Cytometrické metody pro stanovení proliferace lymfocytů RNDr. Jan Lašťovička, CSc. Ústav imunologie 2.LF UK a FN Motol
Funkční testy lymfocytů
• Stanovení proliferace lymfocytů • Schopnost lymfocytů reagovat na antigen • Důležité pro diagnostiku imunodeficitů i pro výzkum
• Fáze aktivace, mitóza, klonální expanze
Aktivace lymfocytů • Specifické antigeny (tetanus, varicella, pneumococcus, candida apod.) • Nevýhoda stimulace jen malého množství specifických lymfocytů • Polyklonální aktivátory – stimulují nezávisle na specifitě TCR • Polyklonální mitogeny Mitogen
Odpovídající populace
Phytohemaglutinin (PHA)
T lymfocyty
Concanavalin A (ConA)
T lymfocyty
Pokeweed mitogen (PWM)
T i B lymfocyty
Lipopolysacharid (LPS)
B lymfocyty
Superantigeny • proteiny se dvěma vazebnými místy – pro MHC gp II a druhé pro vnější stranu Vβ regionu TCR
•
superantigen je specifický pro jeden až několik různých Vβ domén, kterých je 20-50
• superantigen tak může aktivovat 1-20% T lymfocytů • polyklonální mitogeny spouštějí v zásadě stejné reakce jako antigeny
• podobný efekt dosáhneme protilátkami proti TCR nebo CD3
Cytometrické metody detekce proliferace • Měření povrchových aktivačních markerů (CD69, CD71, CD25, HLA-DR) • Kvantifikace vznikajících blastů v procesu blastické transformace • Kvantifikace celkové DNA (PI, EB) • Měření intracelulárních aktivačních markerů (Ki-67) • Inkorporace značených prekurzorů do nově syntetizované DNA (thymidin, BrdU, EdU,)
• Obarvení cytoplazmy nebo membrány buněk (CFSE, Oregon Green, CellVue® Claret apod.)
Blastogeneze lymfocytů
Intracelulární změny a přeměna klidových lymfocytů na lymfoblasty: T buněčné blasty jsou velké lymfocyty s výrazným objemem cytoplazmy
FASCIA • Flow Cytometric Assay of specific cell-mediated immune response in
• •
• • •
activated whole blood Kvantifikuje blasty vznikající při aktivaci lymfocytů Development and evaluation of a flow-cytometric assay of specific cell-mediated immune response in activated whole blood for the detection of cell-mediated immunity against varicella-zoster virus. Svahn A, Linde A, Thorstensson R, Karlen K, Andersson L, Gaines H. J Immunol Methods. 2003 Jun 1; 277(1-2):17-25. Heparinizovaná krev zředěná médiem 1:8 + mitogeny Kultivace 3-7 dní Značení CD3, CD4, CD8, lýza erytrocytů a měření
Měří se BD Trucount a vypočítá se absolutní počet proliferujících buněk/ml Možnost multiplexu s povrchovými znaky
Nestimulované, 72 h kultivace
PHA, 72 h kultivace
Měření celkové DNA • • • • • • •
etidium bromid, propidium jodid, hexidium jodid tzv. interkalační barviva s červenou fluorescencí barvivo se vmezeří mezi páry bazí dvojité šroubovice DNA nejsou specifická pro DNA, proto vyžaduje použití RNAzy barvení předchází permeabilizace buněk (-20oC) nedává informaci o nově syntetizované DNA, nekoreluje s 3H-thy Development of a propidium iodide fluorescence assay for proliferation and cytotoxicity assays. Dengler W.A., Anti-Cancer Drugs 09/1995; 6(4):522-32
Ki-67
