Test aktivace bazofilů s využitím rekombinantních alergenů v diagnostice alergie na pyl břízy

původní práce

Test aktivace bazofilů s využitím rekombinantních alergenů v diagnostice alergie na pyl břízy The basophil activation test with recombinant allergens in diagnosis of the birch pollen allergy IVANA ŠETINOVÁ, MARIE HAVRANOVÁ, STANISLAVA HONZOVÁ

Imunologické centrum, Imumed, Praha

SOUHRN Hlavním cílem naší studie bylo zjistit, zda test aktivace bazofilù (BAT) je možno využít v in vitro diagnostice èasné pøecitlivìlosti na pyl bøízy. Bylo vyšetøeno 34 pacientù s klinickými projevy polinózy a pozitivitou kožního prick testu s komerèním extraktem bøízy a 10 zdravých jedincù. Diagnostická spolehlivost BAT byla srovnána s hodnotami specifického IgE (sIgE) na alergen bøízy. BAT byl také použit ke zjištìní poètu senzibilizovaných pacientù na rekombinantní alergeny rBet v 1 a rBet v 2. Ve skupinì pacientù s polinózou v BAT zareagovalo pozitivnì s extraktem bøízy 33/34 (97 %) pacientù. U 31/34 (91,1 %) pacientù byla zjištìna pozitivita sIgE na alergen bøízy. V BAT 32/34 (94,1 %) pacientù zareagovalo pozitivnì s rBet v 1, 13/34 (38,2 %) pacientù s rBet v 2,1 pacient jen s rBet v 2 1/34 (2,9 %).V kontrolní skupinì nebyl zaznamenán falešnì pozitivní výsledek ani BAT ani pøi stanovení sIgE na alergen bøízy. Z výsledkù vyplývá, že test aktivace bazofilù je diagnosticky srovnatelná metoda se stanovením specifického IgE na alergen bøízy. Prevalence senzibilizace na rBet v 1 a rBet v 2 stanovená BAT odpovídá výsledkùm, které byly získány stanovením sIgE na tyto rekombinantní alergeny v pøedešlých studiích v oblasti støední Evropy. Klíèová slova: alergeny bøízy, profilin, rekombinantní alergeny Bet v 1, Bet v 2, senzibilizace, test aktivace bazofilù

SUMMARY The aim of our study was to find out if the basophil activation test (BAT) can be used for in vitro diagnosis of birch pollen allergy. 34 patients with a seasonal rhinitis and positive skin prick test to birch pollen allergen extract and 10 healthy persons were investigated. The diagnostic reliability of the BAT was compared with the allergen-specific serum IgE (sIgE) to birch pollen. The BAT was also used for determination of the number of patients senzitized to rBet v 1 and rBet v 2. In the group of patients with a seasonal rhinitis 33/34 (97%) had positive BAT to the birch extract. 31/34 (91,1%) patients were found to have positive specific IgE to birch pollen.The BAT with rBet v 1 was positive in 32/34 (94,1%) of patients, with rBet v 2 13/34 (38,2%) and only with rBet v 2 in 1/34 (2,9%) patient. No patient had positive BAT to birch extract, rBet v 1, rBet v 2 or specific IgE in the control group. The basophil activation test was a comparable method with in vitro test of measurement of allergen-specific IgE in the diagnosis of birch pollen allergy in seasonal rhinitis patients in our study. The prevalence of senzitization to the rBet v 1 and rBet v 2 determined by the BAT corresponded to results obtained by different tests in previous studies. Key words: allergens of birch, prophilin, recombinant allergens Bet v 1, Bet v 2, senzitization, the basophil activation test

Úvod K velmi èastým inhalaèním alergenùm v oblasti støední a severní Evropy patøí pyly bøízy. Alergeny bøízy jsou proto v popøedí zájmu diagnostiky a následnì i léèby IgE zprostøedkované alergie. Dosud bylo definováno na molekulární úrovni 8 alergenù bøízy (1, 13, 14, 17). Nejví-

