SZENNYVÍZISZAP-ROTHASZTÓ MIKROBA-

Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi Kar Biológia Doktori Iskola Kísérletes Növénybiológia Doktori Program

TAUBER TAMÁS

SZENNYVÍZISZAP-ROTHASZTÓ MIKROBAKÖZÖSSÉGEK VIZSGÁLATÁNAK OPTIMALIZÁLÁSA doktori értekezés Témavezetı: DR. TÓTH ERIKA egyetemi adjunktus (ELTE Biológiai Intézet Mikrobiológiai Tanszék) A Biológia Doktori Iskola vezetıje:

A Kísérletes Növénybiológia doktori program vezetıje:

PROF. DR. ERDEI ANNA tanszékvezetı egyetemi tanár (ELTE Immunológiai Tanszék)

PROF. DR. SZIGETI ZOLTÁN tanszékvezetı egyetemi tanár (ELTE Növényélettani és Molekuláris Növénybiológiai Tanszék)

Készült az ELTE TTK Mikrobiológiai Tanszékén Budapest 2013 1

KÖSZÖNETMONDÁS Doktori dolgozatom megírásának végeztével köszönettel tartozom mindenek elıtt témavezetımnek, Dr. Tóth Erikának, akinek az ELTE Mikrobiológiai Tanszékén eltöltött tíz évem során mindvégig számíthattam idıt és erıt nem kímélı segítségére, olyankor is, amikor mindkettıbıl kevés volt neki. Nem kevésbé tartozom köszönettel szüleimnek, akik mindig feltétel nélkül támogattak, nem csak az utóbbi, doktori munkával eljegyzett éveimben, hanem születésemtıl kezdve mindig mindenben. Köszönetet mondok továbbá Dr. Márialigeti Károlynak, az ELTE Biológiai Intézet Mikrobiológiai Tanszéke vezetıjének, hogy lehetıvé tette doktori munkám elvégzését tanszékén, ahol egy inspiráló tudományos közösség tagja lehettem. Köszönöm Dr. Erdei Annának és Dr. Szigeti Zoltánnak, hogy lehetıvé tették számomra a Kísérletes Növénybiológia doktori programban való részvételt. Hálás vagyok a diplomamunkájukat az én szárnyaim alatt végzı hallgatóknak a sok pótolhatatlan segítségért és élményért. İk Pechál Nikolett, Czigler András és Wirth Balázs. Köszönöm a Mikrobiológiai Tanszék minden egykori és jelenlegi munkatársának, akiket megismertem az évek során, hogy kedves segítıkészségükre mindig számíthattam, és hogy egy jó hangulatú, emberileg is építı közösségbe tartozhattam velük. Közülük is kiemelném a velem egészen vagy közel „egyívású” munkatársaimat, Vajna Balázst, Felföldi Tamást, Palatinszky Mártont, Homonnay Zalánt, Pór Tamást, Táncsics Andrást, Póhner Zsuzsát, Hajdu Kingát (huh), Bohus Veronikát, Kéki Zsuzsit és azokat, akikkel – a tanszéken, vagy csak annak környékén – különösen szoros és értékes munkakapcsolatban dolgozhattam együtt: Berta Brigittát és Szabó Zsoltot. Különösen is szívesen gondolok azokra az idıkre, amikor egy tanszéken dolgoztunk Cech Gáborral, Vladár Péterrel, Török Györggyel. Köszönet illeti rajtuk kívül a legkülönfélébb területeken és formában nyújtott fontos segítségekért Simka Ágnest, Balogh Lajosné Anikót, Tóth Margitot, Romsics Csabát, Nagymáté Zsuzsát, Sipos Ritát, Révész Sárát, Nikolausz Marcellt, Kovács Józsefet, Barkács Katalint, Kıhler Artúrt, Pestovics Ágit, Oporné Fodor Máriát. Legvégül pedig köszönöm minden valahai nevelımnek és oktatómnak, akik az évek során nagyban hozzájárultak mindahhoz, ami lettem. Közülük is kiemelendı Hajdú Judit, dr. Fóti János, Janzsó Márton, Dr. Balázs Istvánné, Dr. Tóth Béláné, Molnár-Fritsch László, Hiszékeny Ildikó, Dr. Rékási József, Pintér Ambrus OSB, Vásárhelyi Anzelm OSB, Varga Mátyás OSB. Köszönet mindnyájuknak!

2

TARTALOM TARTALOM..................................................................................................................... 1 I. BEVEZETÉS ................................................................................................................. 3 II. IRODALMI ÁTTEKINTÉS ........................................................................................ 6 II. 1. A metanogenezis megismerésének rövid története.................................................. 6 II. 2. A biogáztermeltetés rövid története ..................................................................... 7 II. 3. Szerves anyagok anaerob lebontásának metanogén útja...................................... 8 II. 4. A metántermelést végzı baktériumközösségek tagjai ....................................... 17 II. 5. A Biogáztermelés a gyakorlatban ...................................................................... 23 II. 6. A biogáztermelı közösségek mikrobiológiai vizsgálómódszerei ...................... 28 II. 6. 1. A módszercsoportok általános és történeti áttekintése .............................. 28 II. 6. 2. Kemotaxonómia a közösségvizsgálatokban............................................... 33 II. 7. Kis hozamú gázforrások termelésének volumetriás mérése a szakirodalomban 41 II. 8. Módszerfejlesztésünk elızményei ..................................................................... 43 III. CÉLKITŐZÉS .......................................................................................................... 45 IV. ANYAG ÉS MÓDSZER .......................................................................................... 46 IV. A. Új módszer kidolgozása kis produkciójú gázforrások hozamának volumetriás mérésére ...................................................................................................................... 46 IV. A. 1. A módszer és az eszközök leírása............................................................ 46 IV. A. 2. A "buborékoltató" eszköz ........................................................................ 46 IV. A. 3. Buborékszámlálás szoftver segítségével.................................................. 47 IV. A. 4. A módszer validációjának és további tesztelésének eszközei ................. 51 IV. B. Biogáztermelı szennyvíziszap-rothasztók mikrobiológiai vizsgálata ............. 53 IV. B. 1. A vizsgált reaktorok ................................................................................. 53 IV. B. 2. Az elvégzett kísérletek és a mintavételezések ......................................... 55 IV. B. 3. Az alkalmazott módszerek rövid áttekintése ........................................... 57 IV. B. 4. A lipidek preparálása ............................................................................... 57 IV. B. 5. A respiratorikus kinonok analízise........................................................... 59 IV. B. 6. A foszfolipid-zsírsavak származékoltatása és analízise........................... 61 IV. B. 7. DNS-izolálás a mintákból ........................................................................ 62 IV. B. 8. A vizsgált génszakaszok felszaporítása PCR-rel ..................................... 62 IV. B. 9. Klónkönyvtárak létrehozása..................................................................... 63 IV. B. 10. A klónok csoportosítása Amplifikált Riboszomális DNS Restrikciós Analízis (ARDRA) segítségével ............................................................................. 64 IV. B. 11. T-RFLP analízis ..................................................................................... 64 IV. B. 12. DGGE .................................................................................................... 65 IV. B. 13. Sávok kivágása a DGGE gélbıl és újbóli felszaporításuk..................... 66 IV. B. 14. Bázissorrend-meghatározás ................................................................... 66 IV. B. 15. Az adatok kiértékelése ........................................................................... 67 V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK ..................................................................... 69 V. A. Új metódus kidolgozása kis produkciójú gázforrások hozamának volumetriás mérésére ...................................................................................................................... 69 V. A. 1. A módszertesztelés eredményei ................................................................ 69 V. A. 1. 1. Az eszköz kalibrálása ismert standard gázforrás ellenében .............. 69 V. A. 1. 2. Tesztelés bioreaktorokon .................................................................. 69 V. A. 2. A módszertan és a módszertesztelési eredmények értékelése .................. 73 V. A. 2. 1. Módszerünk elınyei és korlátai ........................................................ 73 V. A. 2. 2. A teszteredmények értékelése ........................................................... 75 1

V. A. 2. 3. A módszerfejlesztés lehetıségei ....................................................... 77 V. B. Biogáztermelı szennyvíziszap-rothasztók mikrobiológiai vizsgálata .............. 78 V. B. 1. Mezofil és termofil félüzemi rothasztók mikrobiótájának vizsgálata ....... 78 V. B. 1. 1. A mezofil és termofil rothasztókból nyert eredmények .................... 78 V. B. 1. 2. A mezofil és termofil rothasztókból nyert eredmények értékelése ... 81 V. B. 2. Könnyen bontható szubsztrátok adagolásának vizsgálata laboratóriumi modell-rendszerben................................................................................................. 83 V. B. 2. 1. Könnyen bontható szubsztrátok adagolásának eredményei .............. 83 V. B. 2. 2. Könnyen bontható szubsztrátok adagolásának értékelése................. 88 V. B. 3. Mezofilról termofil hımérsékletre való felfőtés mikrobiológiai hatásának vizsgálata félüzemi reaktorokon, s a markerek korrelációs megfeleltetési stratégiájának kidolgozása ...................................................................................... 91 V. B. 3. 1. Mezofilról termofil hımérsékletre való felfőtés eredményei............ 91 V. B. 3. 2. A mezofilról termofil hımérsékletre való felfőtéses kísérlet értékelése .......................................................................................................................... 105 V. B. 3. 3. A markerek korrelációs megfeleltetési stratégiájának kidolgozása 110 VI. ÖSSZEFOGLALÁS ............................................................................................... 132 VII. SUMMARY .......................................................................................................... 134 VIII. IRODALOMJEGYZÉK....................................................................................... 136 FÜGGELÉK ............................................................................................................... I-VII

2

I. BEVEZETÉS

I. BEVEZETÉS A metántartalmú biogáz termeltetése az egyik legszerencsésebb találkozása tudománynak, technológiának és sürgıs megoldáskeresésünknek a fogyasztói társadalmak keltette környezeti krízissel kapcsolatban, mely utóbbi vitathatatlanul korunk egyik legégetıbb problémája. A hulladékból energiát és biztonságos talajjavító adalékot elıállító folyamat hátterében baktériumok összetett közösségeinek fáradhatatlan munkája áll, így nyilvánvaló, hogy e mikrobiális folyamatok tanulmányozása a biogáztermelı rendszerek hatásfoknövelésének és javuló kiszámíthatóságának ígéretét hordozza. Az ELTE Mikrobiológiai Tanszékén folyó mikrobiális ökológiai munkák részeként 2005-ben megkezdıdött a szennyvíziszap-rothasztás mikrobiológiájának kutatása, melynek kezdetektıl részese lehettem, s az ebben végzett munkáim alkotják jelen értekezésem tárgyát. A mikrobiális ökológia alapkérdései egyszerőek: mely szervezetek alkotják a vizsgált közösséget, milyen mennyiségben vannak jelen, mi a szerepük az adott ökoszisztémában, illetve milyen kölcsönhatásban állnak egymással és élettelen környezetükkel. A válaszkeresés gyakorlati síkján azonban már számottevı bonyodalmakkal kell szembenéznie a kutatónak. Nem csak gyakorlati szinten nehéz megközelíteni, elkülöníteni, láthatóvá tenni a tılünk oly távoli mérettartományokban létezı apró szervezeteket, hanem az elvi megközelítés számára is hiányoznak az egyértelmő és könnyen kezelhetı határozóbélyegek, csakúgy mint az abundanciát, élettani állapotot, metabolikus kapacitást, kölcsönhatásrendszerbéli pozíciót egyértelmően tükrözı karakterek. Külön-külön ugyan mindegyikre vannak kidolgozott vizsgálati módszereink, így a taxonómiai hovatartozásra a megfelelı kronométergének (leginkább a 16S rRNS-gén) szekvenciái, abundanciaviszonyokra a kemotaxonómiai markermolekulák, élettani karakterek felvételére a legkülönfélébb élettani-biokémiai tesztek vagy aktivitás-vizsgálatra a funkciógének hírvivı RNS-einek kimutatása. Amikor azonban egy – bakteriális méretek viszonylatában – tengernyi anyagi massza (értsd: mikrobiológiai minta) heterogén és komplex rendszerében kívánunk tájékozódni ezek segítségével, eredményeink értelmes összképpé illesztése sokszor igen komoly kihívást jelent. Ennek oka egyrészt a mikrokörnyezetek létébıl fakadó kiküszöbölhetetlen mintázási hibákban, a komplexitás különbözı módszerek nyújtotta vetületeinek eleve nehéz összeilleszthetıségében, valamint a láthatóvá tételi procedúrák (preparálás, tisztítás, tenyésztés, molekulaamplifikáció, mérés stb.) során adódó százféle hibalehetıségben sejthetı. Mindennek ellenére a környezetmikrobiológus nekigyürkızik a munkának, és a módszertani korlátok tisztességes figyelembevételével igyekszik megválaszolni a felmerülı kérdéseket. A válaszkeresésben mindenképpen érdemes egyszerre több módszer információira támaszkodnia, még akkor is, ha néha úgy jár, mint az, akinek több óra van a kezén, ezért nem tudhatja ponto-

3

I. BEVEZETÉS

san, mennyi az idı. Mivel minden óra pontatlan valamelyest, hosszú távon így jobban jár, mintha feltétel nélkül ráhagyatkozna valamelyikre. Fontos és elfogadott törekvés tehát a különféle vizsgálati módszerek egyidejő használata. A mikrobaközösségekrıl való információszerzés leghatékonyabbnak számító eszközei kétségtelenül a nukleinsav-alapú vizsgálati módszerek, így miként a világban, úgy az ELTE Mikrobiológiai Tanszékén is ezek a módszerek képezik a tudományos közösségelemzés húzóágát. Régóta és folyamatosan jelen vannak ugyanakkor a klasszikus mikrobiológiai és a közösség-kemotaxonómiai megközelítések is a tanszéki munkában. Kutatócsoportunk tevékenységében ez utóbbiak kapnak hangsúlyt, magam pedig elsısorban a kemotaxonómia alkalmazásával foglalkoztam diplomamunkám során, majd a késıbbi kutatásokban, így doktori munkám során is. Doktori munkám jellegét ezzel összefüggésben mindvégig meghatározta egy, a munka indulásakor kényszerően kötött (de késıbb sosem bánt) kompromisszum. Berta Brigitta doktorandusztársammal az ELTE Környezettudományi Kooperációs Kutatóközpontjának zászlaja alatt kezdtük munkánkat a Fıvárosi Csatornázási Mővekkel kötött együttmőködési szerzıdés keretében, a Dél-pesti Szennyvíztisztító Telep iszaprothasztóinak mikrobiológiai vizsgálatával. Brigitta feladata a biogázreaktorokra rátáplált járulékos szubsztrátok biológiai elıkezelésének mikrobiális nyomon követése lett volna, míg az enyém az ezt követı rothasztási folyamaté. A biológiai elıkezelési munkálatok azonban nem indultak el (nem valósultak meg azóta sem), így a diplomamunkáink tematikájából adódó irányvonalaknak megfelelıen felosztva kezdtük meg az eredetileg egy téma feldolgozását: ı a DNS-munkákat, én pedig a kemotaxonómiai vizsgálatokat végeztem a közösen tervezett kísérletsorokon. Ez a munkamegosztás a késıbbiekben is fennmaradt a témában. Ennek köszönhetı, hogy az itt közölt nukleinsav-alapú vizsgálatok egy részét nem én magam végeztem el, a módszertani sajátságok miatt azonban ezek vázlatos bemutatására is szükség van a dolgozatban. A nukleinsav-alapú munkák ismertetésekor az Anyag és módszer fejezetben ennek megfelelıen feltüntetem az azokat elvégzı, közös publikációban eddig nem szereplı kollégák nevét a leírás végén. A számos elvégzett közösségfeltáró és -elemzı vizsgálat közül háromnak a bemutatására kerítünk sort e dolgozatban, melyek már megjelent vagy tervezett publikációk témái is egyben. Egy mezofil és termofil reaktorból történı kezdeti közösségfeltárás az elsı, könnyen bontható szubsztrátok adagolásának közösségösszetételre és biogázhozamra gyakorolt hatását tesztelı munka a második, s egy mezofil-termofil közösségátrendezıdés monitorozása a harmadik, melyet egy újfajta adatkezelési koncepció bemutatása egészít ki. Utóbbiról szólva el kell mondanom, hogy a sok korláttal övezett kemotaxonómiai módszerkör alkalmazójaként olykor csaknem irigykedve pillantottam üvegedényeim közül a

4

I. BEVEZETÉS

kitaposottabb úton haladó, kezük alá tervezett eszközökkel dolgozó, jó felbontást ígérı nukleinsav-alapú módszereket használó kollégáimra, míg a közös munkák során meg nem tapasztaltam, hogy másként ugyan, de legalább annyi módszertani korláttal és frusztráló bizonytalansággal kell szembenézniük, mint a közösségvizsgáló kemotaxonómia alkalmazójának. Ez a perspektíva vezetett ahhoz, hogy mindinkább a módszerek alkalmazhatóságának kérdése kezdett foglalkoztatni azon elsıfajú kérdések helyett, melyek megválaszolásának e módszerek az eszközei volnának. Doktori munkám késıbbi idıszakát ezért annak a kérdésnek a fényében végeztem, miként volna meghaladható az a polifázikus módszertani status quo, amelyben a mikrobiális ökológia bizonyos értelemben vesztegel, s hogyan volna lehetséges a rendelkezésre álló ujjlenyomatmódszerek eredményeit egy közös, egyenként mindegyiken továbbmutató szintézisbe rendezni. Hogy a robbanásszerően fejlıdı metagenomvizsgálatok mennyiben teszik majd meghaladottá és átléphetıvé ezt a problémát, azt még nehéz megbecsülni. Ettıl függetlenül izgalmas szellemi kaland volt megkezdeni egy olyan lépést, amelyet a látókörünkbe esı szakirodalom tanúsága szerint a tudományos közösség mindeddig nem kísérelt megtenni, s bár ez a lépésünk dolgozatom megírásáig sajnálatos módon még nem talált stabil nyugvópontra, a koncepció bemutatására és továbbgondolhatóvá tételére reményeim szerint alkalmasnak bizonyulnak az itt közölt eredmények is. A közösségvizsgálatokban tett erıfeszítéseink sorával párhuzamosan haladt egy laboratóriumi léptékő iszaprothasztó modellrendszerünk ellenırzésére alkalmas, újfajta, kishozamú gázáramlást mérı módszer kifejlesztése is. Ez, bár nem szorosan illeszkedik munkám mikrobiológiai problematikájába, annak módszertani hangsúlyaival összerímel, s úgy alakult, hogy doktori munkám talán legsikerültebb és bevallom, legélvezetesebb történetévé kerekedett. E módszerfejlesztés bemutatása alkotja a dolgozat negyedik témakörét. A fenti kettısségnek megfelelıen a dolgozaton is kettıs tagolás érvényesül. Az átláthatóság kedvéért a számozásukban „A” jelő alfejezetek a gázhozammérı módszerfejlesztéssel, a „B” jelőek pedig a közösségelemzéssel kapcsolatos témaegységeket dolgozzák fel.

5

II. IRODALMI ÁTTEKINTÉS

II. IRODALMI ÁTTEKINTÉS II. 1. A metanogenezis megismerésének rövid története A mocsári lidércfényeket látva ısidıktıl fogva tapasztalhatta az ember a metán biológiai keletkezését, annak tudatos használatba vétele azonban csak jóval késıbb, a nagy népsőrőségő civilizációk idején kezdıdhetett el. Bár anekdota szintő ismeretek élnek arról, hogy Asszíriában a Kr.e. X. században illetve Perzsiában a XVI. században már biogázt használtak fürdıvíz melegítésére, és hogy Marco Polo két-háromezer évesre tehetı fedett hulladéktárolókról számolt be Kínából, az elsı megbízható dokumentumaink az európai újkorból származnak. 1600 táján Van Helmont flamand orvos és kémikus állapította meg elıször, hogy bomló szerves anyagból gyúlékony gáz szabadul fel, majd 1776-ban Alessandro Volta olasz fizikus ismerte fel a bomló szerves anyag illetve a keletkezı gáz mennyiségei közti összefüggést (Abbasi és mtsai. 2012). Volta egyszerő kísérletét mocsárgáz győjtésével és lángra gyújtásával demonstratív céllal azóta is gyakran megismétlik (II/1. ábra).

II/1. ábra. Volta kísérlete. A fölzavart tavi üledékbıl felszabaduló buborékokat lefordított szájú edénybe győjtve a gáz késıbb lángra lobbantható1.

Az éghetı gázban a metánt John Dalton és Humphrey Davy egymástól függetlenül azonosították 1804–1808 között. 1868-ban a francia Antoine Béchamp ismerte fel a metántermelıdés mikrobiológiai hátterét, majd a század ’90-es éveiben Vaszilij Leonyidovics Omelianskij szentpétervári mikrobiológus izolált hidrogén- illetve ecet- és vajsavtermelı baktériumokat anaerob módon bontott cellulózból, s ı vetette fel elıször, hogy a metán szén-dioxidból és hidrogénbıl keletkezhet mikrobiális katalízis révén. N. L. Söhngen holland mikrobiológus az ı kísérleteit ismételve igazolta a sejtést 1910 körül, s a metán másik, acetát dekarboxilezésével történı keletkezését is felismerte, bár ez sokáig nem vált elfogadottá. Az elsı metanogén izolátumot H. A. Barker állította elı az általa kidolgozott anaerob

1

http://grants.hhp.coe.uh.edu/ clayne/HistoryofMC/HistoryMC/VoltaII.htm

6


tenyésztési eljárás segítségével 1936-ban, mely organizmus Methanobacillus omelianskii néven vált ismertté, bár 1967-ben kiderült, hogy két, szoros szintrófiában élı baktérium kevert tenyészete volt. Mindmáig azonban a szintrófia egyik iskolapéldájának számít az etanolból ecetsavat és hidrogént elıállító „S törzs” valamint a hidrogénbıl és széndioxidból metánt elıállító „M.o.H. törzs”2 együttélése (Schink 1997; lásd késıbb). Barker laboratóriuma a hollandiai Delftben a metanogenezis kutatásának évtizedekig a fellegvára volt. Az elsı valóban tiszta tenyészeteket is itt hozta létre C. G. Schnellen 1947-ben. Ezek a Methanobacterium formicium (mely szubsztrátul hangyasavat használ) és a Barker után elnevezett Methanosarcina barkeri. Az anyagcsereviszonyok tisztázásának és új meg új, a metanogenezisben szerepet játszó baktériumok leírásának évtizedei után az 1970-es években kezdett meredeken emelkedni a témával foglalkozó szakirodalom mennyisége, miután a metanogenezis kulcs-koenzimeit és az ısbaktériumok (Archaea) mibenlétét felfedezték, illetve az anaerob mikroorganizmusok túlnyomásos kamrákban való rutinszerő tenyésztésének technológiáját kidolgozták (Wolfe 1993). A növekedés azóta sem állt meg.

II. 2. A biogáztermeltetés rövid története A biogén metán gyakorlati felhasználására a világ két távoli pontján, az angliai Exeterben és az indiai Bombayben került elıször sor az 1890-es évek közepén (Abbasi és mtsai. 2012; bár az internetes források jelentıs része ezzel szemben a bombayi lepratelep biogázreaktorának létrehozását az 1850-es évekre teszi, s így azt elsıként tartja számon). A szennyvízbıl illetve emberi ürülékbıl termeltetett gázt világítás céljára használták fel mindkét helyen. A biogázüzemek telepítésének nagy hulláma a XX. század ’40-es éveiben kezdıdött, amikor Európán belül elsısorban Franciaországban és Németországban, másutt pedig elsısorban Indiában építettek hol egyszerőbb, hol már igen összetett rothasztókat. Hazánkban az 1950-es években kezdtek hozzá a biogázzal folyó kísérleteknek a Fıvárosi Csatornázási Mővek Soroksári úti szennyvíztisztító telepén (ma FCSM Zrt., Dél-pesti Szennyvíztisztító Telep), az elsı szerves trágya alapú biogáztelep elıször a Pécsi Állami Gazdaságban létesült (Czupy és Vágvölgyi, 2011). A ’70-es években Észak-Amerikában, a ’80-as években pedig Afrika és Ázsia egyre több országában kezdtek telepítésekbe hulladékkezelés és energianyerés céljából, napjainkra pedig már kiemelt fontosságú, támogatott fejlesztésnek számít a biogázüzemek telepítése mindenütt a világon. 2012-ben Németországban mintegy 7000 biogázüzem mőködött, és számuk meredeken emelkedik, lakosságszámra vetítve azonban Spanyolország az európai csúcstartó biogáz-kihozatalban, ezt köve-

2

M.o.H.: „methanogen oxidizing hydrogen”. Késıbb Methanobacterium bryantii néven írták le. Az „S törzs” („symbiotic”) sajnos a késıbbiekben kihalt.

7


ti Belgium, Hollandia, Svájc, majd Németország (Abbasi és mtsai. 2012). A népesedés és a gazdasági teljesítmény növekedésének árnyoldalaival, az energiakészletek és a környezet hulladékelnyelı kapacitásának végességével szembesülve a szerves hulladékból képzıdı metán energiaforrásként való felhasználása igen gyümölcsözı lehetıségként tőnik fel. Ez a belátás a gazdasági és politikai döntéshozók körében is terjed, így a támogatások révén új és új szerves alapanyagok bevonására, új és új technológiák kidolgozására nyílik lehetıség napjainkban, ami nem csak az ágazat fent említett növekedésének, hanem a tudományos szakirodalom terebélyesedésének is motorja. Talán érdemes megnézni, hogy a Google Scholar keresıje szerint 1965 és 2012 között évente hány új publikáció tartalmazza a „biogas” kifejezést (nem megfeledkezve arról, hogy az efféle adatsorokat számos hiba ter-

10800 11900 12900 14400 13700

helheti) (II/2. ábra). 16000

12000 10000 8000 6000 4000 2000 0

9 7 3 5 5 5 11 10 11 32 62 113 165 228 415 711 799 759 905 964 988 935 987 925 960 1040 1020 1100 1130 1190 1250 1360 1610 1480 1670 2060 2420 2940 3580 4350 5150 6540 8040

új publikációk száma

14000

1965

1970

1975

1980

1985

1990

1995

2000

2005

2010

II/2. ábra A Google Scholar publikáció-keresı találatainak száma „biogas” kifejezésre az egyes évekbıl.

Wolfe fentebbi megállapításával összhangban a ’70-es években ugrik elıször száz fölé az éves találatok száma. A ’80-as és ’90-es években évente közel ezer új publikáció jelenik meg, hogy aztán a ’90-es évek végétıl – talán a klímakonferenciák és a biológiában lezajlott molekuláris forradalom együttes hatására – meredek növekedésnek induljon a találatszám. (Nem kizárt persze, hogy a publikált anyagok digitalizálásának ekkori terjedése is hozzájárul a találatok növekedéséhez ebben az idıszakban.) Megtorpanás csak a gyarapodás ütemében látszik 2008-tól, valószínőleg a gazdasági válság hatására, amely a tudományfinanszírozásban is érezteti hatását.

II. 3. Szerves anyagok anaerob lebontásának metanogén útja A biogáz szerves anyagok anaerob biológiai bontása során keletkezı, nagyrészt metánt (CH4), kisebb részben szén-dioxidot (CO2), nyomnyi mennyiségekben pedig vízgızt, olykor kénhidrogént (H2S), ammóniát (NH3) és más illékony gázkomponenseket (pl. illékony zsírsavakat) tartalmazó gázelegy, mely metántartalma révén égethetı, így hı- és villamos 8


energia elıállítására használható. A gáz minden esetben egy mikrobiális anyagcsereközösség tevékenysége révén keletkezik, amelyet többé-kevésbé állandó metabolikus szereposztásban együttmőködı különféle baktériumok alkothatnak. A kiindulási szerves anyag igen sokféle lehet (például konyhai hulladék, gabonaszalma, állati trágya, humán fekália stb.) de általában három klasszikus szervesanyag-csoport tagjait tartalmazza különbözı arányban: poliszacharidokat, fehérjéket és különbözı zsírokat. Ezek metánná alakítása négy fı lépésben történik. Elsı lépésben hidrolizáló baktériumok bontják a polimereket monomerekig, vagyis cukrok, aminosavak, zsírsavak és egyéb monomerek keletkeznek. Második lépésben ezeket primer fermentálók alakítják energianyerés céljából kis molekulájú anyagokká, elsısorban hidrogénné (H2), CO2-dá és egyéb C1 vegyületekké, ecetsavvá és egyéb kis molekulasúlyú savakká (tejsav, propionsav, vajsav, borostyánkısav) valamint alkoholokká a megfelelı erjesztési folyamatokban. A H2, CO2 és ecetsav ugyan közvetlenül is hasznosítható már a metanogén közösségalkotók számára, ám egyéb alfolyamatokban más irányba is csatornázódhatnak, mielıtt eljutnak a metanogénekig. Harmadik lépés a kis molekulájú savak és alkoholok tovább bontása H2-né, CO2-dá és ecetsavvá, melyet szekunder fermentálók (köztük a szintróf baktériumok) végeznek. Negyedik lépés a CH4 kialakítása H2-bıl és CO2-ból vagy CH4 és CO2 kialakítása ecetsavból, melyet minden esetben az anyagcserefolyamat végén álló metanogén ısbaktériumok (Archaea) végeznek el. Két fı típusuk anyagcseréjük szerint a hidrogénoxidáló (hidrogenotróf) és az ecetsav diszproporcionálásával CH4-t és CO2-t termelı acetiklasztikus metanogének. Metánképzés e két fı szubsztrát mellett más – fıleg C1 – vegyületekbıl is történhet, de ennek jelentısége általában alárendeltebb. Az anyagcsere-hálózat vázlatos képét mutatja a II/3. ábra. A metántermelés folyamatában részt vevı baktériumok szigorúan anaerob környezetben élnek, és többszintő átalakításban hasznosítják és termelik egymás anyagcsere-végtermékeit illetve kiindulási szubsztrátjait. Kapcsolatuk igen összetett és az elıbbi okból kifolyólag nagyon szoros. Ellentétben más táplálékhálózatokkal, ahol általában a fogyasztó szervezet van anyagcseréjét tekintve függı helyzetben a táplálékláncban elıtte álló tagtól, itt a termelı is érzékeny függésben van végtermékei fogyasztójától. A teljes folyamatban, de még inkább az egyes részfolyamatokban felszabaduló energia ilyen körülmények között ugyanis igen csekély. A folyamat legvégsı terméke, a metán, még mindig igen nagy energiájú vegyület (emiatt érdemes mint energiaforrást termeltetnünk), a baktériumoknak pedig a szerves monomerek és a CH4-CO2 termékek energiaszintje között felszabadított energiával kell

9


szerves polimerek

I.

1 monomerek (cukrok, aminosavak, zsírsavak)

2

II.

illékony zsírsavak tejsav borostyánkısav alkoholok

III.

3 ecetsav

C1 vegyületek (CO2), H2

4 5

CH4, CO2

6

1: hidrolizáló baktériumok

4: homoacetogén baktériumok

2: primer fermentáló baktériumok

5: hidrogenotróf metanogének

3: szekunder fermentáló (szintróf) baktériumok

6: acetiklasztikus metanogének

IV.

II/3. ábra. Szerves anyagok anaerob lebontásának útja és a baktériumok különbözı anyagcseretípusú alpopulációinak szerepe a folyamatban. A római számok a hidrolízis, primer fermentáció, szekunder fermentáció és metanogenezis szakaszait jelölik.

fedezniük saját életfolyamataik energiaigényét. A részfolyamatokban felszabaduló energia olykor alig haladja meg az egy mol ATP szintéziséhez minimálisan szükséges (hıveszteséggel is számolva) mintegy -70 kJ/mol energiát, vagy – elektrontranszportlánccal rendelkezı baktériumok esetén – az egy proton membrántranszportjához szükséges mintegy -20 kJ/mol energiát (Schink 1997). Bizonyos reakciók, így például vajsav és víz ecetsavvá és H2-né alakítása standard körülmények között még endergonikusak is, exergonikussá csak igen speciális körülmények között tehetık, így például az egyik végtermék (ez esetben a H2) folyamatos elvonásával, azaz koncentrációjának igen alacsony szinten tartásával. Ez akkor lehetséges, ha a reakciósor következı lépését katalizáló baktériumok folyamatosan fogyasztják a végterméket. Ha ebben a tevékenységükben zavart szenvednek, ellehetetlenül a termelı mikroba anyagcseréje is. A korábban említett Methanobacillus omelianskii esetében például az „S törzs” katalizálta 2 CH3CH2-OH + 2 H2O = 2CH3COO- + 2H+ + 4H2 reakció is endergonikus standard körülmények között (∆G°’ = +19 kJ / 2 mol etanol), így a baktérium számára használható energia felszabadítására csak úgy válhat alkalmassá, ha a metanogén „M.o.H. törzs” folyamatosan elvonja a 10


termelıdött H2-t a saját energiatermelı reakciója révén (4 H2 + CO2 = CH4 + 2 H2O ; ∆G°’ = -131 kJ / mol metán), mely már szerencsére exergonikus folyamat, ám legalább annyira rászorul a kiindulási anyagára, mint a partner a végterméke elvonására. Az efféle speciális egymásra utaltságot nevezzük szintrófiának, melynek során két, egymástól metabolikusan eltérı típusú baktérium jellemzıen energetikai okokból egymásra szorul egy bizonyos szubsztrát lebontásában (Schink 1997). Ennek egyik legtipikusabb példája a hidrogénoxidáló metanogén archaeonok és a szekunder fermentáló baktériumok kapcsolata. A primer fermentálók ugyancsak profitálnak a hidrogénoxidáló közösségalkotók tevékenységébıl, mivel a H2 alacsony parciális nyomása (<10 Pa) lehetıvé teszi a -320 mV redoxpotenciálon a NADH+H+-ból molekuláris hidrogén közvetlen felszabadulását, ami megengedi, hogy a fermentációs terméklista ecetsav-, CO2- és H2-termelıdés irányába tolódjon vajsav- vagy etanol-termelıdés helyett, ami több ATP termelését teszi számukra lehetıvé. Jól kiegyensúlyozott anaerob rendszerben ezért az anyagáramlás fıként a „külsı” vonalakon zajlik (II/3. ábra), habár a „középsı” út anyagforgalma sem lesz soha nulla, mivel aminosvak és zsírsavak bontásakor mindig keletkeznek savak és alkoholok. Ezek éppen akkor jutnak különös szerephez, ha a H2-koncentráció megnı a közegben pl. a hidrogénfogyasztó metanogének mőködési zavara miatt. Ekkor a primer fermentálók anyagcseréje a „középsı” útra terelıdik (II/3. ábra), a képzıdı savak lecsökkentik a pH-t, ami pH 6,00 alatt tovább rontja a metanogének helyzetét. A másik oldalon a szekunder fermentáló szintrófok nem tudják elhasználni ıket (éppen a sok H2 miatt). Ilyenkor tapasztaljuk, hogy a közeg elsavanyodik, a kismolekulájú savak felhalmozódásától bőzössé válik, az anyagcserehálózat pedig végérvényesen sérülhet. Az illósavak felszaporodását a közegben ezért mindig anyagcserezavar jeleként értékelik. A homoacetogén baktériumok szerepét a folyamatokban még kevésbé értjük. Anyagcserespektrumuk révén olykor bekapcsolódhatnak a primer fermentációs folyamatokba is, egyébként pedig söntöt képeznek a hidrogenotróf és acetiklasztikus irányba haladó anyagforgalmi utak között: versengve a hidrogenotróf metanogénekkel és szubsztráthoz segítve az acetiklasztikus metanogéneket ezen alpopulációk szabályozásában juthatnak szerephez. Magas hımérsékleten azonban a folyamat meg is fordulhat, ha az acetiklasztikus metanogének visszaszorulásával felhalmozódik a közegben az ecetsav (Schink 1997). Ez igen fontos lehet a közösség egyensúlyának megtartásában, mivel az ecetsavtermelı primer fermentálók anyagcseréjét hasonlóképpen gátolhatja anyagcsere-végtermékük felhalmozódása a közegben, mint a szintróf baktériumokét a H2-é (Zinder 1993). Szulfát jelenlétében, pl. tengeri üledékekben, vagy magas szulfáttartalmú szubsztráttal terhelt reaktorokban a kapcsolatrendszer tovább bonyolódik. Az oxidált kénformát terminális elektronakceptorként használó szulfátredukáló baktériumok bizonyos csoportjai a primer

11


fermentálók minden szerves termékét képesek közvetlenül CO2-dá oxidálni, miközben a szulfát H2S-né redukálódik. H2 közvetlen oxidálására is képesek lehetnek víz és H2S képzése során. Hidrogénkompetitorai lehetnek tehát a hidrogenotróf metanogéneknek, szélsıséges esetben pedig akár a teljes metanogén populációt megkerülı utakra vezethetik a közösségi anyagcserét, ami a metanogenezis visszaszorulását eredményezi. A szulfát és a szulfátlégzık emiatt nem kívánatos tényezık egy biogáztermelı rendszerben. Más mesterséges rendszerekben, ahol a szulfát redukciója az üzemeltetı célja, hasonló kompetíciós okokból éppen a metanogénektıl igyekeznek megszabadulni (Esposito és mtsai. 2003). Megtelepedhetnek

vasionokat

(Fe3+)

redukáló

baktériumok

is

az

anaerob

anyagcserehálózatokban, melyek ugyancsak beszállhatnak a hidrogénért folyó versengésbe (Zinder 1994). A metanogének kompetíciója H2-ért és/vagy egyéb szubsztrátokért a szulfátredukáló és homoacetogén (vagy akár Fe3+redukáló) baktériumokkal olyan értelemben is bonyolítja az anyagcsererendszert, hogy a szubsztrátok aktuális koncentrációja szerint más-más kiélezettséggel folyik a verseny a csoportokra jellemzı más-más hasznosíthatósági küszöbkoncentrációk miatt. A hidrogén legkisebb parciális nyomásértékeinél, 10-5 atm körül a szulfátredukálók már képesek azt hasznosítani, míg a metanogének csak 10-4 atm táján lesznek képesek belépni a felhasználásba. Az acetogének pedig csak 10-3 atm parciális nyomásértéknél férnek hozzá ehhez az értékes elektrondonorhoz (Zinder 1994). A verseny így egyáltalán nem kiegyenlített, és mindenkor nagyban függ az egyéb környezeti feltételektıl és egyéb közösségalkotóktól is. Az anaerob szervesanyagbontó anyagcsere-hálózatok tehát jól láthatóan magasan szervezett, többszörös visszacsatolásokkal és kölcsönhatásláncokkal átszıtt, ráadásul minden konkrét esetben egyedi vonásokat is mutató rendszerek, így felderítésük izgalmas terepet kínál a kutatás számára. A metanogenezis, mint már említettük, több kiindulási anyagból is megvalósulhat, ahogy a II/1. táblázat is mutatja. Szubsztrát Hidrogén/CO2 Formiát Szénmonoxid Etanol H2/Metanol Metanol Trimetilamin Dimetilszulfid Acetát Piruvát

Reakció 4 H2 + HCO3- → CH4 + 3 H2O 4 HCOO- + 4 H+ → CH4 + 3 CO2 + 2 H2O 4 CO + 5 H2O → CH4 + 3HCO3- + 3 H+ 2 CH3CH2OH + HCO3- → 2 CH3COO- + H+ + CH4 + H2O CH3OH + H2 → CH4 + H2O 4 CH3OH → 3 CH4 + HCO3- + H2O + H+ 4 CH3NH+ + 3 H2O → 3 CH4 + HCO3- + 4 NH4 + 3H+ 2 (CH3)2S + 3 H2O → 3 CH4 + HCO3- + 2 H2S + H+ CH3COO- + H2O → CH4 + HCO34 CH3COCOOH + 2 H2O → 5 CH4 + 7 CO2

∆G0’ -135 -145 -196 -116 -113 -105 -76 -49 -31 -31

II/1. táblázat. A metanogenezis kiindulási anyagai, a reakciók nettó egyenlete és standard szabadenergia-változása.

12


A metánképzıdés folyamataiban a C1-csoport valamint a H2-bıl (vagy szerves köztianyagokból) származó elektronok és protonok szállítása végig koenzimekhez kapcsoltan történik (II/4. ábra). A koenzimek közül nem egy fémionokat is tartalmaz, s a folyamatokat katalizáló enzimek közül is jónéhány rendelkezik fémtartalmú prosztetikus csoportokkal. Az anyagcserehálózat gerince a CO2 redukciójának folyamata H2-nel, amelyhez többé vagy kevésbé, de az összes egyéb kiindulási anyag metabolizmusa is hozzákapcsolódik. A II/5. ábrán a legfontosabb metanogén szubsztrátok anyagcseréje tekinthetı át.

(N-formil-)metanofurán (MFR)

*

10

5

*

*

*

*

(formil-)tetrahidroxi-metanopterin (-H4MPT) (metenil-) „ (metilén-) „ (metil-) „

* (metil-)Koenzim-M (CoM) (merkaptoetán-szulfonsav) Koenzim F420 (CoF420)

(CoF420)H2

*

Koenzim F430 (CoF430) Koenzim-B (CoB) (N-7-merkaptoheptanoil-O-foszfo-L-treonin)

[ CoM – S – S – CoB ]

* 5-hidroxibenzimidazolilkobamid

II/4. ábra. A metanogenezis folyamatában részt vevı koenzimek és a szubsztrátok kapcsolódása. A piros csillag a képzıdı metánmolekula C-atomját jelöli.

13


H2

CO2 1

2

formiát

formil-MFR 3 H2O

ferredoxin

formil-H4MPT 4

(H2)

H2 + F420

F420H2

C

O citokróm-b

metenil-H4MPT 5

6

7

11

metilén-H4MPT

H2 + F420

F420H2

8

metil-aminok

metil-H4MPT

metanol

ATP 12

metil-szulfidok H2 + F420

? 9

metil-CoM

F420H2

11

CoM – S – S – CoB

acetil-CoA 14

acetil-Pi 13

10

CoM – SH CoB – SH

15

acetát

ATP

II/5. ábra. Biológiai metánképzıdés CO2-ból, acetátból, formiátból valamint metanolból, metil-aminokból és metil-szulfidokból. A koenzimeket lásd a II/4. ábrán. A számmal jelölt folyamatok enzimei: 1: egy (NiFe) hidrogenáz, 2: formil-metanofurán-dehidrogenáz, 3: formilmetanofurán : H4MPT–formiltranszferáz, 4: N5,N10-metenil-H4MPT-ciklohidroláz, 5: H2képzı metenil-H4MPT dehidrogenáz, 6: CoF420-redukáló (NiFe) hidrogenáz, 7: CoF420dependens metenil-H4MPT dehidrogenáz, 8: CoF420-dependens metilén-H4MPT reduktáz, 9: kobalt-korrinoid tartalmú metiltranszferáz enzimkomplex, 10: metil-CoM-reduktáz, 11: heterodiszulfid-reduktáz, 12: metiltranszferáz, 13: acetát-kináz, 14: foszfotranszacetiláz, 15: CO-dehidrogenáz (CODH) enzimkomplex. A további magyarázatot lásd a fıszövegben.

