Tartalomjegyzék Bevezetés.................................................................................................................... 2 Doppingolás háttere .................................................................................................. 2
Doppingvétség csoportosításai ............................................................................. 4 A.) Tiltott módszerek ................................................................................................ 4 B.) Tiltott szerek ....................................................................................................... 5
Tiltott szerek jellemzése ......................................................................................... 7 Anabolikus androgén szteroidok és származékaik ................................................... 7 Hormonok és rokonvegyületek ............................................................................... 11 β2-agonisták ............................................................................................................ 12 Antiösztrogének ...................................................................................................... 13 Diuretikumok és egyéb álcázó vegyületek ............................................................. 14 Stimulánsok............................................................................................................. 15 Narkotikumok, cannabinoidok, glükokortikoidok.................................................. 17
Doppinganalitika .................................................................................................... 19 1.) Mintavétel.......................................................................................................... 20 2.) Minta-előkészítés............................................................................................... 23 3.) Azonosítás ......................................................................................................... 24
Erythropoietin, mint doppingszer ...................................................................... 30 Izoelektromos fókuszálás (IEF) .............................................................................. 32
Géndopping ............................................................................................................. 34 Összegzés ................................................................................................................. 35 Irodalom ................................................................................................................... 36
1
Bevezetés Doppingolás háttere
Ez a dolgozat alapvetően a doppingszerek kémiájával és kimutatásával foglalkozik, de muszáj említést tenni ezen tiltott szerek alkalmazását előidéző tényezőkről. A teljesítmény fokozása utáni vágy az ókor sportolóira is jellemző volt, hisz előfordult, hogy frissen kivágott állati szerveket – májat, húst, szívet, herét – fogyasztottak a megmérettetés előtt. Ennek a rítusnak inkább spirituális értéke volt, a sportoló ezzel elhitte, hogy az állat erejét magáévá tette és ettől gyorsabb, erősebb, kitartóbb lett. A tudomány fejlődésével természetesen valódi élettani hatásokkal rendelkező szereket kezdtek alkalmazni, de a cél ugyanaz maradt: a teljesítmény növelése. De vajon mi vesz rá egy élsportolót, hogy edzés mellett – esetleg helyett – doppingszereket használjon? Az ókori olimpiai játékok győztese megkapta azt a bizonyos babérkoszorút, amely dicsőséget, megbecsülést jelentett, ez pedig azt jelentette, hogy a győztes mindent ingyen kapott a városában. A győzelem ilyetén honorálása máig megmaradt, hisz elég egy-egy atlétika-grand prix-re vagy teniszversenyre gondolni, ahol az első helyért nem csekély pénzjutalom jár; de ott vannak a szponzori szerződések is, amelyek nyilván a nagyobb ismeretség függvénye, ez pedig összefüggésben áll a versenyeken nyújtott teljesítménnyel. A legtöbb élsportoló még aktív korában szeretné megteremteni azt az egzisztenciális hátteret, amelyre visszavonult korában tud építeni, ehhez pedig – az előbb vázolt gondolatsor alapján – kimagasló eredményeket kell nyújtania, de ennek elérése néha súlyos áldozatokat jelent. Oliver Stone ezt a „súlyos áldozatot” szemlélteti a Minden héten háború című filmjében, amelyben az amerikai futballista gondolkodás nélkül folytatja az idényt egy beígért nagy összegű reklámszerződésért, viszont még egy ütközés és akkor lebénulhat… az utolsó mérkőzésen hordágyon viszik le ezt a játékost. A doppingolással a sportolók még inkább veszélyeztetik testi épségüket, mert a tiltott
2
szer használatának gyakran nincs külső nyoma, nem ismerik a toxikus adagokat, így könnyen gyógyíthatatlan belső szervi betegségeket okozhatnak maguknak. Csak a testi épségüket veszélyeztetik a sportolók a doppingszer használatakor? Ha az ókorra gondolunk, ott olümposzi magasságokba emelték a győztes atlétákat és határtalan megbecsülés övezte, mert olyan teljesítményt tudtak nyújtani, amely egyedülálló volt. Így van ez most is. Mindenki elcsodálkozik azon, hogy képesek a maratonisták 2 óra alatt lefutni 42.195 métert, hogy képes egy súlyemelő saját súlyának többszörösét kiemelni, hogy képes egy sprinter 10 másodperc alatt lefutni 100 métert. Az ilyen teljesítmény elismerést, megbecsülést vált ki az emberekben. Ha viszont kiderül, hogy ezt manipulációval érte el a sportoló… Gondoljunk Ben Johnsonra! A doppingbotránya óta az összes tiltott szerekkel foglalkozó publikációban szerepel, mint negatív példa és már alig emlékeznek a szöuli olimpia előtt elért eredményeire. Sajnos manapság nagyon sokat találkozunk doppingolással. Némely ilyen hír magyar sportolókat is érint, például: Annus Adrián, Fazekas Róbert. Szerencsére egyre több az olyan hír is, mikor a tiltott szerrel visszaélőket még a verseny előtt kiszűrik, amely köszönhető a rendelkezésre álló megfelelően szelektív, specifikus és kvantitatív analitikai módszereknek, ez pedig visszatartó erő is egyben. Így marad még remény a sportszerető emberekben.
3
Doppingvétség csoportosításai
A doppingvétség kifejezés magában foglalja mindazon tiltott tevékenységeket, amelyek segítségével jobb sporteredményt érhetnek el a versenyzők, amelyekkel el tudják „rejteni” a teljesítményfokozó-szereket a vizsgálatkor illetve ezen szerek birtoklása, forgalmazása, valamint a felbujtás. A doppingolás és doppingvétség nemcsak fair play-elvet sérti, ezzel sportetikába ütköző tevékenység, hanem az orvostudományi erkölcsi kódex írott és íratlan törvényeivel is ellenkezik. Ennek alapján a doppingvétség két fő csoportra osztható: tiltott módszerekre és tiltott szerekre.
A.) TILTOTT MÓDSZEREK:
Oxigénszállítás fokozása: Ez történhet vérdopping útján. Ilyenkor a sportolótól a verseny előtti hónapokban valamekkora mennyiségű vért levesznek, majd közvetlenül a megmérettetés előtt visszainjektálják a versenyzőbe, így megnő a vérvolumen, ezzel pedig a szállított oxigén mennyisége is. Kimutatása egyszerű, hisz a hematológiai paraméterek is nőnek a mennyiséggel. A vérvolumen növekedésével drasztikusan fokozódik a szív izommunkája, így könnyen túlterhelhető a verseny alatt valamint súlyos és korai cardiovascularis betegségek a vérdoppingolás hosszú távú következményei. A vérdoppingon kívül hemoglobin- és perfluoroszénhidrogén-készítmények használatával lehet fokozni az oxigéntranszfert.
Különleges implantátumok: Előfordultak a sporttörténelem során olyan esetek, mikor a versenyzőknek speciális katétert ültettek a szervezetébe. Egy
4
műanyag zsákocska is része volt ennek a „berendezésnek”, amelyben tiszta, a tiltott szertől mentes vizelet volt és mintavételkor ezt szolgáltatta be a versenyző. Felesleges részletezni ennek a módszernek a hátrányait, hisz rendkívül veszélyes illetve kényelmetlen beavatkozás. Ennél jóval egyszerűbb megoldás volt a vizeletcsere. Erre akkor volt lehetősége a versenyzőnek, mikor még a mintaadáskor egyedül volt, ugyanis mostanság már legalább egy doppingellenőr felügyelete mellett kell vizeletmintát szolgáltatni.