104

ce prozkoumaným bøízovým alergenem je hlavní alergen Bet v 1, 17-kDa pathogenesis related protein. Pacienti senzibilizovaní na tento alergen zkøíženì reagují nejen na pyly stromù druhu Fagales, ale zároveò i na øadu potravin rostlinného pùvodu. Jeho homologie byla nalezena napø. v alergenu jablka, lískového oøechu, celeru, mrkvi, tøešni. Vedlejší alergen Bet v 2, 14-kDa actin binding protein

Alergie 2/2005

původní práce (profilin) je známým panalergenem, zodpovìdným za zkøíženou alergii mezi pyly stromù, trav, bylin, ale také mezi potravinami rostlinného pùvodu (banán, meloun, rajèe, citrusy, burský oøech). Vedlejší alergeny Bet v 3 a Bet v 4 ( 9-kDa a 24 - kDa calcium binding protein), Bet v 5 a Bet v 6 (35 - kDa izoflavon reduktáza), Bet v 7 (18-kDa cyclofilin), Bet v 8 (65-kDa pectin esterasa) se v menší èi vìtší míøe také podílejí na zkøížené reaktivitì (1, 9). Prevalence senzibilizace na jednotlivé alergeny bøízy se liší dle zemìpisné šíøky pravdìpodobnì vlivem variabilní expozice rùznými pylovými alergeny (15, 17). Rychlý rozvoj v oblasti molekulárnì biologických technik vedl k lepšímu pochopení vzájemných vazeb a souvislostí mezi jednotlivými alergeny. Pøíprava rekombinantních alergenù a jejich využití pro diagnostiku alergií pøispívá k jejímu podstatnému zkvalitnìní (21). Takto provádìná diagnostika umožòuje nalézt alergen, který je zodpovìdný za senzibilizaci pacienta a zároveò odhalit zkøíženì reagující alergeny (9, 19). Test aktivace bazofilù patøí do skupiny tzv. funkèních testù, které jsou používány k in vitro diagnostice èasné pøecitlivìlosti. Objevení CD63 jako aktivaèního znaku bazofilù vedlo k rozvoji technické analýzy alergen-specifické aktivace bazofilù prùtokovou cytometrií.V posledních 5 letech zvyšující se poèet studií prokazuje, že in vitro aktivace bazofilù stanovená prùtokovou cytometrií je spolehlivou diagnostickou metodou IgE mediované èasné pøecitlivìlosti (3, 7, 18, 19). Výhodou testu je pøedevším rychlost stanovení a minimální manipulace s alergeny. Dochází jen k nepatrným konformaèním zmìnám alergenù. Riziko ztráty vazebné schopnosti protilátky a možnost falešnì negativního výsledku je tím sníženo na minimum (3, 7). Cílem naší studie bylo zjistit, zda tato metoda je srovnatelná se stanovením specifického IgE u pacientù s alergií na pyly bøízy. Tento test byl zároveò použit ke zjištìní senzibilizace na jednotlivé alergeny bøízy s využitím rekombinantních alergenù rBet v 1 a rBet v 2. Získané výsledky byly srovnány s prevalencí senzibilizace na tyto jednotlivé alergeny bøízy dle pøedešlých studií , u kterých byla využita metoda stanovení sIgE na alergeny bøízy Bet v 1 a Bet v 2. Materiál a metody Vyšetøili jsme celkem 44 pacientù, kteøí tvoøili 2 skupiny: I. skupinu tvoøilo 34 pacientù (prùmìrný vìk 24,2 ± 11,3, rozmezí 6–44 1et, 15 mužù/19 žen) s klinickými projevy polinózy pøedevším v jarních mìsících. Byli vybráni na základì klinických pøíznakù vyvolávajících podezøení na senzibilizaci alergeny bøízy. Dalším kritériem byla pozitivita kožního prick testu s komerèním extraktem bøízy. Nejèastìjší projevy senzibilizace byly sezonní alergická rhinitis, conjunctivitis, u nìkterých i projevy sezonního asthma bronchiale. Vìtšina pacientù byla senzibilizována i na další pyly. Kontrolní II. skupinu tvoøilo 10 pacientù (prùmìrný vìk 42,4 ± 10,7, rozmezí 24–55 let, 1 muž/9 žen) s negativní rodinnou i osobní anamnézou ve smyslu atopie, s negativitou kožního prick testu na základní øadu inhalaèních alergenù. Alergie 2/2005

