PD-L1 IHC 28-8 pharmDx SK005 50 vizsgálat az Autostainer Link 48 berendezéshez Javasolt alkalmazás In vitro diagnosztikai használatra. A PD-L1 IHC 28-8 pharmDx egy kvalitatív, Monoclonal Rabbit Anti-PD-L1, Clone 28-8 antitestet alkalmazó immunhisztokémiai vizsgálat, mely a formalinnal fixált, paraffinba ágyazott (FFPE), nem laphámsejtes, nem-kissejtes tüdırákszövetekben (NSCLC) és melanómaszövetekben elıforduló PD-L1 protein detektálására használható az Autostainer Link 48 berendezésen található EnVision FLEX megjelenítırendszer segítségével. A PD-L1 fehérje expresszióját a bármely intenzitáson pozitív membránfestıdést adó tumorsejtek százalékos aránya határozza meg. A nem laphámsejtes NSCLC szövetekben a PD-L1 IHC 28-8 pharmDx segítségével detektált PD-L1 expresszió összefüggésben lehet az OPDIVO® (nivolumab) által eredményezett jobb túlélési aránnyal. A melanómaszövetekben a PD-L1 IHC 28-8 pharmDx segítségével detektált PD-L1 expresszió segítheti azoknak a betegeknek a felmérését, akiknek az esetében felmerül a kombinált OPDIVO®- (nivolumab) és YERVOY®-kezelés (ipilimumab). Összegzés és magyarázat A PD-1 ligandumok (PD-L1 és PD-L2) a T-sejtek PD-1 receptorhoz kötıdve gátolják a T-sejtek proliferációját és citokintermelését. Egyes tumorokban upregulálódnak a PD-1 ligandumok, és az ezen az útvonalon történı jelátvitel hozzájárulhat a tumorok T-sejtek által végzett aktív immunfelügyeletének (surveillance) gátlásához (1). Az OPDIVO® (nivolumab) egy humán immunglobulin G4 (IgG4) monoklonális antitest, amely a PD-1 receptorhoz kötıdik, és blokkolja annak PD-L1 és PD-L2 fehérjével való interakcióját, melynek eredményeképpen az immunválasz PD-1 jelátviteli útvonal által mediált gátlása jön létre, ideértve a tumorral szemben adott immunválasz gátlását is (2). Szingén egértumor modellekben a PD-1 aktivitás gátlása csökkent tumornövekedést eredményezett (3). Az OPDIVO® klinikai elınyeit és a PD-L1 IHC 28-8 pharmDx klinikai hasznosságát vizsgáltuk NSCLC- és melanómaszövetekben. Nem laphámsejtes NSCLC: A PD-L1 fehérjéket expresszáló tumorsejtek nem laphámsejtes, nem-kissejtes tüdırák-páciensmintákban történı detektálása arra utalhat, hogy az OPDIVO® (nivolumab) segítségével biztosított kezelés javíthatja a túlélési arányt. Az OPDIVO® Bristol-Myers Squibb által szponzorált klinikai vizsgálatában részt vevı páciensek mintáit a PD-L1 IHC 28-8 pharmDx segítségével vizsgáltuk. A CA209057 klinikai vizsgálat az OPDIVO® készítménnyel kezelt, nem laphámsejtes NSCLC páciensek PDL1 státuszának felmérésére szolgáló PD-L1 IHC 28-8 pharmDx klinikai validitását vizsgálták (5,11). Melanóma: A citotoxikus T-limfocita antigén-4 (CTLA-4) a T-sejt aktivitásának negatív regulátora. A YERVOY® (ipilimumab) monoklonális antitest, amely a CTLA-4-hez kapcsolódik és meggátolja a CTLA-4 kölcsönhatását a ligandumaival (CD80/CD86). Kimutatták, hogy a CTLA-4 blokádja megnöveli a T-sejt aktiválását és osztódását, ami hozzájárul a tumorellenes immunreakció általános megerısödéséhez (4). A PD-1 és a CTLA-4 kiegészítı és nem redundáns mechanizmusokon keresztül gátolja a tumorellenes immunitást. Az OPDIVO® monoterápia és az OPDIVO® + YERVOY® kombinált terápia jelentısen nagyobb javulást eredményezett a progressziómentes túlélésben YERVOY® monoterápia alkalmazásához képest olyan betegek esetében, akik elırehaladott melanómában szenvednek és korábban még nem részesültek kezelésben (8-10). A Bristol-Myers Squibb által szponzorált klinikai vizsgálatban részt vevı, OPDIVO® készítménnyel kezelt páciensek melanóma tumorszövetmintáit a PD-L1 IHC 28-8 pharmDx segítségével vizsgáltuk. A CA209067 számú klinikai vizsgálat az OPDIVO®, OPDIVO® + YERVOY® kombináció és a csak YERVOY® készítménnyel kezelt, melanómában szenvedı betegek PD-L1 expressziójának felmérésére szolgáló PD-L1 IHC 28-8 pharmDx klinikai validitását vizsgálta. Az OPDIVO® és a YERVOY® a Bristol-Myers Squibb védjegyei. Az eljárás elve A PD-L1 IHC 28-8 pharmDx az FFPE minták Autostainer Link 48 berendezésben és PT Link elıkezelı modullal végzett IHC festési eljárásához optimalizált reagenseket és protokollt tartalmazza (6). Az elsıdleges monoklonális PD-L1 antitesttel vagy a negatív kontroll reagenssel (NCR) végzett inkubálást követıen a mintákat az elsıdleges antitestet termelı fajra specifikus linker antitesttel, majd végül dextrán polimer vázhoz kötött másodlagos antitest molekulákból és torma-peroxidáz molekulákból álló, használatra kész megjelenítı reagenssel kell inkubálni. A következı lépésben hozzáadott kromogén enzimatikus konverziója látható reakciótermék kicsapódását eredményezi az antigén helyén. A kromogén erısítı reagens módosítja a kromogén reakció színét. Ezt követıen elvégezhetı a minta kontrasztfestése, majd a fedılemez felhelyezése. Az eredményeket fénymikroszkóp segítségével kell értelmezni. A festések validálása érdekében két formalinnal fixált, paraffinba ágyazott humán sejtvonalakat tartalmazó kontroll tárgylemezt is biztosítunk. Mellékelt anyagok PD-L1 IHC 28-8 pharmDx (kód: SK005) Az alább felsorolt anyagok 50 teszt elvégzésére elegendık (50 metszetet a PD-L1 elleni elsıdleges antitesttel kell inkubálni, 50 metszetet pedig a negatív kontroll reagenssel, ez összesen 100 metszet). A készletben további PD-L1 elleni elsıdleges antitestek találhatók 15 darab, sejtvonalakat tartalmazó kontroll lemez megfestéséhez. A tesztek száma azon alapul, hogy minden reagensbıl 2 x 150 µl-t kell használni metszetenként, kivéve a DAB+ és a Target Retrieval Solution (antigénfeltáró oldat) reagenst.
(129097-002)
P03914HU_02/SK00521-2/2016.04 1/17
A készlet legfeljebb 15 különálló futtatáshoz elegendı anyagot tartalmaz. Mennyiség 1 x 34,5 ml
Leírás Peroxidase-Blocking Reagent
PEROXIDASE-BLOCKING REAGENT Hidrogén-peroxidot, felületaktív anyagot (detergens) és 0,015 mol/l nátrium–azidot tartalmazó pufferelt oldat. 1 x 19,5 ml
Elsıdleges antitest: Monoclonal Rabbit Anti-PD-L1, Clone 28-8
MONOCLONAL RABBIT ANTI-PD-L1 CLONE 28-8 Monoklonális nyúl anti-PD-L1 antitest stabilizáló proteint és 0,015 mol/l nátrium-azidot tartalmazó pufferelt oldatban. 1 x 15 ml
Negative Control Reagent*
NEGATIVE CONTROL REAGENT Monoklonális nyúl kontroll IgG antitest stabilizáló proteint és 0,015 mol/l nátrium-azidot tartalmazó pufferelt oldatban. *A monoklonális nyúl kontroll IgG értékesítése a Cell Signaling Technology licence alapján történik. 1 x 34,5 ml
LINKER, Anti-Rabbit
LINKER, ANTI-RABBIT Nyúl immunglobulinok elleni egér szekunder antitest stabilizáló proteint és 0,015 mol/l nátrium-azidot tartalmazó pufferelt oldatban. 1 x 34,5 ml
Visualization Reagent-HRP
VISUALIZATION REAGENT-HRP Dextránhoz kötött peroxidáz molekulák és nyúl és egér immunglobulinok elleni kecske másodlagos antitest molekulák, stabilizáló proteint és antimikróbás szert tartalmazó pufferelt oldatban. 15 x 7,2 ml
DAB+ Substrate Buffer
DAB+ SUBSTRATE BUFFER Pufferelt oldat hidrogén-peroxiddal és antimikróbás szerrel. 1 x 5 ml
DAB+ Chromogen
DAB+ CHROMOGEN 3,3’-diaminobenzidin-tetrahidro-klorid szerves oldószerben. 1 x 34,5 ml
DAB Enhancer
DAB ENHANCER Réz-szulfát vízben. 6 x 30 ml
EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low pH (50x)
EnVision FLEX TARGET RETRIEVAL SOLUTION LOW pH (50X) Pufferelt oldat, pH 6,1, felületaktív anyaggal és antimikróbás szerrel. 15 lemez
PD-L1 IHC 28-8 pharmDx Control Slides (kontroll lemezek)
CONTROL SLIDES
XXXXX
PD-L1, SK005 pharmDx
Minden egyes lemez két pelletált, formalinban fixált, paraffinba ágyazott sejtvonal metszeteit tartalmazza: Az NCI-H226** pozitív PD-L1 protein expressziót mutat, míg az MCF-7 sejtvonal nem expresszálja a PD-L1 proteint.
