Tanulással kapcsolatos agyterületek és agypályák vizsgálata házi csirkében (Gallus domesticus)

Semmelweis Egyetem, Doktori Iskola, Idegtudományok Doktori Program

Tanulással kapcsolatos agyterületek és agypályák vizsgálata házi csirkében (Gallus domesticus)

Mezey Szilvia

Témavezető: Dr. Csillag András, egyetemi tanár

Budapest, 2003

Rövidítések jegyzéke ................................................................................................... 4 Bevezetés ...................................................................................................................... 6 Anatómiai áttekintés .................................................................................................. 6 A madáragy és az emlősagy anatómiájának rövid összehasonlítása ...................... 6 Vitatott agyterületek azonosítása madárban........................................................... 9 A nucl. accumbens .............................................................................................. 9 A madár “prefrontális kéreg” ............................................................................ 10 Viselkedésbiológiai vonatkozások........................................................................... 10 A madarak tanulása .............................................................................................. 11 A passzív elkerüléses tanulás élettani és morfológiai alapjai............................... 12 A memória kialakulásának folyamata ............................................................... 12 A passzív elkerüléses tanulásban érintett agyterületek ..................................... 12 Az acetilkolin tanulásban betöltött szerepéről...................................................... 13 Célkitűzések............................................................................................................. 14 Muszkarinos és nikotinos acetilkolin receptorok kötéserősségének változásai házicsirke előagyában, passzív elkerüléses tanulás hatására................................ 15 Bevezetés ................................................................................................................. 15 Az acetilkolin, receptorai és kimutatásuk............................................................. 15 Az acetilkolin és receptorainak előfordulása az agyban ...................................... 17 Az acetilkolin szerepe........................................................................................... 18 A muszkarinos acetilkolin receptorok kötéserősségének változása passzív elkerüléses tanulás hatására – korábbi eredmények ............................................. 19 Eszközök és módszerek ........................................................................................... 20 Passzív elkerüléses tanulás ................................................................................... 20 Az agyak előkészítése autoradiográfiához ........................................................... 21 Receptor-autoradiográfia...................................................................................... 21 Képelemzés........................................................................................................... 22 Statisztikai elemzés .............................................................................................. 22 Eredmények ............................................................................................................. 22 Nikotinos acetilkolin receptorok kötéserőssége és annak változása passzív elkerüléses tanulás hatására.................................................................................. 23 Muszkarinos acetilkolin receptorok kötéserőssége és annak változása passzív elkerüléses tanulás hatására.................................................................................. 23 Megbeszélés............................................................................................................. 25 Összehasonlítás a korábbi eredményekkel ........................................................... 25 Az acetilkolin ill. receptorainak szerepe egyéb tanulási formákban .................... 26 Az acetilkolin szerepe a passzív elkerüléses tanulásban ...................................... 27 Adalékok a prefrontális kéreg-ekvivalens területek meghatározásához .............. 28 Striatotegmentalis neuronok hodológiai és morfológiai elemzése ........................ 30 Bevezetés ................................................................................................................. 30 Eszközök és módszerek ........................................................................................... 32 Pályakövetés ......................................................................................................... 32 Az agyak feldolgozása.......................................................................................... 33

2

Perfúzió ............................................................................................................. 33 További lépések – hodológiai vizsgálatok ........................................................ 33 A metszetek vizsgálata a hodológiai elemzéshez.............................................. 34 A sejtfeltöltés menete ........................................................................................... 34 Elektronmikroszkópia........................................................................................... 35 Eredmények ............................................................................................................. 37 Módszertani megfontolások .............................................................................. 37 Egyszeres retrográd pályajelöléses kísérletek ...................................................... 38 Striatonigralis projekciók .................................................................................. 38 Striatoventrotegmentalis projekciók ................................................................. 39 Kettős retrográd pályajelölések ............................................................................ 44 Anterográd pályajelölések .................................................................................... 44 Retrográd pályakövetés - egysejtfeltöltés............................................................. 47 Fénymikroszkópos elemzés.................................................................................. 47 Elektronmikroszkópos elemzés és posztembedding immuncitokémia ................ 48 Megbeszélés............................................................................................................. 51 Hodológiai vizsgálatok......................................................................................... 51 A jelen és korábbi eredmények összehasonlítása.............................................. 52 A nigralis és ventrotegmentalis striatalis afferensek és efferensek topográfiájának összehasonlítása ...................................................................... 54 Funkcionális összefüggések .............................................................................. 54 A középagyi dopaminerg magokba vetítő striatalis területek neurokémiai jellemzése .......................................................................................................... 55 Utalások a striatum - SN/AVT körben történő párhuzamos jelfeldolgozásra... 55 A madár nucl. accumbens elhelyezkedésének újragondolása........................... 55 Evolúciós vonatkozások.................................................................................... 56 A striatalis projekciós neuronok morfológiája ..................................................... 57 Összehasonlítás a korábbi eredményekkel........................................................ 57 A lobus parolfactorius intrinsic kapcsolatrendszere ......................................... 58 A striato-ventrotegmentalis projekciós neuronokon végződő axonterminálisok eloszlása és ultrastruktúrája ............................................................................. 59 Sejttestek közötti közvetlen kapcsolat .............................................................. 59 Funkcionális következtetések............................................................................ 60 Következtetések ......................................................................................................... 62 Köszönetnyilvánítás .................................................................................................. 63 Összefoglalás .............................................................................................................. 64 Abstract ...................................................................................................................... 65 Irodalomjegyzék ........................................................................................................ 66 Saját közlemények jegyzéke ..................................................................................... 83 Cikkek................................................................................................................... 83 Kivonatok ............................................................................................................. 83

3

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE A – archistriatum;

FPL

Ac – nucl. accumbens;

lateralis;

ACh – acetilkolin;

GABA – γ-aminobutiric acid;

AChR – acetilkolin receptor;

GCt – subst. grisea centralis;

AL – ansa lenticularis;

G-fehérje – GTP-asszociált fehérje;

AVT – area ventralis tegmentalis;

Glu – glutamát;

Bas – nucl. Basalis;

GLv – nucl. geniculatus lateralis, pars

BDA – biotinilált dextrán amin (10K);

ventralis;

BGL – basalis ganglionok;

4OH-GTS – 3-(4-hydroxy,2-

αBgT – α-bungarotoxin;

methoxybenzylidene) anabaseine;

BgT – [3H]-α-bungarotoxin

GTS-21 – 3-(2-methoxybenzylidene)

BNST – a stria terminalis bed nucleusa;

anabaseine;

CA – commissura anterior;

HA – hyperstriatum accessorium;

CO – chiasma opticum;

HCl – hidrogén-klorid (sósav);

DA – dopamin;

HD – hyperstriatum dorsale;

DAB – 3,3'-diamino-benzidin;

HP – hippocampus;

DAR – dorsalis archistriatum;

HV – hyperstriatum ventrale;

DLP – nucl. dorsolateralis posterior

IMHV

thalami;

hyperstriatum ventrale;

DMA – nucl. dorsomedialis anterior

INP – nucl. intrapeduncularis;

thalami;

LMD – lamina medullaris dorsalis;

DAR – dorsalis archistriatum;

LNEO – lateralis neostriatum;

DYN – dynorphin;

LPO – lobus parolfactorius;

E – ectostriatum;

LTP – long term potentiation;

ENK – enkephalin;

LY – Lucifer Yellow;

EPSP

–

serkentő

–

fasciculus

–

intermedier

prosencephali

és

medialis

MeA – metilantranilát;

posztszinaptikus

potenciál;

mAChR – muszkarinos acetilkolin

FB – Fast Blue;

receptor;

FG – fluorogold;

MNEO – medialis neostriatum;

4

MNH

–

medialis

neostriatum

/

SP – substance-P;

hyperstriatum ventrale;

SPf – substance-P mező;

N – neostriatum;

SV2 – szinaptikus vezikula fehérje 2;

nAChR

–

nikotinos

acetilkolin

TeO – tectum opticum;

receptor; NCAM

TH – tirozin-hidroxiláz; –

neural

cell

adhesion

Thal – thalamus;

molecule;

TO – tuberculum olfactorium;

NCLd – neostriatum caudolaterale, pars

TPc

dorsalis;

pontinus, pars compacta;

NgCAM – neural-glial cell adhesion

TrO – tractus opticus;

molecule;

TSM – tractus septomesencephalicus;

NMDA – N-metil D-aszpartát;

QNB – [3H]-quinuclidinil-benzilát;

NO – nitrogén-monoxid;

VAR – ventralis archistriatum;

OPT – a basalis opticus pálya magja;

VL – ventriculus lateralis.

OT – tectum opticum; PA – paleostriatum augmentatum; PB – foszfát puffer; PBS – foszfát puffer és sóoldat; PFC – prefrontális kéreg; PLTd – posterolateralis telencephalon, pars dorsalis; PLTv – posterolateralis telencephalon, pars ventralis; PP – paleostriatum primitivum; PVT – paleostriatum ventrale; RM

–

(red

microspheres)

vörös

mikrogyöngyök; S – septum; SN – substantia nigra; SNr – substantia nigra, pars reticularis; SNc – substantia nigra, pars compacta; SNl – substantia nigra, pars lateralis;

5

–

nucl.

tegmenti

pedunculo-

BEVEZETÉS

ANATÓMIAI ÁTTEKINTÉS

A madáragy és az emlősagy anatómiájának rövid összehasonlítása A madár- és az emlősagy felépítésének párhuzamba állítását az eddigiekben sokban gátolta a madaraknál használt elavult nevezéktan, mely sokszor még a XX. század eleji felfogásokat tükrözte (pl. azt, hogy a madáragy „felfújt” striatumból áll). Ezért egy madár nomenclatura fórum 2002-ben „modernizálta” a madáragy atlasz elnevezéseit. A következőkben ezeket az új neveket is figyelembe véve ismertetném a madáragy anatómiájának főbb vonatkozásait. A dolgozat további részében azonban részben ragaszkodtam a hagyományos elnevezésekhez. A madár- és az emlősagy között a legjelentősebb különbség az, hogy a madarak előagyában nem található meg az emlősagyban meglévő, rétegesen szerveződött kéreg, hanem viszonylag jól körülhatárolt magok alkotják. Ennek következtében az emlős és madár agyterületek párhuzamba állítása meglehetősen bonyolult feladat. Ezért is volt sokáig széleskörűen elfogadott az a téves elképzelés, hogy a madár telencephalont főként striatalis területek alkotják. Innen ered a madár előagyi struktúrák nagy részének striatumhoz kötött elnevezése (pl. neostriatum, ectostriatum). A mai felfogás szerint azonban ezen agyrégióknak csak egy része striatalis vagy pallidalis terület (pl. paleostriatum augmentatum (PA) – új nevén: lateralis striatum; paleostriatum primitivum (PP) – új nevén: globus pallidus; paleostriatum ventrale (PV) – új nevén: ventralis pallidum), más részük tulajdonképpen pallialis struktúra, melyek funkciójuk alapján kéreg-ekvivalens területek, kapcsolatrendszerük alapján pedig akár az emlős agykéreg adott rétegeinek is megfeleltethetők (pl. hyperstriatum dorsale – új nevén: hyperpallium densocellulare ≈ elsődleges látókéreg, II-III. réteg; hyperstriatum accessorium – új nevén: hyperpallium accessorium ≈ másodlagos látókéreg, V-VI. réteg) (104). A basalis ganglionok a madáragyban csakúgy, mint az emlősöknél, dorsalis és

6

Bevezetés

ventralis striatumra és pallidumra oszthatók. Az emlős striatalis komplex megfelelője a madárban a lobus parolfactorius (LPO – új nevén: medialis striatum), ami a striatum dorsomedialis részét alkotja, a nucl. accumbens (Ac), a tuberculum olfactorium (TO) és a stria terminalis bed nucleusa (BNST), melyek a ventromedialis striatum részei, valamint a PA, mely a lateralis striatumot adja. A madáragyban nem elkülöníthetők az emlős nucl. caudatusnak és putamennek megfelelő területek. A PP és a PV alkotják a madarak dorsalis ill. ventralis pallidumát. (1. ábra) A madár thalamus magjainak párhuzamba állítása az emlős thalamicus magokkal még 1. ábra A basalis ganglionok A 11.8

(kékkel jelölve), valamint az egyik prefrontális kéreg ekvivalensként felmerülő neostriatum

terület, /

a

medialis

hyperstriatum

ventrale (MNH; zölddel jelölve) elhelyezkedése a madáragyban az A 11.8, A 9.4 és az A 8.8 síkban (85). (ld. Rövidítések jegyzéke) A 9.4

A 8.8

7

Bevezetés

szintén nincs lezárva. A madár diencephalon rostromedialis határát alkotó dorsalis thalamicus zóna a dorsomedialis anterior (DMA) és posterior, a dorsolateralis anterior (csak a medialis területe, ez ui. döntően vizuális mag) és posterior (DLP) magokból, a dorsointermedialis posterior magból, valamint a lateralis subhabenularis magból áll és feltehetően az emlős intralaminaris, középvonali és mediodorsalis magkomplexum megfelelője (124, 170, 172) (2. ábra). A középagyban szintén nem egyértelmű a madár és az emlős agyterületek megfeleltetése. Így nem található pl. Kuenzel és Masson csirke atlaszában (84) a tág értelemben vett basalis ganglionokhoz tartozó substantia nigra (SN) helyett a nucl.

2. ábra A dorsalis thalamicus zónát

A 6.4

alkotó

magok

(rózs-

aszínnel jelölve), valamint az egyik

prefrontális

ekvivalensként terület,

a

kéreg felmerülő

caudolateralis

neostriatum dorsalis részének (NCLd;

zölddel

jelölve)

elhelyezkedése a madáragyban az A 6.4 és az A 5.2 síkban (85). (ld. Rövidítések jegyzéke)

A 5.8

8

Bevezetés

3. ábra A TPc (SN) és az AVT A 3.4

elhelyezkedése

a

mesen-

cephalicus tegmentumban, az A 3.4-es síkban (sárgával jelölve) (85). (ld. Rövidítések jegyzéke)

pedunculopontinus, pars compacta (TPc) van feltüntetve. Újabb felfogás szerint azonban a TPc valójában nem az emlős nucl. pedunculopontinusnak, hanem a SN-nak (A9

dopaminerg

magcsoport)

felel

meg

(122).

Az

emlősök

nucl.

pedunculopontinusanak feltételezhető madár megfelelője egy, az 1. rhombomera tegmentumaban található kolinerg sejtekből álló terület, mely egy része a Kuenzel és Hodos atlaszban (1988) nucl. profundus mesencephali, pars ventralisként van megjelölve (101). Szintén a kibővített basalis ganglionokhoz tartozik még az area ventralis tegmentalis (AVT), mely az emlős A10-es dopaminerg magcsoport megfelelője a madárban (122). (3. ábra) Vitatott agyterületek azonosítása madárban A nucl. accumbens Az Ac a használatban lévő csirkeagy atlasz szerint a ventriculus lateralis (VL) ventralis csücskénél elhelyezkedő, félkör alakú terület. Caudalisan a commissura anterior síkjától pár milliméterrel rostralisabban terjed és a VL medialis irányú íve által alkotott mélyedésben fekszik (84). Az Ac lokalizációja azonban napjainkban megkérdőjeleződött, mivel - főleg a caudalis síkokban - nem egyezik meg az emlős Ac neurokémiai és sejtmorfológiai jellemzőivel (11, 13, 124, 127, 126), sokkal inkább ráillik a BNST lateralis részének leírása (11). A medialis striatum (LPO) ventromedialis határánál, közvetlenül a VL ventralis

9

Bevezetés

csücske mellett található egy eddig el nem különített terület, mely neurokémiailag hasonlít az emlős Ac-re, mivel az ott található tüskés projekciós neuronokban a substance-P (SP) és az enkephalin (ENK) együttesen is előfordul. Nem ismertek azonban a terület hodológiai kapcsolatai. Emlősökben az Ac reciprok kapcsolatban áll az AVT-vel, míg a ventralis striatum szomszédos területei inkább a SN-val állnak kapcsolatban. Az AVT-be érkező afferentációk kiindulási területeinek feltérképezése a madár striatumban segítené az Ac helyzetének pontosabb meghatározását. A madár “prefrontális kéreg” Az emlős prefrontális kéreg (PFC) szerepe a szervezetet érő külső ingerek, valamint a test belső állapotáról szóló információk összegzése és ezek alapján az adott szituációnak megfelelő viselkedés kiválasztása a fennálló lehetőségek közül. A környezeti változókra adott válaszok alapján a PFC értékeli a viselkedés eredményét és ennek megfelelően megtervezi és végrehajtatja az esetleges újabb lépéseket. Mivel a madarak „intelligenciája” az emlősökével vetekszik, feltételezhető, hogy rendelkeznek olyan agyterülettel, amely az emlős PFC feladatait látja el. Ezt a területet a madáragyban eddig azonban még nem sikerült kétséget kizáróan azonosítani. Kapcsolatrendszere, neurotranszmitter tartalma és - léziós kísérletekkel vizsgált funkciója alapján két agyterületről feltételezhető, hogy madárban a PFC-nek megfelelő terület: a mediorostralis neostriatum / hyperstriatum ventrale területe (MNH) (1. ábra – A 11.8 sík) (106), vagy a caudolateralis neostriatum dorsalis része (NCLd, vagy posterolateralis telencephalon, pars dorsalis, PLTd) (45, 58, 115, 123, 130, 175) (2. ábra). Egyik agyterület sem felel meg azonban teljes mértékben az emlős PFC minden ismérvének (afferentáció a dorsomedialis thalamusból és az elsődleges érzőkérgekből, dopaminerg beidegzés a mesencephalicus ventralis tegmentumból, valamint magas dopamin (DA) / noradrenalin arány), ezért feltételezhető, hogy a madár PFC nem homológja, hanem funkcionális analógja az emlős PFC-nek.

VISELKEDÉSBIOLÓGIAI VONATKOZÁSOK

10

Bevezetés

A madarak tanulása A tanulás kapcsán a házi csirkék agyának vizsgálata számos előnnyel bír az emlősök agyának vizsgálatával szemben. Fészekhagyó madár lévén, a frissen kikelt csirke már percekkel a tojásból való kibújás után mutatja a felnőtt madárra jellemző mozgás- és viselkedésformák döntő többségét. Így a naposcsibe agya fejlett, ugyanakkor a fiatal állatokra jellemzően még rendkívül képlékeny, benne a különböző külső hatások jelentős változásokat okoznak. Továbbá, miután a csirkék a tojásban a külvilágtól viszonylag elzárva fejlődnek és röviddel kikelésük után már elég önállóak a tanuláshoz, minimális környezeti behatás éri őket a vizsgálat előtt. A madarak tanulásának két legvizsgáltabb paradigmája a bevésődés (imprinting) és a passzív elkerüléses tanulás. A bevésődés jelenségét Spalding írta le először 1873-ban (156). Egyik legismertebb formája a szülői bevésődés, mely során a fiatal állatok a születésük utáni korai időszakban megtanulják felismerni szüleiket. A szülői bevésődés legkönnyebben egy meglehetősen rövid érzékeny időszak, a kritikus periódus alatt megy végbe, ennek leteltével az állat bevésődéssel már kevésbé, inkább más tanulási formák segítségével (pl. asszociációs tanulással) képes megtanulni a szülők és a fajtársak jellegzetességeit. A bevésődés gyors tanulási forma, mely során az emléknyom hosszú távra rögzül és csak nehezen törölhető ki. A tanulás és a memória rögzülésének és előhívásának folyamata, valamint az ezekkel kapcsolatos változások kutatásának laboratóriumunkban használt modellje a házi csirke passzív elkerüléses tanulása, melyet Cherkin dolgozott ki (28). E tanulási forma lényege az, hogy a madár egy kellemetlen ízű anyagba mártott tárgy egyetlen megcsípése után a tárgy vizuális jellemzőit megjegyzi, azokat társítja a rossz ízzel és a tárgyat a továbbiakban elkerüli. A passzív elkerüléses tanulás előnye, hogy gyors, könnyen reprodukálható és az állatok nagy részét érinti (∼ 80%). A passzív elkerüléses tanulás alapját egy természetes viselkedési forma adja, mely során a naposcsibék - bár az első egy-két napban még a szikből is képesek táplálkozni kikelésük után azonnal elkezdenek táplálék után kutatni és környezetükben megcsipkedik és megkóstolják a különböző tárgyakat. Ugyanekkor azt is megtanulják, hogy mely dolgok ehetők és melyek nem. A bevésődéshez hasonlóan, a passzív elkerüléses tanulás esetében is létezik egy 2-7 napig tartó kritikus periódus, amikor az

11

Bevezetés

állatok könnyebben tanulnak, mivel ekkor még kísérleteznek és aktívan megcsipkedik a környezetükben lévő tárgyakat. Ennek a fogékony időszaknak az elteltével az új dolgoktól már inkább félnek és csak a táplálékra csípnek rá, egyéb tárgyakra kevésbé. A passzív elkerüléses tanulás élettani és morfológiai alapjai A memória kialakulásának folyamata A passzív elkerüléses tanulás során a memória kialakulásának folyamata időben három, különböző élettani, biokémiai és morfológiai változásokból álló szakaszra bontható (áttekintő irodalom: 137). A rövid távú memória a tanulási folyamat beindulását követő 5 - 10 percen keresztül tárolja az információt és többek között emelkedett glutamát (Glu) transzmisszió (35), NMDA receptor kötéserősség növekedés (157), a GABA transzmisszió csökkenése (31), Ca++-beáramlás (140), retrográd szinaptikus átvitel (NO) (64) és emelkedett plazma kortikoszteronszint (142, 143) jellemzik. A közép távú memória kialakulása során a tanulást követő 15 - 55 perces időtartam alatt beindul azon gének aktivációja (c-fos, c-jun) (9), melyek géntermékei (de novo képződött fehérjék) (49) elindítják a hosszú távú memória során bekövetkező fehérjeszintézis második hullámát (pl. NCAM és NgCAM szintézis) (50, 113, 145, 146), amely a továbbiakban alapját képezi a különböző morfológiai változások kialakulásának (növekszik a szinapszisok sűrűsége és mérete) (138, 160), melyek feltehetően a memórianyomok hosszabb ideig való tárolásának morfológiai alapját adják. A passzív elkerüléses tanulásban érintett agyterületek Az előbb említett élettani, biokémiai és morfológiai változások nemcsak időben, hanem térben is jól behatárolhatóak és arra mutatnak, hogy a passzív elkerüléses tanulás során a memória kialakulásában leginkább két előagyi régió, a pallialis eredetű, szenzoros integrációs feladatokat ellátó intermedier és medialis hyperstriatum ventrale (IMHV) és a motoros szabályozásban és limbikus működésekben is résztvevő LPO érintett. A két agyfélteke nem egyformán vesz részt a memória rögzítésében. A rövidtávú memória kialakulásának feltétele a baloldali IMHV funkcionalitása. A középtávú

12

Bevezetés

memória rögzítésében mind a bal, mind a jobb oldali IMHV részt vesz, míg a hosszútávú memória kialakulásához a bal IMHV-nak és mindkét oldali LPO-nak működőképesnek kell lennie (54, 120; áttekintő irodalom: 53, 66). A memória kialakulása során mutatkozó különbségek a két félteke régiói között valószínűleg a két oldal eltérő funkcionalitásának tudhatók be. Ismert, hogy bal szemével (jobb agyfélteke) a madár az adott tárgynak a környezetben elfoglalt helyzetét, míg jobb szemével (bal félteke) a tárgy topográfiai jellemzőit, így annak vizuális (és az ehhez kapcsolható ízbeli) jellemzőit figyeli meg (53). Ezért várható tehát, hogy a passzív elkerüléses tanulás során a szenzoros integrációt végző bal IMHV aktívabban vesz részt a tanulásban és a memória tárolásában, mint a jobb. Az LPO esetében azonban, mely inkább a motoros és limbikus funkciókban érintett, mindkét oldal egyaránt aktiválódik a tanulás során. Az acetilkolin tanulásban betöltött szerepéről A kolinerg rendszerek szerepének felismerére a kognitív funkciókban abból a tapasztalatból származik, hogy kolinerg antagonisták adagolása ill. kolinerg magok léziója a kognitív funkciók hasonló csökkenéséhez vezet, mint ami az öregedés ill. a dementia során megfigyelhető. Az acetilkolin (ACh) szabályzó neurotranszmitter, tehát hatása nem specifikus, hanem a neuronok alap aktivitásának befolyásolásával hat azok működésére (187). Feltételezhető, hogy nem közvetlenül, hanem inkább közvetetten, egyéb, a tanulásban és a memóriában érintett neurotranszmitterek (pl. Glu, DA) ürülésének szabályozásán keresztül vesz részt a tanulási és memória folyamatokban. Ezen szabályozó hatását az ACh különböző receptorain keresztül eltérő módon fejti ki, de általános tendenciaként elmondható, hogy serkenti a figyelemmel és tanulással kapcsolatos folyamatokat (áttekintő irodalom: 14).

