prokázala, že fixace po dobu 4–168 hodin v 10% NBF detekci PD-L1 systematicky neovlivňuje. Fixační časy ≤3 hodiny mohou vést k proměnlivé detekci PD-L1. Vzorky by měly mít tloušťku 3 nebo 4 mm, měly by být fixované ve formalinu, dehydrované a vyčištěné v sérii alkoholů a xylenu, po kterém následuje infiltrace s roztaveným parafínem. Teplota parafínu by neměla překročit 60 °C. Tkáňové bločky FFPE staré 5 let a více mohou ztratit schopnost imunoreaktivity PD-L1. Vzorky tkání je nutno rozřezat na řezy o tloušťce přibližně 4–5 µm. Po vytvoření řezů se tkáně musí upevnit na sklíčka Fisherbrand Superfrost Plus nebo mikroskopická sklíčka Dako FLEX IHC (kód K8020) a vložena na 1 hodinu do pece při teplotě 58 ± 2 °C. Chcete-li zachovat antigenicitu měly by se tkáňové řezy, jakmile jsou umístěny na sklíčka, uchovávat v temnu při teplotě 2–8 °C (preferováno), nebo při pokojové teplotě do 25 °C, a barveny do 6 měsíců po nařezání. Teplota při skladování nebo manipulaci by nikdy překročit 25 °C, a to v žádném okamžiku po umístění na sklíčka, aby se zajistila integrita a antigenicita tkáně. Použití PD-L1 IHC 22C3 pharmDx na dekalcifikovaných tkáních nebylo validováno a nedoporučuje se. Příprava činidla Před barvením je třeba připravit následující činidla: Roztok EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low pH, 50x Připravte si dostatečné množství roztoku 1x Target Retrieval Solution, Low pH, 50x jeho rozředěním destilovanou nebo deionizovanou vodou (v kvalitě činidla) v poměru 1:50; pH roztoku 1x Target Retrieval Solution musí být 6,1 ± 0,2. Roztok 1x Target Retrieval Solution s pH pod 5,9 může způsobovat chybné výsledky. Jedna 30ml lahvička roztoku Target Retrieval Solution, Low pH, 50x, rozředěného v poměru 1:50 poskytne 1,5 l 1x činidla stačí na naplnění jedné nádržky přístroje PT Link a ošetření až 24 sklíček na jedno použití. Roztok 1x Target Retrieval Solution zlikvidujte po třech použitích a nepoužívejte jej po 5 dnech po rozředění. V případě potřeby je k dispozici další roztok EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low pH, 50x, pod kódem K8005.

P03928CZ_03/SK00621-2/2016.11 p. 3/14

Pufr EnVision FLEX Wash Buffer, 20x Připravte si dostatečné množství pufru Wash Buffer rozředěním pufru Wash Buffer 20x v poměru 1:20 destilovanou nebo deionizovanou vodou (v kvalitě činidla) pro mytí. Nespotřebovaný roztok činidla 1x skladujte při teplotě 2–8 ºC ne déle než jeden měsíc. Čidlo zlikvidujte, pokud je zakalené. Podrobnější informace viz návod k použití přístroje Autostainer Link 48. Pufr EnVision FLEX Wash Buffer, 20x je k dispozici pod kódem K8007. Roztok substrát-chromogen DAB+ Tento roztok by měl být před použitím důkladně promíchán. Jakékoliv sraženina v roztoku nemá vliv na kvalitu barvení. Pro přípravu roztoku substrát-chromogen DAB+ přidejte 1 kapku chromogenu Liquid DAB+ Chromogen na ml pufru DAB+ Substrate Buffer a promíchejte. Připravený substrát-chromogen je stabilní po dobu 5 dnů, pokud je uchováván v temnu při teplotě 2–8 C. Důležitá upozornění:  Pokud použijete celou lahev pufru DAB+ Substrate Buffer, přidejte 9 kapek chromogenu DAB+. Ačkoli na štítku je uvedeno 7,2 ml, jedná se o použitelné množství, ale není připočten „mrtvý objem“ v lahvi.  Barva chromogenu Liquid DAB+ Chromogen v lahvi se může lišit, od bezbarvé po fialově-hnědou. Tím není ovlivněna výkonnost přípravku. Ředění provádějte podle pokynů výše. Nadměrné přidání chromogenu Liquid DAB+ Chromogen do pufru DAB+ Substrate Buffer povede ke zhoršení pozitivního signálu. Postup barvení roztokem Autostainer Link 48 Solution Poznámky k postupu Uživatel by si měl před použitím pečlivě přečíst tyto pokyny a seznámit se se všemi komponenty a vybavením (viz Bezpečnostní opatření). Všechna činidla musí být před imunologickým barvením ekvilibrována na pokojovou teplotu (20–25 °C). Stejně tak by se všechny kroky inkubace měly provádět za pokojové teploty. Řezy tkání nesmí během barvení uschnout. Řezy suché tkáně mohou zvýraznit nespecifické barvení. Všechny požadované kroky a časy inkubace jsou naprogramovány v softwaru Dako Link. Podrobnější informace o programování protokolů a vkládání sklíček a činidel viz návod k použití přístroje Autostainer Link 48 a PT. Poznámka: Činidla a pokyny dodávané s tímto systémem byla vytvořena za účelem optimálního výkonu při použití s doporučenými činidly a materiály. Další ředění činidel nebo pozměnění časů inkubace nebo teplot může vést k chybným nebo nesouhlasným výsledkům. Protokol barvení V možnostech rozevírací nabídky softwaru Dako Link vyberte protokol barvení PD-L1 IHC 22C3 pharmDx. Všechny požadované kroky a časy inkubace jsou naprogramovány v přístroji Autostainer Link 48. Pokud na vašem serveru nejsou příslušné protokoly PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, kontaktujte zástupce technických služeb, aby vám protokoly poskytl. Krok 1: Postup deparafinizace, rehydratace a vyhledání cíle (3 v 1) Podrobné informace viz návod k použití přístroje PT. Nastavte funkci Preheat and Cool (Předehřátí a ochlazování) v přístroji PT Link (kód PT100/PT101) na 65 °C. Funkci Heat (Ohřev) nastavte na 97 °C po dobu 20 minut. ►Naplňte každou nádrž přístroje PT Link 1,5 l pracovního roztoku Target Retrieval Solution, Low pH, 1x pro pokrytí řezů tkáně. ►Předehřejte roztok Target Retrieval Solution na 65 °C. ►Ponořte stojánky Autostainer s řezy tkáně FFPE na sklíčkách do předehřátého roztoku Target Retrieval Solution, Low pH, (1x pracovní roztok) v nádržce přístroje PT Link. Inkubujte 20 minut při teplotě 97 °C. ►Po dokončení inkubace pro vyhledání cíle a poklesu teploty na 65 °C, vyjměte každý stojan se sklíčky Autostainer z nádržky přístroje PT Link a ihned přemístěte stojan Autostainer se sklíčky do nádržky (např. PT Link Rinse Station, kód PT109) s rozředěným pufrem Wash Buffer o pokojové teplotě (kód K8007). ►Ponechte sklíčka inkubovat v rozředěném pufru Wash Buffer zahřátém na pokojovou teplotu po dobu 5 minut. Krok 2: Postup barvení Po deparafinaci, rehydrataci a vyhledání cíle (3 v 1) se stojánky Autostainer se sklíčky vloží do přístroje Autostainer Link 48. Přístroj provede proces barvení, tj. aplikuje příslušné činidlo, monitoruje časy inkubace a opláchne sklíčka mezi jednotlivými činidly. Časy pro jednotlivá činidla jsou naprogramovány v softwaru Dako Link. Krok 3: Kontrastní barvivo Sklíčka by měla být kontrastně podbarvována po dobu 5 minut hematoxylinem (Link) (kód K8008). Inkubační doba hematoxylinu je předprogramována v protokolu. Krok 4: Montáž Je vyžadováno bezvodé permanentní uzavírací médium. Poznámka: U některých obarvených sklíček se může vyskytnout blednutí v závislosti na několika faktorech, včetně mimo jiné na kontrastním podbarvení, uzavíracích materiálech a metodách a na podmínkách uchovávání sklíček. Pro minimalizaci vyblednutí uchovávejte sklíčka v temnu při pokojové teplotě (20–25 °C). Kontrola kvality Činidla PD-L1 IHC 22C3 pharmDx byla z hlediska kvality kontrolována imunohistochemicky za použití vyhledávání cíle a postupů barvení uvedených výše. Odchylky od doporučených postupů pro fixaci tkání, zpracování a zalití může vést ke značné variabilitě výsledků získaných v laboratoři uživatele. Každá série barvení by měla být podrobena kontrolám kvality. Tyto kontroly kvality jsou uvedeny v tabulce 1 a obsahují: vzorky tkáně pacienta obarvené hematoxylinem a eosinem (H & E); laboratoří dodané pozitivní a negativní kontrolní tkáně; a kontrolní sklíčko s buněčnými liniemi dodané společností Dako (5). V USA prostudujte zásady kontroly kvality patologů z College of American Pathologists (CAP) Accreditation Program for Immunohistochemistry (certifikační program pro imunohistochemii), další informace viz též zajištění kvality CLSI pro imunocytochemii, schválené pokyny (5, 6, 7).