Vyšetření 1. Kožní prick test (SPT) Byl proveden s alergenem bøízy testovací komerèní soupravou Alyostal fy Stallergens s použitím lancet Stallergens. Jako pozitivní kontrola byl použit histamin hydrochlorid (10mg/ml), negativní kontrola byla provedena s NaCl 0,9 %.Výsledek byl odeèítán za 15 minut. Za pozitivní reakci byl hodnocen pupen o prùmìru 3 mm a více pøi srovnání s negativní kontrolou. 2. Stanovení sIgE Specifické IgE na alergen bøízy bylo stanoveno na pøístroji Immulite 2000 (DPC). Jako pozitivní byla považována hodnota nad 0,35 U/ml. 3. Test aktivace bazofilù Postup stanovení tak, jak byl publikován (18), byl v nìkolika bodech modifikován: Vyšetøení bylo provádìno z plné krve odebrané do heparinu. Na 1 test bylo tøeba 100 ul krve. Pro každého pacienta byla stanovena negativní kontrola (bez stimulace) a pozitivní kontrola (stimulace 0,4 ug anti-IgE). Stimulace bunìk byla provedena 10× øedìným alergenem Alyostal (Stallergenes) a rekombinantními alergeny rBet v 1 a rBet v 2 (10 ul 0,01 mg/ml, Biomay). Detekce bazofilù byla provádìna pomocí monoklonální protilátky anti-CD203c/PE (Beckmann-Coulter). Aktivace byla detekována protilátkou anti-CD63/FITC (Exbio). Mìøení bylo provádìno na prùtokovém cytometru FC 500 (Beckmann-Coulter). Pro každý vzorek byla provedena detekce nejménì 500 bazofilù a na tomto množství i sledována exprese aktivaèního znaku CD63. Jako pozitivní výsledek byla považována aktivace více než 15 % bazofilù (> 15 % CD203+CD63+). Statistická analýza Pro statistické zpracování a srovnání hodnot aktivovaných bazofilù CD63+ u senzibilizovaných pacientù a kontrolní skupiny byl použit Studentùv t-test. Stejným testem byly srovnány hodnoty BAT u senzibilizovaných pacientù a kontrolní skupiny s extraktem bøízy, rBet v 1 a rBet v 2. Ke srovnání výsledkù hodnot specifického IgE s alergenem bøízy a testu aktivace bazofilù s extraktem bøízy byl použit χ-kvadrát test. Výpoèet citlivosti a specifity testu aktivace bazofilù byl proveden metodou dle Goldmana (4). Pravdivì pozitivní výsledek (TP) byl definován jako pacient s projevy polinózy a pozitivním SPT na pyl bøízy. Za falešnì pozitivní (FP) byl považován pacient s negativní alergickou anamnézou, negativním SPT s pylem bøízy a pozitivním BAT s extraktem bøízy (pozitivním sIgE bøíza). Pravdivì negativní výsledek (TN) byl definován jako pacient s negativní alergickou anamnézou a negativním SPT. Falešnì negativní výsledek (FN) byl urèen u pacienta s polinózou, pozitivním SPT a negativním BAT s extraktem bøízy (sIgE bøíza). Senzitivita = TP/(TP + FN) Specifita = TN/(TN + FP)