Géndopping: A génállomány feltérképezése nemcsak az orvoslásban, hanem a teljesítményfokozásban is nagy áttörést jelentett. Erről a tiltott módszerről a későbbiekben részletesebben is írok.
B.) TILTOTT SZEREK: A doppingszerek többsége eredetileg gyógyítási céllal készült és csak a későbbiekben vették észre a teljesítményt serkentő hatását, így érthető, hogy ezen szerek kategorizálása hatástani csoportosításon alapul. Ezen felül megkülönböztetnek úgynevezett: bármely időszakban (all time, in and out of competition) tiltott szereket, csak versenyen (in competition) tiltott szereket illetve csak bizonyos sportágakban tiltott szereket. Bizonyos, a tiltó listán is szereplő hatóanyagot tartalmazó készítményt betegség esetén használhat a sportoló, de ezt jeleznie, szükség esetén bizonyítania kell a hatóság előtt. Ezeknek a vegyületeknek meghatározták azokat a határértékeit vérben illetve vizeletben, amely alatt még megfelel a gyógyításhoz szükséges terápiás koncentrációnak, de ami felett már doppingvétségnek számít.
5
S1. Anabolikus androgén szteroidok Exogén: 1-androstendiol, bolandiol, calusterone, drostanolone, fluoxymesterone
és származékaik
Endogén:
dihydrotestosterone,
testosterone,
prasterone,
epi-dihydrotestosterone,
19-
norandrosterone S2. Hormonok és rokonvegyületek
erythropoietin (EPO), növekedési faktorok (IGF-1), human-gonadotrop-hormon (hGH)
S3. β2- agonisták
az összes β2- szimpatomimetikum, beleértve azok D- és L- izomerjeit
S4. Antiösztrogének
1. Aromatáz inhibítorok 2.
Szelektív
ösztrogénreceptor
modulátorok
(SERMs) 3. Egyéb antiösztrogének S5. Diuretikumok és egyéb álcázó
Diuretikumok: acetasolamide, amiloride, furosemid,
vegyületek
spironolactone, thiazidok Álcázó vegyületek: epitestosterone, probenicid, αreduktáz-gátlók
(finasteride,
dutasteride),
plazmanövelők (albumin, dextrán) 1. Táblázat: Bármely időszakban tiltott szerek (Forrás: Irodalom 16., 7.)
S6. Stimulánsok
adrenalin,
amfetamin,
ephedrin,
cocain,
(heroin),
fentanyl,
metamfetamin, selegiline S7. Narkotikumok
buprenorphin,
diamorphin
oxycodon, morphin S8. Cannabinoidok
hashis, marijuana
S9. Glükokortikoidok 2. Táblázat: Verseny alatt tiltott szerek (Forrás: Irodalom 16., 7.)
6
Tiltott szerek jellemzése
Anabolikus androgén szteroidok és származékaik
Nagyon elterjedtek a szteroidokat tartalmazó készítmények, mert viszonylag rövid idő alatt látványos eredményt lehet velük elérni. Ezek a vegyületek az endogén termelődő tesztoszteron származékai. Ez a férfi nemi hormon, amely eredetileg a herék Leydig-sejtjeiben képződik és körülbelül 2,5-11 mg-ot állít elő a szervezet naponta. Akárcsak a többi szteroid hormon, a tesztoszteron is egész szervezetet érintő, komplex hatásokkal rendelkezik. A tesztoszteron csak az alapvegyület, mert a májban történő
metabolizmus
során,
melyet
az
5α-reduktáz
enzim
végez,
5α-
dihidrotesztoszteron (DHT) képződik, ez az aktív metabolit mintegy tízszer hatékonyabb az előhormonnál. A tesztoszteron fiziológiás hatása már magzati korban jelentkezik, amikor az anyai gonadotrophormonokkal együtt a masculin nemi jellegeket – mellékhere, ondóvezeték, pénisz – kialakítja. A férfi nemi érésben valamint a pubertás korban bekövetkező változásokért – szőrzetnövekedés, hangmélyülés, stb. – is a tesztoszteron a felelős. Természetesen nem ezek a hatások tették olyan népszerű doppingszerré az androgén hormonokat, de a mellékhatásokban fontos szerepet játszanak. Androgén illetve nemi hormonokra szükség van a megfelelő csont- és izomfejlődéshez – ez az oka, hogy postmenopauzás osteoporosisban is alkalmazzák az ösztrogén terápiát a progresszió lassítására. Az anabolikus szteroidok mind a genitális, mind az extragenitális szövetekben fokozzák a fehérjeképződést, a vizelettel kiválasztott nitrogén, foszfát, kálcium valamint víz mennyiségét csökkentik, ezzel pozitív anyagcsere-egyenleget alakítanak ki. Az előbb említett két hatásból következik, hogy megfelelő fehérjetartalmú étrenddel továbbá jól megtervezett
7
edzésprogrammal látványos izomtömeg és izomerő növekedést lehet elérni a tesztoszteron használatával. A rendelkezésre álló készítményeket parenterálisan illetve szájon át (per os) lehet a szervezetbe juttatni. Az utóbbi módon alkalmazott szteroidokra jellemző a 17-es szénatomon lévő metil- vagy etilcsoport (lásd: 1., 2. ábra). Ez az alkilezés védi a vegyületet a célszerv elérése előtti inaktivációtól, viszont májtoxikussá teszi a hatóanyagot, amely toxicitás a bevett dózis függvénye.
18
OH
CH3 12
17
11 19
1
9
2
10
3
5
14 15
8
H
H 7
6
4
O
16
H
CH3
CH3
13
1. ábra: Metiltesztoszteron
18
HO
CH3 12 11 19
H 2
9 10
HN
14
N
5
H 7
6
4
H 2. ábra: Stanazolol
8
15
8
H 3
CH3 16
H
CH3 1
17 13
A parenterálisan szervezetbe juttatható androgén szteroidok a 17-es szénatomhoz kapcsolódó hidroxil csoporton észterezett származékok, mint ahogy azt a 3. ábra szemlélteti. A különböző savakkal észterezett vegyületeknek eltér a felszívódása például: acetát, propionát észtereknek 3-4 nap a felszívódása, heptanoát, decanoát észtereknek 10 nap, de ismertek olyan származékok is, melyeknek több hét - akár több hónap is – szükséges, hogy megjelenjenek a vérben. A hosszú szénláncú zsírsavakkal észterezett szteroidok szájon át is alkalmazhatók, de ezek a vegyületek nem károsítják a májat, mivel beépülnek a bélfal sejtjeibe, a kilomikronokba, így a májat megkerülve jutnak a vénás keringésbe.
O 18
CH3 12
CH3
11 19
9
2
10
3
5
17 16 14 15
8
H O
CH3
13
H
CH3 1
O
H 7
6
4
CH3 3. ábra: Metenolon oenantát
Az említett izomtömeg-, izomerő-növelő hatások mellett súlyos mellékhatások is jelentkeznek, amelyek korai megjelenése az átlagosnál valószínűbb, mivel sok sportoló a minél gyorsabb fejlődés érdekében a terápiás dózis sokszorosát alkalmazza. A dózisnövelést csak fokozza, hogy az anabolikus hatáshoz – androgénhez is – tolerancia alakul ki, így a szteroid hosszú távú alkalmazása esetén már nem tapasztalható az a látványos eredmény, mint a kezelés elején. A doppingszer elhagyása következtében néhány hét után visszaesés érzékelhető, amely megnyilvánul például: fokozott nátrium-, kálium-, vízürítéssl, a pozitív nitrogénegyensúly megszűnésével és ezen változások látható jeleként a megszerzett izomzat egy része elvész, a testsúly csökken.
