Témavezető: Kötelesné Suszter Gabriella

⎯⎯⎯ Tudományos Diákköri Dolgozat ⎯⎯⎯

ÁMENT ZSUZSANNA Peszticidek meghatározása alacsony zsírtartalmú élelmiszerekből keverőbabás extrakció alkalmazásával

Témavezető: Kötelesné Suszter Gabriella

⎯⎯⎯ Eötvös Loránd Tudományegyetem ⎯⎯⎯ ⎯⎯ Természettudományi Kar ⎯⎯ ⎯ Budapest, 2007 ⎯

Tartalomjegyzék 1. Bevezetés ............................................................................................................................3 2. Irodalmi áttekintés ..............................................................................................................3 2.1. Növényvédelem, mely egyidős a mezőgazdasággal........................................................3 2.2. Szennyezett növényzet, peszticidek jelenlétét befolyásoló tényezők ..............................4 2.3. Növényvédő szerek szabályozása ....................................................................................5 2.4. A peszticidek felosztása...................................................................................................6 2.5. Módszerek a növényvédőszer-hatóanyagok koncentrációjának meghatározására ..........7 2.5.1. Extrakciós eljárások .....................................................................................................8 2.5.1.1. Folyadék-folyadék extrakció (LLE) .........................................................................8 2.5.1.2. Szilárd fázisú extrakció (SPE)..................................................................................8 2.5.1.3. Szilárd fázisú mátrix diszperzió (MSPD).................................................................9 2.5.1.4. Szilárd fázisú mikroextrakció (SPME).....................................................................9 2.5.1.5. Keverőbabás extrakció (SBSE) ..............................................................................10 2.6. Retenciós idő zárolás (RTL) ..........................................................................................12 2.7. A növényvédő szer hatóanyagok detektálási módszerei................................................13 2.8. Tömegspektrumos dekonvolúció (AMDIS) ..................................................................14 3. Kísérleti rész .....................................................................................................................16 3.1. Célok ..............................................................................................................................16 3.2. A minta feldolgozásának menete ...................................................................................16 3.3. Vizsgált növényvédő szerek ..........................................................................................17 3.4. A minta-előkészítés során végzett extrakció hatásfokának vizsgálata ..........................21 3.5. A keverési idő optimálása..............................................................................................22 3.6. A mintabevitel................................................................................................................23 3.7. Elemzés ..........................................................................................................................24 3.8. Kondicionálás, tisztítás ..................................................................................................25 3.8.1. A keverőbabák kezelése és kondicionálása................................................................25 3.8.2. Twiszter csövek és fiolák tisztítása ............................................................................26 3.9. Külső kalibrációval végzett mérések .............................................................................27 4. Validálás ...........................................................................................................................28 4.1. A validálás során vizsgált teljesítményjellemzők:.........................................................31 4.1.1. Specifikusság vizsgálata.............................................................................................32 4.1.2. Linearitás vizsgálata...................................................................................................34 4.1.3. Az elméleti kimutatási határ (LOD) és a mennyiségi meghatározás határának (LOQ) megadása.......................................................................................................................35 5. Összefoglalás ....................................................................................................................36 6. Irodalomjegyzék ...............................................................................................................38

2

1. Bevezetés A peszticid szó jelentése kártevőt ölő szer, olyan anyag, illetve készítmény, amely elpuszítja a nemkívánatos élőlényeket. Évszázadokkal ezelőtt alkalmazásukat az életfeltételek javítása, jó minőségű és kellő mennyiségű élelmiszer előállítása vezérelték. Mára világossá vált, hogy ezen anyagok használata aggodalomra ad okot, mert a legtöbb esetben feltételezhető mutagén, teratogén, karcinogén hatás is [1,2]. Így a kezdeti célok, a jobb életfeltételek és a jó minőségű élelmiszerek igencsak megkérdőjeleződnek, a gazdasági érdek azonban, amely a kellő mennyiséget szorgalmazza, sok esetben erősebbnek bizonyul. Ezen kettős érdekek egyensúlyban tartását célozzák meg azok a jogszabályok, melyek a határértékeket szabnak az egyes hatóanyagok koncentrációjára. Követelmény, hogy a kijuttatott anyagok megjelenése és koncentrációja folyamatos kontroll alatt álljon, melyhez megfelelő teljesítőképességű, modern analitikai módszerek szükségesek. Egy új, korszerű analitikai módszer megjelenését általában hosszú periódus követ, melynek során a technika kipróbálásra és publikációra kerül. Egy rutinanalitikai labor esetében ez az időintervallum akár megkétszereződhet, hiszen a rutin alkalmazást meg kell előzze a módszer validálása, és annak hivatalos szervek általi jóváhagyása. A Wessling Hungary Kft. Élelmiszervizsgáló Laboratóriumában végzett munkám célja egy modern módszer rutinanalitikába való átültetése, validálása, mely kiválthatja a gyakran lassabb, nagy oldószerigényű, szabványosított eljárásokat. 2. Irodalmi áttekintés 2.1. Növényvédelem, mely egyidős a mezőgazdasággal Az évezredek során a létfenntartás ösztöne az emberiséget mindig is arra késztette, hogy a megélhetését biztosító terményeket védelmezzék az azonos ösztön által vezérelt egyéb fajokkal szemben. A gombaölő hatású ként, mint füstölőszert, Kínában már időszámításunk előtt 1000-ben használták. A XVI. században Japánban és Kínában arzén vegyületeket

3

alkalmaztak, mint inszekticid (rovarölő) anyagokat. Európában 1800-ban kezdték alkalmazni az arzén vegyületeket, és az 1900-as években jegyezték az első mérgezési eseteket, arzén tartalmú gyümölcsök és zöldségek fogyasztása után [3]. Peszticidekként 1940 előtt elsősorban szervetlen vegyületeket alkalmaztak, valamint néhány növényi eredetű molekulát, mint például a nikotint vagy permetrint. Az első szintetikus szerves peszticid, a DDT alkalmazása az 1930-as évekre nyúlik vissza. A világ teljes DDT termelése 1960 körül érte el a legmagasabb értéket, közel százezer tonnát, ezután meredeken visszaesett [4]. A DDT-t karbamátok és szerves foszfátok váltották ki, melyek kémiailag sokkal kevésbé stabilisak, és így az élő szervezetekben kisebb mértékben halmozódnak fel, azonban nagyobb reakciókészségük miatt erőteljesebben mérgezőek. 2.2. Szennyezett növényzet, peszticidek jelenlétét befolyásoló tényezők A

peszticidek

előfordulása

a

zöldségekben,

gyümölcsökben

és

ezen

alapanyagokból előállított termékekben egyrészt a növényvédő szerek nem megfelelő kezeléséből, esetleg ipari, kereskedelmi, vagy mezőgazdasági balesetekből adódhat. Másrészt viszont ezek az anyagok helyes mezőgazdasági gyakorlat esetén is közvetlenül a védeni kívánt terményekre, termésekre kerülnek. A növényen, ill. a növényben lévő koncentrációt többek között befolyásolhatja a klíma (esőzés, hőmérséklet, felszíni vizek szennyezettségének mértéke), a növényvédő szer vízoldhatósága, illékonysága, a kezelés során alkalmazott szerformátum, a kezelés módja (állománykezelés, felületre történő permetezés, talajba való bedolgozás, csávázás, légi kijuttatás stb.), az alkalmazott dózis, az alkalmazás ütemezése, a növényvédő szer kémiai és biológiai stabilitása (perzisztencia), eltarthatósága (gyorsan ill. lassan bomló). A vegyületek bomlása szempontjából, két fontos tényezőt kell figyelembe venni: a bomlás ütemét és módját. Ezek a tulajdonságok az egyes komponensekhez rendelhetőek meghatározott körülmények között, de nagyon különbözőek is lehetnek különböző célnövények esetében. A peszticidek toxikus hatása az együttesen zajló fizikai, kémiai és biológiai folyamatok következtében szűnik meg.

4

A kémiai degradáció körébe tartozik minden olyan lebomlási folyamat, mely nem igényel közvetlen kölcsönhatást a növénnyel. A kémiai lebomlás az alábbiak szerint történhet: •

Oxidáció: pl. β-oxidáció, hidroxilezés, dealkilezés, dehidrogénezés, epoxidáció, szulfoxidáció, gyűrűhidroxilezés, -hasítás

•

Redukció: pl. dekarboxileződés, dehidrohalogénezés, hidrolízis, dehalogénezés, alkilezés, konjugációs reakciók stb.

A kémiai bomláshoz általában aktiváció kell, amely lehet termikus, foto-, radio- vagy elektrokémiai. Az összes, a peszticidek bomlásában szerepet játszó folyamat közül rendszerint a mikrobiológiai bomlást tartják a legjelentősebbnek. A mikroorganizmusok azon tulajdonságát, hogy bizonyos peszticideket képesek lebontani, először Audus mutatta be [5], más kutatók, mint például Fellsott [6] rámutattak, hogy egyes növényvédő szerek ugyanazon a területen történő ismételt alkalmazása a mikrobiológiai bomlásuk akkora mértékű felgyorsulásához vezethet, hogy azok elvesztik hatékonyságukat. 2.3. Növényvédő szerek szabályozása Az ENSZ Élelmezésügyi Szervezete (FAO) és az Egészségügyi Világszervezet (WHO) indította el 1963-ban a Codex Alimentarius Programot, amely nemzetközileg elfogadott

élelmiszerszabványokat

dolgoz

ki.

