Metody separace buněk Funkční testy lymfocytů RNDr. Jan Lašťovička, CSc. RNDr. Daniela Rožková, PhD. Ústav imunologie 2.LF UK a FN Motol
Metody izolace buněk Historické shrnutí - První pokusy kolem r. 1960 Používání fyzikálních charakteristik (hustota) nebo biochemických odlišností (přítomnost specifických enzymů) (např. L-leucin-metylester je toxický pro monocyty s obsahem lysozymů a NK buňky) - 1968 Boyum publikoval metodu separace na hustotním gradientu (FICOLL) - Podobné metody používaly arabinogalaktan (stractan) 1317% - 80. léta – objevují se metody založené na reakci Ag-Ab (panning, komplementová lýza) - Rozetové metody - Adherence makrofágů k plastům, B buňky + nylonová vlna
Separace buněk Výchozí materiál:
Solidní orgán: Tkáň se rozřeže na malé částečky, které se ponoří do kultivačního média. Buňky se rostou v kultivační nádobě. Tkáň se rozvolní na jednotlivé buňky mechanicky homogenizátorem, enzymatickým natrávením (trypsinem, kolagenázou, pronázou, dispázou, elastázou apod.). Krev, kostní dřeň – již rovnou buněčná suspenze Směsné populace buněk – pro funkční testy potřeba izolovat určitý typ buněk od ostatních populací buněk Nádorová tkáň: oddělení nádorových buněk od nenádorových Kostní dřeň: CD34+ kmenové buňky od ostatních buněk Krev: izolace různých typů leukocytů
Principy separace
Podle čeho se separuje
Fyzikální vlastnosti Velikost buněk Hustota (densita) Rychlost sedimentace při centrifugaci
Biologické vlasnosti:
Přirozené schopnosti buněk (adherence buněk na plastik) Povrchová exprese molekul - markerů
Kritéria pro výběr metody
Čistota a výtěžek separace Doba zpracování Finanční náročnost
Typy leukocytů
agranulocyty
granulocyty granulocyty
Diferenciální centrifugace
Částice sedimentují na základě svých sedimentačních koeficientů Sedimentační koeficient závisí na hmotnosti, densitě částice a její interakci s kapalinou
Buňky sedají na dno zkumavky – peletka Vrchní část – supernant
nedochází k dosažení hustotní rovnováhy
Částice (typ buňky) je charakterizována sedimentačním koeficientem – zvolení vhodné centrifugační rychlosti
Centrifugace Výkyvný rotor
Parametry: rychlost rotace (počet otáček za minutu) RPM poloměr centrifugace (vzdálenost od středu rotoru, r).
Výpočet relativní centrifugační síly (RCF):
RCF = 0,00001118 . r .(Q)2 Q = rychlost otáčení (RPM) r = poloměr otáčení (cm)
rychlost rotace
Základní separace krevních složek
Transfuzní stanice Centrifugační rychlost 1500 – 2000 g (3000- 3400 rpm)
Základní složky Červené krvinky Sérum bohaté na destičky Buffy coat – bílé krvinky+ destičky Destičky jsou separovány z vrchní frakce (výtěžek asi 50%) z buffy coatu
Sedimentační vlastnosti buněk Erytrocyty
Trombocyty
Lymfocyty
Granulocyty
počet / uL
5,000,000
230,000
2,500
4,500
poloměr (um)
2.7-2.9
1-1.2
4.5-9
5.0-7.5
Objemový podíl (%)
40-50
0.1-0.2
0.1-0.8
0.2-0.8
Hustota (g/mL)
1.1
1.05
1.06
1.08
Sedimentační koeficient
90-100
4-7
130-530
230-540
Gradientová centrifugace
Zonální centrifugace v hustotním médiu – zóny odpovídají určité hustotě Centrifugace do rovnováhy – buňky se zastaví v zóně, která odpovídá jejich hustotě v různé vzdálenosti ode dna zkumavky různá hustota média – gradient hustoty
Gradient se mění:
Plynule (spojité gradienty) Skokově (nespojité gradienty)
Spojitý gradient : centrifugace na Percollu
částečky oxidu křemičitého potažené polyvinylpyrrolidonem Při vysokých otáčkách se vytvoří gradient Na gradient se navrství vzorek Druhá centrifugace o nižších otáčkách Sběr prstenců
Např. separace monocytů
Nespojitý (diskontinuální) gradient
Navrství se na sebe roztoky o různých hustotách
Poslední vrstvu tvoří buněčná suspenze Buňky zůstanou mezi roztokem s vyšší a nižší hustotou, než je jejich hustota.