9
Mivel a tesztoszteron szinte az egész szervezetre hatással van, az anabolikus szteroidok mellékhatásai is igen szerteágazóak. A doppingszer alkalmazásával emelkedik a szervezet hormonszintje, így az endokrin hatások is kifejezettebbek. Nőknél jellemző mellékhatás az „elférfiasodás” (virilisatio), melynek tünetei a clitoris növekedése, menstruációs zavarok, férfias izomrendszer, a hang mélyülése, acne-k megjelenése, akár meddőség is előfordulhat. Férfiak esetében a fokozott androgén hormonszint herefunkciós zavart eredményez. Az endogén tesztoszteron-elválsztás csökkenése miatt a prosztatarák kifejlődésének, a libidó csökkenésének és az impotencia kialakulásának valószínűsége nő. A per os alkalmazható szteroidok májkárosító hatása miatt teljes anyagcserezavar jöhet létre. Néhány példa a májelváltozásokra: májtumor, sejtelhalás, sárgaság, epecsatornák elzáródása. A májfunkció romlása miatt megváltozik a mellékvese eredetű szteroidok metabolizmusa – ennek következtében immunszuppresszió lép fel - valamint gyakori az úgynevezett: szteroid-diabetes jelenség. A kardiovaszkularis rendszer extraterhelését jelenti a só- és vízretenció miatt kialakuló
vérvolumen
növekedés.
Ennek
következtében
fokozódik
a
szív
teljesítménye és emelkedik a vérnyomás, amelyek miocardialis hypertrophiahoz vezetnek, ezáltal pedig fokozódik az infarktus illetve az agyvérzés veszélyének kockázata. A zsíranyagcsere károsodása miatt csökken a HDL-, növekszik az LDLkoleszterin
szintje,
így
az
érelmeszesedéssel
hozzájárul
a
szívérrendszeri
mellékhatások kialakulásához. Az anabolikus szteroidokat használó sportolók gyakran antiszociálissá válnak. Viselkedésük eldeformálódik, agresszívak, a fájdalomküszöbük eltolódik – némelyek ezt előnyként értékelik -, depressziósak (bipoláris), ingerlékenyek lesznek. Pszichikai függőség alakul ki a doppingszerhez, amely csak fokozza a pszichotikus állapotot.
10
Hormonok és rokonvegyületek
Ebbe a csoportba tartozik az adenohypophysis növekedési hormonja. Az endogén vegyület rekombináns DNS-technológiával előállított szintetikus származékai a somatropin és a somatrem. A növekedési hormon közvetlenül hat a zsír- illetve a szénhidrát-anyagcserére,
de
fiziológiás
hatásait
többnyire
közvetve,
a
szomatomedineken – más néven inzulinszerű növekedési faktorok (IGF) – keresztül fejti ki. A szomatomedinek in vivo a májban, a vesében és az izmokban képződnek, szintézisüket a növekedési hormon serkenti. A növekedési hormon a nevét a hatása után kapta, mivel a növekedést serkenti, vagyis az ehhez szükséges folyamatokat, így például: elősegíti a sejtproliferációt, a porcszövet fejlődését, fokozza az aminosavak transzportját a szövetekbe illetve beépülésüket a fehérjékbe. Ideiglenesen elektrolit- és nitrogénretenciót okoz. Inzulinnal ellentétes hatása van az anyagcserére, azaz a glükózleadást serkenti a májban, emellett fokozza a trigliceridhidrolízist a zsírszövetben. Az indirekt – IGF-1 által
közvetített
–
hatásai
inzulinszerűek,
mivel
a
szomatomedinek
aminosavszekvenciája hasonlóságot mutat az inzulinéval. Klinikai alkalmazásban jelenleg növekedési hormon hiányos gyermekek kezelésére adják a somatropint vagy somatremet. Doppingszerként használva a növekedési hormon fokozza az izomfehérje és a nukleinsav képződését, ez pedig izomtömeg növekedéshez vezet – hasonló módon hat az IGF-1 is. A zsírsavbontás stimulálásán keresztül testzsírcsökkenés érhető el, amely szintén hozzájárul a teljesítmény fokozásához. Gyorsítja az izmok regenerációját sérülés után. Az inzulinnal ellentétes hatásai miatt a növekedési hormon hyperglykaemiat okozhat, melynek szövődményeként cukorbetegség, kóros glükóztolerancia, súlyos esetben diabeteses kóma alakulhat ki. Tartós használat esetén májgyulladást okozhat.
11
A hormonszerű doppingszerek közé sorolandó a humán gonadotrop hormon (hGH) és az erythropoietin (EPO). Az utóbbiról még részletesebben szó lesz a dolgozatban, mivel a használatát sokáig nem tudták direkt módszerekkel kimutatni, így igen „közkedveltté” vált a különböző sportágakban. A humán gonadotrop hormonok
szintén
az
adenohypophysisben
termelődnek
és
doppingolás
szempontjából közülük a here interstitialis sejtjeit stimuláló hormon kiemelendő, mert hatására fokozódik a Leydig-sejtekben a tesztoszteronszintézis, így hatásai valamint mellékhatásai megegyeznek az anabolikus androgén szteroidokéval.
β2-agonisták
Ebbe a csoportba az asthma bronchiale-ban használt vegyületek tartoznak. fokozhatja. A β2-agonisták simaizom-relaxáló illetve bronchodilatator hatását mind az asthmas roham oldásában, mind a hypoxiás állapot elkerülésére használhatják. A tiltó lista az anabolikus ágensek közé sorolja ezeket a vegyületeket, mert tartós használatuk esetén izomtömeg-növekedést lehet elérni. Szervezetbe juttatni inhaláció illetve per os tabletta vagy kapszula – ritkán parenterálisan - útján lehet. Vannak gyorsan ható, rövidebb hatástartamú vegyületek, mint például: a salbutamol, terbutalin (lásd: 4., 5. ábra), és vannak akár a 12 óra hatástartamot meghaladó származékok: clenbuterol, salmeterol (lásd: 6. ábra).
HO H3C
OH
HO
H
NH
4. ábra: Salbutamol
12
CH3 CH3
OH H3C NH
HO H
CH3 CH3
OH 5. ábra: Terbutalin
OH H NH
Cl
CH3 CH3 CH3
H2N Cl 6. ábra: Clenbuterol
A β2-agonisták mellékhatásainak egy része a nem megfelelő szelektivitásból ered, így izgatják a szív β1-receptorait is, amely arrhythmiahoz vezethet, ez pedig komoly kockázat a versenyzőnek, hisz terhelés alatt egyébként is a fokozott szimpatikus tónus a jellemző. Sportolói szempontból fontos megemlíteni az izomgörcsre való megnövekedett hajlamot, amelyet a harántcsíkolt izmok β2-receptorai közvetítenek.
Antiösztrogének
Az
antiösztrogének
a
gonadotrop
hormonhoz
hasonlóan
az
endogén
tesztoszteronszintézis serkentésével okoznak izomerő-növekedést. A 7. ábrán látható clomifen és a tamoxifen gátolja az ösztradiol kötődését a receptorához, ezzel feloldja a gonadotropinok negatív feed back gátlását. Az ösztrogénszint csökkentésén keresztül
13
serkenti a gonadotrop hormonok szintézisét anastrozol, amely aromatáz gátló hatású. Mivel megnövekszik a tesztoszteron mennyisége a szervezetben, ezért a mellékhatások is ugyanazok lesznek, mint az anabolikus androgén szteroidok esetében.