• Proliferating cell associated protein • Jaderný protein – role v regulaci buněčného dělení • Intenzivně studovaný v souvislosti s proliferací nádorových buněk • Exprimovaný během všech aktivních fází buněčného dělení • Není exprimovaný v klidové fázi • Specifický a kvantitativní indikátor proliferace • Korelace s BrdU 0,80 – 0,93 • Korelace s Oregon green 0,94 -0,98 (Soarez et al., 2010)
Ki-67
• Výhody: jednoduché provedení • k buňkám v kultuře se nic nepřidává • celkem levná varianta • značení buněk – běžný intracelulární protokol • možnost současného stanovení dalších antigenů
Biolegend anti Ki67 – APC Lymfocyty 72 h s PHA
CD3+
NS
PHA CD4+
Komerční reagencie anti-human Ki-67 Antibody
• BioLegend (www.biolegend.com)
• (AF488, AF647, APC, BV421, BV510, BV605, BV711, Pacific Blue, PE, PECy7, PerCP-Cy5.5)
• BD Pharmingen (www.bdbiosciences.com)
• (AF488, AF555, AF647, AF700, FITC, PE-Cy7, PerCP-Cy5.5)
Inkorporace 3H-thymidinu • Zlatý standard detekce proliferace, používá se od r. 1953 • Metoda s vysokou citlivostí • Inkorporace značeného thymidinu se měří na β-counteru, výsledek v cpm
• Typické hodnoty nestimulovaných lymfocytů ~1.300 cpm • Stimulované lymfocyty (PHA) ~100.000 cpm • Stimulační index (stimulované/nestimulované) • U zdravých dárců SI nad 50 • Výsledky jsou relativní – ke zdravé kontrole
Bromodeoxyuridin (BrdU)
• 5-bromo-2-deoxyuridin – syntetický nukleotid, analog thymidinu
• Inkorporace do nově syntetizované DNA dělících se buněk (během S fáze)
• Substituce thymidinu • Značení BrdU protilátkou vyžaduje permeabilizaci buněk a denaturaci DNA (kyselina, teplo, nukleáza apod.)
BrdU
• Na posledních 2-24 h ke kultuře přidáme BrdU (18µg/ml, Sigma) • Buňky harvestujeme a označíme povrchové antigeny • Denaturace a permeabilizace: 70% etanol, deoxyribonukleáza, Tween20 • Anti-BrdU značená protilátka • Poměr BrdU pozitivních k celkovému počtu buněk • Dobrá korelace s inkorporací 3H-thymidinu (r=0,934 pro ConA)
BrdU • Nevýhoda: nešetrný protokol pro denaturaci DNA může mít za následek destrukci buněčné morfologie a antigenních determinant, na které se váže protilátka
• Kity s DNAzou jsou relativně drahé (cca 25.000.-Kč/100 testů) • Varianta ELISA – levnější (16.700.-Kč/1000 testů)
Komerční reagencie SIGMA (www.sigmaaldrich.com) • 5-Bromo-2′-deoxyuridine, 100mg (496.-Kč) Anti BrdU protilátky: • BioLegend (www.biolegend.com) • eBioscience (www.ebioscience.com)
• BrdU Staining Kit for Flow Cytometry (APC, PE, FITC) 24.900.-Kč • Abcam (www.abcam.com) • Serotec (www.abdserotec.com) • FITC, AF647, AF488, PE, APC (cca 12.000.-Kč/100 testů)
EdU (5-ethynyl-2´deoxyuridine)
• novější alternativa k BrdU • detekce je založena na tzv. „click“ reakcí mezi azidem a alkenovou skupinou
• alkenová skupina je obsažena v ethynylu • azid je konjugován s Pacific Blue, AF647 nebo AF488 • nízké pozadí, vysoká citlivost
Struktura analogů nukleosidu
Ethynyl dU
Brom dU www.lifetechnologies.com
Princip click reakce Click značení nevyžaduje denaturaci DNA
Fluorochrom s azidem reaguje s alkenovou skupinou na dsDNA EdU vestavěný do DNA
www.lifetechnologies.com
EdU protokol
• Přidáme EdU do buněčné kultury, inkubace (2-24h) • Buňky harvestujeme • naznačíme protilátkami proti povrchovým antigenům dle potřeby (nelze použít PE)