A

nemzetközileg

elfogadott

élelmiszerszabványokon felül a Codex tartalmaz előírásokat az élelmiszerhigiéniára, adalékanyagokra, peszticid maradékokra, egyéb szennyezőkre, címkézésre, az analitikai és mintavételezési módszerekre vonatkozóan. A peszticidekkel és a megengedett maximális mennyiségükkel külön kötet foglalkozik [7]. Az Európai Unió korábban a tagországok döntéshozó testületeinek csak ajánlást adott az egészségügyi határértékekről. 2005. Február 23-a óta az eddigi irányelvek helyett rendeletben szabályozza a szermaradékok határértékeit (396/2005/EC). Az új rendelet az egész Európai Unió összes tagállamára érvényes határértékeket szab meg. Egységes határértékeket ad meg a növényi és állati eredetű termékekre, valamint gabonafélékre, noha az eddigi gyakorlat szerint a három terület külön elbírálás alá esett. Abban az

5

esetben, ha egy engedélyezett hatóanyag–termény párra nincsenek toxikológiai adatok egységes 10 µg/kg-os határértéket engedélyeznek. Magyarországon az EüM-FVM együttes, folyamatosan frissülő rendelet szabályozza az egyes peszticidekre és a növényi mátrixokra vonatkozó határértékeket, illetve az esetleges tiltásokat. Az engedélyezett, korlátozott, illetve tiltott szerek listája megtalálható a Növény- Talaj- és Agrárkörnyezet-védelmi Igazgatóság honlapján [8]. 2.4. A peszticidek felosztása A növényvédőszer-hatóanyagok felosztása, illetve besorolása a veszélyesség, a kémiai szerkezet, a felhasználás módja, valamint a hatás és hatásmechanizmus alapján történik. Az egységes felosztás jelenleg nem megoldott. A WHO által javasolt felosztás [9]: Vegyi felosztás, és a kategóriák nemzetközi rövidítései: • Arzén-vegyületek (AS) • Bipiridilium származékok (BP) • Karbamátok (C) • Kumarin származékok (CO) • Réz-vegyületek (CU) • Higany-vegyületek (HG) • Nitrofenol származékok (NP) • Szerves klór-vegyületek (OC) • Szerves foszfátok (OP) • Szerves ón-vegyületek (OT) • Fenoxi-ecetsav származékok (PAA) • Pirazolok (PZ) • Piretroidok (PY) • Triazin származékok (T) • Tiokarbamátok (TC) Felhasználás szerinti felosztás, és a kategóriák nemzetközi rövidítései: • Aficid (levéltetű írtó, AP) • Akaricid (atkaölők, AC) • Bakteriosztatikus peszticidek (fertőtlenítők, B) • Fumigánsok (füstölők, FM) • Fungicidek (gombaölőszerek, F) • Herbicidek (gyomirtók, H) • Inszekticidek (rovarölőszerek, I) • Larvicidek (lárvaölőszerek, L) • Miticidek (atkaölőszerek, MT)

6

• • • • •

Molluszcidek (puhatestűek elleni szer, M) Nematocidek (féregőlők, N) Növényi fejlődést szabályozó peszticidek (PGR) Rodenticidek (rágcsálóirtók, R) Talajra alkalmazott peszticidek (S) A felsorolás jól érzékelteti, hogy az analitikai feladatok a peszticidek meghatározását

illetően mennyire szerteágazóak. Jól tükrözi ezt a minta-előkészítési és a detektálási módszerek sokasága is. 2.5. Módszerek a növényvédőszer-hatóanyagok koncentrációjának meghatározására A növényvédő szerek, mint nyomszennyezők környezeti elemekben való kimutatására több száz módszer született, mióta a szintetikus növényvédő szerek alkalmazásával

egyidejűleg

fejlődésnek

indult

a

növényvédőszer-analitika.

Általánosságban a szermaradékok analitikájában megkülönböztetünk egy bizonyos komponens mérésére alkalmas, „single-compound” és több hatóanyag egyidejű mérésére alkalmas, „multi-residue” módszereket. Egy komponens, ill. egy vegyületcsalád kimutatására alkalmas eljárásokat rendszerint a gyártó cégek fejlesztették ki az általuk gyártott termékekre, és az engedélyezéshez kapcsolódó vizsgálatok folyamán is ezeket alkalmazták. Ma a növényvédő szerek nagy száma, valamint az osztályokba sorolás nehézségei miatt nem alkalmazhatóak ezek a módszerek, így a mai rutin analitikai eljárásokban arra törekednek, hogy a több száz növényvédő szerből minél többet meghatározzanak minél kevesebb mérésből. Gyors és hatékony módszerekre van szükség ahhoz, hogy még a gyorsan romló élelmiszerek esetén is ellenőrzött termék kerülhessen a fogyasztókhoz. A helyes kontroll alapja az élelmiszeranalitikában is a helyes mintavétel valamint a minta alapos homgenizálása, mely meghatározó szerepet játszik az eljárás során, és nagyban befolyásolja a helyes mérési eredményt. A mintavételezéssel szemben támasztott fő elvárás, hogy reprezentatív legyen, ezért egyes estekben speciális mintavevő eszközöket alkalmaznak. Ezután következik a minta feldolgozása.

7

A mintavétellel, a minták szállításával és tárolásával kapcsolatos munkálatokat szakemberek végezték, és ez a fázis nem képezte vizsgálataim tárgyát, valamit munkám során a feladat jellegéből adódóan „multi-residue” módszer alkalmazása szükségszerű, így a továbbiakban ezeket a módszereket tekintem át. 2.5.1. Extrakciós eljárások A multi-residue módszerek közös jellemzője hogy olyan extrakciós eljárásokat próbálnak alkalmazni, ami a meghatározást végző műszer számára a hatóanyagokat alkalmas oldószerben tartalmazó extraktumot eredményez, ugyanakkor minél kevesebb egyéb szennyező anyagot (mátrixalkotót) visz be a készülékbe. 2.5.1.1. Folyadék-folyadék extrakció (LLE) Szerves komponensek extrahálására használt eljárás (Liquid-liquid Extraction), melynek során az oldott meghatározandó anyag

megoszlik

az

extrahálandó

mártrixalkotók és az ezekkel nem elegyedő oldószer között. A használt oldószerek (diklór-metán, dietil-éter, etil-acetát, kloroform, hexán, petroléter, toluol) nagy része ártalmas a dolgozók egészségére és a környezetre, ezen túlmenően a módszer időigényes és nagy mennyiségű oldószer felhasználásával jár, ezért egyre kevésbé felel meg a mai modern analitikai laboratóriumra vonatkozó követelményeknek. A klasszikus módszert (LLE) az élelmiszeranalitikában régóta alkalmazzák, növényvédőszer-analitikában pedig a nyers (pl. vizes, acetonos) extraktban oldott hatóanyagok szerves fázisba vitelére [10], vagy olyan élelmiszereknél, melyeknél egyszerű rögtön folyadék fázisból kiindulni, mint például a méz esetében [11]. 2.5.1.2. Szilárd fázisú extrakció (SPE) A szilárd fázisú extrakció (Solid Phase Extraction), oszlopkromatográfiás módszer, melynek során a tisztítandó extraktumot meghatározott sebességgel (általában vákuumot alkalmazva) átbocsátják egy adszorbenst tartalmazó kolonnán, melyen a célkomponensek megkötődnek. [12].

8

Az extraktumok további tisztításának szükségességét számos tényező határozza meg. Ilyenek pl. a mátrixot felépítő egyéb anyagok, a mérendő koncentrációszint, a detektálási módszer és az extrakciós módszer szelektivitása. A legelterjedtebben alkalmazott módszer a gél permeációs kromatográfia (GPC). Az eljárás fizikai alapú, molekulaméret szerinti szeparáció. Azok a komponensek eluálódnak elsőként az oszlopon, amelyek a töltetpórusokba nem férnek bele. Az oszlopok hosszú élettartalmúak, és a módszer automatizálható [13]. 2.5.1.3. Szilárd fázisú mátrix diszperzió (MSPD) A szilárd fázisú mátrix diszperzió (Matrix Solid Phase Dispersion) a szilárdfázisú extrakcióval rokon, leggyakrabban zöldség és gyümölcs elemzésénél, vagy nehezen kezelhető minták (pl. tojás) esetén alkalmazzák. A módszer leegyszerűsíti és meggyorsítja a minta-előkészítés folyamatát, mivel egyetlen lépésbe tömöríti a minta homogenizációját, a sejtek roncsolását és a minta „felvitelét” a por állagú fázisra, mely gyakran az SPE töltetek közül kerül ki. A töltetet eldörzsölik a homogenizált mintával, az így nyert keveréket SPE patronba töltik, majd kondícionálás, tisztítás után leoldják a vizsgálandó komponenseket [14]. 2.5.1.4. Szilárd fázisú mikroextrakció (SPME) A szilárd fázisú mikroextrakciót (Solid Phase Micro Extraction) J. Pawliszyn fejlesztette ki [15, 16], majd a Supelco cég szabadalmaztatta és forgalmazza. A SPME lényege egy kvarc- vagy fémszál (fíber), amelynek felületére kémiai kötéssel különböző polimer folyadékfilmet rögzítenek. A polimer lehet poláris (pl. polimetakrilát) vagy apoláris (pl. polidimetil-sziloxán), mely a szálon vékony megosztó fázist alkot, ami a minta gőzterébe (ez az ún. headspace SPME, azaz HS-SPME), vagy a vízmintába helyezve szelektíven adszorbeálja a minta egyes komponenseit. Az adszorpciót követően a fíbert a gázkromatográf 200–300 °C-ra fűtött injektorába helyezve, az extrahált komponensek termikusan deszorbeálódnak, és az analízis elvégezhető.