MCF-7: PD-L1 negatív NCI-H226: PD-L1 pozitív
** Ezúton szeretnénk elismerni Dr. AF Gazdar és Dr. JD Minna (NIH) hozzájárulását az NCI-H226 (ATCC Number: CRL-5826™) sejtvonal kifejlesztéséhez (7) (129097-002)
P03914HU_02/SK00521-2/2016.04 2/17
Megjegyzés: A reagensek kifejezetten a készlettel való használatra készültek. A teszt leírt teljesítményének megırzése érdekében tilos bármiféle helyettesítést végezni, kivéve az EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low pH (50x) (kód: K8005) reagenst. A PD-L1 IHC 28-8 pharmDx az Autostainer Link 48 berendezéssel történı használatra készült. További információkért tekintse meg az Autostainer Link 48 és a PT Link használati útmutatóit. Szükséges, de nem biztosított anyagok PT Link Pre-treatment Module (kód: PT100/PT101) (elıkezelı modul) Autostainer Link 48 készülék (kód: AS480) EnVision FLEX Wash Buffer (20x) (kód: K8007) (mosópuffer) EnVision FLEX Hematoxylin (Link) (kód: K8008) Desztillált vagy ionmentes víz (reagens minıségő víz) Stopperóra Pozitív és negatív szövetek a folyamatok ellenırzéséhez (lásd a Minıség-ellenırzés címő részt és az 1. táblázatot) Mikroszkópos tárgylemezek: Dako FLEX IHC Microscope Slides (kód: K8020) tárgylemezek vagy Fisherbrand Superfrost Plus pozitív töltéső tárgylemezek Fedılemezek Tartós rögzítı közeg és segédreagensek a fedılemezek rögzítéséhez Fénymikroszkóp (4–40x optikai nagyítás) Óvintézkedések 1. In vitro diagnosztikai használatra. 2. Foglalkozásszerő felhasználóknak. 3. A termék nátrium-azidot (NaN3) tartalmaz, amely tiszta formában nagyon mérgezı vegyület. A termékben alkalmazott koncentrációkban, bár nem sorolható be veszélyes anyagként, a NaN reakcióba léphet az ólomból vagy rézbıl készült vízvezetékekkel, és erısen robbanékony fém-azidok felhalmozódásához vezethet. Kiöntéskor, a fém-azidok felhalmozódását megelızendı, nagy mennyiségő vízzel kell leöblíteni (12). 4. Az elsıdleges antitest, a negatív kontroll reagens, a linker és a megjelenítı reagens állati eredető anyagot tartalmaz. 5. A fixálás elıtt és után lévı mintákat, és a velük érintkezı anyagokat potenciális fertızéshordozóként kell kezelni, és a megfelelı óvintézkedéseket alkalmazva kell ártalmatlanítani (13). 6. A megadottól eltérı inkubálási idık, hımérsékletek vagy módszerek hibás eredményeket adhatnak. 7. A reagensek optimális koncentrációra vannak hígítva. További hígítás az antigénfestıdés elvesztését eredményezheti. 8. A megjelenítı reagens, a folyékony DAB+ kromogén és az elkészített DAB+ szubsztrát-kromogén károsodhat, ha túlzottan erıs fény éri. Ne tárolja a rendszer komponenseit és ne végezze a festést erıs fényben, például közvetlen napfényben. 9. A paraffinmaradvány álnegatív eredményeket okozhat. 10. A javasolttól eltérı reagenstérfogatok használata a látható PD-L1 immunreaktivitás elvesztését okozhatja. 11. A lemez 2/3-ára vagy nagyobb területre kiterjedı, nagymérető szövetmetszetek esetében elfordulhat, hogy 3x150 µl reagensre lesz szükség. 12. Általános szabály, hogy 18 év alatti személyek nem dolgozhatnak ezzel a termékkel. A felhasználót alaposan ki kell képezni a helyes munkavégzési eljárást, a termék veszélyes tulajdonságait és a szükséges biztonsági intézkedéseket illetıen. További információért tájékozódjon a biztonsági adatlapról (Safety Data Sheet, SDS). 13. A szemmel és bırrel való érintkezés elkerülésére viseljen megfelelı személyi védıfelszerelést. 14. A fel nem használt oldatot a helyi, területi, nemzeti és nemzetközi hatósági elıírásoknak megfelelıen kell megsemmisíteni. 15. Foglalkozásszerő felhasználók részére igény esetén anyagbiztonsági adatlapot biztosítunk. 3
Veszély DAB+ kromogén: 1–5% bifenil-3,3’,4,4’-tetrailtetraammónium-tetraklorid H350 Rákot okozhat. H341 Feltehetıen genetikai károsodást okoz. P201 Használat elıtt ismerje meg az anyagra vonatkozó különleges utasításokat. P202 Ne használja addig, amíg az összes biztonsági óvintézkedést el nem olvasta és meg nem értette. P280 Védıkesztyő használata kötelezı. Szemvédı vagy arcvédı használata kötelezı. Védıruha használata kötelezı. P308 + P313 Expozíció vagy annak gyanúja esetén: Orvosi ellátást kell kérni. P405 Elzárva tárolandó. P501 A tartalom és az edényzet hulladékként történı elhelyezését a helyi, regionális, országos és nemzetközi szabályozásokkal összhangban kell elvégezni.
Figyelmeztetés EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low pH (50x): 1-5% citromsav H319 Súlyos szemirritációt okoz. H411 Mérgezı a vízi élıvilágra, hosszan tartó károsodást okoz. P280 Szemvédı vagy arcvédı használata kötelezı. P273 Kerülni kell az anyag környezetbe jutását. P264 A használatot követıen a kezet alaposan meg kell mosni. P305 + P351 + P338 SZEMBE KERÜLÉS ESETÉN: Több percig tartó óvatos öblítés vízzel. Adott esetben a kontaktlencsék eltávolítása, ha könnyen megoldható. Az öblítés folytatása. P337 + P313 Ha a szemirritáció nem múlik el: Orvosi ellátást kell kérni. P501 A tartalom és az edényzet hulladékként történı elhelyezését a helyi, regionális, országos és nemzetközi szabályozásokkal összhangban kell elvégezni. (129097-002)
P03914HU_02/SK00521-2/2016.04 3/17
Tárolás A PD-L1 IHC 28-8 pharmDx összetevıit, beleértve a kontroll lemezeket, az eredeti tartályában, sötét helyen, 2–8 °C h ımérsékleten kell tárolni, amikor nincsenek használatban az Autostainer Link 48 berendezésben. Ne használja a készletet a dobozon feltüntetett lejárati idın túl. Ha a reagenseket a jelen tájékoztatóban leírtaktól eltérı feltételek között tárolják, akkor a felhasználó köteles a feltételeket validálni. Nincsen nyilvánvaló jel, amely a termék instabilitására utalna, ezért a páciens mintáival egyidejőleg egy pozitív és egy negatív kontroll vizsgálatát is el kell végezni. Minták elıkészítése A mintákat úgy kell kezelni, hogy a szövet alkalmas maradjon IHC festésre. A mintákat a szabványos szövetfeldolgozási módszerekkel kell feldolgozni. Paraffinba ágyazott metszetek Formalinban fixált, paraffinba ágyazott szövetek használhatók. A javasolt kezelési és feldolgozási körülmények a következık: <30 perc ischaemiás idı a fixálószerben történı elmerítést megelızıen, és 24–48 órás fixálási idı 10%-os neutrális pufferelt formalinban. Egyéb fixálószereket nem validáltunk, így azok hibás eredményeket adhatnak. A mintákból készített 3 vagy 4 mm vastagságú blokkot 10%-os neutrális pufferelt formalinnal kell fixálni, alkoholsorral vízteleníteni és xilollal mosni, majd végül olvasztott paraffinnal átitatni. A paraffin hımérséklete nem haladhatja meg a 60 °C-ot. A szövetmintákat 4-5 µm-es metszetekre kell vágni. A metszetkészítést követıen a szöveteket pozitív töltéső Fisherbrand Superfrost Plus tárgylemezekre vagy Dako FLEX IHC mikroszkópos tárgylemezekre (kód: K8020) kell rögzíteni, majd 1 órán át 58 ± 2 °C-os süt ıben inkubálni. Az antigenitás megırzése érdekében a tárgylemezre rögzített szövetmetszeteket sötét helyen, 2–8 °C-os h ımérsékleten, vagy legfeljebb 25 °C-os szobah ımérsékleten kell tárolni, és a metszetkészítést követı 4 hónapon belül meg kell festeni. A szövetek épségének és antigenitásának megırzése érdekében a rögzítést követıen tilos a tárgylemezeket 25 °C-ot meghaladó h ımérsékleten tárolni vagy kezelni. A PD-L1 IHC 28-8 pharmDx készlet kalciummentesített szöveteken történı használatát nem validáltuk, ezért az nem ajánlott. A reagens elıkészítése A festés elıtt a következı reagenseket kell elkészíteni: EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low pH (50x) Készítsen megfelelı mennyiségő 1x Target Retrieval Solution, Low pH reagenst a Target Retrieval Solution, Low pH (50x) reagens 1:50 arányú hígításával. Használjon reagens minıségő vizet. Az 1x Target Retrieval Solution elıírt pH értéke: 6,1 ± 0,2. A Target Retrieval Solution, Low pH (50x) reagens egy darab 30 ml-es palackjának tartalmát 1:50 hígítva 1,5 l 1x reagens áll rendelkezésre, amelyet a PT Link tartályba töltve egy alkalommal legfeljebb 24 tárgylemez kezeléséhez elegendı. Három használat, illetve a hígítást követı 5 nap után öntse ki az 1x Target Retrieval Solution oldatot. Szükség szerint további EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low pH (50x) rendelhetı a K8005 kódszámot használva. EnVision FLEX Wash Buffer (20x) Készítsen elı megfelelı mennyiségő Wash Buffer reagenst a Wash Buffer (20x) reagens 1:20 arányú hígításával. Használjon reagens minıségő vizet. A fel nem használt oldatot 2–8 ºC-on legfeljebb egy hónapig lehet tárolni. Ha zavaros a puffer, semmisítse meg. További információkért tekintse meg az Autostainer Link 48 használati útmutatóját. Az EnVision FLEX Wash Buffer (20x) reagens a K8007 kódszámon rendelhetı. DAB+ szubsztrát-kromogén oldat A használat elıtt az oldatot alaposan fel kell keverni. Az oldatban létrejövı csapadék nem befolyásolja a festés minıségét. A DAB+ szubsztrát-kromogén oldat elkészítéséhez adjon 1 csepp folyékony DAB+ kromogén reagenst egy ml DAB+ szubsztrát puffer reagenshez, majd keverje össze. Az elkészített szubsztrát-kromogén reagens sötétben, 2-8 °C h ımérsékleten történı tárolás esetén 5 napig marad stabil. Fontos megjegyzések: • Ha a DAB+ szubsztrát puffer üveg teljes tartalmát használja, adjon hozzá 9 csepp DAB+ kromogént. A címke szerint az üveg tartalma 7,2 ml, ez azonban a használható tartalomra értendı, és nem foglalja magában az üveg „holttérfogatát“. • A palackban lévı folyékony DAB+ kromogén színe átlátszótól levendula vagy lilásbarna színig változhat. Ez nem befolyásolja a termék teljesítményét. A hígítást a fenti utasításoknak megfelelıen végezze el. Amennyiben túl nagy mennyiségő folyékony DAB+ kromogén reagenst ad hozzá a DAB+ szubsztrát puffer reagenshez, azzal csökkenti a pozitív jelet. Az Autostainer Link 48 készüléken végzett festési eljárás Az eljárással kapcsolatos megjegyzések A felhasználó használat elıtt gondosan olvassa el az utasításokat, és ismerkedjen meg minden komponenssel és készülékkel (lásd: Óvintézkedések). Az immunfestés elıtt a reagenseket hagyja szobahımérsékletre (20–25 °C) melegedni. A további inkubál ásokat is szobahımérsékleten kell végezni. Ne hagyja, hogy a festés során a szövetmetszetek kiszáradjanak. A kiszáradt metszeteken nagyobb mértékő lehet a nem specifikus festıdés. (129097-002)
P03914HU_02/SK00521-2/2016.04 4/17
