A PD-L1 IHC 22C3 pharmdx teszt olyan NSCLC-ben szenvedő páciensek azonosítására javallott, akik KEYTRUDA (pembrolizumab) kezelésben részesülhetnek

PD-L1 IHC 22C3 pharmDx SK006 50 teszt az Autostainer Link 48 készülékkel való használatra Javasolt alkalmazás In vitro diagnosztikai használatra. A PD-L1 IHC 22C3 pharmDx egy kvalitatív immunhisztokémiai teszt, amely a Monoclonal Mouse Anti-PD-L1, Clone 22C3 monoklonális egér antitestet, az EnVision FLEX megjelenítő rendszert és az Autostainer Link 48 készüléket használja a PD-L1 protein kimutatására formalinban fixált, paraffinba ágyazott (FFPE) nem kissejtes tüdőrák (NSCLC) szövetben. A PD-L1 protein expressziója a tumorhányad pontszám (Tumor Proportion Score, TPS), tehát a részleges vagy teljes membránfestődést mutató, életképes tumorsejtek százalékos értéke segítségével határozható meg. A PD-L1 IHC 22C3 pharmDx teszt olyan NSCLC-ben szenvedő páciensek azonosítására javallott, akik KEYTRUDA® (pembrolizumab) kezelésben részesülhetnek. Összegzés és magyarázat A PD-1 ligandumok (PD-L1 és PD-L2) a T-sejteken található PD-1 receptorhoz kötődve gátolják a T-sejtek proliferációját és citokintermelését. Egyes tumorokban upregulálódnak a PD-1 ligandumok, és az ezen az útvonalon történő jelátvitel hozzájárulhat a tumorok T-sejtek által végzett aktív immunfelügyeletének (surveillance) gátlásához. A KEYTRUDA egy humanizált monoklonális antitest, amely a PD-1 receptorhoz kötődve gátolja a receptor és a PD-L1 és PD-L2 ligandum közötti kölcsönhatást, és ezáltal feloldja az immunválasz PD-1 útvonal által mediált gátlását, beleértve a tumorellenes immunválaszt. Szingén egértumor modellekben a PD-1 aktivitás gátlása csökkent tumornövekedést eredményezett (1). Az eljárás elve A PD-L1 IHC 22C3 pharmDx az FFPE minták Autostainer Link 48 készüléken végzett IHC festési eljárásához optimalizált reagenseket és protokollt tartalmazza. Az elsődleges monoklonális PD-L1 antitesttel vagy a negatív kontroll reagenssel (NCR) végzett inkubálást követően a mintákat az elsődleges antitestet termelő fajra specifikus linker antitesttel, majd végül dextrán polimer vázhoz kötött másodlagos antitest molekulákból és torma-peroxidáz molekulákból álló, használatra kész megjelenítő reagenssel kell inkubálni. A következő lépésben hozzáadott kromogén enzimatikus konverziója látható reakciótermék kicsapódását eredményezi az antigén helyén. A kromogén erősítő reagens módosítja a kromogén reakció színét. Ezt követően elvégezhető a minta kontrasztfestése, majd a fedőlemez felhelyezése. Az eredményeket fénymikroszkóp segítségével kell értelmezni. Mellékelt anyagok Készletenként 19,5 ml PD-L1 elsődleges antitestet (hozzávetőlegesen 3 µg/ml proteinkoncentráció) tartalmaz, és a reagensek legfeljebb 15 különálló futtatás 50 tesztjéhez elegendők. Az alább felsorolt anyagok 50 teszt elvégzésére elegendők (50 metszetet a PD-L1 elleni elsődleges antitesttel kell inkubálni, 50 metszetet pedig a negatív kontroll reagenssel, ez összesen 100 metszet). A tesztek száma azon alapul, hogy minden reagensből 2 x 150 µl-t kell használni metszetenként, kivéve a DAB+ és a Target Retrieval Solution (antigénfeltáró oldat) reagenst. A készlet legfeljebb 15 különálló futtatáshoz elegendő anyagot tartalmaz. Mennyiség 1 x 34,5 ml

Leírás Peroxidase-Blocking Reagent

PEROXIDASE-BLOCKING REAGENT Hidrogén-peroxidot, felületaktív anyagot (detergens) és 0,015 mol/l nátrium–azidot tartalmazó pufferelt oldat. 1 x 19,5 ml

Elsődleges antitest Monoclonal Mouse Anti-PD-L1, Clone 22C3

MONOCLONAL MOUSE ANTI-PD-L1 CLONE 22C3 Monoklonális egér (IgG1) PD-L1 antitest, stabilizáló proteint és 0,015 mol/l nátrium–azidot tartalmazó pufferelt oldatban. 1 x 15 ml

Negative Control Reagent

NEGATIVE CONTROL REAGENT Monoklonális egér kontroll IgG antitest, stabilizáló proteint és 0,015 mol/l nátrium–azidot tartalmazó pufferelt oldatban. 1 x 34,5 ml

Mouse LINKER

LINKER, ANTI-MOUSE Egér immunglobulinok elleni másodlagos nyúl antitest, stabilizáló proteint és 0,015 mol/l nátrium–azidot tartalmazó pufferelt oldatban. 1 x 34,5 ml

Visualization Reagent-HRP

VISUALIZATION REAGENT-HRP Dextránhoz kötött peroxidáz molekulák és nyúl és egér immunglobulinok elleni kecske másodlagos antitest molekulák, stabilizáló proteint és antimikróbás szert tartalmazó pufferelt oldatban. P03928HU_03/SK00621-2/2016.11 p. 1/14

15 x 7,2 ml

DAB+ Substrate Buffer

DAB+ SUBSTRATE BUFFER Pufferelt oldat hidrogén-peroxiddal és antimikróbás szerrel. 1 x 5 ml

DAB+ Chromogen

DAB+ CHROMOGEN 3,3’-diaminobenzidin-tetrahidroklorid szerves oldószerben. 1 x 34,5 ml

DAB Enhancer

DAB ENHANCER Réz-szulfát vízben. 6 x 30 ml

EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low pH, 50x

EnVision™ FLEX TARGET RETRIEVAL SOLUTION LOW pH (50X) Pufferelt oldat, pH 6,1, felületaktív anyaggal és antimikróbás szerrel. 15 lemez

PD-L1 IHC 22C3 pharmDx Control Slides

CONTROL SLIDES

XXXXX

PD-L1 IHC 22C3 pharmDx

Lemezenként két sejtvonal lecentrifugált pelletéből készített, formalinban fixált, paraffinba ágyazott metszet: az NCI-H226* sejtvonal közepes mértékű PD-L1 protein expressziót mutat, míg az MCF-7 sejtvonal nem expresszálja a PD-L1 proteint.

MCF-7: PD-L1 negatív NCI-H226: PD-L1 pozitív

* Ezúton szeretnénk elismerni Dr. AF Gazdar és Dr. JD Minna (NIH) hozzájárulását az NCI-H226 (ATCC Number: CRL-5826™) sejtvonal kifejlesztéséhez (2). Megjegyzés: A reagensek kifejezetten a készlettel való használatra készültek. A teszt leírt teljesítményének megőrzése érdekében tilos bármiféle helyettesítést végezni, kivéve az EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low pH, 50x (kód: K8005) reagenst. A PD-L1IHC 22C3 pharmDx készlet az Autostainer Link 48 készülékkel való használatra lett kialakítva. Ha további információra van szüksége, lásd az Autostainer Link 48 és a PT Link felhasználói útmutatóját. Szükséges, de nem biztosított anyagok PT Link Pre-treatment Module (kód: PT100/PT101) (előkezelő modul) Autostainer Link 48 készülék (kód: AS480) EnVision FLEX Wash Buffer, 20x (kód: K8007) (mosópuffer) Hematoxylin (kód: K8008) Desztillált vagy ionmentes víz (reagens minőségű víz) Stopperóra Pozitív és negatív szövetek a folyamatok ellenőrzéséhez (lásd a Minőség-ellenőrzés című részt) Mikroszkópos tárgylemezek: Dako FLEX IHC Microscope Slides (kód: K8020) tárgylemezek vagy Fisherbrand Superfrost Plus pozitív töltésű tárgylemezek Fedőlemezek Tartós rögzítő közeg és segédreagensek a fedőlemezek rögzítéséhez Fénymikroszkóp (4–40x optikai nagyítás) Óvintézkedések 1. In vitro diagnosztikai használatra. 2. Foglalkozásszerű felhasználóknak. 3. A termék nátrium-azidot (NaN3) tartalmaz, amely tiszta formában nagyon mérgező vegyület. A termékben alkalmazott koncentrációkban, bár nem sorolható be veszélyes anyagként, a NaN3 reakcióba léphet az ólomból vagy rézből készült vízvezetékekkel, és erősen robbanékony fém-azidok felhalmozódásához vezethet. Kiöntéskor, a fém-azidok felhalmozódását megelőzendő, nagy mennyiségű vízzel kell leöblíteni (3). 4. Az elsődleges antitest, a negatív kontroll reagens, a linker és a megjelenítő reagens állati eredetű anyagot tartalmaz. 5. A fixálás előtt és után lévő mintákat, és a velük érintkező anyagokat potenciális fertőzéshordozóként kell kezelni, és a megfelelő óvintézkedéseket alkalmazva kell ártalmatlanítani (4). 6. A megadottól eltérő inkubálási idők, hőmérsékletek vagy módszerek hibás eredményeket adhatnak. 7. A reagensek optimális koncentrációra vannak hígítva. További hígítás az antigénfestődés elvesztését eredményezheti. 8. A megjelenítő reagens, a folyékony DAB+ kromogén és az elkészített DAB+ szubsztrát-kromogén oldat károsodhat, ha túlzottan erős fény éri. Ne tárolja a rendszer komponenseit és ne végezze a festést erős fényben, például közvetlen napfényben. 9. A paraffinmaradványok álnegatív eredményeket okozhatnak. 10. A javasolttól eltérő reagenstérfogatok használata a látható PD-L1 immunreaktivitás elvesztését okozhatja. 11. Egy kisebb vizsgálat eredményei szerint a PD-L1 expresszió dinamikus tartománya hasonló volt a párosított elsődleges és metasztatikus NSCLC mintákban. Eltérések lehetnek ugyanazon páciens elsődleges daganatainak és áttéteinek PD-L1 expressziója között. P03928HU_03/SK00621-2/2016.11 p. 2/14