105

původní práce Výsledky

Tab. 1: Vypoètené hodnoty citlivosti a specifity dle Goldmana

V kontrolní skupinì 10 pacientù nebyl zaznamenán falešnì pozitivní výsledek v testu aktivace bazofilù s komerèním exktraktem bøízy, s rBet v 1, rBet v 2. Žádný z pacientù kontrolní skupiny nemìl pozitivní hodnotu sIgE na alergen bøízy. Výsledek pacienta senzibilizovaného na alergeny bøízy v prùtokovém cytometru je znázornìn na obrázku 1. V I. skupinì 34 pacientù s polinózou byla prùmìrná procentuální hodnota aktivovaných CD63+ bazofilù po inkubaci s PBS (negativní kontrola) 3,2 % (SD ± 1,9 %) ve srovnání s prùmìrnou hodnotou 3,49 % bazofilù (SD ± 1,7 %) u 10 kontrolních pacientù ve II. skupinì. Inkubací bazofilù s anti-IgE (pozitivní kontrola) u 34 polinotikù byla zjišA

B

102

103 F1 0,0 %

F1 102 0,0 %

F2 2,2 %

101 100

101

F3 0,0 %

F3 100 0,0 %

F4 97,8 %

100 101 102 CD203c/PE

F1 0,0 %

F2 72,9 %

10

101 100

103

D 103 CD63/FITC

CD63/FITC

10

2

F4 32,9 %

100 101 102 CD203c/PE

103

C 103

F2 67,1 %

CD63/FITC

CD63/FITC

103

2

F1 0,0 %

F2 0,2 %

101

F3 0,0 %

F4 27,1 %

100 101 102 CD203c/PE

F3 100 0,0 %

103

F4 99,8 %

100 101 102 CD203c/PE

103

Obr. 1: Exprese aktivaèního znaku CD63 na bazofilech (CD203c) pacienta senzibilizovaného na pyl bøízy.

97

sIgE

100

92

tìna prùmìrná hodnota 78,9 % aktivovaných bazofilù (SD ± 13,0 %), u kontrolní II. skupiny 79,6 % (SD ± 9,5 %) (graf 1). Srovnáním hodnot neaktivovaných a aktivovaných bazofilù u senzibilizovaných pacientù a kontrolní skupiny nebyl zjištìn významný rozdíl (p > 0,05). V I. skupinì zareagovalo v testu aktivace bazofilù s extraktem bøízy Alyostal 33/34 pacientù (97 %), pozitivita sIgE byla zjištìna u 31/34 pacientù (91,1%). Nebyl zjištìn statisticky významný rozdíl mezi hodnotami sIgE a BAT pøi hladinì významnosti 0,05 (p = N.S.). Citlivost BAT pro extrakt bøízy vypoètena dle Goldmana byla 97 %, pro sIgE 92 %. Specifita obou testù v našem souboru byla 100 % (tab. 1). Inkubací bazofilù s extraktem bøízy, rBet v 1 a rBet v 2 v I. skupinì byly dosaženy tyto prùmìrné procentuální hodnoty: extrakt bøízy 71,6 % (SD ± 22,3%), rBet v 1 72,9 % (SD ± 21,9 %), rBet v 2 68,8 % (SD ± 28,4 %). Ve II. skupinì kontrolních pacientù byly zjištìny prùmìrné hodnoty aktivace bazofilù s extraktem bøízy 2,2 % (SD ± 0,9 %), rBet v 1 1,7 % (SD ± 1,1 %), rBet v 2 2,1 % (SD ± 1,33 %) (graf 2). Srovnáním hodnot senzibilizovaní pacienti dosáhli signifikantnì vyšší procento aktivovaných bazofilù po stimulaci alergenem bøízy, rBet v 1 a rBet v 2 oproti kontrolní skupinì (p < 0,05). Profil senzibilizace v I. skupinì pacientù na jednotlivé rekombinantní alergeny bøízy v testu aktivace bazofilù je znázornìn v grafu 3. 32/34 (94,1 %) pacientù reagovalo pozitivnì v BAT s rekombinantním alergenem bøízy Bet v 1. Na vedlejší alergen bøízy Bet v 2 zareagovalo celkem 13/34 (38,2 %) pacientù. Pozitivita na oba rekombinantní alergeny byla zachycena u 12/34 (35,2 %) pacientù. Pozitivita pouze na hlavní alergen Bet v 1 byla zachycena u 20/34 (58,8 %) pacientù.