9

A SPME-vel történő minta-előkészítés rendkívül egyszerű és gyors, a szükséges mintatérfogat 5–20 cm3, emellett nagy a dúsítás mértéke (körülményektől függően 102– 105-szeres), így alacsony kimutatási határ érhető el. 2.5.1.5. Keverőbabás extrakció (SBSE) A keverőbabás extrakció (Stir Bar Sorptive Extraction) egy egyensúlyi megoszláson alapuló új technika, melyet Baltussen és kutatócsoportja fejlesztett ki, és a Gerstel cég Twister© néven forgalmaz [17]. Az elv hasonlít a SPME-hez, egy keverőbabára felvitt polimer réteg extrahálja a mérendő komponenseket a mintából. A polimer (jelenleg csak polidimetil-sziloxán (PDMS) kapható) fázist olyan üvegtestre viszik fel amely a mágneses részt burkolja (1.a ábra), így megvalósítható a kevertetés, melynek során az extrakció mellett a minta agitálása is biztosított. (A twister másik – szintén SPME-hez hasonló – alkalmazása a gőztér analízis (1. c. ábra)). Az adszorpciós lépés után az extrahált komponenseket visszaoldhatjuk vagy lefűthetjük.

1.a. ábra: A keverőbaba,

b: SBSE,

c:HS-SBSE

A visszaoldást (2. ábra) általában HPLC-s elemzés esetén alkalmazzák, vagy ha a lefűtéshez szükséges speciális egység nem áll rendelkezésre.

2. ábra: visszaoldás

10

Gázkromatográfiás elemzésnél a keverőbabát a mintából kivéve megszárítjuk, majd egy deszorpciós csőbe helyezzük. A lefűtés egy erre kialakított termodeszorber egységben történik (3.a. ábra), mely a gázkromatográfiás injektor fölé van szerelve (3.b. ábra).

3.a ábra: Termodeszorber egység (TDU),

b: Termodeszorber felépítése

A deszorpció két lépésből áll: a lefűtés a TDU-ban történik melyen beállítható a kezdő hőmérséklet, a felfűtési sebesség és a véghőmérséklet. A második lépés a csapdázás

a

programozhatóan

fűthető

injektorban

(Programable

Temperature

Vaporization PTV vagy Cooled Injection System CIS). Ezután a termodeszorbert lehűtjük, és pillanatszerűen felfűtjük az injektort, valamint elindul az oszlop hőmérsékletprogramja. Ezzel rávisszük a mintát az oszlopra, megtörténik az injektálás. A módszer extrakciós hatásfoka rendkívül nagy, mely részben a fázis méretének köszönhető (vastagsága 0,1–1 mm, térfogata kb. 50 µl), amely jóval nagyobb, mint a SPME esetében (vastagság 7–100 µm, térfogat kb. 0,5 µl), ahol könnyen előfordulhat a fíber túltelítése. A keverőbabás extrakciónál ennek valószínűsége nagyon csekély. Az extrahálható komponensek körét az egyes hatóanyagok Ko/w, azaz oktanol-víz megoszlási hányados értéke határozza meg. A gyakorlat azt mutatja, hogy azoknak a vegyületeknek a visszanyerése több mint 50%, amelyeknél a Ko/w > 100. Vagyis az irodalom alapján azok a vegyületek elfogadhatóan twiszterezhetőek, melyekre igaz, hogy a log Ko/w > 2 [18].

11

Az egyes komponensekre vonatkozó megoszlási hányadosok és az elméleti visszanyerési adatok a Gerstel által fejlesztett szoftverben (Twister Recovery Calculator) találhatóak meg. A módszer növényvédőszer-analitikai alkalmazása nagy jelentőségű, saját munkám szempontjából kiemelkedő fontossággal bír Prof. Pat Sandra és munkatársainak 2003-as közleménye, melyben keverőbabás extrakcióval meghatározott növényvédőszermaradékokat zöldség és gyümölcs mátrixokban vizsgálták retenciós idő zárolásos (RTL) GC-MS módszerrel [19] . 2.6. Retenciós idő zárolás (RTL) A retenciós idő zárolás, (Retention Time Locking) az Agilent által kifejlesztett szoftver-vezérelt

technika,

mely

elektronikus

nyomásszabályozóval

rendelkező

készülékeken alkalmazható. Lényege, hogy a végleges hőmérsékletprogrammal felvett standard kromatogram egyik, általunk kiválasztott csúcsára retenciós idő- vivőgáz nyomás görbét veszünk fel. Öt párhuzamos mérés kromatogramja alapján a rendszer rögzíti a retenciós időket az eredeti vivőgáznyomáson, majd ennek 10 és 20%-kal növelt, illetve csökkentett értéke mellett, és (öt pontos) kalibráló egyenest készít a retenciós idő vs. vivőgáz adatokból. Ha később karbantartási okokból vágunk az oszlopból, megváltozik a retenciós idő. Ekkor a rendszer az eredeti paraméterek által meghatározott görbe alapján új nyomás értéket számít ki, úgy, hogy a retenciós idő változatlan maradjon. A RTL használata előnyös lehet SIM (Selective Ion Monitoring) módszerek esetén, hogy tartani tudjuk a retenciós idő ablakokat, azonban még ennél is jelentősebb a kereskedelmi forgalomban lévő azonosító módszerek esetén. Az azonosító módszer tartalmazza az oszlophőmérséklet-programot, az alkalmazott oszlop típusát és a kiválasztott vegyületet, mely adatok segítségével azonos retenciós időket produkálhatunk tetszőleges számú vegyületre. Az Agilent peszticid RTL adatbázisában több mint 500 vegyület található [20].

12

2.7. A növényvédő szer hatóanyagok detektálási módszerei A szelektív gázkromatográfiás detektorok nélkülözhetetlen alapját alkotják a peszticidek azonosítási módszereinek. A detektálás alapja a vizsgálandó molekulában található heteroatom, illetve funkciós csoport. Az 1. táblázat tartalmaz néhány a növényvédőszer-maradék analitikában általánosan használt konvencionális detektort és szelektivitásukat [21]. Detektor Elektronbefogási detektor (ECD) Nitrogén-foszfor detektor (NPD) Elektrolitikus vezetőképességi detektor (ELCD) Lángfotometriás detektor (FPD)

Szelektivitás Halogének, CN, NO2, egyéb elektronbefogásra alkalmas csoportok Nitrogén és foszfor Halogének, kén, nitrogén Foszfor, kén, ón

1. táblázat: Peszticidek meghatározására alkalmas hagyományos GC detektorok A számos hatóanyagra jól használható GC-s technikák egyes vegyületcsoportokra (azok termikus instabilitása vagy kevésbé illékony voltuk miatt) nem alkalmazhatók közvetlenül. Ezekre tipikus példákat tartalmaz a 2. táblázat [22]. Vegyületcsoport Savas gyomirtó szerek Poláris gyomirtó szerek Fenil-karbamid gyomirtó szerek Szulfonil-karbamid gyomirtó szerek Oxim-karbamát rovarölő szerek Benzimidazol gombaölő szerek Ditiokarbamát gombaölő szerek Poláris gombaölő szerek

GC-vel nem vizsgálható vegyületcsoportok ill. vegyületek fenoxi-alkánsavak, benzoesavak, propionsavak paraquat, diquat, glifozát diuron, fenuron,izoproturon, neburon klórszulforon, metszulforon aldikarb, oxamil benomil, karbendazim maneb, mankoceb, cineb trifoorin, foseil-Al

2. táblázat: GC-s módszerekkel nem mérhető hatóanyagcsoportok és vegyülettípusok

13

Ezen vegyületek detektálása származékképzést követően GC-s módszerekkel, illetve származékképzés nélkül vékonyréteg-kromatográfiás vagy folyadékkromatográfiás méréssel valósítható meg. 2.8. Tömegspektrumos dekonvolúció (AMDIS) Mátrix komponensekkel erősen szennyezett minták esetében, vagy több vizsgálandó komponens koelúciója esetén nem valósul meg a teljes kromatográfiás elválasztás, a csúcsok átlapolhatnak, esetleg teljesen el is fedhetik egymást. Amennyiben tömegspektrométerrel detektálunk, lehetőségünk van az átfedő kromatográfiás csúcsok dekonvolúciójára az egyes komponensek tömegspektrumai alapján. A dekonvolúció egy tisztán matematikai eljárás, mely az egyes fragmensek intenzitásának időbeli változását követi, meghatározza az együtt mozgó, egy vegyülethez tartozó fragmenseket, kivonja a spektrumból a hátteret és az interferenciát, és előállítja a letisztított spektrumot. Az így kapott spektrum az adatbázissal összevetve általában jó egyezést ad. Ilyen dekonvolúciós szoftver az AMDIS (Automated Mass-spectral Deconvolution and Identificaton System), melyet a NIST (National Istitute of Standards and Technology) fejlesztett ki [23, 24]. A letisztított tömegspektrumot a szoftver összeveti az NIST spekrumkönyvtárával, és kiszámítja az egyezés minőségét, így a dekonvolúciós szoftver az adatbázisban található vegyületekre célzottan átvizsgálja a scan kromatogramokat. A szoftver a bevitt adatok dekonvolúciója után listát hoz létre. A lista egyes elmeire kattintva egy ablakban ábrázolja az eredeti tömegspektrumot és a matematikai módszerrel tisztított tömegspektrumot. Egy másik ablakban összeveti a tisztított spektrumot a találatként megjelölt hatóanyag NIST könyvtárban található tömegspektrumával (4.ábra).