12. A nagyméretű szövetmetszetek esetében elfordulhat, hogy 3 x 150 µl reagensre lesz szükség. 13. Általános szabály, hogy 18 év alatti személyek nem dolgozhatnak ezzel a termékkel. A felhasználót alaposan ki kell képezni a helyes munkavégzési eljárást, a termék veszélyes tulajdonságait és a szükséges biztonsági intézkedéseket illetően. További információért tájékozódjon a biztonsági adatlapról (Safety Data Sheet, SDS). 14. A szemmel és bőrrel való érintkezés elkerülésére viseljen megfelelő személyi védőfelszerelést. 15. A fel nem használt oldatokat a helyi, regionális és országos szabályozásnak megfelelően kell megsemmisíteni. 16. Foglalkozásszerű felhasználók részére igény esetén anyagbiztonsági adatlapot biztosítunk.

Veszély DAB+ kromogén: 1–5% bifenil-3,3’,4,4’-tetrailtetraammónium-tetraklorid H350 Rákot okozhat. H341 Feltehetően genetikai károsodást okoz. P201 Használat előtt ismerje meg az anyagra vonatkozó különleges utasításokat. P202 Ne használja addig, amíg az összes biztonsági óvintézkedést el nem olvasta és meg nem értette. P280 Védőkesztyű használata kötelező. Szemvédő vagy arcvédő használata kötelező. Védőruha használata kötelező. P308 + P313 Expozíció vagy annak gyanúja esetén: Orvosi ellátást kell kérni. P405 Elzárva tárolandó. P501 A tartalom és az edényzet hulladékként történő elhelyezését a helyi, regionális, országos és nemzetközi szabályozásokkal összhangban kell elvégezni.

Figyelmeztetés EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low pH (50x): 1-5% citromsav H319 Súlyos szemirritációt okoz. H411 Mérgező a vízi élővilágra, hosszan tartó károsodást okoz. P280 Szemvédő vagy arcvédő használata kötelező. P273 Kerülni kell az anyag környezetbe jutását. P264 A használatot követően a kezet alaposan meg kell mosni. P305 + P351 + SZEMBE KERÜLÉS ESETÉN: Több percig tartó óvatos öblítés vízzel. Adott esetben a kontaktlencsék P338 eltávolítása, ha könnyen megoldható. Az öblítés folytatása. P337 + P313 Ha a szemirritáció nem múlik el: Orvosi ellátást kell kérni. P501 A tartalom és az edényzet hulladékként történő elhelyezését a helyi, regionális, országos és nemzetközi szabályozásokkal összhangban kell elvégezni. Tárolás A PD-L1 IHC 22C3 pharmDx összetevőit, beleértve a kontroll lemezeket, sötét helyen, 2–8 °C hőmérsékleten kell tárolni, amikor nincsenek használatban az Autostainer Link 48 készülékben. Ne használja a készletet a dobozon feltüntetett lejárati időn túl. Ha a reagenseket a jelen tájékoztatóban leírtaktól eltérő feltételek között tárolják, akkor a felhasználó köteles a feltételeket validálni. Nincsen nyilvánvaló jel, amely a termék instabilitására utalna, ezért a páciens mintáival egyidejűleg egy pozitív és egy negatív kontroll vizsgálatát is el kell végezni. Minták előkészítése A mintákat úgy kell kezelni, hogy a szövet alkalmas maradjon IHC festésre. A mintákat a szabványos szövetfeldolgozási módszerekkel kell feldolgozni. Paraffinba ágyazott metszetek Formalinban fixált, paraffinba ágyazott szövetek használhatók. Egyéb fixálószereket nem validáltunk, így azok hibás eredményeket adhatnak. 10% semleges pufferelt formalin (NBF) és 12–72 órás fixálási idő javasolt, de egy korlátozott számú mintán végzett vizsgálat azt mutatta, hogy 10% NBF és 4–168 órás fixálási idő használata nem változtatta meg szisztematikusan a PD-L1 kimutatását. A 3 órás vagy rövidebb fixálási idő bizonytalan PD-L1 kimutatást eredményezhet. A mintákból készített 3 vagy 4 mm vastagságú blokkot formalinnal kell fixálni, alkoholsorral vízteleníteni és xilollal mosni, majd végül olvasztott paraffinnal átitatni. A paraffin hőmérséklete ne haladja meg a 60 °C-ot. Az 5 éves vagy régebbi FFPE szövetblokkok PD-L1 immunreaktivitása nem garantált. A szövetmintákat 4-5 µm-es metszetekre kell vágni. Metszetkészítés után a szöveteket Fisherbrand Superfrost Plus tárgylemezekre vagy Dako FLEX IHC mikroszkópos tárgylemezekre (kód: K8020) kell rögzíteni, majd 1 órán át 58 ± 2 °C-os sütőben inkubálni. Az antigenitás megőrzése érdekében a tárgylemezre rögzített szövetmetszeteket sötét helyen, (lehetőség szerint) 2–8 °C-on, vagy legfeljebb 25 °C-os szobahőmérsékleten kell tárolni, és a metszéstől számított 6 hónapon belül meg kell festeni. A szövetek épségének és antigenitásának megőrzése érdekében a rögzítést követően tilos a tárgylemezeket 25 °C-ot meghaladó hőmérsékleten tárolni vagy kezelni. A PD-L1 IHC 22C3 pharmDx készlet kalciummentesített szöveteken történő használatát nem validáltuk, ezért nem ajánlott. A reagens előkészítése A festés előtt a következő reagenseket kell elkészíteni: EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low pH, 50x Készítsen megfelelő mennyiségű 1x Target Retrieval Solution, Low pH reagenst a Target Retrieval Solution, Low pH, 50x reagens 1:50 arányú hígításával. Használjon desztillált vagy ionmentes (reagens minőségű) vizet. Az 1x Target Retrieval Solution előírt pH értéke: 6,1 ± 0,2. Amennyiben az 1x Target Retrieval Solution pH értéke nem éri el az 5,9-et, az hibás eredményekhez vezethet. A Target Retrieval Solution, Low pH, 50x, reagens egy darab 30 ml-es palackjának tartalmát 1:50 hígítva 1,5 l 1x reagens áll rendelkezésre, amelyet a PT Link tartályba töltve egy alkalommal legfeljebb 24 tárgylemez kezeléséhez elegendő. Az 1x Target Retrieval Solution reagenst három használat, illetve a hígítást követő 5. nap után meg kell semmisíteni.