CH3 O N H3C
Cl
7. ábra: Clomifen
Diuretikumok és egyéb álcázó vegyületek
A diuretikumok - illetve a maszkírozó vegyületek kilógnak - az eddig tárgyalt teljesítmény-fokozók sorából, ugyanis a vizelethajtó szereknek nincsen ilyen hatásuk. Tiltó
listára
kerülésük
oka,
hogy
használatukkal
gyors
és
reverzibilis
testsúlycsökkenés érhető el továbbá a vizelettel ürülő doppingszerek eliminációját gyorsítják. Ellenben éppen a teljesítőképesség romlását okozhatják, mivel a vízvesztéssel csökken a vérnyomás, szívizomzavarok léphetnek fel, megnő a kiszáradás veszélye. Néhány ismertebb vizelethajtó vegyületet mutatnak be az alábbi ábrák.
14
O NH
Cl O
O S
H2N
O
OH 8. ábra: Furosemid
Cl
H N
S
S
O H2N
NH O
O
9. ábra: Hydrochlorothiazid
O Cl
NH
N NH
H2N
N
NH2
NH2
10. ábra: Amilorid
Stimulánsok
Az ide sorolt hatóanyagoknak elsősorban központi idegrendszert izgató hatása van, elnyomják a fáradtságérzést, növelik a versenykedvet. Emellett az adrenerg 15
receptorok izgatásával emelik a vérnyomást, amely javítja az izmok vérellátást, így a sportoló az átlagosnál nagyobb teljesítményre lesz képes. A mellékhatások is a szimpatomimetikus
hatásokból
erednek,
azaz
szívritmuszavart,
hypertensiot,
anyagcsere-problémákat, hyperthermiat okoznak illetve pszichostimuláns hatásuk miatt álmatlanság, nyugtalanság, anorexia előfordulhat. Ezeknek a szereknek az esetében nemcsak a pszichés, hanem a fizikai dependencia is kialakulhat, amely feltűnő romlást eredményezhet a sortoló teljesítményében, személyiségében. Kémiai szerkezetüket tekintve ezek a vegyületek a fenil-alkil-amin típusú szimpatomimetikumok (lásd: 11., 12. ábra) közé sorolhatók illetve farmakológiai szempontból ide tartozik a kokain is, melyet a 13. ábra mutat be.
H NH2 CH3 11. ábra: Amfetamin
OH H
H NH CH3 CH3
12. ábra: Ephedrin
16
O
H3C N
CH3 O
O O
13. ábra: Kokain
Narkotikumok, cannabinoidok, glükokortikoidok
Nem túl népszerű doppingszerek a morfinszármazékok (lásd: 14., 15. ábra), mert a kezdeti szellemi és testi teljesítmény-fokozódás után, súlyos visszaesés következik. Csökkentik a fáradtság-, a fájdalomérzetet, a légzőközpontra kifejtett gátló hatással könnyítik a légvételt, viszont akárcsak a stimulánsoknál, itt is fennáll a fizikai dependencia veszélye. A cannabinoidokat és a morfinszármazékokat gyakran a használják a sportolók is a feszültség levezetésére. Egy versenyszezon alatt nemcsak a fizikai, hanem az idegi terhelés is óriási. Ha egy edzőnek fontos a versenyzője egészsége, akkor mindenképp megtalálja a módját, hogy ezeknek a szereknek az alkalmazása nélkül enyhítse a sportolóra nehezedő stresszhatást. A glükokortikoidok szintén nem alkalmasak a teljesítmény emelésére, sőt a fehérjeszintézis csökkentésével illetve a lebontás serkentésével inkább azzal ellentétes eredményt produkálnak, viszont erős gyulladáscsökkentő hatásuk miatt a regenerációt 17
gyorsítják.
A
komplex
mellékhatások
–
csontritkulás,
immunszuppresszió,
anyagcserezavarok, stb. - miatt a glükokortikoidok nem tartoznak a gyakran használt doppingszerek közé. A 16. ábrán látható prednisolon az egyik jellemző képviselője ennek a hatóanyagcsoportnak. CH3
N
O
HO
OH
14. ábra: Morfin
O N
15. ábra: Fentanyl
18
N
CH3
OH
O 20
18
CH3 12
HO
11
19
16
9
1 2
13
H
CH3 10
14 15
8
H 5
3
O
OH
17
H 7
6
4
16. ábra: Prednisolon
Doppinganalitika
A doppingellenes törvény betartása érdekében szükség van az ellenőrzésekre, melyeket mind a versenyek ideje alatt, mind a felkészülés időszakában megtesznek a szakemberek. Az ellenőrök dolgát nehezíti, hogy a doppingmódszerek fejlettebbek, mint a detektálásra szolgáló technikák, erre példa a géndopping esete. A kiértékelést nehezíti, hogy bizonyos szerek, melyek a tiltó listán szerepelnek orvosi célra felhasználhatók – ezért korlátozása alá tartozó szereknek is nevezik ezeket -, ilyenek például: β2-agonisták, diuretikumok, glükokortikoidok, stb. Az élvezeti szerek szintén a korlátozás alatt álló hatóanyagok csoportjába tartoznak, köztük a marijuana is, mivel egyes országokban engedélyezett a fogyasztása. Amennyiben a sportoló terápiás célból alkalmazza valamely korlátozás alatt lévő szert, ezt a szükséges dokumentációval igazolnia kell a doppingfelügyelet előtt. A doppingellenőrzés a következő folyamatokból áll: mintavétel, mintaelőkészítés,
azonosítás,
kiértékelés.
Fontos,
hogy
olyan
módszerekkel
és
technológiával dolgozzanak az ellenőrök, melyek kellően szelektívek, érzékenyek és gyorsak, mivel nagyszámú mintát kell feldolgozniuk viszonylag rövid idő alatt. A
19
doppinganalitika műszeres fejlettségét mutatja be M. Tsivou és társai által készített beszámoló (lásd: Irodalom 11.), amely a 2004-es athéni nyári olimpia doppingellenőrzéseit foglalja össze. Eszerint összesen 3617 mintát – 2926 vizelet és 691 vér – vizsgáltak meg a verseny ideje alatt, melyekben 23 tiltott szert találtak, ezeknek döntő többsége (16 esetben) valamilyen anabolikus hatású szer volt. A 153 tagú ellenőrcsapat napi 24 órában vizsgálta a mintákat. A pozitív eredményt 36 órával – pozitív erythropoietin-teszt esetén 72 óra múlva - a minta leadása után közölni tudták a versenyfelügyelettel. Ez a rövid idő azért is figyelemre méltó, mert az ellenőrök 180 mintát vizsgáltak meg naponta. Ezek a számadatok jól tükrözik, hogy a műszeres analitika segítségével a vizsgálatok ideje lerövidült, a kapacitása pedig növekedett.
1.) Mintavétel
Jelenleg a legtöbb esetben vizeletet ellenőriznek. Ennek legfőbb előnye, hogy a legtöbb anyag vagy azok metabolitja a vizelettel kiválasztódik, valamint a mintavételt a sportoló maga meg tudja tenni. Doppingvétségnek számít, ha sportoló megtagadja a vizeletminta leadását. A tiltott módszerek között említett katéterezéssel vagy infúziózással illetve diuretikumok alkalmazásával manipulálni lehet az így leadott mintát. Manapság már gyakrabban vesznek vért doppingellenőrző vizsgálatokhoz, melynek
előnye
a
vizelettel
szemben,
hogy
peptidhormonokat
nagyobb
koncentrációban tartalmaz, a hematológiai értékek egyéni változása is utalhat doppingszer használatára, csekély a manipuláció lehetősége valamint a „genetikai ujjlenyomat” révén a géndopping is bizonyos fokig detektálható. A mintavételhez viszont mindenképp külső segítség szükséges valamint megnő a fertőzés kockázata is. Hematológia
értékek
kiértékelésekor
magasságkülönbségekből fakadó eltéréseket.