13

Bevezetés

CÉLKITŰZÉSEK Jelen dolgozat témája a madarak, közelebbről a házi csirke (Gallus domesticus) azon agyrégióinak és agypályáinak vizsgálata, mely területek részt vesznek a madarak fiatal kori tanulási folyamataiban. E célból a következő kísérleteket ill. vizsgálatokat kívántuk elvégezni:

Az acetilkolin passzív elhárításos tanulás során játszott szerepének feltárása receptorai (kiemelten a muszkarinos és az α-bungarotoxin-érzékeny kolinerg receptorok) kötéserősség-változásainak vizsgálatán keresztül.

A madár medialis striatum finomabb felosztása a mesencephalicus tegmentumba projiciáló pályák retrográd követése alapján.

A madár nucl. accumbens pontosabb lokalizációja az area ventralis tegmentalisszal fennálló ismert reciprok kapcsolat alapján.

Az area ventralis tegmentalisba projiciáló medialis striatalis sejtek fény- és elektronmikroszkópos struktúrájának és kapcsolatrendszerének feltárása.

A prefrontális kéreg ekvivalens területek pontosabb lokalizációja madárban.

14

MUSZKARINOS ÉS NIKOTINOS ACETILKOLIN RECEPTOROK KÖTÉSERŐSSÉGÉNEK VÁLTOZÁSAI HÁZICSIRKE ELŐAGYÁBAN, PASSZÍV ELKERÜLÉSES TANULÁS HATÁSÁRA

BEVEZETÉS

Az acetilkolin, receptorai és kimutatásuk Az acetilkolin kémiai szerkezete a 4. ábrán látható. A neuronokban

kolinból

és

acetil-koenzim

A-ból

szintetizálódik. A szinaptikus résbe kijutva az ACh a kolinészteráz

enzim

hatására

lebomlik.

A

kolin

visszadiffundál az idegsejtbe, ahol újra felhasználódhat.

4.

ábra

Az

acetilkolin

kémiai szerkezete

Miután a kolinészteráz az ACh-t rendkívül gyorsan lebontja, az ACh közvetlen kimutatása viszonylag nehéz. Helyette rendszerint az ACh szintézisében (kolin-acetil-transzferáz), sejten belüli transzportjában (vezikuláris transzporterek), lebontásában (kolinészteráz), vagy a sejtbe történő újrafelvételében (membrán transzporterek) szereplő enzimek kimutatását végzik. Az ACh kétféle receptoron keresztül fejti ki hatását. A nikotinos (nAChR) és a muszkarinos (mAChR) ACh receptorok nevüket rájuk szelektíven ható agonistáikról, a nikotinról és a muszkarinról kapták. Az agyban található nAChR-ok 5 alegységből (α2-α6, α10 és β2-β4, ill. α7-α9 alegységek hetero-, ill. homo-oligomer variációi) álló Na+-csatornák melyek aktiválódásakor a Na+ a koncentráció grádiensnek megfelelően beáramlik a sejtbe (189). Az egyes alegységek 4-4 transzmembrán fehérjéből (M1-M4) épülnek fel (5. A ábra). Az ACh és antagonistáinak kötőhelyei az

α - γ és α - δ alegységek érintkezési

pontjainál találhatók. Az α alegységeken található még a kígyók Bungarus genusának venomjából kivonható α-bungarotoxin (αBgT) kötőhelye, mely az ACh kompetitív agonistájaként nyitott állapotban blokkolja a receptorokat. A jelen vizsgálatban elemzett

15

Muszkarinos és nikotinos acetilkolin receptorok kötéserősségének változásai

αBgT-érzékeny nAChR az α7 alegység homopentamerje és a nikotint alacsony affinitással köti meg (30, 44). A mAChR-ok olyan G-fehérjével kapcsolt receptorok, melyek egyetlen, 7 transzmembrán hélixből felépülő alegységből állnak (5. B ábra). Patkányban 5 gén (m1 - m5) 4 farmakológiailag különböző mAChR-t kódol (M1 – M4) (185). A mAChR-ok hatása lassabban alakul ki, mint a nAChR-oknak. Az M1, M3 és M5 típusú receptorok Gq fehérjével kötődnek és foszfolipáz-C aktivációján keresztül emelik az intracelluláris Ca++-koncentrációt, ami kinyitja a Ca++-érzékeny K+ & Na+-csatornákat és így EPSP-t vált ki. Az M1 mAChR-ok szelektíven serkentik az NMDA típusú Glu receptorokat, így valószínűleg jelentős szerepük van a corticostriatalis szinapszisoknál az LTP kialakulásában és ebből következően a tanulásban. Az M2 és M4 típusú receptorok Gi fehérjékkel kötődnek és az adenilát-cikláz aktivitásának csökkentése révén, vagy a Go

B

A

NH2 ligandkötő helyek

COO

M1

M4

EC

NH2

IC

I

VII

COO

G-fehérje kötőhelyek 5. ábra A A nAChR egy alegységének vázlatos felépítése. A négy transzmembrán hélix (M1-M4) közül az M1-hez kötött amino-terminális és az M4-hez kapcsolódó karboxi-terminális extracellulárisan (EC) található. A két ligandkötő hely az amino-terminális végen helyezkedik el. B A mAChR vázlatos felépítése. A receptor 7 transzmembrán doménből áll (I.-VII.). A G-fehérje kötő helyek intracellulárisan, az V. és VI. transzmembrán hélix közötti aminosav láncon találhatók.

16


ill. Gi fehérjéken keresztül inaktiválják a Ca++/K+ csatornákat, így csökkentik a Ca++áramot és ezzel a neurotranszmitter kiáramlást (26). A mAChR-ok szelektív kompetitív agonistája a harci gázként is számontartott 3-quinuclidinyl benzilát, mely az ACh-t leszorítja a receptor kötőhelyeiről, ezzel blokkolva a kolinerg hatásokat. A receptorok kötéserősségének vizsgálatára használatos egyik legelterjedtebb módszer a receptor-autoradiográfia (168). Ennek során a receptorokhoz olyan ligandokat kötnek, melyek enyhén radioaktív [H3]-mal, vagy [I125]-dal vannak konjugálva. Az így jelölt receptorok elhelyezkedését és arányát azután a sugárzás hatására

exponálódó

trícium-érzékeny

filmen

lehet

megjeleníteni.

A

film

exponálódásának mértékéből megállapítható és számszerűsíthető a radioaktív ligandot kötött receptorok sűrűsége. Az autoradiográfia nem a receptorok számára utal egy adott régióban, hanem az aktív, ligand kötésére képes receptorok mennyiségét jelzi. A sok, liganddal jelölt receptort tartalmazó területek felett a film erősebben exponálódik és sötétebb lesz, mint a kevesebb ligandot megkötött területeknél. Az acetilkolin és receptorainak előfordulása az agyban Az ACh a szervezetben mind a perifériás, mind a központi idegrendszerben megtalálható. Madárban számos kolinerg (kolin-acetil-transzferáz tartalmú) neuron található a diencephalonban és a mesencephalonban pl. a medialis habenulában (efferentáció a nucl. interpeduncularisba), a nucl. spiriformis medialisban, a nucl. mesencephalicus

profundusban,

a

tectum

opticumban,

a

nucl.

isthmi

pars

parvicellularisban, a nucl. semilunarisban és az oculomotoros, trochlearis és trigeminalis motoros magokban (154). Ezek szinte az egész agyat beidegzik kolinerg terminálisokkal. Az előagyban kolinerg neuronok a medialis septumban és a nucl. basalisban (madárban nem azonos az emlős nucl. basalisszal, az új nevezéktan szerint nucl. basorostralis) találhatók és a kéregbe (madárban a kéreg-ekvivalens területekbe) és

a

hippocampusba

(HP)

projiciálnak.

Kolinerg

interneuronok

legnagyobb

mennyiségben a striatumban találhatók (189). A mAChR és nAChR eloszlása alapján madárban az egész előagy kap kolinerg beidegzést. Kolinerg receptorok legsűrűbben a dorsalis archistriatumban, valamint a PA-ban és az LPO-ban fordulnak elő (39, 155). A mAChR-ok közül madárban eddig az M1 és az M2 eloszlását írták le. M1 mAChR-ok a telencephalonban legnagyobb

17


mennyiségben az archistriatumban, a neostriatumban, az LPO-ban, az Ac-ben és a paleostriatumban találhatók, míg az M2 típusú receptorok sűrűsége a nucl. basalisban a legnagyobb (78). Az M2 mAChR-ok pre- és posztszinaptikusan is előfordulnak, míg az M1 mAChR-ok legfőképpen posztszinaptikusan helyezkednek el. A nAChR-ok esetében a két legelterjedtebb alegység kombináció az α4β2 és az α7 (147, 174). A nAChR-ok pre- és posztszinaptikusan is előfordulnak, míg az αBgT-ra érzékeny nAChR-ok pre-, poszt- és extraszinaptikusan is megtalálhatók (45, 169). A striatumban található ACh egyrészt a kolinerg striatalis interneuronokból, másrészt az emlős nucl. tegmenti pedunculopontinusnak megfelelő magból vetítő gyenge pályából származik. A kolinerg striatalis interneuronok viszonylag nagy (20-50 μm), dendrittüskékkel nem rendelkező idegsejtek, melyek a striatum neuronjainak kb. 1-2%át teszik ki. Axon- és dendritfájuk kiterjedt területekről integrálja az információt és szintén kiterjedt területekre továbbítja azt. Beidegzésük főként glutamáterg, serkentő input a kéregből és a thalamusból, valamint kevésbé jelentős dopaminerg beidegzés a SN-ból és az AVT-ből, valamint GABAerg és SP-tartalmú afferentáció a projekciós neuronok axonkollaterálisaiból. A kolinerg striatalis interneuronok axonjai a striatalis projekciós neuronok dendrittüskéin, dendritjein és sejttestjén végződnek, melyekkel szimmetrikus szinapszisokat képeznek. Mivel a kéregből jövő glutamaterg terminálisok nagyrészt a projekciós neuronok dendrittüskéinek fején szinaptizálnak, a kolinerg szinapszisok így a projekciós neuronok aktivitásának változtatásával képesek befolyásolni a kéregből jövő glutamaterg transzmisszió által kiváltott posztszinaptikus potenciálokat. A kolinerg interneuronok számos axonvaricositassal is rendelkeznek, ezért feltételezhető, hogy a kolinerg hatás nem csak transzszinaptikusan, hanem paracrin módon is közvetítődik (áttekintő irodalom: 26). Az acetilkolin szerepe Az ACh részt vesz az éberség és a REM alvási fázis szabályozásában (a nucl. pedunculopontinus kolinerg projekciói révén a formatio reticularisba és a thalamusba), a szelektív figyelem kialakításában (a basalis előagy kérgi és thalamicus kolinerg projekciói révén), valamint a mozgási (a striatalis interneurokon keresztül) és a tanulási folyamatokban az agyban (121). Hasselmo és Bower (1993) a szaglókéregben végzett vizsgálatok alapján feltételezik, hogy a tanulás során az ACh preszinaptikus szerepe az

18


előagyban kettős: szelektíven elnyomja a lokális szinaptikus átvitelt, míg az afferens pályák szinapszisaira nincs hatással. Ennek következtében a memória rögzülése során a lokális kapcsolatok gátlása megakadályozza, hogy az afferens pályákon érkező új információ interferáljon a korábban tárolt memória nyomokkal. Az ACh szintjének csökkenése ezzel ellenkező hatást ér el, amely viszont a memória előhívásának kedvez. Az ACh a kéregben szabályozza a piramissejtek érzékenységét a szenzoros stimulusokra (187). A kolinerg interneuronok a striatumban a kéregből jövő glutamaterg afferentáció hatására tonikusan tüzelnek, de egy kondicionáló stimulus váratlan fellépése esetén elhallgatnak (189). Általánosságban elmondható, hogy az ACh elősegíti az adott pillanatban a viselkedés szempontjából fontos stimulusok feldolgozását (187). Az ACh közvetetten is befolyásolja a tanulást és egyéb, viselkedéssel kapcsolatos folyamatokat. Számos neurotranszmitterről ismert, hogy az ACh hatással van az axonterminálisokból történő felszabadulásukra. Így pl. preszinaptikus M2 mAChRokon keresztül az ACh nem csak a saját, hanem a Glu és a GABA transzmisszióját is csökkenti a striatumban (163), aminek révén gátolja a corticostriatalis LTP kialakulását. Posztszinaptikus M1 mAChR-okon keresztül viszont az ACh az NMDA receptorok aktivációjával elősegíti az LTP kialakulását. Az LTP-re kifejtett hatásán keresztül az ACh képes lehet a memória tárolásának szabályozására (áttekintő irodalom: 26). Az ACh a preszinaptikus nAChR-okon keresztül serkenti egyéb neurotranszmitterek, pl. a Glu és a DA ürülését (3, 55, 70, 100, 179, 189). Hasonló

módon,

az

ACh

felszabadulására

is

hatással

vannak

egyéb

neurotranszmitterek. Legkutatottabb ezek közül a DA, mely a striatumban kétféleképpen is hathat az ACh-ra: D1 DA receptorokon keresztül növeli az ACh felszabadulást, míg D2 receptorokon keresztül hatva csökkenti azt (1, 37, 161). A muszkarinos acetilkolin receptorok kötéserősségének változása passzív elkerüléses tanulás hatására – korábbi eredmények A mAChR kötéserősségének emelkedését figyelte meg Rose (1980) csirke előagy homogenizátumban, 30 perccel a passzív elkerüléses tanulás után. Tíz perccel és 3 órával az elkerüléses tanulás után a mAChR kötéserőssége nem mutatott változást. A jelen vizsgálat kibővíti az acetilkolin receptoroknak a passzív elkerüléses tanulásban

19


betöltött szerepéről Rose által leírt eredményeket azzal, hogy nem csak a muszkarinos, hanem a nikotinos AChR-ok kötéserősségét is vizsgálja. A homogenizátumok elemzésével szemben, az általunk alkalmazott receptor-autoradiográfia lehetővé teszi a receptorok kötéserősségének nagyobb feloldású mérését, mivel a bekövetkező változások az egyes agyterületekben külön-külön elemezhetők.

ESZKÖZÖK ÉS MÓDSZEREK

Passzív elkerüléses tanulás Összesen 31, egy napos, szexálatlan Hunnia hybrid csibét használtunk a kísérlethez. A passzív elhárításos tanulás tréningjét Stewart (1991) leírása alapján végeztük. Az állatokat párosával, ill. hármasával egymás mellé állított farekeszekbe helyeztük. Egy óra szoktatási idő után kezdtük az előtréninget, mely során az összes csibének vízbe mártott apró fémgömböt nyújtottunk be a rekeszbe, amit a csibék rendszerint megcsíptek. Ezt még kétszer megismételtük és csak azok az állatok vettek részt a kísérlet további részében, amelyek legalább két alkalommal rácsíptek a gömbre. Az előtréning alkalmat ad arra, hogy kiszűrjük azokat az egyedeket, amelyek nem akarnak, vagy nem tudnak rácsípni a gyöngyre, mivel a kísérlet későbbi részében fontos elkülöníteni a "tanult" és a kevéssé motivált, vagy beteg madarakat. A tréning során a kontroll csoport állatai (n = 16) ismét vízbe mártott gömböt kaptak, míg a "tanított" csoport (MeA-csoport) állatainak (n = 15) hasonló színű és méretű, azonban cc. metilantranilátba (MeA) mártott gömböt nyújtottunk be. Mindkét csoport állatai rácsíptek a gömbre. A MeA-csoport állatai a keserű anyaggal bevont gömb megcsípése után undor reakciót mutattak, vagyis becsukták a szemüket és fejüket rázva elhátráltak a gyöngytől. A kontroll csoport állatai nem mutattak undorreakciót a gömb megcsípése után. Harminc perccel a tanítás után végeztük a tanulás tesztjét, amely során mindkét csoport állatainak vízbe mártott gömböt nyújtottunk be. A kontroll csoport állatai ismételten megcsípték a gyöngyöt, míg a MeA-csoportban az összes állat elkerülte azt, egyes madarak még az undor reakciót is mutatták.

20


Ebben a tanulási paradigmában tehát azok az állatok tanultak, amelyek emlékeznek rá, hogy a gyöngy rossz ízű és passzívan elkerülik, vagyis nem csípnek rá. (Ismert az elhárításos tanulásnak aktív formája is, mely során az állatnak aktívan el kell kerülnie a kellemetlen ingert, pl. elfutni az áramütés elől.) Az agyak előkészítése autoradiográfiához A teszt után 5 percen belül az állatokat dekapitáltuk. Az agyakat 1 percen belül eltávolítottuk, izopentán / CO2 keverékben lefagyasztottuk, majd további felhasználásig -25°C-on tároltuk. Az agyakból kriosztáton (Leica) 10 μm vastag koronális metszeteket vágtunk, két síkban. Az egyik sík az LPO-t és a HV-t, a másik az archistriatumot, a HVt és a thalamust tartalmazta. Mindkét síkból összesen 12 metszetet vágtunk, 3-3 metszetet a muszkarinos ill. a nikotinos receptorok kötéserősségének vizsgálatához és 3-at a nem specifikus jelölés ellenőrzésére. A metszeteket poly-L-lizinnel fedett tárgylemezre tettük, szabad levegőn megszárítottuk és további feldolgozásig -25°C-on tároltuk. Receptor-autoradiográfia A metszeteket szobahőmérsékleten 30 percig előinkubáltuk 50 mmol/l koncentrációjú Tris-HCl puffer (pH 7.4) és BSA (1 mg/ml) elegyében. A mAChR-kat [3H]-QNB-vel (QNB; 1 nmol/l, 49 Ci/mmol), a nAChR-kat pedig [3H]-α-bungarotoxinnal (BgT; 0.5 nmol/l, 77 Ci/mmol) jelöltük. A QNB-vel kapcsolatos lépéseket sötétkamrában végeztük. A nem specifikus kötődés megállapításához a metszeteket a mAChR-ok esetében atropin-szulfátban (1 μmol/l), a nAChR-ok esetében pedig hideg BgT-ban (1 μmol/l) inkubáltuk. A metszeteket 1 órán keresztül inkubáltunk 26°C-on, majd 0°C-os foszfát pufferes sóoldattal (PBS) öblítettük, a mAChR-ok esetében 3 x 1 percig, a nAChR-ok esetében pedig 3 x 5 percig. Ezután a metszeteket 0°C-os desztillált vízbe merítettük és szabad levegőn megszárítottuk. A tárgylemezeket kartonpapírra ragasztottuk, [3H]-Ultrofilmmel (Amersham) letakartuk és alumínium lemezek közé szorítottuk. A filmet a mAChR-ok esetében 30, a nAChR-ok esetében pedig 120 napig sötétben exponáltuk. Standardizálás céljából [3H]-leucin-tartalmú metszetsorozatot készítettünk Unnerstall és mtsai (168) leírása alapján, amit a többi metszettel együtt

21


exponáltuk. A filmeket Agfa G150 előhívóban 20°C-on 4 percig hívtuk elő, majd Ilford Hypam fixálóban fixáltuk 3 percig és 1 órán keresztül mostuk folyóvíz alatt. Képelemzés Az autoradiográfiás filmek denzitometriás elemzését Joyce-Loebl Magiscan MD képanalízis rendszerrel végeztük. Az optikai denzitást a metszetekkel együtt inkubált, ismert mennyiségű radioakív ligandot tartalmazó agyhomogenizátumok optikai denzitása alapján felállított standard görbére alapozva, fmol radioaktív ligand / mg szövet mértékegységben fejeztük ki. Agyanként összesen 15 agyterületet rajzoltunk körbe a számítógép képernyőjén mindkét agyfélteke esetében (6. ábra). Az egyes agyterületek optikai denzitását az egész mért terület átlagaként fejeztük ki. Az optikai denzitás és a radioaktivitás összefüggését standard görbén ábrázoltuk. Miután a nem specifikus kötődést vizsgáló metszetek radioaktivitása elhanyagolható volt, ezért ezeket a további elemzéseknél nem vettük figyelembe. Az egyedek közötti variancia mind a kontroll, mind a MeA-csoportban magas volt, ezért az adatokat úgy transzformáltuk, hogy minden egyes agyterület esetében a mért denzitást az adott félteke átlagos denzitásának százalékában fejeztük ki és ezt az értéket megszoroztuk az összes agy azonos hemiszfériuma denzitásának átlagával. Az így kapott értékeket átlagoltuk az agyanként mért 3 metszet esetében. A

B

Statisztikai elemzés Az adatokat két utas ANOVA-val elemeztük, melyben az egyik tényező a csoport (kontroll/MeA), a másik a félteke volt. A szignifikancia szint p < 0.05.