P03928CZ_03/SK00621-2/2016.11 p. 4/14

Ověření stanovení Před prvním použitím barvicího systému v rámci diagnostického postupu by měl uživatel ověřit provedení rozboru tak, že jej otestuje na sérii laboratoří dodaných pozitivních a negativní tkáních se známými IHC charakteristikami. Viz postupy kontroly kvality uvedené v části o kontrole kvality výše. Tyto postupy kontroly kvality by se měly opakovat pro každou novou šarži protilátky, nebo kdykoli dojde ke změně v testovacích parametrech. Možnosti řešení potenciálních problémů, jejich příčiny a navrhovaná nápravná opatření jsou uvedeny v tabulce 10. Interpretace exprese – NSCLC Všechny životaschopné nádorové buňky na celém sklíčku musí být vyhodnoceny a zahrnuty do interpretace exprese PD-L1. Ve vzorku na obarveném sklíčku PD-L1 považovaném za adekvátní pro hodnocení exprese PD-L1 musí být přítomno minimálně 100 životaschopných nádorových buněk. Pro úspěšnou interpretaci obarvených vzorků PD-L1 IHC 22C3 pharmDx je zcela zásadní, aby byly hodnoceny vhodné buňky, identifikována správná buněčná lokalizace a správně interpretována intenzita barvení. Sklíčka by měl vyhodnotit patolog za použití světelného mikroskopu. Pro vyhodnocení imunohistochemického barvení a interpretaci je vhodný objektiv se zvětšením 10–40x. Každé znatelné barvení buněčné membrány nádorových buněk by mělo být zahrnuto do interpretace. Interpretace částečného nebo úplného barvení buněčné membrány (≥1+), které je znatelně odlišné od cytoplazmatického barvení. Cytoplazmatické barvení se považuje za nespecifické barvení a je z hodnocení intenzity barvení vyloučeno. Normální buňky a s nádorem asociované imunitní buňky, jako jsou infiltrující lymfocyty nebo makrofágy, se nezahrnují do interpretace za účelem určení pozitivity PD-L1. Vzorky nádoru s NCR musí mít 0 specifické barvení a ≤1+ barvení pozadí. Skóre pro vyjádření procentuálního podílu nádorových buněk (Tumor Proportion Score, TPS) je procento životaschopných nádorových buněk, které vykazují částečné nebo kompletní zbarvení membrány (≥1+). Vzorky se považují za PD-L1 pozitivní, pokud TPS ≥ 1 % životaschopných nádorových buněk vykazuje zbarvení membrány jakékoli intenzity (tj. ≥1+). Každá série barvení sklíček by měla být vyšetřena v pořadí uvedeném v tabulce 1 pro určení platnosti barvení série a možnosti posouzení barvení vzorku tkáně. Další pokyny viz PD-L1 IHC 22C3 pharmDx Interpretation Manual. Další doporučení pro interpretaci barvení PD-L1 IHC 22C3 pharmDx 1. Pro ověření barvení buněčné membrány použijte objektiv se zvětšením 10–40x. 2. Různé necílové prvky, jako jsou s nádorem asociované imunitní buňky (například makrofágy) a stroma mohou také barvit pozitivně pro PD-L1, avšak neměly by být zahrnuty do interpretace. Tabulka 1. Doporučené pořadí hodnocení sklíček Vzorky Zdůvodnění 1. H&E Barvení vzorku tkáně hematoxylinem a eosinem (H&E) (dodaná se hodnotí jako první pro laboratoří) posouzení histologické a konzervační kvality tkáně. 2. Kontrolní sklíčka s buněčnými liniemi (dodává spol. Dako)

Kontrolní sklíčko s buněčnými liniemi barvené primární protilátkou PD-L1 od PD-L1 IHC 22C3 pharmDx by mělo být vyšetřeno kvůli ujištění, zda všechna činidla fungují správně. Kontrolní sklíčko obsahuje peletu s PD-L1-pozitivními buněčnými liniemi a peletu s PD-L1negativními buněčnými liniemi.

3. Sklíčka s pozitivní kontrolní tkání (dodaná laboratoří)

Poté by měla být vyšetřena sklíčka s pozitivní kontrolní tkání obarvenou primární protilátkou proti PD-L1 a činidlem pro negativní kontrolu. Tato sklíčka ověřují účinnost metody fixace a procesu vyhledání epitopu. Známé kontrolní vzorky pozitivní tkáně by se měly používat pouze ke sledování správného zpracování tkáně a testovacích činidel, NE jako pomůcka pro diagnostiku vzorků pacienta.