20
figyelembe
kell
venni
a
Ritkán, de előfordulhat, hogy az ellenőrzéshez szükséges mintát székletből, kilélegzett levegőből veszik és még ennél is ritkább a hajból vagy nyálból származó vizsgálati anyag. Hajanalízis: A doppinganalitika egyik reménye a hajból történő kimutatás. Önmagában nem valószínű, hogy fogják alkalmazni, mert könnyű és nem is mindig törvénytelen a manipulálása, viszont vannak olyan előnyei, melyek kétes esetekben megkönnyíthetik a versenybíróság döntését. A hatóanyag beépülése a hajba illetve annak keratin-rendszerébe még nem tisztázott. A hajtüszőt gazdagon behálózzák az erek, így elképzelhető, hogy a vérből kerül át a vegyület, de egyesek szerint az izzadságból esetleg a fejbőrből is átdiffundálhat a gyógy- vagy doppingszerként alkalmazott molekula. Bár a hajban is találtak citokróm P-450 enzimrendszert, a metabolizmus a többi szövethez képest elhanyagolható, tehát a vegyületek abban a formában „raktározódnak” itt, amilyenben bekerültek, és addig, amíg a hajat le nem vágják, mivel a szilárd keratin vázból nem tudnak kiszabadulni a molekulák. Ez lehetővé teszi olyan szerek – például: β2agonisták – kimutatását, melyeknek tartós használata tiltott a doppingellenes törvény szerint. További előnye a hajanalízisnek, hogy a mintavétel nem teremt olyan zavarba ejtő helyzetet, mint a vizeletminta adása és nincsenek olyan veszélyei, mint a vérvételnek. A haj esetében a legkülönbözőbb időközökben és gyakoriságban lehet a mintát beszerezni,
mert
nincsenek
olyan
élettani
korlátai,
melyek
a
bevitt
folyadékmennyiséggel függenének össze vagy a szervezetet károsító következményei lennének. A jelenlegi gyakorlat szerint 30-50 mg hajat vágnak le, minél közelebb a fejbőrhöz. A hajanalízis kritikus pontja a tisztítás, amellyel kapcsolatban vannak még megoldandó problémák. Ennek a műveletnek a célja, hogy az aprított vagy porított hajról eltávolítsák a különböző szennyeződéseket – por, füst, izzadság, stb. -, ugyanis ezek zavarhatják a mérést. A tisztításhoz (dekontaminálás) különböző oldószereket illetve ezek keverékét, detergenseket, puffer oldatokat, hígított savakat, desztillált
21
vizet használnak. A művelet során sajnos előfordulhat, hogy a vizsgálandó vegyületet is kioldják, eltávolítják, így a mérés meghiúsul. A kimutatandó hatóanyag izolálása sokkal nehezebb a hajból, mint a vizeletből vagy a vérből, ahol a vegyület oldott állapotban van és valamilyen elválasztó módszerrel „egyszerűen” elkülöníthető az őt körülvevő biológiai rendszerből. A haj esetében a molekulák szilárd keratin vázba vannak beágyazódva, így előbb azt „emésztik”, hidrolizálják vagy oldják. A legtöbb anabolikus ágenst, stimulánsokat sikerült már hajból kimutatni valamint a módszer alkalmasnak bizonyult a hosszantartó doppingszer-használat kimutatására is. A következő táblázat összefoglalja a hajanalízis előnyeit.
Egyszerű, gyors, kényelmes, bármikor
Mintavétel:
megismételhető, veszélytelen Mintatárolás:
Nem igényel különleges körülményeket
Kimutatható hatóanyagok:
Anabolikus ágensek: szteroidok és származékaik, β2-agonisták Stimulánsok: kokain, amfetamin, metamfetamin Opiátok A tartósan használt szerek kimutatása,
Különleges előny:
melyeket vizeletből vagy vérből nem lehet detektálni. 3. Táblázat: A hajanalízis előnyei (Forrás: lásd: Irodalom 10.)
A hajanalízissel kapcsolatban sok, jelenleg még megválaszolatlan kérdés van, melyek egy része a hiányos „hajbiológiai” ismeretekből ered. A pontos okát még nem tudják, de a tudósok bebizonyították, hogy a pigmentáció – etnikumtól függ jelentősen befolyásolja a vegyületek beépülését a keratin vázba. Erre példa Joseph és Cone kísérlete (lásd: Irodalom 10.), melynek eredményeként azt kapták, hogy az 22
afrikai nők fekete hajába 157-szer erősebben kötődik a kokain, mint a kaukázusi nők szőke hajába. Hasonló problémát jelent a haj vegyszeres kezelése, amely megváltoztatja a vegyületek koncentrációját a hajban. Cirimele és társai által végzett kísérletben (lásd: Irodalom 10.) a természetes barna hajban háromszor nagyobb kokain- és kodeinkoncentrációt mértek, mint a hidrogén-peroxiddal kiszőkített haj esetében. Hiányoznak még az analitikai standardok, amelyekkel érvényesíttetni lehetne a hajanalízist, valamint nincs még adat a haj és a vizelet/vér közötti kvantitatív kapcsolatra. Bizonyos sportágakban, ahol a rövid haj előírás vagy ajánlott – például: úszás-, nincs lehetőség a hajból történő kimutatásra. A 4. táblázat összefoglalja a hajanalízis hátrányait, problémáit.
Manipuláció lehetősége:
Hajvágás, hajfestés
Etnikai problémai:
A pigmentáció befolyásolja a vegyületek beépülését. Peptid hormonok nem épülnek be a
Kimutathatósági korlát:
hajba. Nincsenek standard értékek. Nincs
Validálási probléma:
kvantitatív kapcsolat a vizelettel és/vagy a vérrel. Tisztítással eltávolítható a vizsgálandó
Eljárási gondok:
vegyület. Bonyolult kivonás. Spontán hidrolízis történhet a hajban.
Biológiai probléma:
4. Táblázat: A hajanalízis hátrányai és problémái (Forrás: lásd: Irodalom 10.)
2.) Minta-előkészítés
Mivel a minták többsége – akár vizelet, akár vér – egy biológiai mátrixot jelent, melyből a detektálandó hatóanyagot vagy metabolitot izolálni, koncentrálni kell. Az 23
előkészítés során különböző elválasztó technikákat alkalmaznak, hogy az endogén és exogén háttértől – nem tiltott szerek – megszabadítsák a kimutatandó vegyületet. Különböző elválasztási módszereket használnak az izolálásra, így például: folyadékfolyadék, szilárd-folyadék extrakciót és a legelterjedtebben a nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiát (HPLC) alkalmaznak. Az izolált anyagot származékképzéssel készítik elő az analízisre, néha az izolálásra is – például: gázkromatográfia. A mintaelőkészítés során is fontos tényező a gyorsaság, ezért jelentett nagy technológiai fejlődést a HPLC megjelenése, mert az eluens-összetétel változtatásával lehetőség van egyszerre több vegyület elválasztására, bekoncentrálására. A doppingszerek között egyre több a fehérje természetű anyag – például: erythropoietin, növekedési hormon, IGF-1 -, ezek gyors és hatékony elkülönítésére elektroforetikus módszereket alkalmaznak. A műszeres analízis fejlődésével a minta-előkészítés és az azonosítás összekapcsolhatóvá vált. A doppinganalitikában legtöbbször a gázkromatográfiás illetve a nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás elválasztásokat kapcsolják a különböző tömegspektrometriás kimutatásokkal, így ezek bemutatása is a következő fejezetben történik meg.