14

4.ábra: Extrahált spektrum az AMDIS szoftverben

15

3. Kísérleti rész 3.1. Célok Feladatom alapjául Dr. Kende Anikó munkája szolgált [25], amely során az EKOL (Elválasztástechnikai Kutató-Oktató Laboratórium) keretein belül elindította a keverőbabás

minta-előkészítési

technika

adaptálását

növényvédőszer-maradékok

élelmiszer alapanyagokból történő meghatározására. Célom, elvégezni a Wessling Hungary Kft. Élelmiszervizsgáló Laboratórium számára egy SBSE-TD-RTL-GC-MS módszerrel történő méréssorozatot növényvédő szer maradékok meghatározására, valamint a módszert optimálni, végül előkészteni a módszer akreditációját. 3.2. A minta feldolgozásának menete Az első lépésben a mintát homogenizáljuk. Az élelmiszerminták sokfélesége miatt ez a művelet lehet, őrlés, darálás, turmixolás, folyékony élelmiszerek esetén keverés, rázatás. A homogenizált mintából 15 g-ot centrifugacsőbe mérünk, és ahhoz 30 ml metanolt adunk. Vizsgálataim során az ezután következő extrakciós lépést optimáltam, összehasonlítva az ultrahangos rázatás és a rázatógépen történő agitálás extrakciós hatásfokát (3.4. bekezdés). A rázatást követően a próbákat centrifugáljuk (10 perc, 3500 rpm), így elkülönülnek a nagyméretű mátrixalkotók, és tiszta fölülúszót kapunk. A felülúszó fázisból kiveszünk 2 ml-t, és 8 ml desztillált vizet tartalmazó fiolába rakjuk, majd belehelyezünk egy 10 mm hosszú, 0,5 mm vastag PDMS fázissal bevont üveg keverőbabát (Twister©-t). Kevertetéshez Gerstel Twister 15 helyes mágneses keverőt használtam. Meghatározott idejű kevertetés után (3.5. bekezdés), a keverőbabákat a vizsgált oldatból kivesszük, leöblítjük desztillált vízzel, papírtörlőn leitatjuk róla a vizet, majd

16

speciálisan erre a célra kialakított twister-deszorpciós csőbe helyezzük. A csövet fém kupakjával lezárjuk, majd az automata mintaadagoló tálcájába helyezzük. Ezt követi a mintabevitel (3.6. bekezdés) és az elemzés (3.7. bekezdés). 3.3. Vizsgált növényvédő szerek A növényvédőszer lista (3. táblázat), mely 195 hatóanyagot tartalmaz adott volt, összeállításánál fontos szerepet játszott az EKOL azon törekvése, mely szerint olyan módszert kíván előállítani, amely a Magyarországon szabályozott (tiltott, illetve engedélyezett) növényvédőszerek teljes palettája lefedhető. (Jelenleg a Magyarországon engedélyezett peszticidek száma közel 400.)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

Hatóanyag 2,4,5-T methyl ester 2,4-D methyl ester 2,6-benzonitril/dichlobenil 2-phenylphenol acetochlor ametryn aminocarb atrazine azinphos-ethyl azinphos-methyl benalaxyl benfluralin benzolylporp-ethyl BHC a bifenox bifenthrin bis(2,3,3,3-tetrachloropropyl) ether bitertanol bromophos bromophos-ethyl bromopropylate bromucaonzole buprofezin Butylate cadusaphos carbophenothion chlorfenapyr chlorfenprop-methyl chlorfenson chlorfenvinphos

Retenciós idő 23.817 10.886 6.759 8.779 16.502 16.24 6.707 12.671 30.45 26.542 25.957 11.143 27.661 11.413 27.929 28.195

TIon 233 199 171 170 146 227 151 200 132 160 148.2 292.1 105.1 181 341.1 181.2

Q1 235 234 173 0 162 212 150 215 160.1 132 91.1 264.1 77.1 279 343.1 165.1

Q2 268 175 136 0 59 170 136 202 77 77 206.2 276 292 183 311 166

Q3 211 236 100 0 223 185 134 173 105 105 204 293 106 217 189 182

CAS-szám 1928-37-6 1928-38-7 1194-65-6 90-43-7 34256-82-1 834-12-8 2032-59-9 93616-39-8 2642-71-9 86-50-0 71626-11-4 1861-40-1 7696-12-0 319-84-6 42576-02-3 82657-04-3

log Ko/w 3.8 3.43 2.74 3.09 3.03 2.98 1.9 2.82 3.4 2.75 3.4 5.29 4.73 3.8 4.48 8.15

16.329 31.305 18.952 21.35 27.929 29.211 23.609 7.32 11.191 26.424 25.25 12.561 23.517 22.827

130 170.1 331 359 341 173 105 57 159 151 59.1 125.1 175 267

79 57 328.9 302.9 339 175 106 146 158 121 247.1 165.1 111.1 323.1

132 168 125.1 267 343 295 104 156 97 153 249 196 177 269

109 171 333 301 183 293 172 174 88 97 408 197 302 323

127-90-2 55179-31-2 2104-96-3 4824-78-6 39394-17-7 116255-48-2 69327-76-0 2008-41-5 995465-99-9 786-19-6 122453-73-0 14437-17-3 80-33-1 470-90-6

0 4.16 5.11 6.09 4.9 3.24 4.3 3.85 3.9 5.33 4.83 3.4 4.21 3.81

17

31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80

chlorobenzilate chloroneb chloropropylate chlorothalonil chlorpropham chlorpyriphos chlorpyriphos-methyl chlorthal-dimethyl chlorthiophos clodinafop-propargyl Command/Clomazone coumaphos cyanazin cyanofenphos cyfluthrin cypermethrin cyphenothrin cyproconazole cyprodinil Demeton-S-methyl desmetryn diazinon dicamba dicaphton dichlofenthion dichlofluanid diclobutrazol dicloran diethofencarb difenoconazole diflufenican diniconazole diphenylamin dipropetryn disulfoton ditalimphos edifenphos endosulfan a endosulfan b endrin EPN epoxiconazole EPTC etaconazole ethion ethofenprox Etridiazole/Terrazole famphur fenamiphos fenarimol

24.557 8.422 24.557 14.712 10.864 18.148 15.669 18.343 25.322 27.229 12.562 31.745 19.383 26.097 32.621 28.359 31.142 24.888 19.827 10.184 15.309 13.63 9.78 19.386 15.221 16.896 23.535 12.63 19.167 35.297 27.809 25.546 12.888 17.88 13.689 23.317 26.717 22.552 25.105 23.707 28.999 28.032 6.573 25.603 25.163 32.597 7.656 26.71 23.574 30.463

251.1 191 251 266 127.1 197 286 301 269 349 125.1 362 212 157 163.1 181 198 222.1 224 88 213 179 173 262 279 123 270.1 206 151 323.1 266.1 268.1 169.2 255 88 130 109 195 195 263 157 192.1 128 173 231 163.2 211 218 303 139.1

139.1 193 253 264 213 199 288 299 97 238 204.2 226 213 169.1 206.1 163 69 139.1 225 60 198.1 137 175 125 223 167.1 272.1 176 207 265 394.2 270.1 168.2 240.2 89 148.1 173 237 236.9 317 169.1 194 43 245 153 164 183 125.1 154.1 219

253 206 139 268 153 314 125 303 325 266 127 109 214 141 165 165 206 224 210 170 171 152 220 263 97 224 159 178 150 325 267 70 170 184 97 299.1 110 207 207 245 141 138 86 55 97 135 213 217 288 107

111 208 111 270 154 97 290 332 271 351 205 210 68 185 227 209 210 125 226 89 58 199 222 79 162 226 82 208 267 267 246 269 83 222 142 209 310 241 241 265 185 165 132 175 125 107 185 93 217 251

510-15-6 2675-77-6 1437871 37223-69-1 11097-02-2 2921-88-2 5598-13-0 87209-56-1 60238-56-4 126572-25-6 81777-89-1 56-72-4 21725-46-2 13067-93-1 68359-37-5 52315-07-8 39515-40-7 94361-06-5 121522-61-2 919-86-8 1014-69-3 65863-03-8 62610-39-3 2463-84-5 97-17-6 90416-56-1 75736-33-3 99-30-9 87130-20-9 119446-68-3 83164-33-4 76714-88-0 122-39-4 4147-51-7 298-04-4 5131-24-8 17109-49-8 8003-45-0 891-86-1 72-20-8 2104-64-5 135319-73-2 759-94-4 60207-93-4 563-12-2 80844-07-1 2593-15-9 52-85-7 22224-92-6 60168-88-9

4.74 3.44 4.41 3.66 3.3 4.96 4.66 4.24 5.8 3.5 2.86 4.13 2.22 4.29 5.95 6.38 6.29 2.9 4 1.02 2.38 3.81 2.21 3.58 5.2 2.72 3.8 2.8 3.29 4.3 3.53 3.92 3.5 3.81 4.2 3.74 3.48 3.5 3.5 5.2 4.78 3.74 3.21 3.1 5.07 7.05 3.37 3.16 3.23 3.6

18

81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130

fenazaquin fenchlorphos fenclorim fenitrothion fenpropathrin fenpropimorph fenson fensulfothion fenthion fenthion-sulfone fluazifop-p-butyl flubenzimine fluchloralin fludioxinil flumetralin fluquinconazole flusilazole fonofos genite heptachloroepoxide alpha heptachloroepoxide trans hexaconazole hexazinone ioxynil octanoate iprobefos isocarbophos isodrin isoprocarb isopropalin kresoxim-methyl Lindane linuron malathion metazachlor Methamidophos methidathion Methiocarb methyl-parathion metolachlor mevinphos myclobutanil napropamide nitralin nitrapyrin nitrofen nuarimol o,p`-dde o,p`-DDT o,p'-DDD oxadiazone

28.507 16.347 11.664 18.072 28.342 18.179 18.615 25.532 18.048 26.124 24.597 24.391 13.833 24.146 22.28 31.721 23.818 13.058 22.922 20.879 19.485 22.552 28.448 29.535 14.49 20.67 18.805 8.886 19.553 24.049 9.319 18.184 19.422 19.73 5.686 22.222 8.941 17.154 17.848 7.748 23.66 22.527 28.188 7.709 20.871 27.437 21.306 23.381 23.381 23.517