EREDMÉNYEK A statisztikai elemzés során nem találtunk szignifikáns interakciót a csoport és a félteke között egyik kísérleti csoport esetében sem.

6. ábra Az autoradiogrammokon elemzett agyterületek. A Az LPO és a rostralis HV síkja. B Az archistriatum, a caudalis HV és a thalamus síkja. (ld. Rövidítések jegyzéke)

22


Nikotinos acetilkolin receptorok kötéserőssége és annak változása passzív elkerüléses tanulás hatására A kötött BgT egyenletes eloszlást mutatott az előagyban. Viszonylag nagyobb sűrűségben az LPO-ban és a PA-ban fordult elő (7. Ábra). Passzív elkerüléses tanulás hatására az LPO-ban szignifikánsan megnövekedett a megkötött BgT mennyisége (p<0.0001; F=16.128; d.f.=1) a MeA-csoportban. (1. táblázat) A jobb féltekében szignifikánsan több BgT kötődött meg, mint a bal féltekében a dorsalis archistriatum (p < 0.008; F = 8.347; d.f. = 1) és a PP (p < 0.033; F = 5.043; d.f. = 1) területén, mind a kontroll, mind a MeA-csoportban. Muszkarinos acetilkolin receptorok kötéserőssége és annak változása passzív elkerüléses tanulás hatására

7. ábra Frontalis csirkeagy metszetekről készített eredeti autoradiogrammok a kontroll csoportból, az A 11.2 - A 11.6 síkból (bal oldal) és a A 7.5 - 8.0 síkból (jobb oldal) véve, [3H]-quinuklidinil benzilát vagy 23 [3H]-α-bungarotoxin kötődése után. (ld. Rövidítések jegyzéke)


Mindkét csoportban a QNB heterogénen kötődött a különböző előagyi régiókban: alacsony volt a kötéserősség a posterolateralis telencephalon dorsalis részén (PLTd), az ectostriatumban és a HP-ban; közepes kötéserősséget figyeltünk meg a dorsalis archistriatumban, a ventralis archistriatumban, a hyperstriatum accessoriumban, a hyperstriatum ventraleban (HV), a lateralis neostriatumban, a medialis neostriatumban, a PP-ban, a substance-P mezőben, a thalamusban és a PLTv-ben. A legmagasabb kötéserősséget az LPO-ban és a PA-ban figyeltük meg. (7. Ábra) A kötött QNB mennyisége szignifikánsan alacsonyabb volt a MeA-csoportban, mint a

3

1. táblázat A [ H]-QNB (QNB) és a [3H]-α-BgT (BgT) átlagos transzformált kötési értékei 15 előagyi területen, a kontroll csoportban (n = 16) és a MeA csoportban (n = 15), 30 perccel a passzív ízelkerüléses tanulás után. Az értékek fmol / mg szövet (átlag ± S.E.) egységben vannak kifejezve. * = szignifikáns különbség a kontroll és a MeA csoport között (P < 0.05). QNB Agyterület Archistriatum dorsale Archistriatum ventrale

BgT

kontroll

MeA

61293 ± 22690 62992 ± 16355

kontroll

MeA

5.16 ± 0.07

5.27 ± 0.09

1647 ± 250

2041 ± 261

4.35 ± 0.04

4.36 ± 0.04

Ectostriatum

139 ± 30

117 ± 15

3.29 ± 0.21

3.42 ± 0.32

Hippocampus*

589 ± 62*

310 ± 21*

3.97 ± 0.05

3.85 ± 0.10

Hyperstriatum accessorium

1540 ± 62

776 ± 59

4.58 ± 0.04

4.56 ± 0.04

22289 ± 4375*

7713 ± 704*

4.63 ± 0.04

4.50 ± 0.03

1162 ± 411 831052 ± 171293* 7305 ± 3047

317 ± 27 298898 ± 46460* 2791 ± 273

4.54 ± 0.04

4.28 ± 0.04

5.52 ± 0.16*

6.57 ± 0.14*

4.90 ± 0.05

4.98 ± 0.05

4.76 ± 0.06

4.76 ± 0.08

3.80 ± 0.08

3.86 ± 0.13

4.56 ± 0.05

4.54 ± 0.04

Hyperstriatum ventrale* Lateralis neostriatum Lobus parolfactorius* Medialis neostriatum

Paleostriatum augmentatum 272415 ± 68391 77271 ± 8292 Paleostriatum primitivum 32651 ± 10313 13565 ± 3 126 Posterolateralis 816 ± 60* 445 ± 45* telencephalon, p. dorsalis* Posterolateralis telencephalon, p. ventralis Substance-P mező Thalamus

1030 ± 89

644 ± 96

4.51 ± 0.05

4.64 ± 0.06

2 235 ± 438

3 380 ± 1 247

5.64 ± 1.14

4.30 ± 0.09

80 666 ± 71 969

3 472 ± 510

5.99 ± 0.52

5.45 ± 0.12

24


kontroll csoportban, a HP-ban (p < 0.001; F = 25.246; d.f. = 1), a HV-ban (p < 0.011; F = 7.247; d.f. = 1), az LPO-ban (p < 0.012; F = 7.038; d.f. = 1) és a PLTd-ben (p < 0.004; F = 9.446; d.f. = 1). (1. táblázat). A féltekék között nem volt szignifikáns különbség a megkötött QNB mennyiségében.

MEGBESZÉLÉS Harminc perccel a passzív ízelkerüléses tanulást követően, a nAChR-ok kötéserőssége szignifikáns emelkedést mutatott mindkét oldali LPO-ban, míg a mAChR-ok kötéserőssége szignifikánsan csökkent a bal és jobb LPO-ban, HV-ban, HP-ban és a PLTd-ben. Összehasonlítás a korábbi eredményekkel Rose és munkatársai (1980) korábbi eredményeivel ellentétben, a muszkarinos receptorok kötéserőssége a jelen vizsgálatban csökkent a passzív ízelkerüléses tanulás hatására a MeA csoportban. Az eltérés oka feltehetően a két vizsgálatban alkalmazott különböző módszereknek tudható be. Rose és mtsai a receptorok kötéserősségét homogenizált látólebeny és előagyi készítményekben vizsgálták, így együtt elemezték a passzív elkerüléses tanulásban résztvevő, ill. nem érintett agyterületeket. A jelen vizsgálatban alkalmazott receptor-autoradiográfia azonban lehetővé tette az egyes agyterületek külön-külön történő elemzését, így az adott területeken bekövetkező változások jól elkülöníthetők voltak. A madarak tanulását minden esetben teszteltük a további feldolgozás előtt, míg Rose és mtsai ezt nem tették meg. Ezért tehát elképzelhető, hogy Rose és mtsai a tanított csoport madarai között olyan madarak agyában is elemezték a muszkarinos receptorok kötéserősségét, amelyek valójában nem tanultak. A mi esetünkben viszont fennáll annak a lehetősége, hogy az általunk megfigyelt változások valójában nem a tanulás, hanem a memórianyomok előhívása során végbemenő folyamatok hatására következtek be. Bullock és mtsai (1987) a kolinerg szinaptikus vezikuláris marker SV2 titerének szignifikáns emelkedését írták le 2 órával a passzív elkerüléses tanulás után a jobb PAban és medialis HV-ban. Huszonnégy órával a tanulás után pedig az SV2 titerének csökkenését mutatták ki a baloldali PA-ban, valamint az ACh koncentrációjának

25


csökkenését a jobb LPO-ban és a bal PA-ban. A tanulás tesztjét ebben a kísérletben is 30 perccel a tanulás után, közvetlenül az agyak eltávolítása előtt végezték el. Az acetilkolin ill. receptorainak szerepe egyéb tanulási formákban A madarak másik korai tanulási formája, a szülői bevésődés során Bradley és Horn (1981) nem mutattak ki különbséget a muszkarinos receptorok kötéserősségében az alul- és a túltréningezett madarak között. Ez azonban nem meglepő, hiszen a bevésődés számos egyéb szempontból is jelentősen különbözik a passzív elkerüléses tanulástól, mint pl. abban, hogy a bevésődés esetében a denritek és szinapszisok sűrűsége nem változik a tanulás során (17, 65), míg a passzív elkerüléses tanulás során nő (119, 160), a GABAerg transzmisszió az elkerüléses tanulással szemben nem csökken (31), hanem nő (98), valamint a bevésődés során nem mutatható ki a passzív elkerüléses tanulásban szerepet játszó retrográd NO transzmisszió élénkülése sem (64, 4) (áttekintő irodalom: 66, 97, 137). Emberben, patkányban és majomban a nikotin bizonyítottan javítja a kognitív funkciókat, mint pl. a munkamemóriát és a figyelmet (20, 90, 139). Szelektív α7 nAChR agonisták adagolásával (pl. anabazein-rokon analógok, ARR17779) javítható a munkamemória,

még

a

fimbria-fornix

átvágás

következtében

csökkent

emlékezőképességű állatokban is (10, 88, 108, 110). Akut nikotin adagolással javítható a teljesítmény számos tanulási paradigmában, mint pl. a passzív elhárításos tanulás (18, 183), Morris vízi útvesztő (151) és a késleltetett párosítási feladatok (19, 20, 47). Az utóbbi években a BgT-érzékeny nAChR-ok szelektív részleges agonistái (GTS-21 és 4OH-GTS-21) a gyógyszerkutatások előterébe kerültek (108), mivel intracelluláris Ca++-függő transzdukciós mechanizmusok serkentésén keresztül javítják a memóriát, valamint neuroprotektív szereppel is rendelkeznek (91, 110), mely tulajdonságok rendkívül előnyösek lehetnek az Alzheimer-kór kezelésénél (75). A mAChR-ok kevésbé egyértelmű szerepet töltenek be a tanulásban. Azok a patkányok, amelyek centralis amygdalájában több mAChR-t expresszáló sejt volt, hosszabb ideig maradtak mozdulatlanok passzív elhárításos tanulás során, mint azok, amelyeknél kevesebb mAChR-t expresszáló sejtet figyeltek meg. Aktív elhárításos tanulás során azonban a mAChR-t expresszáló neuronok száma a centralis amygdalában

26


negatívan korrelált a korrekt elkerülések számával (188). Téri tanulást (egér) vagy pislogási reflex kondicionálást (nyúl) követően a HP CA1 régiójában a piramis neuronok mAChR immunreaktivitása nőtt, míg az interneuronoké csökkent (184, 186). Passzív elhárításos tanulást követően patkányoknál a neocortexben nőtt az AChR immunreaktivitás a II.-III. és V. rétegben (185). Itt lényeges megjegyezni, hogy a mAChR-ok immunreaktivitása nem utal közvetlenül azok aktivitására. Az előbb említett vizsgálatokban használt M35 antitest ugyanis csak akkor képes a receptorhoz kötődni, ha annak epitopja ép és szabad. Az említett kísérletek szerzői szerint valószínűleg a már internalizált receptorok jelölhetők antitestekkel és ez a módszer így inkább csak a receptorváltozások relatív elemzésére alkalmas (187). Bár a jelen vizsgálatban használt receptor-autoradiográfia felbontása jelentősen kisebb, mint az immuncitokémiáé (ahol az egyes jelölt sejtek is megfigyelhetők), közvetlenül az aktív receptorokat jelöli, így pontosabb képet ad a tanulás során bekövetkező kolinerg változásokról. Az acetilkolin szerepe a passzív elkerüléses tanulásban A jelen vizsgálat és Bullock és mtsai (1987) eredményei egymást kiegészítik a tanulás során történő kolinerg hatások időbeli változásainak elemzésében. Jelen vizsgálat szerint, 30 perccel a passzív elkerüléses tanulás után a nAChR-ok kötéserőssége emelkedik, míg a mAChR-ok kötéserőssége csökken. Mivel a kísérlet során az αBgT-ra érzékeny nAChR-ok kötéserősségének vizsgálatára fókuszáltunk és egyéb nAChR-ok esetleges változásairól nem áll rendelkezésre irodalmi adat, ezért azok itt nem kerülnek tárgyalásra. Az α7 nAChR-ok kötéserősségének jelen vizsgálatban megfigyelt emelkedése a medialis striatumban egybeesik a D1 DA receptorok kötéserősségének növekedésével az LPO-ban passzív elkerüléses tanulást követően (159). A dopaminerg terminálisokon található preszinaptikus nAChR-ok serkentően hatnak a DA ürülésére (179, 189), ezért feltételezhető, hogy a passzív elkerüléses tanulás során az α7 nAChR-ok kötéserősségének emelkedése a DA transzmisszióra serkentőleg hat, amire a D1 DA receptorok kötéserősségének növekedése is utal. A D1 receptorokon keresztül ható, nigrostriatalis és ventrotegmento-striatalis DA emeli a striatalis projekciós neuronok serkenthetőségét (40), ami elősegítheti a tanulást a passzív elkerüléses tanulás során.

27


Mivel azonban a DA is serkentőleg hat az ACh ürülésére (1, 37, 161), elképzelhető az is, hogy pontosan a DA az, amelynek hatására a D1 receptorokon keresztül hatva emelkedik az ACh és így közvetve a nAChR-ok kötéserőssége. Annak eldöntésére, hogy a két elmélet közül melyik áll a kötéserősség változások mögött, részletes receptor-kinetikai vizsgálatok lennének szükségesek. A mAChR-ok kötéserősségének csökkenése az LPO-ban, HP-ban, HV-ban és PLTdben az aktív receptorok számának csökkenésére („down-regulation”) utal. A mAChRok agonista (pl. carbachol) hatására konformáció változáson mennek keresztül, mely következtében csökken a receptor – effektor kötődés, amit akár 5-10 percen belül a receptorok internalizációja követ (áttekintő irodalom: 185). Az acetilkolin szintjének feltételezhető emelkedése a passzív elkerüléses tanulás során tehát ebben az esetben a receptorok kötéserősségének csökkenésével jár. Az SV2 titerének emelkedése 2 órával a tanulás után arra utal, hogy növekszik a kolinerg vezikulák mennyisége, mivel az ACh az oldható formából valószínűleg átalakul vezikuláris formába (22). Ekkor a kolinerg hatás feltehetően még mindig aktív. Huszonnégy órával a tanulást követően mind a kolinerg vezikuláknak, mind magának az ACh-nak a mennyisége alacsonyabb, mint kontroll állatokban, mivel a kolinerg hatás eddigre már valószínűleg lecsengett (22). Adalékok a prefrontális kéreg-ekvivalens területek meghatározásához A PLTd (az NCLd-vel részben átfed) funkciója, elhelyezkedése és kapcsolatrendszere alapján az egyik lehetséges olyan terület, amely az emlős PFC megfelelője lehet (38, 42, 45, 58, 115, 130, 175, áttekintő irodalom: 123). A PFC anatómiai ismérveinek nagyrészt eleget tesz: pallialis afferenseinek jelentős része szekunder szenzoros területekről érkezik (81, 87), erős dopaminerg beidegzést kap a mesencephalicus tegmentum dopaminerg magjaiból, noradrenerg beidegzése azonban kevésbé jelentős (45), így a DA / noradrenalin arány magas (41, 42). Abban azonban nem egyezik meg az emlős PFC-vel, hogy thalamicus beidegzését nem a dorsomedialis thalamusból, hanem a thalamus dorsolateralis posterior magjából (DLP) kapja (87). A DLP valószínűleg az emlős thalamicus centralis lateralis, paracentralis és parafascicularis magoknak felel meg.

28


Egy másik agyterület, amely felmerült a madár PFC keresése során, az MNH (106). Laboratóriumunkban végzett anterográd pályakövetéses kísérletek bebizonyították, hogy az MNH - a PLTd-vel ellentétben - thalamicus afferentációját az emlős PFC-nek megfelelően a dorsomedialis thalamus magból (DMP) kapja (116). A DMP lateralis része feltehetően az emlős mediodorsalis thalamus madár megfelelője (124). A jelen vizsgálat további bizonyítékkal szolgált a PLTd mellett, hiszen AChR kötéserősség változás csak a PLTd területén történt, az MNH-ban (itt a medialis neostriatumnak ill. a HV-nak felel meg) azonban nem.

29

STRIATOTEGMENTALIS NEURONOK HODOLÓGIAI ÉS MORFOLÓGIAI ELEMZÉSE

BEVEZETÉS A basalis ganglionok a gerincesek agyának evolúciósan konzervatív területei, hasonló funkciókkal és kapcsolatrendszerrel az összes, eddig vizsgált gerinces fajban (128). A striatum glutamaterg, serkentő afferentációt kap a legtöbb kérgi területről, valamint a dorsomedialis thalamusból, serotonerg inputot a dorsalis rapheból és dopaminerg beidegzést a substantia nigra pars compacta részéből (SNc), az AVT-ből és a retrorubralis területről (15, 124). A striatum két fő efferens pályája a középagyi dopaminerg magokba (substantia nigra pars reticulata (SNr) és AVT) projiciáló, GABA-t, SP-t és dynorphint (DYN) tartalmazó direkt pálya, ill. a globus pallidusba (madárban: PP) futó, GABA-t és ENK-t tartalmazó indirekt pálya (56, 124). A madár SN csakúgy, mint emlős megfelelője, egy dopaminerg idegsejteket tartalmazó pars compacta és egy GABAerg sejteket tartalmazó pars reticulata részből épül fel (127, 170). Mivel a SNc-t és a SNr-t alkotó sejtek madarakban jelentős átfedést mutatnak (149), ezért a két régióra a továbbiakban együttesen SN-ként fogunk hivatkozni. A striatum belső kapcsolatrendszerét GABAerg és kolinerg interneuronok, valamint a projekciós neuronok kollaterálisai adják (15, 124). Bár az LPO funkcionálisan heterogén (172, 180), szövettanilag egységesnek tűnik. A felépítő neuronok 90-95%-a közepes méretű, tüskés projekciós neuron, a fennmaradó rész pedig nagyobb méretű tüskétlen interneuron (165). A kérgi afferentáció alapján azonban az LPO felosztható hodológiailag elkülöníthető alterületekre. A PA és az LPO lateralis és középső részei somaticus és motoros pallialis területekről kapnak afferentációt és a somaticus striatumot alkotják. A medialis LPO és a ventralis basalis ganglionok (Ac, BNST, OT, PVT) a limbicus pallialis területekről kapnak beidegzést és a visceralis/limbicus striatumot alkotják (172). A striatum reciprok kapcsolata a középagyi dopaminerg magokkal a viselkedés predikciójának neurális alapját képezi, valamint a kérgi és thalamicus információk

30

Striatotegmentalis neuronok hodológiai és morfológiai elemzése

szabályozása és továbbítása révén a mozgás beindításában és koordinálásában is részt vesz (32, 45). Az SN mind emlősökben és madarakban főként a motoros szabályozásban vesz részt, míg az AVT és az Ac a mesolimbicus rendszer részeként egyrészt motoros, másrészt a jutalmazással és érzelmekkel kapcsolatos viselkedést szabályozza (45, 63, 148, 180). Az LPO-nak szintén fontos szerepe van a memória tárolásában: nélkülözhetetlen pl. a passzív elkerüléses tanuláshoz (33, 79, 133, 134, 157, 159) és a szülői bevésődéshez (57, 69) szükséges hosszú távú memória kialakulásához. Az LPO mesencephalicus dopaminerg magokkal való kapcsolatának elemzése céljából két fluoreszcens retrográd pályakövető anyagot, fast blue-t (FB) és vörös mikrogyöngyöket (RM), valamint anterográd pályakövetésre alkalmas biotinilált dextrán amint (BDA; molekulatömeg: 10K) használtunk annak feltérképezésére, hogy a striatum, kiemelten az LPO mely alrégiói projiciálnak a SN-ba ill. az AVT-be a házi csirkében. Kettős retrográd pályakövetést alkalmaztunk annak megállapítására, hogy az LPO azon szubrégióiban, melyekben a SN-ba és az AVT-be projiciáló neuronok is találhatók, ezek azonosak-e, vagyis kollaterálisok révén mindkét dopaminerg magba projiciálnak-e, vagy két, különálló neuronpopulációhoz tartoznak és a mesencephalonba parallel pályákat küldenek. Az AVT striatalis eredetű afferenseinek feltérképezése továbbá segítséget ad a madár Ac pontos lokalizációjának meghatározásában. Eddig rendkívül kevés sejtszintű tanulmány született a madáragyról, különösen a striatumról. Tömböl és mtsai (1988) Golgi-impregnációt alkalmaztak a csirke LPO neuronjainak morfológiai jellemzésére. Perkel és mtsai (2002) pedig LPO neuronok elektrofiziológiai jellemzését kombinálták a sejtek biocitinnel való feltöltésével. A jelen vizsgálatban sejtfeltöltést alkalmaztunk a striatumban található neuronok morfológiájának és sejtszintű kapcsolatrendszerének megismerésére. Csakúgy, mint a Golgi-impregnáció, a sejtfeltöltés is láthatóvá teszi az egyes neuronokat, még a dendrittüskéket is. A sejtfeltöltés azonban azzal a jelentős előnnyel bír a Golgiimpregnációval szemben, hogy lehetővé teszi azonosított neuronok elemzését (pl. pályakövetéssel kombinálva), míg a Golgi-impregnáció a sejteket véletlenszerűen festi meg. A jelen kísérletben az AVT-be adott retrográd pályakövető anyaggal azonosított projekciójú striatalis neuronok fény- és elektronmikroszkópos elemzését végeztük, posztembedding immuncitokémiával kombinálva. Ez az általunk ismert első vizsgálat

31


hodológiailag azonosított neuronok morfológiai és szinaptikus kapcsolatrendszerének feltárására madárban.