3.) Azonosítás
A hatóanyagok vagy metabolitok izolálása, bekoncentrálása és származékképzése után kerül sor a kimutatásra, melynél a specificitás, a szenzitivitás mellett még a gyorsaság a kulcsfontosságú tényező. Detektálásra általában a különböző kromatográfiás módszerekkel kapcsolt tömegspektrometriát valamint a peptidek esetében a különböző immuno assay-eljárásokat használnak. Tömegspektrometria (Mass Spectroscopy, MS): A doppinganalitika igényeinek teljes mértékben megfelel, mert kellően nagy az érzékenysége, hogy kis koncentrációban (10-6 g meghatározása is lehetséges) jelenlévő vegyületeket
24
kimutasson. Szerves és szervetlen anyagok kvalitatív, kvantitatív elemzésére nyújt lehetőséget. A módszer alapja, hogy a gázhalmazállapotban lévő vegyületek ionizálódnak, fragmentálódnak, majd az elektromos és mágneses térben a töltésegységre jutó tömegük – m/z érték - szerint az ionnyalábok szelektálódnak, végül így kerülnek regisztrálásra. A gázhalmazállapotú minta előállítása hevítéssel történik. Az ionizáció létrejöhet a hevítéstől, de gyakoribb, hogy valamilyen részecskével – elektron, ion, atom – bombázzák a vegyületet, illetve a kémiai ionizáció lehetősége is adott. Amennyiben az ionizáló sugárzás eléri a molekula kötéseinek energiáját disszociáció, majd fragmentáció következik be. Analizátorok
végzik
a
fragmentálódott
ionnyalábok
tömeg
szerinti
szétválogatását, majd a detektorba – elektronsokszorozó, fényképezőlemez - jutva kapjuk a tömegspektrumot. A mágneses szektor tömeganalizátor alkalmazásakor a keletkező ionokat keskeny ionsugárrá változtatják elektrosztatikus kapuk (rések) segítségével, majd egy mágneses térbe jutva a mágneses tér által körpályára vannak kényszerítve. Körpálya sugara függ a töltésegységre jutó tömegtől. A kvadropól analizátor esetében nincs mágneses tér, hanem négy elektromosan vezető rúd által képzett „üregbe” jut az ionnyaláb, ahol váltó- és egyenáram együttes hatására oszcilláló mozgást végez, amely mozgás szintén a töltésegységre jutó tömeg függvénye. Ilyen kvadropól analizátort (is) használtak Rodny Montes de Oca Porto és társai (lásd: Irodalom 15.) az anabolikus androgén szetroidok közé tartozó danazol metabolitjainak vizeletből történő meghatározásához. A Fourier-transzformációs tömegspektrométer esetén az ionizált fragmentumok konstans mágneses térben végzett ciklikus mozgásuk következtében keletkező váltóáram kerül detektálásra, amelyből
a
molekulatöredék
tömege
számítható.
Az
ionok
sebességének
meghatározásán alapul a repülési idő analizátor működése, mivel az azonos kinetikus energiájú részecskék sebessége vákuumban a tömegük négyzetgyökével fordítottan arányos. Ezt az analizátort számos teljesítményfokozó- és egyéb doppingszer kimutatására használják, mint például: stimulánsok, β-blokkolók, β2-agonisták, antiösztrogének, vizelethajtók, cannabinoidok. Különlegessége, amely egyben előnye is ennek az eljárásnak az, hogy eltérő kémiai természetű anyagokat – savakat, bázisokat, semleges vegyületeket – egyszerre lehet mérni (lásd: Irodalom 12.). 25
A tömegspektrometria egyaránt alkalmas kvalitatív és kvantitatív analízis elvégzésére. A mérési eljárások standardizálásával lehetőség van a különböző helyeken mért adatok összehasonlítására. Doppinganalitikában is a rendelkezésre álló referencia tömegspektrumokat használják a minőségi elemzésre, míg a spektrumok csúcsai arányosak a vizsgálandó vegyület koncentrációjával az elemzett mintában. A doppinganalitikában gyakran előfordul, hogy két tömegspektrométert összekapcsolnak, ez az úgynevezett: tandem tömegspektromeria (MS-MS). A készülékek megfelelő szinkronizálásával elérhető, hogy az m/z érték alapján szelektálódjanak a molekulatöredékek illetve sorrendiséget is meg lehet állapítani így (lásd: 17. ábra). Tandem tömegspektrometriát használt például Marie Bresson és csapata (lásd: Irodalom), mikor hajból mutatták ki az anabolikus hatású metandienont. Az eljárás során a hajmintát metilén-kloriddal tisztították, majd 1 M NaOH-dal feloldották, végül az előkészítés végén szilárd fázisú és folyadék-folyadék extrakció
után
következett
a
származékképzés
–
ezt
N-metil-N-
trimetilsililtrifluoracetamiddal végezték. Az elválasztást gáz kromatográffal végezték és a detektálás történt tandem tömegspektrometriával, így 2 pg/mg koncentrációban ki tudták mutatni a metandienont.
26
17. Ábra: Példák a tandem MS alkalmazására: A.) A kiválasztott ion szerkezetének vizsgálata: MS-1 meghatározott m/z értékre beállítva. B.) Minden komponens megvizsgálása után a meghatározott ionok kiválasztása, MS-2 meghatározott m/z értékre beállítva. C.) Semleges veszteséggel járó komponensek – pl.: glükoronid konjugátumok, melyek sok hatóanyag közös metabolitja – keresése. D.) Kiválasztott reakció nyomon követése, MS-1 és MS-2 meghatározott m/z értékre beállítva. (Forrás: Irodalom 14.)
Gázkromatográfia (Gas Cromatography, GC): Gázhalmazállapotba jutatott minta komponenseire való szétválasztásra alkalmas. A mozgófázis szintén gáz, míg az állófázis lehet valamilyen felületen abszorbeált folyadék vagy szilárd anyag. A vizsgálandó minta az adagolás pillanatában válik gázhalmazállapotúvá, ehhez szükséges, hogy viszonylag kevés anyagot (néhány μl) juttassanak a rendszerbe, továbbá olyan hőmérsékleten tartsák az adagolót, amelyen a minta a gőznyomása a telítési gőznyomás alatt maradjon. A kis mennyiségű minta nehezíti az eljárás
27
reprodukálhatóságát.
Származékképzéssel
kicsiny
illékonyságú
anyagokat
is
mérhetünk gázkromatográfiásan. Az
elválasztási
módoknak
megfelelően
többféle
kolonnát
használnak.
Alkalmaznak megosztófolyadékokat, melyeket az elválasztandó komponensek kémiai természete alapján állítanak össze. Az alkalmazott szilárd adszorbensek lehetnek: aktív szén, alumínium-oxid, szilikagél, molekulaszűrők, szerves polimerek. Fontos, hogy a szilárd töltetek nagy fajlagos felülettel rendelkezzenek, egyenletes szemcseméret-eloszlást mutassanak, megfelelő legyen a mechanikai szilárdságuk. Gázkromatográf kapcsolása tömegspektrométerrel javítja kimutatás hatásfokát. GC-vel elvégezhető a komponensek megfelelő szelektálása, így az MS által végzett detektálás pontosabb lesz. Technikai nehézséget okoz, hogy a GC-ből körülbelül 1 atmoszféra nyomással lép ki a gáz, a tömegspektrométer viszont vákuumban mér. Ennek kiküszöbölésére a gázkromatogramból távozó gázt egy porózus üvegből készült fúvókán vezetik át, amely egy vákuumkamrában helyezkedik el, így a könnyű molekulasúlyú eluens (argon, hélium) a nyomáskülönbség miatt kidiffundál a fúvókából, a vizsgálandó komponensek – nagyobbak a vivőgáznál, ezért nem jutnak át a pórusokon - pedig bejutnak a tömegspektrométerbe. A következő táblázat bemutatja mennyire elterjedt a gázkromatográf és valamilyen tömegspektrométer kapcsolása.