145.2 285 189.1 277 97.2 128.2 77 292 278 310 282.1 135.1 306.1 248.1 143.1 340.1 233.1 109 0 237 353 83 171.1 127.2 91 136 193 121.1 280 116 181 61 173 81.1 94 145 168 263 162 127 179 72.2 316.1 194 283.1 235 246.1 235.1 235.1 175

160.2 287 224.1 125 181.1 303.3 141.1 293 125.1 125.1 254 186.1 326.1 127 145.1 342.1 206.1 246 141.1 135 355 214 83.1 57.2 204.1 121.1 195 136.2 238 206 183 187 127 133.2 95.1 85 153.1 109 238 192 150 128.2 274.1 196 285 107 248.1 237.1 237.1 177

146 125 226 109 125 0 268.1 156 109 109 383.2 77 264 154.1 157 341 234 137 302 81 351 216 128 128 123 120 263 91 281 131 219 189 125 209.1 141.1 93 109 125 240 109 181 271 300 198 202 203 318 165 165 258

117 298 104 260 265 0 51 140 169 136 255 416 63 404 404 108 315 110 0 289 357 82 71 55 122 110 66 77 264 132 111 124 93 0 47 125 57 79 146 67 82 100 317 160 253 139 316 236 199 260

120928-09-8 299-84-3 3740-92-9 122-14-5 64257-84-7 67306-03-0 80-38-6 115-90-2 55-38-9 3761-42-0 83066-88-0 37893-02-0 33245-39-5 131341-86-1 62924-70-3 136426-54-5 96827-34-8 944-22-9 97-16-5 1024-57-3 1024-57-3 79983-71-4 51235-04-2 3861-47-0 72779-52-3 39284-27-0 465-73-6 2631-40-5 34113-21-8 143390-89-0 608-73-1 56645-87-5 121-75-5 67129-08-2 115182-35-9 950-37-8 716-16-5 63653-66-7 94449-58-8 7786-34-7 96281-50-4 15299-99-7 4726-14-1 1929-82-4 51274-07-8 75872-04-7 3424-82-6 789-02-6 53-19-0 19666-30-9

5.51 4.88 4.17 3.3 5.62 5.5 3.57 2.23 4.09 4.8 5.34 6.66 3.45 4.13 5.45 3.24 4.89 3.94 0 4.56 4.56 3.9 1.85 3.94 3.34 2.7 6.75 2.31 5.8 3.4 4.26 2.91 2.36 2.13 -0.8 2.2 2.87 2.86 3.24 0.13 3.5 3.33 4.78 3.41 4.32 3.17 6 6.79 5.87 4.8

19

131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180

p,p`-DDD paclobutrazol paraoxon parathion penconazole pendimethalin pentachloroaniline pentachloroanisole Pentachloronitrobenzene Permethrin phorate phosalone piperonyl butoxide pirimiphos-ethyl pirimiphos-methyl procymidone profenofos profluralin promecarb prometryn FPD3 propalin propazine propham propiconazole propyzamid prothiophos pyraclofos pyrazophos pyridaben pyridafenthion pyrifenox pyrimethanil pyriproxifen quinalphos quinomethionate quinoxyfen quintozene/pentachloronitrobenze Resmethrin ruelene/crufomate Safrotin/Propetamphos sebuthylazine sulfotep tebuconazole tebufenpyrad tebutam tecnazene tefluthrin terbacil terbufos terbumeton

23.381 21.623 17.311 20.161 20.978 19.859 14.745 12.632 8.947 30.832 11.332 29.023 27.914 19.538 17.267 20.875 24.299 13.262 6.368 17.004 16.236 12.876 7.923 26.916 13.997 22.743 30.919 30.763 30.963 28.507 21.689 13.884 29.383 21.718 21.851 26.231 12.88 27.124 20.251 13.164 12.671 12.184 27.454 28.458 11.227 10.335 14.206 26.537 12.97 12.92

235.1 236.1 109 291 248 252 265 280 250 250 75 182 176.1 333 290 96.1 208 55.2 135.2 241 161 214.1 93.1 173 173 369 360 221 147 340 171 198.2 136.1 146 0 237.1 296 123.2 256 138 200 322 336 318 91.1 202.9 177 161 231 210

237.1 125.1 149 109 159 253 267 265 252 252 121 121 177.1 318 276.1 283.1 139 318.1 150.2 184.1 163 229.2 179.2 69 175 267 194.1 232.2 117 77 173 199.2 96 157.1 234 272.1 298 171.1 169.1 194.1 202 202 338 171 57 214.9 197 160 57 169

165 238 139 97 161 281 263 237 248 248 260 184 149 304.1 305.2 285 206 330 91 226.2 217.1 172 119 259 145 162 139 373.2 148 173 262 200 78 156 0 307 294 128 182.1 236.1 214 97 337 333 190 260.9 178 117 103 225

236 167 275 139 250 162 269 282 254 254 97 367 178 168 233 67 339 264 136 105 0 58 137 175 255 113 138 373 132 120 100 77 77 118 0 309 246 143 276 222 229 238 101 276 233 201 199 163 153 154

72-54-8 77108-06-6 311-45-5 8057-70-3 66246-88-6 64719-41-1 527-20-8 1825-21-4 82-68-8 52645-53-1 298-02-2 54182-71-7 51-03-6 23505-41-1 29232-93-7 32809-16-8 41198-08-7 026399-36-0 2631-37-0 7287-19-6 154-41-6 139-40-2 122-42-9 60207-90-1 23950-58-5 64772-54-9 96489-71-3 13457-18-6 96489-71-3 119-12-0 88283-41-4 53112-28-0 95737-68-1 54511-12-5 85188-88-1 124495-18-7 82-68-8 10453-86-8 299-86-5 77491-30-6 7286-69-3 8054-28-2 80443-41-0 119168-77-3 35256-85-0 117-18-0 93907-48-3 5902-51-2 13071-79-9 33693-04-8

6.02 3.36 1.98 2.86 4.67 4.82 4.82 5.45 5.03 6.5 3.56 4.29 4.29 4.85 4.2 2.95 4.82 5.44 3.1 3.51 0 2.93 2.6 3.72 3.43 0 0 3.8 5.47 3.2 3.7 3.19 0 4.44 0 0 4.64 7.11 3.42 3.82 3.31 3.99 3.89 4.61 3 4.38 6.05 1.89 4.48 3.1

20

181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195

terbuthylazine terbutryne tetraconazole tetradifon tetramethrin I tetrasul thiometon tolclophos-methyl tolyfluanid triadimefon triadimenol triallate trifluralin trimethacarb vinclozolin

13.202 17.001 19.085 28.742 28.838 25.253 11.704 15.806 21.159 18.382 21.221 14.058 11.06 11.303 16.607

214 226 336 159 164.1 252 88 265 137 57 112 86 306 136 212

173 185 338 111 123.2 254 125.1 267 238 208 168 268 264 0 285

216 241 337 229 79 324 89 125 106 85 128 270 307 0 198

229 170 101 227 107 322 93 266 63 210 70 128 290 0 187

82-68-8 886-50-0 112281-77-3 116-29-0 7696-12-0 2227-13-6 640-15-3 78617-09-1 731-27-1 43121-43-3 55219-65-3 2303-17-5 1582-09-8 58784-13-7 50471-44-8

4.64 3.74 3.53 4.61 4.73 0 3.15 4.56 3.9 2.77 2.9 4.6 5.34 2.66 3.1

3.táblázat: Vizsgált növényvédő szerek Munkám során ezen komponensek “twisterezhetőségét” vizsgáltam. 3.4. A minta-előkészítés során végzett extrakció hatásfokának vizsgálata Vizsgálataim során az ultrahangos rázatás és a rázatógépen történő agitálás extrakciós hatásfokát hasonlítottam össze. Mindkét esetben három párhuzamos mintát készítettem, azokat 10–10 percig rázattam, majd a kapott eredmények átlagát vizsgáltam. A mért adatok egyértelműen mutatják (5.ábra), hogy az egyes komponensekre a rázógépes rázatás során nagyobb csúcsterület értékeket kaptam, a későbbiekben tehát ezt alkalmaztam.

21

Az extrakciós hatásfok vizsgálata 1200000000

1000000000

800000000

600000000

400000000

200000000

rázógép

alpha-Cypermethrin

Bitertanol

Fluquinconazole

Fenarimol

Bromuconazole II

Bifenthrin

Fenpropathrin

Bromuconazole I

Resmethryn I

Resmethryn II

Propiconazole I

Propiconazole II

p,p'-DDD

Benalaxyl

Nitrofen

ultrahang

Fluazifop-butyl

Flumetralin

o,p'-DDE

Procymidone

Cyprodinil

Penconazole

Vinclozolin

Tetraconazole

Pyrimethanil

Sebuthylazine

Terbumeton

Atrazine

Tebutam

Fenclorim

Promecarb

0

5.ábra: Az ultrahangos és rázatógépes mintaelőkészítés során kapott csúcsterületek összehasonlítása 3.5. A keverési idő optimálása Az optimális keverési időt 3-3 párhuzamos mérés átlagából, fél, egy, másfél és két órás kevertetés csúcsterület adataiból határoztam meg. Az átlagértékek ábrázolásából kitűnik (6.ábra), hogy másfél óra kevertetés után beáll az egyensúly, a csúcsterület értékek maximálisak, és további fél órás kevertetéssel nem növekednek. Ezért a további méréseim során másfél órás kevertetést alkalmaztam.

6.ábra: Csúcsterület értékek ábrázolása a keverési idő függvényében

22

3.6. A mintabevitel A kísérleteket Agilent 6890 GC, 5973 performance electronics inert MS rendszeren végeztem. A termodeszorber, Twister Desorption Unit (TDU), alatt a Cooled Injection System (CIS) Peltier hűtésű programozható injektorral csatlakozik a gázkromatográfiás oszlophoz. Az automata mintaadagoló, Gerstel MPS2, a deszorpciós csövek kezelésére is alkalmas (7.ábra).