ESZKÖZÖK ÉS MÓDSZEREK

Pályakövetés A kísérleti állatok szexálatlan házicsirkék voltak (Hunnia broiler hybrid). Tizennégy darab egy hetes csirkét használtunk az egyszeres retrográd pályakövetéses kísérletekhez - 5 db-ot az SN és 9 db-ot az AVT vizsgálatához. Két darab egy hetes csirkét használtunk a dupla retrográd jelöléses kísérletekhez és 6 db 3 napos csibét az antrográd pályakövetéshez. A sejtfeltöltéses neuronmorfológiai vizsgálatoknál 12 darab csirkét áldoztunk fel. A madarakat a Bábolnai Gazdaságból 1-2 napos korban szereztük be és standard baromfitápon neveltük a kísérletekig. A sebészeti beavatkozások előtt a madarakat elaltattuk 0.1 ml ketamin-xylazin 2:1 arányú keverékének i.m. beadásával. Az állatok fejét sztereotaxis készülékbe helyeztük, a bőrt eltávolítottuk és fogászati fúróval lyukat fúrtunk a koponyacsontba. A pályakövető anyagokat a jobb féltekébe injektáltuk egy Kopf mikroinjektoros egységbe helyezett 1.0 μl-es Hamilton fecskendővel. Az egyszeres retrográd pályakövetéses kísérletekhez 0.1 μl FB-t (Sigma, 3%- os desztillált vizes oldat) fecskendeztünk az AVT-be (koordináták: rostrocaudalisan a bregma síkja, bregmatól 0.6 mm-re lateralisan és duratól 9 mm-re ventralisan) vagy a SN-ba (koordináták: bregmatól 0.9 mm-re caudalisan, 1.5 mm-re lateralisan és duratól 7.3 mm-re ventralisan). A dupla retrográd pályakövetéses kísérletekhez 0.1 μl FB-t (3%- os desztillált vizes oldat) injekcióztunk a jobb oldali SN-ba és 0.15 μl vörös fluoreszcens karboxilát-modifikált microgyöngyöt (red fluorescent carboxylate-modified microspheres, Molecular Probes, 0.04 μm átmérő) fecskendeztünk a jobb oldali AVT-be. Anterográd pályakövetéshez 0.06 μl BDA-t (10.000 KDa molekulatömeg, 20%-os, 0.9%-os NaCl oldatban) fecskendeztünk 1 állat esetében a dorsomedialis LPO-ba (koordináták: bregmatól 5 mm-re rostralisan, 0.5 mm-re lateralisan és duratól 5.2 mm-re ventralisan), 1 állatnál a dorsolateralis LPOba (koordináták: bregmatól 5 mm-re rostralisan, 1.4 mm-re lateralisan és duratól 4.9 mm-re ventralisan) és 1 állatnál a PA-ba (koordináták: bregmatól 4 mm-re rostralisan, 3

32


mm-re lateralisan és duratól 4.5 mm-re ventralisan). A sejtfeltöltéses kísérletek során a jobb oldali AVT-be (koordináták: rostrocaudalisan bregma, lateralisan bregmatól 0.6 mm, duratól 9 mm ventralisan) FB (Sigma) 3%-os desztillált vizes oldatából 0.1 μl-nyit injektáltunk, az előzőekben leírt módon. Az agyak feldolgozása Perfúzió A műtétek után a túlélési idő 5-7 nap volt a retrográd pályakövetéses madaraknál és 3 nap az anterográd pályakövetéshez használtaknál. Ezután a madarakat elaltattuk 0.4-0.5 ml ketamin-xylazin 2:1 arányú keverékének i.m. beadásával és a szíven keresztül perfundáltuk először 50-100 ml fiziológiás sóoldattal, majd a hodológiai vizsgálatokhoz végzett retrográd pályakövetésekhez használt madaraknál 150-200 ml 4%-os paraformaldehiddel (0.1 M PB-ben, pH 7.4), az anterográd pályakövetéshez használt madaraknál 150 ml 4% paraformaldehid, 4% pikrinsav és 0.2% glutáraldehid oldatával (0.1 M PB-ben, pH 7.4), a sejtfeltöltéshez injektált madaraknál pedig 4% paraformaldehid, 10% pikrinsav és 0.05% glutáraldehid oldatával. Az agyakat eltávolítottuk a koponyából és további felhasználásig 4%-os paraformaldehiddel (0.1 M PB-ben, pH 7.4) immerziósan fixáltuk. A hodológiai vizsgálatok esetében metszés előtt az agyakat fagyasztás elleni védelem céljából éjszakára 20%-os szacharóz oldatba (0.1 M PB-ben, pH 7.4) tettük. További lépések – hodológiai vizsgálatok A hodológiai vizsgálatoknál az agyakból fagyasztó mikrotómon (Leica), -10--20°C-on 50-60 μm vastag szeleteket metszettünk, amelyeket 0.1 M PB-ben, 4°C-on tároltunk további felhasználásukig. Az anterográd pályakövetésnél használt metszeteket először 10 percig 0.1 M PB-ben mostuk, majd 0.1%-os hidrogénperoxid-oldatban inkubáltuk 5 percig. A metszeteket ezután 3x10 percet mostuk 0.1 M PB-ben és 2 órán keresztül szobahőmérsékleten inkubáltuk avidin-biotin - tormaperoxidáz komplexben (Vectastain ABC Elite Kit, Vector Laboratories Inc., 1:100-ban higítva 0.1 M PB-ben). Ezután a metszeteket 3x10 percet 0.1 M PB-ben, majd 3x10 percet 0.05 M-os Tris-HCl mostuk és 5 percre 0.06%-os 3,3'-diaminobenzidin tetrahidroklorid (Sigma) és 0.1%-os

33


hidrogénperoxidáz oldatába helyeztük. Ezt követően a metszeteket 10 percig 0.05 M-os Tris-HCl-ben, majd 10 percig 0.1 M PB-ben mostuk. A metszeteket felváltva kezeletlen, vagy krómzselatinba mártott tárgylemezekre húztuk fel és a levegőn megszárítottuk. A kezeletlen tárgylemezekre húzott metszeteket lefedtük De-Pe X-szel, a krómzselatinos tárgylemezekre felhúzott metszeteket pedig először Nissl-szerint megfestettük, aztán fedtük le. A metszetek vizsgálata a hodológiai elemzéshez A jelölt sejteket, nyúlványokat és axonterminálisokat Olympus Vanox és Olympus BX51 mikroszkópokon vizsgáltuk meg. A mikroszkópban (Olympus BX40) megfigyelt jelölt sejtek pontos elhelyezkedését a metszetek körvonalai és egyéb azonosítható struktúrákhoz viszonyítva, a Neurolucida rendszer (3.0 verzió, MicroBrightField Inc.) segítségével rögzítettük, amely digitalizálja a mikroszkópban látottak alapján a digizalizáló táblán megrajzolt részleteket. A sejtfeltöltés menete Az agyakból 150 μm-es, az LPO-t tartalmazó coronalis metszeteket készítettünk Vibratommal.

A

metszeteket

ezután

4°C-on tároltuk 0.1 M-os PB-ben a

felhasználásukig – de legfeljebb 24 órát. A következőkben leírt sejtfeltöltési módszer Buhl (1993) leírásán alapul. A metszeteket 0.1 M-os PB oldattal töltött Petri csészébe helyeztük és egy fix tárgyasztalú, fluoreszcens feltéttel rendelkező Zeiss Axioskop mikroszkópba tettük. A sejttöltéshez az üvegkapillárisokat (Harvard Apparatus Ltd., boroszilikát üveg kapillárisok filamenttel) mikropipetta-húzón (Sutter Instrument Co.) készítettük úgy, hogy ellenállásuk 300-600 MOhm között legyen, majd feltöltöttük Lucifer Yellow (LY, Sigma) 1%-os, desztillált vizes oldatával. A retrográdan jelölt neuronokat UV fénnyel megvilágítva tettük láthatóvá és Olympus DP11, ill. DP50 digitális fényképezőgép segítségével fényképeztük le. Az aktuális metszeten véletlenszerűen kiválasztottunk egy retrográdan jelölt neuront az

LPO

dorsomedialis

részén,

mikromanipulátor

(Merzhäuser)

segítségével

megközelítettük, majd kb. 10 percen keresztül töltöttük LY-val iontoforézis készülék segítségével (D380 Iontophoretic Dye Marker, Digitimer Ltd.) addig, amíg a festék

34


elérte a dendritek legdistalisabb végeit is (8. ábra). A vizsgálat következetessége érdekében a neuronokat minden esetben az LPO dorsomedialis részéről, az oldalkamrához közel eső sávból választottuk. A fénymikroszópos morfológiai vizsgálathoz és a sejtrekonstrukcióhoz egyes töltött sejtekről egy Olympus BX51-es mikroszkópban, DP50-es digitális fényképezőgép segítségével különböző fókuszmélységű felvételeket készítettünk. Mivel ennek során a LY fluoreszcenciája jelentősen csökkent, ezért ezeket a sejteket már nem használtuk fel a későbbiekben az elektronmikroszkópos vizsgálatokhoz. Elektronmikroszkópia A feltöltött sejteket diamino-benzidinben (DAB) (0.7 mg DAB / 10 ml 0.1 M PBben, vagy 1 db Sigma Fast DAB tabletta / 5 ml PB) 5 percig történő előinkunbálás után 10-15 percig UV fénnyel megvilágítottuk (21), aminek hatására a sejtben található fluoreszcens festék sűrű, sötét DAB csapadékká alakult át. Ezután a metszetnek a töltött sejtet tartalmazó részét kiemeltük és 45 percig 1%-os osmium oldatban (0.1 M PB) osmificaltuk. Az így kezelt szövetet aztán Durcupanba (Fluka) ágyaztuk és a blokkokból 70 nm-es ultravékony metszeteket készítettünk (Reichart Ultracut). Azokról a töltött sejtekről, amelyek áteső fénnyel megvilágítva láthatóak voltak a blokkban, egy Olympus BX51-es mikroszkópra szerelt DP50-es digitális fényképezőgéppel,

A

B

8. ábra A Egy kapilláris (*) mellett elhelyezkedő, az AVT-ből visszajelölődött, FB-t tartalmazó striatalis neuron (nyíl), UV fluoreszcens fénnyel megvilágítva. B Az előző neuron (nyíl), LY-val üvegkapillárison (C) keresztül való feltöltés közben. Lépték: 10 μm.

35


különböző fókuszmélységgel felvételeket készítettünk a sejtek rekonstruálásának céljából. Összesen 34 LY-töltött neuront ágyaztunk be elektronmikroszkópiára és további 6 neuront elemeztünk a beágyazás előtt, fluoreszcens megvilágítással. A neuronok továbbiakban leírt jellemzőit 2 reprezentatív neuron (27-es és 29-es sejt) adatai alapján mutatjuk be. Beágyazás utáni immuncitokémia A töltött sejteken végződő axonterminálisok ingerület-átvivőanyag tartalmának meghatározásához GABA ill. Glu immuncitokémiát alkalmaztunk Somogyi és Hodgson (1985) módszere szerint. Röviden, a nikkel gridre felvett ultravékony metszeteket perjódsav, majd nátrium metaperjodát, végül normál kecskeszérum (NGS) 1%-os oldatával inkubáltuk. A metszeteket ezután vagy nyúlban termelt anti-GABA-val (Sigma, 1 : 750-es higításban Tris-szel pufferelt sóoldatban (TBS)), nyúlban termelt anti-Glu-tal (Sigma, 1:1500-as higításban TBS-ben), vagy 1%-os NGS-sel inkubáltuk 2 órán keresztül szobahőn, vagy éjszakára a hűtőben 4°C-on hagyva. Ezután a metszeteket nyúl antigén ellen termelt, 15 nm-es arany kolloid szemcsékkel konjugált IgG-vel (British Biocell International, 1:20-as higítás 1% bovin szérum albumin és 1% Tween 20 oldatában) inkubáltuk 2 órán keresztül. Végül a metszeteket uranil acetáttal, majd ólom citráttal utókontrasztoztuk. A LY-töltött sejteket tartalmazó szövet ultrastruktúrája és immunogenitása a specifikusan elektronmikroszkópiára előkészített szövet minősége alatt marad, mivel a metszetek nem kerülnek azonnal elektronmikroszkópos feldolgozásra. A sejt festékkel való feltöltése és a fotokonverzió szintén csökkentik a szövet immunogenitását. Ennek ellenére, a vizsgálatban felhasznált neuronok ultrastruktúrája megfelelő mértékben megőrződött a további rutin elektronmikroszkópos és beágyazás utáni immuncitokémiai vizsgálatokhoz. A szimmetrikus szinapszisok felismerése azonban nem volt könnyű a posztszinaptikus struktúrákban felhalmozódott DAB csapadék miatt. Az immun-arany jelölés specificitását a kontrol, GABA és Glu immunjelölt metszeteken, véletlenszerűen kiválasztott területeken, különböző szöveti struktúrák (dendritek, axonterminálisok, sejttest, kapilláris lumen, „maradék”) felett található aranyszemcsék számának összehasonlításával ellenőriztük. A GABA-, ill. Glu-

36


2. táblázat GABA-hoz vagy Glu-hoz immunreakcióval asszociált aranyszemcsék sűrűsége. Az adatok az aranyszemcsék sűrűségét mutatják adott szöveti struktúrák felett (aranyszemcsék száma 1 μm2-en), a „maradékhoz” képest. Összesen 363 (GABA) és 348 (Glu) aranyszemcsét értékeltünk, 7 véletlenszerűen kiválasztott szöveti terület felett mind a GABA, mind a Glu immunjelölt metszetek esetében. Immunjelölés

axon terminális

dendrit

sejttest

kapilláris lumen

GABA

3.42

1.85

-

0

Glu

3.33

0.8

0.7

0.25

specifikus aranyszemcsék sűrűségét a következő módon állapítottuk meg: immun arannyal jelölt metszetekről véletlenszerűen készített felvételeken megmértük a különböző szöveti struktúrák területét az ImageJ képelemző számítógépprogram segítségével (NIH) és megszámoltuk az aranyszemcséket az adott területen. Az aranyszemcsék sűrűségét egységnyi területre (1 μm2) vonatkoztatva fejeztük ki a különböző szöveti struktúrákban, majd kiszámoltuk az arányukat úgy, hogy az egységnyi területre eső sűrűséget elosztottuk a „maradék” (nem meghatározható, vagy ependyma, glia, stb.) szöveti struktúrák egységnyi területe (1 μm2) felett található aranyszemcsék sűrűségével (2. táblázat). GABA ill. Glu pozitív volt minden olyan szöveti struktúra, amelyen az egységnyi területre eső aranyszemcsék száma meghaladta az azonos metszeten található, üres beágyazószer (kapilláris lumen) felett mért háttérértéket (61). A specifikus ellenanyag helyett preimmun szérummal (NGS) inkubált kontroll metszeteken semmilyen szöveti struktúra felett sem volt mérhető mennyiségű aranyszemcse.

EREDMÉNYEK Módszertani megfontolások Az alább leírt pályák pontosságát a célterület melletti találatokkal igazoltuk. Azoknál a beadásoknál, ahol az injekció helye a SN környékére esett (pl. rostralis mesencephalicus terület, preopticus terület), egyetlen esetben sem találtunk FB-jelölt

37


sejteket az LPO-ban vagy a PA-ban. Hasonló módon, az anterográd pályakövetés során a lamina medullaris dorsalistól dorsalisan adott injekciók esetében sem találtunk jelölt terminálisokat az AVT-ben vagy a SN-ban. A pályakövető anyag szétterjedése az injekciós tű behatolási csatornájából, ill. az injekció területéről nem befolyásolta a jelölt sejtek számát és elhelyezkedését, tehát a FB-t nagyrészt csak a beadás közvetlen területe környékén elhelyezkedő sejtek vették fel, ahol a pályajelölő anyag élénksárga, kristályos lerakódásként mutatkozott. A BDA beadások esetében az injekció pontos helyének megállapítását segítette az injektált terület középpontját körülvevő, BDA-val retrográdan jelölődött sejttestek eloszlásának meghatározása. Egyszeres retrográd pályajelöléses kísérletek Striatonigralis projekciók A jobb oldali substantia nigraba injektált FB az azonos oldali basalis ganglionok szinte teljes területén megjelölt neuronokat (9-10. ábrák). Míg a caudalis LPO majdnem teljes területe jelölődött (9. D ábra), addig a rostralisabb metszetekben a FBjelölt (FB+) sejtek leginkább az LPO medialis és dorsalis részein voltak találhatók (9. B, 10. A, D ábra). A sejtek a VL mentén futó sávban helyezkedtek el, majd dorsalisan ívben lateralis irányba fordultak az LPO dorsalis határa, a lamina medullaris dorsalis (LMD) mentén (9. B ábra). Még rostralisabban a jelölt sejtek csak az LPO dorsalis részén voltak találhatók. Az LPO legrostralisabb részében pedig alig voltak jelölt neuronok (9. A ábra). A PA neuronjai szintén gazdagon jelölődtel FB-val (10. E ábra). A legcaudalisabb metszeteken a jelölt sejtek a PA legmedialisabb részén helyezkedtek el, míg rostralisabban a FB+ sejtek beterjedtek a PA középső és lateralis részeire is (10. E ábra). A ventralis striatumban mindig voltak jelölt neuronok az Ac-ben (9. D-E ábra) és a TO-ban (9. A-B ábra). A BNST-ban is találtunk FB+ sejteket, a caudalis metszeteken többet, mint rostralisan (9. E-F, 10. C ábra). Nagy sejttesttel rendelkező FB+ sejtek megfigyelhetőek voltak a dorsalis pallidumban (PP; 9. D-F ábra). A ventralis pallidum sok FB+ neuront tartalmazott végig a rostrocaudalis tengelye mentén (9. D-F, 10. B ábra).

38


Egyéb, FB+ neuronokat tartalmazó telencephalicus területek a medialis és a lateralis septum (9. D, 10. C ábra), valamint a dorsalis pallidumtól és a nucl. intrapeduncularistól (INP) ventralisan eső terület, a ventrobasalis telencephalon, mely a TO-t is magába foglalja (9. A-D, 10. F ábra). Striatoventrotegmentalis projekciók Az AVT-be adott FB injekciókat követően az azonos oldali basalis ganglionok medialis részén jelölődtek neuronok (11.-12. ábra). A striatalis területeken csak az LPO-ban voltak fluoreszcensen jelölt sejtek, a PA egyáltalán nem jelölődött. Az LPO legrostralisabb részén csak elszórtan jelölődtek idegsejtek, míg a középső és caudalis területeken az LPO-nak főként a medialis része jelölődött a VL, dorsalisan pedig a LMD mentén (11. A-C, 12. A-C ábra). Az LPO középső részében csak elszórva voltak megfigyelhetők jelölt neuronok (12. B-C ábra). A ventralis striatumban FB+ neuronok az Ac-ben, TO-ban és a BNST-ben is előfordultak (11. C-E, 12. D-F ábra). Nagyobb beadások esetén a FB+ sejtek eloszlása kijelölte az Ac-t (12. D-E ábra). Még ilyen esetekben

sem

találtunk

azonban

jelölt

sejteket

a

VL

ventralis

csücske

szomszédságában (12. E ábra). Caudalisabb metszeteken megfigyelhető volt FB+ sejtek egy csoportja, mely a VL-t megkerülve a lateralis septum felé hajló ívet követett, ez azonban csak egy keskeny rostrocaudalis sávban volt látható (11. D, 12. F ábra). Míg a ventralis pallidum minden esetben sok jelölt sejtet tartalmazott, a dorsalis pallidum nem jelölődött

(11. B-F ábra). Egyéb telencephalikus területek közül a

medialis és lateralis septum és a preoptikus terület (11. C-F ábra), valamint a ventrobasalis telencephalon (11. E, 12. D ábra) is tartalmaztak FB+ neuronokat.