A szükséges lépések és inkubációs idık elıre be van programozva a Dako Link szoftverben. A programozási protokollokkal és a tárgylemezek és a reagensek behelyezésével kapcsolatos további információkért tekintse meg az Autostainer Link 48 és a PT Link használati útmutatóját. Megjegyzés: A jelen rendszerhez mellékelt reagensek és instrukciók a javasolt reagensekkel és anyagokkal történı használat esetén optimális teljesítményt biztosítanak. A reagensek további hígítása, illetve az inkubálási idı vagy a hımérséklet megváltoztatása hibás vagy ellentmondó eredményeket adhat. Festési protokoll A DakoLink legördülı menüben válassza ki a PD-L1 IHC 28-8 pharmDx festési protokollt. A festéshez szükséges lépések és az inkubálási idık elıre be vannak programozva a DakoLink szoftverbe. Amennyiben a megfelelı PD-L1 IHC 28-8 pharmDx protokollok nem találhatók meg az Ön szerverén, kérjük, vegye fel a kapcsolatot a helyi mőszaki szervizképviselettel. 1. lépés: Deparaffinizálás, rehidratálás és antigénfeltárás (3 az 1-ben) eljárás Javasolt eljárás: A részletekkel kapcsolatban lásd a PT Link felhasználói útmutatóját. Állítsa a PT Link (kód: PT100/PT101) Preheat (Elımelegítés) és Cool (Hőtés) értékét 65 °C-ra. Állítsa be a Heat (Melegítés ) értékét 97 °C-ra, az id ıt pedig 20 percre. ►Töltse fel a PT Link tartályait egyenként 1,5 l Target Retrieval Solution, Low pH, 1x munkaoldattal úgy, hogy elfedje a szövetmetszeteket. ►Melegítse elı a Target Retrieval Solution reagenst 65 °C-ra. ►Merítse be a rögzített FFPE szövetmetszeteket tartalmazó Autostainer állványokat az elımelegített Target Retrieval Solution, Low pH, 1x munkaoldatba a PT Link tartályban. Inkubálja 20 percig 97 °C h ımérsékleten. ►Amint befejezıdött az antigénfeltáró inkubálás és a hımérséklet visszahőlt 65 °C-ra, távolítsa el a tárgylemezeket tartalma zó Autostainer tárgylemezállványokat a PT Link tartályából, és azonnal helyezze a tárgylemezeket tartalmazó Autostainer tárgylemezállványt a hígított, szobahımérséklető Wash Buffer (kód: K8007) reagenst tartalmazó tartályba (pl. PT Link Rinse Station, kód: PT109). ►Hagyja a tárgylemezeket hígított, szobahımérséklető Wash Buffer reagensben 5 percig. 2. lépés: Festési eljárás A deparaffinizálás, rehidratálás és antigénfeltárás (3 az 1-ben) eljárást követıen helyezze a tárgylemezeket tartalmazó Autostainer állványokat az Autostainer Link 48 készülékbe. Ügyeljen arra, hogy a tárgylemezeken elegendı puffer maradjon a betöltés alatt és a futtatás indítása elıtt. A készülék a megfelelı reagens hozzáadásával elvégzi a festési eljárást, követi az inkubációs idıt, és leöblíti a tárgylemezeket a reagensek között. A reagens alkalmazási idıtartamai elıre be vannak programozva a Dako Link szoftverében. 3. lépés: Kontrasztfestés A tárgylemezek kontrasztfestését EnVision FLEX Hematoxylin (Link) (kód: K8008) reagenssel kell végezni 7 percig. A hematoxilin inkubációs ideje elıre be van programozva a protokollba. 4. lépés: Rögzítés Nem víz alapú, tartós rögzítıközeget kell használni. Megjegyzés: Idıvel némi fakulás elıfordulhat a megfestett tárgylemezeken. Ez többféle tényezıtıl függ, például a kontrasztfestéstıl, az alkalmazott rögzítıközegektıl és módszerektıl, valamint a tárgylemezek tárolásának körülményeitıl. A fakulás minimálisra csökkentése érdekében a lemezeket sötét helyen, szobahımérsékleten (20–25 °C között) kell tárolni. Minıség-ellenırzés A PD-L1 IHC 28-8 pharmDx készlet reagenseinek minıség-ellenırzését a fent leírt antigénfeltárási és festési eljárásokat alkalmazó immunhisztokémiai eljárás segítségével végeztük. Amennyiben a felhasználó laboratóriuma eltér az ajánlott fixálási, feldolgozási és beágyazási eljárásoktól, az jelentıs bizonytalanságot okozhat az eredményekben. Minden egyes festési futtatás esetén mellékelni kell minıségbiztosítási kontrollokat. Ezen minıségbiztosítási kontrollokat az 1. táblázat tartalmazza, többek között a következıket: egy H&E festett páciens-szövetminta; labor által biztosított negatív és pozitív kontroll szövetek; és egy Dako által biztosított kontroll tárgylemez (15). Az Egyesült Államokban további információkért lásd a College of American Pathologists (CAP) immunhisztokémiai minısítı programjának minıség-ellenırzési követelményeit és a CLSI immuncitokémiai minıségbiztosítás elfogadott irányelveit (14). A teszt igazolása A festırendszer diagnosztikai eljárásban történı elsı felhasználása elıtt a felhasználónak ellenıriznie kell a teszt teljesítményét. Ehhez ismert pozitív és negatív szöveteket képviselı, ismert immunhisztokémiai (IHC) teljesítményjellemzıkkel rendelkezı, laboratórium által biztosított mintasorozaton kell igazolnia a tesztet. Tekintse meg a terméktájékoztató jelen fejezetében korábban ismertetett minıségellenırzési eljárásokat. Ezeket a minıség-ellenırzési eljárásokat minden új készletnél, illetve a teszt paramétereinek megváltozásakor meg kell ismételni. A potenciális problémákat, azok okait és a lehetséges korrekciós intézkedéseket a 12. táblázatban ismertetjük. A festés értelmezése – Nem laphámsejtes NSCLC és melanóma A tárgylemez kiértékelését patológusnak kell elvégeznie fénymikroszkóp segítségével. A PD-L1 immunhisztokémiai festés értelmezése és értékelése céljából a teljes minta kezdeti felméréséhez 4x-es, míg az ezt követı értékeléshez 10–20x-os nagyítású objektívet lehet használni (szükség esetén az ellenırzéshez pedig 40x-es objektívet). A PD-L1 festést egy barna (3,3’-diaminobenzidin, DAB) reakciótermék jelzi. A daganatsejtek teljes kerületén észlelhetı és/vagy a kerület mentén részlegesen megjelenı lineáris membránfestıdés bármilyen intenzitás esetén pozitív PD-L1 festıdést jelez. A teljes mintát ki kell értékelni. A PD-L1 pontszám értelmezése során a teljes PD-L1 festett betegszövetet tartalmazó tárgylemez valamennyi életképes daganatsejtjét értékelni kell és be kell vonni az értelmezésbe. A megfestett sejtek százalékos arányának meghatározásához minimálisan 100 életképes tumorsejtnek kell lennie a PD-L1 festett betegszövetet tartalmazó tárgylemezen. Ha elıfordul, a citoplazma-festıdést nem kell beleszámolni az életképes sejtek közé. A jóindulatú sejtek és az immunsejtek (pl. az infiltráló limfociták vagy a makrofágok) szintén festıdhetnek a PD-L1 hatására; ezeket azonban nem szabad figyelembe venni a PD-L1 pozitivitást meghatározó pontozás során. (129097-002)
P03914HU_02/SK00521-2/2016.04 5/17
MEGJEGYZÉS: Melanóma betegminták értelmezésekor barna színő melaninpigmentáció lehet jelen. A plazmamembrán festıdésének értékelésekor ki kell zárni a melanint; a melanintartalom felismerésében és kizárásában segítséget nyújthat egy NCR reagenssel festett lemezsorozattal való összehasonlítás. Ha a melanin nagyon magas koncentrációja eleve kizárja a tumorsejtek plazmamembránfestésének értékelését, a mintát ki kell zárni az értelmezésbıl és határozatlannak kell minısíteni. A tárgylemezeket minden festési futtatás során az 1. táblázatban megadott sorrendben kell megvizsgálni a festési menet érvényességének meghatározásához és a szövetminta festıdésének kiértékeléséhez. További információkért tekintse meg a PD-L1 IHC 28-8 pharmDx Interpretation Manual for Non-Squamous Non-Small Cell Lung Cancer or for Melanoma címő kiadványt. 1. táblázat: A tárgylemezek értékelésének javasolt sorrendje Minták Magyarázat Követelmények 1. H&E Elsı lépésként a hematoxilin és A PD-L1 IHC 28-8 pharmDx tesztet és a H&E festést a minta ugyanazon eozin (H&E) segítségével festett paraffinblokkjából származó sorozatmetszeteken kell elvégezni. (A labor biztosítja) szövetminták kiértékelését kell elvégezni a szövettan és a A szövetmintáknak épnek, megfelelıen prezervált állapotúnak kell lenniük, prezervációs minıség felmérése továbbá alkalmasnak kell lenniük a tumor jelenlétének megerısítésére. érdekében. 2. Kontroll lemez A PD-L1 IHC 28-8 pharmDx Minden egyes festési futtatás során meg kell festeni egy kontroll tárgylemezt az készletben található elsıdleges elsıdleges PD-L1 antitesttel. (A Dako biztosítja) PD-L1 antitesttel festett kontroll lemezeket meg kell vizsgálni NCI-H226 (PD-L1 pozitív kontroll sejtvonal) elfogadási kritériumai: annak ellenırzése érdekében, • Plazmamembrán-festıdés a sejtek ≥80%-ában, ≥2+ átlagos festıdési hogy minden reagens megfelelıen intenzitás. mőködik-e. • Nem specifikus festıdés intenzitása <1+. A kontroll tárgylemez PD-L1pozitív sejtvonalpelletet és PD-L1negatív sejtvonalpelletet tartalmaz.
3. Pozitív kontrollszöveteket tartalmazó tárgylemezek (A labor biztosítja)
Következı lépésként az elsıdleges PD-L1 antitesttel és a negatív kontroll reagenssel egyaránt megfestett pozitív kontrollszöveteket tartalmazó tárgylemezeket kell megvizsgálni. Ezek a tárgylemezek igazolják, hogy hatékony volt a fixálási módszer és az antigénfeltáró folyamat. Az ismert pozitív kontroll szöveteket kizárólag a feldolgozott szövetek és tesztreagensek megfelelı teljesítményének ellenırzésére szabad használni, a páciensek mintáinak specifikus diagnosztizálásához NEM használhatók.
MCF-7 (PD-L1 negatív kontroll sejtvonal) elfogadási kritériumai: • Nincs specifikus festıdés. • Nem specifikus festıdés intenzitása <1+. Felhívjuk figyelmét, hogy esetenként megfigyelhetı az MCF-7 sejtpellet néhány sejtjének festıdése. A következı elfogadási kritériumok alkalmazandók: elfogadható, ha a jellegzetes plazmamembrán-festıdést mutató sejtek összes száma ≤10, vagy ha az MCF-7 sejtpellet határain belül ≥1+ intenzitású citoplazmafestıdés van jelen. Ha bármelyik kontroll sejtvonal nem felel meg a fenti kritériumoknak, akkor a páciens mintáinak összes eredményét érvénytelennek kell tekinteni. A kontrolloknak a páciens mintájával megegyezı daganatot tartalmazó biopsziás vagy sebészeti mintának kell lenniük, a páciens mintájával vagy mintáival azonos módon, a lehetı leggyorsabban fixálva, feldolgozva és beágyazva. A festıdés értelmezéséhez használjon ép mintákat, mivel a nekrotikus vagy degenerált sejtek esetében gyakori a nem specifikus festıdés. A pozitív kontrollként használt szöveteknek PD-L1 festés esetén gyenge vagy közepes festıdést kell mutatniuk, ily módon ki tudják mutatni a teszt érzékenységének kismértékő változásait. Minden egyes festési futtatásba két pozitív kontrollszövetet tartalmazó tárgylemezt kell bevonni. PD-L1 anyaggal festett tárgylemez: Barna színő membránfestıdés jelenlétét kell megfigyelni. A nem specifikus festıdés legyen ≤1+. Negatív kontroll reagenssel festett tárgylemezek: Nincs membránfestıdés. A nem specifikus festıdés legyen ≤1+. Ha a pozitív kontroll szövetek nem mutatnak megfelelı pozitív festıdést, a tesztminták eredményeit érvénytelennek kell tekinteni.