100

100

90

90

80

80

70 60 50 40 30

70 60 50 40 30

20

20

10

10

0

pozitivní kontrola kontrolní skupina

negativní kontrola polinotici

Graf 1: Prùmìrné hodnoty testu aktivace bazofilù u pozitivních a negativních kontrol

106

Citlivost %

100

% CD203+ CD63+

% CD203+ CD63+

A = buňky bez stimulace, B = stimulace extraktem břízy, C = rBet v1, D = rBet v2

Specifita % BAT

0

bříza kontrolní skupina

rBet v 1

rBet v 2 polinotici

Graf 2: Prùmìrné hodnoty testu aktivace bazofilù s extraktem bøízy, rBet v 1, rBet v 2 u polinotikù a kontrolní skupiny

Alergie 2/2005

původní práce U 1/34 (2,9 %) pacienta byla zjištìna pozitivita pouze na vedlejší alergen bøízy Bet v 2.

Tab. 2: Návrh výbìru pacientù pro léèbu specifickou alergenovou imunoterapií alergeny bøízy Specifická alergenová imunoterapie alergenem břízy

Diskuse

terapeutický efekt vysoký

Hlavním cílem naší studie bylo zjistit, zda test aktivace bazofilù s využitím komerèního extraktu bøízy a rekombinantních alergenù Bet v 1, Bet v 2 je spolehlivou metodou k odhalení senzibilizace na tyto alergeny. Ve výsledcích nebyl zjištìn signifikantní rozdíl mezi pozitivitou sIgE na alergeny bøízy a výsledkem testu aktivace bazofilù s extraktem bøízy u pacientù s polinózou. U 2 pacientù s pozitivním SPT byl zachycen pozitivní BAT s extraktem bøízy bez pozitivity sIgE na alergen bøízy. Výsledky svìdèí o vìtší senzitivitì i specifitì u vyšetøení BAT. Pozitivita BAT s rBet v 1 byla zachycena u 32/34 (94,1 %) pacientù. Výsledek koreluje s prevalencí v zemích støední Evropy zjištìné stanovením sIgE na rBet v 1 v pøedešlých studií (90–98 %) (16, 17). Celkem zareagovalo v BAT na vedlejší alergen bøízy rBet v 2 13/34 pacientù (38,2 %). Prevalence na tento alergen v zemích støední Evropy u bøízových alergikù je udávána mezi 20–43 % (16, 17). Rekombinantní alergeny mohou být využity jako diagnostický znak senzibilizace, který charakterizuje daného pacienta a který mùže pomoci ke zvolení optimálního terapeutického postupu (14, 21). IgE reaktivita k vysoce zkøíženì reagujícím alergenùm identifikuje pacienta s vysokým rizikem vývoje alergických symptomù z mnoha alergenních zdrojù (9). Tato polysenzibilizace je udávána jako rizikový faktor pro vývoj asthma bronchiale a pro vznik orálního alergického syndromu (OAS) (12). Pøi rozboru klinických pøíznakù u našich pacientù, kteøí zareagovali pozitivnì s panalergenem bøízy Bet v 2, byly u vìtšiny tìchto pacientù zjištìny klinické projevy další senzibilizace – projevy OAS, asthma bronchiale, senzibilizace na další pyly. V návaznosti na zpøesnìní diagnostiky na jednotlivé alergeny bøízy je možno následnì lépe urèit terapeutický postup. U pacientù s profilin-senzibilizací bude léèba komerèními extrakty bøízy používanými pøi specifické aler-