Požadavky Test PD-L1 IHC 22C3 pharmDx a barvení H & E by se měly provádět na sériových řezech ze stejného parafínového bločku vzorku. Ve vzorku považovaném za adekvátní pro hodnocení exprese PD-L1 musí být přítomno minimálně 100 životaschopných nádorových buněk. Tkáňové vzorky by měly být neporušené, dobře zachovalé a měly by potvrdit indikaci nádoru. Kontrolní sklíčko s buněčnými liniemi se obarví primární protilátkou proti PD-L1 v každé sérii barvení. Kritéria přijatelnosti NCI-H226 (PD-L1-pozitivní kontrolní buněčná linie):  Barvení buněčné membrány u ≥70 % buněk o průměrné intenzitě barvení ≥2+.  Nespecifické barvení o intenzitě <1+. Kritéria přijatelnosti MCF-7 (PD-L1-negativní kontrolní buněčná linie):  Nespecifické barvení.  Nespecifické barvení o intenzitě <1+. Poznámka: někdy lze u buněčné pelety MCF-7 pozorovat barvení několika buněk. Platí následující kritéria přijatelnosti: přítomnost ≤10 buněk celkem se zřetelným zbarvením plazmatické membrány, nebo s cytoplazmatickým barvením s intenzitou ≥1+ uvnitř hranic buněčné pelety MCF-7 je přijatelná. Pokud žádná z kontrolních buněčných linií toto kritérium nesplní, budou výsledky testů vzorků pacienta považovány za neplatné. Kontrolními vzorky by měly být biopticky nebo chirurgicky odebrané vzorky stejného nádoru jako pacientův vzorek, které jsou co nejrychleji fixovány, zpracovány a zality stejným způsobem, jako pacientovy vzorky. Pro interpretaci výsledků použijte intaktní vzorky, protože nekrotické nebo degenerované buňky se často barví nespecificky. Tkáně vybrané jako kontrolní vzorky pozitivní tkáně by měly při barvení PD-L1 vykazovat slabé až středně pozitivní barvení, aby pomohly odhalit jemné změny v citlivosti testu. Do každé série barvení by se měla přidat dvě sklíčka s pozitivní kontrolní tkání. Sklíčko obarvené PD-L1: Měla by být pozorována přítomnost hnědého zabarvení plazmatické membrány. Nespecifické barvení by mělo být ≤1+. Sklíčko obarvené činidlem pro negativní kontrolu: Žádné barvení membrány. Nespecifické barvení by mělo být ≤1+. Pokud kontrolní vzorky pozitivní tkáně selžou v demonstraci příslušného pozitivního barvení, budou výsledky testů vzorků považovány za neplatné.

P03928CZ_03/SK00621-2/2016.11 p. 5/14

4. Sklíčka s negativní kontrolní tkání (dodaná laboratoří)

5. Sklíčko s tkání pacienta obarvenou činidlem pro negativní kontrolu

6. Sklíčko s tkání pacienta obarvenou primární protilátkou proti PD-L1.

Poté by měla být vyšetřena sklíčka s negativní kontrolní tkání (o známé PD-L1 negativitě) obarvenou primární protilátkou proti PD-L1 a činidlem pro negativní kontrolu, a to za účelem ověření specificity značení cílového antigenu primární protilátkou. Alternativně mohou negativní části pozitivní kontrolní tkáně sloužit jako negativní kontrolní tkáň, ale to by mělo být ověřeno uživatelem.

Vyšetřete vzorky pacienta ošetřené činidlem pro negativní kontrolu od PD-L1 IHC 22C3 pharmDx. Činidlo pro negativní kontrolu se používá namísto primární protilátky a pomůcek pro interpretaci specifického barvení v místě protilátky. Nakonec vyšetřete celé sklíčko se vzorky pacienta obarvené primární protilátkou proti PD-L1 z testu PDL1 IHC 22C3 pharmDx. Konkrétní informace ohledně imunoreaktivity PD-L1 IHC 22C3 pharmDx viz Souhrn a výklad, Omezení a Charakteristiky účinnosti.

Kontrolními vzorky by měly být biopticky nebo chirurgicky odebrané vzorky stejného nádoru jako pacientův vzorek, které jsou co nejrychleji fixovány, zpracovány a zality stejným způsobem, jako pacientovy vzorky. Do každé série barvení by se měla přidat dvě sklíčka s negativní kontrolní tkání. Sklíčko obarvené PD-L1: Žádné barvení membrány u nádorových buněk. Nespecifické barvení by mělo být ≤1+. Sklíčko obarvené činidlem pro negativní kontrolu: Žádné barvení membrány. Nespecifické barvení by mělo být ≤1+. Pokud na sklíčkách s negativní kontrolní tkání dojde ke specifickému zbarvení plazmatické membrány, budou výsledky testů vzorků pacienta považovány za neplatné. Absence zbarvení buněčné membrány ověřuje specifické značení cílového antigenu primární protilátkou. Nespecifické barvení by mělo být ≤1+.

Pozitivní intenzitu barvení je třeba posuzovat v kontextu jakéhokoliv nespecifického zbarvení pozadí zaznamenaného na sklíčku pacienta s činidlem pro negativní kontrolu ve stejné sérii. U každého imunohistochemického testu negativní výsledek znamená, že protilátka nebyla detekována, ale nutně to neznamená, že protilátka nebyla v analyzovaných buňkách/tkáních přítomna. Všechny životaschopné nádorové buňky na celém obarveném sklíčku pacienta musí být vyhodnoceny a zahrnuty do interpretace exprese PD-L1. Ve vzorku považovaném za adekvátní pro hodnocení exprese PD-L1 musí být přítomno minimálně 100 životaschopných nádorových buněk.

Všeobecná omezení 1. Imunohistochemie je vícekrokový diagnostický postup, který vyžaduje specializované zaškolení ve výběru vhodných činidel a tkáně, fixaci a zpracování; přípravě imunohistochemických sklíček a interpretaci výsledků barvení. 2. Barvení tkání závisí na manipulaci a zpracování tkáně před barvením. Nesprávná fixace, zmrazení, rozmrazování, mytí, sušení, zahřívání, řezání nebo kontaminace jinými tkáněmi nebo tekutinami může způsobovat artefakty, zachycení protilátky nebo falešně negativní výsledky. Nekonzistentní výsledky mohou vzniknout kvůli odchylkám v metodách fixace a zalití nebo v důsledku skrytých nepravidelností tkání. 3. Nadměrné nebo neúplné kontrastní podbarvení může ohrozit správnou interpretaci výsledků. 4. Klinická interpretace pozitivního barvení, nebo jeho nepřítomnosti, musí být vyhodnocena v kontextu klinických projevů, morfologie a jiných histopatologických kritérií. Klinická interpretace jakéhokoli barvení, nebo jeho nepřítomnosti, musí být doplněna morfologickými studiemi, řádnými kontrolami a dalšími diagnostickými testy. Za interpretaci barveného preparátu zodpovídá kvalifikovaný patolog, který zná použité protilátky, činidla a použité metody. Barvení se musí provádět v certifikované laboratoři s příslušným oprávněním a pod dohledem kvalifikovaného patologa zodpovědného za hodnocení barvených sklíček a zaručení adekvátnosti pozitivních a negativních kontrol. 5. U tkání osob infikovaných virem hepatitidy B a s povrchovým antigenem hepatitidy B (HBsAg) se může projevovat nespecifické barevní křenovou peroxidázou (7). 6. Činidla mohou u dříve neošetřených typů tkání vykazovat neočekávané reakce. Možnost neočekávané reakce nemůže být zcela vyloučena ani u testovaných typů tkání, a to v důsledku biologické variability exprese antigenu v novotvarech nebo jiných patologických tkáních. Pokud zdokumentujete neočekávané reakce, kontaktujte technickou podporu společnosti Dako. 7. K falešně pozitivním výsledkům může docházet v důsledku neimunologické vazby proteinů nebo substrátu reakčních produktů. Mohou být také způsobeny pseudoperoxidázovou aktivitou (erytrocyty) a aktivitou endogenní peroxidázy (cytochrom C) (7). 8. Činidla a pokyny dodávané s tímto systémem byla vytvořena za účelem optimálního výkonu. Další ředění činidel nebo pozměnění časů inkubace nebo teplot může vést k chybným nebo nesouhlasným výsledkům. Omezení specifická pro tento produkt 1. Falešně negativní výsledky mohou být způsobeny degradací antigenu v tkáních, ke které může po určité době docházet. Vzorky je nutné barvit během šesti měsíců od upevnění tkání na sklíčka, pokud jsou skladována v temnu při teplotě 2–8 °C (preferováno), nebo při pokojové teplotě do 25 °C. 2. Abyste dosáhli optimálních a reprodukovatelných výsledků, je třeba vyhledat cíl u proteinu PD-L1 před ošetřením, kdy jsou tkáně běžným postupem fixovány (neutrální pufrovaný formalin) a zality v parafínu. 3. Nezaměňujte činidla jiných čísel šarže tohoto přípravku nebo souprav od jiných výrobců. Jedinou výjimkou je roztok EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low pH 50x, který je v případě potřeby k dispozici pod kódem K8005. 4. Obarvené linie kontrolních buněk by se měly použít pouze pro validaci barvení série, ale neměly by se používat pro interpretaci barevné reakce v řezech tkání. 5. Použití testu PD-L1 IHC 22C3 pharmDx s jinými fixativy než formalinem nebylo validováno. 6. Použití testu PD-L1 IHC 22C3 pharmDx pro aspiraci tenkou jehlou nebylo validováno.