Vizsgált komponens: Nitrogéntartalmú vegyületek (stimulánsok, narkotikumok) Anabolikus szerek, β-blokkolók, β2agonisták Vizelethajtók 5. Táblázat: GC/MS alkalmazására példák a doppinganalitikában
28
Nagyhatékonyságú
folyadékkromatográfia
(High
Performance
Liquid
Chromatography, HPLC): A módszer neve a folyékony mozgófázisból ered. Állófázisnak többnyire szilárd adszorbenseket alkalmaznak, melyeknek két alap típusa van: a normál és a fordított fázisú. Előbbinél az adszorbens poláros, az eluens apoláris, míg a második esetben ez fordítva van. A HPLC nagy előnye, hogy használat közben lehet változtatni az eluens összetételét (grádienselució), így az összetett minták szétválasztása gyorsabb lesz. HPLC tömegspektrométerrel való kapcsolásakor megoldandó probléma a vizsgálati anyag gázhalmazállapotba juttatása. A HPLC-ből kicsepegő elegy egy infravörös sugárzással fűtött, vákuumkamrán áthaladó futószalagra kerül. Az eluens a vákuumban folyamatosan elpárolog és távozik a rendszerből, amennyiben alacsony forráspontú, illékony oldószerekből készült a mozgófázis. A „thermo-spray” eljárást a kevésbé illékony anyagok eltávolítására használják. Ilyenkor a HPLC-ből kilépő folyadékot egy 400°C-ra hevített kapillárison vezetik keresztül, amelyet egy vákuumkamrába irányítanak, ahol az oldószer eldiffundál.
Immunoassay eljárások: A doppinganalitikában a vérelemzésekhez használt kimuatatási módszer, mely az antigén és antitest között kialakuló specifikus kölcsönhatásra épül. Ha valamelyik komponenst – általában az antigént – megjelölik radioaktív izotóppal vagy fluorofor szubsztituenssel, akkor a kapcsolódást követően a megfelelő detektorral – radiometriásan, fluoreszcencia-méréssel – szelektíven meghatározható a kívánt antitest vagy fehérje illetve fehérjemolekulához kötve a nem peptid természetű vegyületek (gyógyszerek, doppingszerek) is mérhetővé válnak. Az alapeljárás továbbfejlesztése a különböző enzim-immunoassay-k, ahol az antigéneket enzimek váltották fel. A szubsztrát-enzim kapcsolódás nem eredményez közvetlenül detektálható jelet, ehhez szükség van egy olyan reagensre, amely mérhető jelet bocsát ki a szubsztrátum koncentrációváltozásakor. Mivel egy enzim több szubsztrát átalakulását katalizálja, így jelsokszorozó hatása is van, tehát kisebb koncentrációk mérését teszi lehetővé.
29
Erythropoietin, mint doppingszer
18. ábra: Erythropoietin (Forrás: teach.biosci.arizona.edu)
Ez a peptidhormonok közé sorolt fehérjemolekula már a legtöbb sportágban megjelent, mint doppingszer. A viszonylag csekély számú mellékhatása és a detektálása körüli nehézségek tették olyan népszerűvé az erythropoietint, vagyis az EPO-t. Sokáig csak az indirekt meghatározásra volt lehetőség illetve közvetlenül csak a vérből tudták kimutatni, viszont a sportoló megtagadhatja a vérvételt az ezzel járó veszélyekre hivatkozva. Fiziológiásan a hypoxia váltja ki az endogén EPO felszabadulását. Oxigént érzékelő receptorokat mutattak ki a vese és a máj felszínén, amely nem meglepő, mert ebben a két szervben történik erythropoietin szintézis – 90% a vesében, 10% a májban. A keringésbe jutott erythropoietin eljut a csontvelőbe és kötődik az erythroid
30
progenitor sejtek felszínén található receptorához. A burst-forming-units (BFU) valamint a colony-forming-units (CFU) erythroid sejtek a stimulus hatására differenciálódnak, majd pedig proliferálódnak. Ennek következtében a periférián emelkedik a reticulocytaszám illetve a vörösvérsejtszám. A vérképzésre kifejtett pozitív hatások miatt az EPO-t anaemia kezelésére használják a gyógyászatban, de a teljesítményfokozóként való alkalmazása is ennek köszönhető.
19. ábra: EPO hatása (Forrás: www.roche.de)
Az erythtropoietin a hemoglobin és a hematokrit mennyiségének növelésével fokozza az O2-ellátottságot illetve megakadályozza a hypoxiás állapot kialakulását, erősíti a szív működését, növeli a teljesítőképességet. Mindezek a hatások alkalmassá teszik az EPO teljesítményfokozóként történő használatát. 1983-ban izolálták az EPO-gént és ezt követően már elő tudtak állítani rekombináns erythtropoietint. Az endogén vegyület egy 165 aminosavból valamint 4
31
cukoroldalláncból
álló
glikoprotein.
A
szénhidrátok
hossza
és
helyzete
fajspecifikusságot követ, de a rekombináns EPO elkülönítésében is fontos szerepe van. Kezdetben a vérparaméterek mérésén alapuló indirekt módszerrel próbálták az erythropoietin használatát kimutatni, de ennek több hátránya volt, nem beszélve arról, hogy a sportoló megtagadhatja a vérminta adását. Egy kellően nagy számú és reprezentatív kontrollcsoport hematológiai értékeit kellett ahhoz megvizsgálni, hogy egy jellemző statisztikát alakíthassanak ki a közvetett eljáráshoz. Emellett szignifikáns változást kellett az EPO-nak okoznia, hogy értékelhető eltérés mutatkozzon a vérparaméterekben, amely még nem jelenti automatikusan, hogy valaki doppingol, mert magashegyi edzések során, ahol alacsonyabb az O2-nyomás, fokozódik az endogén erythtropoietin szintézise. A direkt EPO-kimutatási módszerek kidolgozását hátraltatta, hogy a vérben picomol-os nagyságrendben található ez a glikoprotein, de még a vizeletbe is mikroilletve nanomol mennyiség választódik ki. Az erythtropoietin meghatározásában áttörést jelentett az izoelektromos fókuszálás (IEF), amely lehetővé tette a közvetlen detektálást.