7.ábra: Gerstel MPS-2 automata mintaadagoló A CIS és a TDU közötti kapcsolatot a liner hozza létre, melynek hossza kb. 6 mm-rel meghaladja az injektor hosszát. A TDU felhelyezésekor a CIS tetején kiálló liner szakasz a TDU belsejébe kerül úgy, hogy közvetlen kapcsolat jön létre a behelyezett deszorpciós cső szűkítés utáni szakasza és a liner között. A gázzárásról speciális, fémbe ágyazott grafittömítések gondoskodnak. A gázrendszer koordinálását egy vezérlő rendszer végzi, amely biztosítja a vivőgázt, a TDU és a CIS split ágát és szabályozza a pneumatikát mozgató sűrített levegőt is. A mintabevitel első lépése, hogy a gázkromatográf ready-jelet (készenlétet) ad ki, mire a CIS és TDU beállítja a kezdeti hőmérsékleteket (TDU 40 ˚C, CIS 20 ˚C). A TDU pneumatikus szelepe kinyit. A szelep zárásáról mindig az aktuális deszorpciós cső és

23

annak fém kupakja gondoskodik. Amikor nem folyik mérés, egy üres cső van a készülékben. Az automata mintaadagoló kiemeli a záró csövet a TDU-ból és parkoló pozícióba helyezi. Ezután kiemeli a mintatartó csövet a megfelelő tálcáról, és behelyezi a TDU-ba. A TDU hőmérséklet programja 40 ˚C-ról 720 ˚C/min sebességgel felfűt 280 ˚Cra, majd 4 percig tartja a véghőmérsékletet. Négy perc után a Peltier hűtő visszahűti a TDU-t 40 ˚C-ra. Ezalatt a vivőgáz a TDU-n keresztül átöblíti a deszorpciós csövet, és magával viszi a deszorbeált komponenseket a CIS-be. A CIS hőmérséklete 20 ˚C, hogy a TDU-ból érkező anyagokat kicsapdázzuk. A CIS hőmérsékletprogramja akkor indul, amikor a TDU visszahűtött, ekkor 720 ˚C/min sebességgel felfűt 280 ˚C-ra és megtörténik az injektálás. 3.7. Elemzés A kromatográfiás oszlop HP-5 MS+ 30 m x 0,25 mm x 0,25 µm típusú. Szennyezett minták esetén a szennyezők az oszlop elején kondezálódhatnak, ezért a karbantartás során általában egy 25–100 cm-es darabot levágnak az oszlopról. Ennek következtében azonban változnak a retenciós idők, és a SIM ablakokat korrigálni kell minden karbantartás után, valamint a retenciós idő zárolás esetén kicsúszhatunk abból a tartományból, amelyre az eredetileg felvett ötpontos függvény érvényes, és amelyből a szoftver a megfelelő nyomásértéket számolja. Ennek kiküszöbölésére alkalmas az általam is használt bontható kötés Column Union Assembly (Agilent #5182-0744), melynek segítségével az analitikai oszlophoz azzal egyező paraméterekkel rendelkező előtétoszlop csatlakoztatható. A két oszlop egy üvegtestben találkozik, így meggyőződhetünk a helyes pozícionálásról. Szakszerűen alkalmazva gázszivárgási problémák nem merülnek fel. A későbbiek során történő karbantartások alkalmával pedig elegendő az előtétoszlop cseréje,

biztosítva

ezzel

az

állandó

hosszúságú

oszlopot.

Az

oszlop

hőmérsékletprogramja az Agilent növényvédő szer azonosításra kifejlesztett RTL módszere alapján 70 ˚C-ról indul, tartja 2 percig, majd 25 ˚C/min sebességgel felfűt 150 ˚C-ig, ahonnan 3 ˚C/min sebességgel fűt 200 ˚C-ig, végül 8 ˚C/min sebességgel fűt fel 280 ˚C-ra, majd ezt a hőmérsékletet még 10 percig tartja. Összefoglalva (4. táblázat):

24

70 °C 25 °C/min ↑ 150 °C 3°C/min ↑ 200 °C 8°C/min ↑ 280 ˚C

2 perc

10 perc

4.táblázat: Az RTL módszer alapján fejlesztett hőmérsékletprogram A transfer line hőmérséklete 300 ˚C, az oldószer csúcsot kivágó solvent delay 3,2 min. Az ionforrás hőmérséklete 230 ˚C, a kvadrupólé 150 ˚C. 3.8. Kondicionálás, tisztítás Tekintettel arra, hogy a mérendő komponensek általában labilisak és rendszerint kis koncentrációban vannak jelen a mintában, valamint több kutató is bizonyította egyes vegyületek adszorpcióját a használt üvegeszközök [26], és egyéb anyagok, például polietilén felületén [27], nagyon körültekintőnek kell lenni az analízis során használandó eszközök kiválasztása, kezelése és tisztítása során. Az általam használt eszközök közé tartozik a poletilén centrifugacső, melyet egyszeri mintaelőkészítésre

alkalmazok,

valamint

40 ml-es

fiolák,

twiszter

deszorpciós

üvegcsövek, és természetesen a keverőbabák. Az utóbbi eszközök újbóli használata szükségszerű, ezért kezelésüket, tisztításukat nagy körültekintéssel végeztem.

3.8.1. A keverőbabák kezelése és kondicionálása A keverőbabák esetében a tisztítási eljárás alapjául a gyártók által mellékelt leiratot alkalmaztam, valamint vizsgáltam és optimalizáltam az áztatásra és lefűtésre szükséges időt, melyek után az esetleges maradékszennyezőket már nem lehet kimutatni. A kondicionálás első lépése az oldószeres leoldás. A keverőbabákat metanol: diklórmetán 1:1 arányú elegyébe helyezzük, majd ultrahanggal 20 percig rázatjuk. Ez az időintervallum elegendő ahhoz, hogy a baba felületén lévő PDMS fázis a diklórmetán hatására jól láthatóan kifehéredjen, megduzzadjon, és szennyező célkomponensek

25

feltehetőleg legnagyobb koncentrációban az oldószerbe vándoroljanak. Ezután a babákat újabb, tiszta oldószerelegyben két napig áztatjuk, elegendő időt biztosítva ezzel az egyensúly kialakulásához. A keverőbabákat az oldószerelegyből kivéve addig szárítjuk, míg a PDMS fázis ismét elnyeri eredeti színét és méretét, ezután következik a lefűtés. A kondicionálás ezen lépése történhet a gyártó által forgalmazott regeneráló egységben, vagy annak hiányában a mérőkészülékben. A kondicionálás után a mérési módszerrel a vizsgálandó komponensek nem kimutathatóak, a baba tisztának tekinthető. A két napos ázatási idő hosszúnak tűnhet, ez azonban azért szükséges, mert ugyan egyes babák esetén pusztán az ultrahangos rázatás elegendőnek bizonyult, másoknál azonban az egy napos áztatás után is visszamérhetőek (10 babából átlagosan 4 esetén) kb. 1–0,1%-ban a célkomponensek. Ez azért fordulhat elő, mert a vizsgált hatóanyagok koncentrációja nagymértékben eltérhet az egyes mintákban. Hogy megmondhassuk, éppen melyik babát használjuk mintákból történő nyomjelzésére és melyiket a kalibráció legfelső pontjának beállítására, szükséges lenne azok “életútját” nyomon követni, amely azonban merész vállalkozás, különös tekintettel arra, hogy mindegyikük egyforma. 3.8.2. Twiszter csövek és fiolák tisztítása Mint már korábban említettem, a használt üvegeszközök felületén is valószínű egyes apoláris komponensek adszorpciója, ezért a kikevertetéshez alkalmazott fiolákat mosogatás előtt a babák esetében is alkalmazott oldószer eleggyel öblítettem át. A twiszter csövek tisztításánál érdemes minél többet egyszerre mosogatni úgy, hogy azokat szűkítéssel lefelé főzőpohár aljára állítjuk. A tisztításra váró csöveket legelső lépésként mosogatószeres vízben tíz percig ultrahangban rázatjuk, hogy az esetleges zsíros szennyeződéseket lemossuk. Ha a csöveket kizárólag tiszta kesztyű segítségével mozgatjuk, ez a lépés elhagyható. Ugyanezt a lépést (feltöltés-rázatás) elvégezzük a következő oldószerekkel, a következő sorrendben: desztillált víz, aceton, hexán, aceton [25]. Ezután a csöveket száradásig állni hagyjuk. Az ultrahangos tisztítási lépések során az oldószer párolgása miatt a főzőpohárra óraüveget helyezünk.

26

3.9. Külső kalibrációval végzett mérések Munkám megkezdésekor külső kalibrációt alkalmazva végeztem a mennyiségi meghatározást. Kísérletek sokaságát elvégezve a mérések alatt az alapos karbantartás elvégzése után is nyilvánvalóvá vált a babák korróziója. Ez megfigyelhető felületükön, de nyomon követhető a kalibrációs görbék korrelációs koefficiens (R2) értékeinek összevetése alapján is (8. ábra). A grafikonról 10 különböző napon végzett kalibrációs görbék R2 értékeit olvashatjuk le.