9. ábra (41. o.-on) A-F Coronalis csirkeagy metszetek, melyeken a SN-ba adott pályakövető anyag (inzert) által jelölt FB+ neuronok eloszlását ábrázoltuk. Minden egyes karika egy FB+ neuront jelez. (ld. Rövidítések jegyzéke)

39


40


10. ábra A-F Coronalisan metszett csirkeagyakról készült fluoreszcens fénymikroszópos képek, melyek a SN-ba adott retrográd pályakövető anyag által megjelölt idegsejtek eloszlását ábrázolják. A Lobus parolfactorius; jól megfigyelhető a jelölt sejtek tömörülése a medialis szubrégióban. B FB+ neuronok megfigyelhetők a ventralis paleostriatumban (PVT), míg a stria terminalis magja (BNST) alig jelölődött. C Jelölt sejtek jól látható csoportja a medialis septumban. D Az LPO-ban található FB+ neuronokról nagy nagyítással készült kép. E A jelzett sejtek a PA-ban csoportosulnak, kirajzolva a mag körvonalát. F Elszórt FB+ sejtek a ventrobasalis telencephalonban. A metszet szélét nyitott nyilakkal jeleztük. Lépték: 0.25 mm. (ld. Rövidítések jegyzéke)

41


11. ábra A-F Coronalis csirkeagy metszetek, melyeken az AVT-be adott pályakövető anyag (inzert) által jelölt FB+ neuronok eloszlását ábrázoltuk. Minden egyes karika egy FB+ neuront jelez. (ld. Rövidítések jegyzéke) 42


12. ábra A-F Az AVT-be adott FB által a striatumban megjelölt neuronok eloszlása coronalis csirkeagy metszetekről készített fluoreszcens fényképeken. A-C FB+ sejtek eloszlása az LPO rostralis, középső és caudalis síkjában. Megfigyelhető a jelölés rostrocaudalis irányban történő fokozatos mediolateralis és dorsoventralis terjedése. Az inzerten fluoreszcens multipoláris neuronok láthatók az LPO dorsomedialis részén (kis nyilak). D-E A FB+ idegsejtek kirajzolják az Ac területét rostralisabb (D) ill. caudalisabb (E) síkban (nyilak). E A VL (*) ventrolateralis széle mentén egy jelölt sejtektől mentes sáv figyelhető meg. F Nagyobb léptékű fénykép, melyen látható a ventromedialis Ac-től a lateralis septum felé a VL ventralis csücske alatt áthúzódó FB+ sejtsáv (nyilak). Lépték: 0.25 mm. (ld. Rövidítések jegyzéke)

43


Kettős retrográd pályajelölések A kettős retrográd pályajelöléses kísérletek esetében a SN-ból ill. az AVT-ből retrográdan FB- ill. RM-jelölt neuronok eloszlása és sűrűsége azonos volt az egyszeres retrográd pályajelöléses kísérletekben megfigyeltekkel. Összesen 2292 FB-jelölt és 824 RM-jelölt neuron közül csupán 7 neuron 13.

(az összes 0,22 %-a) volt dupla jelölt. Ezek közül 3 az LPO-ban, 4 pedig a ventralis pallidumban helyezkedett el (13. ábra). Anterográd pályajelölések A dorsomedialis LPO-ba injektált BDA az

AVT-ben

és

a

nucl.

pedunculopontinusban jelölt axonokat és terminálisokat (14. B, 15. A-B ábra), míg a 14A

SN-ban csak elszórtan voltak találhatók jelölt struktúrák (15. A-B ábra). Az LPO középső részébe adott injekció után jelölt rostok mind az AVT-ben, mind a SN-ban megfigyelhetők voltak (16. A-B ábra). A dorsolateralis

LPO-ba,

13. ábra Kettős fluoreszcens felvétel az Ac-ben

14B

az AVT-ből (felül, vékony nyíl) ill. a SN-ból (alul, vastag nyíl) visszajelölődött neuronokról, RM-nek ill. FB-nak az AVT-be ill. a SN-ba történt beinjektálását követően. Lépték: 50 μm. (ld. Rövidítések jegyzéke) 14. ábra Fénymikroszkópos felvételek BDAtartalmú

rostokról

és

axonterminálisokról

(nyilak) a SN-ban (A) ill. az AVT-ben (B). Lépték: 100 μm. (ld. Rövidítések jegyzéke)

44


15A

15B

16A

16B

15. ábra Coronalis metszetek – A BDA injekció helye a dorsomedialis LPO-ban (A) és BDA-tartalmú rostok és terminálisok eloszlása a középagyban (B). 16. ábra A BDA centralis LPO-ba törént beadását követően (A) BDA-jelölt rostok és terminálisok elhelyezkedése a középagyban (B). (ld. Rövidítések jegyzéke)

45


17A

17B

18A

18B

17. ábra Coronalis metszetek – A BDA injekció helye a lateralis LPO-ban (A) és BDA-tartalmú rostok és terminálisok eloszlása a középagyban (B). 18. ábra A BDA PA-ba törént beadását követően (A) BDA-jelölt rostok és terminálisok elhelyezkedése a középagyban (B). (ld. Rövidítések jegyzéke)

46


ill. a PA-ba fecskendezett pályajelölő anyag csak a SN-ban volt kimutatható (14. A, 17. A-B, 18. A-B ábra). Az SN jelölődése a dorsolateralis LPO-ba adott injekció után eredhetett abból, hogy a pályajelölő anyag átdiffundált a PA-ba. A BDA 10K-val végzett anterográd vizsgálatokat kizárólagosan azzal a céllal végeztük, hogy megerősítsük a FB retrográd transzportja alapján feltárt striatalis szubrégiók létezését. Ezért nem volt célunk az összes, striatumból eredő efferens projekció részletes feltérképezése és tárgyalása. Retrográd pályakövetés - egysejtfeltöltés Az AVT-be injektált FB az előbbiekben leírtaknak megfelelően, a medialis és dorsalis LPO-ban jelölte meg a neuronokat. Fénymikroszkópos elemzés A LY-jelölt (LY+) neuronok sejttestje körte alakú és 12-18 μm hosszú. A dendritfa 19. ábra Egy tipikus striatoventrotegmentalis projekciós neuron rekonstruált képe, LY-töltés után. A sejttest megnyúlt, a dentritfa nem sűrűn elágazó és a denriteken a tüskék (nyilak) ritkásan helyezkednek el. Inzert: Egy LY-val feltöltött striatoventrotegmentalis projekciós neuron Neurolucidával készített rekonstruált képe. (Lépték = 10 μm)

47


ritkán elágazó, átlagosan 2-8 elsődleges dendrittel, melyek másodlagos ill. harmadlagos dendritekre ágaznak el (19. ábra). A dendritfa átmérője átlagosan 100-120 μm. A dendriteken a tüskék ritkásan helyezkednek el (19. ábra). Elektronmikroszkópos elemzés és posztembedding immuncitokémia Az elektronmikroszkópos elemzés alapján a LY+ neuronok sejtmagja ovális, excentrikus, nem indentált. A soma sejtszervecskékben gazdag, különösen sima és durva endoplazmatikus retikulumban és mitokondriumokban (20. ábra). A 27-es sejt testén somaticus tüskék voltak megfigyelhetők (21. ábra). Egy tipikus, LY+ dendritet mutat be a 22. ábra. A két részletesen elemzett neuron (27. és 29.) hossza a soma legnagyobb átmérőjénél 13 ill. 16 μm volt. Az LY+ neuronokon a legtöbb szinapszis distalis dendritikus szárakon, a dendrittüskék nyakán ill. fején volt. Az aszimmetrikus szinapszisok mind a tüskéken, dendritszárakon és a sejttesten gyakoriak voltak. Ezek között az aszimmetrikus szinapszisok között voltak Glu immunpozitívak, egyik sem volt azonban GABA immunpozitív. Egy tipikus Glu immunpozitív aszimmetrikus axodendritikus szinapszist mutat be a 23. ábra, egy aszimmetrikus GABA immunonegatív axosomaticus szinapszis pedig a 24. ábrán látható. Szimmetrikus szinapszisokat csak dendritszárakon és sejttesten figyeltünk meg. Ezek mind Glu immunonegatívak, GABA immunpozitívak ill. GABA immunonegatívak voltak. Egy tipikus GABA immunpozitív szimmetrikus axodendritikus szinapszis a 25. ábrán, valamint egy GABA immunpozitív szimmetrikus axosomaticus szinapszis a 26. ábrán látható. 20.-26.

Ábra

(49.

o.-on)

LY-val

töltött

striato-ventrotegmentalis

neuronokról

készült

elektronmikroszkópos felvételek. 20. A sejttest megnyúlt, a sejtmag (*) excentrikus és nem indentált. A soma ER-ban (nyíl) és mitokondriumokban (¤) gazdag. (lépték = 1 μm) 21. Somaticus tüske (nyíl) (lépték = 0.5 μm) 22. Dendritelágazás (nyíl) és dendrittüskék (nyíl hegyek). (lépték = 0.5 μm) 23. Egy Glu immunpozitív aszimmetrikus axodendritikus szinapszis (hosszú nyíl). A rövid nyilak aranyszemcséket jelölnek. 24. Egy GABA immunonegatív aszimmetrikus axosomaticus szinapszis (hosszú nyíl) A rövid nyilak aranyszemcséket jelölnek. 25. GABA immunpozitív szimmetrikus axodendritikus szinapszis (hosszú nyíl). A rövid nyilak aranyszemcséket jelölnek. 26. GABA immunpozitív szimmetrikus axosomaticus szinapszis (hosszú nyilak). A rövid nyilak aranyszemcséket jelölnek. (23.-26.: lépték = 0.2 μm)

48


20.

22.

21.

23.

24.

25. 26.

49


28A

27.

28B

29.

31.

30.

27.-31. Ábra LY-val töltött striato-ventrotegmentalis neuronokról készült elektronmikroszkópos felvételek. 27. LY-jelölt axonkollaterállis (nyilak). (lépték = 0.5 μm). 28. Sorozatmetszeteken bemutatott, LY-jelölt axonkollaterális által alkotott szimmetrikus axodendritikus szinapszis (hosszú nyíl) egy GABA immunpozitív dendriten. A rövid nyilak arany szemcséket jelölnek. (lépték = 0.2 μm) 29. Egy LY-jelölt axonkollaterális (nyíl) által képzett aszimmetrikus axodendritikus szinapszis. (lépték = 0.5 μm) 30. Közvetlen somaticus kapcsolat egy LY-jelölt striato-ventrotegmentalis neuron (sejtmagján fehér *) és egy szomszédos, jelöletlen idegsejt (sejtmagján fekete *) között. A fehér nyilak a kapcsolódási felületet jelzik. (lépték = 0.5 μm) 31. Puncta adherentia (fekete nyilak) által képzett közvetlen somaticus kapcsolat egy LY-jelölt striato-ventrotegmentalis neuron (fehér *) és egy törpe idegsejt (fekete *) között. A fehér nyilak az érintkezési felületet jelzik. (lépték = 0.5 μm) 50


Az LY+ neuronokon összesen 50 szinapszist figyeltünk meg. Ezek közül 32-nél (62%) volt felismerhető posztszinaptikus szerkezet, ami alapján osztályozni lehetett, mint szimmetrikus vagy aszimmetrikus szinapszis. A 32 meghatározható szinapszis közül 11 (34%) volt aszimmetrikus axospinosus, 5 (16%) szimmetrikus axodendritikus, 11 (34%) aszimmetrikus axodendritikus, 3 (9%) szimmetrikus axosomaticus és 2 (6%) aszimmetrikus axosomaticus. Egyik töltött sejten sem találtunk szimmetrikus axospinosus szinapszist. A 27. sejt esetében az LY+ axonkollaterálisok szimmetrikus és aszimmetrikus szinapszisokat is kialakítottak dendritszárakon (27., 28. A-B és 29. ábra). Közvetlen sejt-sejt kapcsolat volt megfigyelhető a 29. sejt esetében az LY-töltött neuron és egy szomszédos idegsejt teste között (30. ábra). Nem volt azonban sem funkcionálisan, sem morfológiailag gap junctionra utaló jel. A 29.-es neuron sejtteste mellet egy kis (4 μm) sejt volt található. A két sejtet puncta adherentia kötötte össze (31. ábra), valamint feltételezhetően gap junctionok is, mivel a 29.-es neuronba fecskendezett LY átdiffundált a szomszédos kis sejtbe.

MEGBESZÉLÉS

Hodológiai vizsgálatok A jelen vizsgálat eredményei azt mutatják, hogy a striatonigralis és striatoventrotegmentalis pályák a csirke striatumban nagyrészt átfedő területekről indulnak ki. Jelentős területi átfedést mutatnak a SN-ból ill. az AVT-ből retrográdan visszajelölődött medialis striatalis neuronok az LPO medialis, juxtaventricularis és dorsalis területein. Hasonló területi átfedés figyelhető meg a ventralis striatumban (Ac, BNST, TO), a ventralis pallidumban, septumban és a ventrobasalis telencephalonban. A PA és a PP azonban kizárólagosan csak a SN-ba projiciálnak. Nincs azonban átfedés a SN-ba ill. az AVT-be projiciáló sejtek között sejtszinten, vagyis bár a striatonigralis és a striato-ventrotegmentalis neuronok nagyrészt azonos striatalis és pallidalis területeken helyezkednek el, a SN-ba ill. az AVT-be vetítő neuronok nem azonosak.

51


Ezen eredmények alapján valószínűsíthető, hogy az LPO felosztható hodológiailag eltérő

alrégiókra.

Laboratóriumunkban

a

dorsomedialis

thalamus

anterográd

projekcióinak feltárására folytatott kísérletek alátámasztják ezt a feltételezést, mivel a dorsomedialis anterior thalamicus magba (DMA) adott anterográd pályakövető anyag szelektíven az LPO medialis és ventralis területén lévő neuronokat jelölte meg, míg a dorsomedialis posterior thalamus mag kizárólag a medialis és dorsalis LPO-ba projiciált (116). Az SN-ból ill. az AVT-ből retrográdan visszajelölődött neuronok eltérő elhelyezkedése arra utal, hogy a ventromedialis LPO egy része valójában az Ac-nek felel meg. (Összefoglaló: 32. ábra) A jelen és korábbi eredmények összehasonlítása Eredményeink hasonlóak a striatonigralis és striatoventrotegmentalis pályákon korábban galambban végzett kísérletekhez (76, 56, 6). A FB-jelölés helyenként azonban eltért az egyéb pályajelölő anyagokat alkalmazó kísérletekben megfigyeltektől. A SNba injektált torma-peroxidáz (HRP) az LPO-nak csak a caudoventralis és rostralisan a centralis részében elhelyezkedő neuronokat jelölte meg (76), míg a [H3]-GABA csak a ventralis LPO-ban volt megfigyelhető (56). Minden korábbi kísérletben a PA csak kevésbé jelölődött a SN-ból (76, 56, 6), míg a jelen vizsgálatban a PA nagymértékű retrográd jelölődést mutatott. A HRP továbbá erősen jelölte a PP-t és az INP-t (76), csakúgy mint a FB a jelen esetben, eltérően a [H3]-GABA és a fluorogold (FG)-jelölt sejtek esetében (56, 6). Az AVT esetében – eltérően a jelen FB eredményektől – a HRP csak az LPO ventralis részén jelölt neuronokat (76). A [H3]-GABA-t (56) ill. a FG-ot (6) alkalmazó vizsgálatok nem szenteltek külön figyelmet a SN-ba ill. az AVT-be vetítő striatalis projekciók eltérő topográfiájának, ezért nem is nyújtottak részletes információkat az AVT-ből visszajelölődött neuronok elhelyezkedéséről. A jelen, valamint korábbi vizsgálatok eredményei közötti eltéréseket okozhatta a különböző pályakövető anyagok érzékenységében, illetve a beadások helyében és kiterjedésében való eltérés. Az en passant ill. sérült rostok nem veszik fel könnyen a FB-t (80), míg a HRP és a FG bekerülhet a sérült axonokba is. Így jelölődhetnek az áthaladó rostok sejttestjei is, ami az egy adott területre projiciáló jelölt neuronok számának túlbecsléséhez vezethet.

52


A BDA-jelölt terminálisok a mesencephalonban hasonló eloszlást mutattak, mint egy korábbi, a csirke LPO kapcsolatrendszerét anterográd módszerrel vizsgáló hasonló kísérletben (164). Székely és mtsai Phaseolus vulgaris leucoagglutinint (Pha-L) fecskendeztek a striatum különböző területeibe. Az LPO központi részébe adott Pha-L

A 11.8

A 9.4

A 8.8

A 3.4

32. ábra Az előagyban az AVT-ből, ill. a SN-ból visszajelölődött neuronok elhelyezkedését bemutató sematikus ábra. (ld. Rövidítések jegyzéke)

53


ill. BDA injekciók nyomán axonterminálisok jelölődtek meg az AVT-ben és az SN-ban. A dorsolateralis LPO-ba adott Pha-L szintén megjelölt axonvégződéseket az AVT-ben és a SN-ban. A hasonló helyre adott BDA azonban csak a SN-ban jelölte meg axonokat. Ez a látszólagos eltérés valószínűleg a pályakövető anyagok eltérő tulajdonságaiból fakad, vagy arra is utalhat, hogy a beadás pontos helyének már igen kismértékű eltérése is befolyásolhatja, hogy jelölődnek-e struktúrák az AVT-ben vagy nem. Ez utóbbi feltételezést támasztja alá a központi ill. a dorsolateralis LPO-ba adott BDA által jelölt rostok eltérő eloszlása. A nigralis és ventrotegmentalis striatalis afferensek és efferensek topográfiájának összehasonlítása A striatonigralis és striato-ventrotegmentalis projekciós neuronok topográfiája jelentős

átfedést

mutat

a

nigrostriatalis

és

tegmentostriatalis

neuronok

axonvégződéseinek eloszlásával a basalis ganglionokban (77). A tegmentostriatalis pályák inkább a medialis LPO-ban végződnek, hasonlóan a jelen eredményekhez, melyek a ventralis tegmentumba projiciáló LPO neuronok hasonló eloszlását mutatják be. A striatalis afferensek kompartmentalizációja azonban nem volt annyira kifejezett (77), mint az efferenseké (jelen eredmények). Habár a nigrostriatalis és ventrotegmento-striatalis projekciók madárban - csakúgy, mint emlősben - bizonyítottan nagyrészt striatalis projekciós neuronokon (124), a striatonigralis és striatoventrotegmentalis neuronok pedig dopaminerg SN ill. AVT neuronokon

végződnek

(124),

a

kétféle

pályarendszer

sejttestjeinek

ill.

axonvégződéseinek eltérő eloszlása a striatumban arra utal, hogy a striatum – SN/AVT striatum hurok nem egy egyszerű reciprok kör, hanem intrinsic kapcsolatokat is magába foglal. Funkcionális összefüggések A corticostriatalis afferensek topográfiáját figyelembe véve érdemes megjegyezni, hogy a SN-ba ill. AVT-be vetítő neuronok jelentős része a „visceralis/limbicus” BGLban (medialis LPO, Ac, BNST, TO) és a ventrobasalis telencephalonban helyezkedik el (172). Ez az AVT esetében nem is meglepő, hiszen ez a sejtcsoport madarakban csakúgy mint emlősökben a mesolimbicus rendszer része (45, 68). Ennek alapján az várható, hogy a striatonigralis efferensek egyben a somaticus striatumból (központi és

54


lateralis LPO, PA) is erednek. Ez a PA esetében így is van, ami kizárólag csak a SN-ba vetít, az AVT-be egyáltalán nem. A gyér jelölés alapján azonban úgy tűnik, hogy az LPO somaticus része nem vesz részt a striatum – SN – striatum körben olyan mértékben, mint a medialis limbicus területek. A középagyi dopaminerg magokba vetítő striatalis területek neurokémiai jellemzése A striatonigralis és striatoventrotegmentalis projekciós neuronok elrendezése hasonlóságot mutat egyes ingerületátvivő anyagok eloszlásával a striatumban. A medialis és a dorsalis LPO nagyrészt kis–közepes méretű GABAerg neuronokat, valamint SP, DYN és ENK immunreaktív sejteket tartalmaz (56, 5, 170), míg a közepes-nagyméretű GABAerg neuronok sűrűbben fordulnak elő az LPO központi és lateralis részében (170). A BNST-ben a DYN- és SP-immunreaktív sejtek száma alacsonyabb, mint a környező striatalis területeken, de gazdag ENK- és neurotenzin-tartalmú sejtekben (172), ami megegyezik a jelen megfigyelésekkel, melyek szerint ez a terület striatonigralis és striato-ventrotegmentalis neuronokban szegényebb. A neurokémiailag jellemzett sejtek elhelyezkedésének ezen eltérő megoszlása alátámasztja a jelen eredményeinket, melyek szerint az LPO felosztható hodológiailag és neurokémiailag különböző mediodorsalis és központi területekre. Utalások a striatum - SN/AVT körben történő párhuzamos jelfeldolgozásra A SN-ból és az AVT-ből retrográdan egyaránt jelölt neuronok majdnem teljes hiánya arra utal, hogy a striatonigralis és striato-ventrotegmentalis pályák két elkülönült neuron populációból származnak és a limbikus striatumban inkább parallel, mint divergens információfeldolgozás folyik. Ez összhangban van Yanagihara és mtsai. (2001) eredményeivel, melyek szerint az LPO egymás mellett fekvő neuroncsoportjai szelektíven reagálnak az eltérő modalitásokra, úgy mint a jutalom várása, vagy minősége, ill. a csípés. A madár nucl. accumbens elhelyezkedésének újragondolása Az Ac pontos elhelyezkedése a madáragyban sokat vitatott kérdés. Kuenzel és Masson (1988) csirkeagy atlasza alapján rostralisan az Ac az oldalkamra ventralis

55


csúcsától lateralisan helyezkedik el, míg caudalisabb síkokban átível az oldalkamra ventralis csúcsa körül a lateralis septum irányába. A legújabb adatok szerint azonban az Ac rostralisan lateralis irányba nyúlik, magába foglalva az LPO mediális területének egy részét (172). Caudalisabb síkokban az oldalkamra ventralis csücskét a BNST veszi körül, míg az Ac lateralisabbra és dorsalisabbra tolódik a BNST-tól. Jelen eredmények megerősítik a madár Ac anatómiai elhelyezkedésének ezt a legújabb felfogását. A striato-ventrotegmentalis neuronok megfigyelt eloszlása alapján feltételezhető, hogy a madár Ac nem különíthető el határozottan a medialis LPO-tól, hanem az Ac neuronok benyúlnak az anatómiailag meghatározott medialis LPO-ba és ott az LPO neuronokkal együtt, azokkal keveredve helyezkednek el. Evolúciós vonatkozások A basalis ganglionok felépítése a gerinceseken belül evolúciósan rendkívül konzervatív és a striatum – mesencephalicus tegmentum pályát eddig az összes gerinces fajban megtalálták (102, 94, 128, 149). A madár striatonigralis és striatoventrotegmentalis pályák így közvetlenül megfeleltethetőek a hasonló emlős agypályáknak (32). Emlősökben a SN a striatalis afferentációját a striatum egészéből kapja, mind a három striatalis alrégióból (limbikus, asszociatív, motoros) (23, 166, 162, 52).