(129097-002)
P03914HU_02/SK00521-2/2016.04 6/17
4. Negatív kontrollszöveteket tartalmazó tárgylemezek (A labor biztosítja)
5. Negatív kontrollreagens használatával festett páciensszöveteket tartalmazó tárgylemez
6. Elsıdleges PD-L1 antitesttel megfestett páciensszöveteket tartalmazó tárgylemez
A következı lépésben az elsıdleges PD-L1 antitesttel és a negatív kontroll reagenssel egyaránt megfestett, negatív kontrollszöveteket tartalmazó (más néven PD-L1 negatív) tárgylemezeket kell vizsgálni annak igazolására, hogy az elsıdleges antitest specifikusan jelöli a célantigént. Emellett a pozitív kontroll szövet negatív részei negatív kontroll szövetként is szolgálhatnak, de ezt a felhasználónak igazolnia kell.
Vizsgálja meg a PD-L1 IHC 28-8 pharmDx készletbıl származó negatív kontroll reagenssel megfestett páciensmintákat. A negatív kontroll reagens az elsıdleges antitest helyett kerül alkalmazásra, mely segít az antigén helyén történı specifikus festés értelmezésében. Utolsó lépésként a PD-L1 IHC 288 pharmDx készletben lévı elsıdleges PD-L1 antitesttel megfestett páciensmintákat tartalmazó teljes tárgylemezt vizsgálja meg. A PD-L1 IHC 28-8 pharmDx immunreaktivitásával kapcsolatos specifikus információkért tekintse meg az Összefoglaló és magyarázat, a Korlátozások és a Teljesítményjellemzık címő fejezeteket.
A kontrolloknak a páciens mintájával megegyezı daganatot tartalmazó biopsziás vagy sebészeti mintának kell lenniük, a páciens mintájával vagy mintáival azonos módon, a lehetı leggyorsabban fixálva, feldolgozva és beágyazva. Minden egyes festési futtatásba két negatív kontrollszövetet tartalmazó tárgylemezt kell bevonni. PD-L1 anyaggal festett tárgylemez: A tumorsejtek esetén nincs membránfestıdés. A nem specifikus festıdés legyen ≤1+. Negatív kontroll reagenssel festett tárgylemezek: Nincs membránfestıdés. A nem specifikus festıdés legyen ≤1+. Amennyiben a negatív kontrollszöveteket tartalmazó tárgylemezeken specifikus plazmamembrán-festıdés figyelhetı meg, a páciensminta eredményeit érvénytelennek kell tekinteni. A plazmamembrán-festıdés hiánya igazolja, hogy az elsıdleges PD-L1 antitest specifikusan jelöli a célantigént. A nem specifikus festıdés legyen ≤1+.
A pozitív festıdés intenzitását az ugyanahhoz a futtatáshoz tartozó negatív kontroll reagens tárgylemezen megfigyelt nem specifikus háttérfestıdés figyelembe vételével kell értékelni. Mint minden immunhisztokémiai teszt esetén, itt is igaz, hogy a negatív eredmény csupán azt jelenti, hogy az antigén nem volt detektálható, és nem azt, hogy az antigén nem volt jelen a vizsgálatba bevont sejtekben/szövetekben. A PD-L1 pontszám értelmezése során a teljes PD-L1 festett betegszövetet tartalmazó tárgylemez valamennyi életképes daganatsejtjét értékelni kell és be kell vonni az értelmezésbe. A megfestett sejtek százalékos arányának meghatározásához minimálisan 100 életképes tumorsejtnek kell lennie a PD-L1 festett betegszövetet tartalmazó tárgylemezen.
Általánosan érvényes korlátozások 1. Az immunhisztokémia többlépcsıs diagnosztikai folyamat, amely speciális képzést igényel a megfelelı reagensek kiválasztása, a szövetek kiválasztása, fixálása és feldolgozása, az immunhisztokémiai tárgylemez elıkészítése és a festıdési eredmények értelmezése területén. 2. A szövet festıdése függ a festést megelızı kezeléstıl és elıkészítéstıl. A nem megfelelıen végzett fixálás, fagyasztás, kiolvasztás, mosás, szárítás, melegítés és metszés, illetve a más szövetekkel és folyadékokkal történı szennyezés mőtermékeket, elégtelen antitestfeltárást vagy álnegatív eredményeket okozhat. Az ellentmondó eredmények oka a fixálási és beágyazási módszerek eltérései, illetve a szövetben eredendıen jelen lévı szabálytalanságok lehetnek. 3. A túlzott vagy elégtelen kontrasztfestés veszélyeztetheti az eredmények megfelelı értelmezését. 4. A pozitív festıdés, illetve a pozitív festıdés hiányának klinikai értelmezését a klinikai tünetek, a morfológia és egyéb hisztopatológiai kritériumok figyelembe vételével kell végezni. A festıdés, vagy a festıdés hiányának klinikai értelmezését morfológiai vizsgálatokkal és megfelelı kontrollokkal, valamint egyéb diagnosztikai vizsgálatokkal kell kiegészíteni. A festett tárgylemez értelmezése az alkalmazott antitesteket, reagenseket és módszereket jól ismerı képesített patológus feladata. A festést tanúsított és engedélyezett laboratóriumban kell végezni, a festett tárgylemezek felülvizsgálatáért és a pozitív és negatív kontrollok megfelelıségének biztosításáért felelıs patológus felügyelete alatt. 5. A hepatitisz B vírussal fertızött személyektıl származó, hepatitisz B felületi antigént (HBsAg) tartalmazó szövetek torma-peroxidáz alkalmazásakor nem specifikus festıdést mutathatnak (15). 6. A daganatok és más patológiás szövetek antigén-expressziójának biológiai variabilitása miatt a váratlan reakciók lehetıségét nem lehet teljesen kizárni a tesztelt szövettípusok esetében. Értesítse a Dako technikai támogató csoportját, ha váratlan reakciókat észlel. 7. A proteinek vagy szubsztrát reakciótermékek nem immunológiai jellegő kötıdése álpozitív eredményeket adhat. Ugyancsak álpozitív eredményt adhat a pszeudoperoxidáz aktivitás (eritrociták) vagy endogén peroxidáz aktivitás (citokróm c) (14). 8. A rendszerhez biztosított reagenseket és útmutatásokat optimális teljesítmény eléréséhez alakítottuk ki. A reagensek további hígítása, illetve az inkubálási idı vagy a hımérséklet megváltoztatása hibás vagy ellentmondó eredményeket adhat. Termékspecifikus korlátozások 1. A hamis negatív eredményeket okozhatja az, hogy az antigén idıvel lebomlik a szövetekben. A tárgylemezre rögzített szövetmetszeteket sötét helyen, 2–8 °C-os h ımérsékleten, vagy legfeljebb 25 °C-os szobah ımérsékleten kell tárolni, és a metszetkészítést követı 4 hónapon belül meg kell festeni. A szövetek épségének és antigenitásának megırzése érdekében a rögzítést követıen tilos a tárgylemezeket 25 °C-ot meghaladó h ımérsékleten tárolni vagy kezelni. 2. Az optimális és reprodukálható eredmények érdekében a PD-L1 protein antigénfeltáró elıkezelést igényel a szövetek rutinszerő fixálása (semleges pufferelt formalin) és paraffinba ágyazása során. (129097-002)
P03914HU_02/SK00521-2/2016.04 7/17
3. A reagenseket nem szabad eltérı tételszámú készletekbıl vagy más gyártóktól származó készletekbıl pótolni. Az egyetlen kivétel az EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low pH (50x), amely szükség szerint a K8005 kódszámot használva rendelhetı. 4. A megfestett kontroll sejtvonalak csak a festési futtatás validálására használhatók, a szövetmetszetek festıdési reakciójának pontozására viszont nem. 5. A PD-L1 IHC 28-8 pharmDx használatát a 10%-os neutrális pufferelt formalinon kívül más fixálószerrel fixált szöveteken nem validáltuk. 6. Az excíziós, incíziós, punch- vagy vastagtő-biopsziával nyert mintatípusok elfogadhatónak bizonyultak a PD-L1 IHC 28-8 pharmDx készletet használó klinikai vizsgálatok számára. A vékonytő-biopsziával levett vagy egyéb citológai minták nem voltak megfelelıek a biomarker-elemzéshez, ezért kikerültek a PD-L1 IHC 28-8 pharmDx készletet használó klinikai vizsgálatokból. A nem klinikai teljesítmény értékelése A PD-L1 IHC 28-8 pharmDx analitikai specificitása A PD-L1 IHC 28-8 pharmDx elsıdleges antiteste egy nyúl monoklonális anti-humán PD-L1 antitest, a clone 28-8. Az antitest elıállításához használt immunogén a humán PD-L1 extracelluláris doménjét (Phe19-Thr239) tartalmazó, tisztított rekombináns humán PD-L1. Az elsıdleges PD-L1 antitesttel történı IHC festés nem mutatott keresztreaktivitást a kínai hörcsög ovárium (CHO) sejtek által exogén módon expresszált PD-L2-vel. A PD-L1 IHC 28-8 pharmDx kifejezetten az FFPE szövetekben lévı tumorsejtekben expresszált PD-L1 membránfehérje detektálására szolgál, amely a PD-L1 antigén hozzáadásával teljesen megszüntethetı. A PD-L1 IHC 28-8 pharmDx nem képes detektálni a PD-L1 membránfehérjét olyan PD-L1 knock-out tumorsejtekben, amelyben a PD-L1 gént genetikailag törölték. Normál és daganatos szövetek A 2. táblázat a Monoclonal Rabbit Anti-Human PD-L1 antitest immunreaktivitását foglalja össze a normál szöveteket tartalmazó javasolt panelen. A 3. táblázat a Monoclonal Rabbit Anti-Human PD-L1 antitest immunreaktivitását foglalja össze daganatos szövetek esetén több különféle tumort tartalmazó microarray vizsgálatokban. Minden szövet formalinban fixált, paraffinba ágyazott volt, és a tájékoztatóban leírt módon festették meg PD-L1 IHC 28-8 pharmDx reagenssel. A PD-L1 IHC 28-8 pharmDx által detektált PD-L1 fehérje olyan típusú sejtek membránjában található, amelyek ismerten a PD-L1 antigén expressziójára képesek, mint pl. az immunsejtek és az epithelialis eredető, fıként tumorsejtek sejtjei. 2. táblázat: A PD-L1 IHC 28-8 pharmDx normál szöveteken mért reaktivitásának összefoglalása Szövettípus Pozitív plazmamembrán-festıdés: Pozitív citoplazma-festıdés: (vizsgált #) Szövetelemek Szövetelemek Agyalapi mirigy (3) 1/3 adenohipofízis elülsı lebenye 1/3 adenohipofízis elülsı lebenye 3/3 neurohipofízis hátulsó lebenye Bır (3) 0/3 1/3 epithelium Csecsemımirigy (3) 3/3 medulla epithelium 0/3 Csontvelı (3) 3/3 megakariociták 3/3 megakariociták Emlı (3) 0/3 0/3 Gyomor (3) 0/3 0/3 Hasnyálmirigy (3) 3/3 epithelium (fıként szigetsejtek) 3/3 epithelium (fıként szigetsejtek) Here (3) 0/3 1/3 Leydig-sejtek Kisagy (3) 0/3 0/3 Lép (3) 1/3 makrofágok 0/3 3/3 litorális sejt Máj (3) 2/3 immunsejtek 2/3 immunsejtek Mandula (3) 3/3 crypta epithelium 0/3 3/3 csíraközpont (immunsejtek) Méh (3) 0/3 0/3 Méhnyak (3) 1/3 epithelium 1/3 epithelium Mellékpajzsmirigy (3) 3/3 epithelium 0/3 Mellékvese (3) 3/3 velıállomány sejtek 3/3 velıállomány sejtek Mezoteliális sejtek (3) 0/3 0/3 Nagyagy (3) 0/3 0/3 Nyálmirigy (3) 0/3 0/3 Nyelıcsı (3) 0/3 0/3 Pajzsmirigy (3) 0/3 0/3 Perifériás ideg (3) 0/3 0/3 Petefészek (3) 0/3 0/3 Prosztata (2) 0/2 0/2 Szívizom (3) 0/2 0/2 Tüdı (3) 3/3 alveoláris makrofágok 0/3 Vastagbél (3) 2/3 makrofágok 0/3 Vázizom (3) 0/2 0/2 Vékonybél (2) 0/2 0/2 Vese (3) 3/3 tubulus epithelium 3/3 tubulus epithelium