Izoelektromos fókuszálás (IEF)
Az elektroforetikus módszerek közé tartozik ez az eljárás. Az aminosavakból álló fehérjék töltése változik és változtatható, így elektromos térbe helyezve egy peptidet, az az ellentétes polaritású elektródhoz fog vándorolni. Amennyiben az elektroforézis egy konstans pH grádienssel rendelkező gélhez kötve megy végbe, akkor a fehérjevándorlás megáll az izoelektromos pontban. Ez az az állapot, mikor a molekula nettó töltése 0, vagyis a proteint felépítő aminosavak ikerionos állapotba kerülnek. Mivel a fehérjék különböző pH-n érik el az izoelektromos állapotukat, a módszer alkalmas a különböző peptidtartalmú minták komponenseinek elkülönítésére. Izoelektromos fókuszálással el lehet különíteni az endogén és a rekombináns erythtropoietint, mert eltérő a glikoziláltságuk – a rekombináns EPO-t kínai hörcsög
32
ovariumából nyerik -, ez pedig befolyásolja az ikerionos forma eléréséhez szükséges pH-t. Az IEF-t csak az elválasztáshoz használják, a kimutatáshoz szükséges egy ehhez kapcsolt immunblot technika. A minta-előkészítés során először ultracentrifugálással töményítik a vizeletmintát a fehérjére nézve, majd következik az izoelektromos pont szerinti elkülönítés. Az izolálás után egy polyvinil-fluorid membránra kerülnek a fehérjék úgy, hogy az egyes EPO egységek az izoelektromos pontjuknak megfelelő helyzetet megőrizve erős hidrofób kölcsönhatásba lépnek a membránnal. Anti-EPO antitesttel kezelve a membránt „másolatot” kapunk az erythtropoietin egységek helyzetéről. Az anti-EPO specifikusan, reverzibilisen kötődik a humán és a rekombináns EPO-hoz - viszont keresztkötésekre hajlamos más fehérjékkel, amely a kiértékelést akadályozhatja -, így a mosás után már a kimutatni kívánt glikoprotein egységek maradnak a membránon. Az anti-EPO által készített „másolatokat” átjuttatják egy második membránra, amelyhez elegendő a pH eltolása savas irányba, ettől megváltozik az anti-EPO konformációja, így elektromos térben ledisszociál az első membránról. A második membránon lévő anti-EPO egységekhez szekunder antitesteket kapcsolva, majd foszfatáz vagy peroxidáz enzimekkel reagáltatva a kemolumineszcencia következtében detektálható jelet kapunk. A második membrán közbeiktatásával kiküszöbölhetők az első membránon maradt komponensek zavaró hatása, a második antitest reakcióval pedig növelhető az analitikai módszer érzékenysége.
33
Géndopping
Az orvoslás és a doppingolás terén hatalmas változást jelent(het) az emberi genomba történő beavatkozás. Még a XX. század vége felé is sokan szkeptikusan fogadták azt a futurisztikus ötletet, hogy a megfelelő genom kialakításával „gyártani” lehet a kiváló sportolókat. Szerencsére a még nem tartunk itt, de a géndopping megjelent a teljesítmény-fokozó módszerek között, így mindenképp szükséges erről szót ejteni, annál is inkább, mert a géntechnológiával való visszaélés már nemcsak orvosi vagy sport, hanem általános emberi erkölcsi törvényszegésnek tekinthető. A versenyző génállományának befolyásolásával súlyos – akár maradandó – sérülések gyógyulását vagy az anabolikus folyamatokat befolyásoló endogén anyagokat kódoló gének expressziójának fokozásával izomerő-, izomtömeg-, teljesítmény-növelést lehet elérni. A megfelelő génszekvencia szervezetbe való bejuttatása virális vagy nonvirális vektorokkal történhet. Az előbbi esetben a replikációért és a patogén proteinekért felelős géneket kicserélik a bejuttatni kívánt génekre a különböző vírusokban – például: retrovírus, adeno-asszociált vírus, Herpes simplex vírus -, míg az utóbbinál liposzómákba csomagolják vagy DNS-protein komplex formájában kerül a szervezetbe a DNS részlet. A géntechnológia ma még gyerekcipőben jár, a vektorok hatékonysága nem kielégítő, a célba juttatásuk nem megfelelő. Viszont a géndopping kimutatása is kidolgozásra vár, mivel a jelenlegi módszerek nem teszik lehetővé a vektorok detektálását. Új fejezetet nyithatnak a doppinganalitikában a génexpressziós vizsgálatok, amelyek segítségével mintázat készíthető olyan biológiai mintákból, melyekben a génmódosítás következtében megváltozott szerkezetű fehérjék találhatók.
34
Összegzés
Dolgozatomban igyekeztem átfogó képet adni a doppingvétségek sokaságáról és ezek nyomon követésének, bizonyításának lehetőségeiről illetve a jövőbeni prognosztizálható változásokról. A peptidhormonok, köztük az erythropoietin és az IGF-1 valamint a géndopping az elkövetkező világversenyek „részvevői” lesznek. Emellett nem szabad elhanyagolni a már-már „klasszikusnak” számító anabolikus androgén szteroidokat vagy a stimulánsok közé tartozó amfetamint, ephedrint sem. A nagyfokú műszerezettség a doppinganalitika fejlődését hozta magával, így gyors,
pontos
meghatározásokra
van
már
lehetőség,
mert
elég
csak
a
tömegspektrométer érzékenységére vagy a nagyhatékonyságú folyadék kromatográfia kapacitására gondolni. A korábban csak közvetve bizonyítható szerek – erythropoietin – alkalmazását ma már a műszeres analitika segítségével direkt – izoelektromos fókuszálás - tudják bizonyítani a szakemberek. Úgy tűnik, hogy mindezek következtében egyre kevesebben élnek tiltott szerekkel mind a verseny, mind a felkészülés ideje alatt.
35
Irodalom
1. Fürst Zsuzsanna: Farmakológia Medicina Könyvkiadó Rt., Budapest 2006. 2. Fonyó Attila: Élettan gyógyszrészhallgatók részére Medicina Könyvkiadó Rt., Budapest 2003. 3. Dr. Jákó Péter, Dr. Martos Éva, Dr. Pucsok József: A sportorvoslás alapjai Print City Kiadó és Nyomda Kft., Sárbogárd 1998. 4. Burger Kálmán: Az analitikai kémia alapjai/ Kémiai és műszeres elemzés Semmelweis Kiadó, Budapest 1999. 5. Furka Árpád: Szerves kémia Nemzeti Tankönyvkiadó Rt., Budapest 1998. 6. www.dshs-koeln.de/biochemie/rubriken/07_info/EPO_urin_2002.pdf 7. Noszál Béla, Kraszni Márta, Rácz Ákos, Szókán Gyula: Dopping a sportban az analitikai kémia szemszögéből. Magyar Kémiai Folyóirat – Előadások 2005, 3, 124-128 8. www.wada-ama.org/rtecontent/document/b6_2001.pdf 9. www.wada-ama.org/rtecontent/document/b4_2001.pdf 10. Laurent Rivier: Is there a place for hair analysis in doping controls? Forensic Science International 2000, 107, 309–323
36
11. M. Tsivou, N. Kioukia-Fougia, E. Lyris, Y. Aggelis, A. Fragkaki, X. Kiousi, Ph. Simitsek, H. Dimopoulou, I.-P. Leontiou, M. Stamou, M.-H. Spyridaki, C. Georgakopoulos: An overview of the doping control analysis during the Olympic Games of 2004 in Athens, Greece Analytica Chimica Acta 2006, 555, 1–13 12. Marjo Kolmonen, Antti Leinonen, Anna Pelander, Ilkka Ojanper: A general screening method for doping agents in human urine by solid phase extraction and liquid chromatography/time-of-flight mass spectrometry Analytica Chimica Acta 2007, 585, 94–102 13. Francoise Lasne, Laurent Martin, Nathalie Crepin, and Jacques de Ceaurriz: Detection of isoelectric profiles of erythropoietin in urine: differentiation of natural and administered recombinant hormones Analytical Biochemistry 2002, 311, 119–126 14. Marilyn A. Huestis, Michael L. Smith: Modern analytical technologies for the detection of drug abuse and doping Drug Discovery Today: Technologies 2006, No. 1, Vol. 3, 49-57 15. Rodny Montes de Oca Porto, Ariana Rodr´ıguez Fernandez, Dayamin Martinez Brito, Teresa Correa Vidal, Ahiram Lopez Diaz: Gas chromatography/mass spectrometry characterization of urinary metabolites of danazol after oral administration in human Journal of Chromatography B, 2006, 830, 178–183 16. World Anti-doping Agency: The world anti-doping code/The 2006 prohibited list - International standard
37