A CO2 redukciójának folyamata a molekula formil-csoport formájában való megkötıdésével kezdıdik metanofurán (MFR) koenzim aminocsoportján, amihez a redukálóerıt egy nikkel-vas (NiFe) hidrogenáz enzim biztosítja elemi hidrogén bontásából. Az elektronok és protonok ferredoxinok közremőködésével lépnek be a formil-metanofurán-dehidrogenáz enzim által katalizált reakcióba, melynek során formil-MFR, víz és proton keletkezik (Thauer et al. 1994). A folyamat összességében endergonikus, a ferredoxinok redukciójának energiaigényét nátrium-ion-motoros erı biztosítja (Kaster és mtsai. 2011). [A különbözı metanogén fajokból kimutatott formil-metanofurán-dehidrogenáz enzimek O2 jelenlétében gyorsan inaktiválódnak. Prosztetikus csoportjaikban molibdént (molibdoprotein-guanindinukleotid), nem hem vasat és savlabilis kénatomokat találtak, a Methanothermobacter

14


wolfeii-bıl izolált egyik enzimbe pedig volfrám épül, ha a baktérium hozzájut ehhez az elemhez.] Az ily módon fixált C1 csoport a következı lépésben tetrahidro-metanopterin (H4MPT) koenzimre kerül, amit a kromofór csoportot nem hordozó formil-metanofurán : H4MPT–formiltranszferáz enzim katalizál. Ezen a koenzimen történik a formil-csoport redukálódása a továbbiakban (II/4. ábra). Elıször az N5,N10-metenil-H4MPT-ciklohidroláz enzim protonfelvétel majd vízkilépés kíséretében eltávolítja a formilcsoport oxigénjét, a szénatom pedig kettıs kovalens kötéssel a koenzim 5. nitrogénjéhez, egy egyes kötéssel pedig a 10. nitrogénjéhez kapcsolódik. A továbbiakban ezek a kötések fognak telítıdni hidrogénnel. Ennek elsı lépését a CoF420-dependens metenil-H4MPT dehidrogenáz vagy az ún. H2-képzı metenil-H4MPT dehidrogenáz enzim katalizálhatja – a H2 közegbeli parciális nyomásának függvényében. Viszonylag magas parciális nyomás esetén az utóbbi enzim révén a H2 közvetlenül, szubsztrátként léphet a folyamatba, alacsony nyomás esetén azonban F420 koenzim közvetítésére és az elsı enzimre van szükség. Az F420 koenzim hirdogénnel való redukcióját ugyancsak egy nikkel-vas enzim, a CoF420-redukáló (NiFe) hidrogenáz végzi. A következı redukciós lépést a CoF420-dependens metilén-H4MPT reduktáz segíti, és mindenképpen redukált F420 koenzim szállítja a hidrogéneket. (A Methanococcus voltae-ból izolált hidrogenázok szelenociszteint tartalmaznak normál cisztein helyett.) Bár e redukciós lépések mindegyike exergonikus, energiaraktározás nem történik, mert ehhez túl kicsinyek a reakcióhık – nem utolsósorban a kiindulási anyagként szereplı H2 mindig igen alacsony parciális nyomása miatt. A folyamatban képzıdött metilcsoportot a következı lépésben az élıvilág eddig ismert legkisebb koenzime, a CoM (merkaptoetán-szulfonsav) veszi át. A csoporttranszfert egy metiltranszferáz enzimkomplex végzi, mely a B12 vitaminhoz igen hasonlító szerkezető kobalttartalmú korrinoid prosztetikus csoportot (5-hidroxi-benzimidazolil-kobamid) tartalmaz (II/4. ábra). A koordinációs kötésbe foglalt kobalt ion feltehetıleg szerepel a metilcsoport átmeneti megkötésében a transzfer során (Thauer et al. 1994). Na+- és/vagy protontranszferrel megvalósuló kemiozmotikus energiaraktározás is köthetı a folyamat e mozzanatához, amely az ATPszintézis, és részben a ferredoxin-redukció energiaigényét fogja fedezni (Kaster és mtsai. 2011). Az utolsó lépés, a voltaképpeni metanogenezis, mely kizárólag metanogén Archaeasajátság (a többi reakció más organizmusok anyagcserefolyamataiban is elıfordulhat), három koenzim közremőködését igényli, és a metil-CoM-reduktáz enzim katalizálja. Ennek az utolsó redukciós lépésnek a voltaképpeni elektrondonora a CoB (vagy N-7merkaptoheptanoil-O-foszfo-L-treonin; HS-HTP), melynek tiol-hidrogénjével egyenértékő H+-nal és e--nal a metil-csoport eltávozik a CoM-rıl (metán képzıdik), a két koenzim pedig diszulfid formában összekapcsolódik (CoM–S–S–CoB). Az elektronátvitelben közvetlen szerepet játszik az enzimhez kapcsolódó F430 koenzim, amely egy nikkel-porfinoid (II/4.

15


ábra). A koenzimek regenerációja a heterodiszulfid-reduktáz enzim révén megy végbe, a folyamat hidrogéndonora F420 koenzim. E folyamat nagy energia-felszabadulással jár, ez pedig ferredoxin redukciójára fordítódik (Methanothermobacter marburgensis-ben; Kaster és mtsai 2011). Ezekhez a folyamatokhoz kapcsolódik a többi szubsztráttípus átalakítása is (II/5. ábra). A szabad hangyasav nem köztiterméke a CO2-redukciónak, ezért a felhasználására képes metanogénekben elıször CO2-dá oxidálódik, majd végighalad a fenti reakciósoron (Thauer et al. 1994). A metanol esete összetettebb, ekkor egy megfelelı metiltranszferáz enzim a metanol metilcsoportját a metil-CoM-et létrehozó enzimkomplex kobalt-korrinoidjára viszi, majd innen kerül a metilcsoport a CoM-re, és indul tovább a már tárgyalt módon. Metanolból azonban elemi hidrogén felhasználása nélkül is képzıdhet metán. Ilyenkor minden negyedik metanol metilcsoportja visszafelé teszi meg az utat a reakciósoron, és CO2-dá oxidálódik, miközben három redukált F420 koenzim képzıdik fordított folyamatnak megfelelıen, a II/5. ábrán látható módon, melyek éppen fedezik a másik három metanol metilcsoportjának redukcióját (pontosabban a CoM–S–S–CoB heterodiszulfid bontását) a végsı, energiatermelı lépésben (Keltjens és Vogels 1994). Az acetátból történı metántermelés az arra képes baktériumokban az acetát aktiválásával indul, mely ATP-igényes lépés: az acetát-kináz enzim ATP foszfátcsoportjával acetilfoszfáttá alakítja az ecetsavat (II/5. ábra). Az acetil-csoportot a foszfotranszacetiláz enzim ezután CoA molekulával kapcsolja össze Ac-CoA képzıdése és Pi felszabadulása közben. Az Ac-CoA-ban ezután a (baktériumok körében egyébként általánosan elterjedt) COdehidrogenáz (CODH) enzimkomplex felbontja a szén-szén és a szén-kén kötést is, s a metilcsoport a komplex egy kobalt-vas-kén komponensén keresztül a (H4MPT-vel analóg, de a Methanosarcina fajokról tetrahidro-sarcinapterinnek keresztelt) H4SPT koenzimre kerül, s mint metil-H4SPT bekapcsolódik a metanogenezis fent ismertetett útjába. A -COcsoport a komplex egy nikkel-vas-kén komponensén keresztül egy molekula víz oxigénjével végül CO2-dá oxidálódik, a felszabaduló hidrogének elektronjai pedig ferredoxinhoz kapcsolódva membránkapcsolt elektrontranszport-láncon keresztülhaladva protongradienst generálnak (ezzel megtermelik a kezdeti acetát-aktiváció energiafedezetét), majd a heterodiszulfid (CoM–S–S–CoB) reduktáz valamelyik elektrondonorára kerülnek, így ugyancsak szereplıivé válnak a metanogenezisnek (Ferry 1994). Az acetáthasznosításban szereplı enzimek, azok változatai vagy azokkal analóg mőködéső enzimek megtalálhatók a metántermelı Archaeák többségében, és mőködésük a kulcsa

a

metanogének

minden

nagyobb

rendszertani

egységében

megfigyelhetı

szénautotrófiának. Mivel a metanogének nem, vagy csak módjával katabolizálnak hosszabb

16


szénláncú szerves molekulákat, saját sejtanyagaik felépítéséhez is C1 vegyületekbıl kell kiindulniuk. Ennek a folyamatnak a tudomány által nagyrészt feltárt mechanizmusa a módosított Jungdahl-Wood út, melynek lényegi megértéséhez elegendı az imént tárgyalt anyagcserefolyamatokra visszautalnunk. A metanogén autotrófia terméke ugyanis acetilCoA, illetve az ennek további módosításai révén létrehozott piruvát és α-ketoglutarát (Simpson és Whitman 1994). Az acetil-CoA pedig lényegében az acetáthasznosító anyagcserefolyamat megfordításával keletezik a CO2 alapú metanogenezis egy szakaszának közbeiktatásával, aminek révén az acetilcsoport mindkét szénatomja CO2-ból keletkezik. Az acetil CO-csoportjának szene CO2 egyik oxigénjének vízzé redukálásával keletkezik a CODH enzimkomplex megfelelı helyén annak a biokémiai eseménynek a fordítottjaként, amivel az acetát karboxilcsoportjának szene végül CO2-dá alakul acetiklasztikus metanogénekben (II/5. ábra). A metilcsoport pedig szintén CO2-ból képzıdik a metilH4MPT-né történı redukálódás elsıként tárgyalt folyamatában, s innen átadódik a CODH komplex kobamid prosztetikus csoportjára. A komplex ezután kialakítja a szén-szén illetve a szén-kén kötést CoA molekula részvételével, és létrejön az acetil-CoA, melynek acetáttá és CoA-vá alakulásával még mólonként egy mól ATP is elıállítható (II/5. ábra). A folyamat tehát logikáját tekintve az acetát-alapú metántermelés folyamatának megfordítása, azzal a különbséggel, hogy a metil csoport szene nem metánból képzıdik, hanem a CO2 „irányából” érkezik a H4MPT-re.

II. 4. A metántermelést végzı baktériumközösségek tagjai Sokat tud már a tudomány a biogázképzıdésben szerepet játszó, legkülönfélébb szubsztrátokon és körülmények között végbemenı anyagcsere-folyamatokról, mégis keveset tudunk az ezeket katalizáló mikrobákról. Az ilyen közösségekben élı Bacteria és Archaea csoportok képviselıinek is mindmáig csupán néhány százalékát vonhatták tenyésztésbe, a közösségi dinamikákról és kölcsönhatásokról pedig ugyancsak kevés ismeretünk van (Weiland 2010), ami miatt olykor megmagyarázhatatlan hibákkal és zavarokkal szembesülünk a biogáztermelés gyakorlatában. Az eddigi ismereteink alapján mindazonáltal kirajzolódik egyfajta összkép e közösségek taxonómiai összetételét illetıen, részben leírt fajok, nagyobb részben pedig ezekkel 16S rDNS-szekvenciájuk (vagy funkciógénjeik szekvenciáiban mutatott hasonlóságuk) szerint társítható környezeti klónok alapján. A kiindulási polimerek hidrolízisét és a primer fermentációt végzı baktériumok nagyon különbözı rendszertani csoportokhoz tartozhatnak, legtöbben azonban a Bacteroidetes divízió Bacteroidia és a Firmicutes divízió Clostridia osztályából kerülnek ki (II/2. táblázat). Metabolikus potenciáljuk diverzitásuknak megfelelıen ugyancsak széles spektrumú, és elsısorban ennek az alpopulációnak az összetétele révén képesek a metántermelı közössé-

17


gek alkalmazkodni a kiindulási szubsztrátok sokféleségéhez. Mőködésüket a kiindulási szubsztrát kémiai természetén kívül annak szemcsemérete is nagyban befolyásolja, és általánosan elmondható, hogy a hidrolízis a sebességmeghatározó lépés a biogáz-produkcióban. A monomerek primer bontásának módja alapján, fermentációs végtermékeikkel hatnak a közösségi anyagcserefolyamatok sorában utánuk következı közösségalkotókra is. Phylum Classis Ordo Familia Példafajok

Irodalom Kampmann és mtsai. 2012 Bateroidetes Bacteroidia Bacteroidales Porphyromonadacea Paludibacter propionicigenes Liu és mtsai. 2009 Petrimonas sulfuriphila Liu és mtsai. 2009 Proteiniphilum acetatigenes Liu és mtsai. 2009 Cytophagaceae Liu és mtsai. 2009 Marinilabiliaceae Alkaliflexus imshenetskii Liu és mtsai. 2009 Proteobacteria Gammaproteobacteria Enterobacteriales Enterobacteriaceae Weiland 2010 Firmicutes Clostridia Clostridiales Clostridiaceae Clostridium quini, C. thermocellum, C. orbiscindens, C. straminisolvens, C. bartlettii Liu és mtsai. 2009 Anaerovorax odorimutans Liu és mtsai. 2009 Gracilibacteraceae Gracilibacter thermotolerans Liu és mtsai. 2009 Eubacteriaceae Garciella nitratireducens Liu és mtsai. 2009 Acetobacterium woodii Weiland 2010 Peptococcaceae Kampmann és mtsai. 2012 Peptococcus niger Klocke és mtsai. 2007 Peptostreptococcaceae Peptostreptococcus anaerobicus Klocke és mtsai. 2007 Ruminococcaceae Acetivibrio cellulolyticus Klocke és mtsai. 2007 Bacilli Lactobacillales Lactobacillaceae Lactobacillus reuteri Liu és mtsai. 2009 Leuconostocaceae Leuconostoc citreum Liu és mtsai. 2009 Streptococcaceae Weiland 2010 Streptococcus alactolyticus Liu és mtsai. 2009 Spirochaetes Spirochaetia Spirochaetales Spirochaetaceae Treponema brennaborense Liu és mtsai. 2009

II/2. táblázat. A hidrolízist és primer fermentációt végzı baktériumok tipikus példái biogáztermelı közösségekbıl.

18


A homoacetogén baktériumok eddig leírt csoportjai a Firmicutes divízió Clostridia és Negativicutes osztályaiból kerültek elı, biogáztermelı rendszerekben azonban egyelıre Clostridia osztály képviselıi tőnnek fontosabbnak (II/3. táblázat). A Negativicutes osztály homoacetogén tagjai termeszek béltraktusából kerültek elı (Boga és Brune 2003). Phylum Classis Ordo Familia Példafajok Firmicutes Clostridia Clostridiales Peptococcaceae Desulfotomaculum guttoideum Desulfotomaculum thermocisternum Ruminococcaceae Sporobacter termitidis Clostridiaceae Clostridium aceticum Clostridium magnum Eubacteriaceae Acetobacterium woodii Thermoanaerobacterales Thermoanaerobacteraceae Moorella glycerini Negativicutes Selenomonadales Veillonellaceae Sporomusa termitida Acetonema longum

irodalom

Liu és mtsai. 2009 Liu és mtsai. 2009 Liu és mtsai. 2009 Weiland 2010 Schink 1984 Weiland 2010

Liu és mtsai. 2009

Boga és Brune 2003 Boga és Brune 2003

II/3. táblázat. Acetogén baktériumok tipikus példái biogáztermelı közösségekbıl.

A metanogénekkel (és/vagy kompetitoraikkal) szintrófiában élı baktériumok eddig leírt tagjai a delta-proteobaktériumok közül illetve a Firmicutes divízió Clostridia osztályából kerültek elı, változatosságuk e csoportokon belül meglehetıs (II/4. táblázat). Mivel folyamatos kettıs alkalmazkodásban élnek (hiszen a kiindulási szubsztrátoktól és ezek primer fermentálóitól, valamint anyagcsere-végtermékeik elhasználóitól egyaránt érzékenyen függenek) a szintróf baktériumok alpopulációjának összetétele ugyancsak karakteres jellemzıje a különbözı metántermelı élıhelyeknek és mesterséges rendszereknek. A szulfátredukáló baktériumok nem alkotnak taxonómiailag jól körülhatárolható csoportot: tagjaik többségét ugyan a delta-proteobaktériumok és firmicutesek csoportjaiban találjuk (II/5. táblázat), képviselıik jelen vannak a Nitrospirae, Thermodesulfobacteria törzsekben is, sıt az Archaea domén Euryarchaeota és Crenarcheota divízióiban is találunk szulfátredukálókat (Muyzer és Stams 2008). Ezen túlmenıen anyagcserevariabilitásuk és H2affinitásuk is nagyobb, mint a metanogén baktériumoké, így hatékony – bár nem mindig kedvelt – tagjai lehetnek az anaerob rothasztók közösségeinek.

19

II. IRODALMI ÁTTEKINTÉS Phylum Classis Ordo Familia példafajok Firmicutes Clostridia Clostridiales Clostridiaceae Clostridium ultunense Syntrophomonadaceae Syntrophomonas wolfei, S. sapovorans Syntrophospora bryantii Thermoanaerobacterales Thermoanaerobacteraceae Thermoanaerobacter brockii Peptococcaceae Syntrophobotulus glycolicus Pelotomaculum spp. Proteobacteria Deltaproteobacteria Desulfovibrionales Desulfovibrionaceae Desulfovibrio vulgaris Syntrophobacterales Syntrophobacteraceae Syntrophobacter wolinii, S. pfennigii Syntrophales Syntrophus buswellii, S. gentianae Desulfomonadales Pelobacteraceae Pelobacter venetianus, P. acetylenicus, P. carbinolicus

irodalom

Shink 1997 Shink 1997 Shink 1997

Shink 1997 Shink 1997 Kampmann és mtsai. 2012

Shink 1997

Shink 1997 Shink 1997

Shink 1997

II/4. táblázat. Szintróf baktériumok tipikus példái biogáztermelı közösségekbıl.

A metanogén baktériumok eddig ismert kivétel nélkül az Archaea domén Euryarchaeota divíziójának képviselıi, ám e csoporton belül már nem alkotnak egységes taxonómiai csoportot (II/6. ábra). Konzervatív génszekvenciáik alapján két osztályra osztjuk ıket, az I. osztály tartalmazza a Methanococcales, Methanobacteriales és Methanopyrales rendeket, a II. osztály a Methanosarcinales és Methanomicrobiales rendeket. A szekvenciaösszehasonlításokban adódó erıs bootstrap-értékek alapján feltételezhetı, hogy a II. osztály tagjai monofiletikus csoportot alkotnak, az I. osztályról azonban ez nem mondható el. Vannak ugyanakkor más szisztematikai megközelítések is, amelyek szekvenciahasonlóság helyett génsorrend-alapú összehasonlítást vesznek alapul. Utóbbi módszer például – bár ugyancsak két osztály létét valószínősíti – a Methanopyrales és Methanobacteriales rendeket a Methanosarcinales renddel csoportosítja össze, nem pedig a Methanococcales-szel (Luo és mtsai. 2009).

20

II. IRODALMI ÁTTEKINTÉS Phylum Classis Ordo Familia példafajok Proteobacteria Deltaproteobacteria Desulfuromonadales Desulfuromonadaceae Desulfuromonas spp. Desulfovibrionales Desulfovibrionaceae Desulfovibrio vulgaris Desulfobacterales Desulfobacteraceae Desulfobacter postgatei Desulfobulbaceae Desulfobulbus spp. Firmicutes Clostridia Clostridiales Peptococcaceae Desulfotomaculum spp. Syntrophomonadaceae Dethiobacter alkaliphilus

irodalom

Klocke és mtsai. 2007

Shink 1997

Isa és mtsai. 1986 Muyzer és Stams 2008

Klocke és mtsai. 2007 Kénredukáló!

Liu és mtsai. 2009

II/5. táblázat. Szulfátredukáló baktériumok tipikus példái biogáztermelı közösségekbıl.

II/6. ábra. Az Archaea domén filogenetikai konszenzusfája 31 konzervált fehérje-szekvencia alapján Gao és Gupta (2007) alapján. Kékkel a feltüntetett metanogén fajokat jelöltük. Neighbor joining fa, az elágazási pontoknál a számok a neighbor joining (NJ) / maximum parsimony (MP) / és maximum likelihood (ML) módszerek alapján adódó bootstrap értékek.

21


Akárhogy

is

áll

azonban

a

metanogének

filogenetikájának

kérdése,

az

anyagcserepotenciálban mutatkozó eltérések és hasonlóságok a gyakorlat számára fontosabbak. A metanogének összességében kettı, jól elhatárolható anyagcseretípust alkotnak. Acetiklasztikus (vagy acetotróf) metanogénekbıl ismerünk kevesebbet: A Mathanosarcina és Methanosaeta (régebben: Methanothrix) nemzetségekben találjuk képviselıiket, illetve a Methanococcusok között találták még meg a csoport egyéb tagjaitól eltérıen acetiklasztikus Methanococcus mazeit (Zinder 1994, Touzel és mtsai. 1983; II/6. táblázat). Taxonómiai súlyukat jóval meghaladja fiziológiai jelentıségük a metántermelı közösségek életében. Bár az acetiklasztikus metanogenezis nem feltétlenül kizárólagos, így acetotrófiára alkalmas metanogének képesek lehetnek H2 és CO2 vagy más C1 vegyületek felhasználására is a metanogenezisben, in vitro jól mérhetı preferenciát mutatnak az ecetsav irányába. Phylum Classis Ordo Familia példafajok irodalom Euryarchaeota Methanomicrobia Methanosarcinales Methanosarcinaceae Methanosarcina barkeri Weiland 2010 Methanosarcina thermophila Zinder és mtsai. 1985 Methanosarcina mazei Kampmann és mtsai. 2012 Methanosaetaceae Methanosaeta concilii (régebben Methanotrix soehngenii) Penning és mtsai. 2006; 4 Methanosaeta thermophila (régebben Methanotrix thermophila) 3 Methanococci Methanococcales Methanococcaceae Metanonococcus mazei Touzel és mtsai. 1983 3 www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?mode=Info&id=2224&lvl=3 4 www.uniprot.org/taxonomy/2223

II/6. táblázat. Acetiklasztikus metanogén ısbaktériumok tipikus példái biogáztermelı közösségekbıl.

Az ecetsavbontásra nem képes metanogéneket a hidrogenotróf kifejezéssel nevezzük meg általában, mivel mindegyikük képes H2-bıl és CO2-ból metán létrehozására, és ez energetikailag is jól megtérülı, gyakran preferált s a szintrófia miatt közösségileg is igen fontos anyagcsereútjuk. A metanogének minden osztályában megtaláljuk ıket (II/7. táblázat). Egyéb szubsztrátjaik a metanogenezisben lehetnek az etanol, illetve hangyasav, metanol, metilaminok és metán tiolok (C1 vegyületek) is. Az utóbbi szubsztráttípus felhasználóit szokás

metilotróf

metanogéneknek

is

nevezni,

nem

különítve

el

élesen

a

hidrogenotrófoktól. Körülményektıl függıen ugyanis képesek lehetnek szubsztrátváltásra. A metanogének többsége egy-pár szubsztráttípus közt képes „válogatni”. Bár feltételezések szerint ez a „metilotróf” metanogenezis inkább a Föld ıskorában lehetett igazán fontos táp-

22


lálkozási mód, (minthogy akkoriban nagy koncentrációban álltak rendelkezésre alkalmas prekurzorok, pl. metanol), jelentısége ma is megnıhet olyan szubsztrátok esetén, melyek lebontásakor metanol (pektinbıl), vagy metil-aminok (pl. kolinból, betainból) képzıdnek nagy mennyiségben. A metilált szufidok metánná alakításának jelentısége kicsi, és nem is minden „metilotróf” metanogén képes rá (Zinder 1994). Phylum Classis Ordo Familia példafajok irodalom Euryarchaeota Methanobacteria Methanobacteriales Methanobacteriaceae Methanobacterium thermoformicicum (régebben Methanobacterium thermoautotrophicum) Ahring 1995; 1 Methanobrevibacter millerae Kampmann és mtsai. 2012 Methanothermobacter thermophilus 2 Methanococci Methanococcales Methanococcaceae Methanococcus spp. Ince és mtsai. 2003 Methanopyri Methanopyrales Methanopyraceae Methanopyrus kandleri Kampmann és mtsai. 2012 Methanomicrobia Methanomicrobiales Methanospirillaceae Methanospirillum hungatei Kampmann és mtsai. 2012 Methanomicrobiaceae Methanoculleus bourgensis Kampmann és mtsai. 2012 1 www.uniprot.org/taxonomy/145262 2 www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?name=Methanobacterium+thermophilum

II/7. táblázat. Hidrogenotróf metanogén ısbaktériumok tipikus példái metántermelı közösségekbıl.

II. 5. A Biogáztermelés a gyakorlatban A fentiek alapján talán már nem meglepı, hogy a biogáztermelıdés mennyiségi és minıségi viszonyait igen sok belsı és külsı tényezı befolyásolhatja, amire a mesterséges rendszerek üzemeltetıinek mindenkor tekintettel kell lennie. Az alábbiakban röviden áttekintjük a mesterséges biogáztermeltetés néhány lényeges aspektusát. Kiindulási szubsztrát tekintetében minden olyan szerves anyag szóba jöhet, melynek molekuláris strukturájához a hidrolizáló organizmusok enzimei hozzáférnek, illetve amelynek elemösszetétele kielégíti a baktériumok anabolizmusának szükségleteit. Hozzáférés szempontjából csak az erısen fásodott anyagokat zárhatjuk ki a sorból, az elemösszetétel igénye pedig csupán további feladatokat és költségeket ró az üzemeltetıre, hiszen megfelelı anyagkeverést követıen megoldható az önmagukban rossz tápelem-arányú nyersanyagok

23


együttbontása (Mata-Alvarez és mtsai. 2000). Tapasztalatok alapján irányadóként C:N:P:S = 600:15:5:1 arányban szokták megállapítani a fı tápelemösszetételt (Weiland 2010). Ez – a legtöbb figyelmet igénylı – C:N arány tekintetében 40:1 arányt jelent, bár más források 20-30:1 arányt javasolnak (Yadvika és mtsai. 2004) azzal a megkötéssel, hogy a szén nagy százaléka könnyen bontható frakcióban legyen jelen. Pontos érték már azért sem jelölhetı meg, mert tapasztalatok szólnak amellett, hogy a szükséges C:N-arány függ pl. a hımérséklettıl (Yadvika és mtsai. 2004), ráadásul a N-mennyiségnek inkább a szénvázak bontásából nyert energiával kell arányban állnia (hiszen a szén anyaga nagyrészt nem a felépülı bakteriális biomassza, hanem a távozó CH4 és CO2 részévé válik), az energianyereség értéke pedig függ a különbözı energetikájú anyagcsereutak mindenkori részvételi arányától, a kilépı CH4-CO2 arányától stb. A túl kevés nitrogén a baktériumok minıségi éhezéséhez vezet, a túl sok ugyanakkor a felesleg ammónia formájában való feldúsulásához, minthogy pedig ez pH-módosító és a baktériumokra nézvést gátló hatású lehet mind a hidrolizáló, mind a metanogén baktériumok szintjén, igen sok problémához vezet (Mata-Alvarez és mtsai. 2004, Vigneron és mtsai. 2007). A baktériumok számára kisebb mennyiségben egyéb tápelemeket is biztosítani kell. Ilyen például a nikkel, mely a metánképzésben részt vevı F430 koenzim (Weiland 2010) vagy a NiFe hidrogenázok (Thauer és mtsai. 1994) prosztetikus csoportjaként fontos, a molibdén a formil-metanofurán-dehidrogenáz kofaktoraként,

a

kobalt,

amely

az

ugyanott

szereplı

korrinoid

faktor

(5-

hidroxibenzimidazol-kobamid) felépítésében vesz részt (Thauer és mtsai. 1994). A szelén, molibdén és volfrám szerepe nem minden részletében tisztázott még, de egyes metanogén szervezetek igénylik ezeket is mint kofaktorokat. Míg ezek az elemek körülbelül 0,05 mg/l koncentrációban kell csak jelen legyenek, a vas jelenléte 1-10 mg/l koncentrációban szükséges (Bischoff 2009), többek közt a metanogenezisben szereplı vas-kén proteinek nagy száma miatt. Kalcium és magnézium adagolásával ugyancsak sikerült már metánkihozatalt növelni, ráadásul a habzás fékezésében is jótékony hatásúak (Yadvika és mtsai. 2004). Kiindulási nyersanyagként elsısorban olyan hulladékok kerülnek szóba, mint kommunális szennyvíziszap, vágóhídi hulladékok, állattenyésztésbıl származó sőrő és híg trágya, kommunális hulladék szerves frakciója, gabonaszalma, kukoricaszár és -csutka, halgazdaságok iszapja, gombahulladék, kávébab-héj, főkaszálék vagy külön erre a célra termelt energianövények, mint a cukor- és takarmányrépa, tritikálé, cirok, energiafüvek stb. (MataAlvarez és mtsai. 2000, Weiland 2010). Bár a legkönnyebben bontható, és legjobb metánarányú biogázt adó nyersanyag a kommunális szennyvíziszap, amelyet a trágya majd a növényi hulladék követ, a biogázágazatban a legnagyobb hányadot az energianövények adják Európában (Weiland 2010). A fı kategóriák megoszlását Németországban, mint a legnagyobb jelenlegi biogáztermelı államban a II/7. ábra mutatja.

24


trágya 24% energianövények 59% szennyvíz/ -iszap 5%

települési hulladék 3% ipari hulladék 2%

tájrendezési hulladék 2%

szemétlerakók 2% aratási hulladék 3%

II/7. ábra. A biogáztermelés nyersanyagkategóriáinak megoszlása Németországban, mint a legnagyobb jelenlegi biogáztermelı államban (Weiland 2010).

A tápanyagösszetételtıl nem választható el az anyagok hozzáférhetısége az enzimek számára. Az aprítás, bár energiaigényes, a nagy fajlagos hozzáférhetıségi felület miatt lecsökkenti az optimális metánkihozatalhoz szükséges tartózkodási idıt, amely – bár szubsztrát, üzemi hımérséklet és egyéb körülmények alapján 10 naptól több hónapig terjedhet – fontos gazdasági tényezı minden biogázüzem esetében (Weiland 2010). Ebben tehát optimumkeresés javallott. Érdekes, hogy a darabos adalékanyagok akkor is növelhetik a metántermelés hatékonyságát, ha fajlagos felületarányuk nem jelentıs: ha a felület adszorbensként viselkedik, lokálisan olyan magas anyagkoncentrációk kialakulását segíti elı, mely jótékonyan hathat a baktériumok szaporodására (Yadvika és mtsai. 2004). Mechanikus aprítás mellett gyakran alkalmazzák a kémiai (alkalikus bontás NH4OH-dal, NaOH-dal) és/vagy biológiai elıkezelést, mely utóbbi lehet aerob vagy anaerob természető bakteriális elıemésztés is (Mata-Alvarez és mtsai. 2000), vagy enzimadalékokkal való kezelés (Taherzadeh és Karimi 2008). Az optimális tartózkodási idı (általában kb.10-100 nap), mint már említettük, alapvetıen függ a kiindulási szubsztrát anyagi minıségétıl, és fizikai frakciómegoszlásától. Könnyen bontható szerves szubsztrátok esetén a lebomlási idı akár néhány órás is lehet, a tartózkodási idı azonban mégsem lehet ekkora egy kevert reaktorban, mivel ennyi idı alatt a lassú szaporodású anaerob baktériumok kimosódnak a rendszerbıl. Hogy ezt elkerüljük, a tartózkodási idınek a leglassabban szaporodó közösségalkotó generációs idejének kb. tízszerese kell legyen3. Híg szubszt-rátok esetén ezért megoldást jelentenek a rögzített biofilmes reaktorok, amelyekben egy nagy felülető inert hordozó felületén, élıbevonat formájában vannak 3

www.vki.ejf.hu/letoltes/219/szabadon//anaerob_szennyviztisztitas.pdf

25


jelen a baktériumok, s a szubsztrát oldata áramlik folyamatosan, nagy felületen érintkezve velük (Peters és Alleman 1983). Általános tapasztalat, hogy a reaktortartalom kevertetése javítja a metánkihozatalt, amit üzemi és félüzemi méretekben általában motorikus meghajtású propellerek, keverı- vagy kaparólapátok oldanak meg. Híg szubsztrátok (pl. szennyvíz) anyagainak lebontásakor egyéb konstrukciós lehetıségek is adódnak, mint például a recirkuláltatott gáz buborékai által keverésben tartott (gas-lift) reaktorok (Beeftink és Staugaard 1986, Sáez és mtsai. 1998) vagy a az UASB (Upflow Anaerobic Sludge Bed) reaktorok, ahol az alulról felfelé áramló, a képzıdı bakteriális flokkulumok ülepedési sebességével egyensúlyt tartó szubsztrát, valamint a képzıdı biogáz buborékai keverik finoman a biológiailag aktív iszap rétegeit (MacLeod és mtsai. 1990, Lier és mtsai. 1992.). Saját tapasztalatunk szerint ugyan híg szubsztrát (sőrített szennyvíziszap) esetén batch rendszerő (szakaszosan táplált) reaktor esetén és kis méretléptékben nem befolyásolja negatívan a gázhozamot a kevertetés hiánya, belátható, hogy a diffúziós anyagáramlást nehezítı viszkózus vagy darabos szubsztrátok esetén, illetve folyamatos táplálású reaktorokban, ahol a heterogén áramlási viszonyok miatt kialakuló pangó folyadékterek ronthatják a hatásfokot, valamilyen szintő kevertetés elengedhetetlen, hogy a baktériumsejtek környezetében ne merüljön ki, tılük távolabb pedig ne maradjon emésztetlen a szubsztrát. Fontos tényezı a szubsztrát víztartalma. A metánprodukció mindig nagy víztartalom mellett optimális, 90% alatt általában csökkenés tapasztalható a metántermelésben. A különféle szubsztrátok azonban jellegzetesen különböznek ebbéli optimumukban is (MataAlvarez és mtsai. 2000, Khalid és mtsai. 2011). A magas víztartalom a kirothasztott anyag utóéletében okozhat kezelési nehézségeket. Az üzemi hımérséklet a biogáztermelés egyik kulcstényezıje, amennyiben a baktériális közösségek összetételét a szubsztrát tulajdonságaitól függetlenül is meghatározza tagjainak élettani optimuma erre a változóra nézve. Mint az ısbaktériumok között általában, a metanogének között is jellemzıek a szélsıséges hımérsékleti optimumok. A 98 °C-on optimumot mutató, de még 110 °C-on is növekvı hipertermofil Methanopyrus kandleritıl (Kurr és mtsai. 1991) a szibériai permafrost üledékek -6 °C-on is aktivitást mutató pszichrofil metanogén izolátumaiig (Wagner és mtsai. 2007) széles a skála. A világon mőködı mesterséges biogáztermelı rendszerek többsége 30 és 40 °C közötti mezofil hımérsékleten üzemel, és hogy ennek inkább oka vagy következménye az, hogy többet tudunk a mezofil közösségek összetételérıl, nehéz eldönteni. Az azonban szembeötlı, hogy a pszichrofil közösségek és reaktorfolyamatok kimondottan elhanyagolt területei a vizsgálódásnak, noha üzemelnek reaktorok ilyen hımérsékleten (30 °C alatt). (Kashyap és mtsainak. 2003-as összefoglaló munkáját a pszichrofil biometanációról az elmúlt tíz évben

26


98-an idézték, ami nem mondható soknak annak fényében, hogy ez az egyetlen összefoglaló munka a szőkebb témában, míg például Weiland 2010-es általános összefoglalóját 202en idézték az elmúlt három évben). Az okok közül talán azt lehetne kiemelni, hogy a pszichrofil folyamatok lassabban zajlanak, másfelıl pedig általános tapasztalat szerint az 55 °C körüli optimumon mőködı termofil folyamatok instabilabbak, 50 °C fölött az ammónia toxicitása kifejezettebb, és az üzemi hımérséklet tartása is plusz energiaráfordítást igényel (Khalid és mtsai. 2011). Bár utóbbival kapcsolatban Weiland (2010) megjegyzi, hogy a kombinált rendszerő, hı- és villamos energiát is termelı telepeken általában hıtöbblettermelés van, ami használható volna a reaktorok továbbfőtésére is. İ is elismeri azonban, hogy a lakossági főtésrendszerek általánosabb rácsatlakozása e telepekre, illetve a biogáz esetleges rávezetése a földgázhálózatra újra visszavetheti a termofil reaktorok energiahatékonyságát. Fontos elınye azonban a termofil reaktoroknak a gyors anyaglebontás, valamint a patogén mikroorganizmusok jóval hatékonyabb eliminációja (Sahlström 2003, Weiland 2010), amely a kirothasztott végtermékek elhelyezését teszi biztonságosabbá. További ok lehet,

hogy

ismereteink

szerint

a

szulfátredukáló

baktériumok

növekedési

optimumhımérsékletük alapján jellegzetesen két csoportra oszlanak, mezofil (20-40 °C) és termofil (60-70 °C) csoportra (Sonne-Hansen és mtsai. 1999). Minthogy a termofil csoport optimuma fölötte van a termofil metanogének optimumának, 55 °C környékén kevésbé számíthatunk kiélezett hirdogénkompetícióra. Mind a mezofil, még inkább a termofil közösségek igen érzékenyek a hımérsékletingadozásra ami a metánprodukció stabilitását illeti, ezért precíz hımérsékletszabályozásra van szükség a reaktorokban (Yadvika és mtsai. 2004), szerencsés körülmény azonban, hogy mindkét közösségtípus könnyen regenerálódik akár hosszabb és komolyabb hımérséklet-eltolódások után is (Ahn és Forster 2002). Végül a pH igen fontos paraméter, mivel a metanogének e tekintetben szőktőrésőek. A metanogén rendszerek pH optimuma 7 és 8 közé esik, 6 és 8.5-ös pH alatt illetve felett már drasztikusan csökken a metántermelıdés. Savanyodás könnyen bontható szubsztrátokkal való túltáplálás következtében állhat be könnyen a feldúsuló illósavak miatt, illetve túlzott nitrogénterhelés esetén a felszaporodó ammónia növelheti a pH-t. Megfelelı szubsztrátkeverés és -adagolás, továbbá puffer és adalékanyagok (pl. mész) hozzáadása biztosíthatja a kiegyensúlyozott pH-t. Mivel a primer fermentálóknak nem feltétlenül esik egybe az optimuma a szekunder fermentáló szervezetekével és metanogén baktériumokéval se a pH, sem a hımérséklet tekintetében, gyakran alkalmazzák a kétfázisú biogázszintézist, ahol két egymást követı lépcsıben, elkülönített és más körülményeket biztosító reaktorokban zajlik az illósavak szintézise illetve a szinrófiában megvalósuló metanogenezis (Parawira és mtsai. 2005, Weiland 2010).