P03928CZ_03/SK00621-2/2016.11 p. 6/14

Klinické hodnocení výkonnosti Klinický přínos testu PD-L1 IHC 22C3 pharmDx byl hodnocen v multicentrické, otevřené, randomizované klinické studii hodnotící bezpečnost a účinnost přípravku KEYTRUDA u pacientů s pokročilým NSCLC (9). Pacienti byli PD-L1 pozitivní podle klinického hodnocení (CTA) a došlo u nich k progresi onemocnění po chemoterapii s platinou. U pacientů s genomovou aberací genu EGFR nebo ALK došlo k progresi nádorového onemocnění po léčbě schválené FDA pro tyto aberace před obdržením přípravku KEYTRUDA. Pacienti byli randomizováni (1:1:1) a podle toho dostali buď 2 mg/kg (n=344) nebo 10 mg/kg (n=346) přípravku KEYTRUDA každé 3 týdny nebo 75 mg/m2 docetaxelu každé 3 týdny (n=343). Hodnocení stavu nádoru se provádělo každých 9 týdnů. Cílové ukazatele primární účinnosti pro celkové přežití (OS) a přežití bez progrese (PFS) podle kritérií hodnocené odezvy pevných nádorů verze 1.1 (RECIST 1.1) byly založeny na zaslepeném přehledu nezávislých radiologů. Na základě tohoto CTA bylo do studie randomizováno celkem 1 033 pacientů s NSCLC. Klinická prospěšnost testu PD-L1 IHC 22C3 pharmDx byla hodnocena na archivovaných vzorcích z klinické studie, které byly retrospektivně testovány v referenční laboratoři v USA testem PD-L1 IHC 22C3 pharmDx. Z 1 033 pacientů byla testem PD-L1 IHC 22C3 pharmDx retrospektivně testována nádorová tkáň 529 pacientů. Vzorky 413 pacientů byly pozitivní na expresi PD-L1 (≥ 1 % životaschopných nádorových buněk vykazovalo membránové barvení jakékoli intenzity) a vzorky od 94 pacientů byly negativní na expresi PD-L1 (<1 % životaschopných nádorových buněk vykazovalo membránové barvení jakékoli intenzity). Mezi těmito 413 pacienty s pozitivní expresí PD-L1 měly vzorky od 163 pacientů vysokou expresi PD-L1 (≥50 % životaschopných nádorových buněk vykazovalo membránové barvení jakékoli intenzity). Úroveň shody dosažené mezi CTA a PD-L1 IHC 22C3 pharmDx je uvedena v Tabulce 2. Tabulka 2: Shoda CTA a PD-L1 IHC 22C3 pharmDx Míra shody CTA v porovnání s PD-L1 IHC 22C3 pharmDx

PD-L1 Mez TPS 1 % TPS 50 %

Negativní procentuální shoda (95% interval spolehlivosti (CI)) 94,5 % [91,4 %–96,6 %] 98,3 % [97,1 %–99,0 %]

Pozitivní procentuální shoda (95% interval spolehlivosti (CI)) 80,0 % [76,9 %–82,8 %] 73,2 % [67,9 %–77,9 %]

Mezi randomizovanými pacienty pozitivními na PD-L1 IHC 22C3 pharmDx byly demografické a jiné výchozí charakteristiky mezi léčebnými rameny dobře vyvážené. Průměrný věk byl 63 let (44 % ve věku 65 a starší). Většina pacientů patřila k bílé rase (77 %) a byli to muži (58 %); základní výkonnostní stav byl ECOG 0 (29%), nebo 1 (71%). Sedmdesát osm procent (78 %) pacientů byli bývalí/aktivní kuřáci. Dvacet dva procent (22 %) pacientů mělo skvamózní histologii a 69 % mělo neskvamózní histologii. Výchozí a demografické charakteristiky byly v rámci celé klinické studie podobně dobře vyvážené napříč rameny s pembrolizumabem a docetaxelem. Výsledky účinnosti jsou shrnuty v tabulce 3. KEYTRUDA prokázal trvalý klinický přínos u pacientů s NSCLC, pozitivní expresí PD-L1 a TPS 1 %, což bylo vylepšeno u pacientů s vysokou expresí PD-L1, TPS  50 %, jak bylo stanoveno testem PD-L1 IHC 22C3 pharmDx. Závažnost přínosu byla porovnatelná v rámci celého klinického hodnocení. Tabulka 3 shrnuje klíčová měřítka účinnosti v celé PD-L1 pozitivní (TPS  1 %) populaci a u subsetu s vysokou expresí PD-L1 pozitivní (TPS  50 %) pro celou klinickou studii (PD-L1 pozitivní podle CTA) a u populace pozitivní podle testu PD-L1 IHC 22C3 pharmDx. Kaplan-Meierova křivka pro OS (TPS  1 %, dle stanovení testem PD-L1 IHC 22C3 pharmDx) je na obrázku 1.

P03928CZ_03/SK00621-2/2016.11 p. 7/14

Tabulka 3: Odpověď na přípravek KEYTRUDA u dříve léčených pacientů: Celá klinická studie a PD-L1 IHC 22C3 pharmDx pozitivní pacienti: PD-L1 TPS 1 % a TPS 50 % Cílový ukazatel

KEYTRUDA 2 mg/kg každé 3 týdny Klinické PD-L1 IHC hodnocení 22C3 pharmDx

KEYTRUDA 10 mg/kg každé 3 týdny Klinické PD-L1 IHC hodnocení 22C3 pharmDx

Docetaxel 75 mg/m2 každé 3 týdny Klinické PD-L1 IHC hodnocení 22C3 pharmDx

344

140

346

142

343

131

172 (50 %) 0,71 (0,58; 0,88) <0,001 10,4 (9,4; 11,9)

59 (42 %) 0,54 (0,37; 0,78) <0,001 11,8 (9,6; NA)

156 (45 %) 0,61 (0,49; 0,75) <0,001 12,7 (10,0; 17,3)

59 (42 %) 0,57 (0,39; 0,82) 0,00115 12,0 (8,7; NA)

193 (56 %)

67 (51 %)

---

---

--8,5 (7,5; 9,8)

--7,5 (6,3; 9,9)

266 (77 %) 0,88 (0,73; 1,04) 0,068 3,9 (3,1; 4,1)

97 (63 %) 0,68 (0,50; 0,92) 0,00578 4,9 (4,1; 6,2)

255 (74 %) 0,79 (0,66; 0,94) 0,005 4,0 (2,6; 4,3)