33. ábra A nucl. accumbens lokalizációjának pontosítása. Rostralisan az Ac magába foglalja az LPO medialis területének egy részét. Caudalisabban a BNST mintegy „eltolja” az Ac-t az oldalkamra ventralis csücskétől. (ld. Rövidítések jegyzéke)

56


Eredményeink alapján a madár striatum anatómiailag eltérhet az emlős nucl. caudatus - putamen komplextől abban a vonatkozásban, hogy a nigralis és ventrotegmentalis projekciókat tekintve, hodológiailag eltérő alrégiókból épül fel. A csirke medialis striatum lateralis (somatomotoros) alrégiója nem küld jelentős projekciót a SN-ba. Továbbá, az emlősöktől eltérően, csirkében az AVT a dorsomedialis striatumból is kap afferenseket. Ennek következtében a madár medialis striatum (LPO) valószínűleg nem egyszerűen dorsalis striatalis terület, mivel a medialis része kolokalizál az Ac-szel, ami a ventralis striatumhoz tartozik. Mitöbb, az is feltételezhető, hogy az LPO részben pallidaris terület, melyre nem csak génexpressziós vizsgálatok utalnak (46), hanem az is, hogy az énekesmadarak area X-e (az LPO-n belül) is pallidaris jellegű kapcsolatokkal rendelkezik (D. Perkel, szóbeli közlés). A striatalis projekciós neuronok morfológiája Összehasonlítás a korábbi eredményekkel A jelen vizsgálat eredményei alátámasztják Tömböl és mtsai (1988) Golgiimpregnációval végzett megfigyeléseit az LPO különböző neurontípusairól. Az itt leírt striato-ventrotegmentalis idegsejtek megegyeznek Tömböl I. típusú projekciós neuronjaival, mivel szintén hosszúkás sejttestel (12-13 μm) és ritkán elágazó, hosszú és mérsékelten tüskés dendritekkel rendelkeznek. A jelen vizsgálat alapján az LPO dorsomedialis területén elhelyezkedő striato-ventrotegmentalis neuronok morfológiailag hasonlóak, ezért feltehetően a projekciós neuronok egységes csoportját képezik és funkciójuk is hasonló. Eredményeink alapján a csirke striato-ventrotegmentalis neuronok eltérnek a patkányban leírt közepes méretű, tüskés projekciós idegsejtektől, mivel azoknál a primer dendritek elvékonyodnak és sűrűn tüskések (178), míg a csirkében az AVT-be projiciáló striatalis neuronok ritkásan tüskések (jelen eredmények, 165). Hasonló eltérés azonban megfigyelhető még evolúciósan közelebb álló fajok, mint pl. az ember és a nem humán főemlősök között, mivel a nem humán főemlősök striatalis projekciós neuronjai sűrűbben tüskézettek, mint az emberé (182). Az alább leírt idegsejtek sejtmagja nem indentált, amely megegyezik a patkány striatalis projekciós neuronokban megfigyeltekkel (27). Karle és mtsai (1992) azonban

57


az SP-immunpozitív striatalis neuronok közel 1/3-ánál indentált sejtmagot figyeltek meg. Mivel a jelen kísérlet rendkívüli idő- és munkaigényessége miatt nem vizsgáltunk meg nagy mennyiségű striatalis projekciós neuront, ezért nem zárhatjuk ki annak a lehetőségét, hogy a medialis LPO-ban található striato-ventrotegmentalis projekciós neuronok egy részének csirkében is indentált a sejtmagja. A lobus parolfactorius intrinsic kapcsolatrendszere Az itt leírtakban vizsgált dorsomedialis LPO a legtöbb telencephalicus afferenst a viscero-limbicus ’kérgi’ területekről (piriform kéreg, caudolateralis neostriatum, ventralis/caudalis archistriatum) kapja, ezért Veenman és mtsai (1995) viscero-limbicus striatumnak nevezték el. A terület egyéb afferentációját a dorsomedialis thalamusból, a SN-ból, az AVT-ből és a retrorubralis területről kapja. Az efferensek a medialis striatumot ventralisan, a medialis és lateralis előagyi kötegben, valamint részben az ansa lenticularisban hagyják el. A terminális mezők a tegmentumban: az AVT-ben, a SN-ban és a nucl. mesencephalicus profundus ventralis részén végződnek (111, 164). A striatalis projekciós neuronok helyi axonkollaterálisokat küldenek más projekciós neuronokhoz, ill. lokális interneuronokhoz (74, 118, 165, 178). A SN-ba ill. AVT-be projiciáló neuronok SP és DYN tartalmú axonkollaterálisai kolinerg és/vagy somatostatin-tartalmú interneuronokon végződnek a striatumban (74). A 27. sejt axonkollaterálisának boutonja szimmetrikus szinapszist képezett egy proximális dendritszárral (28. A-B ábra). Az elektrofiziológiai bizonyítékok (167) és az anatómiai jellemzők arra utalnak, hogy ezek a recurrens axonkollaterálisok a szomszédos projekciós neuronok lateralis gátlásával a kéregből jövő információ horizontális szétterjedését gátolják. A 27. sejt axonkollaterálisai aszimmetrikus szinapszisokat is kialakítottak (29. ábra). Mivel a striatalis projekciós neuronok GABAergek, ezért feltételezhető, hogy a 27-es sejt axonkollaterálisa által kialakított aszimmetrikus szinapszis is GABAerg gátló, ill. SP vagy ENK tartalmú, szabályozó hatású. Mindkét esetben azonban a szinapszis várhatóan szimmetrikus lenne. Ismert, hogy fiatal állatokban a GABA serkentő hatású lehet (29), ami megmagyarázhatja az aszimmetrikus GABAerg szinapszis jelenlétét az egy hetes csirkékben. Felnőtt állatokban is bizonyítottan léteznek aszimmetrikus

58


GABAerg szinapszisok nem csak a striatumban, hanem a kisagyban, a globus pallidusban és a SN-ban is (60, 129). A striato-ventrotegmentalis projekciós neuronokon végződő axonterminálisok eloszlása és ultrastruktúrája A striatalis projekciós neuronokon végződő szinapszisok elhelyezkedése az adott afferens kiinduló területétől függ (150). A kérgi/thalamicus glutamaterg bemenetek distalis tüskenyakakkal szinaptizálnak (34, 150). A SN/AVT-ből érkező dopaminerg afferensek főként distalis tüskenyakakon vagy distalis dendritszárakon végződnek (107), de előfordulnak perikaryonon és proximalis dendriten is (71, 72, 82, 83, 105). Az intrinsic GABAerg, kolinerg és SP tartalmú afferensek rendszerint proximalis dendriteken, proximalis tüskenyakakon vagy a sejttesten szinaptizálnak (amint azt a 27es sejt esetében is megfigyeltük) (28. A-B, 29. ábra) (150). Egy adott neuronon az afferensek előbb leírt eloszlása lehetővé teszi a különböző bemenetek közötti összehangolt működést. A distalis tüskék esetében például a tüskenyakon végződő dopaminerg input befolyásolni tudja az ugyannak a tüskének a fején végződő kérgi/thalamicus glutamaterg inputot. Általánosságban elmondható, hogy a distalis végződések a sejt aktivációját befolyásolják, míg a proximalis végződések az idegsejt ingerelhetőségére hatnak. A jelen eredmények megegyeznek a korábbi vizsgálatokkal abban, hogy a szimmetrikus szinapszisok legnagyobb része dendritszárakon vagy sejttesten végződött, míg tüskenyakakon csak elvétve voltak megfigyelhetők (71, 72, 82, 83, 105, 107, 150). A csirke striatumban főként Glu-t tartalmazó aszimmetrikus szinapszisok eloszlása azonban eltér a korábban leírtaktól (34, 150) abban, hogy a jelen vizsgálatban aszimmetrikus szinapszisokat nem csak tüske fejeken, hanem dendritszárakon és sejttesten is megfigyeltünk. Ezek a szinapszisok felépítésük alapján lehetnek atipikus eloszlású pallialis/thalamicus afferensek, vagy eloszlásuk alapján projekciós neuronok helyi axonkollaterálisai. Sejttestek közötti közvetlen kapcsolat A 29-es sejt teste közvetlen kapcsolatban állt egy szomszédos idegsejt somajával úgy, hogy a két sejt membránja között glia nyúlvány nem volt megfigyelhető (30. ábra). Kawaguchi és mtsai (1995) korábban már beszámoltak gap junction-jellegű szoros

59


kapcsolatról a parvalbumin-tartalmú striatalis interneuronok között. A 29-es neuron esetében azonban réskapcsolat nem volt megfigyelhető a vizsgált metszetek egyikén sem. Továbbá ismert, hogy a LY könnyen átdiffundál a réskapcsolatokon, de a jelen esetben a szomszédos sejtben nem volt megfigyelhető LY jelölés. A neuronok közötti közvetlen sejttest-sejttest kapcsolatok az ingerületek kollaterális terjedését segíthetik elő a résztvevő sejtek funkcionális állapotától (membrán potenciál) függően. Egy másik, kisméretű sejt is látható volt közvetlen kapcsolatban 29-es sejt testével, de a LY ebben az esetben átdiffundált a szomszédos neuronba. Az így másodlagosan jelölt neuront mérete és elhelyezkedése alapján neuroglioform „törpe” interneuronként azonosítottuk (141). A neuroglioform sejtek jelenlétét a madár striatumban Tömböl és mtsai (1988) már leírták Golgi-impregnációs vizsgálatokra alapozva. A jelen vizsgálat az első leírást adja e sejtek ultrastruktúrájának, ill. somaticus kapcsolatának. Funkcionális következtetések Az a tény, hogy a külső inputok legnagyobb része a striatumban közvetlenül a projekciós neuronokon végződik arra utal, hogy ezek a neuronok jelentős szerepet töltenek be a különböző forrásokból érkező információk integrálásában. A tüskés projekciós neuronok a küszöb alatti membrán potenciál széles határok között tudja változtatni a szinaptikus bemenetek hosszú ideig történő integrálása céljából (73). A mozgás szabályozása mellett a madár striatum részt vesz kognitív folyamatokban is, pl. a bevésődés és a passzív elkerüléses tanulás során kialakuló hosszú távú memória tárolásában (57, 69, 79, 112, 134). Az LPO medialis és dorsalis területe, ahol az általunk

vizsgált


neuronok

találhatók,

főként

visceralis/limbicus funkciókban érintett. A striato-ventrotegmentalis pálya feltehetően az állat motivációs állapota és korábbi tapasztalata alapján szabályozza a motoros válaszokat (32). Az elektrofiziológiai adatok arra utalnak, hogy az LPO-ban vannak olyan neuronok, amelyek a viselkedés jutalmazási aspektusaiban vesznek részt és vagy a jutalomra való várás közben, vagy a jutalmazás ideje alatt serkentődnek (181). A jelen vizsgálatban elemzett

idegsejtek

az

LPO

azon

területén

helyezkednek

el,

amely

kapcsolatrendszerében hasonlít a jutalmazásos viselkedésben ismerten érintett Ac-re (63, 111, 148). Ezért feltételezhető, hogy a kérgi területekről és a középagyi

60


dopaminerg magokból érkező információ integrálása révén ezeknek a striatoventrotegmentalis neuronoknak a feladata adott mozdulatsorok pozitív vagy negatív eredményének megjóslása a korábbi tapasztalatok alapján, továbbá az így nyert tapasztalatok tárolása.

61

KÖVETKEZTETÉSEK • A nikotinos acetilkolin receptorok kötéserősségének szignifikáns emelkedése a mindkét

oldali

LPO-ban,

valamint

a

muszkarinos

acetilkolin

receptorok

kötéserősségének szignifikánsan csökkenése a bal és jobb LPO-ban, hyperstriatum ventraleban, hippocampusban és a posterolateralis telencephalon dorsalis részén, 30 perccel a passzív elhárításos tanulást követően bizonyítja a kolinerg receptorok és közvetetten az acetilkolin szerepét a passzív elhárításos tanulás során végbemenő idegi folyamatokban. • A striatonigralis és striato-ventrotegmentalis pályák a csirke striatumban nagyrészt átfedő területekről indulnak ki, melyek azonban nem az LPO egész területén, hanem funkcionálisan is elkülöníthető alrégiókban találhatók. Ezen eredmények megerősítik azt a feltételezést, hogy az LPO felosztható hodológiailag eltérő alrégiókra. A substantia nigraból ill. az area ventralis tegmentalisból retrográdan visszajelölődött neuronok eltérő elhelyezkedése arra utal, hogy a ventromedialis LPO egy része valójában a nucl. accumbensnek felel meg. • Az LPO dorsomedialis területén elhelyezkedő striato-ventrotegmentalis neuronok morfológiailag hasonlóak, ezért feltehetően a projekciós neuronok egységes csoportját képezik és funkciójuk is hasonló. Eredményeink alapján a csirke striatoventrotegmentalis neuronok eltérnek a patkányban leírt közepes méretű, tüskés projekciós idegsejtektől, mivel azoknál a primer dendritek elvékonyodnak és sűrűn tüskések, míg a csirkében az area ventralis tegmentalisba projiciáló striatalis neuronok ritkásan tüskések. Belső és külső kapcsolatorendszerük alapján e neuronok képezhetik a viselkedés predikciójának és az adaptív tanulásnak egyik meghatározó strukturális elemét.

62

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Legelőször is szeretnék köszönetet mondani témavezetőmnek, Csillag Andrásnak, aki először mint TDK-st, később mint PhD hallgatót, mindig időt és fáradtságot nem kímélve segített ötletekkel, támogatott mikor semmi sem sikerült és a helyes útra terelgetett ha kezdtem elkalandozni. Rengeteg segítséget kaptam még Szász Istvánné Marcsitól, asszisztensnőnktől. Tőle tanultam meg azokat a gyakorlati dolgokat, az apró részleteket, amik ahhoz kellenek, hogy az ötlet kipattanása után a kísérletet sikeresen el lehessen végezni. Köszönettel tartozom mindenkinek a Csillag laborban, Catherine Montagnesenek, Kálmán Mihálynak, Székely Andreának, Zachar Gergőnek és a TDK-soknak: Ádám Ágotának, Bálint Eszternek és Kitka Tamásnak. Nem csak szakmailag segítettek – ötletekkel, vagy a gyakorlatban, hanem azzal is, hogy mindent meg lehetett velük beszélni – a csirkék napi gondjaitól kezdve a számítógépes problémákig. Prof. Palkovits Miklósnak és Prof. Réthelyi Miklósnak köszönhetem a Doktori Iskolában és az Anatómiai Intézetben is azt a hátteret, amihez feltétlenül szükség van az eredményes kutatáshoz. Az Anatómiai Intézet többi dolgozói is rengeteget segítettek: Prof. Tömböl Teréz és Zayats Natasa és Németh Andrea, mint „sorstársak” a madáragy kutatásban, Deák Szilvia a műtőben, Szabó Istvánné - Marika és Tóth Ferencné - Jutka az irodában és még sokan mások... A kísérletek anyagi hátterét az OTKA T017754, T029613, OTKA 29613, ETT 309, ETT500, a Wellcome Travel Grant és a Semmelweis Egyetem Doktori Iskolájának ösztöndíja biztosította. Kabai Péternek köszönhetem, hogy a zoológiának erre az ágára tévedtem, a Prof. Michael G. Stewart laborjában, az Open University-n töltött hónapok alatt pedig megismerhettem, hogy milyen az Anatómián túli világ. Rachel C. Bourne az autoradiográfiás kísérleteknél nyújtott elengedhetetlen segítséget. Édesanyám, férjem és legjobb barátom Mark Eyre és nagynéném Sváb Erzsi nélkül ez a dolgozat biztosan nem jött volna létre.

63

ÖSSZEFOGLALÁS Kvantitatív receptor autoradiográfiával vizsgáltuk 15 előagyi területen a nikotinos és muszkarinos acetilkolin receptorok kötéserősségének változásait 30 perccel passzív elhárításos tanulást követően naposcsibékben. Szignifikáns növekedés következett be a nikotinos receptorok által megkötött [3H]-αbungarotoxin mennyiségében bilateralisan a lobus parolfactoriusban (LPO). A muszkarinos receptorok által megkötött [3H]-quinuclidinyl benzilát mennyisége szignifikánsan csökkent mindkét oldali hippocampusban, hyperstriatum ventraleban, LPO-ban és a posterolateralis telencephalon dorsalis részén. A jelen eredmények bizonyítják a kolinerg receptorok szerepét a passzív elhárításos tanulás során végbemenő idegi folyamatokban. Retrográd pályakövető anyagot (fast blue, FB) injektáltunk az area ventralis tegmentalisba (AVT) ill. a substantia nigraba (SN) egy hetes csirkékben és feltérképeztük a retrográdan jelölődött idegsejtek helyzetét a striatum alterületeiben. Az egyidejűleg az AVT-be és a SN-ba adott FB ill. vörös mikrogyöngyök segítségével kettős retrográd pályakövetéssel azt vizsgáltuk, hogy ugyanazok a striatalis sejtek projiciálnak-e az AVT-be és a SN-ba. Eredményeinket biotinilált dextrán aminnal végzett anterográd pályakövetéssel erősítettük meg. A SN-ba ill. AVT-be projiciáló neuronok elhelyezkedése átfedést mutat a striatum viscerolimbicus területén, valamint a ventralis paleostriatumban. Csak a SN-ba vetítő sejtek a paleostriatum augmentatumban és a paleostriatum primitivumban voltak találhatók. A kettős retrográd pályakövetés során az összes jelölt striatalis neuron csupán 0.22%-a jelölődött egyidejűleg az AVT-ből és a SN-ból is. Az AVT-t és a SN-t tehát a striatum átfedő területein elhelyezkedő, de különálló sejtpopuláció idegzi be. A striato-ventrotegmentalis neuronok elhelyezkedése alapján a madár nucl. accumbens valószínűleg kolokalizál a medioventralis LPO-val és a két terület nem választható el éles határvonallal. Megvizsgáltuk a striato-ventrotegmentalis neuronok morfológiáját és kapcsolatrendszerét a medialis LPO-ban. A medialis LPO-ban elhelyezkedő, az AVT-ből visszajelölődött FB pozitív sejteket fixált szeletekben feltöltöttük lucifer yellow (LY) festékkel. A fluoreszcens jelet azután fotokonvertáltuk és megvizsgáltuk

a

sejtek

ultrastruktúráját.

A


idegsejtek

somaja

sejtszervecskékben gazdag, a sejtmag nagy és enyhén excentrikus. A LY-jelölt sejtek dendritfája kevés elágazású és ritkásan tüskézett. A jelölt sejteken végződő axospinosus szinapszisok aszimmetrikusak és morfológiailag serkentő, glutamaterg szinapszisoknak felelnek meg. Szimmetrikus és aszimmetrikus axodendriticus és axosomaticus szinapszisok is megfigyelhetők voltak a jelölt sejteken. A szimmetrikus szinapszisok egy része GABA immunpozitív, míg az aszimmetrikus szinapszisok egy része glutamát immunpozitív volt. A jelölt sejtek axoncollateralisai szimmetrikus vagy aszimmetrikus axodendriticus szinapszisokat képeztek. Egy LY-jelölt és egy szomszédos neuron sejttestje között glia nyúlvány beékelődése nélküli, közvetlen sejt-sejt kapcsolatot figyeltünk meg. Az egyik jelölt sejthez kapcsolódott mikroneuront neurogliaform „törpe” sejtként azonosítottuk.

64

ABSTRACT Changes in nicotinic and muscarinic cholinergic receptors in 15 forebrain regions 30 minutes after onetrial passive avoidance training were studied in day-old chicks, by quantitative receptor autoradiography. Nicotinic receptors bound significantly more [3H]-α-bungarotoxin bilaterally in the lobus parolfactorius (LPO), while muscarinic receptors bound significantly less [3H]-quinuclidinyl benzilate bilaterally in the hippocampus, hyperstriatum ventrale, LPO and posterolateral telencephalon, pars dorsalis. The data support an involvement of cholinergic receptor types in the neural mechanisms underlying passive avoidance learning. The tracer fast blue (FB) was injected into the ventral tegmental area (AVT) or substantia nigra (SN) of week-old domestic chicks and the position of retrogradely labelled neurons was mapped in striatal subregions. In a double retrograde labelling experiment using FB and red microspheres we established whether striatal neurons projecting to the AVT and/or SN are the same cells. The anterograde tracer biotinylated dextran amine was used to confirm the results of retrograde tracing. The neurons projecting to the SN or AVT considerably overlap in the viscerolimbic parts of the striatum and in the ventral paleostriatum. Exclusive striatonigral afferents arise from the paleostriatum augmentatum and paleostriatum primitivum. Of all labelled striatal neurons, 0.22% were double labelled from both the AVT and SN. Thus, the AVT and SN are innervated from distinct and partially overlapping subregions of the striatum. At the cellular level, however, striatonigral and striato-ventrotegmental neurons represent separate neuronal populations, even in overlapping regions. Given the arrangement of striatoventrotegmental neurons, the nucl. accumbens probably does not have a distinct boundary with the LPO but extends into the anatomically defined LPO, colocalizing with medial striatal neurons. We also investigated the morphology and connectivity of striato-ventrotegmental neurons in the medial LPO. Neurons in the medial LPO labelled by FB from the AVT were targeted and injected with lucifer yellow (LY) in fixed slices. The fluorescent label in the filled neurons was then photoconverted, and the ultrastructure of cells was investigated. The soma of striato-ventrotegmental neurons is rich in organelles and they possess a large and slightly eccentric nucleus. The LY-labelled cells possess relatively few sparsely spiny dendrites. Axospinous synapses on the labelled cells are asymmetric and correspond morphologically to glutamatergic excitatory type of terminals. Both symmetric and asymmetric axodendritic and axosomatic synapses were detected. Some symmetric synapses were GABA immunolabelled, whereas some asymmetric synapses were immunopositive to glutamate. Axon collaterals of labelled cells formed symmetric or asymmetric axodendritic synapses. Direct contact without interposing glial processes was observed between one of the FB-labelled neurons and an adjacent neuronal soma. There was also a microneuron attached to one of the labelled cells, which we identified as a neurogliaform ‘dwarf’ cell.