Sacharidová média
Sacharidy Složité polysacharidy (Ficoll)
Ficoll-Paque Vodný roztok o hustotě 1.077g/ml , obsahuje 5.7g FICOLL400 a 9g ditrazoátu sodného FICOLL400 - syntetický vysokomolekulární polymer sukrózy a epichlorohydrinu, molekul. váha 400 000
Gradientová centrifugace separace mononukleárních buněk
Mononukleární buňky (PBMC): bílé krvinky vyjma granulocytů
Monocyty (20%), lymfocyty (70%)
Buňky se navrstvují na denzitní médium Ficoll
Promývání buněk
Ve fosfátovém pufru PBS (phosphate buffered saline) izotonický = stejná osmolarita jako přirozené prostředí buněk (krev) Udržuje přirozené Ph = 7,2 – 7,4
Obvykle bez iontů Ca2+, Mg2+
Centrifugace obvykle 300 g (1300 rpm)
Rozpustit v 800 ml of destilované H2O: 8 g of NaCl 0.2 g of KCl 1.44 g of Na2HPO4 · 12H2O 0.24 g of KH2PO4 pH nastavit na 7.4 pomocí HCl – Doplnit destilovanou H2O do 1 litru.
Aferéza
Na centrifugačním přístroji – separátoru jsou odděleny složky krve. Požadovaná složka je odebrána. Ostatní složky se vrací zpět do oběhu pacienta.
Používáno pro separaci, ale též jako léčebná metoda. Terapie: LDL aferéza – odstranění low density lipoproteinu u pacientů s dědičnou hypercholesterolemií Fotoferéza (nádorová onemocnění krve, transplantace) Výměna nebo deplece červených krvinek (talasémie, malárie) Terapeutická výměna plazmy (odstranění autoprotilátek) Darování složek: Plazmaferéza Tromboferéza Leukaferéza
Centrifugační elutriace
umožňuje pomocí speciálního zařízení rozdělit buňky podle rychlosti sedimentace, tj. nejen podle hustoty, ale i objemu. Tato metoda je však technicky mnohem složitější a vyžaduje zvláštní vybavení. Přístroj elutriátor
Odstraňování erytrocytů: hypotonická lýza
Metoda založená na větší náchylnosti erytrocytů k hypotonickému šoku ve srovnání s lymfocyty a ostatními jadernými buňkami Způsobeno rozdílnou stabilitou membrány Osmotická lýza amonium chloridem 0,84%, různé protokoly s použitím destilované vody nebo lyzačních roztoků. Inkubace 15-30s (voda) nebo cca 10 min (speciální roztoky), pak zpět do izotonického prostředí a promýt Použití hlavně při přípravě vzorků pro průtokovou cytometrii: Značení protilátkami v plné krvi Lýza erytrocytů Promytí Měření na cytometru a analýza.