103 (73 %) 0,79 (0,59; 1,06) 0,05767 4,0 (2,2; 4,6)

257 (75 %)

94 (72 %)

---

---

--4,0 (3,1; 4,2)

--3,8 (2,2; 4,2)

18% (14; 23)

24% (17; 32)

18% (15; 23)

20% (14; 28)

9% (7; 13)

5% (2; 11)

139

56

151

60

152

47

58 (42 %) 0,54 (0,38; 0,77) <0,001 14,9 (10,4; NA)

18 (32 %) 0,45 (0,24; 0,84) 0,00541 Nedosažen (9,3; NA)

60 (40 %) 0,50 (0,36; 0,70) <0,001 17,3 (11,8; NA)

19 (32 %) 0,29 (0,15; 0,56) <0,001 Nedosažen (8,3; NA)

86 (57 %)

25 (53 %)

---

---

--8,2 (6,4; 10,7)

--7,2 (4,4; 8,3)

89 (64 %) 0,58 (0,43; 0,77) <0,001 5,2 (4,0; 6,5)

33 (59 %) 0,47 (0,28; 0,80) 0,00221 5,9 (4,2; 9,0)

97 (64 %) 0,59 (0,45; 0,78) <0,001 5,2 (4,1; 8,1)

34 (57 %) 0,41 (0,24; 0,70) <0,001 4,8 (2,8; NA)

118 (78 %)

33 (70 %)

---

---

--4,1 (3,6; 4,3)

--3,9 (2,0; 4,3)

30% (23; 39)

37% (25; 52)

29% (22; 37)

28% (18; 41)

8% (4; 13)

4% (1; 15)

TPS 1 % Počet pacientů OS Úmrtí (%) Míra rizika* (95% CI) Hodnota p† Medián v měsících (95% CI) PFS‡ Případy (%) Míra rizika* (95% CI) Hodnota p† Medián v měsících (95% CI) Celková míra odpovědi‡ ORR %§ (95% CI) TPS 50 % Počet pacientů OS Úmrtí (%) Míra rizika* (95% CI) Hodnota p† Medián v měsících (95% CI) PFS‡ Případy (%) Míra rizika* (95% CI) Hodnota p† Medián v měsících (95% CI) Celková míra odpovědi ‡ ORR %§ (95% CI) * † ‡ § ¶

Míra rizika (KEYTRUDA ve srovnání s docetaxelem) založená na stratifikovaném Coxově modelu proporčních rizik Podle stratifikovaného testu „Log rank test“ Posouzeno BICR pomocí RECIST 1.1 Všechny odpovědi byly částečné Podle pacientů s nejlepší celkovou odpovědí jako potvrzenou dokončenou nebo částečnou odpovědí

P03928CZ_03/SK00621-2/2016.11 p. 8/14

Celkové přežití (%)

Obrázek 1: Kaplan-Meierova křivka pro celkové přežití podle léčebného ramene (TPS  1 % podle testu PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, populace s cílem léčit)

Docetaxel 75 mg/m2 Q3W MK – 3475 2 mg/kg Q3W MK – 3475 10 mg/kg Q3W

n při riziku Docetaxel 75 mg/m2 Q3W

Doba v měsících

MK – 3475 2 mg/kg Q3W MK – 3475 10 mg/kg Q3W

Byly provedeny další analýzy odolnosti pro zvážení možného vlivu chybějících údajů pacientů s pozitivním výsledkem testu PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, kteří ale mohli být negativní podle CTA. Pacienti s takovými výsledky testu jsou součástí populace PD-L1 IHC 22C3 pharmDx / se zamýšleným použitím / zamýšlenou diagnózou (ITD), byli však z klinického hodnocení vyloučeni kvůli negativním výsledkům skríningu CTA. Aby mohly být tyto chybějící údaje vzaty v úvahu, byla provedena analýza citlivosti, aby se vyjasnil hodnověrný rozsah pro míru rizika (HR) s odhadem založeným na subpopulacích PD-L1 IHC 22C3 pharmDx s TPS  1 % a TPS  50 % v rámci ITD pro ověření konzistence se zjištěným HR založeným na zařazení do CTA. Výsledky analýzy citlivosti HR ukázaly, odhady HR jsou robustní vůči jakémukoli předpokládanému oslabení účinku léčby v rámci ITD.

P03928CZ_03/SK00621-2/2016.11 p. 9/14

Neklinické hodnocení výkonnosti Analytická citlivost/specificita Analytická citlivost PD-L1 IHC 22C3 pharmDx byla testována na 127 unikátních případech vzorků FFPE nemalobuněčného karcinomu plic (NSCLC) ve stádiu I až IV za použití výrobní šarže. Hodnocení exprese PD-L1 prokázalo barvení v rozsahu 0–100 % pozitivních nádorových buněk a intenzitou barvení 0–3. Normální tkáně: V tabulce 4 je uveden souhrnný přehled imunoreaktivity myší monoklonální Anti-PD-L1, klonu 22C3 na doporučeném panelu normálních tkání. Na imunitních buňkách a buňkách epiteliálního původu bylo pozorováno zbarvení plazmatické membrány. Na některých typech buněk bylo pozorováno cytoplazmatické zbarvení, ale nebylo zaznamenáno jako pozitivní zbarvení. Všechny tkáně byly fixovány formalinem a zality v parafínu a obarveny PD-L1 IHC 22C3 pharmDx podle pokynů na příbalovém letáku. Na testovaných typech buněk nebo tkání nebyly pozorovány žádné neočekávané výsledky. Pozorované zbarvení bylo konzistentní s uvedenou literaturou pro expresi PD-L1 IHC v normálních tkáních (10, 11). Tabulka 4: Souhrn reaktivity normální tkáně v testu PD-L1 IHC 22C3 pharmDx Typ tkáně Pozitivní barvení plazmatické Pozitivní barvení cytoplazmy: Prvky (počet testovaných) membrány: Prvky tkáně tkáně Brzlík (3) 3/3 medulární epitel 0/3 Děloha (3) 0/3 0/3 Děložní hrdlo (3) 1/3 epitel 0/3 Hypofýza (3) 1/3 přední hypofýza 1/3 přední hypofýza 1/3 zadní hypofýza 1/3 zadní hypofýza Játra (3) 1/3 makrofágy 0/3 1/3 hepatocyty Jícen (3) 0/3 0/3 Kostní dřeň (3) 3/3 megakaryocyty 3/3 megakaryocyty Kůže (3) 0/3 0/3 Ledvina (3) 1/3 tubulární epitel 0/3 Malý mozek (3) 0/3 0/3 Mandle (3) 3/3 epitel krypty 0/3 2/3 germinální centrum (makrofágy) Mezoteliální buňky (2) 0/2 0/2 Mozek (3) 0/3 0/3 Nadledvina (3) 0/3 1/3 medulární buňky Nerv periferní (3) 0/3 1/3 pojivová tkáň /cévy Pankreas (3) 0/3 0/3 Plíce (3) 3/3 alveolární makrofágy 0/3 Prostata (2) 2/2 epitel 0/2 Prs (3) 0/3 0/3 Příštítná tělíska (3) 1/3 glandulární epitel 0/3 Slezina (3) 2/3 makrofágy 0/3 Slinná žláza (3) 0/3 0/3 Sval srdeční (3) 0/3 0/3 Sval, kosterní (3) 0/2 0/2 Štítná žláza (3) 0/3 0/3 Tenké střevo (3) 0/3 0/3 Tračník (3) 2/3 makrofágy 0/3 Vaječník (3) 0/3 0/3 Varlata (3) 0/3 0/3 Žaludek (3) 2/3 lymfocyty 1/3 žlázový epitel 1/3 žlázový epitel