8.ábra: R2 értékek változása különbőző napokon végzett kalibráció adatokból Az egyes görbéken jól látható, hogy a változás minden komponensre azonos napokon szignifikáns. Ebből azt a következtetést vontam le, hogy a babák adszorpciós képessége

27

nem azonos, valószínűleg minden felhasználás alkalmával csökken, melynek logikus magyarázata lehet, hogy egyes mátrixok komponensei kedvezőtlen esetben eltömíthetnek kötőhelyeket, valamint a lefűtések alkalmával fázisvérzés is előfordulhat. A mérési sorozat szermaradék vizsgálatok esetén akkor tekinthető elfogadhatónak, ha a kalibráció korrelációs koefficiense nagyobb, mint 0,99. Ezt a babák eltérő tulajdonságai miatt külső kalibrációval nem sikerült biztsítani, ezért belső standardet választottam. A belső standard megválasztásánál fő szempont, hogy biztosan ne forduljon elő a mintában, kémiai

és

fizikai

tulajdonságai

hasonlóak

legyenek

a

meghatározandó

komponenesekéihez, valamint a minta egyik komponensével se lépjen fel koelúció. Választásom

a

szermaradék

analitikában

széles

körben

alkalmazott

deuterált

chlorpyriphos-methyl-re esett.

4. Validálás A validálás kihívása egyrészt az a számtalan féle élelmiszerfajta melyek peszticidtartalmának mérésére megrendelés érkezhet, másrészt a meghatározandó hatóanyagok sokasága. A hitelesség és pontos validálás miatt nem elegendő egyszer (egyetlen növény esetén) elvégezni a validálást, hanem esetenként minden egyes mátrixra el kell végezni a méréseket. Mivel sok esetben mutatkozik egyezés a mátrixalkotók tekintetében, a Codex Alimentarius a tapasztalatok összegzését felhasználva adott tulajdonságú csoportokra reprezentatív növényeket ajánl 5. táblázat [28].

Csoport

Általános tulajdonság

Áru csoport

Reprezentatív fajok

I.

magas víz és klorofill tartalom

leveles zöldségek hüvelyesek

spenót, fejes saláta Zöldbab

II.

magas víz és alacsony klorofill tartalom

csonthélyasok bogyós gyümölcsök kis gyümölcsök gumós növények

barack, cseresznye Földieper Szőlő burgonya, répa, petrezselyem

III.

magas savtatalom

citrusfélék

narancs, citrom

IV.

magas cukortartalom

V.

magas zsírtartalom

mazsola, datolya olajos magvak

dió, pekándió, pisztácia

28

VI.

alacsony nedvességtartalom

gabona gabonából készült termék

búza, rizs, kukorica korpa, liszt

Egyéni vizsgálatot igénylő termények

fokhagyma, sör, tea fűszer növények, vörös áfonya, stb.

5.táblázat: Növényvédőszer maradékok validálásakor alkalmazható reprezentatív fajok Mivel ugyanilyen hasonlóság nemcsak az egyes élelmiszerfajták, hanem a vizsgálandó

hatóanyagok

között

is

fennáll,

a

validáláshoz

követve

a

AOAC/FAO/AEA/IUPAC irányadásait [29] egy olyan mixet készítettem, melyek tulajdonságai [30] reprezentatív tartományát alkotják mind a 195 vizsgált hatóanyagnak (6. táblázat).

Hatóanyag

log Ko/w

retenciós idő

Methamidophos

-0.80

5.69

mg/l 200

˚C 20

mPa 2.3

˚C 20

Mevinphos

0.13

7.75

600000

20

17

25

17

8, 20

Demeton-S-methyl Terbacil Methidathion Bifenthrin Propham Azinphos-methyl Fenchlorphos Procymidone Vinclozolin Diazinon Cyprodinil Chlorpyriphos Fenazaquin o,p`-DDE Dicloran Lindane Linuron Bitertanol Difenoconazole Acetochlor

1.02 1.89 2.20 8.15 2.60 2.75 4.88 2.95 3.10 3.81 4.00 4.96 5.51 6.00 2.8 9.32 2.91 4.16 4.30 3.03

10.18 26.54 22.22 28.19 7.92 26.54 16.35 20.88 16.61 13.63 19.83 18.15 28.51 21.31 12.63 4.26 18.18 31.305 35.458 16.502

22000 710 240 0.1

20 25 20 20

0.024

88 520 37 95

1-5,22

30 20 25

28

20

0.18

20

87

4, 22

60

20

12

25

185

7.4, 20

1.4

20

2.7

25

1,5

8, 25

0.065 6.4

24 20

0.261

20

183

-, 20

63.9 5 15 223

20 20 20 25

5.1 2.2‚10-7 3.3‚10-5

25 25 25 25

87 63

-, 20

800

−, 20

vizoldhatóság

Gőznyomás

stabilitás DT50 [napok] pH; ˚C 657 4, 22

5 85

6.táblázat: A validáláshoz használt hatóanyagok

29

A komponensek fizikai-kémiai tulajdonságaikat tekintve széles tartományt fednek le: vízoldhatóság 0,065mg/l–600g/l; logKo/w -0,80–8,15; gőznyomás 2,2‚10-7–12mPa; stabilitás 1-800 nap (pH=7). (Természetesen más, egyéb paraméterekkel rendelkező hatóanyagok is alkothatnák a validáláshoz használt mixet.) Az összeállításnál számomra legfőbb paraméter az oktanol-víz megoszlási hányados volt, hiszen ettől (valamint a babán lévő fázis méretétől) függnek a gyártó által megadott elméleti visszanyerési adatok is. Ezért legtöbbet olyan komponsek közül választottam melyek logKo/w értéke az elfogdhatónak mondott 2 körüli tartományt fedi le. A hatóanyagok közül a methamidophos, mevinphos, demeton-S-methyl és terbacil babás kevertetés után nem detektálható (9.b.ábra) (logKo/w<1,89), ezért az ez alatti logKo/w-vel rendelkező hatóanyagokat a továbbiakban nem-twisterezhetőnek tekintem.

9.a ábra: A standard kromatogram folyadékinjektálással;

30

9.b ábra: A standard kromatogram keverőbabás extrakciót követő lefűtéssel

4.1. A validálás során vizsgált teljesítményjellemzők: Specifikusság: A vizsgálandó szermaradékokat interferáló szennyezés nem zavarhatja. A specifikusság meghatározásához felvettem és összevetettem a hozzáadásos vizsgálathoz használt kontroll minta, a kalibrációhoz használt standard elegy és a kimutatási határ szintjének megfelelő koncentráció szinten végzett hozzáadás után kapott minta kromatogramját.

31

Linearitás: A detektálási mód lineáris tartományának át kell fognia a tervezett analitikai tartományt. A szükséges koncentráció-tartományban elkészítettem a kalibrációs egyenest és regresszióanalízis segítségével döntöttem az összefüggés lineáris voltáról, annak elfogadhatóságáról. A linearitás vizsgálatát az analitikai eljárás munkatartományán belül végeztem el.

Elméleti kimutatási határ (LOD µg/kg): Az alkalmazott kromatográfiás körülmények között a zaj háromszorosával egyenlő csúcs létrehozásához szükséges anyagmennyiségből számított koncentráció. Mehatározása analitikai standardok injektálásával történt a kalibrációs görbéből történő számítással. Mennyiségi kiértékelés határa (LOQ, µg/kg): Az a mintában mérhető legkisebb szermaradék koncentráció, melyet elfogadható pontossággal, helyességgel és ismételhetőséggel lehet meghatározni. Az alábbiakban narancs mátrixra, (amely magas savtartalmú citrusféléket reprezentál) részletesen ismertetem az elvégzett validálás eredményeket és azok értékelését.

4.1.1. Specifikusság vizsgálata A specifikusság meghatározásához összehasonlítottam a validálási eljárás során felvett vizsgálathoz használt minta (narancs), a kalibrációhoz használt standard elegy és a vizsgált mátrixhoz a kimutatási határ szintjén történő hozzáadás után kapott kromatogramokat. A 10.a és 10.b ábrán példaként kromatogram részletek láthatóak a procymidonra kiértékelve.

32

10.a ábra: Narancsminta kromatogramrészlet, standard hozzáadása nélkül

10.b ábra: A kimutatási határ szitjén történő hozzásadás után kapott kromatogramrészlet a procimidonról A módszert specifikusnak tekintjük, ha a kontroll mintában a vizsgált hatóanyagokat zavaró kromatográfiás csúcs nem jelenik meg, illetve nincs hatással a kiértékelés megbízhatóságára. Ez a kritérium minden komponens esetén teljesült.

33

4.1.2. Linearitás vizsgálata Az összes komponenst együttesen tartalmazó, hét, különböző koncentrációjú kalibrációs oldatot készítettem 2 μg/kg és 500 μg/kg közötti tartományban. A hét, független beméréssel készült oldat kromatogramjának felvétele véletlen sorrendben történt. A lineáris regresszióval kapott kalibrációs egyenesek korrelációs koefficiensét (R2) és a kalibrációs pontok relatív eltérésének szórását (Srr) [31] a 7.táblázat tartalmazza.

Hatóanyag

R2

Srr

Methidathion

0.994

0.049

Bifenthrin

0.996

0.057

Propham

0.999

0.014

Azinphos-methyl

0.995

0.047

Fenchlorphos

0.998

0.037

Procymidone

0.999

0.071

Vinclozolin

0.998

0.034

Diazinon

0.993

0.029

Cyprodinil

0.992

0.087

Chlorpyriphos

0.999

0.032

Fenazaquin

0.998

0.035

o,p`-DDE

1.000

0.017

Dicloran

0.996

0.065

Lindane

0.993

0.088

Linuron

0.997

0.015

Bitertanol

1.000

0.021

Difenoconazole II

0.997

0.09

Acetochlor

0.998

0.031

7. táblázat: A kalibrációs paraméterek: kalibrációs pontok relatív eltérésének szórása (Srr) és a korrelációs koefficiens (R2)

34

11.ábra: Kalibrációs egyenesek A mérési sorozatot szermaradék vizsgálatok esetén elfogadhatónak tekintjük, ha a kalibráció korrelációs koefficiense (R2) nagyobb, mint 0,99 és a kalibrációs pontok relatív eltérésének szórása (Srr) kisebb, mint 0,1 [32, 33]. Esetemben a feltételek minden vizsgált vegyületre teljesültek, ezért a módszert 2–500μg/kg tartományban lineárisnak tekintem.