27


II. 6. A biogáztermelı közösségek mikrobiológiai vizsgálómódszerei II. 6. 1. A módszercsoportok általános és történeti áttekintése Áttekintésem elızı fejezetében reményeim szerint sikerült meggyızıen bemutatnom, hogy a biogén metán elıállása – akár természetes, akár mesterséges körülmények között is történik – mindig egy-egy igen komplex mikrobiológiai rendszer alrendszereinek magas szinten összehangolt mőködésén alapszik. Nem véletlen tehát, hogy a mikrobiológia tudománya mindig is nagy figyelmet szentelt ezeknek a mikrobiális rendszereknek, és lehetıségeinek arányában minden eszközével vizsgálati körébe vonta azokat. A fentiekben bevezetett történeti szemlélettel tekintem át a mikrobiológiai módszercsoportokat az alábbiakban. Vizsgálhatóság tekintetében a metántermelı közösségek természetesen kevéssé számítanak speciálisnak az egyéb mikrobiális közösségtípusok között, így vizsgálómódszereik köre és története sem választható el azokétól. Ahol mégis, ott azt külön kiemelem. A mikrobiális kutatások történetén szinte a kezdetektıl végighúzódik egy finom törésvonal a vizsgálódás statikus, egy-egy organizmusra önmagában, és egy dinamikus, az organizmusokat egymás és abiotikus környezetük viszonyrendszerében vizsgáló ökológiai fókusz között. A másodikat egy lépéssel általában megelızi az elsı fajta a kutatás frontvonalán, hiszen ennek kellett kitermelnie azokat az alapismereteket, melyeket a másik szemléletmód aztán rendszerbe foglalhatott, illetve mert ez a szemlélet áll talán közelebb az orvosi mikrobiológiához, amely tudományfinanszírozási okokból mindig is húzóágazat volt a diszciplínán belül. Ez a kettısség – noha a két irányzat viszonya általában nem versengı, hanem megtermékenyítıen kooperatív – nézetem szerint jól tetten érhetı a mikrobiológia tudományának mai arculatán is, ahogyan már a kezdetekkor is megmutatkozott. A XIX. század második felében jelent meg a Robert Koch nevével fémjelezhetı, és a mikrobiológia módszertanát majd egy évszázadra megalapozó módszertan, mely alapvetıen szilárd táptalajon, izoláltan kinövesztett tiszta tenyészetek élettani, mikroszkópos és állatkísérletes vizsgálatán alapult. A XX. század elején zárkózott fel e mellé a Szergej Vinogradszkij megalapozta ökológiai szemlélető irányzat, mely kevert mikrobiális kultúrák belsı kölcsönhatásokban megnyilvánuló törvényszerőségeit kutatta. (Lechevalier és Solotorovsky 1965, Penn és Dworkin 1976). A mikrobiológia fejlıdését az 1970-es évekig lényegében e meglévı technikák tökéletesedése és az ismeretek gyarapodása jelentette. Egyre inkább gátjaivá váltak azonban a továbbhaladásnak a bizonytalan határozóbélyegek (pl. a telep- illetve sejtmorfológia és egyéb fenotípusos tulajdonságok) valamint a nem vagy csak igen nehezen kitenyészı baktériumok mind szembeötlıbben nagy száma. Az ökológiai szemlélet létjogosultságát (és a módszertani újítás általános igényét) egyébként tán nem is jelzi más jobban, mint a Methanobacillus

28


omelianskii fedınéven három évtizeden át inkognitóban élı szintróf együttélés Barker laboratóriumában. A bakterológiai vizsgálatok mennyiségi következtetéseinek kérdıjeles volta így is csak az 1980-as évekre vált megkerülhetetlenné, amikor is nagyságrendi különbségek mutatkoztak meg a direkt mikroszkópos sejtszámláláson és a hagyományos, tenyésztéses telepszámláláson alapuló módszerek eredményei között. Ez a jelenség Staley és Konopka (1985) kifejezésével „nagy telepszámlálási anomália” (the great plate count anomaly) néven híresült el. Különféle becslések eredményei alapján kimutatták: talajmintákból élıhelytıl függıen a baktériumoknak csak mintegy 0,1-1 %-a tenyészthetı ki (Torsvik és mtsai., 1990), míg egyes vízi élıhelyekrıl 4-6 nagyságrendes különbséget is kimutattak (Grimes és mtsai., 1986). Metántermelı közösségekrıl ugyancsak születtek a tenyésztéses technikák elfogultságát elemzı publikációk (Wagner és mtsai. 1993). A hagyományos lemezöntéses telepszámlálás inkubációs ideje alatt akaratlanul guild-szelekciót provokál a kutató, hiszen a mintázott élıhelyétıl eltérı körülményeket teremtve azokat a közösségalkotókat juttatja szaporodási elınyhöz, amelyeknek az új körülmények felelnek meg. Így tehát az eredeti élıhelyen passzív, dormans alakban nyugvó mikrobák akár dominánsnak is mutatkozhatnak a tenyésztés végén, míg az eredeti domináns csoport esetleg meg sem mutatkozik. Természetesen minél jobban hasonlítanak a tápközegbeni körülmények az élıhelyihez, annál gyengébb az eredménytorzulás, így ezen a területen is elınyt élveztek azon kutatások, melyek vizsgálati területeinek baktériumai jól tenyésznek az egészségügyi vizsgálatok számára nagy ráfordítással fejlesztett különféle univerzális, dúsító vagy szelektív táptalajokon. Ezen aerob vagy mikroaerofil organotróf baktériumokéval szemben döcögısen haladhatott az olyan élıhelyek benépesítıinek tenyésztésalapú kutatása, mint a rothasztók szintróf kapcsolatokban gazdag anaerob közege vagy tiszta vizek és az oligotróf területek. Bár semmilyen élı baktérium mesterséges tenyésztése nem jelent elvi lehetetlenséget, a természetes habitatok lehetséges életkörülményeinek sokféleségét lefedı táptalajkészlet kidolgozása gyakorlatilag lehetetlen. Ennek ellenére máig folynak módszerfejlesztések új és új mikrobák tenyésztésbe vonására oligotróf környezetet tükrözı természetes vagy kis tápanyagtartalmú táptalajok, növekedési faktorok, mesterséges gradiensek, diffúziós technikák stb. segítségével (Cappuccino és Sherman 2010). Sajnos azonban a tenyésztéses technikák mind idı-, munka- és költségigényes módszerek, így nagy mintaszámú vizsgálatokban alkalmazhatóságuk korlátozott. Ennek ellenére használatuk és fejlesztésük megkerülhetetlen feltétele a mikrobiális ökológia haladásának is, hiszen tiszta tenyészetek alapján juthatunk ahhoz az alapvetı ismeretkészlethez, melyre minden más módszer kidolgozásában és/vagy eredményeinek értelmezésében támaszkodnunk kell (Nichols 2007). A XX. század második felében tehát megérett a helyzet a guildszelekció lehetıségét kikerülı, tenyésztéstıl független vizsgálati módszerek térnyerése elıtt, s a tudományos és

29


technikai fejlıdés elıretörése egyaránt szerencsésen találkozott ezzel az igénnyel. A mikrobiológia mindinkább megpróbál a mikrobák által in situ hagyott „nyomok”: kémiai markermolekulák, különösképpen pedig információs „arculattal” rendelkezı nukleinsavmarkerek alapján tájékozódni a mikrobális közösségekrıl. Elsıként a közösségi DNS egészét kezdték vizsgálni olyan módszerekkel, mint a közösségek

teljes

DNS-készletének

kereszthibridizációja

(total

genomic

cross-DNA

hybridization), a denaturált DNS reasszociációs kinetikájának vizsgálata (Thermal denaturation and reassociation of whole extracted DNA), vagy a G+C arányon alapuló sőrőséggradiens alapú összehasonlítás (Ranjard 2000). Hamarosan azonban kiemelt jelentıségő felismeréssé vált a filogenetikai leszármazás történetérıl információt ırzı kronométerszekvenciák használhatósága mind a baktériumok identifikációjában mind a determinációban, ami elvezetett a genomméret alatti vizsgálódás igényéhez. Elsıként a citokróm-c fehérje aminosavszekvenciájának vizsgálata kezdıdött el, ám ezt közösségvizsgálatokban sosem alkalmazták. Ezt – elsısorban Carl Woese munkássága nyomán (Woese 1987) – rövidesen felváltotta az (eltérı sebességgel változó régióik folytán különbözı mélységő filogenetikai viszonyokban is használható és univerzálisan elıforduló) riboszomális RNS-gének bázissorrendjének használata (Sipos 2009), ezek közül is elsısorban a 16S rRNS-géné. Woese még a különálló rRNS molekulák kinyerésével jutott vizsgálati anyaghoz, ám ezekben az években indult hódító útjára Kary B. Mullis találmánya (1986), a polimeráz láncreakció (PCR), amivel a DNS célzott szakaszának vizsgálata is rutinszerővé válhatott, s mind a citokrómok, mind az RNS-ek vizsgálata jórészt génjeik szintjén folytatódhatott. Megnyílt továbbá az út a funkciógének kimutatásához is, felgyorsulhatott a nukleinsav-próbák hibridizációján alapuló kimutatási technikák pl. a FISH (fluoreszcens in situ hibridizáció) fejlıdése (Wagner és mtsai. 1994), és a Sanger-féle DNS-szekvenálási eljárás is új alapokra helyezıdött. A teljesgenom-vizsgálatoknak ugyan máig megvan az alkalmazási területük, és más amplifikációs technikák is napvilágot láttak a PCR-en kívül (pl. Multiple displacement amplification – MDA; Dean és mtsai. 2002), mégis a PCR-alapú DNSamplifikátumok vizsgálati köre indult robbanásszerő fejlıdésnek. Egyrészt lehetıvé vált a génspecifikus közösségi klónkönyvtárak rutinszerő létrehozása, mely önmagában is felfogható elválasztástechnikai és amplifikációs technikának, másrészt a közösségi szintő DNSujjlenyomatmintázatok kinyerése lehetıvé tette az egyes közösségek gyors összehasonlítását, egyes módszerek esetében pedig taxonómiai információ közvetlen kinyerését is azokból. A közösségen belüli filogenetikai diverzitás mellett a funkcionális diverzitás feltárását a különbözı gének közösségi expressziós mintázatát megmutató RNS-alapú vizsgálati módszerek teszik lehetıvé. A tisztított RNS molekulákról reverz transzkriptáz enzimekkel in vitro DNS-másolat (cDNS) készül, melynek további vizsgálata a DNS-mintákéhoz hason-

30


lóan folytatódik. Legelterjedtebben az univerzális primerekkel felszaporított 16S rRNS gének változatosságát elemzik, ezen a példán is vehetık sorra a legelterjedtebb közösségvizsgálati módszerek. A DNS alapú ujjlenyomat-módszerek között némiképp önkényes felosztással elkülöníthetünk olyanokat, amelyek az amplifikált DNS-szakaszok (vagy azok származékainak) mérete alapján rendezik ezeket mintázatba általában agaróz vagy poliakrilamid gélelektroforézissel. Az amplifikált szakaszok természetes hosszpolimorfizmusának elektroforetikus elemzésén (Length Heterogeneity PCR) túl méret szerint rendez az ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis), a T-RFLP (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism), a riboszomális gének közötti spacer-régiók erıs hosszpolimorfizmusát feltáró RISA (Ribosomal Intergenic Spacer Analysis), vagy a ma már ritkábban használt RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) (Muyzer 1999). Az emésztéses, random, vagy spacer régiókat elemzı módszerek közös vonása, hogy további filogenetikai elemzést nem vagy csak igen korlátozottan tesznek lehetıvé, ám pl. az ARDRA és a T-RFLP a klónkönyvtárak és közösségi ujjlenyomat-mintázatok összeegyeztetését nagyban segíthetik. A felszaporított közösségi génszakaszon belüli szekvenciális eltéréseket tárják fel a DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) a TGGE (Thermal Gradient Gel Electrophoresis) az SSCP (Single-Stranded Conformational Polymorphism) vagy a biszbenzimid-polietilénglikol (Bb-PEG) elektroforézis. Hátrányaik között szerepel a mérési körülményekre való nagyfokú érzékenység, a hatékony elválasztást illetı amplikonméretkorlát és egyéb hibalehetıségek (Muyzer 1999, Ranjard 2000). Elınyük viszont, hogy az elektroforézist követıen a sávok jelölt próbákkal azonosíthatók, vagy a gélbıl kivágva tovább vizsgálhatók, szekvenálhatók stb. Így igen jól lehet becsülni a mintázat egyes elemei termelıinek taxonómiai helyét. A felsorolás korántsem teljes, egyrészt mivel csak a legelterjedtebb eljárásokra szorítkozott, másrészt mivel mind a mai napig születnek új és új technikák. A nukleinsav alapú ujjlenyomat-módszerek és a klónkönyvtárak a mikrobiális közösségelemzés egyik leghatékonyabb jelenlegi módszerkörét adják, ugyanakkor hibáik is számosak. Az egyik fı problémát az okozza, hogy a PCR-t és a mikrobiális ökológiában alkalmazott módszerek jelentıs hányadát eredetileg az orvosi diagnosztika céljaira fejlesztették ki, így specifikus kimutatásokra és ebbıl adódóan egyféle rendszerre, egyféle templátra dolgozták ki, például a DGGE módszert egy szervezet egyetlen génjének pontmutáció-detektálására (Sipos 2009). A közösségelemzésre való optimálásra való törekvések folyamatosak, az ökológiai szemlélető kutatatás azonban itt is elszenvedi a lépéshátrány következményeit. A másik komoly nehézséget a DNS in vitro kezelésében rejlı olyan csökkenthetı, de teljes mértékben kikerülhetet-

31


len hibalehetıségek jelentik, mint a preferenciális amplifikáció a PCR (Sipos és mtsai. 2007) vagy a preferenciális ligálás a klónozóvektorok esetében (Palatinszky és mtsai. 2011). A preferenciális amplifikáció legszélsıségesebb példája, amikor egy mismatch a primer 3’végi pozíciójában a templát amplifikációjának teljes elmaradásához vezet (Ishii és Fukui 2001), de ha máshol is van, minél közelebb helyezkedik el a 3’ véghez, annál nagyobb mértékben jelentkezik a preferenciális amplifikáció. A PCR alapú eredmények mennyiségi torzulásához hozzájárulhat pl. a közösségalkotó mikrobák rRNS-operonjainak számában mutatott különbség, vagy az operonok közötti heterogenitás egyazon genomon belül (Crosby és Criddle 2003). Igen fontos végül a közösségi génszakaszok felszaporítására használt univerzális primerek problematikája, hiszen ezek az univerzálisnak szánt próbákat a már ismert baktériumok célgénjeinek konszenzusszekvenciáihoz tervezik meg, ezek pedig körülbelül azt a bizonyos 1%-át teszik ki az összes becsült taxonnak. A PCR tehát ab ovo elınyben részesíti a már leírt taxonok képviselıit és közeli rokonaikat. (Ez igen határozottan támasztja alá azt, amit a tenyésztésen alapuló fajleírások megkerülhetetlenségérıl fentebb írtunk.) Ennél fogva az amplifikáción átesett mintákból származó eredmények mennyiségi vonatkozásban szemikvantitatívnak mondhatók. Az RT-PCR (Real Time PCR) technika ugyan jóval pontosabban adja vissza a kiindulási minta mennyiségi viszonyait, itt azonban pontosan meghatározott célszervezetek mennyiségi arányainak magállapítása lehetséges csak, közösségfeltárásra nem nyílik lehetıség. A tejesség kedvéért érdemes néhány szót ejteni az új generációs, nagy áteresztı képességő DNS-szekvenálási módszerekrıl, melyek jelenleg rohamosan terjednek a biológiai kutatásokban, s a közösségmikrobiológia is kezdi felvenni eszköztárába ezeket. Jóllehet ezeket a módszereket is genetikailag kis variabilitást mutató szövetminták és tiszta tenyészetek vizsgálatára tervezik és optimalizálják, a közösségi genomvizsgálatokhoz is nyújtanak ígéretes perspektívát. Az emulziós mikroreaktorokban vagy mikrotiter-lemezeken megvalósuló klonális PCR-ek sokasága kiválthatja a munkaigényes klónkönyvtárkészítést, valamint mivel célgének korlátozott hosszúságú szekvenciái helyett egész génkontigokat mutathatunk ki a közösségekbıl, elvben funkció is rendelhetı lehet a közösségalkotókról nyert taxonómiai információkhoz pusztán DNS-alapon is. Az átfedı genomrészletek óriási számítási kapacitással való elillesztésén alapuló módszerkörnek sokáig korlátjaként tőnt föl az egyszeri leolvasások lehetséges maximális hossza, ami a közösségi genomok kuszaságában való eligazodáshoz kulcsfontosságú kritériumnak látszik. A Roche 454 rendszer jelen dolgozat írásakor azonban már közelíti az 1000 bázispáros leolvasási hosszok lehetıségét, amivel a hagyományos PCR reakciók és az ezen alapuló szekvenálási eljárások leolvasási hatékonyságát közelíti jóval nagyobb számú egyszerre kezelt minta és rövidebb futásidık mellett. Kérdés ugyanakkor, hogy a most még csak feltárulni látszó óriási lehetıségek me-

32


zején milyen problémák, elıre nem látott bizonytalanságok és módszertani korlátok bukkannak majd elı a közösség-mikrobiológiai alkalmazás terén, s önmagában kérdés lehet az is, hogy meddig és milyen széles körben engedhetik meg maguknak az ipari társadalmak az ekkora beruházásokat igénylı high-tech tudomány finanszírozását… Ezért korai volna még takarodót fújni a közösségvizsgálatok napjainkig használt „hagyományos” ujjlenyomatmódszereinek – még ha ezt egyes nyugati mőhelyekben meg is teszik. A fejlesztık által is gerjesztett tudományos optimizmus hangjai mellett óvatos, sıt szkeptikus véleményeket is hallani lehet a tudományos közösségben, a módszerfejlıdés jelen üteme mellett ugyanakkor senki nem fogalmaz még meg karakán állításokat a jövı lehetıségeit és korlátait illetıen. Noha a mikrobiológiai háttérkutatás napjainkban hangsúlyosan a nukleinsav alapú molekuláris biológia módszereire támaszkodik, ezek robbanásszerő fejlıdése sem oldotta meg a tudományág egyik klasszikus nehézségét, mely szerint nincsen olyan, önmagában jól kiragadható egyetlen bélyeg, amely alapján egy baktérium egyértelmően és megnyugtatóan identifikálható lenne. Ezért célszerő egyszerre több fenotipikus bélyeget figyelembe venni a fajleírások során. Így terjedt el a több párhuzamos vizsgálati módszerrel egyszerre dolgozó polifázikus taxonómia szemléletmódja az identifikációban és determinációban. Még inkább jelentkezik ez a nehézség a közösség-mikrobiológiában, ahol tiszta tenyészetek helyett egymástól fizikailag izolálhatatlan csoportok keverékével kell dolgoznunk, s ezeket közös mintákból kiindulva kell megkülönböztetnünk egymástól. Éppen a PCR alapú technikák mennyiségi viszonyok feltárásában mutatott bizonytalansága húzza alá a tenyésztéstıl és amplifikációtól egyaránt független módszerek fontosságát, amelyek közül a közösségmikrobiológiai vizsgálatokban a kemotaxonómia adaptált módszerei a legelterjedtebbek. A kemotaxonómiai módszerek választásának legfontosabb indoka annak felismerése, hogy ez a módszerkör ígéretesen szolgálhatja a nukleinsav-alapú módszerek alapján nyert információ értelmezését, sıt mennyiségi viszonyok tekintetében azoknál megbízhatóbb információt ad.

II. 6. 2. Kemotaxonómia a közösségvizsgálatokban A kemotaxonómia a változó szekvenciával vagy szerkezettel rendelkezı biológiai polimerek illetve molekulák sokféleségét elemzı, s azt a rendszertan illetve a meghatározás területén felhasználó biológiai segédtudomány. A varlábilis molekulák adta mintázatok termelıikre specifikus voltát elıször a növényrendszertan területén kezdték kihasználni (Wiertelak 1931, Hawksworth 1976, Vaughan és Denford 1968, Harborne és mtsai. 1971, Gibbs 1974), és az új megközelítési mód gyorsan terjedt a botanikán kívül a mikrobiológia területén is (Gorin és Spencer 1970, Lechevalier 1977, Minnikin és Goodfellow 1981, Nahaie és mtsai. 1984). Eleinte ezen a területen is a

33


determináció és identifikáció területén használták ki a kémiai markereket mint rendszerezési szempontot nyújtó taxonómiai bélyegeket, de a parazitológia területén való felhasználás (Maazoun és mtsai. 1980) útján végül a közösségvizsgálatok eszköztárába is felvételt nyert e módszerkör (Höfle 1988, White 1988). Jóllehet a bakteriális kemotaxonómia számos markermolekulával dolgozik, ha tiszta tenyészeteket vizsgál (lipidek, sejtfal-aminosavak és szénhidrátkomponensek, proteinek), a közösségvizsgálatokban elsısorban a lipidfrakció foszfolipid-zsírsavainak és a respiratorikus kinonjainak használata terjedt el. Kis súllyal bár, de teret nyer az intakt foszfolipidek használata is a közösségfeltárásokban (Gehron és White 1983), és a teljes (nem csak membránalkotó foszfolipideket érintı) észterlipid-frakció vizsgálata is (Green és Scow 2000). Az Arcaea domén tagjainak éterlipidjei unikális jellegük miatt megbízható indikátorai az ısbaktériumok biomassza-mennyiségének, ám kis variabilitásuk folytán finomabb közösségjellemzést nem tesznek lehetıvé. További hátrányuk preparálásuk munka- és mérésük idıigényes volta a Bacteria-zsírsavakéhoz és a kinonokéhoz viszonyítva (Gattinger és mtsai. 2003). A DNS- vagy fehérjealapú vizsgálómódszereknél kisebb felbontóképességük dacára e módszerek jelentısége növekedett a környezetmikrobiológiában egyrészt a polifázikus szemlélet terjedése miatt, másrészt amiatt, hogy ezek javára írható kisebb költségvonzatuk, esetenként alacsonyabb idı- és munkaigényük, továbbá az is, hogy amplifikációs lépés híján eredményeik torzítás nélküli leképzıdései a mintában található abundanciviszonyoknak. A zsírsav és kinonvizsgálatok alkalmazhatóságának alapja a közösség-mikrobiológiában egyrészt viszonylag egyszerő izolálhatóságuk, másrészt az a szerencsésnek mondható helyzet, hogy az eukarióta élıvilág (leszámítva a gombákat) mindössze néhány kinont (koenzim-Q [Q10], plasztokinon, fillokinon [MK-4]) és kevés zsírsavat, elsısorban páros, 12-24 C-atomszámú monokarbonsavakat termel. (Bár növényi magvakban felhalmozódhatnak igen nagy koncentrációban „különleges” zsírsavak is [Millar és mtsai. 2000], ezek nem befolyásolják jelentısen a módszerek környezetmikrobiológiai alkalmazhatóságát.) A molekulavariánsok túlnyomó többségén ezzel szemben elsısorban a baktériumok, másodsorban a gombák osztoznak. Telített ubikinont például mindmáig csak gombákból írtak le, menakinonok pedig kizárólag prokariótákban fordulnak elı (a fillokinont kivéve, mely azonban a bakteriális eredető növényi plasztiszok kinonja). A baktériumok világában azonban igen jelentıs variabilitással szerepelnek e markermolekulák (Collins és Jones 1981, Zelles 1999). A taxonómiai diverzitás mellett a funkcionális diverzitás kutatását is lehetıvé teszik az izotópos technikákkal kombinált kemotaxonómiai módszerek, ahol C13 tartalmú tápanyagok közösségbe juttatását követıen az azokat hasznosító

baktériumok

markermolekuláiban

lesz

jelen

az

izotóp,

ezek

pedig

tömegspektrometriásan elválaszthatók az anyagcsereaktivitást nem mutató, vagy más szubsztrátokon élı közösségalkotók hasonló molekuláitól (Green és Scow 2000, Yao és

34


mtsai. 2012). Fiziológiai változások nyomon követésére speciális esetekben ugyancsak alkalmas lehet a módszerkör, egyes közösségalkotók ugyanis körülményeiknek megfelelıen módosíthatják zsírsav- és kinonprofiljukat is (Kieft és mtsai. 1994). A zsírsavak a sejteken belül nagyon sok helyen, és változatos formában lehetnek jelen. A kemotaxonómiában markerként használt zsírsavak elsısorban a sejtek plazmamembránját felépítı foszfolipidek alkotóelemei. Egy membránalkotó foszfolipid egy hidrofil fejbıl és egy hidrofób láncrészbıl áll. A fej egy glicerinmolekula, ami két zsírsavval és egy foszfátcsoporttal alkot észterkötést, a láncrész pedig általában a két, hosszú zsírsavláncból áll. A szénlánc általában 14-20 szénatomot tartalmaz, és a leggyakoribbak az egyenes láncúak, az egyszeresen telített (egy kettıs kötést tartalmazó), illetve az egy metil-csoportot tartalmazó változatai. A metil-csoport elhelyezkedése (izo vagy anteizo elágazás), és a kettıs kötés elhelyezkedése taxonómiai jelentıséggel bír (II/8. ábra). A baktériumok zsírsav-összetétele nemzetségre jellemzı tulajdonság, ezen belül a fajok általában a zsírsavak arányában térnek el. Csoportosításukat, melyet a közösségvizsgálatokban alkalmaznak, az II/8. táblázatban láthatjuk. Jelölés PLFA SATFA i, a, Me

Elnevezés foszfolipid zsírsavak telített, észterkötéső zsírsavak egyenesláncú elágazó láncú

Elıfordulás, indikációs lehetıség biomassza Bacteria, Eukaria Bacteria, Eukaria Gram-pozitív baktériumok; szulfátredukáló baktériumok, Cytophíga, Flavobacterium, Actinobacteria Gram-negatív baktériumok, Clostridium, Bifidobacterium nemzetségek

-cy

ciklopropil tartalmú

MUFA 16:1ω6 18:1ω6

egyszeresen telítetlen észterkötéső zsírsavak 16-os lánchossz, 1 kettıs kötés a láncvégtıl a 6. helyen 18-as lánchossz, 1 kettıs kötés a láncvégtıl a 6. helyen 15-ös, 17-es lánchossz

I-es típusú metanotróf szervezetek I-es típusú metanotróf szervezetek Szulfátredukáló baktériumok

PUFA

többszörösen telítetlen észeterkötéső zsírsavak

Eukarya. cianobaktérium

PLOH α β ω myl

észterkötéső, hidroxi-szubsztituált zsírsavak -OH a karboxilcsoport melletti 1. szénatom -OH a karboxilcsoport melletti 2. szénatom -OH a karboxilcsoportot követı utolsó szénatomon miklosavak (β-hidroxi, α-elágazás)

Gram-negatív baktériumok, Actinobacteria Mycobacterium Gombák Actinobacteria

UNOH α β myl

nem észterkötéső, hidroxi-szubsztituált zsírsavak -OH a karboxilcsoport melletti 1. szénatom -OH a karboxilcsoport melletti 2. szénatom miklosavak (β-hidroxi, α-elágazás)

Anaerob baktériumok Sphingomonas, Candida Bacteroides, Flavobacterium Mycobacterium, Nocardia

II/8.táblázat. A leggyakrabban elıforduló zsírsavtípusok és jellemzı termelıik (Zelles, 1999)

Elnevezésük rendszere, bár kissé kaotikus, az alábbi alapvetı szabályokat követi: az alapláncot mindig a szénatomok számával jelöljük, kettıspont után pedig a szénlánc telítettségi fokát. Pl. C18:0 – a 18 szénatomból álló, elágazás nélküli zsírsav, más jelöléssel 18:0. 18:2 – 18 szénatomból álló, elágazás nélkül zsírsav, amely két kettıskötést tartalmaz. A 35


kettıs kötések helyzetét számozhatjuk a láncvégtıl, ilyenkor kis omegával jelöljük (18:2ω9,12c – 18 szénatomból álló zsírsav, amiben két kettıskötés van, a láncvégtıl számítva a 9. és 12. szénatomnál), de számozhatunk a karboxil-csoporttól is az izomertípus feltüntetésével (ilyenkor ugyanez pl. 18:2 c6 t9, ahol c cisz-, t pedig transz- helyzető elrendezıdést jelöl a kettıs kötéseknél). Az izo- vagy anteizo elágazásokat „i” illetve „a” betővel jelöljük, a ciklopropil tartalom jele cy. Többek közt Gram-negatív baktériumok, gombák, aktinobaktériumok zsírsavai tartalmazhatnak OH- csoportot vagy csoportokat. Ennek a helyzetét (ha ismert) a görög abc betőivel jelöljük (II/8. táblázat).A zsírsavak többségének van saját neve is, pl. 15:0 = pentadekánsav. Ez a rendszer azonban a gyakorlatban nehezen kezelhetı.

II/8. ábra. A zsírsavak általános felépítése.

A kemotaxonómiai markermolekulák az organizmusok faji szintő besorolására nem használhatók, de a közösséget alkotó csoportok nemzetség vagy magasabb taxonómiai egységek szintjén már gyakran elválnak egymástól a kinon- illetve zsírsavprofil alapján. A respiratorikus kinonok a baktériumok és eukariota sejtszervecskék membránkapcsolt elektrontranszport-folyamataiban részt vevı proton- és elektronszállító vegyületek. Alapfelépítésük szerint egy egy- vagy többgyőrős kinoidális molekularészbıl és az ezt szubsztituáló csoportokból állnak. Az utóbb említett csoportok közül az egyik, általában a kinon csoport 2. szénatomját szubsztituáló poliizoprén lánc teszi lehetıvé a sejtmembránban való oldódásukat. Ez utóbbiak a láncokat felépítı egységek száma, és telítettségi foka szerint változóak, és ez alapján kromatográfiásan elválaszthatók. Egy-egy mikrobafaj egy, esetleg két-háromféle kinont termel nagy mennyiségben (major kinonok),

36


és számos más felépítéső minor kinont lényegesen kisebb mennyiségben. Jelölésük rendszere a következı: MK-val jelöljük a mena-, Q-val az ubikinonokat. (felépítésüket ld. II/9. ábra) Ezt az izoprénegység száma követi. Telített láncú kinonoknál a telítettség fokát zárójelbe írva jelöljük (pl.: MK5(H2) – 5 izoprénegységbıl álló oldallánccal rendelkezı menakinont jelent, melynek oldalláncán egy eredetileg kettıs kötés telített.) Ha ismert, akkor a hidrogenáltsági fok elé bekerülhet római számmal a telített izoprénegység pozíciója is. Ilyenkor a kinonrésztıl indulva számozzuk az egységeket: MK5(II, III -H4) - ötös izoprénes menakinon, melynek a kinonrésztıl számított második és harmadik izoprénegysége telítıdött. A menakinonok variabilitása, így taxonómiai értéke is nagyobb a diverzitásvizsgálatokban. Míg a Gram-negatív baktériumoknál mind ubi-, mind menakinonok elıfordulnak (sıt, némely csoportjaik kinontípust válthatnak környezetük redoxpotenciálja szerint), addig Gram-pozitív csoportok esetében kizárólag menakinonok fordulnak elı nagy variabilitással.

II/9.ábra. Kinonok általános felépítése

A II/9.a., b. és c. táblázatok összefoglalóan, bár a teljesség igénye nélkül mutatják gyakoribb ubi- és menakinontípusok elıfordulását különbözı mikrobanemzetségekben. Talajból lipideket elıször az egyfázisú Bligh-Dyer módszerrel (Bligh & Dyer, 1959), majd ennek módosításával (White, 1979) vontak ki. A lipidextraktumból a foszfolipidek oszlopkromatográfiás módszerrel kitisztíthatók, majd átészteresítéssel zsírsav-metilészterek képezhetık, melyek gázkromatográfiás módszerrel pontosan azonosíthatók. Ezt a módszert tökéletesítette Zelles és Bai (1993). Mégis sokan az elsı, egyszerőbb módszert használják kemotaxonómiai

markerek

extrakciójához.

Az

elsı

zsírsav-alapú

közösségi

mintázatelemzések mezıgazdasági talajok vizsgálatában nyertek teret (Zelles és mtsai. 1992; Klug & Tiedje, 1993; Reichardt 1997; Ibekwe és mtsai, 1998;). Bardgett és mtsai. (1997) eredményei szerint zsírsavanalízis alapján megkülönböztethetık a legeltetett és nem legeltetett területrıl származó talajok. Frostegård és mtsai 1993-ban eltérı talajok nehézfémszennyezésének hatását vizsgálták e módszerrel. Mindkét típusú talajban csökkent

37


a Gram-pozitív, és nıtt a Gram-negatív baktériumok zsírsavainak mennyisége a szennyezés hatására. A mikrobiális biomassza mennyisége egyértelmő csökkenést mutatott mind a PLFA, mind az ATP mind a talajrespiráció alapú vizsgálatok szerint. Trinitro-toluolos talajszennyezés hatását PLFA-alapon vizsgálva Wilke és mtsai. 2004-ben azt találták, hogy a gombák és egysejtőek mennyisége csökkent, majd a szervesanyag-kezeléssel járó talajremediáció hatására lényegesen megnövekedett. kinon ubikinon

Gram-negatív baktérium

Q-6 Q-7 Q-8

Rhodopseudomonas Shewanella Burkholderia, Comamonas, Thiobacillus, Alcaligenes, Xanthomonas, Pseudomonas, Acinetobacter, Azotobacter, Aeromonas, Proteus, Enterobacter, Escherichia Pseudomonas, Hyphomicrobium, Acinetobacter Acidiphilium, Agrobacterium, Ochrobactrum, Sphingomonas, Methylobacterium, [egysejtő-, növényi mitokondrium] Legionella, Thiobacillus, Pseudomonas, Protomonas, Paracoccus, Xanthobacter, Acetobacter, Hyphomonas Legionella, Hyphomonas

Q-9 Q-10 Q-11 Q-12 menakinon MK-5 MK-5(H2) MK-6 MK-6(H2) MK-7 MK-8

Flavobacterium, Hyphomicrobium, Desulfobulbus Desulfobulbus Cytophaga Desulfovibrio Cytophaga, Flavobacterium, Flexibacter Aeromonas, Proteus, Enterobacter, Escherichia

II/9.a. táblázat. Kinonok, s az ezeket termelı, talajokban megtalálható Gram-negatív baktériumnemzetségek (Collins, 1981; Fujie és mtsai., 1998a; World Data Center of Microorganisms 1995 alapján)

A respiratorikus kinonokat sokáig csak az anyagcseretípusok vizsgálatában és tiszta tenyészetek kemotaxonómiájában használták. Kinon alapú közösségvizsgálatról elıször 1986-ban esik szó (Hedrick és White), s ez úttörınek számít a kinon alapú kemotaxonómiában. Minninkin és mtsai. extrakciós módszertani kutatása (1984) segíti ıket. Hiraishi és mtsai. (1990) statisztikai módszerekkel elemezték az iszapok közösségi összetételét, sikerrel tettek különbséget az eltérı kezeléső iszapok között kinon alapon, és a hasonló származású mintákat kinonjaik alapján is hasonlónak találták. Ekkor fogalmazódott meg elıször a kinonanalízis monitoring vizsgálatok terén való használhatósága. Fujie és mtsai. (1998) összefoglaló táblázatokat tettek közzé a kinonok talajmikróbákban való elıfordulásáról. Szennyvíztisztító bioreaktorok mikróbaközösségeinek monitoring jellegő vizsgálata kapcsán érzékeny statisztikai változókat dolgoztak ki és teszteltek Hu és mtsai (1999a), emellett kisebb idıigényő kinontisztítási módszert is kidolgoztak (1999b), melyet késıbbi munkáinkban magunk is használtunk.

38

II. IRODALMI ÁTTEKINTÉS menakinon MK-6 MK-7 MK-7 (H2) MK-8 MK-8 (H2) MK-8 (H4) MK-8 (H6) MK-9 MK 9 (H2) MK 9 (H4) MK-9 (H6) MK-9 (H8) MK-10 MK-10 (H2) MK-10 (H4) MK-10 (H6) MK-10 (H8) MK-11 MK-12

Gram-pozitív baktérium Micrococcus Bacillus, Thermoactinomyces, Micrococcus Brevibacterium Lactobacillus, Micrococcus, Rhodococcus Brevibacterium, Corynebacterium, Micrococcus, Rhodococcus, Nocardia Janibacter, Nocardia, Nocardioides, Terrabacter Streptomyces, Nocardiopsis, Actinomadura, Micromonospora Arthrobacter, Clavibacter, Curtobacterium, Thermoactinomyces, Brevibacterium Arthrobacter, Corynebacterium, Gordona, Mycobacterium, Amycolatopsis, Microtetraspora, Streptosorangium, Brevibacterium, Micrococcus Actinoplanes, Amycolatopsis, Cellulomonas, Micromanospora, Microtetraspora, Pseudonocardia, Saccharopolyspora, Saccharothrix, Streptosporangium, Actinomyces Streptomyces, Actionomadura Streptomyces, Actionomadura, Catenuloplanes Rathayibacter, Aureobacterium Glycomyces, Actinomyces Actinoplaces, Actinomyces, Glycomyces, Micromonospora, Nocardiopsis Nocardiopsis, Thermomonospora Thermomonospora, Catenuloplanes Agrococcus, Aureobacterium, Microbacterium, Curtobacterium Agrococcus, Agromyces, Aureobacterium, Microbacterium

II/9.b. táblázat. Kinonok, s az ezeket termelı, talajokban megtalálható Gram-pozitív baktériumnemzetségek (Collins, 1981; Fujie és mtsai., 1998a; World Data Center of Microorganisms 1995 alapján) ubikinon Q-6 Q-7 Q-9 Q-10 Q-10 (H2)

Q-10 (H4)

Mikrogombák Saccharomyces Candida Arthroderma, Ascobolus, Aspergillus, Ctenomyces, Eladia, Microsporon, Mucor, Oidiodendron, Paecilomyces, Penicillopsis, Penicillium Aspergillus, Paecilomyces, Penicillium Acremonium, Amauroascus, Arachniotus, Aspergillus, Botryotrichum, Botritis, Chloridium, Crysosporium, Cladorrhinum, Dothichiza, Fusarium, Geomyces, Gliocadium, Myrothecium, Paecilomyces, Penicillium, Phialophora, Phoma, Preusia, Scopulariopsis, Sporothrix, Trichoderma, Verticillium Botryotrichum, Penicillium

II/9.c. táblázat. Kinonok, s az ezeket termelı, mikrogombanemzetségek (Fujie és mtsai., 1998a alapján)

talajokban

megtalálható

A módszereknek természetesen megvannak a maguk korlátai, melyek közül a legfontosabbak (a) az azonos molekulatípust termelı mikrobák átfedı reprezentáltsága a profilban, (b) tiszta tenyészetek szükségessége a taxon - marker párok ismeretének gyarapodásához, (c) a markerkészlet környezeti változók szerinti módosulásának lehetısége egyazon organizmus esetében (Ramsey és mtsai. 2006). Hátrány lehet továbbá, amit eddig mint elınyt emlegettünk: amplifikációs lépés hiányában nagyobb mennyiségő mintából kell kiindulni, hogy a lipidfrakció minor komponensei is kimutathatósági határ fölött legyenek jelen (Green és Scow 2000). Hátrányként könyvelhetı el az átfogó kemotaxonómiai

39


adatbázisok hiánya is, ami többek közt annak is köszönhetı, hogy a fajleírások során sokáig elmulasztották a szerzık a leírt faj lipid- és/vagy kinonkészletét közölni, sıt, az egyértelmő elıírások ellenére sok esetben mindmáig elmarad ezen adatok közlése (és megkövetelése) a fajleírásokban. A XX. század végétıl kezdıdik a polifázikus megközelítés alkalmazása. Ibekwe és mtsai. (1998) az elsık között alkalmaztak párhuzamosan többféle módszert a közösségek megfigyelésére. Zsírsavprofil- és BIOLOG-vizsgálatot alkalmaztak a taxonok szénforráshasznosítási mintázatának feltárására. Következtetésük az, hogy a PLFA alkalmasabb módszer a közösségváltozás-detektálásra, ami nem különösebben meglepı, hiszen a BIOLOG potenciális anyagcsereaktivitást vizsgál, a zsírsav-analízis ellenben közösségösszetételt. 2000-ben Ritchie és mtsai. precedens jelleggel alkalmaznak párhuzamosan kemotaxonómiai és DNS-alapú módszert, s az ekkor a még újnak számító LH-PCR (Length Heterogenity PCR) molekuláris módszer használhatóságát igyekeznek igazolni párhuzamos PLFA-analízissel. Talajminták megkülönböztethetıségét vizsgálva azt találják, hogy erıs korreláció van a DNS és a PLFA mintázatok között. A sort Liu és mtsai. (2000) folytatták szennyvízmintákat vizsgálva. Kinon és zsírsav mintázatot DGGE eredményekkel hasonlítottak össze. Az eredményeik feldolgozásából feltőnıen hiányzik a kiérlelt koncepció, értelmezéseik nem többek a kapott eredmények feletti puszta tőnıdésnél. Ez elıre vetíti a polifázikus szemlélető közösség-vizsgálatok késıbb állandósuló adatkezelési és értelmezési nehézségeit, melyekrıl a késıbbiekben még szót fogunk ejteni. Ettıl függetlenül kutatásuk úttörınek mondható a módszerek polifázikus szemlélető közösségi alkalmazásának fejlıdésében. Fontos összefoglaló elemzés született 2006-ban Ramsey és mtsai. keze alatt, melyben mikrobiális közösségváltozásokkal foglalkozó cikkek sorát tekintették át kiderítendı, hogy melyik a leghatékonyabb stratégia a közösségváltozások kimutatásában az addig használt ujjlenyomat-módszerek közül. PCR-alapú módszerek (DGGE, T-RFLP, RISA, RAPD) szénforrás-hasznosítási mintázatot elemzı módszerek és a PLFA-analízis alapján született eredményeket vetnek össze. Nem találtak olyan esetleírást, ahol az eltérı kezelések hatásait úgy sikerült volna elkülöníteni szénforrás-hasznosítási mintázat vagy PCR-alapú DNSmarkermintázat segítségével, hogy PLFA alapon ne váltak volna szét a kezelések. Kiemelik a zsírsavanalízis DGGE-nél érzékenyebb voltát a közösségváltozások detektálásában, amit többek közt azzal magyaráznak, hogy a kimutatható kemotaxonómiai markerek mennyisége legalább egy nagyságrenddel szélesebb skálán mozoghat, mint a DGGE sávok intenzitásából származtatott mennyiségi mutatóké. Konklúziójuk, hogy változások tettenérésében a PLFA-analízis bizonyul a legmegfelelıbbnek, és amennyiben tényleges taxonómiai információt akarunk e változásokhoz rendelni, akkor támad igény PCR-alapú

40


kiegészítı vizsgálatokra. Ezt kiegészítve Córdova-Kreyols és mtsai. 2006-ban kaliforniai sós mocsarak üledékeiben vizsgálódván megállapították hogy a PLFA-mintázat gyorsabban követi a közösségváltozásokat, mivel a DNS tovább marad a talajban a sejtek pusztulása után, mint a zsírsavak, így a zsírsavanalízis alkalmasabb marker az idıbeli változások detektálásához. A kezdeti módszerkutatások után idıvel egyre többen kezdik alkalmazni a kemotaxonómiai analízist. Frey és mtsai. 2006-ban statisztikai elemzéseket végeznek PLFA és T-RFLP eredményeken, melyeket nehézfémszennyezéssel sújtott talajmintákból nyertek ki. A nehézfém-szennyezés mértéke és hatása érdekli ıket, nem a kémiai markerek használhatósága, tehát már tisztán felhasználóként, metodológiai megfontolások nélkül nyúlnak a módszerhez. Ettıl az idıszaktól kezdıdıen csupán a preparációs módszertant finomító cikkek születnek a témában (Wu és mtsai. 2009, Gómez-Brandón és mtsai. 2010, Hanif és mtsai 2012), a többi munka a módszereket alkalmazó kutatási beszámoló számos élıhelytípusból, elsısorban talajokból (Liao és mtsai. 2007, Djukic és mtsai. 2010, Zhang és mtsai. 2010, Vargas Gil és mtsai. 2011, Elhottová és mtsai. 2012), másodsorban komposztból (Yu és mtsai. 2007, Amir és mtsai. 2008) és biogázreaktorokból (Li és mtsai. 2006, Ahmed és mtsai.2007), illetve rizoszférából (Ravit és mtsai. 2006), vízi üledékekbıl (Wang és mtsai. 2011), planktonból (Takasu és mtsai. 2012) stb.