Nespecifické barvení 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/2 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/2 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/2 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3

Neoplastické tkáně: V tabulce 5 je uveden souhrnný přehled imunoreaktivity myší monoklonální Anti-PD-L1, klonu 22C3 na panelu neoplastických tkání. Na imunitních buňkách a buňkách epiteliálního původu bylo pozorováno zbarvení plazmatické membrány. Na některých typech buněk bylo pozorováno cytoplazmatické zbarvení, ale nebylo zaznamenáno jako pozitivní zbarvení. Všechny tkáně byly fixovány formalinem a zality v parafínu a obarveny PD-L1 IHC 22C3 pharmDx podle pokynů na příbalovém letáku. Na testovaných vzorcích tumoru nebyly pozorovány žádné neočekávané výsledky. Pozorované zbarvení bylo konzistentní s uvedenou literaturou pro expresi PD-L1 IHC v neoplastických tkáních (10-13). Tabulka 5: Souhrn reaktivity neoplastické tkáně v testu PD-L1 IHC 22C3 pharmDx Typ tumoru

Adenokarcinom

Místo Děloha, endometrium Děloha, z jasných buněk Děložní čípek, endocervikální typ GI, metastázující do plic Hlava a krk, tvrdé patro Jícen Konečník Plíce Prostata Prs, DCIS Prs, invazivní duktální Prs, invazivní duktální metastázující do lymfatické uzliny Příloha Slinivka břišní Slinivka břišní, duktální Slinné/příušní žlázy

PD-L1 pozitivní/celkem N=159 0/3 0/1 0/1 0/1 0/1 0/1 0/4 1/4 0/5 0/2 0/7 0/1 0/1 0/2 0/3 0/2 P03928CZ_03/SK00621-2/2016.11 p. 10/14

Typ tumoru

Adrenokortikální karcinom Astrocytom Embryonální karcinom Ependymom Feochromocytom Glioblastom Hepatoblastom Hepatocelulární karcinom Chondrosarkom Chordom Intersticiální karcinom Karcinom Karcinom bazálních buněk Karcinom ledviny Papilární Z jasných buněk Karcinom z buněk tvaru pečetního prstenu Karcinom z přechodných buněk Leiomyosarkom Lymfom Anaplastický velkobuněčný Difuzní B-buněk Hodgkin Non-Hodgkin Malobuněčný karcinom Medulární karcinom Meduloblastom Melanom Meningiom Mesotheliom Neuroblastom Neurofibrom Osteosarkom Primitivní neuroektodermální tumor (PNET) Rhabdomyosarkom

Seminom Spermatocytom

Spinocelulární karcinom

Synoviální sarkom Thymom Tumor z ostrůvkových buněk

Místo Štítná žláza, folikulární Štítná žláza, folikulární-papilární Štítná žláza, papilární Tenké střevo Tlusté střevo, metastázující do jater Tlusté střevo, mucinózní Tračník Vaječník Vaječník, endometrioid Vaječník, mucinózní Vaječník, sérový Žaludek Žaludek, mucinózní Žlučník Nadledvinka Přední mozek Varle Mozek Nadledvinka Mozek Játra Játra Kost Pánevní dno Konečník Tenké střevo Tračník Nosohltan, NPC Kůže

PD-L1 pozitivní/celkem N=159 0/1 0/1 0/3 0/2 0/1 0/1 0/5 0/1 0/1 0/1 0/1 0/6 0/1 1/5 0/1 0/3 0/1 0/1 0/1 0/1 0/1 0/5 0/1 0/1 0/1 0/1 0/1 0/1 0/1

Ledvina Ledvina Metastázující karcinom tlustého střeva z buněk tvaru pečetního prstenu do vaječníku Tračník Ledvina Močový měchýř Měkká tkáň, hrudní stěna Močový měchýř

0/1 0/6

Lymfatické uzliny Lymfatické uzliny Lymfatické uzliny Lymfatické uzliny Plíce Štítná žláza Mozek Konečník Nosní dutina Mozek Peritoneum Retroperitoneum Měkká tkáň, bedra Kost Retroperitoneum Měkká tkáň, embryonální Prostata Retroperitoneum Varle Varle Děloha Děložní čípek Hlava a krk Jícen Kůže Metastatický esofageální spinocelulární karcinom do lymfatických uzlin Plíce Pánevní dno Mediastinum Slinivka břišní

0/1 0/4 2/2 1/1 0/1 0/1 0/1 0/1 0/1 0/2 0/1 0/1 0/1 0/2 0/1 0/1 0/1 0/1 0/2 0/2 0/1 2/5 0/2 0/7 0/2

0/1 0/1 0/1 0/6 0/1 0/1

0/1 1/2 0/1 1/1 0/1

P03928CZ_03/SK00621-2/2016.11 p. 11/14

Opakovatelnost / externí reprodukovatelnost Opakovatelnost/externí reprodukovatelnost testu PD-L1 IHC 22C3 pharmDx byla hodnocena ve společnosti Dako a na třech externích testovacích pracovištích. Výkonové parametry jsou uvedeny v tabulkách 6 až 9. Ve studiích opakovatelnosti provedených ve společnosti Dako byla stanovena negativní procentuální shoda (NPA), pozitivní procentuální shoda (PPA) a celková shoda (OA) pro mez ≥ 1 % a mez ≥ 50 %, jak je uvedeno v tabulkách 6 a 7. Vzhledem k tomu, že studie opakovatelnosti vedly ke 100 % shodě, byly intervaly spolehlivosti vypočítány za použití Wilsonova skóre testu, na základě počtu nezávislých párových srovnání. U externích studií reprodukovatelnosti byly průměrná procentuální shoda (NPA), průměrná pozitivní procentuální shoda (PPA) a celková procentuální shoda (OA) stanoveny pro mez ≥ 1 % a mez ≥ 50 %, jak je uvedeno níže v tabulkách 8 a 9. Průměrné shody byly vypočteny, protože v parametrech reprodukovatelnosti neexistuje žádný přirozený údaj, jako je místo a pozorovatel. Intervaly spolehlivosti pro průměrné shody byly vypočteny za použití percentilové metody bootstrap. (Všimněte si, že studie opakovatelnosti nebyly analyzovány pomocí intervalů spolehlivosti bootstrap, protože tyto intervaly nelze vypočítat z údajů s nulovým počtem diskordancí.) Tabulka 6: Opakovatelnost testu PD-L1 IHC 22C3 pharmDx testovaném na jednom pracovišti (≥1 %) Studie opakovatelnosti