P03928HU_03/SK00621-2/2016.11 p. 3/14

Szükség szerint további EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low pH, 50x rendelhető a K8005 kódszámot használva. EnVision FLEX Wash Buffer, 20x Készítsen elő megfelelő mennyiségű Wash Buffer reagenst a Wash Buffer 20x reagens 1:20 arányú hígításával. Használjon desztillált vagy ionmentes (reagens minőségű) vizet. A fel nem használt oldatot 2–8 ºC-on legfeljebb egy hónapig lehet tárolni. Ha zavaros a puffer, semmisítse meg. További információkért tekintse meg az Autostainer Link 48 használati útmutatóját. Az EnVision FLEX Wash Buffer, 20x reagens a K8007 kódszámon rendelhető. DAB+ szubsztrát-kromogén oldat A használat előtt az oldatot alaposan fel kell keverni. Az oldatban létrejövő csapadék nem befolyásolja a festés minőségét. A DAB+ szubsztrát-kromogén oldat elkészítéséhez adjon 1 csepp folyékony DAB+ kromogén reagenst egy ml DAB+ szubsztrát puffer reagenshez, majd keverje össze. Az elkészített szubsztrát-kromogén reagens sötétben, 2–8 C hőmérsékleten történő tárolás esetén 5 napig marad stabil. Fontos megjegyzések:  Ha a DAB+ szubsztrát puffer üveg teljes tartalmát használja, adjon hozzá 9 csepp DAB+ kromogént. A címke szerint az üveg tartalma 7,2 ml, ez azonban a használható tartalomra értendő, és nem foglalja magában az üveg „holttérfogatát“.  A palackban lévő folyékony DAB+ kromogén színe átlátszótól levendula vagy lilásbarna színig változhat. Ez nem befolyásolja a termék teljesítményét. A hígítást a fenti utasításoknak megfelelően végezze el. Amennyiben túl nagy mennyiségű folyékony DAB+ kromogén reagenst ad hozzá a DAB+ szubsztrát puffer reagenshez, azzal csökkenti a pozitív jelet. Az Autostainer Link 48 készüléken végzett festési eljárás Az eljárással kapcsolatos megjegyzések A felhasználó használat előtt gondosan olvassa el az utasításokat, és ismerkedjen meg minden komponenssel és készülékkel (lásd: Óvintézkedések). Az immunfestés előtt a reagenseket hagyja szobahőmérsékletre (20–25 °C) melegedni. A további inkubálásokat is szobahőmérsékleten kell végezni. Ne hagyja, hogy a festés során a szövetmetszetek kiszáradjanak. A kiszáradt metszeteken nagyobb mértékű lehet a nem specifikus festődés. A szükséges lépések és inkubációs idők előre be van programozva a Dako Link szoftverben. A programozási protokollokkal és a tárgylemezek és a reagensek behelyezésével kapcsolatos további információkért tekintse meg az Autostainer Link 48 és a PT Link használati útmutatóját. Megjegyzés: A jelen rendszerhez mellékelt reagensek és instrukciók a javasolt reagensekkel és anyagokkal történő használat esetén optimális teljesítményt biztosítanak. A reagensek további hígítása, illetve az inkubálási idő vagy a hőmérséklet megváltoztatása hibás vagy ellentmondó eredményeket adhat. Festési protokoll Válassza ki a PD-L1 IHC 22C3 pharmDx festési protokollt a Dako Link legördülő menüben található opciók közül. A szükséges lépések és inkubációs idők előre be van programozva az Autostainer Link 48 szoftverében. Ha az Ön szerverén nem találhatók meg a megfelelő PD-L1 IHC 22C3 pharmDx protokollok, hívja a helyi műszaki szervizképviseletet a protokollok eléréséhez. 1. lépés: Deparaffinizálás, rehidratálás és antigénfeltárás (3 az 1-ben) eljárás A részletekkel kapcsolatban lásd a PT Link felhasználói útmutatóját. Állítsa a PT Link (kód: PT100/PT101) Preheat (Előmelegítés) és Cool (Hűtés) értékét 65 °C-ra. Állítsa be a Heat (Melegítés) értékét 97 °C-ra, az időt pedig 20 percre. ►Töltse fel a PT Link tartályait egyenként 1,5 l Target Retrieval Solution, Low pH, 1x munkaoldattal úgy, hogy elfedje a szövetmetszeteket. ►Melegítse elő a Target Retrieval Solution reagenst 65 °C-ra. ►Merítse be a rögzített FFPE szövetmetszeteket tartalmazó Autostainer állványokat az előmelegített Target Retrieval Solution, Low pH, 1x munkaoldatba a PT Link tartályban. Inkubálja 20 percig 97 °C hőmérsékleten. ►Amikor befejeződött az antigénfeltáró inkubálás és a hőmérséklet visszahűlt 65 °C-ra, távolítsa el a tárgylemezeket tartalmazó Autostainer tárgylemezállványokat a PT Link tartályából, és azonnal helyezze a tárgylemezeket tartalmazó Autostainer tárgylemezállványt a hígított, szobahőmérsékletű Wash Buffer (kód: K8007) reagenst tartalmazó tartályba (pl. PT Link Rinse Station, kód: PT109). ►Inkubálja a tárgylemezeket hígított, szobahőmérsékletű Wash Buffer reagensben 5 percig. 2. lépés: Festési eljárás A deparaffinizálás, rehidratálás és antigénfeltárás (3 az 1-ben) eljárást követően helyezze a tárgylemezeket tartalmazó Autostainer állványokat az Autostainer Link 48 készülékbe. A készülék a megfelelő reagens hozzáadásával elvégzi a festési eljárást, követi az inkubációs időt, és leöblíti a tárgylemezeket a reagensek között. A reagens alkalmazási időtartamai előre be vannak programozva a Dako Link szoftverében. 3. lépés: Kontrasztfestés A tárgylemezek kontrasztfestését Hematoxylin (Link) (kód: K8008) reagenssel kell végezni 5 percig. A hematoxilin inkubációs ideje előre be van programozva a protokollba. 4. lépés: Rögzítés Nem víz alapú, tartós rögzítőközeget kell használni. Megjegyzés: Némi fakulás előfordulhat a megfestett tárgylemezeken. Ez többféle tényezőtől függ, például a kontrasztfestéstől, az alkalmazott rögzítőközegektől és módszerektől, valamint a tárgylemezek tárolásának körülményeitől. A fakulás minimálisra csökkentése érdekében a lemezeket sötét helyen, szobahőmérsékleten (20–25 °C között) kell tárolni.

P03928HU_03/SK00621-2/2016.11 p. 4/14

Minőség-ellenőrzés A PD-L1 IHC 22C3 pharmDx készlet reagenseinek minőség-ellenőrzését a fent leírt antigénfeltárási és festési eljárásokat alkalmazó immunhisztokémiai eljárás segítségével végeztük. Amennyiben a felhasználó laboratóriuma eltér az ajánlott fixálási, feldolgozási és beágyazási eljárásoktól, az jelentős bizonytalanságot okozhat az eredményekben. Minden egyes festési futtatás esetén mellékelni kell minőségbiztosítási kontrollokat. A minőségbiztosítási kontrollokat az 1. táblázat mutatja, beleértve a következőket: egy H&E festett páciens-szövetminta; a laboratórium által biztosított negatív és pozitív kontroll szövetek; és a Dako által biztosított Kontroll tárgylemez (5). Az Egyesült Államokban további információért lásd a College of American Pathologists (CAP) immunhisztokémiai akkreditációs programjának minőség-ellenőrzési követelményeit és a CLSI immuncitokémiai minőségbiztosítás elfogadott irányelveit (5, 6, 7). A teszt igazolása A festőrendszer diagnosztikai eljárásban történő első felhasználása előtt a felhasználónak ellenőriznie kell a teszt teljesítményét. Ehhez ismert pozitív és negatív szöveteket képviselő, ismert immunhisztokémiai (IHC) teljesítményjellemzőkkel rendelkező, laboratórium által biztosított mintasorozaton kell igazolnia a tesztet. Lásd a minőség-ellenőrzési eljárásokat leíró fenti minőség-ellenőrzési részt. Ezeket a minőség-ellenőrzési eljárásokat minden új antitest-tételnél, illetve az assay paramétereinek megváltozásakor meg kell ismételni. A potenciális problémákat, azok okait és a lehetséges korrekciós intézkedéseket a 10. táblázatban ismertetjük. A pontszám értelmezése - NSCLC A PD-L1 pontszám értelmezése során a teljes tárgylemez valamennyi életképes daganatsejtjét értékelni kell és be kell vonni az értelmezésbe. Ahhoz, hogy a minta megfelelő legyen a PD-L1 értékeléshez, legalább 100 életképes daganatsejtnek kell jelen lennie a PD-L1 antitesttel megfestett lemezen. A PD-L1 IHC 22C3 pharmDx készlet segítségével megfestett minták sikeres pontozásának kritikus feltétele a megfelelő sejtek értékelése, a sejten belüli elhelyezkedés megfelelő azonosítása és a festődés intenzitásának megfelelő értelmezése. A tárgylemez kiértékelését patológusnak kell elvégeznie fénymikroszkóp segítségével. Az immunhisztokémiai festődés értelmezéséhez és értékeléséhez 10–40x nagyítású objektív használható. A daganatsejtek bármely kivehető membránfestődését figyelembe kell venni a pontozás során. Pontozni kell a részleges vagy teljes sejtmembrán-festődést (≥1+), amely elkülöníthető a citoplazma festődésétől. A citoplazma festődését nem specifikus festődésnek kell tekinteni, és nem szabad figyelembe venni a festődési intenzitás értékelése során. A normál sejteket és a daganathoz kapcsolódó immunsejteket, mint az infiltráló limfocitákat vagy makrofágokat nem szabad figyelembe venni a PD-L1 pozitivitást meghatározó pontozás során. A NCR reagenssel festett daganatmintáknak 0 specifikus festődést és ≤ 1+ háttérfestődést kell mutatniuk. A tumorhányad pontszám (Tumor Proportion Score, TPS) a részleges vagy teljes membránfestődést (≥1+) mutató, életképes tumorsejtek százalékos értéke segítségével határozható meg. A minta akkor tekinthető PD-L1 pozitívnak, ha az életképes tumorsejtek TPS ≥1%-a mutat bármilyen intenzitású membránfestődést (tehát ≥1+). A tárgylemezeket minden festési futtatás során az 1. táblázatban megadott sorrendben kell megvizsgálni a festési menet érvényességének meghatározásához és a szövetminta festődésének kiértékeléséhez. További útmutatás: lásd a PD-L1 IHC 22C3 pharmDx értelmezési kézikönyvét. További ajánlások a PD-L1 IHC 22C3 pharmDx festés értelmezéséhez 1. A membránfestődés igazolásához 10–40x-es nagyítású objektívet kell használni. 2. A nem vizsgált elemek, mint a daganathoz kapcsolódó immunsejtek (pl. makrofágok) és a stroma is pozitív PD-L1 festődést mutathatnak, de nem vehetők figyelembe a pontozás során. 1. táblázat: A tárgylemezek értékelésének javasolt sorrendje Minták Magyarázat Követelmények 1. H&E Első lépésként a hematoxilin és A PD-L1 IHC 22C3 pharmDx és a H&E festést a minta ugyanazon eozin (H&E) segítségével festett paraffinblokkjának sorozatmetszetein kell végezni. Ahhoz, hogy a minta (A labor biztosítja) szövetminták kiértékelését kell megfelelő legyen a PD-L1 értékeléshez, legalább 100 életképes elvégezni a szövettan és a daganatsejtnek kell jelen lenni. prezervációs minőség felmérése érdekében. A szövetmintáknak épnek, megfelelően prezervált állapotúnak kell lenniük, továbbá alkalmasnak kell lenniük a tumor jelenlétének megerősítésére. 2. Kontroll A PD-L1 IHC 22C3 pharmDx Minden egyes festési futtatás során meg kell festeni egy kontroll sejtvonalakat sejtvonalakat készlet részét képező elsődleges tartalmazó tárgylemezt tartalmazó PL-D1 antitesttel megfestett elsődleges PD-L1 antitesttel. tárgylemez kontroll sejtvonalakat tartalmazó tárgylemezt meg kell vizsgálni a NCI-H226 (PD-L1 pozitív kontroll sejtvonal) elfogadási kritériumai: (A Dako biztosítja) reagensek megfelelő  Sejtmembrán festődés a sejtek ≥70%-ában, ≥2+ átlagos festődési működésének meghatározásához. intenzitás.  Nem specifikus festődés intenzitása <1+. A kontroll sejtvonalakat tartalmazó tárgylemezen PD-L1-pozitív MCF-7 (PD-L1 negatív kontroll sejtvonal) elfogadási kritériumai: sejtvonalpellet és PD-L1-negatív  Nincs specifikus festődés. sejtvonalpellet található.  Nem specifikus festődés intenzitása <1+. Felhívjuk figyelmét, hogy esetenként megfigyelhető az MCF-7 sejtpellet néhány sejtjének festődése. A következő elfogadási kritériumok alkalmazandók: elfogadható, ha a jellegzetes plazmamembrán-festődést mutató sejtek összes száma ≤10, vagy ha az MCF-7 sejtpellet határain belül ≥1+ intenzitású citoplazma-festődés van jelen. Ha bármelyik kontroll sejtvonal nem felel meg a fenti kritériumoknak, akkor a páciens mintáinak összes eredményét érvénytelennek kell tekinteni. P03928HU_03/SK00621-2/2016.11 p. 5/14