II. 7. Kis hozamú gázforrások termelésének volumetriás mérése a szakirodalomban Mind a biogáztermeltetés tanulmányozásában, mind a biotechnológia számos egyéb területén igen hasznos kísérleti eszközök a laboratóriumi léptékő, azaz mintegy 0,1-10 dm3 térfogattal üzemelı bioreaktorok. Laboratóriumi léptékben azonban csupán igen kis gázhozam várható egy reaktorból, kis gázhozamok kielégítıen pontos mérése pedig sokkal nehezebb feladat, mint amilyennek elsıre gondolhatnánk. Csupán néhány fajta (nem laboratóriumi célra tervezett) készülék kapható kereskedelmi forgalomban, amelyek 1 ml/perc hozam mellett (vagy ez alatt) képesek a feladatra, ezek rendeltetésükbıl (mőszaki berendezések mőködésének kézi ellenırzése) adódóan mindössze egycsatornás mérésre alkalmasak, ráadásul mivel általában ultrahangos vagy optikai elven mőködnek (bár így anyagáramot is, nem csak térfogatáramot detektálnak; Nakao 2006), beszerzésük igen költséges. Laborléptékő bioreaktorok üzemeltetıi már régóta küzdenek a problémával, így az évtizedek során számos megoldásról beszámolt a szakirodalom a módszerekre jellemzı elınyökkel és hátrányokkal együtt. A legegyszerőbb módszerek a folyadékkiszorítás elvén alapulnak (Jawed és Tare 1999; Sterling és mtsai. 2001), amikor folyadékkal telt zárt üvegedény terébıl a bevezetett gáz

41


kiszorítja a folyadékot egy másik vezetéken keresztül, s a folyadékszint elmozdulása alapján leolvasható a termelt gáz mennyisége. Walker és mtsai. (2009) egy kiváló munkában taglalják az ilyen eszközök hordozta hibalehetıségeket, s bár jól használható korrekciós és optimalizáló megoldásokat is javasolnak, írásukból nyilvánvaló, hogy sok kényelmetlenséggel kell szembenézniük az ilyen felszerelést alkalmazóknak, ha megbízható eredményeket kívánnak. A legtöbb módszer közlekedıedényekben történı folyadékszint-változások optikai vagy elektromos detektálásán alapszik. Ezek mőködésekor általában egy U-alakú csıben mozgatja a gáz a folyadékot több egymást követı ciklusban. Amint a folyadékszint a csı gázforrástól távolabbi ágában eléri a detektor szintjét, az jelet küld egy vele összekapcsolt számláló készüléknek, egy automatikus szelep kinyílásával ugyanakkor megszőnik a nyomáskülönbség, a közlekedıedényben helyreáll a folyadékszint, a szelep újra bezárul, a ciklus pedig kezdıdik elıröl. A hozam a ciklusok számából (és az edényzet paramétereibıl) számolható (Angelidaki és mtsai. 1992; Dissing és mtsai. 1984; Liu és mtsai. 2004; Moletta és Albagnac 1982; Nilsson és mtsai. 1988; Van den Berg és mtsai. 1974). Pereda és mtsai. (2010) kombinálták ezt a megoldást a közvetett kiszorítás elvével (Weisenburger és mtsai. 2008), hogy elkerüljék a folyadék-gáz kontaktust: ennek során egy teflonzsák fúvódik fel egy szigetelt edényben, s az ez által az edénybıl kiszorított gáz mennyiségét mérik. Néhány fejlesztésben

közlekedıedényekben

detektált

folyadékszint-változás

helyett

nyomásmérésen alapul a szelepek vezérlése (Beaubien és mtsai. 1988). A számolt ciklusok során át adagokban továbbengedett gáz azonban közös vonása e megoldásoknak. Közös hátránya e módszereknek a nagy eszközigény, mivel minden egyes gázforrás saját közlekedıedényt, detektort és szelepet (némelyik egynél többet) kíván megfelelı vezérléssel, mely utóbbi további eszközöket (vagy megfelelı számítógépes programot) feltételez. A biogáz begyőjtése késıbbi vizsgálatok céljára ugyancsak feladat lehet, a folyadékkiszorításos edényekben azonban a gáz részben elnyelıdik a folyadékban, részben szennyezıdik annak gızeivel. Száraz gázgyőjtı zacskók használata a térfogatmérést teszi ugyanakkor komplikálttá. Ezekben az esetekben ráadásul elvész az információ a gázfejlıdés dinamikájáról, különösen rövid idıskálán. A közlekedıedényes megoldások esetében a csatlakoztatott gázgyőjtı eszköz nyomásváltoztató hatása révén zavarja a hozammérı eszköz mőködését downstream helyzetben is. Glauser és mtsai. e probléma egy elmés megoldását mutatták be (1984), de az ı eszközeik kivitelezése és kezelése kifejezetten is komplikáltnak tőnik, miközben a folyadék-gáz kontaktus is állandó ezekben. A szappanos áramlásmérık egy igen pontos és ısi válfaját képezik a kis volumenő gázáramlásmérıknek (Exner 1875), manapság pedig újra alkalmazzák automatizált

42


verzióikat (Lashkari és Kruczek 2008). Ezekben egy készülék meghatározott idıközökben szappanos jellegő anyag vizes oldatából hártyát formáz egy nedvesített falú üvegcsı belsejébe, melyben az áramló gáz gyakorlatilag ellenállás nélkül továbbtolja a hártyát, majd kialakul a következı hártya, és így tovább. A csıben sorakozó szappanlamellák elhaladását törésmutató- vagy konduktancia-különbség alapján érzékelik a detektorok. A lamellák távolságából és az adagoló órajelébıl jó idıfelbontással regisztrálható a gázhozam dinamikája is. Hátrány azonban a legtöbb hasonló módszert felülmúló eszközigény, amennyiben minden gázforrás külön adagolót, mérıcsövet, detektorsort igényel. Topolnicki és mtsai. (2009) egy igen egyedi elven mőködı áramlásmérıt fejlesztettek, amelyben egy kapillárison vezetik keresztül a gázt, a mindenkori áramlási sebesség pedig a kapilláris két végén mért nyomásértékek különbségébıl kalkulálható. Ez a módszer (amennyiben automatizált) talán az elképzelhetı legjobb idıbeli felbontást szolgáltatja: gyakorlatilag a detektorok és az elektronika jelkezelı kapacitása szabja határát. A forrásonként két darab érzékeny nyomásszenzor azonban itt is a gázforrások számával egyenes arányban növekvı költségeket jelent. Az utóbbi idıben felfutott mérési elv a Milligascounter® koncepció, ahol folyadék alatt egy billentyő alatt győlı gáz adott mennyisége felemeli a billentyőt, majd kiszabadul, és a billentyő újabb adag gáz felfogását kezdi meg. A billenések száma illetve ismétlıdésük sebessége adja az információt a gázfejlıdésrıl. A módszer hátránya, hogy a finommechanika igen megdrágítja a berendezéseket, és a mozgó alkatrészek állapotára bizonyára igen érzékeny. Jin és mtsai. (2008) egy fotoelektromos szivárgásdetektort fejlesztettek, mely buborékszámláláson alapul, munkájukban azonban nem számolnak el meggyızıen a buborékformálás megbízható reprodukálhatóságának igényével, továbbá itt is külön fotoelektromos detektorra van szükség minden egyes gázforráshoz. Eszközüket azonban terepi munkára dolgozták ki, és nem kétséges, hogy ilyen körülmények között igen praktikus lehet. Buborékok lassított áramlási körülmények mellett történı mozgásának precíz detektálása alapján azonban elıttünk senki nem kísérelt meg gázhozamot mérni az általunk áttekintett nemzetközi szakirodalom tanúsága szerint.

II. 8. Módszerfejlesztésünk elızményei Az üzemi és félüzemi reaktorokban rothasztott szennyvíziszap nem tekinthetı homogénnek a benne mőködı mikrobióta szempontjából. Nem csupán a beltartalom kevertetésének tökéletlenségeibıl és a pelyhes anyagszerkezetben kialakuló mikrohabitatok létezésébıl kifolyólag (térben), hanem a kommunális hulladékként érkezı szennyvíz

43


változó és az üzemeltetı által nem kontrollálható összetételébıl adódóan is (idıben). A laboratóriumi léptékő reaktorok üzembe helyezése – túl a párhuzamosan vizsgálható egységek számának bıvíthetıségén – ennek fényében válik praktikussá, mivel az egy alkalommal vett, és kis adagokban sterilizálva raktározott nyersiszap-készletbıl hosszú idın keresztül táplálhatók állandó összetételő szubsztráttal. 2007-ben egy, a Dél-Pesti Szennyvíztisztító Telepen tervezett főkaszálék-adagolás kapcsán felkérést kaptunk laboratóriumi elıvizsgálatok elvégzésére. A termosztát szekrényben, légmentesen zárható üvegedényekbıl kialakított rothasztók gázterébıl kimutatni a biogáz termelıdését zárt rendszerben is lehetséges (OxiTop rendszerben), ekkor azonban a mőködı reaktortartalom igen kicsiny kell legyen, hogy nagy gáztér maradjon az edényekben a felhalmozódó gáz számára. Késıbb tapasztaltuk is (kivezetıcsövek eltömıdése esetén), hogy a reaktorok belsejében igen komoly túlnyomás alakulhat ki, amely szétvetve a rektort nem csupán mechanikai úton okozhat kellemetlenségeket. További érv a koncepció ellen, hogy nem tudható, a megnövekvı gáztenzió nem változtat-e élettanilag releváns fizikokémiai paramétereken, miközben egy normál rektorban, normál üzem esetén ezzel biztosan nem kell számolnunk. Mindezt átgondolva eleve a gázelvezetéses megoldást választottuk, s kézenfekvı módon adódott a lehetıség, hogy a rothasztás folyamatát a gázhozam mérésén keresztül kísérjük figyelemmel. A mérési elv megszületéséhez az elsı inspirációt a kezdetkor alkalmazott folyadékkal telt győjtıedényekben felfelé szaladó apró buborékok látványa adta, valamint az a jól látható jelenség, hogy periodikusan fel-felgyorsul majd újra lelassul a képzıdésük. Ha valahogyan nagyobb buborékok képzıdnének, ha ezeket kellıen le lehetne lassítani a folyadékban, s ha a mozgásuk útját is meg tudnánk szabni, akkor számolhatóvá válnának, térfogatuk is becsülhetı volna, és a gázkivétel idıbeli dinamikáját is jobban meg tudnánk figyelni. A különbözı ötletek során át végül egy igen egyszerő modellhez jutottunk: A vízszinteshez képest enyhén döntött, folyadékkal telt csövekben a buborékok egyenes pályán, egyenletes, és a döntés szögével állítható sebességgel mozognak fölfelé (ld. Mikolacsı). Kezdeti megoldásként vízzel telt, és a vízszinteshez képest enyhén megdöntött üvegpipetták alsó végébe vezettük a gázt, amely buborékokat alkotott a pipetták vízterében. Számítógép és hozzá csatlakoztatható kamera segítségével programozott idıközönként rövid videofelvételeket készítettünk a vízzel telt osztott pipettákban felfelé kúszó buborékokról, majd a felvételeket manuálisan értékeltük ki a buborékok osztáshoz viszonyított hosszának és a buborékérkezések közt eltelt idık feljegyzésével. Mivel ez igenigen monoton és idıigényes munka volt, valamint mivel tanszéki kollégánkon keresztül kapcsolatba kerültünk egy mintázatfelismerı szoftverek kódolásával foglalkozó fiatal programozóval, Szabó Zsolttal, hamarosan megkezdıdött módszerünk automatizálása is.

44

III. CÉLKITŐZÉS

III. CÉLKITŐZÉS Munkánk egyik célja egy könnyen használható, laboratóriumi léptékő, biogáztermelı modellrendszer létrehozása volt, valamint e rendszer mőködési folyamatának nyomon követését lehetıvé tevı egyszerő, könnyen kivitelezhetı és használható, többcsatornás gázhozammérı módszer illetve eszköz kifejlesztése. További célunk volt biogáztermelı közösségek vizsgálata respiratorikus kinon-, membránzsírsav-, és DNS-alapú ujjlenyomatmódszerekkel: (a) egy mezofil és egy termofil, félüzemi szennyvíziszap-rothasztóból származó mikrobaközösség összehasonlítása, (b) könnyen bontható szubsztrátok adagolásának hatásvizsgálata mezofil közösségeken, laboratóriumi modellrendszer alkalmazásával, valamint (c) egy félüzemi biogázreaktorokon elvégzett, mezofilról termofil hımérsékletre való felfőtési folyamat hatásának monitorozása. Utóbbi munkáinkhoz kapcsolódóan célunk volt végül egy adatkezelési módszer kidolgozása is, melynek alkalmazásával kimutathatjuk a különbözı ujjlenyomat-módszerekkel létrehozott közösségi markermintázatok elemeinek közös termelı szervezetektıl való származását az eredeti adatsorokban rejtve maradó idıbeli együttmozgások kimutatása révén.

45

IV. ANYAG ÉS MÓDSZER

IV. ANYAG ÉS MÓDSZER IV. A. Új módszer kidolgozása kis produkciójú gázforrások hozamának volumetriás mérésére IV. A. 1. A módszer és az eszközök leírása Az eszköz három jól elhatárolódó részbıl áll (IV/1. ábra): •

A csövek, melyekben a buborékok haladnak, és az ezeket körülvevı vizuális

markerek (ld. késıbb). •

Egy számítógéphez csatlakoztatható egyszerő kamera, és a számítógép.

•

A számítógépen futó mintazatfelismerı szoftver.

A kamera és a számítógép természetesen kereskedelmi forgalomban kapható eszközök, így a továbbiakban fıleg a saját munkánk eredményeit képezı üvegcsöves buborékoltató eszközrıl és a csövek képébıl mérési adatsort generáló programról írunk.

IV. A. 2. A "buborékoltató" eszköz Az eszköz párhuzamosan elhelyezett L-alakú üvegcsövekbıl, egy ezek rögzítésére, valamint ezek vizuális hátteréül szolgáló fehér tálcából, s az ezen elhelyezett színes jelekbıl áll, melyek a látvány értelmezését segítik a szoftver számára (IV/1. ábra a). A vastagabb, kb. 40 cm hosszúságú ága az üvegcsöveknek 6 mm belsı átmérıjő Pyrex üvegbıl készültek. Ezek a csıágak fekszenek fel a tálcára, s a vízszinteshez képes enyhén megdöntve a tálcát a buborékok az ezeket kitöltı folyadékban lassan elindulnak felfelé, mint a Mikola-csıben. A buborék igyekszik a csı felsı részében lenni, és vízszintes helyzetben igyekszik egyrészt a csı tetejét egész hosszában kitölteni, a felületi feszültség miatt ugyanakkor gömb alakra is törekszik, így egy elnyújtott forma jön létre (Tüzes és Papp 2007). A 6 mm-es belsı csıátmérı optimálisnak mutatkozott ahhoz, hogy a buborékok ne képezzenek benne légzárat (vagyis a felületi feszültség nem tudja megakadályozni, hogy a folyadék átfolyhasson a buborék alatt), de még eléggé kitöltsék keresztben a csövet ahhoz, hogy a buborék alatt átáramló folyadékréteg kellıen vékony legyen. Utóbbi a folyadék és a buborék vizuális elkülöníthetısége miatt fontos. A merıleges vékonyabb csıág 2 mm belsı átmérıjő, és kb. 15 cm hosszúságú. A vékonyabb ágak a tálca vízszintes helyzetében függılegesen állnak, ezekhez csatlakozik a gázforrások felıl érkezı gázvezeték. A gáz nyomása a termelıdés ütemében lassan nyomja lefelé a folyadékot a vékony ágban, s enyhe megdöntés esetén csak csekély ellennyomást kell leküzdenie. Az L-csı könyökrészét elérve a gáz belép a vastagabb, vízszinteshez közeli helyzető ágba, majd a felhajtóerı valamint a felületi feszültség eredıje szerint jól reprodukálódó módon szakad le a függélyes ág gázterérıl, és önálló buborékként elindul a 46


vastag csıágban. Amennyiben a folyadékot megfestjük, fölülnézetben a buborékok (az alattuk átáramló vékony folyadékréteg ellenére) a háttér színét engedik érvényesülni. Így egy egyszerő képelemzı szoftver számára is könnyen értelmezhetı képet kínál a csı (IV/1. ábra b): a folyadék színét mutató sávban a háttér színét mutató szakaszok (buborékok) jelennek meg, és mozognak állandó sebességgel egy irányba. A különbözı reaktorokból táplált csövek párhuzamos elrendezésével több, de külön figyelemmel kísérhetı sávot helyezhetünk a látótérbe, így minimális eszközbıvítéssel többcsatornássá bıvíthetjük eszközünket. A jó képalkotáshoz mindössze állandó, fehér, szórt fényre van még szükség, amely csillogás nélkül megvilágítja a csöveket (Tauber és mtsai. 2011).

(a) c l

s gáz ki

p

α

g

(b)

t

r d

e

f

g a a a

IV/1. ábra. A gázhozammérı rendszer sematikus vázlata. (a) Oldalnézet: p L-alakú üvegcsövek festett folyadékkal töltve, bennük buborékok (fehér ellipszisek), g fehér tálca a csövek rögzítéséhez és vizuális hátteréül, c kamera, l fényforrás, s számítógép, r kevertetett reaktor (gázforrás), t termosztátszekrény, α a megdöntés szöge (3-10°). (b) Felülnézet: d vizuális startvonal a szoftver számára a csövek automatikus kereséséhez, e milliméter-skála a manuális buborékméret-korrekcióhoz, f méretreferencia-marker automatikus buborékméretmeghatározáshoz.

IV. A. 3. Buborékszámlálás szoftver segítségével Hogy számítógéppel végezhessük a buborék-képek automatikus analízisét, három feladatot kellett megoldani: pixel-osztályozás, buborékazonosítás és buborékméretmeghatározás.

47


Az osztályozás egy egyszerő színalapú döntés, vajon a vizsgált pixel buborék, csı, színes marker vagy a hátér része-e. A döntés a három színkomponens (vörös, zöld, kék) mérésén alapszik egyszerő szín-szabályok és egy egyszerő döntési fa segítségével. A különbözı kritériumoknak megfelelı pixelcsoportok helyzetének regisztrálásával megkezdıdhet a képi információ feldolgozása. A következı lépés megállapítani az egy képkockán megjelenı buborékok számát és méretét. Ehhez elıször a csövek pontos helyzetét kell bemérni [ehhez szolgál segítségül a csövek színétıl elütı keresési startvonal a látótérben (IV/1 ábra b)]. Ezután minden csıben külön történik a buborékok keresése. A csı definíció szerint egy kellıen hosszú, folytonos, egyenes sorozata a beállított színszabály szerint megfelelı színő pixeleknek. A buborék definíció szerint egy kellıen hosszú, folytonos nem „csıszínő” pixelsorozat egy csıben. A csı színét meghatározó folyadékfesték minıségét és koncentrációját úgy kell megválasztani, hogy a 6 mm belsı átmérıjő csıben fehér háttér mellett a háromból két színkomponens tiszta keverékét mutassa. A módszer beállítása és tesztelése során ezért 0,6 mM KMnO4 oldatot használtunk, mely optimális magenta színt mutat maximális vörös és kék, de minimális zöld fényerıvel. A csövek automatikusan kereshetık a háttérben (az ez esetben kék startvonaltól elindulva), mint magenta sávok a fehér háttérben. A buborék pedig ez után úgy detektálható, mint a zöld színkomponenst is tartalmazó pixelek sorozata a komplementer színt mutató sávban. A rendszer folyamatosan monitorozza a kamera által beolvasott frame-ek sorozatában az összes csövet, és ha megjelenik egy buborék, követi annak mozgását. Ha feltőnik egy buborék egy frame-ben, mely még nem volt jelen (vagy nem volt a kritikus pozícióban) az elızıben, akkor regisztrációra kerül a buborék-listában. Ez a lista a program által folyamatosan bıvített és mentett egyszerő szövegfájl, mely soronként tartalmazza a buborékok összes adatát (megjelenés idıpontja, csı pozíciója, hossz, kalkulált térfogat stb.). Bár a csövek fent vázolt elrendezése mellett nagyon hasonló buborékok képzıdnek a csıkönyökökben, mégsem lehet garantálni, hogy mindig ugyanakkorák, s tapasztaltuk is, hogy a buborékméret kismértékben függ a gáztermelıdés sebességétıl. Ezen kívül a detektált buborékhossz értéke mindig függ a csövek és a kamera kölcsönös helyzetétıl, távolságától is. A pontos méretmeghatározás céljából kerül a pontosan ismert hosszúságú színes méretreferencia-marker a látótérbe (IV/1.b. és IV/2. ábrák). A szoftver minden észlelt buborék méretét összeveti e marker észlelt méretével, amibıl meghatározható a buborék mmben kifejezett hossza az 1. egyenlet alapján: di p' = i d m pm

48

1. egyenlet


ahol di az i-dik (aktuálisan vizsgált) buborék tényleges hossza mm-ben (ez a keresett érték), dm a referenciamarker tényleges (ismert) hossza mm-ben; pi' az i-dik buborék detektált mérete (korrigálva a meniszkuszoknál adódó hosszveszteséggel – lásd késıbb) pixelszámban kifejezve, pm pedig a referenciamarker detektált hossza pixelszámban kifejezve (IV/2.ábra). A buborék térfogata (jó minıségő üvegáru használata esetén) arányos a csıbeli hosszával. Manuális csıkalibrálás során megállapíthatjuk a buborékhossz-értékeket a buboréktérfogat ellenében ábrázoló kalibrációs egyenes paramétereit, melyeket megadva a szoftvernek, az a buborékhossz (di) alapján kalkulálni tudja a buboréktérfogatot a 2. egyenlet alapján: Vi =

di − b a

2. egyenlet

ahol Vi az i-dik buborék térfogata ml-ben (keresett érték), a a kalibrációs egyenes meredeksége, b az y-tengelymetszet értéke, mely utóbbiak a felhasználó által megadott értékek a szoftver számára (b ≠ 0 a csı jelentıs vastagsága miatt). Két korrekciós lehetıség bevezetése is szükséges azonban, hogy kielégítı mérési pontosságot érhessünk el. Precíz manuális térfogat-hossz kalibráció csak úgy oldható meg, ha a buborékokat határoló meniszkuszok végpontjainak távolságát mérjük meg. A szoftver azonban a meniszkuszok bonyolult fénytörési effektusai miatt fellépı fényerı- és színbeli eltérések következtében a meniszkuszok képi környezetét nem a buborék részeként fogja azonosítani, így a buborékok egy közel négyszögletes résként jelennek meg a program számára a csıszínő sávban, amely azonban rövidebb, mint ami a buborék reális hosszából következne, ha a szoftver látná a meniszkuszok végpontjait. Ezért a buborékok detektált hosszértékéhez rendre hozzá kell adnunk egy korrekciós faktort, hogy kiküszöböljük a fentiekbıl adódó komoly szisztematikus hibát. E korrekciós faktor értékét a szoftver készítette pillanatfelvétel segítségével határozhatjuk meg, melyen szerepel egy buborék, illetve szerepel egy, a látótérben a csövek síkjába helyezett milliméterskála is (IV/1.b. és IV/2.c. ábra).

49


(a)

(c)

pbub’

dm

pbub

di c

c

1

1

(b)

pm pi

dbub

IV/2. ábra. Az analizált kép és a buborékgeometria. a és b: az aktuális illetve a pixelezett, program által analizálható kép három csıvel. di az i-dik buborék hossza, dm a méretreferencia-marker hossza, [d] = mm; pi az i-dik buborék detektált hossza, pm a méretreferenciamarker detektált hossza, [p] = pixelszám. c: a c1 korrekciós faktor megállapításához használt buborék tényleges és detektált hosszának különbsége. dbub a kalibrációt végzı személy által vizuálisan megállapított hossza a kiválasztott buboréknak, pbub a szoftver által detektált buborékhossz pixelben. pbub' az X1. egyenlet alapján dbub-ból számolt korrigált buborékhossz. c1 = pbub'-pbub.

A buborék hosszát megállapítva a skála segítségével az 1. egyenlet logikája szerint meghatározhatjuk az eltérést a buborék szoftver által kalkulált és tényleges hossza között. Mivel a tényleges buborékhossz (dbub) ezúttal ismert, visszaszámolható belıle az a realisztikus pixelszám (pbub') amely megfelelne ennek a tényleges hossznak. Ennek különbsége a (szoftver által a pillanatfelvételen kijelzett) detektált pixelszámtól megadja a c1 korrekciós faktor értékét ([c1] = pixelszám), melyet megadva a programnak automatikusan hozzáadja azt az összes továbbiakban detektált buborék pixelszámához. Ezzel természetesen azt feltételezzük, hogy a meniszkuszokból adódó hossztévesztés ugyanaz lesz az összes buborék esetében, erre azonban lehet is számítani fix kamerapozíció és állandó megvilágítási körülmények között. Amennyiben a buborékformálódás kielégítıen egyformának mondható méréseink teljes idıtartamában, vagyis nincs komoly szórása vagy idıbeli kúszása a buborékhossz-értékeknek, egy további korrekciós lehetıségünk is van a pontosság finomítására. Eszközünket egy kalibrációs mérésben egy ismert pontosságú referencia-gázhozammérıvel vagy standard gázforrással sorba kötve megállapíthatjuk az eszközünkön ténylegesen keresztülhaladt gáztérfogat és a saját eszközünk által detektált térfogat különbségét. Ezt a kü50


lönbséget a kalibrációs mérés alatt detektált buborékok számával elosztva megkapjuk c2 korrekciós faktort ([c2] = ml), melynek értékét (akár csövenként külön) megadva a szoftver azt a továbbiakban minden detektált buborék kalkulált térfogatához hozzáadja. A méretkorrekciók elhagyása szisztematikus hibához vezet, ezért a párhuzamosan detektált csövekbıl kiolvasott hozamadatsorok (amennyiben a csövek valóban azonos átmérıjőek) összehasonlíthatók maradnak. A méretreferencia-marker detektált mérete, mivel a marker szegélyei elvágólagosak, természetesen nem szorul korrekcióra. A detektált és a valós méret aránya pontos, illetve a kamera felbontóképességének korlátos volta vezethet szegélyenként egyegy pixeles zajhoz. E zaj arányának csökkentése a méretreferencia-marker hosszának növelésével lehetséges. A gázhozam a buborékok érkezési idıpontjainak különbségébıl (továbbiakban ∆t értékekbıl) és a buborékok térfogatából egyszerően számolható. Fontos hangsúlyozni, hogy a mérés nem jár képi információ hosszútávú elektronikus tárolásával. Csupán numerikus adatváltozók tárolása történik egy szövegfájlban, így egy 10000 buborék regisztrálásával nyert adatsor (ez kb. 4,5 l gáznak felel meg a mi rendszerünkben) mindössze 0,7 Mb memóriát foglal le a számítógépen. A IV/3. ábra összegzı be-

i-dik buborék a csıben

Méretreferencia-marker

mutatását adja a detektálás és adatgenerálás folyamatának. észlelt buborékméret pixelben

korrigált buborékméret pixelben

számolt buborékméret mm-ben

számolt buboréktérfogat ml-ben

2. egyenlet

(kalkulált adat)

pi

+ c1

pi ‘

di − b = Vi a

(kalkulált adat)

(elızıleg kalkulált korrekciós faktor)

gázhozam

(kalkulált adat)

1. egyenlet d i = pi ' dm

∆ti

(elızıleg kalkulált korrekciós faktor) a

pm (a méretreferenciamarker észlelt mérete)

+ c2

pm

dm

b

(a manuális kalibrációban szerkesztett kalibráló egyenes paraméterei )

(ismert adat)

eredményresult data file file

Kamera & Számítógép

IV/3. ábra. A buborékészleléstıl a hozamadatsor generálásáig tartó folyamat logikája. di az idik buborék hossza, dm a méretreferencia-marker hossza, [d] = mm; pi és pi' az i-dik buborék detektált illetve korrigált hossza, pm a méretreferencia-marker detektált hossza, [p] = pixelszám. Vi az i-dik buborék térfogata, [Vi] = ml. ∆ti az i-1-dik buborék és i-dik buborék észlelési idıpontjainak különbsége. A szaggatott vonalkeretek a program számára a felhasználó által megadott paramétereket emelik ki.

IV. A. 4. A módszer validációjának és további tesztelésének eszközei Készülékünk pontosságának vizsgálata és korrekciója céljából állandó kis volumenő héliumáramot vezettünk csöveinkbe egy ennek biztosítására képes gázkromatográfberendezés (HP 5890) kapillárisoszlopából. A héliumáramlás pontos értékét a vezetékhez 51


csatlakoztatott vízszintes üvegpipettában mozgó folyadékcsepp vándorlási sebességének precíz mérésével határoztuk meg (több mérés eredıjeképpen). Az áthaladó gáz mennyiségét a hozam és a mérésidı alapján számoltuk. A szoftverünk által generált mérési adatokat öszszevetettük a kalkulált hozamértékekkel. Az adatokat kiértékeltük. A biogáz-modellrendszeren való tesztelés során fél dm3-es csiszoltdugós állólombikokban rothasztottuk a Fıvárosi Csatornázási Mővek Dél-Pesti Szennyvíztisztító Telepérıl származó, vételezés után autoklávban sterilizált sőrített nyersiszapot. A kezdı kultúra ugyancsak a telep mezofil rothasztóiból származott. A reaktorokat termosztátszekrényben, 35°C-on, mágneses kevertetéssel üzemeltettük. A 82,65 mg O2/ml kémiai oxigénigényő iszap reaktorokra táplálása batch-rendszerben, 10 napos tartózkodási idıvel történt oly módon, hogy kétnaponta cseréltük a reaktortartalom 20%-át (1 dl) azonos mennyiségő nyers iszapra. A rátáplálás az oxidatív stressz kerülése érdekében N2-áram alatt történt. A gázt a csiszolatos

dugók

csonkjain

keresztül

szilikoncsöveken

át

vezettük

ki

a

termosztátszekrénybıl a buborékszámláló csövekbe. Az illesztési pontokat vákuumzsírral (Dow Corning®) szigeteltük. A detektáláshoz Vista IM Live! Cam (Creative; 800×600 felbontás) kamerát használtunk, a mintázatanalízist pedig az általunk fejlesztett, BuBBer névre keresztelt szoftver végezte a fentebb taglaltak alapján. A szoftvert nyílt forráskóddal hozzáférhetıvé tettük4. A mérési folyamat során a c1 korrekciós faktor értéke 3,25 pixel volt, a méretreferencia-marker hossza 20 mm, az átlagos detektált buborékhossz illetve térfogat 25,8 pixel (azaz 18.7 mm; SD: 2,09) illetve 0,43 ml (SD: 0.04) volt. A buborékképzıdést a rátáplálások közötti két napos periódusok teljes tartamában regisztráltuk. A reaktortartalom folytonos pH-mérését OP-211/3 Laboratory pH Meter (Radelkis, Budapest) eszközzel végeztük. Hogy karakterizálni tudjuk a gázhozamban tapasztalt rövid távú oszcillációt és megállapíthassuk, hogy ennek oka a közösség élettani mőködésében keresendı, vagy pedig a kísérleti elrendezésbıl, esetleg a mérési módszer jellegébıl adódó mőtermékrıl van szó, elvégeztük az adatsorok Morell hullámhossz-analízisét (wavelet spectrum analysis) (Shumway és Stoffer 2000). Ez a matematikai adatelemzési módszer akár egymásra rakódó periodikus változások adatsorokból történı kimutatására alkalmas, és különösen hidrológiai és klimatológiai munkákban elterjedt a használata (Burns és mtsai. 2002; Whitt és Schumann 2005). Erre MATLAB MathWorks programot használtunk. A továbbiakban három egymást követı rátáplálási periódusban két párhuzamosan vizsgált reaktor (A és B) gáztermelése alapján nyert adatsorok eredményeirıl számolunk be. A három bemutatott periódust megelızıen számos perióduson keresztül voltak már azonos módon fenntartva a reaktorok. A tárgyalt periódusokra reaktoronként külön mint A1, A2, A3, B1, B2 és B3 periódusokra fogunk hivatkozni. 4

http://mikrobiologia.elte.hu/Miscell.html

52


IV. B. Biogáztermelı szennyvíziszap-rothasztók mikrobiológiai vizsgálata IV. B. 1. A vizsgált reaktorok A doktori munkám részét képezı vizsgálatok a Fıvárosi Csatornázási Mővek Zrt. Délpesti Szennyvíztisztító Telepének félüzemi (1,5 és 2,5 m3-es térfogatú) szennyvíziszaprothasztóinak mikrobiológiai elemzésével kezdıdtek (IV/4. ábra). A telepen rothasztott szennyvíziszap az elsıdleges és másodlagos ülepítımedencék iszapjának keverékébıl áll, így tartalmazza a szennyvíz primer szennyezıdéseit és a biológiai tisztítási fázisban keletkezett bakteriális biomassza tömegét is. A félüzemi reaktorokat (a 2000 m3-es üzemi reaktorokhoz hasonlóan) batch-rendszerben (idıszakosan), naponta kétszer táplálták víztelenítı szalagon sőrített, mintegy 5% szárazanyag-tartalmú szennyvíziszappal, 12,5 napos tartózkodási idıt tartva. A reaktorok folyamatosan kevertetve üzemeltek. Elsı vizsgálatunkban egy mezofil és egy termofil félüzemi reaktor mikrobaközösségét hasonlítottuk össze. Második tárgyalt vizsgálatunkat már egy saját laboratóriumi biogáztermelı modellrendszer mintáival végeztük. 2007-ben egy, a Dél-Pesti Szennyvíztisztító Telep biogáztornyaira tervezett főkaszálék-hozzáadagolás kapcsán ugyanis felkérést kaptunk laboratóriumi elıvizsgálatok elvégzésére, melyhez létre kellett hoznunk egy laboratóriumi léptékő iszaprothasztó modellrendszert. Az állandó hımérsékletet (mezofil rothasztás: 37°C) fenntartására szolgáló termosztátszekrény terében, félliteres, csiszolt dugós állólombikokban végezzük az iszaprothasztást állandó mágneses kevertetés mellett. A termelıdı biogázt a csiszolatos üvegdugók kivezetı csövéhez illesztett szilikoncsöveken keresztül vezettük el hozammérés céljából (IV/5. ábra). A gázhozam mérését az alább leírt kísérletek idején már saját fejlesztéső módszerünkkel végeztük, mely rendszerrıl a dolgozat késıbbi fejezeteiben részletesen is írunk, illetve a nemzetközi szakirodalomban is közzétettük (Tauber és mtsai. 2010).

IV/4. ábra. Félüzemi iszaprothasztók az FCSM Zrt. Dél-pesti Szennyvíztisztító Telepén

53


A

rothasztott

iszapban

mőködı

mikrobaközösség

fenntartására

szolgáló

rothasztólombikba a Fıvárosi Csatornázási Mővek Dél-Pesti Szennyvíztisztító Telepérıl vételeztünk rothasztott iszapot indítókultúrának. A folyamatos fenntartás szubsztrátjául ugyaninnen vételeztünk nagyobb mennyiségő sőrített nyersiszapot, majd ezt kisebb adagokra osztva autoklávos sterilizálással tartósítottuk. A telepen rendszeresített gyakorlatnak megfelelıen 10 napos tartózkodási idıvel rothasztottuk az iszapot: két napos periódusokban, a palacktartalom 20 %-ának nyers iszapra cserélésével valósítottuk meg az adagolást. IszaprothasztóIV/5. ábra. dellrendszer.

Szennyvíziszap-rothasztó

mo-

ként gömbölyő lombikokat használtunk,

melyekbıl

szilikon-

csöveken keresztül elvezettük a keletkezı biogázt a gázméréshez. A lombikokat 35°C-os termosztátban mágneses keverıasztalokra helyeztük, és a kísérlet során folyamatosan kevertettük az iszapot. A kísérletet három iszaprothasztóval végeztük, az egyik kontrollként szolgált, míg a másik kettıt párhuzamos kísérlet keretében különbözı szubsztrátokkal tápláltuk. A kezelés során elsıként fehérjét, majd keményítıt, végül napraforgóolajat adagoltunk. A kísérlet során végig mértük és figyeltük a gáztermelés alakulását. Harmadik tárgyalt vizsgálatunkat, a hımérsékletemelés hatásának, illetve a mezofil közösségbıl termofil közösségbe való átrendezıdésnek a nyomon követését az FCSM Zrt. Dél-pesti Szennyvíztisztító Telepének már ismertetett félüzemi rothasztóin lefolytatott felfőtéses kísérlethez csatlakozva végeztük el. Két reaktor (T4 és T6) felfőtését követtük nyomon. A reaktorok 2-2 m3 iszaptartalommal üzemeltek. Hetente kétszer történt rátáplálás reaktoronként 500 l rothasztott iszap sőrített nyersiszapra cserélésével, ami 14 napos tartózkodási idıt jelent. A rátáplált iszap átlagos szárazanyagtartalma 2,87 % volt. A hımérésklet emelését a két reaktoron különbözı ütemezésben hajtották végre. A T4-es reaktor felfőtése a mezofil optimumközeli 34,1°C-ról termofil optimumközeli 55°C-ra egy lépésben, hirtelen történt, a T6-os reaktor felfőtése ugyanilyen intervallumban 21 nap alatt, egyenletes hımérsékletemeléssel valósult meg. Abiotikus paraméterek (hımérséklet, illósavtartalom, pH, gázhozam) mérése is kísérte a rátáplálásokat, melyet a szennyvíztelep munkatársai végeztek az elıírt standard protokollok szerint.

54


IV. B. 2. Az elvégzett kísérletek és a mintavételezések Elsı munkánkhoz a T2-es termofil és T4-es mezofil félüzemi biogázreaktorokból vettünk mintát egy idıben kemotaxonómiai- és DNS-munkákhoz 2005. szeptember 20-án. A továbbiakban mint T (termofil) és M (mezofil) mintákra hivatkozunk ezekre. A körülményeket kísérleti céllal nem változtattuk, célunk csupán a kétféle optimumhımérséklető közösség összehasonlítása volt. Kemotaxonómiai munkához a fermentorok leengedı csapjának bı átfolyatását követıen zsírtalanított, jól zárható üvegedényben elızıleg összemért oldószer elegybe (diklór-metán : metanol, 1:2) engedtünk megközelítıen 20 g tömegő rothasztott iszapot, majd jégben hőtve a laborba szállítottuk ezeket, s tömegüket pontosan viszszamértük. Tárolásuk -20 °C-on történt. DNS-munkákhoz steril üvegedényekbe vettünk rothasztott iszapot. Az üvegeket jéggel töltött dobozban szállítottuk a laboratóriumba. Itt minden mintából ötször 1-1 ml-nyi iszapot pipettáztuk 2 ml-es csavaros kupakos csövekbe. A mintákat centrifugáltuk (13000 g, 2 perc), majd a felülúszót leöntöttük, a sőrő iszapot pedig feldolgozásig -20 °C-on tároltuk. Második munkánkban könnyen bontható szubsztrátok adagolásának hatását vizsgáltuk laboratóriumi léptékő modellreaktorainkon, illetve ezek mikrobiális közösségein. Az adagolt szubsztrátok elkészítéséhez az alábbi anyagokat használtuk: 1.

autoklávozott, nyers, 5% szárazanyag-tartalom körüli szennyvíziszap

2.

fehérje (húskivonat, MM329, KOI: 1185 mg O2 / g)

3.

keményítı (MN624, KOI: 1126 mg O2 / g)

4.

étkezési napraforgóolaj (KOI: 2867 mg O2 / g)

A kísérlet során kiindulásképpen használt iszaprothasztó közösséget elızıleg tisztán nyers szennyvíziszap adagolásával tartottuk fenn. A kísérlet kezdetekor az iszap kémiai oxigénigényét megmértük (8700 mg O2/100 g) és a kezeléshez használt szubsztrátot úgy állítottuk össze, hogy a szennyvíziszap térfogatának 75 százalékát helyettesítettük azonos KOI értékő alternatív szubsztráttal, majd az elegyet tiszta, kiforralt csapvízzel 100 ml-re egészítettük ki. A kísérlet indításakor és még további két alkalommal fehérjét adagoltunk az iszaprothasztóba, majd két alkalommal tiszta nyersiszapot adagoltunk. Ezután három alkalommal keményítıt adagoltunk. Mivel a gázhozamgörbéken a keményítı hatása hosszabban volt látható, ezért ezúttal három alkalommal adagoltunk nyersiszapot. Ezután három alkalommal adagoltunk olajat, majd innentıl kezdve már csak tiszta nyersiszapot. A kísérlet kezdetén mintát vettünk a nyersiszapból is (IV/1. táblázat). Egy-egy rothasztási szakasz 2 napig tartott, utána újabb adag szubsztrátot adagoltunk, mégpedig úgy, hogy a rothasztott iszapból 100 ml-t eltávolítottunk, ebbıl mintát vettünk, majd 100 ml friss szubsztrátot öntöttünk a lombikba. A mintavétel és az adagolás pontos menetét az IV/1. táblázat tartalmazza. A leöntött iszapokból mintát vettünk. Zsísavelemzéshez 10 ml mintát adtunk diklór55


metán és metanol 1:2 arányú elegyének 30 ml-éhez, majd a végleges feldolgozásig -20 °Con tároltuk a keveréket. A molekuláris módszerekhez 1,5 ml-t Eppendorf-csıbe raktunk, 18000 g-n 5 percig centrifugáltuk, a felülúszót leöntöttük és a szilárd fázist -20 °C-on tárultok a minták feldolgozásáig. Dátum 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19.

Feldolgozott minták

Mintavételt követıen adagolt szubsztrát

A0 25g iszap (2175 mg O2/ 25g) + 5,51 g fehérje + 70 ml víz A1, B1, C1 25g iszap (2175 mg O2/ 25g) + 5,51 g fehérje + 70 ml víz 25g iszap (2175 mg O2/ 25g) + 5,51 g fehérje + 70 ml víz A3, B3, C3 100g iszap (8700 mg O2 / 100g) 100g iszap (8700 mg O2 / 100g) 25g iszap (2175 mg O2/ 25g) + 5,8 g keményítı + 69 ml víz A5, B5, C5 25g iszap (2175 mg O2/ 25g) + 5,8 g keményítı + 69 ml víz 25g iszap (2175 mg O2/ 25g) + 5,8 g keményítı + 69 ml víz A6, B6, C6 100g iszap (8700 mg O2 / 100g) 100g iszap (8700 mg O2 / 100g) A8, B8, C8 100g iszap (8700 mg O2 / 100g) 25g iszap (2175 mg O2/ 25g) + 2,28 g olaj + 73 ml víz A10, B10, C10 25g iszap (2175 mg O2/ 25g) + 2,28 g olaj + 73 ml víz 25g iszap (2175 mg O2/ 25g) + 2,28 g olaj + 73 ml víz A11, B11, C11 100g iszap (8700 mg O2 / 100g) 100g iszap (8700 mg O2 / 100g) 100g iszap (8700 mg O2 / 100g) A13, B13, C13 100g iszap (8700 mg O2 / 100g) NyI* * NyI: az alapvetı szubsztrátként adagolt nyersiszapból is vettünk mintát kemotaxonómiai célokra. 2009.11.25 2009.11.27 2009.11.29 2009.12.01 2009.12.03 2009.12.05 2009.12.07 2009.12.09 2009.12.11 2009.12.13 2009.12.15 2009.12.17 2009.12.19 2009.12.21 2009.12.23 2009.12.25 2009.12.27 2009.12.29 2009.12.31

IV/1. táblázat: A mintavétel és a szubsztrátadagolás menete. Az „A” reaktor az egész kísérlet során a kontroll szerepét játszotta, így minden alkalommal normál (100 g iszap) rátáplálást kapott. A 18. periódusban a kezelt reaktorokra nem történt rátáplálás, a kontrollra azonban igen.

Harmadik munkánkban, a szennyvíztelepi félüzemi mezofil rothasztók felfőtésének nyomon követésében mintavételezésünkkel egy közel három hónapos adaptációs idıszakot monitoroztunk (IV/2. táblázat). Mindkét reaktorból nyolc mintát, ezek közül hatot-hatot heti rendszerességgel vettünk. A két-két utolsó minta a többitıl idıben elkülönülve, hosszabb adaptációs periódusokat követıen került vételezésre. Felfőtés egy lépésben T4-es reaktor Felfőtés több lépésben T6-os reaktor mintavétel dátuma T (°C) mintanév T (°C) mintanév 2012. november 7. 34.1* 4/1 34.1 6/1 2012. november 14. 55.0 4/2 41.5 6/2 2012. november 21. 47.3 4/3 45.9 6/3 2012. november 28. 55.7 4/4 52.5 6/4 2012. december 5. 54.9 4/5 55.0 6/5 2012. december 12. 54.8 4/6 54.8 6/6 2012. január 16. 55.3 4/7 54.9 6/7 2012. február 13. 55.4 4/8 55.4 6/8 * A hımérséklet megemelése az elsı mintavételt követıen azonnal megindult.

IV/2. táblázat. Minták a felfőtéses kísérletbıl.

56


A kiindulási iszapmintákat a reaktorokból a szennyvíztisztító telep munkatársai vételezték csavarkupakos üvegedényekbe, és haladéktalanul laboratóriumunkba küldték azokat. A különbözı vizsgálatokra szánt alminták kiadagolása, elıkészítése és megfelelı eltárolása szintén megtörtént még a mintavételezés napján. A DNS-munkákhoz 1,5 ml-es Eppendorf csöveket töltöttünk meg a rothasztott iszapmintából, majd centrifugálással ülepítettük le a baktériumsejteket is tartalmazó szilárd anyagot (9000 g-n, 10 perc). A felülúszót elöntöttük, míg a sejteket tartalmazó iszapot -20°C-ra lehőtve tettük el a további feldolgozásig. A kemotaxonómiai vizsgálatokhoz 10-10 ml iszapot öntöttünk a zsírtalanított üvegedényekben elıkészített 30 ml diklór-metán : metanol (1 : 2) extrahálóelegyhez, majd további feldolgozásig -20°C-on tároltuk el a mintákat.