Diagnostická mez

Plán studie Každý ze 16 vzorků NSCLC (8 PD-L1-negativních a 8 PD-L1-pozitivních) s různou IHC expresí PD-L1 byl testován na každém ze šesti přístrojů Autostainer Link 48. Mezi analytiky ≥1 % Každý ze 16 vzorků NSCLC (8 PD-L1-negativních a 8 PD-L1-pozitivních) s různou IHC expresí PD-L1 byl testován šesti analytiky na jednom přístroji Autostainer Link 48. Mezi dny ≥1 % Každý ze 16 vzorků NSCLC (8 PD-L1-negativních a 8 PD-L1-pozitivních) s různou IHC expresí PD-L1 byl testován šest dní za sebou na přístroji Autostainer Link 48. Mezi šaržemi ≥1 % Každý ze 16 vzorků NSCLC (8 PD-L1-negativních a 8 PD-L1-pozitivních) s různou IHC expresí PD-L1 byl testován ve třech opakováních a s každou ze tří šarží činidla na přístroji Autostainer Link 48. Mezi sériemi ≥1 % Každý ze 16 vzorků NSCLC (8 PD-L1-negativních a 8 PD-L1-pozitivních) s různou IHC expresí PD-L1 byl testován v šesti opakováních v jedné sérii na přístroji Autostainer Link 48. V jeden den ≥1 % Každý ze 16 vzorků NSCLC (8PD-L1-negativních a 8 PD-L1-pozitivních) s různou IHC expresí PD-L1 byl testován ve dvou sériích v jeden den, s opakováním v průběhu tří dní na přístroji Autostainer Link 48. NPA= Negativní procentuální shoda; PPA= Pozitivní procentuální shoda; OA=Celková shoda Mezi přístroji

≥1 %

% shoda (95% CI) NPA 100 % (91,2–100 %) PPA 100 % (91,2–100 %) OA 100 % (95,4-100 %) NPA 100 % (91,0–100 %) PPA 100 % (91,2–100 %) OA 100 % (95,4-100 %) NPA 100 % (91,2–100 %) PPA 100 % (91,2–100 %) OA 100 % (95,4-100 %) NPA 98,6% (96,0–100 %) PPA 98,6% (95,7–100 %) OA 98,6% (95,8-100 %) NPA 100 % (91,2–100 %) PPA 100 % (91,2–100 %) OA 100 % (95,4-100 %) NPA 100 % (91,0–100 %) PPA 100 % (91,2–100 %) OA 100 % (95,4-100 %)

Tabulka 7: Opakovatelnost testu PD-L1 IHC 22C3 pharmDx testovaném na jednom pracovišti (≥50 %) Studie opakovatelnosti

Diagnostická mez

Plán studie Každý ze 16 vzorků NSCLC (10 PD-L1-negativních a 6 PD-L1-pozitivních) s různou IHC expresí PD-L1 byl testován na každém ze šesti přístrojů Autostainer Link 48. Mezi analytiky ≥50 % Každý ze 16 vzorků NSCLC (10 PD-L1-negativních a 6 PD-L1-pozitivních) s různou IHC expresí PD-L1 byl testován šesti analytiky na jednom přístroji Autostainer Link 48. Mezi dny ≥50 % Každý ze 16 vzorků NSCLC (10 PD-L1-negativních a 6 PD-L1-pozitivních) s různou IHC expresí PD-L1 byl testován šest dní za sebou na přístroji Autostainer Link 48. Mezi šaržemi ≥50 % Každý ze 16 vzorků NSCLC (8 PD-L1-negativních a 8 PD-L1-pozitivních) s různou IHC expresí PDL1 byl testován ve třech opakováních a s každou ze tří šarží činidla na přístroji Autostainer Link 48. Mezi sériemi ≥50 % Každý ze 16 vzorků NSCLC (10 PD-L1-negativních a 6 PD-L1-pozitivních) s různou IHC expresí PD-L1 byl testován v šesti opakováních v jedné sérii na přístroji Autostainer Link 48. V jeden den ≥50 % Každý ze 16 vzorků NSCLC (10 PD-L1-negativních a 6 PD-L1-pozitivních) s různou IHC expresí PD-L1 byl testován ve dvou sériích v jeden den, s opakováním v průběhu tří dní na přístroji Autostainer Link 48. NPA= Negativní procentuální shoda; PPA= Pozitivní procentuální shoda; OA=Celková shoda Mezi přístroji

≥50 %

% shoda (95% CI) NPA 100 % (92,9–100 %) PPA 100 % (88,6–100 %) OA 100 % (95,4-100 %) NPA 100 % (92,7–100 %) PPA 100 % (88,6–100 %) OA 100 % (95,4-100 %) NPA 100 % (92,9–100 %) PPA 100 % (88,6–100 %) OA 100 % (95,4-100 %) NPA 100 % (92,6–100 %) PPA 100 % (92,6–100 %) OA 100 % (96,2-100 %) NPA 100 % (92,9–100 %) PPA 100 % (88,6–100 %) OA 100 % (95,4-100 %) NPA 100 % (88,3–100 %) PPA 100 % (82,4–100 %) OA 100 % (92,4-100 %)

P03928CZ_03/SK00621-2/2016.11 p. 12/14

Tabulka 8: Reprodukovatelnost testu PD-L1 IHC 22C3 pharmDx testovaném na třech externích pracovištích (≥1 %) Studie Diagnostická mez reprodukovatelnosti Plán studie % shoda (95% CI) Mezi pracovišti ≥1 % Každý ze 36 vzorků NSCLC (16 PD-L1-negativních ANA 94,8% (90,3-98,4%) a 20 PD-L1-positivních) s různou IHC expresí PD-L1 APA 95,5% (91,2-98,7%) byl testován po pět ne po sobě jdoucích dní. Analýza OA 95,2% (90,8-98,6%) mezi pracovišti byla provedena mezi třemi pracovišti a spočívala v párovém srovnání 2 700 hodnot. Na pracovišti ≥1 % Každý ze 36 vzorků NSCLC (16 PD-L1-negativních ANA 96,2% (94,1-97,5%) a 20 PD-L1-pozitivních) s různou IHC expresí PD-L1 APA 96,7% (95,0-97,9%) byl testován po pět NE po sobě jdoucích dní na OA 96,5% (95,2-97,4%) každém ze tří studijních pracovišť. Analýza na pracovišti byla provedena u tří pracovišť a spočívala v párovém srovnání 1 080 hodnot. Mezi pozorovateli ≥1 % Každý ze 62 vzorků NSCLC (28 PD-L1-negativních ANA 85,8% (79,3-91,8%) a 34 PD-L1-positivních) s různou IHC expresí APA 88,2% (82,2-93,3%) PD-L1, barvený PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, byl OA 87,1% (81,0-92,6%) zpracován třemi patology, po jednom na každém ze tří studijních pracovišť, po tři NE po sobě jdoucí dny. Analýza mezi pozorovateli byla provedena mezi třemi pracovišti a spočívala v párovém srovnání 1 674 hodnot. Podle pozorovatele ≥1 % Každý ze 62 vzorků NSCLC (28 PD-L1-negativních a ANA 93,7% (90,0-96,1%) 34 PD-L1-positivních) s různou IHC expresí PD-L1, APA 94,8% (91,6-96,7%) barvený PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, byl zpracován OA 94,3% (92,0-95,9%) třemi patology, po jednom na každém ze tří studijních pracovišť, po tři NE po sobě jdoucí dny. Analýza podle pozorovatele byla provedena u tří pracovišť a spočívala v párovém srovnání 558 hodnot. ANA=Průměrná negativní shoda; APA=Průměrná pozitivní shoda; OA=Celková shoda Tabulka 9: Reprodukovatelnost testu PD-L1 IHC 22C3 pharmDx testovaném na třech externích pracovištích (≥50 %) Studie Diagnostická mez reprodukovatelnosti Plán studie % shoda (95% CI) Mezi pracovišti ≥50 % Každý ze 36 vzorků NSCLC (21 PD-L1-negativních a ANA 90,3 % (84,4–95,2 %) 15 PD-L1-positivních) s různou IHC expresí PD-L1 byl APA 85,2 % (75,6–92,9 %) testován po pět NE po sobě jdoucích dní. Analýza OA 88,3% (81,4-94,3%) mezi pracovišti byla provedena mezi třemi pracovišti a spočívala v párovém srovnání 2 700 hodnot. Na pracovišti ≥50 % Každý ze 36 vzorků NSCLC (21 PD-L1-negativních a 15 PD-L1-positivních) s různou IHC expresí PD-L1 byl ANA 91,9% (88,8-94,8%) testován po pět NE po sobě jdoucích dní na každém APA 87,6% (82,5-92,2%) ze tří studijních pracovišť. Analýza na pracovišti byla OA 90,2% (86,3-93,7%) provedena u tří pracovišť a spočívala v párovém srovnání 1 080 hodnot. Mezi pozorovateli ≥50 % Každý ze 62 vzorků NSCLC (30 PD-L1-negativních a ANA 92,6% (87,8-96,7%) 32 PD-L1-positivních) s různou IHC expresí PD-L1, APA 92,8% (88,1-96,8%) barvený PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, byl zpracován OA 92,7% (88,1-96,8%) třemi patology, po jednom na každém ze tří studijních pracovišť, po tři NE po sobě jdoucí dny. Analýza mezi pozorovateli byla provedena mezi třemi pracovišti a spočívala v párovém srovnání 1 674 hodnot. Podle pozorovatele ≥50 % Každý ze 62 vzorků NSCLC (30 PD-L1-negativních a ANA 96,4% (94,0-98,5%) 32 PD-L1-positivních) s různou IHC expresí PD-L1, APA 96,5% (94,3-98,6%) barvený PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, byl zpracován OA 96,4% (94,3-98,6%) třemi patology, po jednom na každém ze tří studijních pracovišť, po tři NE po sobě jdoucí dny. Analýza podle pozorovatele byla provedena u tří pracovišť a spočívala v párovém srovnání 558 hodnot. ANA=Průměrná negativní shoda; APA=Průměrná pozitivní shoda; OA=Celková shoda Řešení problémů Tabulka 10: Řešení problémů Problém 1. Sklíčka se nebarví