3. Pozitív kontrollszöveteket tartalmazó tárgylemezek (A labor biztosítja)

Következő lépésként az elsődleges PD-L1 antitesttel és a negatív kontroll reagenssel egyaránt megfestett pozitív kontrollszöveteket tartalmazó tárgylemezeket kell megvizsgálni. Ezek a tárgylemezek igazolják, hogy hatékony volt a fixálási módszer és az epitópfeltárási folyamat. Az ismert pozitív kontroll szöveteket kizárólag a feldolgozott szövetek és tesztreagensek megfelelő teljesítményének ellenőrzésére szabad használni, a páciensek mintáinak specifikus diagnosztizálásához NEM használhatók.

A kontrolloknak a páciens mintájával megegyező daganatot tartalmazó biopsziás vagy sebészeti mintának kell lenniük, a páciens mintájával vagy mintáival azonos módon, a lehető leggyorsabban fixálva, feldolgozva és beágyazva. A festődés értelmezéséhez használjon ép mintákat, mivel a nekrotikus vagy degenerált sejtek esetében gyakori a nem specifikus festődés. A pozitív kontrollként használt szöveteknek PD-L1 festés esetén gyenge vagy közepes festődést kell mutatniuk, ily módon ki tudják mutatni a teszt érzékenységének kismértékű változásait. Minden egyes festési futtatásba két pozitív kontrollszövetet tartalmazó tárgylemezt kell bevonni. PD-L1 anyaggal festett tárgylemez: Barna színű membránfestődés jelenlétét kell megfigyelni. A nem specifikus festődés legyen ≤1+. Negatív kontroll reagenssel festett tárgylemezek: Nincs membránfestődés. A nem specifikus festődés legyen ≤1+.

4. Negatív kontrollszöveteket tartalmazó tárgylemezek (A labor biztosítja)

5. Negatív kontrollreagens használatával festett páciensszöveteket tartalmazó tárgylemez 6. Elsődleges PD-L1 antitesttel megfestett páciensszöveteket tartalmazó tárgylemez

A következő lépésben az elsődleges PD-L1 antitesttel és a negatív kontroll reagenssel egyaránt megfestett, negatív kontrollszöveteket tartalmazó (más néven PD-L1 negatív) tárgylemezeket kell vizsgálni annak igazolására, hogy az elsődleges antitest specifikusan jelöli a célantigént. Emellett a pozitív kontroll szövet negatív részei negatív kontroll szövetként is szolgálhatnak, de ezt a felhasználónak igazolnia kell.

Vizsgálja meg a PD-L1 IHC 22C3 pharmDx készlet negatív kontroll reagensével megfestett páciensmintákat. A negatív kontroll reagens az elsődleges antitest helyett kerül alkalmazásra, mely segít az antigén helyén történő specifikus festés értelmezésében. Utolsó lépésként a PD-L1 IHC 22C3 pharmDx készletben lévő elsődleges PD-L1 antitesttel megfestett páciensmintákat tartalmazó teljes tárgylemezt vizsgálja meg. A PD-L1 IHC 22C3 pharmDx készlet immunreaktivitására vonatkozó pontos információkat lásd az Összefoglalás és magyarázat, a Korlátozások és a Teljesítményjellemzők című részekben.

Ha a pozitív kontroll szövetek nem mutatnak megfelelő pozitív festődést, a tesztminták eredményeit érvénytelennek kell tekinteni. A kontrolloknak a páciens mintájával megegyező daganatot tartalmazó biopsziás vagy sebészeti mintának kell lenniük, a páciens mintájával vagy mintáival azonos módon, a lehető leggyorsabban fixálva, feldolgozva és beágyazva. Minden egyes festési futtatásba két negatív kontrollszövetet tartalmazó tárgylemezt kell bevonni. PD-L1 anyaggal festett tárgylemez: A tumorsejtek esetén nincs membránfestődés. A nem specifikus festődés legyen ≤1+. Negatív kontroll reagenssel festett tárgylemezek: Nincs membránfestődés. A nem specifikus festődés legyen ≤1+. Amennyiben a negatív kontrollszöveteket tartalmazó tárgylemezeken specifikus sejtmembránfestődés figyelhető meg, a páciensminta eredményeit érvénytelennek kell tekinteni. A specifikus membránfestődés távolléte igazolja, hogy az elsődleges antitest specifikusan jelöli a célantigént. A nem specifikus festődés legyen ≤1+.

A pozitív festődés intenzitását az ugyanahhoz a futtatáshoz tartozó negatív kontroll reagens páciens-tárgylemezen megfigyelt nem specifikus háttérfestődés figyelembe vételével kell értékelni. Mint minden immunhisztokémiai teszt esetén, itt is igaz, hogy a negatív eredmény csupán azt jelenti, hogy az antigén nem volt detektálható, és nem azt, hogy az antigén nem volt jelen a vizsgálatba bevont sejtekben/szövetekben. A PD-L1 pontszám értelmezése során a teljes PD-L1 festett páciensszövetet tartalmazó tárgylemez valamennyi életképes daganatsejtjét értékelni kell és be kell vonni az értelmezésbe. Ahhoz, hogy a minta megfelelő legyen a PD-L1 értékeléshez, legalább 100 életképes daganatsejtnek kell jelen lenni.

Általánosan érvényes korlátozások 1. Az immunhisztokémia többlépcsős diagnosztikai folyamat, amely speciális képzést igényel a megfelelő reagensek kiválasztása, a szövetek kiválasztása, fixálása és feldolgozása, az immunhisztokémiai tárgylemez előkészítése és a festődési eredmények értelmezése területén. 2. A szövet festődése függ a festést megelőző kezeléstől és előkészítéstől. A nem megfelelően végzett fixálás, fagyasztás, kiolvasztás, mosás, szárítás, melegítés és metszés, illetve a más szövetekkel és folyadékokkal történő szennyezés műtermékeket, elégtelen antitestfeltárást vagy álnegatív eredményeket okozhat. Az ellentmondó eredmények oka a fixálási és beágyazási módszerek eltérései, illetve a szövetben eredendően jelen lévő szabálytalanságok lehetnek. 3. A túlzott vagy elégtelen kontrasztfestés veszélyeztetheti az eredmények megfelelő értelmezését. 4. A pozitív festődés, illetve a pozitív festődés hiányának klinikai értelmezését a klinikai tünetek, a morfológia és egyéb hisztopatológiai kritériumok figyelembe vételével kell végezni. A festődés, vagy a festődés hiányának klinikai értelmezését morfológiai vizsgálatokkal és megfelelő kontrollokkal, valamint egyéb diagnosztikai vizsgálatokkal kell kiegészíteni. A festett preparátum értelmezése az alkalmazott antitesteket, reagenseket és módszereket jól ismerő képesített patológus feladata. A festést tanúsított és engedélyezett laboratóriumban kell végezni, a festett tárgylemezek felülvizsgálatáért és a pozitív és negatív kontrollok megfelelőségének biztosításáért felelős patológus felügyelete alatt. 5. A hepatitisz B vírussal fertőzött személyektől származó, hepatitisz B felületi antigént (HBsAg) tartalmazó szövetek torma-peroxidáz alkalmazásakor nem specifikus festődést mutathatnak (7). P03928HU_03/SK00621-2/2016.11 p. 6/14