Separace monocytů pomocí adherence na plastové povrchy
Monocyty mají přirozenou schopnost adherovat na povrch kultivačního plastiku Buňky se nechávají adherovat několik hodin Lymfocyty a ostatní mononukleární buňky zůstávají plovoucí v médiu Čistota separace : kolem 70 – 80% Účinnost separace: méně než 50%
Výhody: finančně nenáročné Nevýhody:
prodloužená doba separace Variabilita mezi dárci
Membránové znaky imunocytů Molekuly antigenů a epitopy na povrchu imunocytů jsou popsány a tříděny od r. 1980 CD (Cluster of Differentiation) V současnosti definováno 339 znaků
Separace populací leukocytů na základě povrchových znaků
Pozitivní separace: marker použitý k separaci je přítomen na izolovaných buňkách
CD14+ monocyty CD4+ lymfocyty
Negativní separace/ Deplece: odstranění určitého typu buněk
Kombinace obou přístupů: izolace složitěji definované populace
Čistota separace: většinou nad 90% Čistota vs. výtěžek
Separace populací leukocytů na základě povrchových znaků – typy separací
Tvorba shluků s červeným krvinkami – rozety: Klasická izolace T lymfocytů Rozety vytvořené pomocí protilátek – komerční kity
Imunomagnetická separace – komerční kity
Sortování buněk pomocí průtokové cytometrie
Separace pomocí tvorby rozet
Založeno na přítomnosti specifických receptorů na T a B lymfocytech Lidské T lymfocyty exprimují molekulu CD2 – receptor pro SRBC (tzv. E-rozety) B lymfocyty exprimují molekulu LFA-3 a vážou myší erytrocyty (tzv. M-rozety) Rozety jsou vidět pod mikroskopem jako lymfocyt obklopený erytrocyty SRBC můžeme pak odstranit hypotonickou lýzou Pomocí gradientové centrifugace můžeme buňky s navázanými erytrocyty separovat
Rozety vytvořené vazbou protilátek
Používáno pro negativní separaci, zahušťování populace Na červených krvinkách vazba protilátky na glykoforin A Princip separace Separace CD4 lymfocytů
Separační techniky s použitím monoklonálních protilátek Panning – protilátka je navázána na plastový povrch (nevýhodou je velká spotřeba protilátek) Imunoafinitní separace Selekce pomocí magnetického pole (MACS) Selekce průtokovou cytometrií (FACS)
Imunoafinitní separace
Protilátka je navázána na nosič
Vlastnosti nosiče (magnetismus nebo hustota) umožní separaci protilátkou označených buněk Často využíván princip sloupcové chromatografie
Marker buněčné populace
nosič Cell
Protilátky jsou připojené ke kuličkám
Výhody: vysoká čistota a výtěžek Nevýhody: časová a finanční náročnost
Protilátka specifická pro buněčný marker
Magnetická separační kolona Po inkubaci s magnetickými partikulemi buňky procházejí kolonou umístěnou v silném magnetickém poli Magneticky označené buňky jsou zadrženy v koloně a odděleny od neznačených buněk Po vyjmutí kolony z magnetického pole jsou zadržené buňky vymyty Obě populace jsou použitelné k dalším experimentům
Imunomagnetická separace
Naznačení buněk protilátkami s navázanými magnetickými partikulemi
Kolonka v magnetickém poli. Buňky s navázanou protilátkou zůstávají v kolonce. Promytí.
Kolonka se odstraní z magnetického pole. Buňky s navázanou protilátkou se vymyjí z kolonky
Pozitivní separace • vyšší čistota separace • na vyizolovaných buňkách jsou navázány protilátky, které mohou ovlivnit vlastnosti buněk ve funkčních testech
Imunomagnetická separace
Naznačení nechtěných populací buněk protilátkami s navázanými na magnetické partikule
Kolonka v magnetickém poli. Buňky s navázanou protilátkou zůstávají v kolonce. Neoznačené buňky (požadovaná populace) se vymyjí do nové zkumavky.