Příčina problému 1a. Programová chyba. 1b. Nedostatečná reakce s roztokem DAB+ Substrate-Chromogen Solution (DAB) 1c. Azid sodný v promývacím pufru. 1d. Degradace kontrolního sklíčka

2a. Slabé barvení sklíček se vzorky. 2b. Slabé barvení sklíček se vzorky nebo pozitivních linií buněk na kontrolním sklíčku od společnosti Dako.

2a. Byla použita nevhodná metoda fixace. 2b. Nedostatečné vyhledání cíle.

Doporučené řešení 1a. Ověřte, že pro programování sklíček byl použit program PD-L1 IHC 22C3 pharmDx. 1b. Ověřte, že roztok DAB+ Substrate-Chromogen Solution byl správně připraven. 1c. Použijte pouze pufr Dako Wash Buffer (kód K8007). 1d. Na vnějším obalu překontrolujte datum exspirace a podmínky uchovávání soupravy. 2a. Překontrolujte, že byla použita pouze správná fixativa a fixační metody. 2b. Ověřte, že postup 3 v 1 před ošetřením byl proveden správně. P03928CZ_03/SK00621-2/2016.11 p. 13/14

3. Nadměrně zbarvené pozadí sklíček

3a. Parafín odstraněn pouze částečně. 3b. Sklíčka oschla během vkládání do přístroje Autostainer Link 48. 3c. Nespecifické vazby činidel k řezu tkáně. 4. Použití nesprávných mikroskopických sklíček.

4. Tkáň je oddělená od sklíček. 5. Nadměrně silné specifické barvení.

3a. Ověřte, že postup 3 v 1 před ošetřením byl proveden správně. 3b. Pomocí pufru zajistěte, aby sklíčka zůstala vlhká během vkládání a před spuštěním série. 3c. Překontrolujte správnou fixaci vzorku a/nebo přítomnost nekrózy. 4. Použijte mikroskopická sklíčka Dako FLEX IHC Microscope Slides (kód K8020), nebo nabitá sklíčka (jako např. Fisherbrand Superfrost Plus). 5a. Překontrolujte, že byla použita pouze správná fixativa a fixační metody. 5b. Použijte pouze pufr Dako Wash Buffer (kód K8007). 6. Toto je normální a nemá to vliv na barvení.

5a. Byla použita nevhodná metoda fixace. 5b. Byl použit nesprávný promývací pufr. 6. Roztok Target Retrieval Solution je 6. Po zahřátí se roztok Target Retrieval po zahřátí zakalený. Solution zakalí. POZNÁMKA: V případě, že problém nelze připsat žádné z výše uvedených příčin, nebo pokud doporučené nápravné opatření nevyřeší problém, zavolejte technickou podporu společnosti Dako a požádejte o další pomoc. Další informace týkající se technik barvení a přípravy vzorků lze nalézt v příručce pro vzdělávání Dako: Immunohistochemical Staining Methods (5) (k dispozici ve společnosti Dako). Literatura 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13.

Keytruda® package insert. R. Phelps, et al., Journal of Cellular Biochemistry Supplement (1996) 24:32-91. Department of Health, Education and Welfare, National Institutes for Occupational Safety and Health, Rockville, MD. “Procedures for the decontamination of plumbing systems containing copper and/or lead azides.” DHHS (NIOSH) Publ. No. 78-127, Current 13. August 16, 1976. Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Protection of Laboratory Workers From Occupationally Acquired Infections; Approved Guideline – Third Edition. CLSI document M29-A3 [ISBN 1-56238-567-4]. Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087 – 1898 USA, 2000. Taylor CR and Rudbeck L. Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods. Sixth Edition. Dako, Carpinteria, California; 2013. Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCCLS). Quality assurance for Immunocytochemistry; Approved guideline. CLSI document MM4-A (1-56238-396-5) CLSI, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA; 1999. Omata M, Liew C-T, Ashcavai M, Peters RL. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B s surface antigen: a possible source of error in immunohistochemistry. Am J Clin Path 1980; 73:626. Garon EB, Rizvi NA, Hui R, Leighl N, Balmanoukian AS, Eder JP, et al. Pembrolizumab for the treatment of non-small-cell lung cancer. New Eng J Med 2015; 372:2018-28. Herbst RS, et al. Pembrolizumab versus docetaxel for previously treated, PD-L1-positive, advanced non-small-cell lung cancer (KEYNOTE-010): a randomised controlled trial. The Lancet online 2015 Dec 19. Okazaki T, Honjo T. PD-1 and PD-1 ligands: from discovery to clinical application. International Immunol 2007(19); 7:813. Brown JA, Dorfman DM, Ma F-R, Sullivan EL, Munoz O, Wood CR, et al. Blockade of Programmed Death-1 Ligands on Dendritic Cells Enhances T Cell Activation and Cytokine Production. J Immunol 2003; 170:1257. Cooper WA, Tran T, Vilain RE, Madore J, Seliger CI, Kohonen-Cornish M, et al. PD-L1 expression is a favorable prognostic factor in early stage non-small cell carcinoma. Lung Cancer 2015; 89:181. Chen B, Chapuy B, Ouyang J et al. PD-L1 Expression Is Characteristic of a Subset of Aggressive B-cell Lymphomas and VirusAssociated Malignancies. Clin Cancer Res 2013; 19:3462-3473.

Teplotní rozmezi od do

Vydání 11/16

P03928CZ_03/SK00621-2/2016.11 p. 14/14