T lymfocyty RNDr. Jan Lašťovička, CSc. Ústav imunologie 2.LF UK, FN Motol
Klasifikace T lymfocytů • Lymfocyty exprimující TCR ab nebo gd • Lymfocyty exprimující koreceptory CD4 a CD8 • Regulační T lymfocyty • Intraepiteliální lymfocyty • NK-T lymfocyty
Rozdělení podle typu TCR • Typ ab je u většiny savců převládající, tyto lymfocyty se diferencují v thymu a rozeznávají peptidy v komplexu s MHC • Typ gd se může vyvíjet i mimo thymus a rozeznává buď nativní antigeny nebo jednoduché organické látky (např. aminy), zřejmě se uplatňují při obraně proti specifickým patogenům
T buněčný receptor je podobný Fab fragmentu protilátky, je ale vždycky vázaný na membránu
Rozdělení podle exprese CD4/CD8 • T lymfocyty typu ab nesou na povrchu molekuly CD8 (koreceptor pro MHC I. třídy) nebo CD4 (koreceptor pro MHC II. třídy) • Většina CD8+ T buněk jsou cytotoxické lymfocyty • Většina CD4+ T buněk jsou pomocné (helper) T lymfocyty (Th)
Koreceptory CD4 a CD8 • Molekuly MHC se váží svými nepolymorfními úseky na molekuly CD4 a CD8: • CD8 váže molekuly MHC I. třídy a může se současně navázat na stejný komplex MHC I.peptid, který je rozpoznán T-buněčným receptorem • CD4 váže molekuly MHC II. třídy a může se současně navázat na stejný komplex MHC II.peptid, který je rozpoznán T-buněčným receptorem
Vazebná místa pro CD4 a CD8 na molekulách MHC I. a II. třídy
MHC gp I. jsou přítomny na všech jaderných buňkách organizmu. MHC gp II. pouze na buňkách předkládajících antigen
T buněčný receptorový komplex je tvořen proteiny rozeznávajícími antigen a invariantními signálními proteiny, které zajišťují jeho signální funkci (ITAM = Immunoreceptor tyrosine-based activation motif)
Vývoj T lymfocytů • T lymfocyty se vyvíjejí podobně jako B • Prekurzory T buněk migrují z kostní dřeně do thymu, kde probíhá přeskupení genů kódujících TCR • a:b T receptory jsou podrobeny pozitivní a negativní selekci • Buňky, které přežily (2-4%), opouštějí thymus a migrují do periferních lymfoidních orgánů
Buněčná organizace thymu
Epiteliální buňky thymu tvoří síť obklopující vyvíjející se thymocyty
Během vývoje v thymu u thymocytů probíhají změny v expresi povrchových molekul, podle toho je možno rozlišit určitý stupeň jejich vývoje (pT=pre T cell receptor)
Thymocyty v různém stupni vývoje se nacházejí v různých částech thymu
Vývoj T lymfocytů v thymu • Do thymu migrují prothymocyty z kostní dřeně • Po první fázi přeskupení genů pro TCR (část b a d) se objeví pre-TCR (obdoba pre-BCR) + CD3 • Ve druhé fázi se přeskupují geny pro TCRa a poté vzniká definitivní TCR, složený z a a b řetězců + CD3
Vývoj T lymfocytů v thymu • POZITIVNÍ SELEKCE : • Probíhá v kortexu přežívají pouze ty buňky, které dokážou vázat vlastní MHC proteiny (asi 10-30%) • Tyto buňky pak exprimují buď CD4 nebo CD8, podle toho, váže-li příslušný TCR MHC I. nebo II. třídy
Vývoj T lymfocytů v thymu • NEGATIVNÍ SELEKCE: • Probíhá v kortiko-medulární části • Jsou eliminovány všechny potenciálně autoreaktivní thymocyty, které vážou svým TCR s vysokou afinitou komplexy MHC molekul s vlastními peptidy, přítomnými v thymu (předkládají je epiteliální buňky a DC)
Receptorová výbava T lymfocytů • Migrace, aktivace i efektorové funkce jsou závislé na buněčných interakcích zprostředkovaných adhezivními molekulami: • Selektiny (lymphocyte homing) • Integriny (adheze ke sliznicím) • Imunoglobulinová skupina (interakce lymfocytů navzájem)
Vstup lymfocytů z krve do lymfatických uzlin vyžaduje působení adhezivních molekul a chemokinů
Receptorová výbava T lymfocytů • Skupina selektinů: • Obsahuje tři strukturně příbuzné adhezivní receptory označované podle typů buněk, na kterých se vyskytují • L – leukocytární • E – endoteliální • P – platelet, trombocytární
L-selektiny a vaskulární adresiny
Integriny zajišťují adhezi T lymfocytů k endotelu nebo sliznici
Imunoglobulinová skupina adhezivních molekul zajišťuje interakce lymfocytů – váže se na adhezivní molekuly různých typů, včetně integrinů, jiných členů imunoglobulinové skupiny a lektinů