IV. B. 3. Az alkalmazott módszerek rövid áttekintése Mindhárom munkánkban elvégeztük a közösségi zsírsavprofil vizsgálatát, továbbá a mezofil-termofil összehasonlításban illetve a felfőtéses kísérletben a közösségi kinonprofilt is megvizsgáltuk. DNS-alapú vizsgálatok terén mindhárom munkánkban alkalmaztunk TRFLP (terminális restrikciós fragmenthossz-polimorfizmus) vizsgálatot, ám míg az elsı és harmadik munkánkban ez a közösség egészére kiterjedt és klónkönyvtár-elemzés egészítette ki, addig második munkánkban, a könnyen bontható szubsztrátok adagolásának vizsgálatában csupán az Archaea közösségalkotókat vizsgáltuk e módszerrel (a metil-koenzimM-reduktáz enzim α alegységét kódoló mcrA gént vizsgálva és adatbázis segítségével azonosítva a terminális restrikciós fragmenteket). A Bacteria közösségalkotókat ebben az esetben denaturáló gradiens gélelektroforézis (DGGE) módszerrel vizsgáltuk. A DGGE elınye az elméletileg elérhetı igen jó felbontás. A módszerrel elvben egy bázispárban különbözı DNS-szekvenciák is elválaszthatók egymástól, ráadásul az így elválasztott sávok késıbb tovább elemezhetık. A T-RFLP vizsgálat során szintén bázissorrendbeli különbségek alapján jellemezhetı a vizsgált minta. A módszer felbontása a használt endonukleázok számával növelhetı, de még így is elmarad a DGGE-tıl, ezért a zsírsavelemzéssel nem elemezhetı Archaea közösség vizsgálatához használtuk, amelynek dirverzitása mindig jóval kisebb, mint ez eubakteriális közösségé. Az ujjlenyomatvizsgálatok mellett mindhárom munkánkban több 16S rDNS gén szekvenciaanalízisét is elvégeztük (klónokból vagy DGGEsávokból). Az alábbiakban áttekintjük az alkalmazott módszereket.

IV. B. 4. A lipidek preparálása A lipidfrakció preparálása során Findlay módszerét vettük alapul, amelyet több ponton módosítottunk (Findlay, 1996). A minták kezelésük és tisztításuk során csak zsírtalanított, tiszta (tehát semmiféle kemotaxonómiai markert nem tartalmazó) eszközökkel kerültek

57


érintkezésbe. Ahol lehetséges volt hőtöttük, fénytıl és oxigéntıl távol tartottuk a vizsgált anyagot. Az extrakciót tiszta, 200 °C-on 2 órán át zsírtalanított üvegedényekben végeztük. A mintákat diklór-metán : metanol 2 : 1 arányú elegyébe helyeztük (20 g rothasztott iszapra: 20 ml diklór-metán illetve 40 ml metanol). A lipidextrakció kezdı lépéseként foszfátpuffert mértünk az elegyhez (20 ml, 50 mM K2HPO4 oldat; pH 7.4), és 6 órán át, 4 °C-on mágneses keverıasztalon kevertettük. 24 óra elteltével további 10 ml diklór-metánt és 10 ml desztillált vizet adunk a keverékhez, s a jobb sejtfeltárás érdekében 10 percre ultrahangos rázatóba (TESLA UC 405 BJ 1) helyeztük a mintát tartalmazó üvegedényt. Ezt követıen 12 órán át állni hagytuk az elegyeket. Az üvegben ilyenkor jól láthatóan elkülönül egy alsó, diklór-metános, és egy felsı, vizes fázis. A metanol túlnyomó hányada fokozatosan átoldódik a diklór-metános fázisból a vizes fázisba. A vizes-metanolos fázis nagy részének eltávolítása után üveg centrifugacsövekbe töltöttük az elegyet és centrifugálással (Janetzki T32; 500 g) elválasztottuk az iszap szilárd alkotóit a folyadékfázistól. A centrifugálás vékony, kocsonyás réteggé préseli ezek nagy részét a szerves és vizes fázis határán. A kloroformos fázist 200°C-on zsírtalanított Pasteurpipettával vittük át Whatmann-papírral (Whatmann 2Chr) bélelt üvegtölcsérbe, így átszőrve különítettük el a szerves fázist a benne maradt szilárd részecskéktıl és a vizes fázis maradékaitól. A tisztított szerves fázis vákuumos bepárlását (Büchi Rotavapor R-200)) követıen a lipidoldékony anyagokat kloroformban vettük fel. A lipidek tisztítása illetve elválasztása szők kicsövezéső, üveggyapot aprítékkal tömített üvegcsövekbe kézzel töltött szilikagél alapú oktadecil oszlopon (Baker Bond Phase C18, 40 µm Prep LC Packing) kezdıdött (IV/6. ábra). Az oszloptöltetet metanollal átnedvesítettük majd nagy nyomású levegıvel kloroformot préseltünk keresztül rajta, ezzel tömörítettük. A lipidoldékony talajkomponensek oldatát 1-1 ml kloroformban felvéve a kloroformmal nedvesített oszlopra injektáltuk. További 10 ml kloroform átfolyatásával a kinonok számos egyéb anyag IV/6. ábra. A közösségi lipidfrakció tisztítása kézzel töltött szilikagél alapú oktadecil oszlopok (Baker Bond Phase C18, 40 µm Prep LC Packing)

58

kíséretében lemosódnak az oszlopról (IV/6. ábra), míg a glikolipidek és foszfolipidek adszorbeálódnak az állófázishoz. Ezeket 10-10 ml aceton-


nal, illetve metanollal eluáltuk. A kinonok (kloroformos) és a foszfolipidek (metanolos) frakcióját további feldolgozásig -20 °C-on eltároltuk. A foszfolipidek metanolos frakciójába 1 ml diklór-metánt adagoltunk a lipidek oxidációjának elkerülése végett.

IV. B. 5. A respiratorikus kinonok analízise A kloroformos frakció a kinonok mellett a nyers iszapextraktum anyagainak jelentıs részét (pl. az oldat jellegzetes mélysárga színét adó pigmenteket, viaszokat, egyéb zsíroldékony komponenseket) még tartalmazza, ezért további tisztítást igényel, melyet Kieselgel 60 F254 típusú szilikagél vékonyrétegen végeztünk, futtatóelegyként hexán és dietiléter 55:10 arányú elegyét használva. A kinonok a számunkra felesleges anyagoktól retenciós idejük alapján szeparálódnak a vékonyrétegen, ezen túlmenıen azonban egymástól is elválnak az ubikinonok és a menakinonok. A kinonmolekulák átesı UV fényben történı detektálását a rétegben található F254 indikátor teszi lehetıvé (IV/7. ábra). Vékonyréteg-kromatográfia esetén nehézséget jelent, hogy a nagy mennyiségben jelen levı szennyezı anyagok némelyike – az anyagfelvitel helyén a réteg szemcséi közé kötve – befolyásolhatja a kinonok mobilitását illetve az eluensáramlás körülményeit, akadályozva ezzel a kinonok és a szennyezıdések szeparálódását.

menakinonok

ubikinonok

IV/7. ábra. Szilikagél vékonyréteg kloroformmal eluált lipidextraktum futtatását követıen normális fényviszonyok közt és UV transzilluminátoron szemlélve.

Második és harmadik vizsgálatunkban a vékonyréteg-kromatográfia helyett már a jóval egyszerőbben kezelhetı elıre gyártott SepPak® (Waters) szilika oszlopokon végeztük el a kinonok tisztítását illetve szeparálását. Hexánban feloldva injektáltuk az anyagokat az oszlopokra, majd Hu és mtsai. (1999b) leírását követve 98 : 2 arányú hexán : dietiléter eleggyel mostuk le a menakinonokat, majd 10 : 90 arányúval az ubikinonokat. Az eluált frakciókat bepároltuk, majd acetonitril-izopropanol elegyben visszaoldva vetettük alá HPLCanalízisnek. A kereskedelmi forgalomban standard kinonoldatok csak korlátozottan hozzáférhetık, ezért a kinonmolekulák pontos analíziséhez a mintákkal egyidejőleg autentikus baktériumtörzsek kinonjainak preparálása szükséges, melyek ismert molekulái alapján történik a ve-

59


gyületek meghatározása. A kinonok visszanyerése a vékonyrétegrıl acetonitril izopropanol 65:35 arányú elegyében történt 12 órás rázatással. Az oldatokat nylonfilteres ependorf-szőrı segítségével tisztítottuk meg a réteg szemcséitıl (Alltech Micro-Spin Filter Tubes). A szőrletet vákuumos exszikkátorban koncentráltuk, s -20°C-on, üvegedényben tároltuk. A mintákat acetonitril : izopropanol 65:35 eluens használata mellett magas nyomású folyadékkromatográffal vizsgáltuk tovább (Pharmacia LKB 2248 pumpa, oszlop: ODS Spherisorb), a kinonokat 270 nm-en történı fényelnyelésük alapján detektáltuk (Uvikord II detektor). Az ubikinonok illetve menakinonok azonosítása retenciós idejük alapján történt. Mivel

standard

kinonok

oldatai

nincsenek

kereskedelmi

forgalomban,

ismert

kinonösszetételő autentikus baktériumtörzsek tiszta tenyészeteinek biomasszájából kinyert kinonokat használtunk standardként (Collins és mtsai. 1977). Az általunk használt autentikus törzsek (fıkinonjuk aláhúzva): Escherichia coli DSM 1116 [Q-8, Q-7, Q-6, Q-5, Q-4; MK-8, MK-n]; Bacillus sphaericus DSM 28 [MK-7, MK6, MK-5]; Arthrobacter variabilis DSM 20132 [MK-9(H2), MK-8(H2), MK-7(H2), MK9]; Brevibacterium linens DSM 20426 [MK-8(H2); MK-8, MK-7(H2)]; Pseudomonas fragi DSM 3456 [Q-9, Q-8, Q-7, Q-6]; Nocardioides simplex DSM 10368 [MK-8(H4), MK9(H4), MK-8(H6), MK-8(H2), MK-7(H4)]; Tsukamurella paurometabolum DSM 7482 [MK-9, MK-10, MK-8, MK-7); Oerskovia turbata /tanszéki izolátum, 99.8 %-ban megegyezik a DSM 20577 törzzsel/ [MK-9(H4), MK-9(H2), MK-8(H4)], Actinomadura verrucosospora DSM 43358 [MK-9(H6), MK-11(H4), MK11(H2)]. A standard törzsekbıl nyert kinonstandardokat a mintáktól külön, de egyazon mintasoron belül futtattuk a nagy nyomású folyadékkromatográfon. A molekulák poliizoprénláncának hossza (az izoprénegységek száma) a normált retenciós idı logaritmusával áll egyenes arányban. Az izoprénegység-szám és a telítettségi fok illetıleg a retenciós értékek logaritmusa alapján így kalibrációs táblázat készíthetı melybe extra-és interpolációval a standard csúcsok között nem szereplı molekulavariánsok várható lgRT-értékei is bekerülhetnek. Mivel a kinonok között túlnyomórészt a lánchossz és a telítettségi fok tesz különbséget (ellentétben a zsírsavakkal, ahol e kettı mellett a sokféle szubsztituens is bonyolítja a variációs skálát), ez jó biztonsággal teszi lehetıvé a legtöbb menakinontípus pontos detektálását. Ubikinonok közül sajnos csak telítetlen alaptípusok állnak rendelkezésünkre, így közülük csak ez a típus azonosítható. Telítetlen ubikinonok csak gombákban fordulnak elı, autentikus gombatörzsek pedig nem álltak rendelkezésünkre. A kromatográfiában használatos HP Chem program környezetében igen nehézkesnek és rugalmatlannak találtuk az elemzés lehetıségeit különös tekintettel az automatikus integrálásra és a kalibrációs táblázat alapján történı csúcsazonosításra. Ezért Microsoft Excel környezetben megírt saját illesztıprogramunk segítségével szerkesztettünk kalibrációs tábláza-

60


tot a (baktériumokból nyert) standard kinonok futási sebessége alapján. Tisztított közösségi kinonjaink kromatogrammjait HP Chem programban manuálisan integráltuk csúcsonként, s a mintánként kimásolt csúcs-összesítı táblázatokat .txt szövegfájl formájában tároltuk el. A kalibrációs táblázatot, és a mintacsúcsok adatait tartalmazó szövegfájlokat felhasználva ezután egy saját magunk által írt (Delphi7 programozási környezetben kódolt) illesztıprogram segítségével végeztük el a csúcsazonosítást, melynek alapja a minta kinoncsúcsai retenciós idejének ±0,04-es ablakon belüli egybeesése volt a standard kinonok retenciós idejével (a retenciós idı 10-es alapú logaritmus-skáláján mérve; tapasztalati érték). Ahol a standardok csúcsainak távolságlogaritmusa kevesebb volt, mint 2×0,04, ott különbségük felénél lesz a kategóriahatár, ha pedig egy mintabéli csúcs nem esik standard csúcs ablaknyi környezetébe, ott programunk a legközelebbi standard csúcs nevét adja ennek a molekulatípusnak egy pozitív vagy negatív index-számmal ellátva aszerint, hogy milyen irányban és hányadik ablak-tartományba esik ettıl a standard csúcstól. Ily módon adatsorainkban a nem azonosított csúcsok is egymástól megkülönböztethetı módon, külön névvel jelennek meg. Így például MK9(H2)+2 jelentése: nem azonosított menakinon-molekula, melynek retenciósidı-logaritmusa az MK9(H2) menakinon lgRT értékétıl pozitív irányba esik (nagyobb annál), és az analízisben beállított ablakméret kétszeresének megfelelı tartományban van tıle számítva. Természetesen a pontos retenciósidı-értékével indexelve is azonosítható egy molekulatípus, a késıbb generált adatsorokat azonban mégis átláthatóbbá teszi ez a módszer.

IV. B. 6. A foszfolipid-zsírsavak származékoltatása és analízise A foszfolipideket tartalmazó metanolos frakcióval Welch (1991) módszere alapján dolgoztunk tovább. Az oldat vákuum-bepárlását követıen a lipideket metanol-toluol 1:1 arányú elegyének 0,5 ml-ében oldottuk vissza, átvittük csavarkupakos, zsírtalanított üvegkémcsıbe, majd ugyanennyi metanolos KOH (0,2 N) oldatot adtunk hozzájuk, s 15 percig 37°C-on vízfürdıben inkubáltuk a csöveket. Ekkor történik a transzészterifikáció: a foszfolipidek zsírsavai metilészterekké alakulnak. Lehőlés után 0,5 ml 0,2 N ecetsavoldatot adtunk az elegyhez, s röviden (5 mp) vortexeltük a csöveket, majd 2 ml kloroformot és 2 ml desztillált vizet adtunk az elegyekhez. 30 másodperces erıteljes vortexeléssel a kloroformos fázisba rázattuk át a metilésztereket. Az ecetsav hozzáadásakor mintáinkban (általunk nem azonosított, és a receptúrákban sem említett) fehér csapadék képzıdött, amely emulziót képezve erısen megnehezítette a fázisszeparációt (centrifuga-használat esetén is) és a kloroformos fázis tiszta edényzetbe vitelét. Késıbbi munkáink során találtunk csak megoldást a problémára: a fagyasztás (-20°C-on) megbontja az emulzió szerkezetét, és kiváltja a fázisszeparációt. A bepárolt, majd hexánban felvett metilésztereket gázkromatográfiával

61


(HP 5890 gázkromatográf, HP1 kapilláris-oszlop, hélium vivıgáz) választottuk szét. A zsírsavszármazékokat retenciós idejük alapján standard metil-észterekhez viszonyítva határoztuk meg a kinonokhoz hasonló módon saját programunkkal, 0,08 perces (tapasztalati) range-értéken belül megfeleltetve a zsírsavszármazékok RT értékeit a standard metilészterekéivel. Zsírsavak gázkromatográfiás vizsgálatában a retenciós idı lineárisan arányos a szénlánc hosszával. Mivel az általunk használt gázkromatográf mőködése idıközben megbízhatatlanná vált, második és harmadik vizsgálatunk során zsírsav-metilésztereink azonosítását már MIDI rendszer segítségével (MIDI Sherlock version 6.1) végeztettük el. A mérés a DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) kemotaxonómiai laboratóriumában történt, az adatkorrekciót és kiértékelést mi magunk végeztük. Megjegyzendı, hogy a tiszta tenyészetek vizsgálatára optimalizált MIDI rendszer a közösségi zsírsavprofilok csúcsainak meghatározását sok tévesztéssel végezte el, így az eredményül kapott profilok csúcsainak egyenkénti manuális ellenırzésére és a profilok korrekciójára (sok munkaórában) minden esetben szükség volt.

IV. B. 7. DNS-izolálás a mintákból A két kísérleti fermentor iszapjából a MoBio Laboratories termékével, a Soil DNA kit segítségével izoláltunk DNS-t, a gyártó által megadott módszert követve. Az alkalmazott DNS-izolálási módszer a sejtek fizikai (roncsolás üveggyöngyökkel) és kémiai feltárásán (detergenses kezelés) alapul. A mechanikai roncsolással történı sejtfeltárást a kit által javasolt vortexelés helyett sejtmalommal végeztük (30 Hz-es rázatás, 2,5 perc). A DNS tisztítása centrifugálással, a fehérjék kicsapásával és a nukleinsavak szilikát alapú mátrixhoz kötésével történt. A DNS izolálás eredményességét 1%-os agaróz-gélelektroforézis segítségével ellenıriztük. A gél elkészítéséhez 1 g agarózt, 100 ml 1x TBE oldatot, valamint DNSfestéket használtunk. Utóbbi az elsı vizsgálatban etidium-bromid, a második és harmadik vizsgálatban GR Safe DNA Stain I festék volt. A DNS termék méretének meghatározása 2.5 µl Lambda DnA/EcoRI+HindIII Marker 3 (Fermentas) molekulasúly marker segítségével történt. Az elektroforézist 100 V/cm-en, 20 percig végeztük. A DNS jelenlétét UV transzilluminátor segítségével ellenıriztük.

IV. B. 8. A vizsgált génszakaszok felszaporítása PCR-rel Az elsı vizsgálatban (mezofil-termofil összehasonlítás) 16S rRNS gén két fajmeghatározásra alkalmas szakaszát PCR segítségével amplifikáltuk a mintáinkból T-RFLP-vizsgálat és klónkönyvtár-készítés céljából. Külön PCR reakciót mértünk össze az Archaea és Bacteria domén tagjainak kimutatására alkalmas primerpárok felhasználásával (27 forward

62


és TET-519 reverz Bacteria illetve HEX-A344 forward és A934 rererz primerek Archaea esetén). (A premixek összetételét és a reakció hıprofilját lásd a Függelékben.) A második vizsgálatban (könnyen bontható szubsztrátok adagolása) „seminested” PCR-t végeztünk: elıször 27 forward és 1492 reverz primerrel sokszorosítottuk a 16S rDNS gént, majd ezt a PCR terméket templátul használva, GC-kapoccsal ellátott 27 forward és 519 reverz primereket alkalmazva újra amplifikáltuk a gén egy szakaszát egy második PCR során. Az így nyert kettıs szálú DNS-ek végén guaninban és citozinban gazdag szakasz (GC-kapocs vagy GC-clamp) található. Az Archea közösséget T-RFLP elemzéssel vizsgáltuk. Ennek elsı lépéseként PCR-rel amplifikáltuk az mcrA gént mlas forward és fluorescensen (FAM) jelölt mcrA-rev reverz primerrel. (Az alkalmazott primerek listáját, a reakcióelegyek összetételét és a reakciók hıprofilját lásd a Függelékben.) A felfőtéses kísérletben Bacteria közösség 16S rDNS-ének egy szakaszát a 27 forward és 519 reverz univerzális primer pár segítségével szaporítottuk fel T-RFLP-vizsgálat és klónkönyvtár-készítés céljából. Az Archaea közösség 16S rDNS-ének egy szakaszát két lépésben („semi-nested” PCR) az A109f és A1000r, majd a 340f és A1000r univerzális primer párokkal amplifikáltuk. Az alkalmazott primereket, a reakcióelegyek összetételét és hıprofilját lásd a Függelékben.) A PCR termékeket Wizard SV PCR Clean-Up Systemet (Promega) használva megtisztítottuk. A tisztított PCR termékeket agaróz gélektroforézissel megfuttattuk, a géleket etídium-bromiddal megfestettük, majd a GeneTools (Syngene) programmal meghatároztuk a DNS mennyiségét.

IV. B. 9. Klónkönyvtárak létrehozása A 16S rDNS PCR termékekeit a Viogene PCR-M→Clean Up System (Proteogenix) szilika alapú kitjének segítségével megtisztítottuk, 30 µl DEPC kezelt vízzel eluáltuk, majd a templát DNS-t Promega pGEM-T Easy (Promega) vektorokba ligáltuk (37 °C-on egy éjszakán át), az E. coli JM109 kompetens sejteket pedig hısokkal transzformáltuk a cég által leírt protokoll szerint. A kinıtt telepeket steril fogpiszkáló segítségével 35 µl DEPC kezelt vizet tartalmazó 600 µl-es Eppendorf csövekbe mostuk, majd a szuszpenziókat 98°Con 5 percig denaturáltuk PCR készülékben, ezután 12 000 g-n 3 percig centrifugáltuk. A 98°C-os 5 perces denaturáció során a sejtekbıl kiszabaduló DNS centrifugálás után a felülúszóba kerül. Innen mértük be a templátokat M13 PCR elegybe. (Az alaklamazott primereket, a premix összetételét és a reakció hıprofilját lásd a Függelékben.) Az így létrejövı termékekbıl 1µl-t ezután az elızınek megfelelı, 21 ciklusos PCR-nek vetettük alá 344fHEX/934r (Archaea) és 27f-TET/519r (Eubacteria) primer párokkal. Ezután a klónokat a közösségi DNS-amplikonokkal megegyezı módon készítettük elı T-RFLP analízisre.

63


A felfőtéses kísérletben a PCR amplifikációt követıen a DNS terméket EZ-10 Spin Column PCR tisztító kit (Bio Basic Inc., Kanada) segítségével tisztítottuk meg a primer dimerektıl és a további alkalmazásokat zavaró sószennyezıdésektıl a gyártó utasításait követve. Ettıl kezdve a klónkönyvtár készítése az ismertetett módon történt a 6/1, a 6/6 és egy, az itt vizsgált mintasornál késıbbi, 2011. március 12-én vett mintából. Jelen dolgozat írásakor a klónok T-RF-eredményei nem álltak rendelkezésre még, így az eredmények értékelésében a reprezentáns klónok szekvenciáinak in silico hasításából adódó T-RF hosszakat vetettük össze a közösségi minta T-RF-hosszaival, s [a T-RF-driftbıl adódó hibalehetıségek figyelembe vételével (Kaplan és Kitts 2003)] ilyen módon feleltettük meg egymásnak a közösség domináns csúcsait és a klónokat.

IV. B. 10. A klónok csoportosítása Amplifikált Riboszomális DNS Restrikciós Analízis (ARDRA) segítségével A felfőtéses kísérletben szekvenálandó klónjaink szőrésére ARDRA-csoportokat hoztunk létre. Az inszert DNS amplifikációját követıen a termékeket restrikciós emésztésnek vettettük alá, amely a Bacteria esetén AluI és BsuRI (HaeIII), az Archaea közösség vizsgálatakor AluI és MspI (HpaII) enzimekkel történt (összetételt, hasítóhelyet ld. a Függelék vonatkozó pontjában). Az emésztmény detektálása 2%-os agaróz gélben történt. A felhasznált agaróz mennyisége 2 g volt. További eltérés, hogy ARDRA elemzés esetén 20 µl-nyi mintát vittünk fel a gél zsebeibe 8 µl töltı pufferrel való összekeverés után. A futás 80 V/cm-en, 90 percen keresztül zajlott. A kapott mintázatok alapján a klónokat csoportosítottuk, a két enzimmel hasított DNS termékek gélben kapott mintázatának egyezése esetén egy ARDRA csoportba kerültek. Minden csoportból kiválasztottunk egy-egy reprezentánst, amelyet bázissorrend meghatározásnak vettetünk alá.

IV. B. 11. T-RFLP analízis A terminális restrikciós fragmens hossz polimorfizmus (T-RFLP) szemikvantitatív molekuláris ujjlenyomat módszer, amely során a kialakuló terminális fragmensek (T-RF-ek) mintázata alapján következtetni lehet az egyes közösségalkotók (fajok) jelenlétére, valamint azok relatív abundanciájára. A T-RFLP során az emésztett PCR termék fluoreszcensen jelölt terminális fragmensei a kapott kromatogramban egy-egy csúcsként jelennek meg, a közösség egy-egy tagját képviselve. A csúcs alatti terület pedig a DNS relatív mennyiségérıl, ezáltal a közösségbeli dominanciaviszonyokról ad információt. A különbözı közösségek így specifikus mintázattal jellemezhetıek, amelyek alapján az egyes közösségek összetétele összehasonlítható. A mezofil és termofil közösségek mintáiból és a klónkönyvtár mintegy száz tagjából származó PCR-termékeket vetettük alá T-RFLP-analízisnek. A fluoreszcensen jelölt prime-

64


rekkel készült PCR termékekbıl restrikciós endonukleázt tartalmazó reakcióelegyeket állítottunk össze. (Az elegyek és pufferek összetételét lásd a Függelékben.) Az emésztett mintákat ezután etanolos precipitációnak vetettük alá. (Menete a Függelékben.) Az így megtisztított közösségi 16S rDNS-hez 30 µl dH2O-t adtunk, majd az elektroforézisig -20°C-on tároltuk. Futtatás elıtt a mintákból erısségüknek megfelelıen 1-4 µl-t mértünk 12 µl formamid és 0,5 µl TAMRA 500 (Applied Biosystems) elegyébe, majd 98°C-on 5 percig denaturáltuk. A terminális fragmentek elválasztását ABI Prism 310 Genetic Analyser (Applied Biosystems) kapilláris gélelektroforézis készülékkel végeztük. Ennek során a mintákkal együtt eltérı fluoreszcens jelöléssel ellátott molekulasúly standardot is futtatunk, esetünkben ez a TAMRA 500 (Applied Biosystems) volt, melynek segítségével késıbb meg tudjuk állapítani a fragmentumok pontos hosszát GeneScan (Applied Biosystems, 3.1.2. verzió) programcsomag segítségével. A jel intenzitása arányos a kópiaszámmal, ezért a görbe alatti terület nagyságából következtethetünk a közösség relatív abundancia viszonyaira is, a PCR technika torzítását figyelembe véve (Polz és Cavanaugh 1998, Lueders és Friedrich 2003). Az adatok értékeléséhez a T-Align, interneten elérhetı programcsomagot használtuk (Smith 2005). A könnyen bontható szubsztrátok adagolásvizsgálatában a PCR termékeket HaeIII, MspI (New England Biolabs) restrikciós endonukleázzal emésztettük. A 10 µl végtérfogatban mintegy 10 ng DNS tartalmú PCR termékhez 10 egység (U) enzimet adtunk és 30 °C-on egy éjszakán át inkubáltuk a reakcióelegyet (Tauber és mtsai. 2013). (A reakcióelegyek összetételét lásd a Függelékben.) A csúcsokat a németországi kollégák mcrA adatbázisa segítségével azonosítottuk „in silico” emésztések során (Nikolausz és mtsai 2012). Az adatbázis különféle mintákból izolált szekvenciákat tartalmaz teoretikusan, és a gyakorlatban is meghatározott T-RF-méretekkel. A felfőtéses kísérlet feldolgozásában Bacteria esetében AluI (Fermentas) és BsuRI (Fermentas) enzimek hasítottak, míg Archaea-vizsgálathoz AluI (Fermentas) és MspI (Fermentas) restrikciós endonukleázokat használtuk. (A reakcióelegyek összetételét lásd a Függelékben.)

IV. B. 12. DGGE Mivel a G-C kötés stabilabb, mint az A-T, denaturálódásnál a láncvégekre épült GCgazdag DNS szakaszok kevésbé hajlamosak szétválni, ezáltal egy úgynevezett GC-kapcsot (GC-clamp) alkotnak. Így a denaturálódás során a kettıs szálú DNS az egyik végénél nem fog szétválni, ennek következtében a teljesen denaturálódott DNS adott denaturálóanyagkoncentrációnál megáll a gélben, nem vándorol tovább. A gélben optimális esetben egy-egy

65


csík egy-egy taxonnak felel meg, a csíkok intenzitása pedig arányban áll a taxon abundanciájával a közösségen belül. Az elektroforézishez 7 %-os poliakrilamid tartalmú gélt használtunk. A grádiens elıállításához 40 százalékos és 60 százalékos denaturáló gél törzsoldatokat készítettünk, ahol definíció szerint a 100 százalékos denaturáló koncentrációjú gél 7 M ureát és 40 százalék formamidot tartalmaz. A 40 százalékos törzsoldat elkészítéséhez 4,8 ml 40 százalékos akrilamid oldatot, 480 µl 50-szeres töménységő Tris-acetát-EDTA (TAE) puffert, 4 g ureát és 3,84 ml formamidot 24 ml-re egészítünk ki desztillált vízzel. A 60 %-os törzsoldathoz 4,8 ml 40 %-os akrilamid oldatot, 480 µl 50-szeres töménységő TAE puffert, 5 g ureát és 4,8 ml formamidot egészítünk ki 24 ml-re desztillált vízzel. Az oldatokat ultrahangos rázatással buborékmentesítettük, majd közvetlenül a gélöntés elıtt 50 µl 20 %-os ammónium perszulfát oldatot és 50 µl tetrametil-etilén-diamin (TEMED) oldatot adtunk, ami beindítja a polimerizációt. A denaturáló grádiens gélt perisztaltikus pumpa és grádienskeverı segítségével öntöttük, amelyre denaturálószert nem tartalmazó töltı gélt rétegeztünk. A végsı PCR termék teljes térfogatát (45 µl) Hamilton-fecskendıvel juttattuk a gél zsebeibe. Az elektroforézist 1 %-os TAE pufferben, 60 °C-on, 80 V feszültséggel 15 órán át INGENY PhorU készülékben végeztük. Ezután a gélt etídium-bromidban 30 percig festettük, majd kétszer 15 percen keresztül mostuk 1 %-os TAE pufferben. A kialakult futási mintázatot átesı UV fény mellett digitális kamerával rögzítettük. A sávmintázatot TotalLab (TL120, Nonlinear Dynamics) képelemzı programmal kiértékeltük és ez alapján elvégeztük a minták klaszteranalízisét.

IV. B. 13. Sávok kivágása a DGGE gélbıl és újbóli felszaporításuk A poliakrilamid gélbıl UV átvilágítás mellett, steril szikével kivágtuk a diszkrét csíkokat, s ezeket steril Eppendorf-csövekbe tettünk. A csíkokra mintánként 20 µl steril DEPCkezelt desztillált vizet pipettáztunk és 12 órán keresztül 4°C-on inkubáltuk. Másnap a felülúszót átmértük új tesztcsövekbe és felhasználásig -20°C-on tároltuk. A gélcsíkokból eluált DNS-t szekvencia meghatározás céljából ismételt PCR amplifikációnak vettettük alá a korábbi PCR-DGGE analízisnél használt primerpárokkal, azonban a forward primer ezekben az esetekben jelöletlen volt. A PCR termékeket Viogene PCR-M® Clean Up System rendszerrel (Viogene-Biotek Corp Sunnyvale, CA, USA) tisztítottuk a gyártó utasításainak megfelelıen.

IV. B. 14. Bázissorrend-meghatározás A mezofil-termofil összehasonlításban a közösségek és a klónok két enzimmel kapott TRFLP mintázatait összevetve választottuk ki klónkönyvtárunk azon tagjait, melyek átfedı csúcsokat 66

adtak

a

közösségi

minták

T-RFLP

eredményeivel.

Ezeken

aztán


szekvenciavizsgálatot végeztünk. A transzformált sejtek telepeibıl izolált DNS-t elıször M13 primerekkel amplifikáltuk, majd az így kapott fragmentekre doménspecifikus primerekkel mértünk össze PCR-t, ennek termékét Viogene kittel megtisztítottuk. Az ekképpen tisztított DNS-re állítottunk össze szekvenáló PCR-t, mely a Sanger-féle stop-nukleotidos módszeren alapul annyi kiegészítéssel, hogy az egyes dideoxi-nukleotidok más-más hullámhosszon fluoreszkáló festékkel jelöltek. Ehhez az ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit-jét (Applied Biosystems) használtuk. A reakcióhoz használt primerek a már említett 519r és 934r oligok voltak. (A szekvenáló reakció összetételét és a reakció hıprofilját lásd a Függelékben.) A szekvenáló reakció termékét etanol precipitációval tisztítottuk, ezután ABI Prism 310 Genetic Analyser (Applied Biosystems) automata szekvenátorral elemeztük. A szekvenciákat Chromas programcsomaggal ellenıriztük és a kapott adatokat BLAST internetes adatbázis segítségével illesztettük és analizáltuk. A könnyen bontható szubsztrátok vizsgálatában a DGGE-sávokból felszaporított termékek szekvenálása hasonlóan történt. A reakciójához használt primerek 27f és 519r oligok voltak. A szekvenciameghatározás a LGC Genomics GmbH berlini laboratóriumában történt. Kiméra szekvenciákra Mallard szoftverrel szőrtünk (Ashelford és mtsai. 2006), a kimérákat kizártuk a további vizsgálódásból. A felfőtéses kísérlet esetében a klónozott gének bázissorrend meghatározását ugyancsak a LGC Genomics GmbH berlini laboratóriumában végezték el. Az alkalmazott primerek 27f és 519r oligok voltak. A bázissorrend-adatok kiértékelését MEGA5 program segítségével végeztük. A kapott szekvenciákkal legközelebbi rokon szervezeteket nyilvános adatbázisban (GenBank) kerestük meg a BLAST program segítségével (Altschul és mtsai. 1997), valamint a legközelebbi tenyészthetı rokon fajokat (típustörzseket) az interneten elérhetı EzTaxon adatbázis alkalmazásával azonosítottuk (Kim és mtsai. 2012).

IV. B. 15. Az adatok kiértékelése Adataink kiértékeléséhez és eredményeink szemléltetéséhez Microsoft Excel® programot illetve PAST statisztikai programot (Hammer és mtsai. 2001) használtunk, valamint saját fejlesztéső szoftvereinket alkalmaztuk. A házi programok és a többféle mérési rendszer használatából kifolyólag sokszor további feladat volt a különbözı minták táblázatainak egybeszerkesztése közös adatmátrixszá. Ez nagyszámú változó esetén manuálisan már rendkívül veszıdséges munka, így ezt is a számítógépre bíztuk: a minták adatsorait egységes táblázatba rendezı program megírására Szabó Zsoltot kértük fel, aki a buborékszámlálásos gázhozammérı módszer kifejlesztésekor is a szoftverkódolás kivitelezıje volt. Az általunk kidolgozott, származtatott változókat is elemzésbe vonó adatkezelési eljárás kivitelezése érdekében illetve ennek tesztelésére alkalmas szimulált adatsorok generálásá-

67


hoz szintén saját szoftverre volt szükségünk. A szimulációkból valamint a valós mintákból származó adatmátrixok értékeibıl adatkezelı programunk adatcsoportokon belül meghatározott tagszámú összeadásokat végez, megfelelı adatszőrést hajt végre, majd a képzett öszszegeket mint származtatott változókat a kiindulási adatokkal együtt klaszteranalízisnek veti alá. Ennek eredménye alapján nagyítható (így részleteiben is tanulmányozható) és nyomtatható hasonlósági fát szerkeszt. Az adatkezelési koncepció részletes kifejtésére a V. B. 3. 3. fejezetben kerítünk sort. Az újszerő adatkezelési módszer tesztelésére mikrobaközösségek molekulamarkereinek idıbeli szintváltozásait szimulálni képes szoftvert is kódoltunk. Ez egy megadott tagszámú virtuális mikrobaközösség populációdinamikáját modellezi egy általánosított Lotka-Volterra modell alapján. A virtuális közösségalkotókhoz (elıre beállítható szorzó szerint) hozzárendelt virtuális markermolekulák szintjét minden generációs lépésben feljegyzi. Így egy, a valóságosakhoz hasonló adatmátrixot generál különbözı típusú markerekkel (ahogy a valóságban is dolgozunk pl. zsírsav-, kinon- és DNSmarkerekkel), melyek hordozzák az információt a közösség idıbeli változásairól. Ám a valós helyzettıl eltérıen itt eleve pontosan ismerjük a markereket „termelı” szervezetek kilétét (hisz mi magunk rendeltünk markereket a közösségalkotókhoz). Így ezen adatsorok segítségével tesztelhetıvé válik bármely adatkezelési eljárás a tekintetben, hogy az adatsorok alapján képes-e az eredeti közösségszerkezetre utaló, használható információt nyújtani. A programok kódolását az ELTE Informatikai Karával közösen végzett szakdolgozati kooperációs program keretében Czigler András végezte, aki az adatrendezés tökéletesítésében is segítségünkre volt (Czigler 2010). A felfőtéses kísérlet T-RFLP-eredményeit – szintén az V. B. 3. 3. fejezetben tárgyalt okokból – visszakorrigáltuk az eredeti biomasszamennyiségnek megfelelı mennyiségi arányokra, ahol a biomasszamennyiség becslését a közösségi zsírsavak mennyiségi összegzésével végeztük. Az összefüggéskeresést zavaró hatások csökkentése érdekében a statisztikai elemzésekbıl kizártuk azokat a markerváltozókat, amelyek a) csak egyetlen mintában voltak jelen, és fajlagos mennyiségük a markercsoportban nem érte el az 5%-ot, b) amelyek kevesebb, mint a minták felében voltak jelen és egyikben sem érték el az 1%-ot csoportjukon belül, c) azon nem azonosított kemotaxonómiai markerek, amelyek kevesebb, mint 10 mintában voltak jelen, s egyikben sem érték el az 5%-ot kategóriájukban. (Utóbbi kritérium hatálya alá csupán 6 db, az ubikinon-adatsorban szereplı nem azonosított változó esett, mindegyik 2%-os elıfordulás alatt).

68

V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK

V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK V. A. Új metódus kidolgozása kis produkciójú gázforrások hozamának volumetriás mérésére V. A. 1. A módszertesztelés eredményei V. A. 1. 1. Az eszköz kalibrálása ismert standard gázforrás ellenében Az általunk használt rendszerparaméterek (800×600 felbontású kamera, 6 mm belsı csıátmérı, 28 cm-es távolság a csövek síkja és a kamera frontlencséje között) mellett a következı eredményeket kaptuk. Elsı körben 11 értékelhetı mérést végeztünk. Minden mérés 100 buborék áthaladásáig tartott 0,87 ml/perces állandó hozam mellett. Csupán a kézi kalibrálásra hagyatkozva (vagyis csak c1 korrekciós faktort használva; 3,25 px) a detektált gázmennyiség (átlagosan 59,81 ml) 5.82±0,18%-kal volt kisebb, mint a standard hozam alapján kalkulált mennyiség (átlagosan 62,6 ml). Bevezetve ebbıl a különbségbıl c2 korrekciós faktort (0,0279 ml) a következı 11 mérésben a detektált gázmennyiség sokkal jobban közelítette a várt értéket: a különbség mindössze ±0,17% volt. A szisztematikus hiba tehát eltőnt. V. A. 1. 2. Tesztelés bioreaktorokon Két reaktor három, egyenként kettı napos rátáplálási periódusának gázhozammérését végeztük el, minden rátáplálási idıpontban újra indítva a buborékszámlálást. Kis idıfelbontással szemlélve a hozamgörbéket (V/1. ábra) karakterisztikus mintázatot látunk kezdeti magas, de gyorsan csökkenı hozammal, stabil gáztermelési periódussal, majd hosszan elnyúló leszálló ággal. Az V/1. ábrán az is megfigyelhetı (az elsı mérési periódus görbéin bemutatva), hogy az adatpontokba átlagolt mérési alapértékek (vagyis buboréktérfogat-∆t adatpárokból számolt hozamértékek) szórása nagyobb, mint a szomszédos (két óránkénti) átlagértékek különbsége. Ha összevetjük a buborékméret-adatok és a ∆t idıadatok relatív szórását (V/1. táblázat), láthatjuk, hogy az utóbbi felel a hozamszórás nagy részéért, mintegy tízszeresen meghaladva a méretek relatív szórását. Ez az ingadozás a buborékok érkezési ütemében ráadásul nem volt kaotikus, hanem egy határozottan szabályosnak tőnı, intenzív oszcilláció képét mutatta, melyet a két órás átlagadatok természetesen elfedtek. Nagy (buboréknyi) idıfelbontással ábrázolva a hozamgörbét (V/2. ábra) mind az ingadozás intenzitása, mind szabályossága nyilvánvalóan látszik. A buborékok érkezési ütemének idıbeli fluktuációját parallel videofelvételekkel is igazoltuk. A gázkilépés periodikusan visszavisszaesett akár 80%-kal, majd újra maximumáig nıtt.

69

Gázhozam [ml/perc]


0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0

10

20 Mérési idı [óra]

Gázhozam [ml/perc]

A1

A2

30

40

A3

0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0

10

20 Mérési idı [óra] B1

B2

30

40

B3

V/1. ábra. Biogázhozamok 2 órás bontásban. a: A reaktor eredményei. b: B reaktor eredményei. A hibasávok az adatpontok szórását mutatják A1 és B1 mérések esetében.

a buborékméretek relatív szórása A1 A2 A3 B1 B2 B3

0,064 0,056 0,062 0,076 0,069 0,073

a ∆t értékek relatív szórása 0,623 0,520 0,708 0,459 0,638 0,670

V/1. táblázat. A buborékméretek és ∆t idıintervallumok relatív szórása.

70


0.8 Gázhozam [ml/perc] .

0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0

4

8

12

16

.

24

28

32

36

40

44

Mérési idı [óra]

0.8

Gázhozam [ml/perc]

20

0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1

max.

0 7:12:00

9:12:00

11:12:00 13:12:00 M érési idı [óó:pp:mm]

15:12:00

V/2. ábra. A1 periódus hozama maximális (mindenkori ∆t-nyi) felbontással, melyen minden buborék adatpontja szerepel. A jelölt idıszakban a hozamingadozás frekvenciája maximális volt.

Hogy egzakt módon tudjuk karakterizálni az észlelt oszcillációt, az adatsorokból Morell hullámhossz-spektrumot generáltunk (V/3.a. ábra). (Az angol wavelet spectrum kifejezésnek eddig nem ismertük meg elfogadott magyar változatát. Talán a hollámhossz-spektrum kifejezés tőnik alkalmasnak, holott az általunk használt ábrázolásban inkább a periódusidıspektrum volna szabatos.) Egy efféle spektrumon a vizsgált adatsor ingadozásainak periódusidıi vannak feltüntetve a mérési idı ellenében, mégpedig matematikailag generált ideális hullámokhoz való illeszkedésük szignifikanciaszintjei szerint, színkódolt tartományok formájában feltüntetve. Ez az ábrázolásmód akkor is jól elkülönülten mutatja az adatsori ingadozások karakterisztikáit, ha egyszerre több háttértényezı ingadozása rakódott az adatokra.

Ilyenkor

függıleges

irányban

(azaz

más

periódusidıvel)

elkülönülı

szignifikanciamaximumok mutatják a spektrumon az adatgrafikonokon sokszor kivehetetlenül egymásra íródó szabályos ingadozások jelenlétét. A spektrum által kirajzolt szignifikanciamaximum-zónák

y

irányú

középpontjaiból

megszerkesztettük

a

gázhozamgörbéink oszcillációinak frekvenciaprofiljait (V/3.b. és c. ábra). Ezeken jól látható, hogy közvetlenül rátáplálások után hosszabb periódusú ingadozás kezdıdött (az y tengely fordított!), ezt követıen gyorsul az ingadozás, míg az idıszak 20. órája táján eléri ma71


ximumát. Ez után enyhén csökkenı tendencia következett minden esetben. A lassú kezdeti

Periódusidı [perc]

ingadozás különösen B reaktor esetében volt igen kifejezett.