(129097-002)
P03914HU_02/SK00521-2/2016.04 8/17
3. táblázat: A PD-L1 IHC 28-8 pharmDx daganatos szöveteken mért reaktivitásának összefoglalása Tumor típusa Elhelyezkedés / Szerv PD-L1 pozitív/összes (N=162) Bronchioloalveolaris carcinoma, tüdı 0/1 Emlı, DCIS 0/2 Emlı, invazív duktális 3/7 Emlı, invazív duktális, nyirokcsomóáttét 1/1 Epehólyag 2/4 Fej és nyak, kemény szájpad 0/1 Féregnyúlvány 1/1 Gyomor 1/6 Gyomor, mucinózus 0/1 Gyomor-bélrendszeri, tüdıáttét 0/1 Hasnyálmirigy 1/2 Hasnyálmirigy, duktális 0/3 Méh, endometrium 1/3 Méh, világossejtes 1/1 Méhnyak, endocervikális típus 0/1 Adenocarcinoma Nyálmirigy/parotis 0/2 Nyelıcsı 1/1 Pajzsmirigy, follikuláris 0/1 Pajzsmirigy, follikuláris-papilláris 0/1 Pajzsmirigy, papilláris 0/3 Petefészek 0/1 Petefészek, endometriális 0/1 Petefészek, mucinózus 0/1 Petefészek, szerózus 0/1 Prosztata 2/4 Rectum 2/4 Tüdı 2/5 Vastagbél 2/5 Vastagbél, májáttét 1/1 Vastagbél, mucinózus 0/1 Vékonybél 0/2 Adrenokortikális karcinóma Mellékvese 0/1 Astrocytoma Nagyagy 0/3 Húgyhólyag 3/6 Átmeneti sejtes karcinóma Vese 0/1 Basalis sejtes karcinóma Bır 0/1 Embrionális karcinóma Here 0/1 Ependymoma Agy 0/1 Glioblasztóma Agy 0/1 Hepatoblasztóma Máj 0/1 Hepatocelluláris karcinóma Máj 1/5 Rectum 0/1 Interstitialoma Vastagbél 0/1 Vékonybél 0/1 Karcinóma Nasopharyngealis, NPC 0/1 Kissejtes karcinóma Tüdı 1/2 Kordóma Medenceüreg 0/1 Bır 1/2 Fej és nyak 0/2 Méh 1/1 Méhnyak 2/4 Laphámsejtes karcinóma Metasztatikus nyelıcsı laphámsejtes karcinóma áttéte 1/1 nyirokcsomóban Nyelıcsı 4/7 Tüdı 1/3 Limfóma Anaplasztikus nagysejtes Nyirokcsomó 1/1 Diffúz B-sejtes Nyirokcsomó 2/4 Hodgkin Nyirokcsomó 2/2 Non-Hodgkin Nyirokcsomó 1/1 Liposzarkóma Hasüreg, mucinosus 0/1 Medulláris karcinóma Pajzsmirigy 0/1 Medulloblastoma Agy 0/1 Orrüreg 0/1 Melanóma Rectum 0/1 Meningióma Agy 0/2 Mezotelióma Peritoneum 0/1 Nagysejtes karcinóma Tüdı 1/1 Neuroblasztóma Retroperitoneum 0/1 Neurofibróma Lágyszövet, derék 0/1 Metasztatikus pecsétsejtes karcinóma carcinoma áttéte 0/1 Pecsétsejtes karcinóma petefészekben Vastagbél 0/1 Primitív neuroektodermális Retroperitoneum 0/1 (129097-002)
P03914HU_02/SK00521-2/2016.04 9/17
Tumor típusa Spermatocitóma Szarkóma Kondroszarkóma Leiomyosarcoma Liposzarkóma Oszteoszarkóma Rhabdomyosarcoma Synoviális szarkóma Világossejtes Szeminóma Szigetsejttumor Thymoma Vesesejt karcinóma Papilláris Világossejtes
Elhelyezkedés / Szerv Here
PD-L1 pozitív/összes (N=162) 0/2
Csont Húgyhólyag Lágyszövet, mellkasfal Hasüreg, mucinosus Csont Lágyszövet, embrionális Prosztata Retroperitoneum Medenceüreg Hasfal Here Hasnyálmirigy Mediastinum
0/1 0/1 0/1 0/1 0/2 0/1 0/1 0/1 0/1 0/1 0/2 0/1 1/1
Vese Vese
0/1 0/6
Analitikai érzékenység: Nem laphámsejtes NSCLC A PD-L1 IHC 28-8 pharmDx analitikus érzékenységét 112 egyedi pácienstıl származó nem laphámsejtes, I–IV. stádiumú NSCLC FFPE mintán vizsgáltuk egy gyártói készlet segítségével. A PD-L1 expresszió értékelése festıdést mutatott a 0-100% pozitív daganatsejt és 0-3 festıdési intenzitás tartományban. Megismételhetıség: Nem laphámsejtes NSCLC A PD-L1 IHC 28-8 pharmDx ismételhetıségét a Dako vizsgálta. A teljesítményadatokat a 4. táblázat tartalmazza. Minden egyes meghatározott PD-L1 expressziós szint esetén elvégzésre került a tesztek negatív százalékos egyezési (NPA), pozitív százalékos egyezési (PPA) és teljes százalékos egyezési (OA) értékének független páros összehasonlítása. A leggyakrabban megfigyelt értéket alkalmaztuk az NPA, a PPA és az OA, valamint az ezekhez tartozó 95%-os Wilson-féle konfidencia-intervallumok kiszámításához, így az ezen megfigyelésbıl származó egyik érték eltávolításra került a páros összehasonlítási mőveletbıl. 4. táblázat: A PD-L1 IHC 28-8 pharmDx ismételhetısége - nem laphámsejtes NSCLC % egyezés (95%-os CI)
Megismételhetıség Módszer Berendezések között
Megfigyelık között
Napok között
Tételek között
Futtatásokon belül
(129097-002)
A 10, különbözı PD-L1 IHC expressziós szintekkel rendelkezı nem laphámsejtes NSCLC mintát három példányban teszteltük három Autostainer Link 48 berendezésben. Összesen 60 független páros összehasonlítást végeztünk. A 12, különbözı PD-L1 IHC expressziós szintekkel rendelkezı nem laphámsejtes NSCLC mintát három példányban három analitikus segítségével ellenıriztük egy Autostainer Link 48 berendezésben. Összesen 72 független páros összehasonlítást végeztünk. A 10, különbözı PD-L1 IHC expressziós szintekkel rendelkezı nem laphámsejtes NSCLC mintát három példányban öt nem egymást követı napon ellenıriztük az Autostainer Link 48 berendezésben. Összesen 80 független páros összehasonlítást végeztünk. A 20, különbözı PD-L1 IHC expressziós szintekkel rendelkezı nem laphámsejtes NSCLC mintát két példányban öt reagenstétellel vizsgáltuk az Autostainer Link 48 berendezésben. Összesen 160 független páros összehasonlítást végeztünk. A 10, különbözı PD-L1 IHC expressziós szintekkel rendelkezı nem laphámsejtes NSCLC mintát egy futtatáson belül nyolc példányon vizsgáltuk az Autostainer Link 48 berendezésben. Összesen 70 független páros összehasonlítást végeztünk.
≥1% expressziós szint ≥5% expressziós szint ≥10% expressziós szint NPA 100 (82,4, 100) NPA 100 (86,2, 100) NPA 100 (91,6, 100) PPA 100 (91,6, 100) PPA 100 (90,4, 100) PPA 100 (82,4, 100) OA 100 (94,0, 100) OA 100 (94,0, 100) OA 100 (94,0, 100)
NPA 100 (86,2, 100) PPA 100 (92,6, 100) OA 100 (94,9, 100)
NPA 100 (91,6, 100) PPA 100 (88,6, 100) OA 100 (94,9, 100)
NPA 100 (93,4, 100) PPA 100 (82,4, 100) OA 100 (94,9, 100)
NPA 100 (86,2, 100) PPA 100 (93,6, 100) OA 100 (95,4, 100)
NPA 100 (89,3, 100) PPA 100 (92,6, 100) OA 100 (95,4, 100)
NPA 98,2 (90,6, 99,7) PPA 100 (86,2, 100) OA 98,8 (93,3, 99,8)
NPA 100 (94,3, 100) PPA 100 (96,2, 100) OA 100 (97,7, 100)
NPA 100 (95,4, 100) PPA 100 (95,4, 100) OA 100 (97,7, 100)
NPA 100 (96,4, 100) PPA 100 (93,6, 100) OA 100 (97,7, 100)
NPA 100 (84,5, 100) PPA 100 (92,7, 100) OA 100 (94,8, 100)
NPA 100 (87,9 100) PPA 100 (91,6, 100) OA 100 (94,8, 100)
NPA 100 (92,7, 100) PPA 100 (84,5, 100) OA 100 (94,8, 100)
P03914HU_02/SK00521-2/2016.04 10/17
Külsı reprodukálhatóság: Nem laphámsejtes NSCLC A PD-L1 IHC 28-8 pharmDx külsı reprodukálhatóságát három külsı tesztelıhely vizsgálta. Értékelés elıtt a megfestıdött metszetek vakosítására és randomizálására került sor. A teljesítményadatokat az 5. táblázat tartalmazza. Minden egyes meghatározott PD-L1 expressziós szint esetén elvégzésre került a tesztek negatív százalékos egyezési (NPA), pozitív százalékos egyezési (PPA) és teljes százalékos egyezési (OA) értékének független páros összehasonlítása. A leggyakrabban megfigyelt értéket alkalmaztuk az NPA, a PPA és az OA, valamint az ezekhez tartozó 95%-os Wilson-féle konfidencia-intervallumok kiszámításához, így az ezen megfigyelésbıl származó egyik érték eltávolításra került a páros összehasonlítási mőveletbıl. 5. táblázat: A három külsı vizsgálóhelyen tesztelt PD-L1 IHC 28-8 pharmDx - nem laphámsejtes NSCLC reprodukálhatósága Reprodukálhatóság
% egyezés (95%-os CI) Módszer
Vizsgálóhelyek közötti elemzés (három vizsgálóhely)
A 10, különbözı PD-L1 IHC expressziós szintekkel rendelkezı nem laphámsejtes NSCLC mintát öt nem egymást követı napon teszteltük. A vizsgálóhelyek közötti elemzést három vizsgálóhelyen, összesen 140 független páros összehasonlítás segítségével végeztük. Vizsgálóhelyen A 10, különbözı PD-L1 IHC expressziós szintekkel belüli vizsgálat rendelkezı nem laphámsejtes NSCLC mintát öt nem egymást követı napon teszteltük a három vizsgálóhelyen. A vizsgálóhelyen belüli elemzést három vizsgálóhelyen, összesen 120 független páros összehasonlítás segítségével végeztük. Megfigyelık A 15, különbözı PD-L1 IHC expressziós szintekkel között (egy rendelkezı, PD-L1 IHC 28-8 pharmDx segítségével megfigyelı megfestett nem laphámsejtes NSCLC minta pontozását mindhárom három patológus végezte el három nem egymást követı vizsgálóhelyen) napon, három vizsgálóhelyen. A megfigyelık közötti elemzést három vizsgálóhelyen, összesen 120 független páros összehasonlítás segítségével végeztük. Egy megfigyelın A 15, különbözı PD-L1 IHC expressziós szintekkel belül (egy rendelkezı, PD-L1 IHC 28-8 pharmDx segítségével megfestett nem laphámsejtes NSCLC minta pontozását megfigyelı mindhárom három patológus végezte el három nem egymást követı vizsgálóhelyen) napon, három vizsgálóhelyen. A egy megfigyelın belüli elemzést három vizsgálóhelyen, összesen 90 független páros összehasonlítás segítségével végeztük.