6. A reagensek váratlan reakciót adhatnak az előzőleg nem tesztelt szövettípusokon. A daganatok és más patológiás szövetek antigén-expressziójának biológiai variabilitása miatt a váratlan reakciók lehetőségét még a tesztelt szövettípusok esetében sem lehet teljesen kizárni. Értesítse a Dako technikai támogató csoportját, ha váratlan reakciókat észlel. 7. A proteinek vagy szubsztrát reakciótermékek nem immunológiai jellegű kötődése álpozitív eredményeket adhat. Ugyancsak álpozitív eredményt adhat a pszeudoperoxidáz aktivitás (eritrociták) vagy endogén peroxidáz aktivitás (citokróm C) (7). 8. A rendszerhez biztosított reagenseket és útmutatásokat optimális teljesítmény eléréséhez alakítottuk ki. A reagensek további hígítása, illetve az inkubálási idő vagy a hőmérséklet megváltoztatása hibás vagy ellentmondó eredményeket adhat. Termékspecifikus korlátozások 1. A hamis negatív eredményeket okozhatja az, hogy az antigén idővel lebomlik a szövetekben. A sötét helyen, (lehetőség szerint) 2–8 °C-on vagy legfeljebb 25 °C-os szobahőmérsékleten tárolt mintákat a tárgylemezre rögzítés után hat hónapon belül meg kell festeni. 2. Az optimális és reprodukálható eredmények érdekében a PD-L1 protein antigénfeltáró előkezelést igényel a szövetek rutinszerű fixálása (semleges pufferelt formalin) és paraffinba ágyazása során. 3. A reagenseket nem szabad eltérő tételszámú készletekből vagy más gyártóktól származó készletekből pótolni. Az egyetlen kivétel az EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low pH, 50x, amely szükség szerint a K8005 kódszámot használva rendelhető. 4. A megfestett kontroll sejtvonalak csak a festési futtatás validálására használhatók, a szövetmetszetek festődési reakciójának pontozására viszont nem. 5. A PD-L1 IHC 22C3 pharmDx használatát nem validáltuk más (nem formalin) fixálószerekkel fixált szöveteken. 6. A PD-L1 IHC 22C3 pharmDx használatát nem validáltuk vékonytű-aspirációs technikával előállított preparátumokon. A klinikai teljesítmény értékelése A PD-L1 IHC 22C3 pharmDx klinikai előnyét az előrehaladott NSCLC-ben szenvedő pácienseknél alkalmazott KEYTRUDA biztonságosságát és hatásosságát értékelő multicentrikus, nyílt címkés, randomizált klinikai vizsgálatban teszteltük (9). A páciensek egy klinikai vizsgálati teszt (CTA) szerint PD-L1 pozitívak voltak, és platina-tartalmú kemoterápiával végzett kezelést követően súlyosbodott a betegségük. Az EGFR vagy ALK genomikus tumoraberrációval rendelkező páciensek állapota az aberrációkra alkalmazott, FDA által jóváhagyott terápia mellett súlyosbodott a KEYTRUDA alkalmazása előtt. A pácienseket (1:1:1 arányban) 3 hetenként adott 2 mg/kg (n=344) vagy 10 mg/kg (n=346) KEYTRUDA-kezelésre vagy 3 hetenként adott 75 mg/m2 docetaxel-kezelésre (n=343) randomizáltuk. 9 hetente végeztük a tumorstátusz értékelését. Az elsődleges hatásossági végpontok a szolid tumorokban a hatást mérő kritériumok 1.1-es verziója (Response Evaluation Criteria on Solid Tumors Version 1.1, RECIST 1.1) szerint, radiológusok által végzett független, vak vizsgálattal értékelt teljes túlélés (OS) és a progressziómentes túlélés (PFS) voltak. A CTA alapján összesen 1033 NSCLC pácienst randomizáltunk a vizsgálatban. A PD-L1 IHC 22C3 pharmDx klinikai hasznosságának értékeléséhez archivált klinikai vizsgálati mintákat teszteltünk retrospektív módon egy amerikai referencia laboratóriumban a PD-L1 IHC 22C3 pharmDx készlet segítségével. A 1 033 páciens közül 529 páciens daganatszövetét retrospektív módon teszteltük a PD-L1 IHC 22C3 pharmDx teszt segítségével. 413 páciens mintája pozitív PD-L1 expressziót mutatott (az életképes daganatsejtek ≥1%-a mutatott bármilyen intenzitású membránfestődést), 94 páciens mintája pedig negatív PD-L1 expressziót (az életképes daganatsejtek <1%-a mutatott bármilyen intenzitású membránfestődést). A pozitív PD-L1 expressziót mutató 413 páciens körében 163 páciens mintája mutatott nagyfokú PD-L1 expressziót (az életképes tumorsejtek ≥50%-a mutatott bármilyen intenzitású membránfestődést). A CTA és a PD-L1 IHC 22C3 pharmDx közötti egyezést a 2. táblázat mutatja. 2. táblázat: A CTA és a PD-L1 IHC 22C3 pharmDx közötti egyezés Egyezés aránya CTA és PD-L1 IHC 22C3 pharmDx

PD-L1 Határérték TPS 1% TPS 50%

Negatív százalékos egyezés (95% konfidencia intervallum [KI]) 94,5% [91,4–96,6%] 98,3% [97,1–99,0%]

Pozitív százalékos egyezés (95% konfidencia intervallum [KI]) 80,0% [76,9–82,8%] 73,2% [67,9–77,9%]

A PD-L1 IHC 22C3 pharmDx készlettel pozitív eredményt mutató, randomizált páciensek körében a demográfiai és egyéb kiindulási jellemzők kiegyenlítettek voltak a kezelési karok között. A medián életkor 63 év volt (a páciensek 44%-a volt 65 éves vagy annál idősebb). A páciensek túlnyomó része fehér (77%) férfi (58%) volt; az alapszintű ECOG teljesítménystátusz 0 (29%) vagy 1 (71%) volt. A páciensek hetvennyolc százaléka (78%) volt leszokott/aktív dohányos. A szövettani vizsgálatok szerint a páciensek huszonkét százaléka (22%) laphámsejtes, hatvankilenc százaléka (69%) nem laphámsejtes tüdőrákban szenvedett. A kiindulási és demográfiai jellemzők hasonlóképpen kiegyenlítettek voltak a teljes klinikai vizsgálat pembrolizumab és docetaxel karjai között. A hatásossági eredményeket a 3. táblázat foglalja össze. A KEYTRUDA tartós klinikai előnyt mutatott a TPS 1% értékű pozitív PD-L1 expressziót mutató NSCLC pácienseknél, és a klinikai előny további növekedést mutatott a PD-L1 IHC 22C3 pharmDx készlettel mérve nagyfokú, TPS 50% értékű pozitív PD-L1 expressziót mutató NSCLC pácienseknél. Az előny nagyságrendileg hasonló volt a teljes klinikai vizsgálatban észlelthez. A 3. táblázat összegzi a teljes PD-L1 pozitív (TPS  1%) populáció, a teljes klinikai vizsgálat nagyfokú pozitív PD-L1 (TPS  50%) expressziójú alcsoportja (PD-L1 pozitív a CTA szerint) és a PD-L1 IHC 22C3 pharmDx készlettel pozitívnak ítélt populáció legfontosabb hatásossági eredményeit. Az OS Kaplan-Meier görbéjét (TPS  1%, PD-L1 IHC 22C3 pharmDx készlettel mérve) az 1. ábra mutatja.

P03928HU_03/SK00621-2/2016.11 p. 7/14

3. táblázat: A KEYTRUDA-ra adott válasz a korábban kezelt NSCLC páciensek körében: A teljes klinikai vizsgálat és a PD-L1 IHC 22C3 pharmDx teszt szerint pozitív páciensek: PD-L1 TPS 1% és TPS 50% Végpont

KEYTRUDA 2 mg/kg 3 hetente Klinikai PD-L1 IHC vizsgálat 22C3 pharmDx

KEYTRUDA 10 mg/kg 3 hetente Klinikai PD-L1 IHC vizsgálat 22C3 pharmDx

Docetaxel 75 mg/m2 3 hetente Klinikai PD-L1 IHC vizsgálat 22C3 pharmDx

344

140

346

142

343

131

172 (50%) 0,71 (0,58, 0,88) <0,001 10,4 (9,4, 11,9)

59 (42%) 0,54 (0,37, 0,78) <0,001 11,8 (9,6, NÉ)

156 (45%) 0,61 (0,49, 0,75) <0,001 12,7 (10,0, 17,3)

59 (42%) 0,57 (0,39, 0,82) 0,00115 12,0 (8,7, NÉ)

193 (56%)

67 (51%)

---

---

--8,5 (7,5, 9,8)

--7,5 (6,3, 9,9)

266 (77%) 0,88 (0,73, 1,04) 0,068 3,9 (3,1, 4,1)

97 (63%) 0,68 (0,50, 0,92) 0,00578 4,9 (4,1, 6,2)

255 (74%) 0,79 (0,66, 0,94) 0,005 4,0 (2,6, 4,3)

103 (73%) 0,79 (0,59, 1,06) 0,05767 4,0 (2,2, 4,6)

257 (75%)

94 (72%)

---

---

--4,0 (3,1, 4,2)

--3,8 (2,2, 4,2)

18% (14, 23)

24% (17, 32)

18% (15, 23)

20% (14, 28)

9% (7, 13)

5% (2, 11)

139

56

151

60

152

47

58 (42%) 0,54 (0,38, 0,77) <0,001 14,9 (10,4, NÉ)

18 (32%) 0,45 (0,24, 0,84) 0,00541 Nem érte el (9,3+, NÉ)

60 (40%) 0,50 (0,36, 0,70) <0,001 17,3 (11,8, NÉ)

19 (32%) 0,29 (0,15, 0,56) <0,001 Nem érte el (8,3+, NÉ)

86 (57%)

25 (53%)

---

---

--8,2 (6,4, 10,7)

--7,2 (4,4, 8,3)

89 (64%) 0,58 (0,43, 0,77) <0,001 5,2 (4,0, 6,5)

33 (59%) 0,47 (0,28, 0,80) 0,00221 5,9 (4,2, 9,0)

97 (64%) 0,59 (0,45, 0,78) <0,001 5,2 (4,1, 8,1)

34 (57%) 0,41 (0,24, 0,70) <0,001 4,8 (2,8, NÉ)

118 (78%)

33 (70%)

---

---

--4,1 (3,6, 4,3)

--3,9 (2,0, 4,3)

30% (23, 39)

37% (25, 52)

29% (22, 37)

28% (18, 41)

8% (4, 13)

4% (1, 15)