5 10 15 20 25 30 35 40 5 10 15 20 25 30 35 40 5 10 15 20 25 30 35 40 45

(a)

(b)

A2

A1 0

10

A3

20

30

40

(c)

B2

B1 0

10

B3

20

30

40

Mérési idı [óra] V/3. ábra. Morell-féle hullámhossz-spektrum és frekvenciaprofilok. a: A1 periódus hullámhossz-spektruma. b és c: A illetve B reaktor hozamainak frekvenciaprofiljai az 1., 2., és 3. periódusban. A folytonos vonalak egyazon maximálszignifikancia-mezık pontjait kötik össze, a szaggatott vonalak a szomszédos mezık közeli pontjait. További magyarázat az V. A. 2. fejezetben.

Az észlelt ingadozás legnagyobb idıbeli következetességgel és szignifikanciával az A1 mérési periódusban jelentkezett (ezt mutattuk be az V/2. és az V/3.a. ábrákon). Ebben az esetben a frekvenciamaximum a mérés kezdetétıl számolt 11:12:00 - 12:02:00 idıintervallumra esett, ahol a periódusidık átlaga 12 perc 39 másodperc volt. Négy periódus esett ebbe szakaszba, mindegyik alatt 7 buborék érkezett 0,44 ml-es átlagtérfogattal. Vagyis egy ilyen periódus alatt a gázhozam 3,08 ml volt. On-line pH-mérést is végeztünk, hogy fényt derítsünk a gázkilépés ingadozó voltának esetleges fizikokémiai hátterére. A pH a mérési idıszak folyamán 6,8 - 7 értékek között változott, de semmiféle kimutatható ingadozását nem tapasztaltuk.

72


V. A. 2. A módszertan és a módszertesztelési eredmények értékelése V. A. 2. 1. Módszerünk elınyei és korlátai A digitális képalkotási technikák és a mintázatfelismerı szoftverek mai fejlettségi szintjén kézenfekvı alkalmazni ezeket az eszközöket egyszerő mérési feladatok elvégzésére. Az áramló gáz buborékok formájában folyadékban láthatóvá tehetı, és geometriailag alkalmas módon felépített eszközzel a gázbuborékok kis hidrosztatikai nyomás ellenében, reprodukálható méretben és alakban, pontos nyomvonalon, kicsi és állandó sebességgel képesek mozogni, aminek következtében megbízhatóan észlelhetık, számolhatók és mérhetık mint egy alkalmasan kialakított vizuális mintázat részletei. Nincs szükség sem komplex vagy precíz technikával kialakított mozgó alkatrészekre, sem szelepekre vagy speciális detektorokra. Egy egyszerő, olcsó webkamera üvegcsövek fölé rögzítve, valamint egy alkalmas szoftver elvégzi a mérés egészét anélkül, hogy bármilyen számottevı módon befolyásolná a mért rendszert. Mindössze a csövekben (melyek speciális kotyogóként is felfoghatók) találkozik a gáz csekély hidrosztatikai ellennyomással, melyet a termelı gázforrás légkörit meghaladó enyhe túlnyomása is leküzd már. Nincs szükség hardvervezérlésre a kamera mőködtetésén túl. A csövek végére csatlakoztatható esetleges gázgyőjtı zsákok sem befolyásolják a mérés eredményét, ha pedig mégis, csak ideiglenesen, a nyomásarányok állandósulásáig. Nem utolsósorban pedig eszközünk minimális ráfordítással bıvíthetı több csatornás készülékké: gázforrásonként csupán egy további üvegcsövet kell a látótérbe helyezni. A látótér mérete illetve a kamera felbontása természetesen korlátját jelenti ennek is, de jelenlegi szoftver-verziónk 8 csatorna (csı) mérésére eleve alkalmas, így nyolc gázforrás mérése mindössze hét L-csıvel jelent nagyobb ráfordítást, mint egyetlen forrás mérése. Ez az eszközszintő egyszerőség meglehetısen praktikussá teszi módszerünket. A látótér nagyságának és a kamera csövektıl mért távolságának változtathatósága a mindenkori igények szerinti optimum keresésének lehetıségét kínálja. A kamera látóterébe annál több párhuzamosan mérhetı csı fér (kis szoftvermódosítással a mérhetı csövek száma 8 fölé emelhetı, erre azonban nekünk sosem volt szükségünk idáig), minél távolabb van a kamera a csövektıl. Ekkor azonban a buborékok kisebb szög alatt látszanak, ami a méretmeghatározás pontosságát és a jel-zaj arányt kedvezıtlenül befolyásolja. (Ez a kamera felbontásának növelésével természetesen visszakorrigálható). Fordítva is igaz ugyanakkor, hogy a mérhetı csövek számának rovására a mérési pontosság jelentısen javítható a kamera és a csövek közelítésével. A csövek megdöntési szögének váltakozásával szők határok között kereshetünk optimumot a buborékok sebessége és az idımérés pontossága, illetve a buborékok mérete és száma között. A buborékok sebességének növelése nagyobb gázhozam esetén indokolt, amikor a buborékok gyorsan is képzıdnek, és félı, hogy túl nagyra nınek, vagy nem ideális áramlási viszonyok esetén beérik egymást, és egyesülnek a csıben. 73


A nagy buborékméret elınye viszont, hogy erısen javítja a térfogatmérés pontosságát a jelzaj arány javítása és az esetleg fennmaradó szisztematikus hibák arányának csökkenése miatt. A kis buborékméret elınye ugyanakkor, hogy adott mennyiségő gáz több buborék formájában fog megjelenni, ami a mérés idıbeli felbontását növeli. Zajon a fentiekben az abból eredı hibákat értjük, hogy a kamera felbontása véges, az észlelhetı buborékhatár képe ráadásul a folyadék- és gázfázis között a meniszkuszok miatt eleve bizonytalan. Így a folyadékáramlás ingadozásából, az eszköz és/vagy az épület mikromozgásaiból vagy a megvilágítás esetleges ingadozásaiból fakadóan változó optikai mikrotényezıkön múlik, hogy egy határpixelt a program a buborék vagy környezete részeként azonosít majd. Ez azonban aligha jelenthet egy pixelnél nagyobb bizonytalanságot buborékhatáronként, azaz két pixelnyit buborékonként. Nem mindegy azonban, hogy ez a két pixelnyi esetleges hiba például egy hét pixelesnek detektált buborékon alapuló térfogatszámítást terhel, vagy egy harminc pixelesen alapuló mérést. Módszerünk hátrányaként tartható számon, hogy a gáz, ha kevés folyadékkal is, de kontaktusba lép, amire tekintettel kell lenni a folyadék és a festék megválasztásánál, illetve elkerülhetetlen a gázkomponensek részleges beoldódása a folyadékba. Ezen a téren ugyanakkor további optimalizálási lehetıségek is nyílnak. Walker és mtsai. (2009) úgy találták, hogy 75%-osan telített sóoldat használatával a folyadékkiszorításos győjtıedényekben megelızhetı a gázkomponensek beoldódása. Sóoldat minden további nélkül alkalmazható a buborékszámoló csövek esetében is, amennyiben a festékanyag színén és/vagy idıtállóságán ez nem változtat. Festékanyagként munkánk során 0,06 mM-os KMnO4 oldatot használtunk optimálishoz közeli magenta (R: 255 G: 0 B: 255) színe miatt, a permanganát ionok azonban lassan Mnoxiddá redukálódva mintegy két hét alatt elbarnították a csöveket, így azok rendszeres tisztítást igényeltek. Késıbbi munkáink során alternatív festıanyagokat keresve megállapítottuk a 0.5 M-os (telítettség-közeli) CuSO4 oldat alkalmasságát optimálishoz közeli ciánkék (R: 0 G:255 B: 255) színe miatt. A töménység az oldat kezelését megnehezítheti, ugyanakkor a gázbeoldódás problémájára önmaga megoldást jelenthet. Egyéb, inertebb rézsók ugyanúgy szóba jöhetnek (pl. CuCl2). Optimálishoz közeli sárga (R: 255 G: 255 B:0) színe miatt jól tudtuk alkalmazni a 0,0015%-os Na-fluoreszcein oldatot, amelyet azonban – más rendszereken szerzett tapasztalataink alapján – a gáz ammóniatartalma színtelenít el rövid idın belül, így magas nitrogéntartalmú anyagok rothasztásánál meggondolandó a használata. A környezı hımérséklet hirtelen változásai befolyásolhatják a mérés eredményét, amennyiben a buborékok összehúzódnak vagy kitágulnak a csövek belsejében. Amennyiben a pontosság megkívánja, és lehet számítani a külsı hımérséklet hirtelen ingadozásaira,

74


érdemes a készüléket a reaktorokkal együtt termosztálni. A gáz természetesen összehúzódhat vagy kitágulhat a csöveket megelızı gázvezetékben is. Kétségtelen, hogy egy hideg gázbuborék több anyagot foglal magában, mint egy ugyanakkora meleg. Ne felejtsük el azonban, hogy térfogatáramot mérünk, eszközünk valóban nem alkalmas anyagáram mérésére. Természetesen szimultán hımérséklet- és nyomásmérés lehetıvé teszi az adatok ilyen célú korrekcióját is, az együtt termosztálás azonban egyszerőbb megoldásnak tőnik. A habzás minden bioreaktorokkal foglalkozó kísérlet egyik fı buktatója. Eszközünk elınyére válik e téren is az egyszerőség. Nem kerülnek érintkezésbe érzékeny alkatrészek az esetleg túlfutó habbal. Csupán a gázvezetékeket és a mérıcsöveket kell kitisztítanunk. Természetesen a hab belépése az eszközbe ellehetetleníti a további mérést, ez azonban valószínőleg minden egyéb módszerre ugyanígy igaz. Habzásgátló anyagok adagolása javallott ilyen esetekben, Mathiasen (1989) Mg2+ és Ca2+ adagolását javasolja ilyen esetekre, de idıszakos habzás esetén számunkra az is megoldást jelentett, ha csökkentve az iszapmennyiséget egyszerően nagyobbra hagytuk a reaktorok gázterét. V. A. 2. 2. A teszteredmények értékelése A tesztelı és egyben kalibráló mérés standard gázforrással szemben azt mutatta, hogy a használt paraméterek esetén a manuális kalibráció és vizuális korrekció (c1) önmagában is alig 6%-os szisztematikus hibával terhelt mérést tesz lehetıvé. Bevezetve c2 korrekciós faktort (amely voltaképpen nem más, mint a kalibráló mérés szisztematikus hibája elosztva a buborékszámmal) a késıbbi mérésekben a szisztematikus hiba a mérési értékek szórásának értéke alá csökkent, tehát 0,17% alá. A c2-es faktor bevezetése ennél fogva ajánlatos. Ez a pontosság azonban csak állandó buborékméretek esetén érhetı el, ez pedig állandó gázfejlıdési sebesség mellett lehetséges. Mivel utóbbi valódi mérési szituációban természetesen nem várható hosszú távon, ennél valamivel nagyobb pontatlanságra kell számítani. A pontatlanságok fı forrásai minden bizonnyal a kalibrációkor és a méretmeghatározásoknál fellépı, szabad szemmel nem korrigálható alá- és fölébecslések (amennyiben a számítógép idımérése kielégítıen pontosnak tekinthetı). Számítani lehet arra, hogy a meniszkuszi alávagy fölébecslések az eltérı látószög miatt kissé eltérnek különbözı mérető buborékok esetén, ezen eltérések pedig nem korrigálódnak sem c1, sem c2 faktorokkal. Ez valószínőleg igen csekély mérvő hibát ad a méréshez, ugyanakkor felveti esetleges dinamikus korrekciós változók bevezetésének lehetıségét késıbbi módszerfejlesztés keretében. A bioreaktorokon végzett méréseink eredményeit tekintve a kis idıfelbontású gázhozamprofilok (V/1. ábra) alakja könnyen értelmezhetı. A kezdeti gyors gázfejlıdés a nyersiszap könnyen továbbalakítható kis molekulájú szerves anyagainak, például illó zsírsavak gyors bontásának köszönhetı (mely utóbbiak jelenlétérıl a nyersiszapban érzékszervi

75


úton is könnyen meggyızıdhetünk). Ezt az elızı periódus végén felhalmozódott metabolikus enzimek illetve a rátápláláskor bekeveredett oxigén jelenléte is segíti. Utóbbi szerepét alátámasztják késıbbi gázösszetétel-méréseink, melyek szerint CO2 a rátáplálást követı kezdeti idıszakban a metánnál jól láthatóan nagyobb arányban termelıdik. A CO2 idıszakos többlete a fakultatív anaerob közösségalkotók légzési végtermékeként magyarázható. Ezzel párhuzamosan megindul a biopolimerek bontása, ami következı idıszakban folyamatos tápanyag-utánpótlást és stabil gázhozamot biztosít. A biopolimerek fogyásával feltételezésünk szerint megindul a közösség önlebontása, ami a fokozatos, elnyúló hozamcsökkenéshez vezet a periódusok végén. Az efféle hozamprofilok tanulmányozásából információt nyerhetünk a mikrobaközösségek állapotáról, szubsztráthasznosítási hatékonyságáról, éhezéstőrésérıl stb. Célunk a Morell hullámhossz-spektrumok elkészítésével annak megállapítása volt, hogy az észlelt, rövid periódusú hozamingadozás kísérleti vagy mérési mőtermék-e, avagy a közösség élettanában és/vagy a rothasztott iszap fizikokémiai sajátságaiban rejlı belsı oka van. Amennyiben a fluktuációt ébresztı hatás forrása külsı (pl. a termosztát visszacsatolások közötti hıingadozása, szabályosan jelentkezı zavarok a mágneses kevertetésben, nem várt hibák a buborékészlelésben és számításban stb.) az volna várható, hogy a jelenség szinkronizáltan jelentkezik a párhuzamosan mőködı reaktorokban, még inkább pedig, hogy az ingadozás természete nem mutat összefüggést a rátáplálási periódusok idıszakaszaival. A hullámhossz-spektrumok (V/3. ábra) azonban világosan mutatják, hogy minden rátáplálási periódusnak idıben jellegzetesen formált, ugyanakkor egyedi hullámhosszprofilja van, amibıl számunkra az a következtetés adódik, hogy az ingadozásnak a szubsztrátbontási folyamat történetébe ágyazott belsı oka van. Ezt az A1 periódusnak az V/3. ábrán is megfigyelhetı egyidejő hozam- és frekvenciaanomáliái is megerısítik a mérési idı közepe táján. Késıbbi megfigyelésünk, miszerint kevertetés hiányában az ingadozás elmarad – bár a hozam teljes, és alakulása hasonló –, ugyancsak ezt a sejtést támasztja alá, hiszen amíg a gömbölyded állólombikban hatékony kevertetés folyik, a rektortartalmat ez kellıen homogénen tarthatja ahhoz, hogy esetleges periodikus biokémiai folyamatok szinkronizálódhassanak. Ennek hiányában azonban eltérıen szinkronizált mikrohabitatok alakulhatnak ki a reaktorban, melyek parciális hozamingadozásai kioltják egymást. Megjegyezzük, hogy rövid idıszakokra és igen alacsony amplitúdóval ugyan, de olykor kevertetés nélkül is tapasztalunk gyanúsan szabályos hozamingadozásokat. A termosztátciklusok és a kevertetési zavarok szerepét egyidejő hangfelvételek segítségével is sikerült kizárnunk (ekkor a termosztát főtési idıszakaiban hallható pattogó hangot és a mágneses keverık „kotyogását” rögzítettük), bár az, hogy a párhuzamos reaktorok hozamingadozása közel sem szinkronizált, önmagában is kellıen igazolja e lehetıségek kizá-

76


rását. Ellenıriztük a habképzıdés lehetséges szerepét is: nem mőködik-e egy, a termelt gáz által föl-fölemelt majd átszakadva visszaereszkedı szilárd habkéreg egyfajta fújtatóként a gázt adagolva, megfigyelésünk szerint azonban tiszta folyadékfelszín esetén is tapasztalható az oszcilláció. Mivel a pH értéke konstansnak bizonyult ingadozó hozamú idıszakok folyamán, ugyancsak kizárható a lehetséges háttértényezık közül. Összehangolt sejtciklusok szerepe anaerob közegben ilyen rövid ciklusidıvel aligha elképzelhetı. Sajnos egy ilyen rövid periódusú ingadozás okának mélyebb felderítése igen nehéz feladatnak tőnik (különösen további munkahipotézisek hiányában), amelyre a jelen munka keretei között nem nyílt lehetıség. V. A. 2. 3. A módszerfejlesztés lehetıségei A legmagasabb szignifikanciával észlelt legrövidebb periódusidejő hozamingadozás A1 periódus 11:12 - 12:02 idıszakában jelentkezett (V/2. és V/3. ábrák) 12 perc 39 másodperces átlagos periódusidıvel, periódusonként átlag 3 ml gázhozammal, melyen 7-7 buborék osztozott. Egy ilyen ingadozás kimutatásához olyan mérıeszközre van szükség, melyben a jeladó gázmennyiség legfeljebb fele akkora, mint a periódusonkénti hozam. Az átlagos buboréktérfogat (0,44 ml) esetünkben ezt bıven megengedi. Ebben a konstrukcióban 0,88 mlnél kisebb periódusonkénti hozamú ingadozások nem mutathatók ki megbízhatóan. A csövezet geometriájának módosításával, a csıátmérı csökkentésével azonban módszerünk adaptálható nagyobb felbontású mérésekhez is. Mivel a vékonyabb csövekben a buborékok már légzárat képeznek vizes oldatokban, egy határig a felületi feszültség csökkentésével dolgozhatunk (pl. detergensek használatával), azután szükségessé válik a folyadék visszavezetése a buborékok "mögé" egy járulékos vezetéken keresztül, melynek révén egy, a felfelé mozgó buborékok által hajtott köráramlás lehetıvé teszi a buborékok haladását a mérıcsıben. Ilyen elven akár kapillárisokban mozgó apró buborékok is számolhatók és mérhetık, amivel mind a térfogati, mind az idıbeli felbontás növelhetı. Végkövetkeztetésként elmondható, hogy (a) sikerrel megalkottunk egy mérési elvet és eszközt, mellyel párhuzamosan több kis hozamú gázforrás kibocsátása mérhetı anélkül, hogy a gázforrások számának növelésével szorzatosan növekedne az eszközigény. Sikerrel kalibráltuk (b) standard gázforrás ellenében, és kielégítı mérési pontosságot értünk el. A módszer kiválóan mőködött bioreaktorok mőködésének nyomon követésében (c), amennyiben jól használható gázhozamprofilok generálásán túl a hozamok nem várt, rövid periódusidejő ingadozását is feltárta, és jól analizálható adatsorokat generált annak elemzéséhez. Lehetıségeink arányában igazoltuk, hogy a tapasztalt ingadozás oka a mérés tárgyának mőködésében (a gáztermelı közösség mőködésében) inherens módon rejlik, nem pedig kísérleti vagy mérési mőtermékrıl van szó.

77


V. B. Biogáztermelı szennyvíziszap-rothasztók mikrobiológiai vizsgálata V. B. 1. Mezofil és termofil félüzemi rothasztók mikrobiótájának vizsgálata V. B. 1. 1. A mezofil és termofil rothasztókból nyert eredmények Mind T-RF-csúcsok, mind klón-szekvenciák és azok „in silico emésztése” alapján sikerült mintáinkban taxonokat azonosítani a Bacteria és Archaea doménekbıl. Jelentıs eltérés volt tapasztalható a T-RF mintázatban a termofil és mezofil közösség között mindkét domén esetében. Viszonylag kevés észlelt csoport fordult elı egyszerre mindkét hımérsékleten, amint az megfigyelhetı az V/4. és V/5. ábrákon.

M

T

0%

10% 20% 30% 79,4 152,04 193,08 sim. Methanoculleus sp. 550,00

40% 50% 60% 97,22 154,19 228,63 sim. Methanosaeta sp.

70% 80% 90% 100% 107,39 155,38 380,04 sim. Methanosarcina sp.

V/4. ábra. Az Archaea közösség összetétele a T-RFLP-vizsgálat alapján a vizsgált termofil (T) és mezofil (M) reaktorokban. A jelmagyarázatban a számok a fragmenthosszakat jelölik. „sim. Methanoculleus sp.” értsd: similis Methanocullei speciei, azaz (klónszekvencia alapján) Methanoculleus fajhoz hasonlító.

A mezofil Archaea közösség domináns tagja a Methanosaeta fajt képviselte, emellett Methanoculleus és Methanosarcina fajokat azonosítottunk, valamint még tenyésztésbe nem vont Archaea-csoportok képviselıit. Ezzel szemben a termofil Archaea-közösséget majdnem teljes egészében egy Methanosarcina faj alkotta, mely T-RF-mérete alapján ugyanannak mutatkozott, mint a mezofil közösségben talált faj (V/4. ábra). E mellett igen kis mennyiségben egyéb csoportok jelenléte is megmutatkozott. Két klón Methanosaeta conciliinek illetve Methanoculleus bourgensisnek bizonyult 16S-rDNS szekvenciája alapján.

78


M

T

0%

10%

20%

30%

40%

72,5 sim. uc. klón anaerob iszaprothasztóból 81,29 102,75 145,86 150,6 198,7 217,33 sim. Smithella sp. 232,99 sim. Dokdonella sp. 236,97 247,76 sim. CFB sp. 271,05 sim. Acidovorax sp. 519,69

50%

60%

70%

80%

90%

100%

74,16 sim. Nostocoida sp. 82,72 sim. Coprothermobacter sp. 123,47 147,08 158,47 201,66 sim. uc. klón anaerob iszaprothasztóból 224,59 233,57 sim. uc. ak tivált iszapból 239,51 249,16 273,21 520,47 sim. uc. anaerob iszaprothasztóból

V/5. ábra. A Bacteria közösség összetétele a T-RFLP-vizsgálat alapján a vizsgált termofil és mezofil reaktorokban. A jelmagyarázatban a számok a fragmenthosszakat jelölik. „sim. Nostocoida sp.” értsd: similis Nostocoidae speciei, azaz (klónszekvencia alapján) Nostocoida fajhoz hasonlító.

A Bacteria közösségek között is szembetőnı különbség a mezofil közösség termofilnál nagyobb diverzitása (V/5. ábra). A domináns csoportok nagy része mindkét mintában eddig le nem írt, de környezeti klónként már kimutatott taxonok közeli rokonának bizonyult. Mindkét közösségbıl kimutattuk a Cytophaga-Flexibacter-Bacteroides taxoncsoport tagjainak jelenlétét. Néhány esetben sikerült nemzetség-szintő meghatározást végeznünk klónok szekvenciaanalízisével, ahol a klónok a mintabeli csúcsokkal átfedı csúcsokat adtak TRFLP-alapon. Ezek a klónok a Nostocoida, Acidovorax és Smithella nemzetségek tagjainak mutatkoztak a mezofil, és Coprothermobacter- illetve Docdonella-tagoknak a termofil közösségben. Kemotaxonómiai markereink alapján elıször diverzitási és ekvitabilitási (mennyiségi kiegyenlítettséget mutató) indexeket számoltunk Hu és mtsai. (1999a) alapján (V/6. ábra). Látható, hogy zsírsavak alapján nem találunk komoly diverzitásbeli különbséget a kétféle reaktor között (bár a termofil reaktor diverzitása valamivel nagyobb volt; V/6.b. ábra). Szembetőnı ugyanakkor, hogy az azonos mennyiségő mintából származó zsírsavmennyiség mezofil közösségbıl több mint háromszor akkora volt, mint a termofilból kinyerhetı (V/6.a. ábra).

79


0.4

a)

b) 30

c) 0.7

25

0.6

µmol/g szárazanyag

0.35 0.3

0.5

20

0.25

D

0.2

0.4 15

E

0.3

0.15

10

0.2

0.1 5

0.05 0

0.1

0

M

T

0 M

T

M

T

V/6. ábra. a) A zsírsavak összesített mennyisége mintánként. b) „D” diverzitásindex zsírsvak alapján. D=[Σ(fx0,5)]2; ahol fx az x-dik marker fajlagos mennyisége és x=1 n. (D a markerek számára és mennyiségeik kiegyensúlyozottságára egyaránt érzékeny). c) „E” ekvitabilitási index zsírsvak alapján (E csak a markerek mennyiségeinek kiegyensúlyozottságára érzékany). E = D/n ahol n a markerek száma.

Az egyes zsírsavtípusok megoszlásában néhány jellegzetes különbség látható (V/7. ábra). Így például jól látható ciklopropil tartalmú (cy) és a többszörösen telítetlen (PUFA) zsírsavak kisebb arányú jelenléte a termofil reaktorban. A szulfátredukálók indikátorának tekintett C15:1 és C17:1 zsírsavak jelenléte mindkét reaktorban kis arányú. Egy vagy több azonosítatlan zsírsav aránya nagyobb volt a termofil mintában.

M

T

SATFA

MUFA

PUFA

elágazó

C15:1, C17:1

cy

azonosítatlan

V/7. ábra. Zsírsavtípusok arányai a mintákban. SATFA: telített zsírsavak (Saturated fatty acids), elágazó: elágazó szénláncú zsírsavak, PUFA: többszörösen telítetlen zsírsavak (Polyunsaturated fatty acids), 15:1 - 17:1 : C15:1 és C17:1 zsírsavak, jellemzıen szulfátredukáló baktériumok zsírsavai, Cy: ciklopropil-tartalmú zsírsavak, azonosítatlan: azonosítatlan zsírsavak.

80


Kinonok tekintetében az egyetlen informatív jellegzetesség az MK5(H2) egyszeresen telített rövid láncú menakinon igen nagy (valamivel 50 % feletti) arányú dominanciája volt mindkét reaktorban, amely a szulfátredukáló Desulfobulbus nemzetség markere. V. B. 1. 2. A mezofil és termofil rothasztókból nyert eredmények értékelése A közösségekbıl DNS-alapon azonosított baktériumcsoportok egyikénél sem váratlan szennyvíziszaprothasztókban való elıfordulásuk. A mezofil közösség Archaea-csúcsai közt dominanciát élvezı, Methanosaeta-ként azonosított T-RF-et jó eséllyel a klónja alapján Methanosaeta concilii-ként azonosított baktérium adja, melyet több ízben is izoláltak már iszaprothasztókból mint mezofil acetiklasztikus szervezetet (Chouari és mtsai. 2005a). Az ugyaninnen kimutatott Methanoculleus bourgensis-t elıször egy cserzıüzem szennyvizébıl izolálták (Wright és Pimm 2003). Ez a törzs H2-t és CO2-t hasznosító mezofil, kokkusz alakú baktérium, mely ecetsavat is igényel növekedéséhez. Az acetáthozzáférés a mi mintánkból kimutatott szervezet számára sem jelenthet gondot Methanosaeta-dominált közösségünkben. A termofil mintában gyakorlatilag egyeduralkodó Methanosarcina rokont ugyan nem sikerült átfedı csúcsot adó klón segítségével pontosan meghatározni, tudható azonban e nemzetségrıl, hogy tagjai ecetsav mellett H2-t, CO2-t, metanolt és metilamint is hasznosítanak metántermelésük során. Nem kell tehát feltételeznünk a szélsıséges Methanosarcinadominancia ellenére sem, hogy a lebontási anyagcsereutak szélsıségesen eltolódnának az ecetsavtermelıdés irányába (ld. II/3. ábra, 10. old.) termofil hımérsékleten. A Bacteria domén tagjairól elmondható, hogy a meghatározható T-RF-csúcsok termelıi többségükben eddig tenyésztésbe nem vont szervezetekkel mutatnak rokonságot, ezek azonban éppen iszaprothasztókból kerültek elı korábban (Chouari és mtsai. 2005a). Szulfátredukáló baktériumok, melyek jelenlétére kemotaxonómiai eredményeink alapján is számítunk, ezek közt lehetnek (Chouari és mtsai. 2005b). A közelebbrıl is azonosított csoportok leírt rokonai közül a Nostocoida nemzetség némely tagjáról tudható, hogy szennyvíziszap-flokkulumokból leírt fonalas baktériumokról van szó (Schade és mtsai. 2002), s könnyen meglehet, hogy jellegzetesen pelyhes iszapjaink e tulajdonságát éppen ez a szervezet biztosítja fonalaival. Ugyancsak kerültek elı iszaprothasztókból Acidovorax (Schulze és mtsai. 1999) és Dokdonella (Li és mtsai. 2012) fajok is, melyek jelenlétét mi is kimutattuk. A Smithella és Coprothermobacter fajokat szintén több ízben izoláltak már szennyvíziszaprothasztókból. A Smithella fajok szintrofikus szervezetek, filogenetikailag pedig szulfátredukáló csoportokhoz is közel állnak (Schink és Stams 2001). Coprothermobacter fajokat mint mezofil proteolitikus szervezeteket Etchebehere és mtsai. (1998) izoláltak mezofil iszaprothasztóból. Esetünkben a termofil reaktorból került elı rokon szervezetre utaló DNSmarker.

81


Mivel a mintáinkból azonosított nemzetségek fajainak leírásaiban sajnálatosan nem került közlésre a fajra jellemzı zsírsavprofil – kivéve a Dokdonella kunshanensis (Li és mtsai. 2012) leírását, mely szervezetbıl kizárólag elágazó szénláncú zsírsavakat izoláltak [izo-C17 : 1ω9c

(31.6 %), izo-C15 : 0 (12.6 %), izo-C16 : 0 (21.3 %), izo-C17 : 0 (13.1 %) és izoC11:0 3-OH (6.5

%)] –, a nukleinsav-alapú és zsírsavalapú eredményeink megfeleltetı összevetésére nem nyílik lehetıségünk. A zsírsavak és azon belül a különbözı zsírsavtípusok mennyiségi különbségei alapján azonban levonhatunk bizonyos következtetéseket. A zsírsavak összmennyiségének erıs különbsége a két üzemhımérséklet között kétféleképpen is értelmezhetı: vagy eleve kisebb biomassza él egy termofil rothasztó iszapjának egységnyi térfogatában, vagy a termofil közösség észterlipidekkel rendelkezı Bacteria tagjai arányukban visszaszorulnak az éterlipid-membránnal rendelkezı (a zsírsavprofilhoz tehát hozzá nem járuló) Archaea közösségalkotókkal szemben. Elıbbi értelmezés a hasonló volumenő gáztermelıdés fényében kérdéses, a másodikhoz pedig azt kell feltételeznünk, hogy a hidrolízis, acetogenezis, szintróf hidrogéntermelés stb. folyamatait katalizáló Bacteria közösségalkotók termofil körülmények között annyival hatékonyabban végzik dolgukat, hogy majd negyedakkora mennyiségő biomassza elégséges a folyamatok elvégzéséhez. Bármelyiket is fogadjuk el, a zsírsavalapon vizsgálható Bacteria részközösségre nézve ugyanazt jelenti mindkettı: kisebb összes biomasszát. Nem zárható ki természetesen a preparálási mőtermék lehetısége sem, késıbbi eredményeink azonban (mint látni fogjuk) alátámasztják, hogy észlelésünk helytálló, a termofil közösségben csakugyan kevesebb zsírsav található. Az enterális baktériumok markereiként számon tartott ciklopropil-tartalmú zsírsavláncok csökkent mennyisége a termofil reaktorban egybecseng a patogén csíraszámok redukcióját illetı korábban említett eredményekkel (Sahlström 2003, Weiland 2010). A szulfátredukáló baktériumok zsírsavmarkerei (C15:1 és C17:1) alárendelt szerepet mutatnak a zsírsavprofilok alapján, nem úgy, mint az MK5(H2) kinonmarkerük, amely erısen dominálta a kinonprofilokat. Ez arra enged következtetni, hogy bár a légzı (membránkapcsolt elektrontranszport-lánccal rendelkezı) szervezetek között nagy arányban találunk szulfátredukálókat, a Bacteria-populációban mégis alárendelt a szerepük, a csoport nagy része tehát respiratorikus kinonokat nem termelı, fermentáló szervezet. Mivel MK5(H2) kinon eddig jellemzıen csak Desulfobulbus fajokból került elı (Sorokin és mtsai. 2012), gyaníthatjuk e genus jelenlétét mindkét közösségben. A fent említett nemzetség-szintő egyeztetés lehetetlensége a kétféle eredmény között, illetve az erıs taxonómiai információt hordozó kemotaxonómiai markerek mennyiségeinek kicsinysége (és közel egyformasága a két közösségben) meggátol minket a mélyebb következtetések levonásában, ezzel együtt is elmondható azonban, hogy kezdeti közösségfeltárásunk eredményes volt.

82


V. B. 2. Könnyen bontható szubsztrátok adagolásának vizsgálata laboratóriumi modell-rendszerben V. B. 2. 1. Könnyen bontható szubsztrátok adagolásának eredményei A könnyen bontható szubsztrátok adagolása jól látható, karakterisztikus változásokhoz vezetett a gázhozamban, amint azt a V/8. ábra szemlélteti.

V/8. ábra. A három reaktor gázhozamai kétórás bontásban a kísérletsor teljes ideje alatt. A: kontroll, B-C: adagolt szubsztráttal kezelt párhuzamos reaktorok. A fölsı számok a rátáplálási periódusokat jelölik (ld. IV/1.táblázat). A kategóriatengely alatti számok a minták számozását jelölik. Az adatsorok a rátáplálási idıpontokban megszakadnak. A 2. rátáplálási periódus második felében és a 17. periódusban C reaktor hozamának mérése túlhabzás miatt meghiúsult.

A kontrollreaktor gázhozamprofilja alkalomról alkalomra hasonló, míg a kezelt reaktorok egymáshoz hasonló változásokat mutatnak különbözı szubsztrátok rátáplálását követıen. A fehérje adagolása azonnali, markáns gázhozamnövekedést eredményezett, amely gyorsan, még a rátáplálási periódusok végére visszaesett a kontroll-szinte, s a fehérjeadagolás végeztével a hozamok idıbeli karakterisztikája is gyorsan normalizálódott. Ezzel szemben a keményítı adagolása kezdetben határozott hozamcsökkenéssel járt a kontrollreaktorokhoz képest. Ezt követıen azonban erıs hozamnövekedés indult meg jelentıs idıbeli eltolódással a két kezelt reaktor esetében. A C jelő reaktor jóval késıbb reagált a keményítıadagolásra, akkor azonban magasabb maximumot és erısebb meredekséget ért el a hozam. A hozammaximumok különbsége 90 óra volt, a keményítı adagolásának hatása három normál (csak nyersiszappal történı) rátáplálási periódus után múlt el, az összesített gázhozam az érintett periódusok (6.-11.) alatt reaktoronként 6341 ml (A), 7260 ml (B) és 7523 ml (C) volt. Étolaj-adagolás esetén a kezelt reaktorok alacsonyabb, de állandóbb gázprodukciót mutattak, mint a kontroll. Az olajadagolás végeztével a normál periódusokban hozamuk egy ideig meghaladta a kontrollreaktorét. A 18. rátáplálási periódusban a kezelt reaktorok nem kaptak semmilyen rátáplált anyagot, csak a kontroll-reaktor. A többletet eredményezı hatás lecsengését kívántuk megfigyelhetıvé tenni így.

83


A zsírsavanalízis eredményeként 48-féle zsírsavat mutattunk ki a reaktorokból, ami gazdag eubakteriális közösségre utal. Az adagolt nyersiszap jelentısen különbözött a mintáktól mind a zsírsavtípusok számában, mind arányukban. A minták egymástól inkább a zsírsavtípusok mennyiségi arányaiban különböztek, mintsem a zsírsavak elıfordulásában. A leggyakoribb zsírsavak az élıvilágban általánosan elterjedt (így kevés taxonómiai információt hordozó) C16:0, C16:1, C18:0, C18:1 zsírsavak valamint az elágazó láncú anteizo C15:0 és izo C15:0 zsírsavak voltak minden mintában (V/9. ábra) 100% PUFA

90%

80% MUFA

70%

60%

50% elágazó

40% SATFA

30% -OH

20% ciklikus

10%

C1 C3 C5 C6 C8 C10 C11 C13

B1 B3 B5 B6 B8 B10 B11 B13

A0 A1 A3 A5 A6 A8 A10 A11 A13

NyI

0%

C19:0+1 * C18:3 w6c(6,9,12) C18:2 w6,9c/18:0ante C18:1 w5c C15:1 w6c C17:1 w8c C15:1 w5c C17:1 w6c C16:1 w6c / 16:1w7c C16:1w5c C13:1at12-13 C20:1w9c C15:1 w8c C18:1w6c C18:1 w9c C18:1 w7c C16:1 w7c/16:1w6c C18:1 w7c11-methyl C17:1 w9c ISO / 16:010-methyl C17:1 ISOI/ANTEISOB C15:1 G ISO C19:0 ANTEISO C18:0 10-methyl C17:0 ISO C17:0 ANTEISO C16:0 ISO C16:0 ANTEISO C15:0 ISO C15:0 ANTEISO C14:0 ISO C14:0 ANTEISO C13:0 ISO C13:0 ANTEISO C12:0 ISO C16:0Nalcohol C17:0 ISO 3OH C15:0 ISO 3OH C11:0 ISO 3OH C13:0 3OH/15:1iH C11:0 2OH C10:0 3OH C10:0 2OH C9:0 3OH C19:0 w8c cyclo C20:0 C19:0 C18:0 C17:0 C16:0 C14:0 C13:0 C10:0 C9:0

V/9. ábra Zsírsavak a mintákban átlagolt összesített részarányuk szerinti elrendezésben. A zsírsavelnevezések értelmezését ld. a II. 6. 2. fejezetben. A: kontroll, B-C: adagolt szubsztráttal kezelt párhuzamos reaktorok, NyI: nyersiszap. SATFA: telített zsírsavak (saturated fatty acids), elágazó: elágazó szénláncú zsírsavak, PUFA: többszörösen telítetlen zsírsavak (polyunsaturated fatty acids), MUFA: egyszeresen telítetlen zsírsavak (monounsaturated fatty acids), -OH: hidroxiszubsztituált zsírsavak, *: azonosítatlan zsírsavak.

84


V/10. ábra. Zsírsav-mintázat alapján szerkesztett hasonlósági fa (euklideszi távolság) és a maior valamint minor zsírsav-típuskörök megoszlása a mintákban. MUFA: egyszeresen telítetlen zsírsavak (Monounsaturated Fatty Acids), SATFA: telített zsírsavak (Saturated fatty acids), „branched”: elágazó szénláncú zsírsavak, PUFA: többszörösen telítetlen zsírsavak (Polyunsaturated fatty acids), -OH: hidroxiszubsztituált zsírsavak, 15:1 - 17:1 : C15:1 és C17:1 zsírsavak, jellemzıen szulfátredukáló baktériumok zsírsavai, Cy: ciklopropil-tartalmú zsírsavak. A római számok a szövegben tárgyalt klasztereket jelölik. A mennyiségi eloszlások esetén a kategóriaátfedések miatt az értéktengely valójában dimenzió nélküli, a százalékértékek csak a viszonyítás megkönnyítésére szolgálnak.

A minták zsírsav-alapú klaszteranalízise (V/10. ábra) azt mutatja, hogy kontroll-minták mutatják egymással a legnagyobb hasonlóságot (I. klaszter), az olajkezelt minták ezekhez közel kerültek (II. klaszter), illetve további kontroll mintákkal keveredtek, míg a keményítıés fehérjekezelt minták külön csoportosultak (III. klaszter). A fı zsírsavtípusok összesített mennyiségei (V/10. ábra) nem mutatnak jelentıs változást kezelések hatására. Egyedül a szulfátredukáló baktériumokra általánosan jellemzınek tekintett C15:1 és C17:1 zsírsavak vannak a kezelt reaktorokban jellemzıen kisebb mennyiségben, mint a kontrollban. Különbségek inkább akkor tárulnak elénk, ha betekintünk e zsírsavcsoportok belsı struktúrájába. A legnagyobb mennyiségben jelen lévı telített zsírsavak menynyisége nem mutatott jellegzetes változást a kísérlet folyamán, a kisebb telített zsírsavkomponensek mennyiségi ingadozása pedig véletlenszerőnek tőnik. Az egyszeresen telített (MUFA) zsírsavak között ezzel szemben jellegzetes változást mutatott a már említett C15:1 és C17:1 zsírsavak mellett a C18:1ω6c zsírsav is (V/9. és V/11. ábra). Mennyisége jól láthatóan a keményítı- és protein-táplált idıszakokban volt magas, míg a olaj-táplálás esetén és a kontroll-mintákban alacsony volt. A V/10. ábra III. klaszterének az egyik „csoportképzı” jellegzetességét valószínőleg ez adja. C13:1 at 12-13 és C16:1ω5c épp ellenkezı alakulást mutat-

85


tak. További zsírsavak esetén is felismerhetı az adagolt szubsztrát minısége szerint mutatott változás, így a C18:1ω1c fehérjerátáplálás hatására növekedett meg mennyiségében, míg anteizo C15:0 (V/9. ábra) és C16:1ω7c / 16:1ω6c zsírsavak keményítıadagolásra mutattak növekedést.

V/11. ábra. Egyszeresen telített zsírsavak mennyiségi arányváltozásai. A minták a kezelési típusok szerinti elrendezésben láthatók (K: kontroll reaktorok normál nyersiszapos táplálással, P: protein, S: keményítı, O: olaj, n: normál nyersiszapos táplálás). A csillagok és a háromszög jelzés a szövegben is említett zsírsavak azonosítását könnyítik.

Jóllehet a C15:1 és C17:1 zsírsavak (szulfátredukáló baktériumok markerei) aránya csökkent fehérje- és keményítıadagolás hatására (V/10. ábra), a zsírsavcsoport belsı diverzitása megnıtt (V/11. ábra). Például C15:1ω8c zsírsav teljesen hiányzik a kontrollmintákból, és az olajadagolást követıen a kezelt reaktorokból is eltőnt. [A8 minta elkülönülése a hasonlósági fán a C18:0 zsírsav kiugróan magas arányának köszönhetı benne, az A3 minta elkülönülése az I. klasztertıl a C18:1ω7c különösen kicsiny arányának tulajdonítható e mintában (V/10. ábra), az A13 minta esetén ugyanez a C18:0 zsírsavnak köszönhetı (C18:0 2,26%-ot adott, míg átlaga a kontroll mintákban 10.80% volt)]. A DGGE-mintázat alapján készített klaszteranalízis a zsírsavakéhoz hasonló módon egy csoportba rendezte a kontrollmintákat (V/11. ábra, VI. klaszter). A B reaktor esetében jól elkülönülnek a keményítıbontás megindulása elıtti és az azt követıen vett minták (VI. és V. klaszter), s a keményítıbontásra lassabban reagáló C reaktorból a kritikus periódusban vett C5 és C6-os minták is egy közös ágon kerültek távol szomszédaiktól.

86


V/11. ábra. DGGE sávmintázat alapján szerkesztett hasonlósági fa (euklideszi távolság) és a gélkép a fa topológiájának megfelelı elrendezésben. A mintaneveket ld. a IV/1. táblázatban és az V/8. ábrán. A római számok a szövegben tárgyalt klasztereket jelölik. Az ovális keretek a sikeresen szekvenált sávokat jelölik. Az azonosított baktériumcsoportokat megneveztük.