65

IRODALOMJEGYZÉK 1.

Abercombie E. and DeBoer P. (1997) Substantia nigra D1 receptors and stimulation of striatal cholinergic interneurons by domapine: a proposed circuit mechanism. J. Neurosci. 17: 8498-8505.

2.

Absil P., Foidart A., Hemmings HC. Jr., Steinbusch HWM., Ball GF. and Balthazart J. (2001) Distribution of DARPP-32 immunoreactive structures in the quail brain: anatomical relationship with dopamine and aromatase. J. Chem. Neuroanat. 21: 23-39.

3.

Albuquerque EX., Alkondon M., Pereira EF., Castro NG., Schrattenholz A., Barbosa CT., Bonfante-Cabarcas R., Aracava Y., Eisenberg HM., Maelicke A. (1997) Properties of neuronal nicotinic acetylcholine receptors: pharmacological characterization and modulation of synaptic function. J. Pharmacol. Exp. Ther. 280: 1117–1136.

4.

Ambalavanar R., McCabe BJ. and Horn G. (1994) NADPH diaphorase (nitric oxide synthase) in a part of the chick brain involved in imprinting. Brain Res. 644: 160-165.

5.

Anderson KD. and Reiner A. (1990) Extensive co-occurrence of substance P and dynorphin in striatal projection neurons: an evolutionarily conserved feature of basal ganglia organization. J. Comp. Neurol. 295: 239-369.

6.

Anderson KD. and Reiner A. (1991) Striatonigral projection neurons: a retrograde labeling study of the percentages that contain substance-P or enkephalin in pigeons. J. Comp. Neurol. 303: 658-673.

7.

Anderson KD., Karle EJ. and Reiner A. (1991) Ultrastructural single- and doublelabel immunohistochemical studies of substance P-containing terminals and dopaminergic neurons in the substantia nigra in pigeons. J. Comp. Neurol. 309: 341-362.

8.

Andrew RJ. (1999) The differential roles of right and left sides of the brain in memory formation. Behav. Brain Res. 98: 289-295.

9.

Anokhin KV. and Rose SPR. (1991) Learning-induced increase of immediate early gene messenger RNA in the chick forebrain. Eur. J. Neurosci. 3: 162-167.

66

Irodalomjegyzék

10.

Arendash GW., Sengstock GJ., Sanberg PR., Kem WR. (1995) Improved learning and memory in aged rats with chronic administration of the nicotinic receptor agonist GTS-21. Brain Res. 674: 252–259.

11.

Aste N., Panzica GC., Viglietti-Panzica C., Harada N., Balthazart J. (1998) Distribution and effects of testosterone on aromatase mRNA in the quail forebrain: a non-radioactive in situ hybridization study. J. Chem. Neuroanat. 14: 103-115.

12.

Barbeau A. (1962) The pathogenesis of Parkinson’s disease: a new hypothesis. Can. Med. Assoc. J. 87: 802-807.

13.

Berk ML. (1987) Projections of the lateral hypothalamus and bed nucleus of the stria terminalis to the dorsal vagal complex in the pigeon. J. Comp. Neurol. 260: 140-156.

14.

Blokland A. (1999) Acetylcholine: a neurotransmitter for learning and memory? Brain Res. Rev. 21: 285-300.

15.

Bolam JP., Hanley JJ., Booth PAC. and Bevan MD. (2000) Synaptic organisation of the basal ganglia. J. Anat. 196: 527-542.

16.

Bradley P. and Horn G. (1981) A study of cholinergic receptor sites in parts of the chick brain. Exp. Brain Res. 41: 121-123.

17.

Bradley P., Horn G. and Bateson P. (1981) Imprinting: an electron microscopic study of chick hyperstriatum ventrale. Exp. Brain Res. 41: 115-120.

18.

Brioni JD., Arneric SP. (1993) Nicotinic receptor agonists facilitate retention of avoidance training – participation of dopaminergic mechanisms. Behav. Neural. Biol. 59: 57–62.

19.

Buccafusco JJ., Jackson WJ., Terry AV., Marsh KC., Decker MW. and Arneric SP. (1995) Improvement in performance of a delayed matching-to-sample task by monkeys following ABT-418: a novel cholinergic channel activator for memory enhancement. Psychopharmacology 120: 256–266.

20.

Buccafusco JJ., Prendergast MA., Terry AV., Jackson WJ. (1996) Cognitive effects of nicotinic cholinergic receptor agonists in nonhuman primates. Drug Dev. Res. 38: 196–203.

21.

Buhl E.H. (1993) Intracellular injection in fixed brain slices: a highly versatile tool to examine neuronal geometry in combinations with other neuroanatomical

67

Irodalomjegyzék

techniques. In: Meredith, G.E. and Arbuthnott, G.W. (Eds.), Morphological Investigations of Single Neurons in Vitro. IBRO Handbook Series: Methods in the Neurosciences, Vol. 16., John Wiley & Sons Ltd., Chichester, pp. 28-46. 22.

Bullock S., Csillag A. and Rose SPR. (1987) Synaptic vesicle proteins and acetylcholine levels in chick forebrain nuclei are altered by passive avoidance training, J. Neurochem. 49(3): 812-820.

23.

Bunney BS. and Aghajanian K. (1976) The precise localization of nigral afferents in the rat as determined by a retrograde tracing technique. Brain Res. 117: 423435.

24.

Burchuladze R., Potter J. and Rose SPR. (1990) Memory formation in the chick depends on membrane-bound protein kinase C. Brain Res. 535: 131-138.

25.

Burchuladze R. and Rose SPR. (1992) Memory formation in day old chicks requires NMDA but not non-NMDA glutamate receptors. Eur. J. Neurosci. 4: 533-538.

26.

Calabresi P, Centonze D, Gubellini P, Pisani A and Bernardi G (2000) Acetylcholine-mediated modulation of striatal function. Trends Neurosci. 23(3): 120-127.

27.

Chen Q., Veenman L., Knopp K., Yan Z., Medina L., Song W.-J., Surmeier DJ. and Reiner A. (1998) Evidence for the preferential localization of glutamate receptor-1 subunits of AMPA receptors to the dendritic spines of medium spiny neurons in rat striatum. Neurosci. 83(3): 749-761.

28.

Cherkin A. (1969) Kinetics of memory consolidation: role of amnestic treatment parameters. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63: 1094-1101.

29.

Cherubini E., Gaiarsa JL. and Ben-Ari Z. (1991) GABA: an excitatory transmitter in early postnatal life. Trends Neurosci. 14: 515-519.

30.

Clarke PBS., Schwartz RD., Paul SM., Pert CB. and Pert A. (1985) Nicotininc binding in the rat brain: autoradiographic comparison of [3H]acetylcholine, [3H]nicotine and [125I]alpha-bungarotoxin. J. Neurosci. 5:1307-1315.

31.

Clements MP. and Bourne RC. (1996) Passive avoidance learning in the day-old chick is modulated by GABAergic agents. Pharmacol. Biochem. Behav. 53(3): 629-634.

32.

Csillag A. (1999) Striato-telencephalic and striato-tegmental circuits: relevance to

68

Irodalomjegyzék

learning in domestic chicks. Behav. Brain Res. 98:227-236. 33.

Csillag A., Stewart MG., Székely AD., Maglóczky Z., Bourne RC. and Steele RJ. (1993) Quantitative autoradiographic demonstration of changes in binding to delta opioid, but not mu or kappa receptors, in chick forebrain 30 minutes after passive avoidance training. Brain Res. 613: 96-105.

34.

Csillag A., Székely AD. and Stewart MG. (1997) Synaptic terminals immunolabelled against glutamate in the lobus parolfactorius of domestic chicks (Gallus domesticus) in relation to afferents from the archistriatum. Brain Res. 750: 171-179.

35.

Daisley JN. and Rose SPR. (1994) The effect of a passive avoidance task on the release of amino acids in vitro from the left IMHV of the day old chick. Biochem. Trans. 22: 1608.

36.

Daisley JN. and Rose SPR. (1999) Adenosine-amino acid interactions in the chick brain: a role in passive avoidance learning. Brain Res. 847: 149-156.

37.

Di Chiara G, Morelli M. and Consolo S. (1994) Modulatory functions of neurotransmitters in the striatum: ACh/dopamine/NMDA interactions. Trends Neurosci. 17: 228-233.

38.

Diekamp B., Kalt T. and Güntürkün O. (2002) Working memory neurons in pigeons. J. Neurosci. 22: RC210(1-5).

39.

Dietl MM., Cortés R. and Palacios JM. (1988) Neurotransmitters in the avian brain. II. Muscarinic cholinergic receptors. Brain Res. 439: 360-365.

40.

Ding L. and Perkel DJ. (2002) Dopamine modulates excitability of spiny neurons in the avian basal ganglia. J. Neurosci. 22(12): 5210-5218.

41.

Divac I. and Mogensen J. (1985) The prefrontal ’cortex’ in the pigeon. Catecholamine histofluorescence. Neurosci. 15(3): 677-682.

42.

Divac I., Mogensen J. and Björklund A. (1985) The prefrontal ’cortex’ in the pigeon. Biochemical evidence. Brain Res. 332(2): 365-368.

43.

Doubell TP. and Stewart MG. (1993) Short term changes in the numerical density of synapses in the intermediate and medial hyperstriatum ventrale following onetrial passive avoidance learning. J. Neurosci. 13(5): 2230-2236.

44.

Drisdel RC. and Green WN. (2000) Neuronal alpha-bungarotoxin receptors are alpha7 subunit homomers. J. Neurosci. 20: 133-139.

69

Irodalomjegyzék

45.

Durstewitz D., Kröner S. and Güntürkün O. (1999) The dopaminergic innervation of the avian telencephalon. Prog. Neurobiol. 59: 161-195.

46.

Eisenstat DD., Liu JK., Mione M., Zhong W., Yu G., Anderson SA., Ghattas I., Puelles L. and Rubenstein LR. (1999) DLX-1, DLX-2, and DLX-5 expression define distinct stages of basal forebrain differentiation. J. Comp. Neurol. 414: 217-237.

47.

Elrod K., Buccafusco JJ., Jackson WJ. (1988) Nicotine enhances delayed matching-to-sample performance by primates. Life Sci. 43: 277–287.

48.

Fabian-Fine R., Skehel P., Errington ML., Davies HA., Sher E., Stewart MG., Fine A. (2001) Ultrastructural distribution of the alpha7 nicotinic acetylcholine receptor subunit in rat hippocampus. J. Neurosci. 21: 7993–8003.

49.

Freeman FM. and Rose SPR. (1995a) MK801 blockade of fos and jun expression following passive avoidance training in the chick. Eur. J. Neurosci. 7: 563-569.

50.

Freeman FM. and Rose SPR. (1995b) Two time windows of anisomycin-induced amnesia for passive avoidance training in the day old chick. Neurobiol. Learn. Mem. 63: 291-295.

51.

Gasbarri A., Sulli A., Pacitti C., Puglisi-Allegra S., Cabib S., Castellano C., Introini-Collison I. and McGaugh JL. (1997) Strain-dependent effects of D2 dopaminergic and muscarinic-cholinergic agonists and antagonists on memory consolidation processes in mice, Behav. Brain Res. 86: 97-104.

52.

Gerfen CR. (1985) The neostriatal mosaic. I. Compartmental organization of projections from the striatum to the substantia nigra in the rat. J. Comp. Neurol. 236: 454-476.

53.

Gibbs ME., Andrew RJ. and Ng KT. (2002) Hemispheric lateralization of memory stages for discriminated avoidance learning in the chick. Behav. Brain Res. 139: 157-165.

54.

Gilbert DB., Patterson TA. and Rose SPR. (1991) Dissociation of brain sites necessary for registration and storage of memory for a one-trial passive avoidance task in the chick. Behav. Neurosci. 105(4): 553-561.

55.

Gray R., Rajan AS., Radcliffe KA., Yakehiro M., Dani JA. (1996) Hippocampal synaptic transmission enhanced by low concentrations of nicotine. Nature 383: 713–716.

70

Irodalomjegyzék

56.

Graybiel AM. (1990) Neurotransmitters and neuromodulators in the basal ganglia. Trends Neurosci. 13: 244-254.

57.

Gruss M. and Braun K. (1996) Stimulus-evoked increase of glutamate in the mediorostral neostriatum/hyperstriatum ventrale of domestic chick after auditory filial imprinting: an in vivo microdialysis study. J. Neurochem. 66: 1167-1173.

58.

Güntürkün O. (1997) Cognitive impairments after lesions of the neostriatum caudolaterale and its thalamic afferent in pigeons: functional similarities to the mammalian prefrontal system? J. Hirnforsch. 38: 133-143.

59.

Hall K., Brauth SE. and Kitt CA. (1984) Retrograde transport of [H3]GABA in the striatotegmental system of the pigeon. Brain Res. 310(1):157-63.

60.

Hámori J. és Takács J. (1989) Two types of GABA-containing axon terminals in cerebellar glomeruli of cat: an immunogold-EM study. Exp. Brain Res. 74: 471479.

61.

Hámori J., Takács J., Verley R., Petrusz P.and Farkas-Bargeton E. (1990) Plasticity of GABA- and of glutamate - containing terminals in the mouse thalamic ventrobasal complex deprived of vibrissal afferents. An immunogoldelectron microscopic study. J. Comp. Neurol. 302: 739-748.

62.

Hasselmo ME. and Bower JM. (1993)

Acetylcholine and memory. Trends

Neurosci. 16(6): 218-222. 63.

Heimer L., Alheid GF., de Olmos JS., Groenewegen HJ., Haber SN., Harlan RE. and Zahm DS. (1997) The accumbens: beyond the core-shell dichotomy. J. Neuropsychiatry & Clin. Neurosci. 9(3): 354-381.

64.

Holscher C. and Rose SPR. (1993) Inhibiting synthesis of the putative retrograde messenger nitric oxide results in amnesia in a passive avoidance task in the chick. Brain Res. 619: 189-194.

65.

Horn G., Bradley P. and McCabe BJ (1985) Changes in the structure of synapses associated with learning. J. Neurosci. 5: 3161-3168.

66.

Horn G. (1998) Visual imprinting and the neural mechanisms of recognition memory. Trends Neurosci. 21(7): 300-305.

67.

Joel D. and Weiner I. (1994) The organization of the basal gangliathalamocortical circuits: open interconnected rather than closed segregated. Neurosci. 63: 363-379.

71

Irodalomjegyzék

68.

Joel D. and Weiner I. (2000) The connections of the dopaminergic system with the striatum in rats and primates: an analysis with respect to the functional and compartmental organization of the striatum. Neurosci. 96(3): 541-474.

69.

Johnston ANB., Clements MP. and Rose SPR. (1999) Role of BDNF and presynaptic proteins in passive avoidance learning in day-old domestic chicks. Neurosci. 88(4): 1033-1042.

70.

Jones S., Sudweeks S., Yakel JL. (1999) Nicotinic receptors in the brain: correlating physiology with function. Trends Neurosci. 22: 555–561.

71.

Karle EJ., Anderson AD. and Reiner A. (1992) Ultrastructural double-labeling demonstrates synaptic contacts between dopaminergic terminals and substance Pcontaining striatal neurons in pigeons. Brain Res. 572: 303-309.

72.

Karle EJ., Anderson AD. and Reiner A. (1994) Dopaminergic terminals form synaptic contacts with enkephalinergic striatal neurons in pigeons: and electron microscopic study. Brain Res. 64: 149-156.

73.

Kawaguchi Y., Wilson CJ., Augood SJ. and Emson PC. (1995) Striatal interneurones: chemical, physiological and morphological characterization. Trends Neurosci. 18(12): 527-535.

74.

Kawaguchi Y., Wilson CJ. and Emson PC. (1990) Projection subtypes of rat neostriatal matrix cells revealed by intracellular injectin of biocytin. J. Neurosci. 10: 3421-3438.

75.

Kitagawa H., Takenouchi T., Wesnes K., Kramer W. and Clody DE. (1998) Phase I studies of GTS-21 to assess the safety, tolerability, PK and effects on measures of cognitive function in normal volunteers. In: 6th International Conference on Alzheimer’s Disease – Abstract: 765.

76.

Kitt CA. and Brauth SE. (1981) Projections of the paleostriatum upon the midbrain tegmentum in the pigeon. Neurosci. 6: 1551-1566.

77.

Kitt CA. and Brauth SE. (1986) Telencephalic projections from midbrain and isthmal cell groups in the pigeon. II. The nigral complex. J. Comp. Neurol. 247: 92-110.

78.

Kohler EC., Messer WS. and Bingmann VP. (1995) Evidence for muscarinic acetylcholine subtypes in the pigeon telencephalon. J. Comp. Neurol. 362(2): 271282.

72

Irodalomjegyzék

79.

Kossut M. and Rose SPR. (1984) Differential 2-deoxyglucose uptake into chick brain structures during passive avoidance training. Neurosci. 12: 971-977.

80.

Köbbert C., Apps R., Bechmann I., Lanciego JL., Mey J. and Thanos S. (2000) Current concepts in neuroanatomical tracing. Prog. Neurobiol. 62: 327-351.

81.

Kröner S. and Güntürkün O. (1999) Afferent and efferent connections of the caudolateral neostriatum in the pigeon (Columba livia): a retro- and anterograde pathway tracing study. J. Comp. Neurol. 407: 228-260.

82.

Kubota Y., Inagaki S., Kito S., Takagi H. and Smith AD. (1986a) Ultrastructural evidence of dopaminergic input to enkephalinergic neurons in rat neostriatum. Brain Res. 367: 374-378.

83.

Kubota Y., Inagaki S. and Kito S. (1986b) Innervation of substance P neurons by catecholaminergic terminals in the neostriatum. Brain Res. 375: 163-167.

84.

Kuenzel WJ. and Masson M. (1988) A Stereotaxic Atlas of the Brain of the Chick (Gallus domesticus). The Johns Hopkins University Press.

85.

Kuenzel WJ. (2002) A stereotaxic atlas of the brain of the chick. Online kiadás: jarvis.neuro.duke.edu/nomen/chicken-atlas.html.

86.

Lehmann J. and Langer SZ. (1983) The striatal cholinergic interneuron: synaptic target of domapinergic terminals? Neurosci. 10: 1105-1120.

87.

Leutgeb S., Husband S., Riters LV., Shimizu T., Bingmann VP. (1996) Telencephalic afferents to the caudolateral neostriatum of the pigeon. Brain Res. 730(1-2): 173-181.

88.

Levin ED., Bettegowda C., Blosser J., Gordon J. (1999) AR-R17779, an alpha7 nicotinic agonist, improves learning and memory in rats. Behav. Pharmacol. 10: 675–680.

89.

Levin ED., Bradley A., Addy N., Sigurani N. (2002) Hippocampal α7 and α4β2 nicotinic receptors and working memory. Neuroscience 109:757–765.

90.

Levin ED., Simon BB. (1998) Nicotinic acetylcholine involvement in cognitive function in animals. Psychopharmacology (Berlin) 138: 217–230.

91.

Li Y., Papke RL., He Y-J., Millard B. and Meyer EM. (1999) Characterization of the neuroprotective and toxic effects of a7 nicotinic receptor activation in PC12 cells. Brain Res. 81: 218-225.

92.

Loscertales M., Rose SPR., Daisley JN. és Sandi C. (1998) Piracetam facilitates

73

Irodalomjegyzék

long-term memory for a passive avoidance task in chicks through a mechanism that required a brain corticosterone action. Eur. J. Neurosci. 10(7): 2238-2243. 93.

Loscertales M., Rose SPR. és Sandi C. (1997) The corticosteroid synthesis inhibitors metyrapone and aminoglutethimide block long-term memory for a passive avoidance task in day-old chicks. Brain Res. 769: 357-361.

94.

Marín O., Smeets WJAJ. and González A. (1998) Evolution of the basal ganglia in tetrapods: a new perspective based on recent studies in amphibians. Trends Neurosci. 21(11): 487-494.

95.

McCabe BJ. and Horn G. (1988) Learning and memory: regional changes in Nmethyl-D-aspartate receptors in the chick brain after imprinting. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85: 2849-2853.

96.

McCabe BJ. and Horn G. (1991) Synaptic transmission and recognition memory: time course of changes in N-methyl-D-aspartate receptors after imprinting. Behav. Neurosci. 105: 289-294.

97.

McCabe BJ. and Horn G. (1994) Learning-related changes in Fos-like immunoreactivity in the chick forebrain after imprinting. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91: 11417-11421.

98.

McCabe BJ., Horn G. and Kendrick K. (2001) GABA, taurine and learning: release of amino acids from slices of chick brain following filial imprinting. Neurosci. 105(2): 317-324.

99.

McCabe BJ. and Nicol AU. (1999) The recognition memory of imprinting: biochemistry and electrophysiology. Behav. Brain Res. 98: 253-260.

100. McGehee DS., Heath MJ., Gelber S., Devay P., Role LW. (1995) Nicotine enhancement of fast excitatory synaptic transmission in CNS by presynaptic receptors. Science 269: 1692–1696. 101. Medina L. and Reiner A. (1994) Distribution of choline acetyltransferase immunoreactivity in the pigeon brain. J. Comp. Neurol. 342: 497-537. 102. Medina L. and Reiner A. (1995) Neurotransmitter organisation and connectivity of the basal ganglia in vertebrates: implications for the evolution of basal ganglia. Brain Behav. Evol. 46: 235-258. 103. Medina L. and Reiner A. (1997) The efferent projections of the dorsal and ventral pallidal parts of the pigeon basal ganglia, studied with biotinylated dextran amine.