Lymfocyty z krve vstupují do lymfoidních tkání přes stěny cév • První krok je vazba L-selektinu na GlyCAM-1 a CD34 • Lokální chemokiny (např. CCL21) stimulují chemokinové receptory na T buňkách, což vede k aktivaci LFA-1 • To vede k pevné vazbě T buňky na ICAM1 a k prostupu endotelem • Metaloproteinázy narušují mezibuněčné spoje endotelu a umožňují penetraci
Buňky předkládající antigen (APC)
Nezralé DC pohlcují antigeny ve tkáních (molekuly MHC II jsou obarveny zeleně a lysozomální proteiny červeně)
Po pohlcení antigenu DC migrují do lymfatických uzlin, kde dozrávají a exprimují velké množství komplexů MHC:peptid a kostimulační molekuly
Interakce T lymfocytů s APC • Aby se z klidového T lymfocytu stala aktivovaná buňka, musí se setkat s antigenem na povrchu APC • O udržení kontaktu mezi lymfocytem a APC se starají adhezivní molekuly
Povrchové molekuly z imunoglobulinové skupiny zajišťují interakce mezi lymfocyty a APC. Vazba ICAM-3 : DC-SIGN je specifická pro dendritické buňky.
Přechodné adhezivní interakce mezi T buňkami a APC jsou stabilizovány rozpoznáním specifického antigenu
• Signál 1 je antigen specifický – interakce peptid:MHC s TCR. • Signál 2 je kostimulační – CD80/86 s CD28. • Signál 3 je cytokinový a nasměruje T buňku k diferenciaci na různé funkce
• Naivní T buňky mohou přežívat řadu let jako malé klidové lymfocyty • V případě, že jsou aktivovány, rychle se dělí a vytvářejí klon efektorových T lymfocytů • CD28 – závislá kostimulace aktivovaných T buněk indukuje expresi T buněčného růstového faktoru IL-2 a jeho vysokoafinitního receptoru
Vysokoafinitní IL-2 receptor je složený ze tří řetězců a je přítomen pouze na aktivovaných T buňkách
Aktivované T buňky sekretují a reagují na IL-2 • Klidové T buňky exprimují pouze IL-2 receptor střední afinity • Aktivované T buňky exprimují vysokoafinitní IL-2 receptor (složený ze všech tří subjednotek) a produkují IL-2 • Vazba IL-2 na jeho receptor signalizuje T buňce, že má vstoupit do buněčného cyklu • IL-2 indukuje proliferaci T buněk
Tolerance • Antigen prezentující buňka může T buňku buď aktivovat, nebo inaktivovat • Pokud APC dodá pouze kostimulační signál (signál 2), nestane se nic • Pokud T buňka rozezná antigen bez přítomnosti kostimulačního signálu, je inaktivována • Tento mechanizmus umožňuje indukci tolerance k vlastním antigenům
Tolerance k antigenům vlastních tkání vychází z rozpoznání antigenu bez přítomnosti kostimulace
Nutnost poskytnutí signálu 1 i 2 je podstatná pro zabránění odpovědi proti vlastním antigenům
Efektorové T buňky mohou reagovat na své cílové buňky bez kostimulace Jakmile je naivní T buňka jednou aktivovaná signálem 1 a 2, sekretuje a odpovídá na IL-2 a stane se efektorovou buňkou. Každý další kontakt se specifickým antigenem spustí její efektorové funkce bez nutnosti dalšího stimulačního signálu. Cytotoxická T buňka může takto zabíjet virem infikované cíle, které exprimují pouze peptid:MHC komplex a nedávají kostimulační signál.
Variabilita signálu 3 od APC zajišťuje diferenciaci naivních CD4 buněk do různých efektorových směrů
Úloha efektorových T buněk v buňkami zprostředkované a v humorální imunitní odpovědi k reprezentativním patogenům
Cytotoxické CD8 T lymfocyty • Naivní CD8 T buňky se vyvíjejí do cytotoxických T buněk, které jsou velmi destruktivní • Proto naivní CD8 buňky vyžadují větší kostimulační aktivitu než CD4 • Nejsilnější je kostimulace zralými DC, které poskytují vysokou kostimulační aktivitu • Většina CD8 odpovědí vyžaduje zapojení CD4 T buněk – ty musí rozpoznat stejný antigen na APC
Cytotoxická T buňka indukuje v cílové buňce apoptózu
Subpopulace CD4 T lymfocytů • CD4 T buňky se diferencují do různých subpopulací efektorových T buněk:
Th1, Th2, Th17 a T-regulační Tyto subpopulace jsou definovány na základě sekrece různých cytokinů
Diferenciace CD4 T buněk do Th1 nebo Th2 určuje, jestli převáží humorální nebo buněčná složka
• Th1 buňky mají hlavní úlohu při aktivaci makrofágů: aktivují je hlavně pomocí IFN-g do vysoce mikrobicidního stavu. Ty pak mohou zabíjet intracelulární patogeny. • Naopak Th2 buňky makrofágy inaktivují produkcí IL-10.