A fa topológiájáért felelıs sávok nagy része kevert szekvenciákból állónak bizonyult, a kivágott sávok 22%-ának (14 sáv) esetében azonban sikerrel járt a szekvenciavizsgálat. Ez minden mintában Bacteroidetes-dominanciát mutat, de a Clostridiales és Thermotogales csoportok tagjai is kimutathatók voltak. A szekvenciák mindegyike nem tenyészthetı baktériumokhoz tartozó környezeti klónokhoz esett közel a szekvencia-adatbázis alapján. A T-RFLP-profilok tanúsága szerint az Archaea csoport kisebb diverzitással képviselteti magát a közösségben (V/12. ábra). Csak a Methanoculleus csoportot sikerült nemzetség-szinten azonosítani. Egy T-RF a Methanosaetaceae család tagjaként került azonosításra, míg két másik csúcsot nem sikerült azonosítani az adatbázis segítségével. Habár a csúcsok elıfordulásában nem mutatkozik különbség, viszonylagos méretik megváltoztak a kezelések hatására, amint az a kezeléseket reprezentáló minták T-RF-profiljain megfigyelhetı (V/12. ábra). A Methanosaetaceae családhoz tartozó T-RF-csúcs nagysága a fehérjeadagolás idején mutatott relatív növekedést.

87


V/12. ábra. Az Archaea T-RFLP elektroforetogramja (mcrA gén; MspI enzim). A mintaneveket ld. a IV/1. táblázatban és az V/8. ábrán. bp: bázispár, E.c.: környezeti klón, Mc: Methanoculleus, Ms: Methanosaetaceae, U.p.: meghatározatlan csúcs. A csúcsokat a németországi kollégák mcrA adatbázisa segítségével azonosítottuk (ld. IV. B. 11. fejezet).

V. B. 2. 2. Könnyen bontható szubsztrátok adagolásának értékelése A gázhozammérés eredménye jól mutatja a mikrobiális közösség élettani válaszát a szubsztrátváltoztatásra. A fehérjeadagolás azonnali gázhozamnövelésébıl arra következtethetünk, hogy a baktériumok alkalmazkodási idıigény nélkül képesek a fehérjék bontására. A közösség alkalmasint eleve fel van készülve fehérjebontásra, hiszen a kommunális szennyvíziszap nagy része bakteriális biomassza, így sok fehérjét tartalmaz. A fehérjék megnövekedett mennyisége extra nitrogénforrást jelentett a mikrobák számára s ennek lehet köszönhetı a heves anyagcserenövekedés. A keményítı késedelmes hozamnövelı hatása látványosan szemlélteti a baktériumok alkalmazkodását a megváltozott életkörülményekhez (jelen esetben a táplálékhoz), valamint hogy ez az alkalmazkodás idıt igényel. Véletlenszerő tényezık is hatással lehetnek rá, hisz másként nehéz magyarázni a két azonosan kezelt reaktor eltérı idejő reakcióját a keményítıadagolásra. A felhalmozódott keményítı késıbbi erıs hozamnövelı hatása nyilvánvaló. A lassú, de kiegyensúlyozott gáztermelés az étolaj adagolása során azt mutatja, hogy a közösségben folyamatosan jelen van a trigliceridek bontásának képessége, ám ez az elıbbiekhez képest lassú folyamat. Érthetı ez, amennyiben figyelembe vesszük, hogy a települési szennyvizekkel folyamatosan érkeznek emulgeált zsiradékok a szennyvíztisztító telepekre, ugyanakkor a kísérleti rátáplálást követıen az olajcseppecskék (a melléadagolt iszappal való erıs összerázás dacára) részben „zsírkarikákká” egyesültek a reaktortartalom felszínén, ami nehezebb hozzáférést engedhetett csak a hidrolizáló szervezetek számára. Ennek köszönhetıen az el nem bontott zsiradék az olaj-

88


adagolás befejeztével egy ideig még tovább emelhette a hozamot a normál periódusban kapott 100 g nyersiszap biztosította (kontrollnak megfelelı) hozamon felül. Általánosságban elmondható, hogy a minták elsısorban a zsírsavak arányában különböztek, nem elsısorban a zsírsavak elıfordulásában vagy számában. A nyersiszap különbözısége a mintáktól jól látható a zsírsavak számában és arányában, ami mutatja, hogy a mikrobióta – legenyhébben fogalmazva – módosítja a bevitt anyag markerkészletét, amit sejthetünk a lipidbontás (gázhozamban megmutatkozó) perzisztens képességébıl is. De abból a megfontolásból kiindulva is, hogy a nagyarányú bakteriális biomasszát tartalmazó kommunális szennyvíziszap bontására adaptálódott bakteriális közösségnek értelemszerően maguk a külsı eredető bakteriális markermolekulák is alapvetı szubsztrátját jelentik. Az elhalt sejtek foszfolipidtartalmának rövid életidejét a közegben továbbá egyöntetően állítja a vonatkozó szakirodalom (Córdova-Kreyols és mtsai. 2006). Mivel amúgy sem volna lehetséges egy bizonyos marker mennyiségének felbontása arra a zavaró hányadra, amely a szubsztráttal jutva a rendszerbe eddig elkerülte a lebontást, illetve arra a kemotaxonómiailag releváns hányadra, amelyet a közösség maga épített fel, a szubsztrát kemotaxonómiai vizsgálata legfeljebb akkor szolgálhat információval, ha egyazon szubsztrátdózis elbontásának folyamatát monitorozzuk. A miénkhez hasonló kísérleti elrendezés esetén legjobb, ha ráhagyatkozva az irodalmi tapasztalatokra nem növeljük feleslegesen mintáink számát. Ugyanakkor természetesen érdemes a közösség mintázását úgy idızíteni, hogy idıben minél távolabb essék a megelızı rátáplálástól (ahogyan mi is tettük). Közvetlenül a soron következı rátáplálás elıtt véve a mintát lesz legkisebb az esélye annak, hogy számottevı mennyiségő külsı eredető markermolekula szennyezze mintánkat. A kis taxonómiai értékő zsírsavak nagy mennyisége mellett az elemzés kimutatta jellegzetes, bizonyos taxonómiaicsoportokra jellemzı zsírsavak jelenlétét is. A nem hidroxiszubsztituált, elágazó láncú zsírsavak (különösen a 15 és 17 C-atomos telített molekulák) a Bacteroidetes csoport legáltalánosabb markerei (Mayberry és mtsai. 1982). A Bacteroidetes

csoport

számos

munkában

bizonyult

biogáztermelı

rendszerek

legabundánsabb közösségalkotójának (Ariesyady és mtsai. 2007, Kampmann és mtsai. 2012, Lee és mtsai. 2012). Mintáinkban az elágazó láncú zsírsavak nem mutatnak számottevı mennyiségi ingadozásokat. Mindez összhangban áll Lechevalier és Lechevalier közlésével

(1988),

miszerint

a

Bacteroidetes-dominálta

közösségek

elég

stabilak

szubsztrátváltozások hatásaival szemben. Jóllehet a fı zsírsavak összességükben nem mutatnak látványos ingadozást, a statisztikai elemzés képes volt kimutatni összefüggéseket. Eredményeink szerint a kontroll és az olajkezelt közösségek együtt csoportosultak a hasonlósági fán, ami arra utal, hogy az étolaj jelenléte nem állítja váratlan kihívás elé a rezidens közösséget (és ezt a gázhozameredmények is alátámasztják). Ez megerısíti feltevésünket,

89


mely szerint a trigliceridek általános összetevıi a kommunális szennyvíziszapnak, így a közösség hozzájuk szokhatott, ha nem is feltétlenül bomlanak könnyen. Az egyszeresen telített zsírsavak (MUFA) arányaiban mutatkozó eltolódások közösségösszetétel-változásra utalnak, de ezen molekulák alacsony információs értéke miatt csak annyit mondhatunk, hogy a változások valószínőleg a közösség Gram-negatív tagjait érintették, mivel a MUFA molekulákat általános Gram-negatív markerekként tartják számon, míg az elágazó láncú zsírsavak Gram-pozitív baktériumokat jeleznek. A C15:1 és C17:1 zsírsavak arányváltozásai megengedik a következtetést, hogy a szubsztrátváltások zavaró hatása jelentısen befolyásolja a szulfátredukáló baktériumok mőködését, mivel e markerek összmennyisége csökkent, ellenben új altípus (C15:1 ω8c) is megjelent közöttük. Ahogy a zsírsavak, úgy a DGGE vizsgálat eredményei is inkább enyhe abundanciaingadozásokra utalnak mintsem radikális átrendezıdést jeleznének. Míg a kontrollminták a hasonlósági fán együvé csoportosulnak, addig a kezelt reaktorokból származók elválnak egymástól, és fıként a keményítıbontás megindulása tekinthetı vízválasztónak. A keményítı okozta, gázhozamgörbék által is megmutatott adaptációs kényszer fényében nem meglepı, hogy éppen ekkor produkáltak a közösségek kimutatható összetétel-ingadozást. Számos munka eredménye szerint a Clostridia (Wirth és mtsai. 2012), a Bacteroidetes (Kampmann és mtsai. 2012, Lee és mtsai. 2012) csoportok vagy mindkettı együtt (Schlüter és mtsai. 2008, Shigematsu és mtsai. 2009) gyakorta adják biogáztermelı közösségek domináns hidrolizáló tagjait. Kampmann és mtsai. (2012) szerint továbbá a Bacteroidetes és Firmicutes közösségek gyakran meglepı stabilitásról tesznek tanúságot ilyen rendszerekben. Mások (Fernandez és mtsai. 2000) ugyanakkor pusztán glükózadagolással provokáltak közösségösszetétel-változást biogázreaktorokban (de nem a Bacteroidetes-dominálta közösségekben). Az irodalmi tapasztalatokkal összhangban sikerült kimutatnunk ezeket a baktériumcsoportokat saját mintáinkból is. Kilenc sáv bizonyult tenyésztésbe nem vont Bacteroidetes klónhoz igen hasonlatosnak, egy bizonyult tenyésztésbe nem vont Clostridia klón közeli rokonának, egy a Thermofragaceae család tagjának mutatkozott hasonló alapon, míg három a Bacteria divízió eddig le nem írt tagjával mutat rokonságot. A Clostridiasávval egy magasságban fıleg az olajkezelt mintákban (B10-11, C10-11; V/11. ábra, 87. old.) találunk sávokat, de ez a tény szemlátomást nem befolyásolja a fa topológiáját olyan mértékben, hogy ezek a minták együvé csoportosuljanak. Az Archaea csoportból mindössze a Methanoculleus T-RF-et sikerült nemzetség szinten azonosítani a használt adatbázis alapján. Az acetiklasztikus Methanosaetaceae család tagja minden bizonnyal alárendeltebb szerepet játszanak a közösségben, de kétségtelenül jelen vannak két másik, nem azonosított Archaeonnal együtt (V/12. ábra, 88. old.). Látható, hogy az Archaea közösségalkotókat csak kevéssé befolyásolta a szubsztrát természete, ami érthe-

90


tı, hiszen mint metanogének elsısorban az eubakteriális lebontási folyamatok végtermékeitıl (CO2, H2, acetát) függenek. Ezek megoszlása azonban természetesen befolyásolhatja a különbözı anyagcseréjő metanogének abundanciaarányait (Lee és mtsai. 2009), ahogy itt is elképzelhetı, hogy a szubsztrát fehérjearányának növekedése a megszokottnál jobban az acetogenezis irányába terelte az anyagcsereutakat, így az acetiklasztikus csoport felszaporodhatott. Mindent egybevetve szennyvíziszaprothasztó laboratóriumi modellrendszerünk mezofil közösségét széles szubsztráthasznosítási spektrummal rendelkezı, robosztus, Bakteroidetes dominanciájú közösségként írhatjuk le, mely kényelmes alanya lehet számos szubsztrátadagolási kísérletnek, amelyek kiváló és gyors nyomon követését teszi lehetıvé a gázhozammérés. A közösségösszetétel mélyebb feltárását a DGGE nem teljes felbontása hiúsította meg egyfelıl, másrészt – mint késıbb látni fogjuk – éppen a közösség robosztus volta az, amely megfoszt bennünket a további információnyerés lehetıségétıl, hiszen markáns idıbeli változások híján alig mutatkozik összefüggés a különbözı markercsoportok tagjainak idıbeli viselkedése között.

V. B. 3. Mezofilról termofil hımérsékletre való felfőtés mikrobiológiai hatásának vizsgálata félüzemi reaktorokon, s a markerek korrelációs megfeleltetési stratégiájának kidolgozása V. B. 3. 1. Mezofilról termofil hımérsékletre való felfőtés eredményei

m3/m3

6

4/2 4/4 4/6 4/3 4/5

5

4/7

4/8

6/5 6/4 6/3 6/2

hımérséklet [°C]

mg/l 4 3

gázhozam [m3/m3]

4/1

2

60

6/8

6/7

°C

6/6

50 40

6/1

30 20

illósav [mg/l]

1

10

0

0 3.

2.

1.

7.

. 15

.

.

7.

7.

.

8.

. 26

7.

15

26

6.

.1

.2

.7

.1

6. 1. 7. .1 12 7. .2 11 . .7 11 8. .1 10

3.

2.

1.

1.

12

11

11

10

V/13. ábra. A hımérséklet, az illósav-tartalom és a gázhozam alakulása a kísérlet során a mintavételeink idıpontjában. A számok a görbék mentén a mintázott reaktorra és az minták sorszámára utalnak.

A szennyvíztelepen mért abiotikus tényezık tükrében végigkövethetı a két párhuzamos kísérlet (hirtelen és fokozatos felfőtés) története. A V/13. ábra) részén láthatók a hımérsék-

91


let-értékek a mintavételi idıpontokban. A hımérséklet volt a mesterségesen változtatott független hatótényezı, melynek az üzemi és mikrobiológiai paraméterekre gyakorolt hatását vizsgáltuk. A 4-es számú reaktor esetében a hımérsékletemelés hirtelen, egy lépésben történt mezofilról termofil értékre (37 °C-os átlaghımérsékletrıl 55 °C-os átlagra; az V/13. ábrán is látható kis hımérséklet-ingadozások a telepi főtırendszer kis mőködésbeli bizonytalanságainak tulajdoníthatók). A 6-os számú reaktor esetében a felfőtés egy három hetes intervallumban, egyenletes hımérsékletnöveléssel történt. A V/13. ábrán az illósavtartalmat és a gázhozamot is feltüntettük. Jól látható a hıstressz idıszakára esı növekvı illósavtartalom és csökkent gázhozam. A kísérlet végére mindkét reaktor jelentıs hozamot produkált. A pH az illósavtartalommal ellentétesen, kis kitérésekkel mutatott csak változást 6,4 és 7,7-es szélsıértékek között (ezért nem tüntettük fel az ábrán), ám míg a 4-es reaktorban a kísérlet idıszakában 6,8 volt az átlag-pH, addig a 6-osban 7,4 a tapasztalt illósavtartalommal összhangban.

a)

25 20 15 10 5 0 4/1 4/2 4/3 4/4 4/5 4/6 4/7 4/8 D MK

b)

6/1 6/2 6/3 6/4 6/5 6/6 6/7 6/8 DQ

40 30 20 10 0 4/1 4/2 4/3 4/4 4/5 4/6 4/7 4/8 6/1 6/2 6/3 6/4 6/5 6/6 6/7 6/8 D Zsírsav

c)

30 25 20 15 10 5 0 4/1 4/2 4/3 4/4 4/5 4/6 4/7 4/8 D Bsu

6/1 6/2 6/3 6/4 6/5 6/6 6/7 6/8 D Alu

V/14. ábra. A markerek mintánkénti diverzitása. a) „D” diverzitásindex mena- (MK) és ubikinonok (Q) alapján. b) „D” diverzitásindex foszfolipid-zsírsavak alapján. c) „D” diverzitásindex T-RF-ek alapján hasítóenzimek szerint bontva. D=[Σ(fx0,5)]2; ahol fx az x-dik marker fajlagos mennyisége a markercsoportban és x=1 n. n a markerek száma a markercsoportban.

A mikrobiális közösséget jellemzı markerek összetételváltozását az azt egyetlen változóba sőrítı markerdiverzitásindex (Hu és mtsai. 1999a) segítségével tekintettük át elıször (V/14. ábra). A DNS-markerek mindkét reaktorban diverzitásingadozást mutatnak a hımér-

92


sékletváltást követı illetve a hımérsékletemelés alatti idıszakban, majd a termofil közösség stabilizálódásával a markerdiverzitás lecsökken. Ugyanez a tendencia mutatkozik meg enyhén a kinondiverzitásban fokozatos felfőtés esetén, míg a hirtelen hımérsékletváltásnál ez nem észlelhetı. A zsírsavakból számolt diverzitásértékek nem mutatnak tendenciózus változást a hımérskletemeléssel. A domináns DNS-markerek (T-RF-ek) Bacteria termelıihez a 16S rDNS klónkönyvtár szkevenciavizsgálata és a klónok in silico emésztése alapján több esetben sikerült taxonómiai információt rendelnünk. A V/2. táblázat foglalja össze a klónokat a szekvenciájuk alapján legközelebbi rokonnak mutatkozó fajokkal valamint a T-RFLP vizsgálatban használt Alu és Bsu enzimek hasítóhelyei szerint adódó in silico T-RF-méreteikkel. A klónok a Chloroflexi, Betaproteobacteria, Clostridia, Synergistetes, Thermotogae és Bacteriodetes phylumokba sorolhatók. A klónszekvenciákhoz a táblázatban bemutatott leírt fajokon kívül számos igen hasonló szekvencia adódódott az adatbázis alapján: eddig nem tenyésztett környezeti klónok szekvenciái. Többségük anaerob iszapokból, biofilmekbıl vagy biogázreaktorokból került elı. Azonosított klónok száma (db)

AluI (bp)

Bsu (bp)

Név és Phylum

Hasonlóság %

11*

75

305

Defluviitoga tunisiensis FR850164 (Thermotogae)

99

83

238

Coprothermobacter CP001145 (Clostridia)

98

1

71

-

4

235

220

1

75

279

13

245

264

1

-

273

1

239

-

4**

In silico hasítási Legközelebbi típustörzs hely

proteolyticus

Flavobacterium filum DQ372981 (Bacteroidetes) Levilinea saccharolytica AB109439 (Chloroflexi) Aminobacterium colombiense CP001997 (Synergistetes) Longilinea arvoryzae AB243673 (Chloroflexi) Ethanoligenens harbinense ADJQ01000048 (Clostridia) Paludibacter propionicigenes CP002345 (Bacteroidetes)

94 91 90 88 85 83

Amoebophilus asiaticus CP001102 79 (Bacteroidetes) * 9 klón 99%-os, egy 95%-os, további egy pedig 100%-os hasonlósággal ** 2 klón 98%-os, egy 89%-os, további egy pedig 94%-os hasonlósággal 1

249

234

V/2. táblázat. A közösségek 16S rDNS klónkönyvtárának klónjaihoz a szekvenciájuk alapján legközelebbi rokonnak mutatkozó fajok valamint a T-RFLP vizsgálatban is használt Alu és Bsu enzimek hasítóhelyei szerint adódó in silico T-RF-méreteik.

93


A T-RF-markerek mennyiségi megoszlását mutató V/15. és V/16. ábrán ugyancsak jeleztük a legközelebbi hasonlóságot mutató fajt a talált klónoknak megfeleltethetı T-RFeknél. Az V/2. táblázatban feltőntetett in silico T-RF méretek egy vagy két bázispár eltérést mutathatnak a nekik megfeleltetett közösségi T-RF-ek méretétıl a T-RF-drift jelensége miatt (Kaplan és Kitts 2003), amely abból ered, hogy a kapilláris-gélelektroforézis során az azonos hosszúságú DNS-fragmentek eltérı purin- és pirimidinbázis-arányaik szerint eltérı sebességgel

haladhatnak,

így

valós

hosszuktól

néhány

bázispárnyival

eltérı

fragmenthosszal mutatkoznak meg. [Az ebbıl adódó bizonytalanság egyértelmően tisztázható lenne a klónozott gének tényleges (nem in silico) T-RFLP elemzésével, erre azonban a dolgozat megírásáig nem volt lehetıség.] További bizonytalansági tényezıként elıfordul, hogy egyazon T-RF különbözı mintákból kimutatva egy-két bázispárnyi eltéréssel érkezik a kapilláris végén a detektorhoz, így elıfordul, hogy észlelt méretük miatt adattáblázatainkban szomszédos markerkategóriába „csúsznak át” (pl. a mintasor egy szakaszán Alu75 TRF helyett rendre Alu76-ot találunk), miközben – különösen domináns csúcsok esetén – alig valószínő, hogy hirtelen közösségátrendezıdés eredményét látjuk. Ilyen esetekben, ahol ezt legjobb szakmai belátásunk szerint megtehettünk, összevontuk a kategóriákat, így kerültek tehát a markereink közé olyanok, mint az Alu75-76 T-RF. Az ábrákon jól látható a markermennyiségek ingadozása, és hogy az érett termofil közösség jellegzetesen más összetételt mutat, mint a mezofil illetve átmeneti közösségek. Több T-RF esetében jól megfigyelhetı a fokozatos kiszorulás a közösségi mintázatból, bizonyos esetekben pedig fokozatos feldúsulást látunk. Így például feldúsultak a Defluviitoga tunisiensis, Coprothermobacter proteolyticus, Flavobacterium filum és Amoebophilus asiaticus fajokkal rokonítható T-RFek, míg kiszorultak a Levilinea saccharolytica, Longilinea arvoryzae, Paludibacter propionicigenes és Ethanoligenens harbinense fajokkal rokoníthatók.

94


60% 50% 40%

Alu072-73 sim. F.f.

30% 20% 10% 0% 4/1

4/2

Alu049 Alu072-73 sim. F.f. Alu10102 Alu147 Alu175 Alu205 Alu222 Alu236-37 sim. L.s. Alu248 sim. A.a. Alu271 Alu519-21 Alu578-81

4/3

4/4

4/5

4/6

4/7

4/8

Alu053 Alu075-76 sim. D.t. / A.c. Alu10405 Alu149 Alu193 Alu209 Alu225 Alu240 sim. P.p. Alu252-53 Alu494-95 Alu523

Alu075-76 sim. D.t. / A.c.

Alu243 sim. L.a.

70%

Alu240 sim. P.p.

Alu083 sim. C.p.

80%

Alu236-37 sim. L.s.

90%

Alu243 sim. L.a.

Alu248 sim. A.a.

100%

6/1

6/2

6/3

6/4

Alu062 Alu083 sim. C.p. Alu132 Alu150 Alu197 Alu210 Alu233 Alu242 Alu255 Alu497 Alu526

6/5

6/6

6/7

6/8

Alu066 Alu090 Alu138 Alu159 Alu202 Alu215 Alu234 Alu243 sim. L.a. Alu257 Alu504 Alu536

V/15. ábra. A Bacteria közösség markerösszetétele Alu enzimes emésztéssel végzett T-RFLPvizsgálat alapján a vizsgált mintákban. „sim. A.a.” értsd: similis Amoebophili asiatici, azaz (klónszekvencia alapján) Amoebophilus asiaticushoz hasonlító. További rövidítések: F.f.: Flavobacterium filum, L.s.: Levilinea saccharolytica, A.c.: Aminobacterium colombiense, P.p.: Paludibacter propionicigenes, D.t.: Defluviitogae tunisiensis, C.p.: Coprothermobacter proteolyticus, L.a.: Longilinea arvoryzae. A sávok kitöltési mintázata a mindkét enzimmel megjelenı T-RF-ek esetében azonos a V/16. ábrán látható megfelelı sávokéval.

95


100% 90%

Bsu238 sim. C.p. Bsu304-05 sim. D.t.

80%

Bsu235 sim. A.a.

30% 20% 10% 0% 4/1

4/2

4/3

4/4

Bsu052-54 Bsu172 Bsu195 Bsu203 Bsu228 Bsu235 sim. A.a. Bsu252 Bsu270 Bsu285 Bsu304-05 sim. D.t. Bsu325 Bsu406-08 Bsu494

4/5

4/6

4/7

4/8

Bsu061 Bsu175 Bsu197-99 Bsu214 Bsu230 Bsu236 Bsu255 Bsu272-73 sim. E.h. Bsu287 Bsu316 Bsu332 Bsu411 Bsu504-05

6/1

6/2

6/3

Bsu263 sim. L.a.

40%

Bsu219-20 sim. L.s.

50%

Bsu272-73 sim. E.h.

Bsu280 sim. A.c.

Bsu263 sim. L.a.

60%

Bsu238 sim. C.p.

70%

6/4

Bsu075 Bsu182 Bsu201 Bsu219-20 sim. L.s. Bsu231 Bsu238 sim. C.p. Bsu259 Bsu280 sim. A.c. Bsu294 Bsu318 Bsu339-40 Bsu421 Bsu519-22

6/5

6/6

6/7

6/8

Bsu076 Bsu185 Bsu202 Bsu226 Bsu234 Bsu251 Bsu263 sim. L.a. Bsu282 Bsu297 Bsu319 Bsu375 Bsu442 Bsu578-81

V/16. ábra. A Bacteria közösség markerösszetétele Bsu enzimes emésztéssel végzett T-RFLPvizsgálat alapján a vizsgált mintákban. „sim. A.a.” értsd: similis Amoebophili asiatici, azaz (klónszekvencia alapján) Amoebophilus asiaticushoz hasonlító. További rövidítések: L.s.: Levilinea saccharolytica, D.t.: Defluviitogae tunisiensis, A.c.: Aminobacterium colombiense, E.h.: Ethanoligenens harbinense, C.p.: Coprothermobacter proteolyticus, L.a.: Longilinea arvoryzae. A sávok kitöltési mintázata a mindkét enzimmel megjelenı T-RF-ek esetében azonos a V/15. ábrán látható megfelelı sávokéval.

A szukcessziós folyamat kimutatására fıkomponens-analízist (PCA) alkalmaztunk (V/17. ábra). Mindkét reaktor esetében jól látható a szukcessziós folyamat végbemenetele, ahogy a két hımérsékletemelési stratégia szerint adódó jellegzetes különbség is. Kiemelendı a 4/4-es minta távolsága az összes többitıl.

96


4/5 4/6

4/7

Component 2

19,559%

6/8

4/4

4/2

6/7 4/8

4/3 6/5

6/6

6/3 6/2

6/4

6/1

4/1

Component 1

59,752%

V/17. ábra. A T-RFLP-vizsgálat eredménye alapján készült fıkomponens-analízis (Alu és Bsu enzimes emésztés együtt, biomasszamennyiséggel korrigált adatokból, kovariancia szerint). A kék kör a mezofil kiindulási állapotot, a piros a kísérlet végi termofil állapotot jelöli. A barna nyilak a 4-es reaktor, a zöldek a 6-os reaktor közösségének szukcessziós útját követik.

A közösségi zsírsavmintázat típuskategóriák szerinti eloszlása (V/18. ábra) markáns átrendezıdést nem mutat felfőtés hatására, ám a többszörösen telített zsírsavak (PUFA) következetes és gyors együttnövekedése a hımérséklettel, és a szulfátredukálók (SRB) zsírsavainak idıleges feldúsulása a 4-es közösség termofil átrendezıdése során trendszerőnek látszik, ahogy az érett termofil közösségekben a ciklopropil-győrős oldalláncú zsírsavak nagyobb aránya is. A MIDI-rendszer által nem azonosított zsírsavak gyakoribb elıfordulása figyelhetı meg továbbá termofil körülmények között.

97


4/1 4/2 4/3 4/4 4/5 4/6 4/7 4/8 6/1 6/2 6/3 6/4 6/5 6/6 6/7 6/8 SATFA

MUFA

PUFA

-OH

Cy

elágazó

C15:1, C17:1

azonosítatlan

V/18. ábra. A közösségi zsírsavmintázat típuskategóriák szerinti eloszlása a mintákban. SATFA: telített zsírsavak (saturated fatty acids), elágazó: elágazó szénláncú zsírsavak, MUFA: egyszeresen telítetlen zsírsavak (monounsaturated fatty acids), PUFA: többszörösen telítetlen zsírsavak (poliunsaturated fatty acids), -OH: hidroxiszubsztituált zsírsavak. 15:1 17:1 : C15:1 és C17:1 zsírsavak, jellemzıen szulfátredukáló baktériumok zsírsavai, Cy: ciklopropil-tartalmú zsírsavak, azonosítatlan: azonosítatlan zsírsavak. Az értéktengely a markerkategória-átfedések miatt dimenziónélküli.

100% azonosítatlan

90% PUFA

80% 70%

MUFA

60% 50% 40%

elágazó

30%

SATFA -OH

20%

ciklikus

10%

1

3

5

7

2

4

6

8

4/

4/

4/

4/

6/

6/

6/

6/

0%

* 11:20 unid * 9:00 unid * 14:959 unid 7:90 *unid 13:565 *unid 5:20 *unid * 4:00 unid * 3:40 unid C18:2 ? 6,9c C18:3 ? 6c(6,9,12) C16:1? 7c C13:1 AT 12-13 C20:1 ? 9c C18:1? 7c C18:1? 9c C17:1? 6c C17:1? 8c C15:1 ? 6c C16:1? 5c ISO C17:1? 9c / 16:0 10 methyl C15:1 ISO G 11methyl C18:1? 7c C15:1 ISO I C17:0 ANTEISO C17:0 ISO C16:0 ISO C15:0 ANTEISO C15:0 ISO C14:0 ISO C13:0 ANTEISO C13:0 ISO C12:0 ISO C17:0 ISO 3OH C11:0 ISO 3OH C15:0 3OH C19:0 CYCLO ? 8c C20:0 C18:0 C17:0 C16:0 C15:0 C14:0 C13:0 C12:0

V19. ábra. A foszfolipid-zsírsavak mennyiségi eloszlása a mintákban. SATFA: telített zsírsavak (saturated fatty acids), elágazó: elágazó szénláncú zsírsavak, PUFA: többszörösen telítetlen zsírsavak (polyunsaturated fatty acids), MUFA: egyszeresen telítetlen zsírsavak (monounsaturated fatty acids), -OH: hidroxiszubsztituált zsírsavak, *: azonosítatlan zsírsavak.

Egyenként tekintve a zsírsavak mennyiségi alakulását (V/19. ábra) ugyancsak szolidnak tőnik az átrendezıdés a T-RF-ek mennyiségi átrendezıdéséhez viszonyítva. Ennek ellenére,

98


ha fıkomponens-analízist végzünk a zsírsavmennyiségek alapján, (V/20. ábra), láthatóan igen hasonló szukcessziós történetet kapunk vissza, mint a DNS-markerek hasonló elemzésekor. A két reaktor kiindulási és végállapotának közelsége és a 4/4-es közösség többitıl való eltávolodása itt is megfigyelhetı.

4/1

Component 2

11.666%

6/1

6/2

6/3 6/4

.. . 6/7

6/6 6/5

.

6/8

4/6 4/7 4/4

4/8

4/5 4/3 4/2

Component 1

85,656%

V/20. ábra. Zsírsavösszetétel alapján készült fıkomponens-analízis eredménye (kovariancia szerint). A kék kör a mezofil kiindulási állapotot, a piros a kísérlet végi termofil állapotot jelöli. A barna nyilak a 4-es reaktor, a zöldek a 6-os reaktor közösségének szukcessziós útját követik.

Trendszerő változás a kisebb részarányú zsírsavak némelyike esetén figyelhetı meg inkább (V/21. ábra), ezek közt azonban olykor következetes együttmozgás is elıfordul, így például az izo C13:0 és anteizo C13:0, az izo C17:0 és anteizo C17:0 párok között.

99


C13:0 ISO C13:0 ANTEISO C19:0 CYCLO ω8c C17:0 ISO 3OH C17:0 ISO

0,07

C17:0 ANTEISO

0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0

4/1 4/2 4/3 4/4 4/5 4/6 4/7 4/8

fajlagos mennyiség

0,08

C11:0 ISO 3OH C12:0 C20:1 ω9c C18:3 ω6c(6,9,12)

6/1 6/2 6/3 6/4 6/5 6/6 6/7 6/8

V/21. ábra. Trendszerő mennyiségi változást mutató zsírsavak a felfőtéses kísérlet során.

Hasonló, ám a mintasorok szabad szemmel való áttekintése során nehezen szembeötlı zsírsav-együttmozgások feltárására elvégeztük a zsírsav-markerek korrelációs klaszteranalízisét (V/22. ábra), amely további együttmozgásokra derített fényt. A fán az erıs korrelációs hasonlóság idısori elemzésben erıs idıbeli együttmozgásra utal. 0,9-nél nagyobb korrelációs hasonlóságot mutatnak nem csak a fentebb említett zsírsavak, hanem más párok és hármasok is. Megfigyelhetı az is, hogy a zsírsavak tágabb együttmozgásaik alapján is csoportosulnak.

100


* *

* *

*

V/22. ábra. A Zsírsavmarkerek idıbeli Pearson-féle korrelációja alapján (paired group módszerrel, abszulút mennyiségi adatok alapján) szerkesztett hasonlósági fa. Piros keretek emelik ki az erıs együttmozgást (hasonlóság > 0,9) mutató zsírsavmarker-párokat illetve – hármasokat. *: azonosítatlan zsírsavak.

A respiratórikus menakinonok relatív mennyiségi viszonyait tekintve (V/23. ábra) szembetőnı a Desulfobulbus fajokból leírt MK5(H2) kinon dominanciája, valamint a viszonylag csekély mérvő átrendezıdés a közösségi mintázatban. Ezzel ellentétben az ubikinonokra tekintve (V/24. ábra) határozott változás látható, amely leginkább a Q4-es kinon termofil irányú feldúsulásában és a Q8, Q9 és Q10 kinonok párhuzamos visszaszorulásában érhetı tetten. Az ubikinon-diagramon szembeötlı nagyszámú azonosítatlan marker egy része valószínőleg részlegesen telített izoprénláncú ubikinonoknak felel meg, melyek kimutatatására azonban nem rendelkeztünk standardekkel vagy autentikus mikroba-törzsekkel.

101

V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK 100% MK11(H4) MK10(H6) MK11(H2) MK9(H6)+1 * MK10(H2)-1 * MK9(H4) MK8(H6)-1 * MK9(H2) MK8(H4)-1 * MK9 MK6(H8)-1 * MK7(H4) MK8+1 * MK6(H6)-1 * MK5(H8) MK6(H4) MK5(H6) MK6(H2) MK4(H8) MK6 MK4(H6) MK5(H2) MK4(H4) MK5 MK4(H2) MK2(H8) * MK3(H4) MK4

90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 4/1 4/2 4/3 4/4 4/5 4/6 4/7 4/8

6/1 6/2 6/3 6/4 6/5 6/6 6/7 6/8

V/23. ábra. A menakinonok mennyiségi eloszlása a mintákban. *: azonosítatlan marker (a retenciós idejében legközelebb esı markerrıl és attól számított elıfordulási sorszámával elnevezve).

102


100%

Q12+4 * Q11+1 * Q11-4 * Q10+2 * Q10 Q10-2 * Q9+3 * Q9+2 * Q9+1 * Q9 Q9-1 * Q9-2 * Q8+2 * Q8 Q8-1 * Q7+2 * Q7+1 * Q7 Q7-1 * Q6+2 * Q6+1 * Q6 Q6-1 * Q5+1 * Q5 Q5-1 * Q4

90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 4/1 4/2 4/3 4/4 4/5 4/6 4/7 4/8

6/1 6/2 6/3 6/4 6/5 6/6 6/7 6/8

V/24. ábra. Az ubikinonok mennyiségi eloszlása a mintákban. *: azonosítatlan marker (a retenciós idejében legközelebb esı markerrıl és attól számított elıfordulási sorszámával elnevezve). A kinonok együttes mennyiségi mozgásai alapján végzett fıkomponens-analízis eredménye a V/25. ábrán látható. A szukcessziós mozgás és a 4/4-es minta kiugrása a másik két marker esetéhez hasonlóan feltőnı, jóllehet a 6-os közösség mintasorának két végpontja kinonok tekintetében legalább annyira távol esı a többitıl.

103


6/1

Component 2

16.85%

6/8

4/2 6/2

4/1

6/3

6/6 6/4

4/6

4/8

4/5 6/7

4/7

6/5 4/3

4/4

Component 1

64.505%

V/25. ábra. Mena- és ubikinonok mennyiségei alapján készült fıkomponens-analízis eredménye (kovariancia szerint). A kék kör a mezofil kiindulási állapotot, a piros a kísérlet végi termofil állapotot jelöli. A barna nyilak a 4-es reaktor, a zöldek a 6-os reaktor közösségének szukcessziós útját követik.

Fıkomponens-analízist végeztünk a három fı markertípus egyesített adatsorai alapján is (V/26. ábra). Ez vizsgálatunk eredményeinek minden adatát figyelembe veszi. Hogy enyhítsük a mérési adatok természetének különbségébıl adódó abszolútérték-eltérések torzító hatását, az adatok természetes alapú logaritmusát vettük, s ennek alapján készült a fıkomponens-elemzés. A két fı komponens kovariancia-képviselı erejének csökkenése (a külön végzett elemzésekhez viszonyítva) ennek az adathomogenizálásnak tulajdonítható. A szukcessziós folyamat egyértelmően kirajzolódik, a 4/4-es minta különállása azonban enyhül a konszenzusos PCA-eredményekben.

104


4/4 16.965%

4/5 4/7

4/6

Component 2

4/3 4/2

6/5

6/7

6/6

4/8 6/8

4/1 6/1

6/4 6/3

Component 1

6/2

37.888%

V/26. ábra. A három markertípus (TR-F, foszfolipid-zsírsav és respiratórikus kinon) alapján végzett fıkomponens-analízis konszenzus-eredménye. A kék kör a mezofil kiindulási állapotot, a piros a kísérlet végi termofil állapotot jelöli. A barna nyilak a 4-es reaktor, a zöldek a 6-os reaktor közösségének szukcessziós útját követik. Az elemzés az abszolút mennyiségi adatok természetes alapú logaritmusának felhasználásával készült.