≥1% expressziós szint
≥5% expressziós szint
NPA 100 (93,6, 100) PPA 98,8 (93,6, 99,8) OA 99,3 (96,1, 99,9)
NPA PPA OA
91,4 (82,5, 96,0) 97,1 (90,2, 99,2) 94,3 (89,1, 97,1)
NPA 100 (92,6, 100) PPA 98,6 (92,5, 99,8) OA 99,2 (95,4, 99,9)
NPA PPA OA
96,4 (87,9, 99,0) 95,3 (87,1, 98,4) 95,8 (90,6, 98,2)
NPA 96,9 (89,3, 99,1) PPA 100 (93,6, 100) OA 98,3 (94,1, 99,5)
NPA 100 (94,3, 100) PPA 89,3 (78,5, 95,0) OA 95,0 (89,5, 97,7)
NPA PPA OA
NPA PPA OA
95,8 (86,0, 98,8) 100 (91,6, 100) 97,8 (92,3, 99,4)
100 (93,1, 100) 100 (90,8, 100) 100 (95,9, 100)
A klinikai teljesítmény értékelése: Nem laphámsejtes NSCLC A PD-L1 IHC 28-8 pharmDx klinikai használatóságának értékelése a CA209057 számú, háromfázisú, randomizált, nyílt jelöléső, nivolumab és docetaxel készítményeket összehasonlító, felnıtt (≥ 18 év), elırehaladott vagy áttétes nem laphámsejtes NSCLC-ben szenvedı pácienseken végzett vizsgálattal történt, akiket elızıleg eredménytelenül kezeltek platinabázisú doublet kemoterápiával. A vizsgálatban összesen 582, 112 vizsgálati helyrıl, 22 országból származó tesztalany került be randomizált módon (Argentína, Ausztrália, Ausztria, Brazília, Kanada, Chile, Csehország, Franciaország, Németország, Hongkong, Magyarország, Olaszország, Mexikó, Norvégia, Peru, Lengyelország, Románia, Oroszország, Szingapúr, Spanyolország, Svájc és az Egyesült Államok). A tesztalanyok 1:1 arányban kerültek randomizálásra, a rétegezés pedig a következı elvek szerint történt: 1) elızetesen alkalmaztak kontra nem alkalmaztak fenntartó terápiát és 2) másodvonalbeli kontra harmadvonalbeli terápia. A vizsgálat elıtti (alapértékeket képviselı) tumorszövetmintákat még a randomizálás és az elsı kezelés elıtt begyőjtöttük a hatékonyság elıre megtervezett, elıre meghatározott alapszintő PD-L1 expressziós szintek szerinti elemzése érdekében (másodlagos cél). Az elsıdleges cél a teljes túlélés (OS) meghatározása volt. Az egyéb másodlagos célok közé tartozott az objektív válaszarány (ORR), progressziómentes túlélés (PFS), valamint a betegséggel összefüggı tünetek 12 hét alatt bekövetkezı javulása a tüdırák tüneti skála (LCSS) alapján mérve. Az alapszintő demográfiai és betegségjellemzık összességében kiegyenlítetten fordultak elı a nivolumab és docetaxel csoportok randomizált tesztalanyai között. Az átlagos életkor 62 év volt (tartomány: 21–85), ahol az alanyok 34%-a volt 65 éves vagy idısebb, és 7%-a volt 75 éves vagy idısebb. A páciensek túlnyomó része fehér (92%) férfi (55%) volt; az alapszintő ECOG teljesítménystátusz 0 (31%) vagy 1 (69%) volt. A páciensek hetvenkilenc százaléka volt leszokott/aktív dohányos. A tumorminták nem laphámsejtes, a vizsgálat bevonási kritériumainak megfelelı NSCLC tumorokból kerültek begyőjtésre. A 6. táblázat a CA209057 számú vizsgálatban részt vevı randomizált tesztalanyok elıre meghatározott alapértékő expressziós szinteken mutatott PD-L1 expressziójának gyakoriságát mutatja. 6. táblázat: Vizsgálat elıtti PD-L1 expresszió gyakorisága a CA209057 vizsgálatban részt vevı összes, nem laphámsejtes NSCLC-ben szenvedı randomizált tesztalany esetén Kiindulási populáció PD-L1 expressziós kategória
Nivolumab 3 mg/kg
Docetaxel
Összesen
Összes Mérhetı PD-L1, N (%) PD-L1 expresszió ≥ 1% PD-L1 expresszió < 1% PD-L1 expresszió ≥ 5% PD-L1 expresszió < 5% Kiinduló PD-L1 expresszió ≥ 10% PD-L1 expresszió < 10% PD-L1 nem mérhetı, N (%)
292 231 (79,1) 123/231 (53,2) 108/231 (46,8) 95/231 (41,1) 136/231 (58,9) 86/231 (37,2) 145/231 (62,8) 61 (20,9)
290 224 (77,2) 123/224 (54,9) 101/224 (45,1) 86/224 (38,4) 138/224 (61,6) 79/224 (35,3) 145/224 (64,7) 66 (22,8)
582 455 (78,2) 246/455 (54,1) 209/455 (45,9) 181/455 (39,8) 274/455 (60,2) 165/455 (36,3) 290/455 (63,7) 127 (21,8)
(129097-002)
P03914HU_02/SK00521-2/2016.04 11/17
Az OPDIVO® csoport elıre meghatározott expressziós szintjein PD-L1 expressziót mutató páciensek jobb túlélési aránnyal rendelkeznek a docetaxel csoportba tartozó páciensekhez képest, míg a docetaxel csoportba tartozó páciensek túlélési aránya azon páciensek túlélési arányával egyezett meg, akik nem mutattak PD-L1 expressziót. A PD-L1 expressziós szint alapján végzett elemzés során a teljes túlélés (OS) medián értékét tekintve a nivolumab csoport jelentıs eltérést mutatott a docetaxel csoporthoz képest. A nivolumab tesztalanyok teljes túlélés mediánja 17,1, 18,2 és 19,4 hónap volt a docetaxel csoportban részt vevı tesztalanyok 9,0, 8,1 és 8,0 hónapjához képest a sorrendben ≥1%, ≥5% és ≥10%-os PD-L1 expressziós szintek esetén. A <1%, <5% és <10%-os expressziós szintek esetén a kezelési csoportokban lévı tesztalanyok teljes túlélési értékei között nem volt eltérés tapasztalható, a nivolumab esetén a teljes OS 9,7 és 10,4 hónap között, míg a docetaxel csoport esetén 10,1 és 10,3 hónap között változott. Az 1. ábrán nem rétegezett kockázati arány (HR) és a teljes túlélés (OS) medián értéke látható. A 2. és 3. ábrán az alcsoportok PD-L1 expressziós szintje alapján elkészített Kaplan-Meier túlélési görbe látható. 1. ábra: Forest-görbe – PD-L1 expressziós szinten alapuló teljes túlélés (OS) a CA209057 vizsgálatban részt vevı, nem laphámsejtes NSCLC-ben szenvedı páciensek esetén
≥1% (n = 246)
Nem rétegezett HR 0,59
<1% (n = 209)
PD-L1 expressziós szint
Teljes túlélés (OS) medián értéke (hónap) OPDIVO Doceraxel 17,1
9,0
0,90
10,4
10,1
≥5% (n = 181)
0,43
18,2
8,1
<5% (n = 274)
1,01
9,7
10,1
≥10% (n = 165)
0,40
19,4
8,0
<10% (n = 290)
1,00
9,9
10,3
0,25
0,5
1,0
2,0
Az OPDIVO-ra pozitívabban reagál Megjegyzés: A nem rétegezett kockázati arány értékének, valamint a hozzá tartozó 95%-os konfidencia-intervallum becslését a Cox-féle arányos kockázati modell segítségével végeztük el, ahol a randomizált csoportot egyetlen kovariánsnak tekintettük 2. ábra: Teljes túlélés - a CA209057 vizsgálatban részt vevı, ≥1% PD-L1 expressziós szintő, nem laphámsejtes NSCLC betegek 1,0 0,9 0,8
Túlélési esély
0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 OPDIVO Docetaxel
0,1 0,0 0
3
6
9
12
15
18
21
24
27
Teljes túlélés (hónap) Kockázatok száma OPDIVO 123 98 Docetaxel 123 102
(129097-002)
86
77
73
65
27
13
5
0
80
61
44
36
13
4
3
0
P03914HU_02/SK00521-2/2016.04 12/17
3. ábra: Teljes túlélés - a CA209057 vizsgálatban részt vevı, <1% PD-L1 expressziós szintő, nem laphámsejtes NSCLC betegek 1,0 0,9 0,8
Túlélési esély
0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 0
OPDIVO Docetaxel
3
6
9
12
15
18
21
24
27
Teljes túlélés (hónap) Kockázatok száma OPDIVO 108 82 Docetaxel 101 87
(129097-002)
70
60
48
39
26
17
4
0
69
53
38
30
13
5
2
0
P03914HU_02/SK00521-2/2016.04 13/17
Analitikai érzékenység: Melanóma A PD-L1 IHC 28-8 pharmDx analitikus érzékenységét 104 egyedi pácienstıl származó I–IV. stádiumú melanóma FFPE mintán vizsgáltuk. A PD-L1 expresszió értékelése festıdést mutatott a 0-100% pozitív daganatsejt és 0-3 festıdési intenzitás tartományban. Megismételhetıség: Melanóma A PD-L1 IHC 28-8 pharmDx ismételhetıségét a Dako vizsgálta. Értékelés elıtt a megfestıdött metszetek vakosítására és randomizálására került sor. A teljesítményadatokat a 7. és a 8. táblázat tartalmazza. Minden egyes meghatározott PD-L1 expressziós szint esetén elvégeztük a tesztek átlagos negatív százalékos egyezési (ANA), átlagos pozitív százalékos egyezési (APA) és teljes százalékos egyezési (OA) értékének nem redundáns páros összehasonlítását. 7. táblázat: A PD-L1 IHC 28-8 pharmDx ismételhetısége - melanóma Megismételhetıség Berendezések között
Megfigyelık között
Napok között
Tételek között
Futtatásokon belül
Módszer A 16, különbözı PD-L1 IHC expressziós szintekkel rendelkezı melanóma mintát három példányban teszteltük három Autostainer Link 48 berendezésben. Összesen 160 páros összehasonlítást végeztünk. A 16, különbözı PD-L1 IHC expressziós szintekkel rendelkezı melanóma mintát három példányban, három analitikus segítségével ellenıriztük egy Autostainer Link 48 berendezésben. Összesen 240 páros összehasonlítást végeztünk. A 16, különbözı PD-L1 IHC expressziós szintekkel rendelkezı melanóma mintát három példányban, öt nem egymást követı napon ellenıriztük az Autostainer Link 48 berendezésben. Összesen 160 páros összehasonlítást végeztünk. A 16, különbözı PD-L1 IHC expressziós szintekkel rendelkezı melanóma mintát két példányban három reagenstétellel vizsgáltuk az Autostainer Link 48 berendezésben. Összesen 640 páros összehasonlítást végeztünk. A 16, különbözı PD-L1 IHC expressziós szintekkel rendelkezı melanóma mintát egy futtatáson belül nyolc példányon vizsgáltuk az Autostainer Link 48 berendezésben. Összesen 160 páros összehasonlítást végeztünk.