Th1 buňky koordinují odpověď na intracelulární patogeny (Mycobacterium, Leishmania)
Různé typy efektorových T buněk produkují různé efektorové molekuly • Th2 buňky jsou specializované na imunitní odpověď proti parazitům a na vznik alergické odpovědi. Poskytují pomoc při aktivaci B buněk a sekretují B buněčné růstové faktory IL-4, IL-5, IL-9 a IL-13. • Subpopulace Th17 podporuje akutní zánět tím, že pomáhá shromažďovat neutrofily do místa infekce
Různé typy efektorových T buněk produkují různé efektorové molekuly
Regulační T lymfocyty • Heterogenní skupina buněk s různým typem vývoje • První skupina se vyvíjí v thymu a označuje se jako přirozené regulační lymfocyty (natural Treg). Exprimují FoxP3. Jejich hlavní funkcí je zabránit autoimunitním reakcím. Při selhání této funkce vznikají autoimunitní syndromy.
Regulační T lymfocyty • Druhá skupina jsou tzv. adaptivní regulační lymfocyty, vyvíjejí se v periferii z naivních CD4 buněk. Je to heterogenní skupina s různými fenotypy a vlastnostmi. Jednou z jejích hlavních skupin je subpopulace Th3, je součástí slizničního imunitního systému. Kontroluje imunitní reakce ve sliznicích a její nedostatek se projevuje autoimunitními poruchami a záněty ve střevě. Produkují IL-4, IL-10 a TGF-b
Regulační T lymfocyty • Další skupinou adaptivních regulačních buněk je subpopulace Tr1, její původ je nejasný • Produkují inhibiční cytokiny IL-10 a TGF-b, ale ne IL-4 (tím se liší od Th3)
Funkce regulačních buněk: - Autoimunitní reakce - Alergie - Protinádorová imunita - Periferní tolerance
Superantigeny • Superantigeny jsou odlišnou skupinou antigenů, která není zpracovávána na peptidy a rozeznávána MHC molekulami, fragmentace superantigenu naopak ničí jeho biologickou aktivitu • Superantigen má dvě vazebná místa: na vnější stranu MHC II molekul a na Vb oblast většiny TCR, (mimo vazebné místo pro antigen) • Bakteriální nebo virové superantigeny: Stafylokokový enterotoxin (syndrom toxického šoku), mitogeny (LPS, rostlinné lektiny), protilátky proti CD3 nebo TCR
Superantigeny • Superantigen propojí MHC gp II na povrchu jakýchkoli APC s TCR přítomnými na povrchu velké části T buněk (až 10% všech) • To dává T lymfocytu signál podobný normálnímu aktivačnímu signálu přes TCR a vede k rychlé aktivaci velkého množství T buněk
Stanovení počtu T lymfocytů • Průtoková cytometrie • Stanovení povrchových molekul CD3 (všechny T lymfocyty), CD4, CD8 • Subpopulace Th1 a Th2, Th17 – měření intracelulárních cytokinů IFN-g a IL-4 a IL17 po aktivaci • Stanovení Treg – intracelulární detekce FoxP3
Funkční testy T lymfocytů • Test blastické transformace – schopnost odpovídat na polyklonální stimuly • Mitogeny: phytohemaglutinin (PHA) Concanavalin A (ConA), Pokeweed mitogen (PWM) • Specifické antigeny: tetanus, candida, PPD, virové antigeny • Měří se inkorporace 3H-thymidinu
Funkční testy T lymfocytů • Modifikace pro průtokovou cytometrii – měří se inkorporace značeného bromodeoxyuridinu do DNA • CFSE – (carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester) fluorescenční barvení cytoplazmy buněk, dá se pak zjistit, kolikrát se buňka rozdělila
Funkční testy T lymfocytů • Stanovení povrchových aktivačních molekul na lymfocytech po aktivaci • Eprese CD69 – časný aktivační marker • Exprese CD25 (a podjednotka IL-2R) • Exprese HLA-DR • Exprese CD71
Cytotoxické testy • Aktivované CD8 T lymfocyty zabíjejí cílové buňky • Zabíjení cílů je možno detekovat různými způsoby • Cílové buňky jsou označeny radioaktivním chrómem – mrtvá buňka chróm uvolní • Cílové buňky jsou značeny fluorochromem a je u nich detekována apoptóza