TPS 1% Páciensek száma OS Halálozás (%) Kockázati arány* (95% KI) p-érték† Medián érték, hónap (95% KI) PFS‡ Események (%) Kockázati arány* (95% KI) p-érték† Medián érték, hónap (95% KI) Általános válaszadási arány‡ ORR %§ (95% KI) TPS 50% Páciensek száma OS Halálozás (%) Kockázati arány* (95% KI) p-érték† Medián érték, hónap (95% KI) PFS‡ Események (%) Kockázati arány* (95% KI) p-érték† Medián érték, hónap (95% KI) Általános válaszadási arány‡ ORR %§ (95% KI) * † ‡ § ¶

Kockázati arány (KEYTRUDA docetaxelhez hasonlítva) a rétegzett Cox-féle arányos kockázati modell alapján Rétegezett log-rank próba alapján BICR értékelte a RECIST 1.1 segítségével Valamennyi válasz részleges válasz volt Az igazolt teljes vagy részleges válaszként meghatározott legjobb általános választ adó páciensek alapján

P03928HU_03/SK00621-2/2016.11 p. 8/14

Teljes túlélés (%)

1. ábra: A teljes túlélés Kaplan-Meier-görbéje kezelési karonként (TPS 1% a PD-L1 IHC 22C3 pharmDx készlettel mérve, beválasztás szerinti populáció)

Docetaxel 75 mg/m2 Q3W MK – 3475 2 mg/kg Q3W MK – 3475 10 mg/kg Q3W

n, kockázatnak Docetaxel 75 mg/m2 Q3W

Idő, hónap

MK – 3475 2 mg/kg Q3W MK – 3475 10 mg/kg Q3W

További robusztussági elemzéseket végeztünk a pozitív PD-L1 IHC 22C3 pharmDx teszteredményt adó, de a CTA szerint esetlegesen negatív páciensek hiányzó adataiból eredő potenciális hatások felmérésére. Az ilyen teszteredményeket adó páciensek a PD-L1 IHC 22C3 pharmDx vizsgálat rendeltetésszerű használat/ diagnosztizálni kívánt (intent-to-diagnose, ITD)/ populációjába tartoznak, de a CTA szűrésen adott negatív eredményük miatt kizárásra kerültek a klinikai vizsgálatból. Ahhoz, hogy számot adhassunk a hiányzó adatokról, érzékenységi elemzést végeztünk az ITD populáció keretében a TPS  1% és TPS  50% alpopulációk PD-L1 IHC 22C3 pharmDx tesztje alapján becsült kockázati arány (HR) valószerű tartományának megállapítására, a CTA alapján bevont páciensek megfigyelt HR értékeivel való egyezés igazolása érdekében. A HR érzékenységi elemzés eredményei azt mutatták, hogy a becsült HR értékek kellően robusztusak a kezelési hatás bármely feltételezett csökkenésével szemben az ITD kereten belül.

P03928HU_03/SK00621-2/2016.11 p. 9/14

A nem klinikai teljesítmény értékelése Analitikai érzékenység/specificitás A PD-L1 IHC 22C3 pharmDx analitikus érzékenységét 127 egyedi nem kissejtes tüdőrákból (NSCLC) származó FFPE mintán vizsgáltuk, melyeket egy gyártói készlet segítségével I–IV. stádiumba osztályoztunk. A PD-L1 expresszió értékelése festődést mutatott a 0-100% pozitív daganatsejt és 0-3 festődési intenzitás tartományban. Normál szövetek: A 4. táblázat összegzi a monoklonális egér Anti-PD-L1, Clone 22C3 antitest immunreaktivitását a normál szöveteket tartalmazó javasolt panelen. Plazmamembrán festődést figyeltek meg immunsejteken és epitheliális eredetű sejteken. Citoplazma festődést jeleztek egyes sejttípusok esetében, de nem tekintették pozitív festődésnek. Minden szövet formalinban fixált, paraffinba ágyazott volt, és a jelen tájékoztatóban leírt utasítások szerint festették meg a PD-L1 IHC 22C3 pharmDx reagenssel. Nem figyeltünk meg váratlan eredményeket a vizsgált sejttípusokon vagy szövettípusokon. A megfigyelt festődés megfelelt a normál szövetek PD-L1 expresszióját vizsgáló IHC szakirodalomban közölteknek (10, 11). 4. táblázat: A PD-L1 IHC 22C3 pharmDx normál szöveteken mért reaktivitásának összegzése Szövettípus Pozitív plazmamembránPozitív citoplazma-festődés: (vizsgált minták száma) festődés: Szövetelemek Szövetelemek Agyalapi mirigy (3) Bőr (3) Csecsemőmirigy (3) Csontvelő (3) Emlő (3) Gyomor (3) Hasnyálmirigy (3) Here (3) Kisagy (3) Lép (3) Máj (3) Mandula (3) Méh (3) Méhnyak (3) Mellékpajzsmirigy (3) Mellékvese (3) Mezoteliális sejtek (2) Nagyagy (3) Nyálmirigy (3) Nyelőcső (3) Pajzsmirigy (3) Perifériás ideg (3) Petefészek (3) Prosztata (2) Szívizom (3) Tüdő (3) Vastagbél (3) Vázizom (3) Vékonybél (3) Vese (3)

1/3 hipofízis: elülső lebeny 1/3 hipofízis: hátsó lebeny 0/3 3/3 medulla epithelium 3/3 megakariociták 0/3 2/3 limfociták 1/3 gyomormirigy 0/3 0/3 0/3 2/3 makrofágok 1/3 makrofágok 1/3 hepatociták 3/3 crypta epithelium 2/3 csíracentrum (makrofágok) 0/3 1/3 epithelium 1/3 glanduláris epithelium 0/3 0/2 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 2/2 epithelium 0/3 3/3 alveoláris makrofágok 2/3 makrofágok 0/2 0/3 1/3 tubulus epithelium

Nem specifikus festődés 0/3

1/3 hipofízis: elülső lebeny 1/3 hipofízis: hátsó lebeny 0/3 0/3 3/3 megakariociták 0/3 1/3 gyomormirigy

0/3 0/3 0/3 0/3 0/3

0/3 0/3 0/3 0/3 0/3

0/3 0/3 0/3 0/3 0/3

0/3

0/3

0/3 0/3 0/3 1/3 velőállomány sejtek 0/2 0/3 0/3 0/3 0/3 1/3 kötőszövet/erek 0/3 0/2 0/3 0/3 0/3 0/2 0/3 0/3

0/3 0/3 0/3 0/3 0/2 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/2 0/3 0/3 0/3 0/2 0/3 0/3

Daganatos szövetek: Az 5. táblázat összegzi a monoklonális egér Anti-PD-L1, Clone 22C3 antitest immunreaktivitását daganatos szöveteket tartalmazó panelen. Plazmamembrán festődést figyeltek meg immunsejteken és epitheliális eredetű sejteken. Citoplazma festődést jeleztek egyes sejttípusok esetében, de nem tekintették pozitív festődésnek. Minden szövet formalinban fixált, paraffinba ágyazott volt, és a jelen tájékoztatóban leírt utasítások szerint festették meg a PD-L1 IHC 22C3 pharmDx reagenssel. Nem figyeltek meg váratlan eredményeket a vizsgált daganatmintákon. A megfigyelt festődés megfelelt a daganatos szövetek PD-L1 expresszióját vizsgáló IHC szakirodalomban közölteknek (10-13). 5. táblázat: A PD-L1 IHC 22C3 pharmDx daganatos szöveteken mért reaktivitásának összegzése PD-L1 pozitív/összes Tumor típusa Helyszín N=159 Emlő, DCIS 0/2 Emlő, invazív duktális 0/7 Emlő, invazív duktális, nyirokcsomóáttét 0/1 Epehólyag 1/5 Fej és nyak, kemény szájpad 0/1 Féregnyúlvány 0/1 Adenokarcinóma Gyomor 0/6 Gyomor, mucinózus 0/1 Gyomor-bélrendszeri, tüdőáttét 0/1 Hasnyálmirigy 0/2 Hasnyálmirigy, duktális 0/3 Méh, endometrium 0/3 Méh, világossejtes 0/1 P03928HU_03/SK00621-2/2016.11 p. 10/14

Tumor típusa

Adrenokortikális karcinóma Astrocytoma Átmeneti sejtes karcinóma Basalis sejtes karcinóma Embrionális karcinóma Ependymoma Feokromocitóma Glioblasztóma Hepatoblasztóma Hepatocelluláris karcinóma Interstitialoma

Karcinóma Kissejtes karcinóma Kondroszarkóma Kordóma

Laphámsejtes karcinóma

Leiomyosarcoma Limfóma Anaplasztikus nagysejtes Diffúz B-sejtes Hodgkin Non-Hodgkin Medulláris karcinóma Medulloblasztóma Melanóma Meningióma Mezotelióma Neuroblasztóma Neurofibróma Oszteoszarkóma Pecsétsejtes karcinóma Primitív neuroektodermális tumor (PNET) Rhabdomyosarcoma Spermatocitóma Synoviális szarkóma Szeminóma Szigetsejttumor Thymoma Vesesejt karcinóma Papilláris Világossejtes

Helyszín Méhnyak, endocervikális típus Nyálmirigy/parotis Nyelőcső Pajzsmirigy, follikuláris Pajzsmirigy, follikuláris-papilláris Pajzsmirigy, papilláris Petefészek Petefészek, endometriális Petefészek, mucinózus Petefészek, szerózus Prosztata Tüdő Vastagbél Vastagbél, májáttét Vastagbél, mucinózus Végbél Vékonybél Mellékvese Nagyagy Húgyhólyag Vese Bőr Here Agy Mellékvese Agy Máj Máj Vastagbél Végbél Vékonybél Nasopharyngealis, NPC Tüdő Csont Medenceüreg Bőr Fej és nyak Méh Méhnyak Metasztatikus nyelőcső laphámsejtes karcinóma áttéte nyirokcsomóban Nyelőcső Tüdő Húgyhólyag Lágyszövet, mellkasfal