rBet v 1 +, rBetv 2 -

terapeutický efekt střední rBet v 1+, rBetv 2 +

terapeutický efekt nízký rBetv 1-, rBet v 2+

genové imunoterapii obtížnìjší (9, 14). Tyto extrakty jsou standardizovány pouze na hlavní alergen, obsah vedlejších alergenù vìtšinou není pøesnì urèen a nemusí být vždy dostateèný. Pacienti, kteøí jsou senzibilizováni pøedevším na hlavní alergen bøízy Bet v 1, budou mít velký profit pøi léèbì specifickou alergenovou imunoterapií. U pacientù, kteøí reagují v malé míøe na hlavní alergen bøízy Bet v 1 a pøedevším u tìch, kteøí reagují jen na nìkteré vedlejší bøízové alergeny, lze oèekávat malý efekt této léèby (9, 14, 20). Dle literárních údajù by se mìl výbìr pacientù s alergií na pyl bøízy pro alergenovou imunoterapii øídit schématem, který je znázornìn v tabulce 2 (20, 14). Závěr Test aktivace bazofilù je novou in vitro metodou v diagnostice èasné pøecitlivìlosti. Z našich výsledkù vyplývá, že je metodou srovnatelnou se stanovením specifikého IgE a kožními prick testy pøi diagnostice alergie na pyl bøízy a mohl by v urèitých indikacích nahradit tato dosud rutinnì používaná vyšetøení. Test aktivace bazofilù zároveò patøí mezi diagnostické metody, které lze využít i pro diagnostiku alergie I. typu rekombinantními alergeny (21). Stanovení èasné pøecitlivìlosti na jednotlivé alergeny bøízy Bet v 1 a Bet v 2 pomocí tohoto testu umožní lépe odhalit profil senzibilizace daného pacienta a urèit riziko dalšího vývoje alergického onemocnìní. Pøesnìjší zjištìní senzibilizace na konkrétní alergen mùže pomoci pøi rozhodování o vhodném zpùsobu léèby. MUDr. Šetinová Ivana Imunologické centrum, Imumed, Praha e-mail: [email protected]

34 pacientů test aktivace basofilů (BAT) s extraktem břízy pozitivní sIgE na alergen břízy pozitivní pozitivní BAT rBet v 1 a negativní rBet v 2 pozitivní BAT rBet v 1 a rBet v 2 negativní BAT rBet v 1 a pozitivní rBet v 2

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90 100

%

Graf 3: Profil senzibilizace na alergeny bøízy u polinotikù. SPT bøíza pozitivní u 34 pacientù.

Alergie 2/2005

LITERARURA 1. Asero R, Mistrello G, Roncarolo D et al. Detection of clinical markers of sensitization to profilin in patients allergic to plant-derived foods. J Allergy Clin Immunol 2003; 112:427–432. 2. Ebo DG, Hagendorens MM, Bridts CH et al. Sensitization to cross-reactive carbohydrate determinants and the ubiquitous protein profilin: mimickers of allergy. Clin Exp Allergy 2004; 34: 137–140. 3. Ebo DG, Hagendorens MM, Bridts CH et al. In vitro diagnosis: should we follow the flow? Clin Exp Allergy 2004; 34:332–9. 4. Erdman SM, Heussen N, Moll-Slodowy S et al. CD63 expresion on basophils as a tool for diagnosis of pollen-associated food allergy: sensitivity and specificity. Clin Exp Allergy 2003; 33:607–614. 5. Ferreira F, Hawranek T, Gruber P et al. Allergic cross-reactivity: from gene to the clinic. Allergy 2004; 59:243–267.