4.1.3. Az elméleti kimutatási határ (LOD) és a mennyiségi meghatározás határának (LOQ) megadása A kimutatási határ meghatározása standard oldatokkal felvett kalibrációs görbéből történt. A kalibráció paraméterinek számítását excell macro segítségével végeztem [31], és ez alapján állítottam be a terveztt gyakorlati kimutatási határ szintjét. A kapott értékeket az 8. táblázat tartalmazza.

35

Hatóanyag

Kalibrációból számolt elméleti LOD (pg)

Gyakorlati LOD (kromatogramból) (pg)

Elméleti kimutatási határ LOQ (ppb)

Gyakorlati LOQ 1 g narancs (ppb)

Tervezett LOQ (ppb)

Acetochlor

3665

3500

3.67

11

10

Azinphos-methyl

7446

7000

7.45

22.34

20

Bifenthrin

1660

2000

1.66

4.98

5

Bitertanol

3193

3000

3.19

9.58

10

Chlorpyriphos

3920

4000

3.92

11.76

10

Cyprodinil

3623

4000

3.62

10.87

10

Diazinon

4206

4000

4.21

12.62

10

Dicloran

5880

6000

5.88

17.64

20

Difenoconazole

4490

4000

4.49

13.47

10

Fenazaquin

2996

3000

3.00

8.99

10

Fenchlorphos

3536

4000

3.54

10.61

10

Lindane

1596

1500

1.60

4.79

5

Linuron

7233

7000

7.23

21.7

20

Methidathion

15993

15000

15.99

47.98

50

o,p`-DDE

1887

2000

1.87

5.6

5

Procymidone

2785

3000

3.07

9.2

10

Propham

6320

6000

6.32

18.96

20

Vinclozolin

2987

3000

2.99

8.96

10

8.táblázat: Az elméleti kimutatási határ (LOD) és a mennyiségi meghatározás határa (LOQ) 5. Összefoglalás Munkám során megállapítotam, hogy a rázatógépes extrakció nagyobb hatékonyságú, mint az ultrahanggal végzett, kimértem azt az optimális: másfél órás keverési időt, mely során kialakul és beáll az egyensúly. Vizsgáltam és optimalizáltam az áztatásra és lefűtésre szükséges időt, melyek után az esetleges maradékszennyezőket már nem lehet kimutatni. A mennyiségi meghatározához belső standardet választottam, mely megválasztásánál fő szempont volt, hogy biztosan ne forduljon elő a mintában, kémiai és fizikai tulajdonságai hasonlóak legyenek a meghatározandó komponenesekéihez, valamint a minta egyik komponensével se lépjen fel koelúció. Választásom a deuterált chlorpyriphos-methyl-re esett.

36

A validálás során vizsgált teljesítményjellemzőket 26 reprezentatív hatóanyagra számítottam. A komponensek kiválasztásánál szempont volt, hogy fizikai kémiai tulajdonságaik széles tartományt fedjenek le, ezen belül különös tekintettel voltam a visszanyerést leginkább meghatározó víz-oktanol megoszlási hányadosra (logKo/w=-0,80– 8,15). Méréseim alapján az általam használt méretű babával (5x10mm) nem vizsgálhatóak azok a hatóanyagok, melyek logKo/w értéke kisebb, mint 1,89; ezek a komponensek keverőbabás extrakcióval nem detektálhatóak. Mennyiségi meghatározásra alkalmas a módszer azon komponensekre, melyekre a logKo/w nagyobb, mint 1,89. Azon komponensek esetén ahol logKo/w értéke 1,89 és 2,91 közötti a kimutatási határ 20–50 ppb, 2,91 fölötti megoszlási hányadossal rendelkező komponensek kimutatási határa 5– 10 ppb közé esett. Méréseim alapján megállapítottam, hogy narancs mátrix esetén a módszer minden komponensre specifikus, a mérhető lineáris tartomány 5–500μg/kg közötti. Köszönetnyilánítás Témavezetőmnek, Kötelesné Suszter Gabriellának, szakmai és emberi segítségét, alaposságát, türelmét. Dr. Eke Zsuzsannának, Dr. Rikker Tamásnak, és Kőpataki Tamásnak, hogy fenntratva az EKOL és a Wessling Hungary Kft. közötti együtműködést, lehetővé tették, hogy korszerű készüléken, magas szinvonalú szakmai iránytás mellett végezhessem a munkám. Valamint, biztosították a kísérletimhez szükséges anyagi és eszközforrásokat. Köszönöm továbbá szakmai és baráti támogatását mindazoknak, akik munkám elkészítésében bármilyen módon segítségemre voltak.

37

6. Irodalomjegyzék [1] John Doull, Curtis D. Klaassen and Mary O.Amdur, Casarett and Doull’s Toxicology, 5th Edition Macmillan Publishing Company, New York, NY, (1996) [2] Michael J. Jerelanko and Manfred A Hollinger, Handbook of Toxicology CRS Press, (2002) [3]

Robert H. Dreishbach and William O.Robertson, Prevention, Dignosos and

Treatment Appleton and Lange Handbook of Poisoning, East Norwalk, CT, (1987) [4] www.fvm.hu Földművelésügyi és Vidékfejlesztési Minisztérium [5] Audus L. J., Biological detoxication of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid in soils, isolation of effective organism, Nature 166–365, (1950) [6] Felsott A., Maddox J. V., Bruce W., Enhanced microbial degradation of carbofuran in soils with histories of Furadan use, Bull. Environ. Contam. Toxico., (1981) [7] www.codexalimentarius.com [8] www.ontsz.hu Országos Növény- és Talajvédelmi Szolgálat [9] Hazard, The WHO Recommended Classification of Pesticides, IPCS, IOMC, (2002) [10] Analysis of Foodstuffs – DFG S19 (1999) §35 LMBG 00.00.34 [11] Y. R. Tahboub. M. F. Zaater. T. A. Barri, Analityca Chimica Acta 558, (2006) [12] Liska, J. Krupcik, Leclercq P. A., The use of solid sorbents for direct accumulation of organic compounds from water matrixes, J. High Resoult. Chromatogr., 12–557, (1989) [13] Specht W., Tillkes M., Gas chromatographic determination of pesticide residues after clean-up by gel-permeation chromatograpy and minii silica gel-column chromatograpy, Fresenius Z. Anal. Chem., 322–443 (1985) [14] Steven A. Barker, Matrix Solid Phase Dispersion (MSPD), J. Biochem. Biophys. Methods 70 151–162 (2007) [15] Belardi R.G., Pawliszyn J., The application of chemically modified fused silica fibers in the extraction of organics from water matrix samples and their rapid transfer to capillary columns, Water Pollut. Res. J. Can., 24–179, (1989) [16] Arthur C.L., Pawliszyn J., Solid phase microextraction with thermal desorption using fused silica optical fibers, Anal. Chem., 62–2145, (1990)

38

[17] www.gerstel.com [18] P.Sandra, E. Baltussen, F. David, A. Hoffmann, Stir Bar Sorptive Extraction (SBSE) applied to Environmental Aqueous Samples, Gerslet AppNote 2/2000 [19] P. Sandra, B. Tienpont, F. David: Stir bar sorptive extreaction (TwisterTM) RTLCGC-MS A versatile method to monitor more than 400 pesticides in different matrices, Gerstel AppNote 2003/1. [20] H. Prest, P.L. Wylie, K. Weiner, D. Agnew, RTL-MSD Pesticide Method and database, Agilent Application 5968-4884 [21] P. T. Holland, Capillary GC with Selective Detectors (ECD, NPD, FPD), in Analysis of Pesticides in Ground and Surface Water, Vol. 11, Springer, Berlin, (1994) [22] C. V. Eadsforth, A. P. Woodbridge, Techniques and procedures for the determination of pesticides, in Environmental Behaviour of Agrochemicals, Vol. 9, John Wiley & Sons, Chichester, (1995) [23] www.amdis.net [24] NIST, USA, http://chemdata.nist.gov [25] Dr. Kende Anikó, Mintaelőkészítési és mintabeviteli módszerek élelmiszerek növényvédő-szermaradékainak gázkromatográfiás meghatározásában, Doktori értekezés, (2006) [26] Hinckley D. A., Bidleman T. F., Analysis of pesticides in seawater after enrichment onto C8 bonded-phase cartridges, Enciron. Sci. Technol., 23–995, (1989) [27] Borburgh H. J., Hammers W. E., Extraction of organophosphorus pesticides from water samples on Bakerbond SPE octadecyl cartridges at the ng/L level, Tox. Environ. Chem., 35–79(1992) [28] Codex Alimentarius, Volume2, 2nded., Pesticide Residues in Food, 147–365, FAO, (1993) [29] AOAC/FAO/IAEA/IUPAC Expert Consultation, Guidlines for Single-laboratory Validation of Analytical Methods for Trace-level Concentrations of Organic Chemicals [30] www.herts.ac.uk FOOTPRINT Pesticide Properties Database [31] FAO/IAEA Training and Reference Centre for Food and Pesticide Control, Template for regression calculations.xls [32] Ambrus Á., Minoségbiztosítási kézikönyv (5. kiadás). FVM Növény- és

39

Talajvédelmi Főosztály Növényvédoszermaradék-analitikai Hálózat, Növény- és Talajvédelmi Központi Szolgálat, Budapest, (2005) [33] Ambrus Á: Worked example for validation of a multi-residue method, In: Fajgelj A., Ambrus Á., Principles and practices of method validation, The Royal Society of Chemistry, UK, 157–175, (2000)

40