% egyezés (95%-os CI) ≥1% expressziós szint ≥5% expressziós szint ANA 89,5 (83,2, 93,6) APA 90,5 (84,8, 94,2) OA 90,0 (86,0, 92,9)
ANA 90,8 (85,7, 94,2) APA 85,5 (77,6, 90,9) OA 88,8 (84,6, 91,9)
ANA 96,4 (92,9, 98,2) APA 96,8 (93,8, 98,4) OA 96,6 (94,5, 97,9)
ANA 91,3 (87,1, 94,2) APA 88,8 (83,4, 92,6) OA 90,2 (87,0, 92,7)
ANA 95,5 (90,3, 97,9) APA 96,8 (93,1, 98,6) OA 96,3 (93,5, 97,9)
ANA 90,0 (84,0, 93,9) APA 90,0 (84,0, 93,9) OA 90,0 (86,0, 92,9)
ANA 98,6 (97,3, 99,3) APA 98,8 (97,8, 99,4) OA 98,7 (98,0, 99,2)
ANA 92,6 (90,6, 94,2) APA 86,6 (83,1, 89,5) OA 90,5 (88,7, 91,9)
ANA 97,1 (92,6, 98,9) APA 97,7 (94,1, 99,1) OA 97,4 (94,9, 98,7)
ANA 93,6 (89,0, 96,4) APA 89,8 (82,7, 94,2) OA 92,2 (88,4, 94,8)
Külsı reprodukálhatóság: Melanóma A PD-L1 IHC 28-8 pharmDx külsı reprodukálhatóságát három külsı tesztelıhely vizsgálta. Értékelés elıtt a megfestıdött metszetek vakosítására és randomizálására került sor. A teljesítményadatokat a 8. táblázat tartalmazza. Minden egyes meghatározott PD-L1 expressziós szint esetén elvégeztük a tesztek átlagos negatív százalékos egyezési (ANA), átlagos pozitív százalékos egyezési (APA) és teljes százalékos egyezési (OA) értékének nem redundáns páros összehasonlítását. 8. táblázat: A három külsı vizsgálóhelyen tesztelt PD-L1 IHC 28-8 pharmDx - melanóma reprodukálhatósága % egyezés (95%-os CI) Reprodukálhatóság Módszer ≥1% expressziós szint ≥5% expressziós szint A 18, különbözı PD-L1 IHC expressziós szintekkel Vizsgálóhelyek rendelkezı melanóma mintát öt nem egymást követı ANA 99,3 (98,8, 99,7) ANA 93,8 (92,5, 95,1) közötti elemzés APA 99,3 (98,8, 99,7) APA 92,7 (91,2, 94,2) napon teszteltük. A vizsgálóhelyek közötti elemzést (három OA 99,3 (98,7, 99,7) OA 93,3 (91,9, 94,7) három vizsgálóhelyen, összesen 1350 páros vizsgálóhely) összehasonlítás segítségével végezték. A 18, különbözı PD-L1 IHC expressziós szintekkel rendelkezı melanóma mintát öt nem egymást ANA 99,3 (98,4, 99,8) ANA 97,3 (95,8, 98,5) Vizsgálóhelyen követı napon teszteltük a három vizsgálóhelyen. APA 99,3 (98,5, 99,8) APA 96,8 (95,1, 98,2) belüli vizsgálat A vizsgálóhelyen belüli elemzést három vizsgálóhelyen, OA 99,3 (98,5, 99,8) OA 97,0 (95,6, 98,3) összesen 540 páros összehasonlítás segítségével végezték. A 30, különbözı PD-L1 IHC expressziós szintekkel rendelkezı, PD-L1 IHC 28-8 pharmDx segítségével Megfigyelık között ANA 93,2 (91,3, 94,8) megfestett melanóma minta értékelését három patológus ANA 90,4 (88,1, 92,5) (egy megfigyelı végezte el három nem egymást követı napon, három APA 91,7 (89,7, 93,6) APA 91,9 (89,8, 93,9) mindhárom vizsgálóhelyen. A megfigyelık közötti elemzést három OA 91,1 (89,1, 93,1) OA 92,6 (90,7, 94,3) vizsgálóhelyen) vizsgálóhelyen, összesen 810 páros összehasonlítás segítségével végezték. A 30, különbözı PD-L1 IHC expressziós szintekkel Egy megfigyelın rendelkezı, PD-L1 IHC 28-8 pharmDx segítségével megfestett melanóma minta értékelését három patológus ANA 99,2 (97,9, 100) ANA 97,9 (96,1, 99,4) belül (egy megfigyelı végezte el három nem egymást követı napon, három APA 99,3 (98,2, 100) APA 97,6 (95,4, 99,2) OA 99,3 (98,1, 100) OA 97,8 (95,9, 99,3) mindhárom vizsgálóhelyen. Az egy megfigyelın belüli elemzést három vizsgálóhelyen, összesen 270 páros vizsgálóhelyen) összehasonlítás segítségével végezték.
(129097-002)
P03914HU_02/SK00521-2/2016.04 14/17
A klinikai teljesítmény értékelése: Melanóma A PD-L1 IHC 28-8 pharmDx értékelése a CA209067 számú klinikai vizsgálatba bevont betegek mintáinak segítségével történt, ami egy 3. fázisú, randomizált, duplavak vizsgálat a nivolumab monoterápia vizsgálatára vagy a nivolumab és az ipilimumab kombinált terápia vizsgálatára az ipilimumab monoterápiával szemben olyan betegeknél, akik metasztázisos melanómában szenvednek, és korábban nem kaptak kezelést. A vizsgálatba összesen 1296 beteget vontunk be 21 ország (Ausztrália, Ausztria, Belgium, Kanada, Csehország, Dánia, Finnország, Franciaország, Németország, Írország, Izrael, Olaszország, Hollandia, Új-Zéland, Norvégia, Lengyelország, Spanyolország, Svédország, Svájc, Egyesült Királyság és Egyesült Államok) 137 vizsgálati helyrıl. A vizsgálatba bevont 1296 beteg közül 945 beteget randomizáltunk a három kezelési kar valamelyikébe 1:1:1 arányban, és rétegeztük ıket PD-L1 státusz (≥5% egy klinikai vizsgálati próba alapján), BRAF státusz és AJCC M stádium szerint. A kiindulási demográfiai adatok és betegségjellemzık összességében kiegyenlítetten fordultak elı a kezelési csoportok randomizált betegei között. Az életkor medián értéke 60 év volt (tartomány: 18–90), ahol az alanyok 40%-a volt 65 éves vagy idısebb, és 13%-a volt 75 éves vagy idısebb. A betegek többsége fehérbırő (97%) és férfi (65%) volt. A vizsgálat elıtti (kiinduló érték) tumormintákat melanómában szenvedı betegektıl győjtöttük be, 86%-ban metasztázisos területekrıl. A 945 randomizált vizsgálati beteg közül 915 betegnél (97%) végeztük el az archivált szövetminták retrospektív vizsgálatát a PD-L1 IHC 28-8 pharmDx teszttel. 55 vizsgálati beteg (6%) esetében a melanin kizárta a PD-L1 expressziós státusz értékelését, 47 beteg (5%) esetében pedig a beleegyezés visszavonása vagy mintahiány miatt volt ismeretlen a PD-L1 státusz. Így 843 vizsgálati betegnél (89%) sikerült megállapítani a PD-L1 státuszt. A legalább 1%-os, illetve az 1%-nál alacsonyabb szintő tumor PD-L1 expressziót mutató betegek aránya kiegyenlített volt a kezelési csoportok között. A CA209067 vizsgálatban PD-L1 IHC 28-8 pharmDx teszteredményekkel rendelkezı vizsgálati betegek PD-L1 expressziós státuszértékeit a 9. táblázat mutatja.
9. táblázat: PD-L1 expresszió gyakorisága a CA209067 vizsgálatban részt vevı összes, melanómában szenvedı randomizált tesztalany esetén Alanyok száma, n (%) nivolumab nivolumab + ipilimumab ipilimumab Mérhetı PD-L1 szintő alanyoka 288 278 277 PD-L1 expressziós szint: 171 (59,4) 155 (55,8) 164 (59,2) ≥1% <1% 117 (40,6) 123 (44,2) 113 (40,8) 80 (27,8) 68 (24,5) 75 (27,1) ≥5% <5% 208 (72,2) 210 (75,5) 202 (72,9) a Csak a mérhetı PD-L1 eredmények száma; nem tartalmazza a bizonytalan PD-L1 eredmények számát A nivolumab, illetve a nivolumab és az ipilimumab kombinációja jobb PFS értéket mutatott az ipilimumab eredményeihez képest a PD-L1 expressziós alcsoportokban. A nivolumab+ipilimumab, illetve a nivolumab eredményeinek összehasonlítása nem volt a vizsgálat elsıdleges céljai között, így a vizsgálatot nem az vezérelte, hogy felfedje ezt a különbséget. Az alacsony PD-L1 expressziós szintet mutató betegeknél azonban a nivolumab + ipilimumab kombináció jobb PFS értéket eredményezett a nivolumab kezeléshez képest. A magas PD-L1 expressziós szintő betegek esetében a PFS értéke összevethetı volt a nivolumab, illetve a nivolumab + ipilimumab kombinált kezelés között. A nivolumab és a nivolumab + ipilimumab kombinált kezelési csoportoknál magasabb ORR arány volt megfigyelhetı a PD-L1 expressziós státusz mindkét meghatározása mellett (≥1% vagy ≥5% tumorsejtmembrán expresszió) az ipilimumab kezelési csoporthoz képest. Azoknál a nivolumab készítménnyel, illetve a nivolumab + ipilimumab kombinált készítménnyel kezelt alanyoknál, akiknél a tumorsejtmembrán expresszió ≥1%, illetve ≥5% volt, számszerően nagyobbnak mutatkozott az ORR érték azokhoz képest, akiknél a tumorsejtmembrán expresszió <1%, illetve <5% volt. Az ipilimumab csoportban az ORR értékei összevethetık voltak a PD-L1 expressziós alcsoportok között PD-L1 expresszió definíciójától függetlenül (≥1% vagy ≥5% tumorsejtmembrán expresszió). Ezenfelül magasabb ORR érték volt megfigyelhetı a nivolumab + ipilimumab kezeléssel, mint a nivolumab monoterápiával a PD-L1 expressziós szinttıl függetlenül. A jelen vizsgálat PD-L1 expressziós analízisei alapján a nivolumab + ipilimumab kombinációnak a PFS értékre vonatkozó legnagyobb elınye a nivolumab monoterápiával szemben a <5% PD-L1 expressziós érték mellett jelentkezhet. A PD-L1 expresszió segítség lehet olyan betegek felmérése során, akiknél szóba jöhet a nivolumab + ipilimumab kombinált terápia a nivolumab monoterápiával szemben, azonban ezt az adatot csak az összes rendelkezésre álló klinikai információval való összefüggésben szabad fontolóra venni, mivel a PD-L1 expressziós alcsoportok mindegyikében klinikai jelentıséggel bíró reakciók voltak megfigyelhetık. A PD-L1 expressziós szintek mindegyike mellett a nivolumab + ipilimumab kombinációt kapó, kezelni szándékozott (intent-to-treat, ITT) populáció javuló hatékonyságot tapasztalt az ipilimumab monoterápiával összevetve. A PFS kockázati arányokat (HR) és a PFS medián értékeit a PD-L1 expressziós szint függvényében a 10. táblázat mutatja be. A vizsgáló által mért ORR értékeket a PD-L1 expressziós szint függvényében a 11. táblázat mutatja be.