negativní separace - vyizolované buňky jsou „untouched“
Separační kolona MiniMACS
MACS – automated Magnetic Cell Sorting Magnetické mikropartikule konjugované s monoklonálními protilátkami, komerční soupravy k izolaci libovolné buněčné subpopulace Buňky lze izolovat za 40 min přímo z plné krve, čistota 95-98% Rychlost metody až 10 mil buněk za vteřinu Kompatibilita s průtokovou cytometrií – fluorescenční i magnetické značení lze provádět zároveň
MACS – Automated Magnetic Cell Sorting
FACS – Fluorescence Activated Cell Sorting Průtoková cytometrie je standardní metoda pro analýzu buněk v suspenzi Buňky jsou označené monoklonální protilátkou s navázaným fluorochromem Když buňka prochází detektorem, je pomocí elektrického výboje vychýlena ze své dráhy a nasměrována do sběrné zkumavky Vysoká čistota separace – až 99% Zisk cca 50 000 buněk za vteřinu
Sortování buněk průtokovou cytometrií
Průtoková cytometrie
Umožňuje velmi přesně definovat populaci pomocí vhodné kombinace protilátek Vysoká čistota
Nevýhody: časově náročné Ovlivnění životnosti buněk Obtížné zajištění sterility Nízké výtěžky
HODNOCENÍ SPECIFICKÉ BUNĚČNÉ IMUNITY Je nutné pro efektivní diagnostiku: primárních imunodeficiencí sekundárních imunodeficiencí (infekce, malnutrice, trauma, nádory, účinky terapie)
autoimunitních imunopatologických nemocí ZÁKLADNÍ KLINICKÉ PROJEVY PORUCH SPECIFICKÉ BUNĚČNÉ IMUNITY opakované infekce plic, GIT, kůže virové infekty intracelulární bakterie (M.tuberculosis) oportunistické infekce (r. Candida, Pneumocystis carinii)
DIAGNOSTICKÉ LABORATORNÍ POSTUPY JSOU KOMPLEXNÍ
jsou navrhovány na základě podrobného klinického
vyšetření jsou hodnoceny v kontextu klinického stavu ZÁKLADNÍ TESTY:
- počet leukocytů, dif. KO, abs. počty VÝBĚROVÉ TESTY:
- vlastní imunologické vyšetřovací metody
I)
KOŽNÍ TESTOVÁNÍ:
intradermální aplikace anamnestických na thymu závislých antigenů mikrobiálního původu ANAMNESTICKÉ AG:
předpokládá se předchozí kontakt přirozená expozice: candidin, toxoplasmin umělá expozice = aktivní imunizace (tetanový toxoid)
INDURACE po 48 hodinách (reakce pozdní přecitlivělosti) histologicky infiltrace CD4+ T lymfo a makrofágy INTERPRETACE:
pozitivita = neporušená T buněčná imunita negativita = anergie
II) EX VIVO LABORATORNÍ TESTY
kvantifikace počtu buněk imunitního systému (krev, jiné tekutiny a tkáně)
funkční testy
KVANTIFIKACE BUNĚK IMUNITNÍHO SYSTÉMU
NĚKDY VYŽADUJE SEPARACI BUNĚK
Druhy lymfocytů a jejich funkce
CD8+
• • • •
B lymfocyty: produkce protilatek (neutralizace mikrobů, aktivace komplementu), fagocytóza CD4+ Th lymfocyty: aktivace makrofágů, pomoc CD8+ a B lymfocytům CD8+ Th lymfocyty: zabíjení infikovaných buněk, NK buňky (natural killer): zabíjení infikovaných buněk, nádorových b.
Funkční testy lymfocytů
Stimulace směsné populace (PBMC) nebo izolovaných populací
Sledování:
Proliferace ( T lymfocyty) produkce protilátek (B lymfocyty) produkce cytokinů (T lymfocyty) cytotoxicity (CD8+ buňky, NK buňky)
in vitro kultivace kultivační media (růstové faktory, cytokiny) CO2 atmosféra
Stimulační agens ve funkčních testech
Aktivace specifickým antigenem:
proteinový (tetanus – PPD) Polysacharidový (pneumokok)
Aktivace nespecifickým mitogenem
polyklonální aktivátory Často lektiny - specifická vazba na membránové cukry
charakter
Aktivace T buněk
Aktivace B buněk
phytohaemagglutinin (PHA)
rostl. lektin
ano
ne
concanavalin A (conA)
rostl. lektin
ano
ne
lipopolysacharid (LPS)
složka stěny G- bakterií
ne
ano
rostl. lektin
ano
ano
Myší protilátka
ano
ne
Nízkomol. aktivátory sign. drah
ano
ano
Název
pokeweed mitogen (PWM) Protilátka proti CD3 PMA + ionomycin
PŘIROZENĚ CYTOTOXICKÉ BUŇKY – IN VITRO DIAGNOSTIKA heterogenní populace usmrcují buňky infikované viry, infekční agens a nádorově transformované buňky nejdůležitější populace jsou NK buňky NK BUŇKY: CD56+ (NCAM-1)
Aktivita NK buněk:
• je testována lytická aktivita NK buněk • terčová linie je označena radioaktivním Cr • suspenze označených terčových buněk je smíchána s izolovanými PBMC (obsahují NK buňky) • během inkubace jsou terčové buňky lyzovány a do supernatantu se uvolňuje radioaktivní Cr • uvolněná radioaktivita je funkcí NK cytotoxicity