PD-L1 pozitív/összes N=159 0/1 0/2 0/1 0/1 0/1 0/3 0/1 0/1 0/1 0/1 0/5 1/4 0/5 0/1 0/1 0/4 0/2 0/1 0/3 0/6 0/1 0/1 0/1 0/1 0/1 0/1 0/1 0/5 0/1 0/1 0/1 0/1 0/1 0/1 0/1 0/2 0/2 0/1 2/5 0/1 0/7 1/2 0/1 0/1

Nyirokcsomó Nyirokcsomó Nyirokcsomó Nyirokcsomó Pajzsmirigy Agy Orrüreg Végbél Agy Peritoneum Retroperitoneum Lágyszövet, derék Csont Metasztatikus pecsétsejtes karcinóma carcinoma áttéte petefészekben Vastagbél Retroperitoneum Lágyszövet, embrionális Prosztata Retroperitoneum Here Medenceüreg Here Hasnyálmirigy Mediastinum

0/1 0/4 2/2 1/1 0/1 0/1 0/1 0/1 0/2 0/1 0/1 0/1 0/2

Vese Vese

0/1 0/6

0/1 0/1 0/1 0/1 0/1 0/1 0/2 0/1 0/2 0/1 1/1

P03928HU_03/SK00621-2/2016.11 p. 11/14

Ismételhetőség/Külső reprodukálhatóság A PD-L1 IHC 22C3 pharmDx ismételhetőségét és reprodukálhatóságát a Dako és három külső tesztelőhely vizsgálta. A teljesítményadatokat a 6–9. táblázat tartalmazza. A Dako által végrehajtott ismételhetőségi vizsgálatok ≥1% határértékre és ≥50% határértékre megállapított negatív százalékos egyezését (NPA), pozitív százalékos egyezését (PPA) és teljes egyezését (TE) a 6. és a 7. táblázat mutatja. Mivel az ismételhetőségi vizsgálatok 100%-os egyezést mutattak, a konfidencia intervallumokat a Wilson pontozási módszerrel számítottuk a független páros összehasonlítások száma alapján. A külső reprodukálhatósági vizsgálatok ≥1% határértékre és ≥50% határértékre megállapított átlagos negatív százalékos egyezését (ANA), átlagos pozitív százalékos egyezését (APA) és teljes százalékos egyezését (TE) az alábbi 8. és 9. táblázat mutatja. Az átlagos egyezések értékét számítottuk, mivel a reprodukálhatósági paramétereknek nincs természetes referenciája, mint a vizsgálóhely vagy megfigyelő. Az átlagos egyezések konfidencia intervallumát egy százalékos bootstrap-módszerrel számítottuk. (Felhívjuk figyelmét, hogy az ismételhetőségi vizsgálatokat nem elemeztük a bootstrap konfidencia intervallumok segítségével, mivel ezek az intervallumok nem számíthatók nulla eltérést mutató adatokból.) 6. táblázat: Az egyik vizsgálóhelyen tesztelt PD-L1 IHC 22C3 pharmDx ismételhetősége (≥1%) Ismételhetőségi vizsgálat Berendezések között

Diagnosztikai határérték

Vizsgálat elrendezése

≥1%

A különféle PD-L1 IHC expressziót mutató 16 NSCLC mintát (8 PD-L1 negatív és 8 PD-L1 pozitív) hat Autostainer Link 48 készüléken teszteltük. Kezelők közötti ≥1% A különféle PD-L1 IHC expressziót mutató 16 NSCLC mintát (8 PD-L1 negatív és 8 PD-L1 pozitív) hat analitikus segítségével teszteltük egy Autostainer Link 48 készüléken. Napok között ≥1% A különféle PD-L1 IHC expressziót mutató 16 NSCLC mintát (8 PD-L1 negatív és 8 PD-L1 pozitív) hat, nem egymást követő napon teszteltük az Autostainer Link 48 készüléken. Tételek között ≥1% A különféle PD-L1 IHC expressziót mutató 16 NSCLC mintát (8 PD-L1 negatív és 8 PD-L1 pozitív) három példányban és háromféle készletszámú reagenskészlettel teszteltük az Autostainer Link 48 készüléken. Futtatásokon belül ≥1% A különféle PD-L1 IHC expressziót mutató 16 NSCLC mintát (8 PD-L1 negatív és 8 PD-L1 pozitív) egy futtatáson belül hat példányban teszteltük az Autostainer Link 48 készüléken. Napok közötti ≥1% A különféle PD-L1 IHC expressziót mutató 16 NSCLC mintát (8 PD-L1 negatív és 8 PD-L1 pozitív) egy napon végzett két futtatás során, három napon át teszteltük az Autostainer Link 48 készüléken. NPA= negatív százalékos egyezés; PPA= pozitív százalékos egyezés; OA=teljes egyezés

% egyezés (95%-os konfidencia-intervallum) NPA 100% (91,2-100%) PPA 100% (91,2-100%) OA 100% (95,4-100%) NPA 100% (91,0-100%) PPA 100% (91,2-100%) OA 100% (95,4-100%) NPA 100% (91,2-100%) PPA 100% (91,2-100%) OA 100% (95,4-100%) NPA 98,6% (96,0-100%) PPA 98,6% (95,7-100%) OA 98,6% (95,8-100%) NPA 100% (91,2-100%) PPA 100% (91,2-100%) OA 100% (95,4-100%) NPA 100% (91,0-100%) PPA 100% (91,2-100%) OA 100% (95,4-100%)

7. táblázat: Az egyik vizsgálóhelyen tesztelt PD-L1 IHC 22C3 pharmDx ismételhetősége (≥50%) Ismételhetőségi vizsgálat Berendezések között

Diagnosztikai határérték ≥50%

Vizsgálat elrendezése

A különféle PD-L1 IHC expressziót mutató 16 NSCLC mintát (10 PD-L1 negatív és 6 PD-L1 pozitív) hat Autostainer Link 48 készüléken teszteltük. Kezelők közötti ≥50% A különféle PD-L1 IHC expressziót mutató 16 NSCLC mintát (10 PD-L1 negatív és 6 PD-L1 pozitív) hat analitikus segítségével teszteltük egy Autostainer Link 48 készüléken. Napok között ≥50% A különféle PD-L1 IHC expressziót mutató 16 NSCLC mintát (10 PD-L1 negatív és 6 PD-L1 pozitív) hat, nem egymást követő napon teszteltük az Autostainer Link 48 készüléken. Tételek között ≥50% A különféle PD-L1 IHC expressziót mutató 16 NSCLC mintát (8 PD-L1 negatív és 8 PD-L1 pozitív) három példányban és háromféle készletszámú reagenskészlettel teszteltük az Autostainer Link 48 készüléken. Futtatásokon belül ≥50% A különféle PD-L1 IHC expressziót mutató 16 NSCLC mintát (10 PD-L1 negatív és 6 PD-L1 pozitív) egy futtatáson belül hat példányban teszteltük az Autostainer Link 48 készüléken. Napok közötti ≥50% A különféle PD-L1 IHC expressziót mutató 16 NSCLC mintát (10 PD-L1 negatív és 6 PD-L1 pozitív) egy napon végzett két futtatás során, három napon át teszteltük az Autostainer Link 48 készüléken. NPA= negatív százalékos egyezés; PPA= pozitív százalékos egyezés; OA=teljes egyezés

% egyezés (95%-os konfidencia-intervallum) NPA 100% (92,9-100%) PPA 100% (88,6-100%) OA 100% (95,4-100%) NPA 100% (92,7-100%) PPA 100% (88,6-100%) OA 100% (95,4-100%) NPA 100% (92,9-100%) PPA 100% (88,6-100%) OA 100% (95,4-100%) NPA 100% (92,6-100%) PPA 100% (92,6-100%) OA 100% (96,2-100%) NPA 100% (92,9-100%) PPA 100% (88,6-100%) OA 100% (95,4-100%) NPA 100% (88,3-100%) PPA 100% (82,4-100%) OA 100% (92,4-100%)

P03928HU_03/SK00621-2/2016.11 p. 12/14

8. táblázat: A három külső vizsgálóhelyen tesztelt PD-L1 IHC 22C3 pharmDx reprodukálhatósága (≥1%) Reprodukálhatósági vizsgálat Vizsgálóhelyek közötti

Diagnosztikai határérték

Vizsgálat elrendezése

≥1%

A különféle PD-L1 IHC expressziót mutató 36 NSCLC mintát (16 PD-L1 negatív és 20 PD-L1 pozitív) öt, nem egymást követő napon tesztelték. A vizsgálóhelyek közötti elemzést három vizsgálóhelyen, összesen 2700 páros összehasonlítás segítségével végezték. Vizsgálóhelyen belüli ≥1% A különféle PD-L1 IHC expressziót mutató 36 NSCLC mintát (16 PD-L1 negatív és 20 PD-L1 pozitív) öt, nem egymást követő napon tesztelték három vizsgálóhelyen. A vizsgálóhelyen belüli elemzést három vizsgálóhelyen, összesen 1080 páros összehasonlítás segítségével végezték. Megfigyelők közötti ≥1% A különféle PD-L1 IHC expressziót mutató, PD-L1 IHC 22C3 pharmDx készlet segítségével megfestett 62 NSCLC minta (28 PD-L1 negatív és 34 PD-L1 pozitív) pontozását három patológus végezte három, nem egymást követő napon, három vizsgálóhelyen. A megfigyelők közötti elemzést három vizsgálóhelyen, összesen 1674 páros összehasonlítás segítségével végezték. Egy megfigyelőn belüli ≥1% A különféle PD-L1 IHC expressziót mutató, PD-L1 IHC 22C3 pharmDx készlet segítségével megfestett 62 NSCLC minta (28 PD-L1 negatív és 34 PD-L1 pozitív) pontozását három patológus végezte három, nem egymást követő napon, három vizsgálóhelyen. Az egy megfigyelőn belüli elemzést három vizsgálóhelyen, összesen 558 páros összehasonlítás segítségével végezték. ANA=Átlagos negatív egyezés; APA=Átlagos pozitív egyezés; OA=Teljes egyezés