(129097-002)
P03914HU_02/SK00521-2/2016.04 15/17
10. táblázat: Progressziómentes túlélés összesítése PD-L1 szintek és kezelési csoportok szerint - a CA209067 vizsgálatban részt vevı összes, melanómában szenvedı randomizált tesztalany
Kezelés
nivolumab + ipilimumab
nivolumab
ipilimumab
PD-L1 Események PFS medián értéke expressziós száma/ hónapokban kifejezve szint betegek száma (95%-os CI)
HR az ipilimumab szerrel szemben (95%-os CI)
HR a nivolumab monoterápiával szemben (95%-os CI)
≥5%
28/68
13,96(9,72, NR)
0,39
(0,25, 0,62)
0,96 (0,58, 1,58)
<5%
103/210
11,24(7,98, NR)
0,42
(0,32, 0,54)
0,70 (0,54, 0,91)
≥1%
72/155
12,35(8,51, NR)
0,44
(0,32, 0,58)
0,95 (0,69, 1,31)
<1%
59/123
11,17(6,93, NR)
0,38
(0,27, 0,53)
0,56 (0,40, 0,79)
≥5%
33/80
14,00(9,07, NR)
0,41
(0,26, 0,63)
--
<5%
122/208
0,59
(0,47, 0,75)
--
5,32(2,83, 7,06)
≥1%
79/171
<1%
76/117
12,39(8,11, NR) 2,83(2,76, 5,13)
0,46
(0,34, 0,61)
--
0,67
(0,49, 0,92)
--
≥5%
53/75
3,94 (2,79, 4,21)
--
--
<5%
154/202
2,83 (2,76, 3,09)
--
--
≥1%
122/164
3,91 (2,83, 4,17)
--
--
<1%
85/113
2,79 (2,66, 2,96)
--
--
Rövidítések: CI = konfidencia-intervallum, NR = nem érte el, PFS = progressziómentes túlélés HR = a kezelés hatásainak kockázati tényezıje a Cox-féle arányos kockázati modell alapján a kezelés, PD-L1 státusz és a PD-L1 státusz szerinti kezelés kölcsönhatásának figyelembe vételével
11. táblázat: Vizsgáló személy által mért ORR: Melanómában szenvedı betegek PD-L1 expresszió szerint - a CA209067 vizsgálatban részt vevı PD-L1 szintre tesztelt alanyok PD-L1 Betegek ORR Kezelés % [95% CI] Expressziós szint száma ≥5% 68 72% (59,9, 82,3) Nivolumab + <5% 210 55% (47,8, 61,6) Ipilimumab ≥1% 155 65% (56,4, 72,0) <1% 123 52% (42,8, 61,1) ≥5% 80 58% (45,9, 68,5) <5% 208 41% (34,6, 48,4) Nivolumab ≥1% 171 54% (46,6, 62,0) <1% 117 33% (24,9, 42,6) ≥5% 75 21% (12,7, 32,3) <5% 202 18% (12,8, 23,8) Ipilimumab ≥1% 164 19% (13,2, 25,7) <1% 113 19% (11,9, 27,0)
12. táblázat: Hibaelhárítás Probléma 1. Nincs festıdés a kontroll, illetve a minta tárgylemezeken
Valószínő ok 1a. Programozási hiba.
1b. A DAB+ szubsztrát-kromogén oldat (DAB) reagens nem ad reakciót 1c. Nátrium-azid került a mosópufferbe.
2a. A minta tárgylemezei gyengén festıdnek. 2b. A minta tárgylemezei vagy a Dako által mellékelt kontroll tárgylemezen lévı pozitív sejtvonal gyengén festıdnek.
(129097-002)
1d. A kontroll tárgylemez teljesítményének csökkenése 2a. Nem megfelelı fixálási módot alkalmaztak. 2b. Nem megfelelı antigénfeltárás.
Javasolt teendı 1a. Ellenırizze, hogy az SK005 PD-L1 IHC 28-8 pharmDx programot választotta-e a tárgylemezek programozásához. 1b. Gyızıdjön meg arról, hogy a DAB+ szubsztrátkromogén oldat reagens megfelelıen volt elkészítve. 1c. Kizárólag a K8007 kódszámú Dako Wash Buffer reagenst használja. 1d. Ellenırizze a készlet csomagolásán feltüntetett lejárati idıt és tárolási körülményeket. 2a. Gondoskodjon arról, hogy csak jóváhagyott fixálószert és fixálási módszert alkalmazzanak. 2b. Ellenırizze, hogy a 3 az 1-ben elıkezelési eljárást megfelelıen végezték-e el.
P03914HU_02/SK00521-2/2016.04 16/17
3. Erıs háttérfestıdés a lemezeken.
3a. A paraffin nincs teljesen eltávolítva. 3b. A tárgylemezek az Autostainer Link 48 berendezésbe történı behelyezés közben kiszáradtak. 3c. A reagensek nem specifikus kötıdése a szövetmetszethez.
4. A szövet levált a tárgylemezekrıl.
4a. Nem megfelelı mikroszkópos tárgylemezek használata.
3a. Ellenırizze, hogy a 3 az 1-ben elıkezelési eljárást megfelelıen végezték-e el. 3b. Ügyeljen arra, hogy a tárgylemezeken elegendı puffer maradjon a betöltés alatt és a futtatás indítása elıtt. 3c. Gyızıdjön meg arról, hogy megfelelıen végezték-e a minta megfelelı fixálását, illetve hogy nincs-e jelen nekrózis. 4a. Használjon Dako FLEX IHC Microscope Slides (kód: K8020) tárgylemezeket vagy pozitív töltéső tárgylemezeket (például: Fisherbrand Superfrost Plus). 4b. A festés elıtt a metszeteket 58 ± 2 °C fokos sütıbe kell helyezni 1 órára. 5a. Gondoskodjon arról, hogy csak jóváhagyott fixálószert és fixálási módszert alkalmazzanak. 5b. Kizárólag a K8007 kódszámú Dako Wash Buffer reagenst használja. 6. Ez normális jelenség, és nem befolyásolja a festıdést.
4b. A mintákat nem megfelelıen készítették elı 5. Túlzottan erıs specifikus festıdés. 5a. Nem megfelelı fixálási módot alkalmaztak. 5b. Nem megfelelı mosópuffer használata. 6. A Target Retrieval Solution 6. Felmelegítéskor zavarossá válik a (antigénfeltáró oldat) reagens Target Retrieval Solution (antigénfeltáró felmelegítéskor zavarossá válik. oldat) reagens. MEGJEGYZÉS: Ha a probléma a fenti okok egyikének sem tulajdonítható, vagy ha az ajánlott korrekciós intézkedés nem oldja meg a problémát, további segítségért hívja a Dako mőszaki szolgálatát. A festési módszerekre és minta-elıkészítésre vonatkozó további információkat lásd: Dako Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods (15) (beszerezhetı a Dako cégtıl).
Irodalomjegyzék 1. Topalian SL, Drake CG, Pardoll DM. Targeting the PD-1/B7-H1 (PD-L1) pathway to activate anti-tumor immunity. Curr Opin Immunol 2012; 24(2):207-212. 2. Wang C, Thudium KB, Han M, et al. In vitro characterization of the anti-PD-1 antibody nivolumab, BMS-936558, and in vivo toxicology in non-human primates. Cancer Immunol Res 2014; 2(9):846-56. 3. OPDIVO® package insert. 4. YERVOY® package insert. 5. Borghaei H, Paz-Ares L, Horn L, et al. Nivolumab versus Docetaxel in advanced nonsquamous non-small-cell lung cancer. N Engl J Med 2015; 10.1056/NEJMoa1507643. 6. Phillips T, Simmons P, Inzunza HD, et al. Development of an automated PD-L1 immunohistochemistry (IHC) assay for non-small cell lung cancer. Appl Immuno Molec Morph 2015; 23(8):541-9. 7. Phelps RM, et al. NCI-navy medical oncology branch cell line data base. J. Cell. Biochem. 1996; 63: 32-91. 8. Weber JS, D’Angelo SP, Minor D, et al. Nivolumab versus chemotherapy in patients with advanced melanoma who progressed after anti-CTLA-4 treatment (CheckMate 037): a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet Oncol 2015; 16: 375–84. 9. Postow M, Chesney J, Pavlick A, et al. Nivolumab and ipilimumab versus ipilimumab in untreated melanoma. N Engl J Med. 2015; 372(21):2006-17. 10. Larkin J, Chiarion-Sileni V, Gonzalez R et al. Combined Nivolumab and Ipilimumab or Monotherapy in Untreated Melanoma. N Engl J Med. 2015; 373(1):23-34. 11. Topalian SL, Hodi FS, Brahmer JR, et. al. Safety, Activity, and Immune Correlates of Anti-PD-1 Antibody in Cancer. New Eng. J. Med. 2012; 366(26):2455-2465. 12. Department of Health, Education and Welfare, National Institutes for Occupational Safety and Health, Rockville, MD. “Procedures for the decontamination of plumbing systems containing copper and/or lead azides.” DHHS (NIOSH) Publ. No. 78-127, Current 13. August 16, 1976. 13. Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Protection of Laboratory Workers From Occupationally Acquired Infections; Approved Guideline – Fourth Edition. CLSI document M29-A4 [ISBN 1-56238-962-9]. Clinical and Laboratory Standards Institute, 950 West Valley Road, Suite 2500, Wayne, Pennsylvania 19087 – 1898 USA, 2014. 14. Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCCLS). Quality assurance for Design Control and Implementation of Immunohistochemistry Assays; Approved guideline. CLSI document I/LA28-A2; Vol. 31 No. 4 (ISBN 1-56238-745-6) CLSI, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087 USA; 2011. 15. Taylor CR and Rudbeck L. Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods. Sixth Edition. Dako, Carpinteria, California; 2013.
Kiadás: 16/04
(129097-002)
P03914HU_02/SK00521-2/2016.04 17/17