107

původní práce 6. Harwanegg C, Laffer S, Hiller R et al. Microarrayed recombinant allergens for diagnosis of allergy. Clin Exp Allergy 2003; 33: 7–13. 7. Honzová S, Havranová M. Test aktivace basofilù, jeho pøínos pro klinickou praxi. Alergie 2003; 4:292–7. 8. Chapman MD,Smith AM,Vailes LD et al. Recombinant allergens for diagnosis and therapy of allergic disease. J Allergy Clin Immunol 2000; 106:409–418. 9. Kazemi-Shirazi L, Niederberger V, Linhart B et al. Recombinant marker allergens: Diagnostic gatekeepers for the treatment of allergy. Int Arch Allergy Immunol 2002; 127:259–268. 10. Mahler V, Fischer S, Heiss S et al. cDNA cloning and characterization of a cross-reactive birch polen allergen: identification as a pectin esterase. Int Arch Allergy Immunol 2001; 124:64-6. 11. Mahler V, Vrtala S, Kuss O et al. Vaccines for birch pollen allergy based on genetically hypoallergenic derivatives of the major birch pollen allergen, Bet v 1. Clin Exp Allergy 2004; 34:115-122. 12. Mari A. Multiple pollen sensitization: a molecular approach to the diagnosis. Int Arch Allergy Immunol 2001; 125:57–65. 13. Midoro-Horiuti T, Brooks EG, Goldblum RM. Pathogenesis-related proteins of plants as allergens. Ann Allergy Asthma Immunol 2001; 87:261–271. 14. Mothes N,Valenta R. Biology of Tree Pollen Allergens. Curr Allergy Asthma reports 2004; 4:384–390. 15. Mothes N, Horak F, Valenta R. Transition from a botanical to a molecular classification in tree pollen allergy: Implications for diagnosis and therapy. Int Arch Allergy Immunol 2004; 135: 357–373. 16. Movérare R, Westritsching K, Svensson M et al. Different IgE reactivity profiles in birch pollen-sensitive patients from six European populations revealed by recombinant allergens: an imprint of local sensitization. Int Arch Allergy Immunol 2002; 128:325–335.

108

17. Rossi RE, Monasterolo G, Monasterolo S. Detection of specific IgE antibodies in the sera of patients allergic to birch pollen using recombinant allergens Bet v 1, Bet v 2, Bet v 4: evoluation of different IgE reactivity profiles. Allergy 2003; 58:929–932. 18. Sanz M, Sánchez G, Gamboa P. Allergen-induced basophil activation: CD63 cell expresision detected by flow cytometry in patients allergic to Dermatophagoides pteronyssinus and Lolium perenne. Clin Exp allergy 2001; 31:1007–1013. 19. Saporta M, Kamei S, Persi L et al. Basophil activation during pollen season in patient monosenzitized to grass pollens. Allergy 2001; 56:442–445. 20. Špièák V. Poselství J. Lišky a specifická alergenová imunoterapie (SAIT). Alergie 2003; 4:317–321. 21. Valent R, Hauswirt AW, Natter S. Assays for measuring in vitro basophil activation induced by recombinant allergens. Methods 32 2004;265–270. 22. Valenta R, Duchene M, Vrtala S et al. Recombinant allergens for immunoblot diagnosis of tree-pollen allergy. L Allergy Clin Immunol 1991; 88:889–894. 23. Valenta R, Lidholm J, Niederberge V et al. The recombinant allergen-based concept of component-resolved diagnostics and immunotherapy (CRD and CRIT). Clin Exp Allergy 1999; 29: 896–904. 24. Van Ree R. Carbohydrate epitopes and their relevance for the diagnosis and treatment of allergic diseases. Int Arch Allergy Immunol 2002; 129:189–197. 25. Van Ree R, Van Leeuwen WA, Akkerdaas JH et al. How far can we simplify in vitro diagnostics for Fagales tree pollen allergy? A study with three whole pollen extracts and purified natural and recombinant allergens. Clin Exp Allergy 1998; 29:848–855.

Alergie 2/2005