% egyezés (95%-os konfidencia-intervallum) ANA 94,8% (90,3-98,4%) APA 95,5% (91,2-98,7%) OA 95,2% (90,8-98,6%)

ANA 96,2% (94,1-97,5%) APA 96,7% (95,0-97,9%) OA 96,5% (95,2-97,4%)

ANA 85,8% (79,3-91,8%) APA 88,2% (82,2-93,3%) OA 87,1% (81,0-92,6%)

ANA 93,7% (90,0-96,1%) APA 94,8% (91,6-96,7%) OA 94,3% (92,0-95,9%)

9. táblázat: A három külső vizsgálóhelyen tesztelt PD-L1 IHC 22C3 pharmDx reprodukálhatósága (≥50%) Reprodukálhatósági vizsgálat Vizsgálóhelyek közötti

Diagnosztikai határérték ≥50%

Vizsgálat elrendezése

A különféle PD-L1 IHC expressziót mutató 36 NSCLC mintát (21 PD-L1 negatív és 15 PD-L1 pozitív) öt, nem egymást követő napon tesztelték. A vizsgálóhelyek közötti elemzést három vizsgálóhelyen, összesen 2700 páros összehasonlítás segítségével végezték. Vizsgálóhelyen belüli ≥50% A különféle PD-L1 IHC expressziót mutató 36 NSCLC mintát (21 PD-L1 negatív és 15 PD-L1 pozitív) öt, nem egymást követő napon tesztelték három vizsgálóhelyen. A vizsgálóhelyen belüli elemzést három vizsgálóhelyen, összesen 1080 páros összehasonlítás segítségével végezték. Megfigyelők közötti ≥50% A különféle PD-L1 IHC expressziót mutató, PD-L1 IHC 22C3 pharmDx készlet segítségével megfestett 62 NSCLC minta (30 PD-L1 negatív és 32 PD-L1 pozitív) pontozását három patológus végezte három, nem egymást követő napon, három vizsgálóhelyen. A megfigyelők közötti elemzést három vizsgálóhelyen, összesen 1674 páros összehasonlítás segítségével végezték. Egy megfigyelőn belüli ≥50% A különféle PD-L1 IHC expressziót mutató, PD-L1 IHC 22C3 pharmDx készlet segítségével megfestett 62 NSCLC minta (30 PD-L1 negatív és 32 PD-L1 pozitív) pontozását három patológus végezte három, nem egymást követő napon, három vizsgálóhelyen. Az egy megfigyelőn belüli elemzést három vizsgálóhelyen, összesen 558 páros összehasonlítás segítségével végezték. ANA=Átlagos negatív egyezés; APA=Átlagos pozitív egyezés; OA=Teljes egyezés

% egyezés (95%-os konfidencia-intervallum) ANA 90,3% (84,4–95,2%) APA 85,2% (75,6–92,9%) OA 88,3% (81,4-94,3%)

ANA 91,9% (88,8-94,8%) APA 87,6% (82,5-92,2%) OA 90,2% (86,3-93,7%) ANA 92,6% (87,8-96,7%) APA 92,8% (88,1-96,8%) OA 92,7% (88,1-96,8%)

ANA 96,4% (94,0-98,5%) APA 96,5% (94,3-98,6%) OA 96,4% (94,3-98,6%)

P03928HU_03/SK00621-2/2016.11 p. 13/14

Hibaelhárítás 10. táblázat: Hibaelhárítás Probléma 1. A tárgylemezek nem festődnek

Valószínű ok 1a. Programozási hiba. 1b. A DAB+ szubsztrát-kromogén oldat (DAB) reagens nem ad reakciót 1c. Nátrium–azid került a mosópufferbe.

2a. A minta tárgylemezei gyengén festődnek. 2b. A minta tárgylemezei vagy a Dako által mellékelt kontroll tárgylemezen lévő pozitív sejtvonal gyengén festődnek. 3. Erős háttérfestődés a lemezeken.

1d. A kontroll tárgylemez teljesítményének csökkenése 2a. Nem megfelelő fixálási módot alkalmaztak. 2b. Nem megfelelő antigénfeltárás. 3a. A paraffin nincs teljesen eltávolítva. 3b. A tárgylemezek kiszáradtak az Autostainer Link 48 készülékbe való betöltés közben. 3c. A reagensek nem specifikus kötődése a szövetmetszethez.

4. A szövet levált a tárgylemezekről. 5. Túlzottan erős specifikus festődés.

4. Nem megfelelő mikroszkópos tárgylemezek használata.

Javasolt teendő 1a. Győződjön meg arról, hogy a PD-L1 IHC 22C3 pharmDx program volt kiválasztva a tárgylemezek programozásához. 1b. Győződjön meg arról, hogy a DAB+ szubsztrátkromogén oldat reagens megfelelően volt elkészítve. 1c. Kizárólag Dako Wash Buffer (kódszám: S3006) reagenst szabad használni. 1d. Ellenőrizze a készlet csomagolásán feltüntetett lejárati időt és tárolási körülményeket. 2a. Gondoskodjon arról, hogy csak jóváhagyott fixálószert és fixálási módszert alkalmazzanak. 2b. Ellenőrizze, hogy a 3 az 1-ben előkezelési eljárást megfelelően végezték-e el. 3a. Ellenőrizze, hogy a 3 az 1-ben előkezelési eljárást megfelelően végezték-e el. 3b. Ügyeljen arra, hogy a tárgylemezeken elegendő puffer maradjon a betöltés alatt és a futtatás indítása előtt. 3c. Győződjön meg arról, hogy megfelelően végeztéke a minta megfelelő fixálását, illetve hogy nincs-e jelen nekrózis. 4. Használjon Dako FLEX IHC Microscope Slides (kód: K8020) tárgylemezeket vagy pozitív töltésű tárgylemezeket (például: Fisherbrand Superfrost Plus). 5a. Gondoskodjon arról, hogy csak jóváhagyott fixálószert és fixálási módszert alkalmazzanak. 5b. Kizárólag Dako Wash Buffer (kódszám: S3006) reagenst szabad használni. 6. Ez normális jelenség, és nem befolyásolja a festődést.

5a. Nem megfelelő fixálási módot alkalmaztak. 5b. Nem megfelelő mosópuffer használata. 6. A Target Retrieval Solution 6. Felmelegítéskor zavarossá válik a (antigénfeltáró oldat) reagens Target Retrieval Solution (antigénfeltáró felmelegítéskor zavarossá válik. oldat) reagens. MEGJEGYZÉS: Ha a probléma a fenti okok egyikének sem tulajdonítható, vagy ha az ajánlott korrekciós intézkedés nem oldja meg a problémát, további segítségért hívja a Dako műszaki szolgálatát. A festési módszerekre és minta-előkészítésre vonatkozó további információkat lásd: Dako Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods (5) (beszerezhető a Dako cégtől). Irodalomjegyzék 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13.

Keytruda® package insert. R. Phelps, et al., Journal of Cellular Biochemistry Supplement (1996) 24:32-91. Department of Health, Education and Welfare, National Institutes for Occupational Safety and Health, Rockville, MD. “Procedures for the decontamination of plumbing systems containing copper and/or lead azides.” DHHS (NIOSH) Publ. No. 78-127, Current 13. August 16, 1976. Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Protection of Laboratory Workers From Occupationally Acquired Infections; Approved Guideline – Third Edition. CLSI document M29-A3 [ISBN 1-56238-567-4]. Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087 – 1898 USA, 2000. Taylor CR and Rudbeck L. Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods. Sixth Edition. Dako, Carpinteria, California; 2013. Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCCLS). Quality assurance for Immunocytochemistry; Approved guideline. CLSI document MM4-A (1-56238-396-5) CLSI, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA; 1999. Omata M, Liew C-T, Ashcavai M, Peters RL. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B s surface antigen: a possible source of error in immunohistochemistry. Am J Clin Path 1980; 73:626. Garon EB, Rizvi NA, Hui R, Leighl N, Balmanoukian AS, Eder JP, et al. Pembrolizumab for the treatment of non-small-cell lung cancer. New Eng J Med 2015; 372:2018-28. Herbst RS, et al. Pembrolizumab versus docetaxel for previously treated, PD-L1-positive, advanced non-small-cell lung cancer (KEYNOTE-010): a randomised controlled trial. The Lancet online 2015 Dec 19. Okazaki T, Honjo T. PD-1 and PD-1 ligands: from discovery to clinical application. International Immunol 2007(19); 7:813. Brown JA, Dorfman DM, Ma F-R, Sullivan EL, Munoz O, Wood CR, et al. Blockade of Programmed Death-1 Ligands on Dendritic Cells Enhances T Cell Activation and Cytokine Production. J Immunol 2003; 170:1257. Cooper WA, Tran T, Vilain RE, Madore J, Seliger CI, Kohonen-Cornish M, et al. PD-L1 expression is a favorable prognostic factor in early stage non-small cell carcinoma. Lung Cancer 2015; 89:181. Chen B, Chapuy B, Ouyang J et al. PD-L1 Expression Is Characteristic of a Subset of Aggressive B-cell Lymphomas and VirusAssociated Malignancies. Clin Cancer Res 2013; 19:3462-3473.

Kiadás dátuma: 16/11 P03928HU_03/SK00621-2/2016.11 p. 14/14