74

Irodalomjegyzék

Neurosci. 81(3): 773-802. 104. Medina L. and Reiner A. (2000) Do birds possess homologues of mammalian primary visual, somatosensory and motor cortices? Trends. Neurosci. 23: 1-12. 105. Mendez I., Elisevich K., Naus CCG. and Flumerfelt BA. (1990) Neostriatal substance P and somatostatin neurons receive a direct nigral dopaminergic input: an ultrastructural double-labeling immunocytochemical study. Soc. Neurosci. Abstr. 16: 301. 106. Metzger M., Jiang S. and Braun K. (1998) Organization of the dorsocaudal neostriatal complex: a retrograde and anterograde tracing study in the domestic chick with special emphasis on pathways relevant to imprinting. J. Comp. Neurol. 395: 380-404. 107. Metzger M., Jiang S. and Braun K. (2002) A quantitative immuno-electron microscopic study of dopamine terminals in forebrain regions of the domestic chick involved in filial imprinting. Neurosci. 111(4): 611-623. 108. Meyer EM., de Fiebre CM., Hunter BE., Simpkins CE., Frauworth N., de Fiebre NE. (1994) Effects of anabaseine related analogs on rat brain nicotinic receptor binding and on avoidance behaviors. Drug Dev. Res. 31: 127-134. 109. Meyer E., Kuryatov A., Gerzanich V., Lindstrom J. and Papke RL. (1998) Analysis of 4OH-GTS-21 selectivity and activity at human and rat a7 nicotinic receptors. J. Pharmacol. Exp. Ther. 287: 918–925. 110. Meyer EM., Tay ET., Papke RL., Meyers C., Huang G. and de Fiebre CM. (1997) Effects of 3-[2,4-dimethoxybenzylidene]anabaseine (DMXB) on rat nicotinic receptors and memory-related behaviors. Brain Res. 768: 49–56. 111. Mezey S. and Csillag A. (2002) Selective striatal connections of midbrain dopamiergic nuclei in the chick (Gallus domesticus). Cell Tiss. Res. 308: 35-46. 112. Mezey S., Székely AD., Bourne RC., Kabai P. and Csillag A. (1999) Changes in binding to muscarinic and nicotinic cholinergic receptors in the chick telencephalon, following passive avoidance learning. Neurosci. Lett. 270: 75-78. 113. Mileusnic R., Rose SPR., Lancashire C. and Bullock S. (1995) Characterisation of antibodies specific for chick brain NCAM which cause amnesia for a passive avoidance task. J. Neurochem. 64: 2598-2605. 114. Mileusnic R., Anokhin K. and Rose SPR. (1996) Antisense oligodeoxynucleotides

75

Irodalomjegyzék

to c-fos are amnesic for passive avoidance in the chick. NeuroReport 7: 12691272. 115. Mogensen J. and Divac I. (1982) The prefrontal ‘cortex’ in the pigeon. Behavioural evidence. Brain Behav. Evol. 21: 60-66. 116. Montagnese CM., Mezey SE. and Csillag A. (2003) Efferent connections of the dorsomedial thalamic nuclei of the domestic chick (Gallus domesticus). J. Comp. Neurol. 459(3): 301-326. 117. Parent A. and Hazrati L-N. (1995) Functional anatomy of the basal ganglia. I. The cortico-basal ganglia-thalamo-cortical loop. Brain Res. Rev. 20:91-127. 118. Parent A., Sato F., Wu Y., Gauthier J., Lévesque M., Parent M. (2000) Organization of the basal ganglia: the importance of axonal collateralization. Trends Neurosci. 23(10): 20-27. 119. Patel SN., Rose SPR. and Stewart MG. (1988) Training induced spine density changes are specifically related to memory formation processes in the chick. Gallus domesticus. Brain Res. 463: 168-173. 120. Patterson TA. and Rose SPR. (1992) Memory in the chick: multiple cues, distinct brain locations. Behav. Neurosci. 106: 465-470. 121. Perry E., Walker M., Grace J. and Perry R. (1999) Acetylcholine in mind: a neurotransmitter correlate of consciousness? Trends Neurosci. 22: 273-280. 122. Puelles L. and Medina L. (1994) Development of neurons expressing tyrosine hydroxilase and dopamine in the chicken brain: a comparative segmental analysis. Megtalálható: Smeets WJ. and Reiner A. (szerkesztők) – Phylogeny and development of catecholamine systems in the CNS of vertebrates. Cambridge University Press, 381-404 o.. 123. Reiner A. (1986) Is prefrontal cortex found only in mammals? Trends Neurosci. 9: 298-300. 124. Reiner A. (2002) Functional circuitry of the avian basal ganglia: Implications for basal ganglia organization in stem amniotes. Brain Res. Bull. 57(3/4): 513-528. 125. Reiner A., Brauth SE., Karten HJ. (1984a) Evolution of the amniote basal ganglia. Trends Neurosci. 7: 320-325. 126. Reiner A., Davis BM., Brecha NC., Karten HJ. (1984b) The distribution of enkephalin-like immunoreactivity in the telencephalon of the adult and

76

Irodalomjegyzék

developing domestic chicken. J. Comp. Neurol. 228: 245-262. 127. Reiner A., Karten HJ. and Solina AR. (1983) Substance P: localization within paleostriatal-tegmental pathways in the pigeon. Neurosci. 9(1): 61-85. 128. Reiner A., Medina L. and Veenman CL. (1998) Structural and functional evolution of the basal ganglia in vertebrates. Brain Res. Rev. 28: 235-285. 129. Ribak CE. and Roberts RC. (1990) GABAergic synapses in the brain identified with antisera to GABA and its synthesizing enzyme, glutamate decarboxylase. J. Electron Microsc. Tech. 15(1): 34-48. 130. Riters LV., Erichsen JT., Krebs JR. and Bingman VP. (1999) Neurochemical evidence for at least two regional subdivisions within the homing pigeon (Columba livia) caudolateral neostriatum. J. Comp. Neurol. 412: 469-487. 131. Rose SPR. (1989) Glycoporotein synthesis and post-synaptic remodelling in long term memory. Neurochem. Int. 3: 299-307. 132. Rose SPR. (1991a) Biochemical mechanisms involved in memory formation in the chick. In Andrew, R. J. (Ed.), Neural and Behavioural Plasticity: The Use of the Domestic Chick as a Model. Oxford University Press, Oxford, pp. 277-304. 133. Rose SPR. (1991b) How chicks make memories: the cellular cascade from c-fos to dendritic remodelling. Trends Neurosci. 14(9): 390-397. 134. Rose SPR. and Csillag A. (1985) Passive avoidance training results in lasting changes in deoxyglucose metabolism in left hemisphere regions of chick brain. Behav. Neural. Biol. 44: 315-324. 135. Rose SPR., Gibbs ME. and Hambley J. (1980) Transient increase in forebrain muscarinic cholinergic receptor binding following passive avoidance learning in the young chick. Neurosci. 5: 169-172. 136. Rose SPR. and Harding S. (1984) Training increases 3H fucose incorporation in chick brain only if followed by memory storage. Neurosci. 12: 663-667. 137. Rose SPR. and Stewart MG. (1999) Cellular correlates of memory formation in the chick following passive avoidance learning. Behav. Brain Res. 98: 237-243. 138. Rusakov DA., Stewart MG., Davies HA. and Harrison E. (1995) Population trends in the fine spatial reorganisation of synaptic elements in forebrain regions of chicks 0.5 and 24 h after passive avoidance training. Neurosci. 66: 291-307. 139. Rusted JM., Newhouse PA., Levin ED. (2000) Nicotinic treatment for

77

Irodalomjegyzék

degenerative neuropsychiatric disorders such as Alzheimer’s disease and Parkinson’s disease. Behav. Brain Res. 113: 121–129. 140. Salinska E., Chaudhury D., Bourne RC. and Rose SPR. (1999) Passive avoidance testing results in increased responsiveness of syntosomal voltage in ligand gate channels in chick brain. Neurosci. 93(4): 1507-1514. 141. Sancesario G., Pisani A., D'Angelo V., Calabresi P. and Bernardi G. (1998) Morphological and functional study of dwarf neurons in the rat striatum. Eur. J. Neurosci. 10(12): 3575-3579. 142. Sandi C. and Rose SPR (1994a) Corticosteroid receptor antagonists are amnestic for passive avoidance learning in day-old chicks. Eur. J. Neurosci. 6: 1292-1297. 143. Sandi C. and Rose SPR. (1994b) Corticosterone enhances long-term retention in one day old chicks trained in a weak passive avoidance learning paradigm. Brain Res. 647: 106-112. 144. Sandi C. and Rose SPR (1997) Training-dependent biphasic effects of corticosterone in memory formatino for a passive avoidance task in chicks. Psychopharm. 133: 152-160. 145. Scholey AB., Mileusnic R., Schachner M. and Rose SPR. (1995) A role for a chicken homolog of the neural cell adhesion molecule L1 in consolidation of memory for a passive avoidance task. Learn. Mem. 2: 17-25. 146. Scholey AB., Rose SPR., Zamani MR., Bock E. and Schachner M. (1993) A role for the neural cell adhesion molecule in a late consolidating phase of glycoprotein synthesis 6 h following passive avoidance training of the young chick. Neurosci. 55: 499-509. 147. Seguela P., Wadiche J., Dineley-Miller K., Dani JA., Patrick JW. (1993) Molecular cloning, functional properties, and distribution of rat brain alpha 7: a nicotinic cation channel highly permeable to calcium. J. Neurosci. 13: 596–604. 148. Simon H., Scatton B. and Le Moal M. (1980) Dopaminergic A10 neurones are involved in cognitive functions. Nature 286: 150-151. 149. Smeets WJAJ., Marín O. and González A. (2000) Evolution of the basal ganglia: new perspectives through a comparative approach. J. Anat. 196: 501-517. 150. Smith AD. and Bolam JP. (1990) The neural network of the basal ganglia as revealed by the study of synaptic connections of identified neurons. Trends

78

Irodalomjegyzék

Neurosci. 13(7): 259-265. 151. Socci DJ., Sanberg PR., Arendash GW. (1995) Nicotine enhances morris water maze performance of young and aged rats. Neurobiol. Aging 16: 857–860. 152. Solomonia RO., McCabe BJ. and Horn G. (1998) Neural cell adhesion molecules, learning and memory in domestic chicks. Behav. Neurosci. 112: 646-655. 153. Somogyi P. and Hodgson AJ. (1985) Antiserum to γ-aminobutyric acid. III. Demonstration of GABA in Golgi-impregnated neurons and in conventional electron microscopic sections of cat striate cortex. J. Histochem. Cytochem. 33: 249-257. 154. Sorenson EM., Parkinson D., Dahl JL. and Chiappinelli VA. (1989) Immunohistochemical localization of choline acetyltransferase in the chicken mesencephalon. J. Comp. Neurol. 281: 641-657. 155. Sorenson EM. and Chiappinelli VA. (1992) Localisation of 3H-nicotine, kappa-bungarotoxin, and

125

125

I-

I-alpha-bungarotoxin binding to nicotinic sites in the

chicken forebrain and midbrain. J. Comp. Neurol. 323: 1-12. 156. Spalding DA. (1873) Instinci with original observations on young animals. MacMillan’s 27: 282-293; újra kiadva: Brit. J. Anim. Behav. 2: 2-11. 157. Steele RJ., Stewart MG. and Rose SPR. (1995) Increases in NMDA receptor binding are specifically related to memory formation for a passive avoidance task in the chick: a quantitative autoradiographic study. Brain Res. 674(2): 352-356. 158. Stewart MG. (1991) Changes in dendritic and synaptic structure in chick forebrain consequent on passive avoidance learning. In R. J. Andrew (Ed.), Neural and behavioural plasticity: The Use of the Domestic Chick as a Model, Oxford University Press, Oxford, pp. 305-328. 159. Stewart MG., Kabai P., Harrison E., Steele RJ., Kossut M., Gierdalski M. and Csillag A. (1996) The involvement of dopamine in the striatum in passive avoidance training in the chick. Neurosci. 70: 7-14. 160. Stewart MG. and Rusakov DA. (1995) Morphological changes associated with stages of memory formation in the chick following passive avoidance training. Behav. Brain Res. 12: 21-28. 161. Stoof JC., Drukarch B., de Boer P., Westerink GH. and Groenewegen HJ. (1992) Regulation of the activity of striatal cholinergic neurons by dopamine. Neurosci.

79

Irodalomjegyzék

47(4): 755-770. 162. Streit P., Knecht E. and Cuénod M. (1979) Transmitter-specific retrograde labeling in the striato-nigral and raphe-nigral pathways. Science 205: 306-308. 163. Sugita S., Uchimura N., Jiang ZG. And North RA. (1991) Distinct muscarinic receptors inhibit release of GABA and excitatory amino acids in mammalian brain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88: 2608-2611. 164. Székely AD., Boxer IM., Stewart MG. and Csillag A. (1994) Connectivity of the lobus parolfactorius of the domestic chicken (Gallus domesticus): an anterograde and retrograde pathway tracing study. J. Comp. Neurol. 348: 374-393. 165. Tömböl T., Csillag A. and Stewart MG. (1988) Cell types of the paleostriatal complex of the domestic chicken (Gallus domesticus): a Golgi study. J. Hirnforsch. 29(5): 493-507. 166. Tulloch IF., Arbuthnott GW. and Wright AK. (1978) Topographical organization of

the

striatonigral

pathway

revealed

by

anterograde

and

retrograde

neuroanatomical tracing techniques. J. Anat. 127(2): 425-441. 167. Tunstall MJ., Oorschot DE., Kean A. and Wickens JR. (2002) Inhibitory interactions between spiny projection neurons in the rat striatum. J. Neurophys. 88: 1263-1269. 168. Unnerstall JR., Niehoff DL., Kuhar M.J. and Palacios JM. (1982) Quantitative receptor

autoradiography

using

[3H]-Ultrofilm:

application

to

multiple

benzodiazepine receptors. J. Neurosci. Methods 6: 59-73. 169. Uteshev VV., Meyer EM. and Papke RL. (2002) Activation and inhibition of native neuronal alpha-bungarotoxin sensitive nicotinic ACh receptors. Brain Res. 948: 33-46. 170. Veenman CL., Medina L., Reiner A. (1997) Avian homologues of mammalian intralaminar, mediodorsal and midline thalamic nuclei: immunohistochemical and hodological evidence. Brain Behav. Evol. 49: 78-98. 171. Veenman CL., Reiner A. (1994) The distribution of GABA-containing perikarya, fibres, and terminals in the forebrain and midbrain of pigeons, with particular reference to the basal ganglia and its projections targets. J. Comp. Neurol. 339: 209-50. 172. Veenman CL., Wild JM. and Reiner A. (1995) Organisation of the avian

80

Irodalomjegyzék

‘corticostriatal’ projection system: A retrograde and anterograde pathway tracing study in pigeons. J. Comp. Neurol. 354: 87-126. 173. Wächtler K. and Ebinger P. (1989) The pattern of muscarinic acetylcholine receptor binding in the avian forebrain. J. Hirnforsch. 30(4): 409-414. 174. Wada E., Wada K., Boulter J., Deneris E., Heinemann S., Patrick J., Swanson LW.. (1989) Distribution of alpha 2, alpha 3, alpha 4, and beta 2 neuronal nicotinic receptor subunit mRNAs in the central nervous system: a hybridization histochemical study in the rat. J. Comp. Neurol. 284:314–335. 175. Waldmann C. and Güntürkün O. (1993) The dopaminergic innervation of the pigeon caudolateral forebrain: immunocytochemical evidence for a ‘prefrontal cortex’ in birds? Brain Res. 600: 225-234. 176. Watson JT., Adkins-Regan E., Whiting P., Lindstrom JM. and Podleski TR. (1988) Autoradiographic localisation of nicotinic acetylcholine receptors in the brain of the zebra finch (Poephila guttata). J. Comp. Neur. 274: 255-264. 177. Whiting PJ. and Lindstrom J. (1986) Purification and characterisation of a nicotinic acethylcoline receptor from the chick brain. Biochem. 25: 2082-2093. 178. Wilson CJ. and Groves PM. (1980) Fine structure and synaptic connections of the common spiny neuron of the rat neostriatum: a study employing intracellular injection of horseradish peroxidase. J. Comp. Neurol. 194: 599-615. 179. Wonnacott S. (1997) Presynaptic nicotinic ACh receptors. Trends Neurosci. 20: 92–98. 180. Yanagihara S., Izawa E-I., Koga K., Maeda K-I. and Matsushima T. (2000) Coding of attention, memory and expectancy in chick telencephalon. Eur. J. Neurosci. 12 (Suppl. 11): 82. (Abstract). 181. Yanagihara S., Izawa E-I., Koga K. and Matsushima T. (2001) Reward-related neuronal activities in basal ganglia of domestic chicks. Neuroreport 12(7): 14311435. 182. Yelnik J., Francois C., Percheron G. and Tandé D. (1991) Morphological taxonomy of the neurons of the primate striatum. J. Comp. Neurol. 313: 273-294. 183. Zarrindast MR., Sadegh M., Shafaghi B. (1996) Effects of nicotine on memory retrieval in mice. Eur. J. Pharmacol. 295: 1–6. 184. Van der Zhee EA., Compaan JC., Bohus B. and Luiten PGM. (1995) Alterations

81

Irodalomjegyzék

in the immunreactivity for muscarinic acetylcholine receptors and colocalized PKCγ in mouse hippocampus induced by spatial discrimination learning. Hippocampus 5: 349-362. 185. Van der Zhee EA., Douma BRK., Bohus B. and Luiten PGM. (1994) Passive avoidance training induces enhanced levels of immunoreactivity for muscarinic acetylcholine receptor and coexpressed PKCγ and MAP-2 in rat cortical neurons. Cerebral Cortex 4: 376-390. 186. Van der Zhee EA., Kronforst MA. and Disterhoft JF. (1994) Hippocampallydependent trace eyebling conditioning induces changes in the immunoreactivity for muscarinic acetylcholine receptors and PKCγ in the rabbit hippocampus. Soc. Neurosci. Abs. 20: 1433. 187. Van der Zhee EA. and Luiten PGM. (1999) Muscarinic acetylcholine receptors in the hippocampus, neocortex and amygdala: a review of immunocytochemical localization in relation to learning and memory. Prog. Neurobiol. 58: 409-471. 188. Van der Zhee EA., Roozendal B., Bohus B., Koolhaas JM. and Luiten PGM. (1997) Muscarinic acetylcholine receptor immunoreactivity – 1. Cellular distribution correlated with fear-induced behavior. Neurosci. 76: 63-73. 189. Zhou FM., Liang Y., Dani JA. (2001) Endogenous nicotinic cholinergic activity regulates dopamine release in the striatum. Nat. Neurosci. 4: 1224–1249. 190. Zhou F., Wilson CJ. and Dani JA. (2002) Cholinergic interneuron characteristics and nicotinic properties in the striatum. J. Neurobiol. 53: 590-605.

82

SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE

Cikkek Montagnese, C., Mezey, E. Sz. and Csillag, A. (2003) Efferent connections of the dorsomedial thalmic nuclei of the domestic chick (Gallus domesticus). J. Comp. Neurol. 459: 301-326. Mezey, Sz. and Csillag, A. (2002) Selective striatal connections of midbrain dopaminergic nuclei in the chick (Gallus domesticus). Cell Tissue Res. 308:35-46. Mezey, Sz., Székely, A. D., Bourne, R. C., Kabai, P. and Csillag, A. (1999) Changes in binding to muscarinic and nicotinic cholinergic receptors in the chick telencephalon, following passive avoidance learning. Neurosci Lett. 270: 75-78. Pónyi J., Mezey Sz. és Nagy A. (1997) A Tihany előtti vizekből származó halak parazita rákjainak vizsgálata, 1995-ben. Állattani Közlemények 82: 65-68; Kivonatok Csillag, A. and Mezey, Sz., (2002) Identified projection neurons of the domestic chick lobus parolfactorius: single-cell filling followed by electronmicroscopic characterization. Program no. 264.3, 2002 Abstract Viewer and Itinerary Planner. Washington, DC: Society for Neuroscience; Csillag, A. and Mezey, Sz. (2002) The light and electron microscopic characterisation of identified striato-ventrotegmental projection neurons in the domestic chick (Gallus domesticus). FENS Abstr. vol. 1., A091.8; Mezey, Sz., V. Doyère, I. De Souza, S. Laroche, M. G. Stewart, H. Davies, K. Cambon and C. Kendal (2002) Long-term effects of LTP and LTD in vivo on synapse morphometry in the middle and outer molecular layers of the rat dentate gyrus. FENS Abstr. vol. 1., A147.24; Mezey, Sz. and Csillag, A. (2002) Parallel processing in the striatotegmental pathway of the chick. Neurobiology, kiadás alatt; Mezey, Sz. and Csillag, A. (2001) Origins of striatonigral and striatotegmental pathways in the chick. Soc. Neurosci. Abstr., 27 (Program No. 855.15). Mezey, Sz. and Csillag, A. (2001) Selective striatal connections of mesencephalic dopaminergic nuclei. J. Anat., 198(3):344.

83

Saját közlemények jegyzéke

Mezey, Sz. and Csillag, A. (2000) Selective striatal connections of mesencephalic dopaminergic nuclei. European Journal of Neuroscience, 12 Suppl. 11: 165; Mezey, Sz. and Csillag, A. (1999) Selective striatal connections of mesencephalic dopaminergic nuclei. Neurobiology, 7(3): 356; Csillag A., Bourne, R. C., Székely A. D., Mezey Sz. and Kabai P. (1998) Acethylcholine receptor alterations in forebrain regions of young post-hatch domestic chicks following passive avoidance learning. Neurobiology, 6(2): 176-177.

84

Tanulással kapcsolatos agyterületek és agypályák vizsgálata házi csirkében (Gallus domesticus)

Recommend Documents