• Inkubujeme 15 min s fixačním roztokem, promyjeme • Inkubujeme 15 min s permeabilizačním roztokem, promyjeme • Inkubujeme 30 min s reakčním pufrem, promyjeme • Měříme na cytometru
NS PHA
Komerční soupravy Invitrogen (Life Technologies) www.lifetechnologies.com
• Click-iT® EdU Alexa Fluor® 488 Flow Cytometry Assay Kit • Click-iT® EdU Alexa Fluor® 647 Flow Cytometry Assay Kit • Click-iT® EdU Pacific Blue™ Flow Cytometry Assay Kit • Cena 12.700.-Kč / 50 testů
Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester (CFDA-SE) CFSE
MW=557
Používán od roku 1994 Lipofilní molekula, která je minimálně fluorescenční, dokud není transportována do buňky Do buňky proniká pasivní difuzí V buňce esterázy štěpí acetylové skupiny a molekula se stává výrazně fluorescenční Succinimidyl ester se váže kovalentně k volným aminoskupinám na makromolekulách v cytoplazmě Nenavázaný zbytek se z buňky vyloučí
CFSE Komplexy CFSE zůstávají v buňce během celého vývoje a dělení – detekováno ještě po 8 týdnech Polovina CFSE se dostává do dceřiných buněk při každém dělení nebo při buněčné fúzi CFSE není předáváno okolním buňkám v kultuře WANG et al.,2005
CFSE CFSE
4 h1
Doba kultivace 24 h
5µM
95%
53%
33%
28%
2.5µM
97%
90%
85%
84%
0.5µM
95%
90%
89%
88%
0.05µM
94%
93%
92%
90%
0 (blank)
97%
95%
93%
92%
koncentrace
48 h
72 h
Stanovení životnosti lymfocytů trypanovou modří - třídenní kultivace Garza et al., 2011
Doporučené koncentrace: Výrobce (Invitrogen): 5µM 2,5µM (Garza et al., 2011)
Excitace
Emise
CFSE
492
517
FITC
495
519
Cell Trace Violet
405
450
Pacific Blue
403
455
CellVue Claret
655
675
PerCP
490
678
CFSE protokol - lymfocyty
• Celá řada modifikací barvícího postupu • Lymfocyty v 1 ml PBS (nesmí obsahovat sérum), minimálně 5.106 • přidáme CFSE (několik µl podle požadované koncentrace) • Inkubace 15 minut za občasného míchání • Přidáme 4 ml PBS s 2% FCS • Promyjeme 3x (poslední promytí v komplet. médiu) • Spočítáme buňky a naředíme na koncentraci 1 - 2.106
% divided
Kultivace 72 h PBMC
Vyhodnocení
• Proliferující frakce: procento buněk, které se rozdělí jednou nebo vícekrát
• % buněk nebo MFI populace, SI • Nezajímá nás, kolikrát se buňka rozdělí, ale kolik vznikne nových buněk
• Srovnáváme pacienta se zdravou kontrolou • Frekvence prekurzorů: procento rodičovské populace, které odpovídá na mitogenní stimulaci
Komerční soupravy • • • • • •
•
Life Technologies (Invitrogen) www.lifetechnologies.com CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit - For Flow Cytometry (4.850.-Kč/100-1000 testů) CellTrace™ Violet Cell Proliferation Kit, for flow cytometry (8.390.-Kč/100-1000 testů)
ABCAM www.abcam.com CFSE - Cell Labeling Kit (8.400.-Kč) eBioscience www.ebioscience.com CFSE
Cell Proliferation Dye eFluor® 450 Cayman Chemicals www.caymanchem.com CFSE Cell Division Assay Kit SIGMA (www.sigmaaldrich.com)
CellVue® Claret Far Red Fluorescent Cell Linker Mini Kit (5.200.-Kč/10 testů)
Ekonomické hledisko Metoda
Cena Kč/test
FASCIA
0
Propidium jodid CFSE CellTrace™ Violet
9 5-50 8-80
BrdU ELISA * Ki-67 3H-thymidin * FASCIA s BD® Trucount
50 130 140 230
BrdU
250
EdU CellVue® Claret
250 520
*Stanovení v tripletech Ceny nezahrnují náklady na izolaci a kultivaci buněk