V. B. 3. 2. A mezofilról termofil hımérsékletre való felfőtéses kísérlet értékelése Már a két bemutatott abiotikus paraméter, az illósavtartalom és a gázhozam alakulása is jól tükrözi azt a közösségszintő mikrobiológiai eseményt, amely várakozásainknak megfelelıen végbement mezofil hımérsékletrıl termofilra való felfőtés során. A radikális változtatásnak kitett közösség gázhozama azonnal visszaesik a felfőtést követıen, illósavtartalma pedig jelentıs növekedésnek indul, ami – mint korábban említettük – a metanogén közösségben stresszhatás és mőködési zavar jele. Hirtelen felfőtés esetén érthetı módon elpusztulnak vagy inaktiválódnak azok a közösségalkotók, amelyeknek növekedési optimumától távol esik az új üzemi hımérséklet, miközben a termofil csírabevitel a nyersiszap – vélhetıen dormans – alkotóival még nem kapott elég idıt, hogy aktiválódjék, abundanciáját megnövelje, anyagcsere-kapcsolatait kiépítse. (Modellrendszeri kísérleteinkbıl tudjuk, hogy az itt bemutatotthoz hasonló hımérsékletkövetı közösségváltás sterilizált iszappal való táplálás esetén nem lehetséges: mőködı termofil metanogén közösség nem épül ki, és a gáztermelés végleg leáll. A közösségek tehát igénylik rugalmasságukhoz a folyamatos külsı csírabevitelt, önmaguktól nem tartanak fenn olyan belsı tartalékdiverzitást, amely az új közösség megalapozója lehetne.) Fokozatos felfőtés esetén – bár a gáztermelés visszaesik, és az illósavtartalom némileg megnı az átmeneti hımérsékleteken – a közösség idıt kap a régi 105


közösségalkotók kimosódásával és újabbak megtelepedésével történı alkalmazkodásra, az anyagcsere-hálózat igény szerinti lassú, anaerob sejtciklusokkal követhetı átrendezıdésére. Ugyanakkor a hirtelen hımérsékletváltás után is normális szintre emelkedik a gázhozam a kísérlet végére, és eredeti szintjére esik vissza az illósavtartalom. Visszaigazolódik tehát a szakirodalomban is emlegetett tapasztalat (Ahn és Forster 2002), miszerint mindkét közösségtípus képes felépülni illetve spontán regenerálódni akár hosszú és radikális hımérsékletváltások után is. Tulajdonképpen ezen jelenségek határesetét érhetjük tetten abban a tényben is, hogy a biogázreaktorokat a legtöbbször nem kell mesterségesen fenntartott indítókultúrákkal oltani, a metánprodukció ugyanis magától elindul a környezetbıl és a szubsztrátokból összeverbuválódott organizmusok közösséggé szervezıdésével is, amenynyiben a hımérséklet és a redoxpotenciál megfelelı. A DNS-alapú módszerek határozottan és taxonómiailag is informatív módon tükrözik a közösségváltozást. A termofil közösség csökkent diverzitása a mezofilhoz képest itt is megmutatkozik, csakúgy, mint a mezofil-termofil közösségösszhasonlítás esetében (V. B. 1. 1. fejezet). Jól látható, hogy a mezofil-termofil átmenet fokozatos felfőtés esetén sima, trendszerő, fokozatos közösségátrendezıdéssel valósul meg, míg radikális, hirtelen hımérsékletváltás esetén rendetlenebbül, véletlenszerőnek látszó ingadozásoktól zavartan valósul meg az új közösségi egyensúly kialakulása. Ez többé-kevésbé a többi markertípus közösségi változásaiban is megmutatkozik, és kiválóan összecseng az abiotikus paraméterek változásmódjával, valamint a fıkomponensanalízisek nyomán látható jellegzetes „kerülıúttal”, amelyet a 4-es reaktor közössége bejár az új egyensúly kialakulásáig. A közösségátrendezıdés azonban ettıl függetlenül hasonló eredménnyel zárul: fokozatosan kiszorultak a Levilinea saccharolytica, Longilinea arvoryzae, Paludibacter propionicigenes és Ethanoligenens harbinense fajokkal rokonítható T-RF-ek, és több más, közelebbrıl nem azonosított T-RF is, míg egyebek között a Defluviitoga tunisiensis, Coprothermobacter proteolyticus, Flavobacterium filum és Amoebophilus asiaticus fajokkal rokonítható T-RFek dominánssá válnak. Az Aminobacterium colombiense Alu enzimes emésztéssel ugyanazt a T-RF-et adja, mint a Defluviitoga tunisiensis, Bsu enzimmel azonban elkülönülnek, ez alapján pedig úgy tőnik, hogy az A. colombiense alárendelt szerepet játszik a mezofil, majd az átmeneti közösségekben is, idıvel pedig kiszorul a termofil közösségbıl. Az Alu75-76 T-RF-et pedig zömmel a D. tunisiensis faj adja. A klónkönyvtár segítségével jó hasonlósággal meghatározott T-RF-ek különösen két faj erıteljes feldúsulását mutatják termofil körülmények között: a Defluviitoga tunisiensis eszerint – bár jelen van a mezofil közösségben is – termofil körülmények között kap csak komolyabb teret, a Coprothermobacter proteolyticus pedig kimondottan csak termofil közösségben jelenik meg, válik rezidenssé, sıt, akár dominánssá. Az elıbbi fajról tudjuk, hogy termofil növekedési optimuma ellenére

106


egy sajtkészítésbıl származó savót feldolgozó mezoterm reaktorból izolálták Tunéziában (Hania és mtsai. 2011), a másodikat pedig – nevének megfelelıen – termofil körülmények közül izolálták [elıször Thermobacteroides proteolyticus néven (Ollivier és mtsai. 1985), majd átnevezésre került a Coprothermobacter nemzetség típusfajaként (Rainey és Stackebrandt 1993)], majd megtalálták például termofil komposztban is (Kersters és mtsai. 1994). Ezen eredményünk tehát kiválóan egyezik a szakirodalmi adatokkal, azonosított fajaink metanogén közösségek jellegzetes alkotói. A többi fajokkal rokonított klónunk esetében a szekvenciahasonlóság a faji megfeleltetéshez túl kicsiny, és csupán annyi mondható el, hogy a máig kitenyésztett baktériumfajok közül a V/2. táblázatbéli (93. old.) áll legközelebbi rokonságban a talált klónokkal. A Flavobacterium filum-hoz 94%-ban hasonló klón esetében még nem zárható ki teljesen az azonos nemzetségbe tartozás, a többiek esetében azonban már igen. Ennek ellenére sem érdektelen talán végigtekinteni klónjaink legközelebbi leírt rokonainak során. A Flavobacterium filum egy koreai szennyvíztisztító teleprıl került elı (Ryu és mtsai. 2007) és bár mezofil szervezet, nem kizárható, hogy egy közeli termofil rokonának klónjára bukkantunk reaktorainkban, hiszen az ennek megfelelı T-RF feldúsulása a termofil közösségszervezıdés során trendszerő. Levilinea saccharolytica néven egy mezofil anaerob törzset írtak le (Yamada és mtsai. 2006), és a vele rokonítható klón nálunk

is

kiszorul

a

termofil

közösségekbıl,

ami

mezofil

növekedési

optimumhımérsékletet valószínősít. Az Aminobacterium colonbiense hígtrágyarothasztóból elıkerült mezofil aminosavfermentáló szervezet (Baena és mtsai. 1998), melynek mi egy termofil rokonát azonosíthattuk, ha csupán 90%-os szekvenciahasonlósággal is. A Longilinea arvoryzae egy rizsföld metanogén közösségébıl elıkerült mezofil szervezet (Yamada és mtsai. 2007). Észlelt rokona nálunk is kiszorul termofil körülmények között, bár mintha az átmeneti zavaros idıszak növelné az abundanciáját. Melaszos szennyvízbıl izolált mezofil szervezet az Ethanoligenens harbinense (Xing és mtsai. 2006). A vele rokonságot mutató T-RF nálunk is kiszorul a termofil közösségbıl, bár sokáig állja a sarat felfőtés után. Rizsföld anoxikus, növényi maradványokkal teli talajából írták le (Ueki és mtsai. 2006) a Paludibacter propionicigenes propionsavtermelı, 30°C növekedési optimumú szervezetet, akinek távoli rokona nálunk is hasonló hımérsékleti optimumnak megfelelıen szorult ki a két közösség T-RF-mintázatából (hirtelen felfőtés esetén gyorsabban). A legtávolabbról rokonított klón az amıba-endoszimbionta Amoebophilus asiaticus kandidátus-fajjal mutat 79%-os szekvenciahasonlóságot. A távolabbi rokonfajok számbavétele alapján is egy jellegzetes metántermelı közösség körvonalazódik tehát. A legalább genus-szinten azonosított klónjainkhoz érdemes megnéznünk a leírt fajok zsírsavkészletét. Defluviitoga tunisiensis C16:0 (42.7%), C18:1ω9c (30.7%), C16:1ω9c (10.7 %), C18:0 (9.9%) és C18:1ω7c (6.0 %) zsírsavakkal rendelkezik (Hania és mtsai. 2011), melyek

107


mind jelen vannak a közösségi zsírsavkészletben, a Coprothermobacter proteolyticus eredeti fajleírásában elmulasztják közölni a zsírsavkészletet, ám egy ugyanabba a nemzetségbe tartozó faj (Thermobacteroides leptospartum, Toda és mtsai. 1988) leírásában a C16:0 (27.7%), iso-C17:0 (18.5%) és iso-C15:0 (16.4%) zsírsavakat találjuk, melyeket ugyancsak kimutattunk a közösségbıl, nemzetségen belül pedig a zsírsavkészlet azonosnak tekinthetı, ha a termelési arányok nem is feltétlenül. A Flavobacterium filum-hoz 94 %-ban hasonló klónunk esetében még elképzelhetı a genus-szintő összetartozás és így várhatóan a zsírsavkészlet azonossága is. Ebbıl a fajból izo-C15:0 (19.7%), C15:0 (17.2%), izo-C15:1 G (16.8%), izo-C16:0 3-OH (9.7%), izo-C15:0 3-OH (9.2%), izo-C16:0 (5.8%), anteizo-C15:0 (3.7%), izoC14:0 (3.5%), izo-C17:0 3-OH (3.5%), C15:0 3-OH (1.9%), C15:1ω6c (1.8%), izo-C16:1 H (1.5%), izo-C14:0 3-OH (1.5%), C16:0 (1.5%), C16:0 3-OH (1.2%), C14:0 (1.0%) és isoC13:0 (0.7%) zsírsavakat izolálták (Ryu és mtsai. 2007). Az aláhúzott négy zsírsav kivételével kimutattuk a közösségbıl ezeket a molekulákat is. A leírt fajokkal 90% körüli vagy az alatti hasonlóságot mutató klónok esetében a genus-szintő együvé tartozás kizárható, így a zsírsavkészlet hasonlóságát sincs értelme firtatni. Sajnos a zsírsavmintázat moderált változásai nem követik árulkodó módon a T-RF-ek változásait, így ránézésre nem mondható több e megfelelésekrıl. A zsírsavtípusok változásában megemlítendı a ciklopropil-tartalmú zsírsavak feldúsulása a termofil közösségi egyensúly felé törekedve. Minthogy ezt a zsírsavat enterális baktériumok markereként szokták számon tartani, eredményünk itt ellentmond a termofil körülmények általánosan tapasztalt, enterális patogéneket elimináló hatásának. E zsírsavmarker enterális mikrobakörhöz rendeltsége ugyanakkor (bár jellemzı) nem kizárólagos, jelen esetben valószínőbb, hogy rezidens közösségalkotótól származik. A szulfátredukáló baktériumok markereként számon tartott C15:1 és C17:1 zsírsavak kicsiny aránya a többi zsírsav között összevetve a Desulfobulbus szignatúrakinon MK5(H2) dominanciájával újra csak arra enged következtetni, hogy a feltételezett Desulfobulbus fajok az anaerob légzı szervezetek között mutatnak csak dominanciát, akik arányaikkal amúgy együttesen is eltörpülnek a fermentáló szervezetek sokaságában. A mennyiségi arányok idıbeli alakulása ugyanakkor nem mutat összhangot a két marker között, ami egy további bizonytalansági tényezıre hívja fel a figyelmünket. A Desulfobulbus fajok zsírsavkészletérıl szóló szakirodalom ugyanis beszámol arról a jelenségrıl, hogy ezek a baktériumok a rendelkezésükre álló szubsztrátnak megfelelıen más-más zsírsavarányt produkálnak foszfolipidjeikben, így a propionsavon vagy tejsavon mint szénforráson való növekedéskor mért C17:1 dominancia helyett CO2 és H2 jelenlétében tenyésztve C16:0 és C18:1 válik dominánssá a zsírsavkészletükben (Taylor és Parkes 1983). Elképzelhetı tehát, hogy metanogén közösségekben a Defulfobulbus fajok beolvadnak zsírsavaikkal a többi szervezet tömegébe (utóbbi zsírsavakat megtaláltuk a klónok alapján azonosított, termofil közösségben fajoknál is, s amúgy is

108


gyakoriak). Elképzelhetı az is, hogy a C16:0 és C18:1 zsírsavak jelentıs hányada éppen ezektıl a szulfátredukálóktól származik, akik eszerint talán mégsincsenek olyan kisebbségben a fermentálók mellett, mint az imént következtettünk rá. Azonosított DNS- ujjlenyomat nem áll rendelkezésünkre, hogy támpontot adjon a kérdés megválaszolásához. Vizsgált DNSmarker híján ugyancsak keveset mondhatunk a PUFA zsírsavak termofil feldúsulásáról, ami eukarióta szervezetek feldúsulását jelentené, ugyanakkor az eukarióta mitokondriumokra jellemzı Q10 ubikinon visszaszorulása termofil egyensúly felé haladva óvatosságra int e következtetést illetıen. Mivel általános tapasztalat, hogy tömegesen találni ismert fajhoz nem sorolható klónokat anaerob rothasztókban és más metanogén közösségekben, az sem kizárható, hogy mégis prokarióták termelik ezeket a zsírsavakat. A zsírsavak korrelációs hasonlósági fáján sem csak hasonló zsírsavtípusba tartozó markerek együttmozgását láthatjuk meg – ami nyilvánvalóan egyazon termelı szervezettıl való származásukat valószínősíti – de figyelemre méltó például a viszonylag ritka C15:0 3OH zsírsav igen erıs együttmozgása egy azonosítatlan zsírsavval (4:00 unid) is, amely a 6-os reaktor termofil közösségeiben jelent meg, és ha valóban egy máig nem ismert zsírsavtípus képviselıje, valószínő, hogy termelıjét sem ismerjük még. Ugyanígy gondolatébresztı, hogy a termofil közösségekben általánosan megnıtt a MIDI adatbázisok számára azonosíthatatlan zsírsavak aránya, ami ugyancsak azt sugallja, hogy sok fehér folt van még a tudásunkban a metanogén közösségek összetételével és tagjaik kilétével kapcsolatban. Felvetıdik a kérdés, miért tapasztalható eltérı változékonyság a markerek között, és például a faji szinten is megnyugtatóan azonosított Defluviitoga tunisiensis irodalomból ismert fı zsírsavainak (C16:0, C18:1ω9c) idıbeli változása miért nem mutat hasonló karaktert, mint az ugyanezen fajhoz rendelhetı T-RF-marker változása? Nos, a faj két fı zsírsava (és a többi is) elég általánosnak mondható a baktériumok körében, más szóval a D. tunisiensis nem egy különleges szervezet a zsírsavait tekintve. Joggal valószínősítjük tehát, hogy a közösség más tagjai is jelentıs mennyiséget „dobtak közösbe” ugyanezekbıl a markermolekulákból, maszkírozva ezzel egymás abundanciaváltozásait. Nyilvánvaló, hogy itt a DNS- és zsírsavmarkerek taxonómiai felbontási képességére jellemzı különbséggel szembesülünk (a DNS-marker javára), ugyanakkor joggal mondanánk-e, hogy a zsírsavanalízist feleslegessé teszi a közösségi vizsgálatban a DNS-markerek vizsgálhatósága? Mint az Irodalmi áttekintés fejezetben említettük, a PCR-amplifikáción alapuló markersokszorozás alaposan torzíthatja a mennyiségi viszonyokat, míg a zsírsavpreparációban és -mérésben nem ismerünk komoly elfogultságot eredményezı tényezıt. Ez nem vezet ellentmondáshoz a fenti tapasztalatainkkal, mivel az, hogy a DNS-markerek – jó taxonómiai felbontóképességük miatt – megmutatják a minták-béli abundanciaváltozásokat, nem jelenti, hogy például a markertermelı szervezetek eredeti arányait is megbízhatóan tükrözik vissza a belılük származó mar-

109


kerek arányai. Másfelıl a kisebb taxonómiai felbontás ellenére a zsírsav- (és kinon-) mintázat ha másképp is, de ugyancsak információt hordoz a közösségi eseményekrıl. A markerekkel külön, majd együttesen is elvégzett fıkomponens-analízissel a szukcessziós folyamat bemutatása mellett éppen az volt a célunk, hogy megmutassuk: az olykor nehezen értelmezhetı összkép, a látszólagos ellentmondások és bizonytalanságok ellenére egyik markercsoport sem bizonyul alkalmatlannak a közösségi változások nyomon követésére, sıt észre kell vegyük, hogy mindhárom markertípus hitelesen képezi le a közösségváltozást. Hiszen figyelemre méltóan hasonló karakterő szukcessziós utakat rajzolnak ki, így egymás alkalmazhatóságát kölcsönösen igazolják. A történet tehát mindegyik adatsorban ott bujkál, csak a megfelelı kapaszkodók hiányoznak számunkra, hogy jobban megfejtsük a rejtvényt, és a fentebb leírtaknál mélyebben értsük meg a közösségek belsı változásainak természetét. V. B. 3. 3. A markerek korrelációs megfeleltetési stratégiájának kidolgozása A fentiekben lényegét tekintve végighaladtunk azon a gondolatmeneten, amellyel a polifázikus

szemlélető

közösségelemzések

rekonstruálni

igyekeznek

egy

közösségösszetételt és közösségváltozást a különbözı molekuláris ujjlenyomatok alapján. Az általunk áttekintett szakirodalomból úgy tőnik, a hasonló módszereket alkalmazó szerzık nem is lépnek tovább az efféle következtetéseknél, és a megjelenı publikációk nagy része is a fentiekhez hasonló tőnıdés az adatok nyújtotta képlékeny összkép fölött (Liu és mtsai. 2000). A mindenkori olvasónak (és gyaníthatóan maguknak a szerzıknek is) könynyen támadhat az az érzése, hogy a sok ismeretlen faktor – mint amilyen a nem ismert (csak észlelt) fajok nagy száma egy ilyen mikrobaközösségben, az átfedı markertermelés okozta információvesztés, vagy az alkalmazott módszerek tökéletlenségeibıl (például preferenciális DNS-amlifikációból) adódó várható információtorzulások – miatt az egész eredményértékelés tulajdonképpen csupán ügyesen átgondolt, és szakszerően tálalt nem-tudás, illetve valószínő forgatókönyveken való kreatív ötletelés, nem pedig tényleges közösségfeltárás vagy nyomon követés. Az pedig a mindenkori olvasó elıismereteitıl, beállítottságától vagy éppen jóindulatától függ, hogy rábólint az adatértelmezés szerzı által felkínált forgatókönyvére, vagy nekiáll érveket keresni (és találni), hogy jelentıs részben miért megalapozatlanok vagy legalábbis tetszılegesek a leírt következtetések. Ez a bizonytalanság természetesen a rendelkezésünkre álló módszerek és a vizsgált tárgy természetébıl fakadó, szükségszerően adódó helyzet, ugyanakkor különös, hogy e helyzet meghaladására mintha kevés erıfeszítés irányulna a szakterület mővelıi részérıl. A másik sajátosság, ami feltőnhet, hogy a tarka diagramokon megjelenı számtalan színes sáv közül csak kevéssel kapcsolatban adódik értelmezı gondolat, a többségnek kényszerő figyelmen kívül maradás lesz a sorsa, vagy egy sokváltozós adatelemzı módszer alkotta összképben oldódik fel az általa

110


hordozott információ. Pedig érezhetı, hogy az ismereteink és módszereink alapján kirajzolódó értelmezési horizonton túl rengeteg információ lapul még kitermeletlenül az adatsorok mélyén. Miként lehetne – legalább részben – hozzáférni ezekhez? Az efféle gondolatok még nem is fogalmazódtak meg bennem élesen, amikor doktori munkám legelején, az ELTE KKKK egyik mőhelymegbeszélésén egy levegıkémiával foglalkozó doktorandusztársam, Muránszky Gábor témaismertetését hallgattam, melyben arról került szó, miként lehet városi légszennyezı komponensek forrását azonosítani illetve közös forrásból való származásukat kimutatni mennyiségük együttes idıbeli változásai alapján. (Például ha egy üzem leáll, az általa kibocsátott légszennyezı komponensek szintje egyszerre mutat csökkenést egy idıbeli monitoringvizsgálat adatsoraiban.) Az efféle elemzéshez arra van szükség, hogy magukat a mért változókat tegyük statisztikai összehasonlítás tárgyává, értékeik idıbeli változása a monitoring során ugyanis olyan karakterisztikát rajzol ki, melyek alapján összehasonlíthatóak, azaz megmutatkozhatnak a hasonló „történettel” bíró változók csoportjai. Az idıben hasonlóan változó anyagok mögött ugyanis valószínőleg hasonló történet áll (pl. azonos kibocsátó forrás, és annak mőködési ingadozásai). Ekkor ébredt bennem a gondolat, hogy hasonló logikával a közösségmikrobiológiában használt ujjlenyomatmódszerek markerei eredetének is nyomába lehetne eredni: egy közösségbeli légzı baktérium, amely a közösségi markermintázathoz hozzájárul valamilyen kinonnal, különféle zsírsavakkal, és egy T-RF-markerrel, abundanciájának idıbeli (vagy térbeli) változásai során értelemszerően változtatni fogja markereinek mennyiségi arányait is a közösségi ujjlenyomatmintázatban. Ha például egy baktérium dominánssá válik egy közösségben, vélhetıleg zsírsavai és T-RF markerei is dominánssá válnak a markerkészletben. Az adatsorok megfelelı statisztikai elemzésével kimutathatnánk az idıbeli együttmozgásokat, és ezzel azonosíthatnánk különbözı típusú markerek közös termelıit. Így akár soha ki nem tenyésztett környezeti klónokhoz is hozzárendelhetnénk olyan fenotipikai bélyegeket, mint bizonyos zsírsavak megléte, vagy légzés képessége (kinonmarkerek alapján). Igaz, soha nem bizonyossággal, de a mintaszámmal és a változások amplitúdójával növekvı hihetıséggel tehetnénk meg e hozzárendeléseket. Közbevetjük: az alapgondolat még csak véletlenül sem újdonság: amikor valaki közösségi ujjlenyomat-mintázatokat vet össze, tulajdonképpen nem tesz mást, mint a vizsgált markereknek egy idı-, tér- vagy állapotsor mentén való viselkedését veszi szemügyre, és ebbıl igyekszik információt nyerni a közösség történetérıl. Erıs markeregyüttmozgás esetén ilyenkor is közös termelıre kezd gyanakodni az elemzı. Ennek egyszerő példáját mutattuk be az elızı fejezet V/22. ábrájával (101. old.), ahol hasonló karakterő zsírsavak idısori korrelációit kimutatva közös termelı szervezet létét valószínősítettük. Arra azonban, hogy ne bakteriális markercsoporton belül, hanem különbözı markercsoportok között végezzünk

111


célirányos statisztikai felderítést termelıszintő összetartozások kimutatására (vagyis hogy idıbeli együttmozgásokból kikövetkeztessük, hogy pl. mely kinon és T-RF származik a mintában ugyanattól a baktériumtól), tudomásunk szerint még nem volt példa a közösségmikrobiológiában. Ehhez a markerváltozók összevont csoportjában kell korrelációs összehasonlításokat végeznünk valamilyen alkalmas, sokváltozós adatelemzési módszer segítségével. Ha egy marker egy másik típusú markerrel mennyiségileg következetesen korrelál idı-vagy térsorokban, az közös termelı szervezet létét valószínősíti (ha nem is bizonyítja). Az elsıre talán nem is komplikáltnak tőnı feladat megfelelı kivitelezéséhez azonban különbözı problémákkal kell szembenéznünk. Rögtön szembesülnünk kell a taxonómiai relevanciájukat tekintve átfedı markerek fentebb látott problémájával. Két baktérium, amelyek T-RF-eik alapján elkülöníthetık, könnyen lehet, hogy ugyanazt a zsírsavat termelik nagy mennyiségben ami (az V/27. ábrán látható módon) ahhoz vezet, hogy a zsírsavmarker külön-külön egyik termelıjének T-RF-markerével sem korrelál különösebben jól, hanem azok mindenkori (mintákon belüli) összegével fog korrelálni. Az V/27. ábrán mutatott esetben nem fogunk szemmel látható markeregyüttmozgást észrevenni egyszerő diagramokon (különösen ha sok egyéb marker adatai uralják az összképet), holott az információ mégis ott

markermennyiség .

rejlik az adatokban! Kár volna lemondani róla, ha kinyerhetı.

idı- vagy térsor T-RF1

T-RF2

T-RF3

Zsírsav1

Σ T-RF1-3

V/27. ábra. Egy egyszerő, elképzelt mikrobaközösség markereinek változása idı vagy térsoron. A közösséget alkotó három faj elkülönül T-RF markerei alapján (T-RF1, T-RF2, T-RF3), miközben mindhárman ugyanazt a zsírsavat (Zsírsav1) termelik. A termelt zsírsav (hibátlan kimutatásokat feltételezve) egyik T-RF-fel sem korrelál jól külön-külön, ugyanakkor láthatóan nagyon jól korrelál a három T-RF mindenkori mennyiség-összegével (szaggatott vonal).

A valóságban persze nem tudjuk, mely változókat kell összeadnunk az egyik markercsoportban, hogy aztán ez az összeg korreláljon a másik csoport valamely változójával. Hogyan lehetne ezeket az összetartozó markereket mégis megtalálni? A matematikai statisztika mélyebb ismeretének híján felkerestük az ELTE TTK sokváltozós statisztikai módszereket 112


sőrőn alkalmazó szaktekintélyeit, ám ilyesfajta rejtett összefüggések kimutatására alkalmas módszer nem volt ismert az ı körükben sem. Maradt tehát a modern számítástechnika számítási kapacitását kihasználó „nyers erı” módszere: kombinatorikusan adjuk össze a változóink mennyiségeit mintánként, majd az így nyert származtatott összegváltozók között keressük azokat, amelyek kiugróan jó korrelációt mutatnak más változókkal. Az erre a mőveletre alkalmas célszoftver kifejlesztését az ELTE IK Numerikus Analízis Tanszéke és a Mikrobiológiai Tanszék közötti együttmőködés keretében diplomamunkát készítı Czigler András programtervezı informatikus hallgatóval közösen végeztük el (Czigler 2010). A szoftver a megfelelı rendezésben betáplált adatokból kombinatorikusan összegváltozókat képez, s ezeket a származtatott változókat bevezetve a változók közé kiszámolja az adatok közötti Pearson-féle korreláció értékét (bár más hasonlósági indexek számolására is alkalmas), ezeket rendezhetı alakban kilistázza, illetve megfelelıen kezelhetı hasonlósági fa alakjában ábrázolja. Természetesen a nyers erı alkalmazásában azért jó néhány ésszerő optimalizációra is lehetıség nyílt. Így például a különbözı változótípusokat továbbra is külön kezeljük, és az összegképzést csak a csoportokon belül végzi el a szoftver, hiszen nincs belátható értelme annak, hogy mondjuk egy zsírsav és egy T-RF mennyiségi összegének korrelációját vizsgáljuk egy másik zsírsavval. Azzal, hogy csoporton belül maradunk, az összegképzés kombinatorikus lehetıségeinek száma erısen redukálódik. A felhasználó markercsoportonként megadhatja továbbá, hogy hány tagú összegekig menjen el a program az összegváltozók generálásában, és ehhez járul egy, a programba épített várható számítási idıt becslı alkalmazás is, amely alapján eldönthetı, megéri-e nekikezdeni az aktuálisan beállított paraméterekkel az analízisbe. Nem nehéz ugyanis belátni, hogy nagyszámú változót tartalmazó adatmátrixok és soktagú összegekig való elszámolás esetén a kombinációk száma olyan óriásira rúghat, hogy az egy általánosan használt asztali számítógép kapacitását igen hosszú idıre lefoglalhatja. További problémaként merült fel a csoporton belüli változók nagyságrendileg eltérı mennyiségi aránya egymástól. Tételezzük fel ugyanis, hogy ha a képzeletbeli közösségünk példájánál maradva a három feltüntetett T-RF mellett még számos egyéb T-RF is szerepel az adatsorban (mondjuk T-RF4, T-RF5, T-RF6, T-RF7), akkor amennyiben ez utóbbi TRF-ek arányaikban eltörpülnek a „fontos” T-RF-ek mellett és/vagy idıben egyenletes mennyiséget produkálnak, akkor úgy adódhatnak hozzá sorban az értékes T-RFösszegünkhöz, hogy a zsírsavval továbbra is magas korrelációt adnak az összegek, mégis salakinformációval töltıdött fel az eredménytáblázatunk és a hasonlósági fánk. Erre mutatunk példát a V/28. ábrán. A fa informatív ágán az értékes összegváltozót is tartalmazó új összegváltozók jelennek meg, melyek azonban értéktelen többletinformációt képviselnek,

113


nagy változószám esetén áttekinthetetlenné teszik az amúgy sem egyszerő adatsruktúrát. Ennek megoldására beépítettünk egy szőrési metódust, amely a túlságosan erıs korrelációt mutató markercsoportok felhalmozódását meggátolja azok (beállítható hasonlósági küszöb alapján való) szőrésével, valamint elıre beállítható egy nagyságrend-különbségi korlát, amely fölött nem végzi el a program az összeadásokat. Utóbbi korlátozás az elvégzendı számítások mennyiségét is csökkenti. d/T-RF7 d/T-RF2 d/T-RF6 d/T-RF2+T-RF3 d/T-RF5 d/T-RF3 d/T-RF1+T-RF3

d/T-RF2 d/T-RF2+T-RF3 d/T-RF1+T-RF2 d/T-RF3 d/T-RF1+T-RF3

a)

z/Zsírsav1 d/T-RF1+T-RF2+T-RF3 d/T-RF1

b)

d/T-RF1+T-RF2+T-RF3+T-RF4+T-RF5 d/T-RF1+T-RF2+T-RF3+T-RF4 z/Zsírsav1 d/T-RF1+T-RF2+T-RF3 d/T-RF4 d/T-RF1+T-RF2 d/T-RF1

V/28. ábra. a) A szövegben említett példaváltozók és összegváltozóik közötti korrelációs hasonlóság. A bekeretezett összefüggést kerestük. b) Az alacsony nagyságrendő és/vagy közel konstans mennyiségő változók értéktelen információval tölthetik fel az eredményeket (szürke kapocsjel). A fák a saját fejlesztéső szoftverünkkel készültek (Pearson korreláció, átlagos láncmódszer). A változók neve elıtt a változócsoport neve szerepel (d: DNS-markerek, z: zsírsavak). Az eredeti változók neve erıs, az összegváltozóké halványabb színnel jelenik meg.

A faszerkesztésre szoftverünk elsı verziójában háromféle módszer közül választhatunk, ezek az egyszerő, a teljes és az átlagos láncmódszer. (Általában az Átlagos láncmódszert preferálják a másik kettıvel szemben, ám a mi koncepciónkban idáig a faszerkesztési módszer megválasztásának alárendelt szerepe van, mi ugyanis a fát csupán a legerısebben korreláló párok gyors megmutatására használjuk, a fa közepes topológiájából nem nyerünk információt. A legerısebb korrelációk pedig minden módszerrel megmutatkoznak.) A nagy adatmennyiséget tartalmazó adatmátrixok alapján készülı hasonlósági fák már a változók egyenkénti összehasonlításakor is áttekinthetetlenül nagyok lehetnek, nemhogy a bevezetett összegváltozókkal együtt. Ezért a szoftver egy részleteiben nagyítható, pásztázható formában rajzolja ki a hasonlósági fát, hogy az kényelmesebben tanulmányozható lehessen. Mivel ahogyan már említettük, a statisztika matematikájában való felkészültségünk csekélyebb annál, mintsem hogy elıre fel mertük volna mérni az adatkezelési koncepciónkban leselkedı egyéb rejtett buktatókat, a továbblépésnek azt a módját választottuk, hogy virtuálisan összeállított mesterséges modellközösségek markermintázatán teszteltük a módszerünket, ahol elıre ismerhetjük a várt eredményt, mellyel az adatkezelési módszernek vissza kell térnie. Ezért még a programtervezéssel párhozamosan készítettünk egy közösségdinamikát modellezı szimulációs szoftvert is, melyben meghatározott markertípusokkal jellemezhetı, elıre megadott számú „fajt” indítottunk útjára egy virtuális közösségben, melyben a közösségi szukcesszió folyamatát egy általános Lotka-Volterra modell segítségével szi-

114


muláltuk. A program fajonként minden futás elején kisorsolja az összes többi fajjal vett kölcsönhatási rátákat, melyek alapján a fajok (aktuális létszámuknak megfelelı arányban) minden generációs lépésben módosítják a többi faj létszámát. A markerek természetesen minden generációs lépésben „gazdájuk” abundanciaváltozásának megfelelıen kapnak új mennyiségi értékeket. Bár a modell determinisztikus, a program megadott indítóközösségekkel több szukcessziós folyamatot is szimulál (melyek között a véletlenszerően sorsolt kölcsönhatási ráták adják a különbséget) a végén pedig egy olyan lefutott közösségi szukcessziós folyamatot választ eredménynek, amely kellıen hosszan tartott kihalások nélkül ahhoz, hogy módszerteszteléshez elegendı adathoz jussunk általa. (Természetesen ilyen program nélkül is tudtunk volna modell-adatsorokat készíteni, ahogy azt például az V/27. ábra szerkesztéséhez is megtettük, de egyszerőbben használhatónak és elegánsabbnak tetszett közösségszimulációval generálni az adatsorokat). Az alábbiakban egy egyszerő virtuális modellközösség idıbeli „monitorozásának” példáján keresztül mutatjuk be, miként teszteltük adatelemzési koncepciónkat. Kérdésünk volt, hogy kimutathatóak-e a korrelációk és összegkorrelációk (abszolút mennyiségek adatsorán kívül) markercsoportokon belül fajlagosított mennyiségekkel is, illetve ha nem, segít-e rajtunk Aitchison (2003) tanácsa, mely szerint logaritmizálva a fajlagos mennyiségek adatait újra normálhatjuk azokat korrelációs elemzések számára. Miként módosul a korreláció, ha a többforrású markereket termelıik más nagyságrendben produkálják, illetve lehet-e tenni valami további lépést ennek a jelenségnek a kezelésére? Nem utolsósorban pedig kérdés volt, hogy újonnan fejlesztett szoftverünk visszaadja-e a várakozásainknak megfelelı korrelációs mintázatot. A bemutatott modellközösség négy fajból állt, ezek pedig az alábbiak szerint hozzájuk rendelt két markertípusból termeltek négy-négyféle fajuknak megfelelı minıségőt és menynyiségőt (V/3. táblázat). markerek és termelési mennyiségük baktérium DNS1 DNS2 DNS3 DNS4 zsírsav1 zsírsav2 zsírsav3 zsírsav4 1. faj

0

0

0

0

100 0

0

0

0

1000 0

0

0

100 0

0 100

100

2. faj

100 0

3. faj 4. faj

1000 0

1000 0

0

0

10 0

1000

0

1000 1000

V/3. táblázat. A bemutatott modellközösség négy fajának DNS- és zsírsavmarkerei. A táblázatban foglalt számok azt mutatják, hogy melyik baktérium melyik markert termeli és milyen nagyságrendben termeli azt. A szám a szimuláció során egy egyszerő szorzótényezı, amely az illetı faj mindenkori egyedszámával megszorozva megadja a marker fajra jutó mennyiségét az adott generációs lépésben.

115


Modellközösségünk négy faja tehát elkülöníthetı DNS-markere alapján, és mindegyik csak egyféle DNS-markert termel ugyanolyan mennyiségben, pontosabban – hogy valósághőbben értelmezzük az összefüggést – a képzeletbeli PCR-t követıen minden sejt 100 amplikonnal képviselteti magát a közösségi ujjlenyomatmintázatban. (A valódi biológiai mintákban persze jóval nagyobb a fajok és a markerek mennyisége.) A zsírsav4 markert három faj is termeli ugyanolyan arányban, zsírsav2-t csak az 1. faj, sejtenként mind 1000-1000 zsírsavmolekulát adva a képzeletbeli extraktumhoz. Zsírsav1-et a 2. és 4. faj is termeli, ám utóbbi csak tizedannyit termel belıle, mint az elıbbi, zsírsav3-at pedig ugyancsak két faj termeli, de a 3. faj csak századannyi mennyiségben, mint az 1. faj. Az eltérı mértékben való markertermeltetéssel abbéli erıs gyanúnkat kívántuk tesztelni, mely szerint ha két termelı eltérı mértékben járul hozzá egy marker mennyiségéhez, miközben másik vizsgált (megkülönböztethetı) markerük ettıl függetlenül azonos mennyiségben (vagy más eltérés szerint) termelıdik, sérülni fog a közös marker várt korrelációja ezek összegével. A szukcessziós folyamat 10 generációs idıszakon keresztül zajlott, minden generációból történt mintavétel. A szukcesszió folyamatában a markermennyiségek a V/29. ábrán látható módon változtak. (Maguknak a baktériumoknak az abundancia-arányai a peremfeltételek miatt egyértelmően megfelelnek a DNS-markerarányoknak, így az abundanciát nem ábrázoltuk külön.)

116


70 60

mennyiség

50 40 30 20 10

a)

0 1

2

3

4

DNS1

5 6 7 "Mintavétel" ideje DNS2

8

DNS3

9

10

DNS4

1200

160 140

1000

mennyiség

120 800

100

600

80 60

400

40 200

b)

20

0

0 1

2

3

4

5 6 7 "Mintavétel" ideje

8

9

10

zsírsav1

zsírsav2

zsírsav3

zsírsav4

(zsírsav2)

(zsírsav3)

V/29. ábra. a) A DNS-markermennyiségek alakulása a szimulált közösségben. b) A zsírsavak mennyiségének alakulása a szimulált közösségben. Mivel zsírsav2 és zsírsav3 görbéi nagyon közeliek az ábrán, szürkítve és szaggatott vonallal másodlagos tengelyen is feltüntettük ıket, megmutatva az enyhe eltérést közöttük. A termelı szervezetek abundancia-arányai egyértelmően megfelelnek a DNS-markerarányoknak, így az abundanciát nem ábrázoltuk külön.

Látható a DNS-markerek alakulásából (V/29. ábra, V/3. táblázat), hogy a 3. faj domináns közösségalkotóból alárendelt szerepbe szorult a szukcesszió során, miközben a 2. faj harmadrangú közösségalkotóból domináns szerepbe került. Eközben a 4. faj másodrangú közösségalkotó szerepbıl szinte teljesen kiszorul a közösségbıl, míg az 1. faj közel konstans abundanciával egzisztál végig. A zsírsavmarkerek közül ennek megfelelıen zsírsav2 mennyiségi alakulása pontosan leképezi az ıt egyedül termelı 1. faj (és DNS1 marker) mennyiségi változását, zsírsav3 pedig ugyancsak az ıt elsısorban termelı 1. faj mennyiségi 117


ingadózásai szerint változik, a másodlagos tengelyen ábrázolva azonban megfigyelhetı, hogy mennyisége eltér zsírsav2-étıl, és a különbség az ıt másodlagosan termelı 3. faj (DNS3) mennyiségi arányai szerint változik (azaz csökken). A két termelı által is produkált zsírsav1 a 2. faj változási trendjét követi inkább, ami érthetı abból is, hogy ez fajlagosan tízszer annyit termel belıle, mint a másodlagos termelı 4. faj, de abból is, hogy 2. faj változása markánsabb, mint 4. fajé. A zsírsav4 marker pedig három egyenrangú termelıje meglehetısen különbözı változási karakterisztikájának eredıjét mutatja. Mi tehát a várakozásunk az együttmozgásokkal kapcsolatban? Az egyetlen szervezetet jelzı DNS1 és zsírsav2 markerek pontos mennyiségi korrelációjára számítunk, ugyanígy számítunk továbbá a zsírsav4 és az ezt termelı három faj DNS-markerei összegének (DNS2 + DNS3 + DNS4) tökéletes korrelációjára (legalábbis abszolút mennyiségi adatok betáplálása esetén). Kíváncsiak vagyunk, miként módosul az DNS-markerek összegének korrelációja a közös zsírsavval eltérı volumenő zsírsavtermelés esetén. Ha megnézzük DNS1 és zsírsav2 korrelációját abszolút adatokon, természetesen visszakapjuk a tökéletes korrelációt, hiszen a szimulációs program nem szimulált véletlen hibákat, DNS1 és zsírsav2 markerek mennyiségeit pedig egyszerő szorzással származtatta 1. faj létszámából minden lépésben. Ha azonban a markermennyiségeket csoportjukon belül fajlagosítjuk (úgy, hogy összegük csoporton belül mintánként 1-et vagy 100%-ot adjon ki), a korreláció „elromlik”. A közösségi ujjlenyomat-módszerek alkalmazása során sokféle elınye miatt gyakran használjuk a fajlagosítást. Egyrészt tompítja a mintavételi és preparálási hibák következményeit összehasonlíthatóvá téve az eltérı összmennyiségő markert tartalmazó mintákat, máskor méréstechnikailag könnyíti meg a kutató dolgát a fajlagosítás lehetısége, így például TRFLP-vizsgálatokban a fragmentek elválasztásakor olyan mennyiséget injektál a kapillárisra, hogy a kicsiny és nagy csúcsok egyaránt jól látszódjanak, az ebbıl az önkényességbıl adódó abszolút mennyiségi torzulások azonban a mennyiségfajlagosítás révén eltőnnek a mintaközi összehasonlításokban. Ennek ellenére az adatok statisztikai értékelésekor figyelemmel kell lenni arra, hogy az adott módszer alkalmazható-e fajlagosított adatokkal. A fajlagosítással ugyanis megszőnik a változók függetlensége: bármelyik változó értékének megváltozása hatással lesz az összes többi változó fajlagos mennyiségére a mintában. Aitchison (2003) felhívja a figyelmet arra, hogy épp emiatt hiteles korrelációs vizsgálatok nem is végezhetık fajlagos adatsorokon annak ellenére, hogy sok tudományos munkahagyomány mindennapjaiban ez bevett gyakorlat. Mint látjuk, még inkább jelentıssé válik a fajlagosítás okozta probléma, amikor különbözı módszerekbıl nyert, már fajlagosított adatsorokat vonunk be közös statisztikai vizsgálatba. Nem nehéz megérteni, hogy esetünkben miért szüntette meg a fajlagosítás az abszolút adatok esetén tökéletesnek mutatkozó korre-

118


lációt. DNS1 mennyisége kiegyensúlyozott az egész szukcessziós folyamatban, fajlagos mennyiségi grafikonja ugyanakkor elején és végén kissé „lekonyul” a DNS2 és DNS3 markerek mintasor végi illetve eleji nagy mennyiségei miatt. Zsírsav2 marker idıbeli fajlagos mennyiségi változására ugyanakkor e két DNS-marker mennyiségi változása semmiféle hatással nincs (hiszen a fajlagosítás markercsoportokon belül történt), ellenben hatással vannak rá a többi zsírsavak mennyiségi változásai. Hiába keressük tehát kiszemelt változóink kiváló korrelációját fajlagos adatokban, egyikét is, másikét is elváltoztatták a csoportjukon belüli egyéb változások. Amennyiben abszolút mennyiségi adatok nyerése nem lehetséges, Atchison a fajlagos adatok újranormálásának egyik módszeréül azok logaritmizálását javasolja, ami nagyrészt feloldja a fajlagosítás okozta, korrelációszámításokat meghamisító adattorzulást. Bár az abszolút mennyiségek természetes alapú logatitmusaival ugyanúgy megkapjuk a várt korrelációt, mint az alapadatokkal, a fajlagos adatok logaritmizálása nem hozta vissza azt, a korreláció továbbra is gyenge.. A továbbiakban ezért az abszolút menynyiségi adatokat kell vizsgálatainkban felhasználnunk.

a)

(DNS2+DNS3+DNS4) ∟ zsírsav4

b)

1200

600 y = 20.457x - 578.06

1000

500

800

300

y = 10x + 2E-07

400

2

R =1

200

200 100

0 -50 -200 0

50

100

150

0 0

-400

20

40

(DNS1+DNS3) ∟ zsírsav3

160 140 120 100 80 60 40 20 0

V/30. ábra. Összegváltozók korrelációja a tagváltozók termelıinek eltérı típusú közös markerváltozójával a) azonos volumenő markertermelés esetén valamint b) és c) eltérı volumenő markertermelés esetén.

y = 1.1034x + 27.27 2

R = 0.4872

0

119

2

R = 0.6011

400

600

c)

(DNS2+DNS4) ∟ zsírsav1

20

40

60

80

60


A közös marker eltérı nagyságrendő termelése esetén mérhetı korrelációkat a V/30. ábra mutatja. A zsírsav4 markert azonos mennyiségben termelı 2. 3. és 4. fajok DNSmarkereinek összegével (DNS2 + DNS3 + DNS4) várakozásainknak megfelelıen tökéletes korrelációt kapunk (V/30.a. ábra). Abban az esetben azonban amikor a DNS-markereket azonos, a közös zsírsavmarkert ellenben különbözı mennyiségben termelték a fajok, nem látunk jó korrelációt (V/30.b. és c. ábra). Ha megnézzük, mit mutat a szoftverünk által szerkesztett hasonlósági fa (V/31. ábra), láthatjuk, hogy a fenti tapasztalatokkal összhangban megtalálja a jó korrelációkat, de nem talált korrelációt azon változók között, ahol a fentiekben sem találtunk. Teljes korrelációt mutat (DNS2 + DNS3 + DS4) és zsírsav4 változók valamint DNS1 és zsírsav2 változók között (sötétkék keretek). Utóbbiakkal igen jó korrelációval csatlakozik az (ugyancsak az 1. faj által nagy mennyiségben termelt) zsírsav3 (világoskék keret), amelynek teljes korrelációját ezekkel csak a nagy abundanciaértékeket produkáló 3. faj kis mérvő termelése zavarta meg. Szemmel a tökéletestıl megkülönböztethetetlenül jó korrelációt mutat zsírsav1 a fı termelıjének DNS2-markerétıl (szaggatott keret; a korrelációs együttható értéke ez esetben r = 0.999696). Termelıinek DNS-összegváltozójától (DNS2 + DNS4) azonban csak gyenge korrelációt mutat.

D/1+2+4 D/2+4 Zs/1 D/2 D/1+2 D/2+3 D/1+2+3 D/4 D/1+4 D/3+4 D/1+3+4 D/3 D/1+3 Zs/4 D/2+3+4 D/1+2+3+4 Zs/3 Zs/2 D/1

V/31. ábra. Szoftverünk által készített hasonlósági fa eredeti és származtatott összegváltozókkal (Pearson korreláció, átlagos láncmódszer). A keretek a kiemelten magas korrelációjú változópárokat emelik ki (lásd még a fıszövegben). D/ és a piros szín a DNS-markereket mutatja, a számok a markerazonosítók markercsoporton belül. Zs/ és a zöld szín a zsírsavváltozókat jelöli hasonló módon. Az összegváltozók eredeti markercsoportjuk halványított színét öröklik. A tengelyen a korrelációs együttható értékei láthatók.

120


Utólag annak okát sem volt nehéz megérteni, miért nincs jó korreláció eltérı mérvő markerprodukciók esetén, illetve, hogy miért mutat zsírsav1 DNS2-vel sokkal jobb korrelációt, mint (DNS2+DNS4)-gyel. Ha megnézzük a DNS2 és DNS4 markerek, származtatott összegváltozójuk és a zsírsav1 marker idıbeli változását (V/32. ábra), láthatjuk, hogy zsírsav1 érthetı módon annak a termelıjének DNS-markerével mozog együtt, amely a másikhoz képest tízszeres arányban termeli, nem pedig a két DNS-marker összegével. Jól kivehetı ugyanakkor, hogy együttmozgásuk eltérése (szürkített terület az ábrán) továbbra is arányos a kis termeléső 4. faj DNS-markerének (DNS4) mennyiségével az idıben, s nem nehéz kitalálni, hogy az eltérés nagysága épp tizede DNS4 mindenkori mennyiségének, megfelelıen a termelésbeli volumenkülönbség mértékének! Ha (DNS2 + DNS4) származtatott összegváltozó helyett [DNS2 + (DNS4)/10]-et ábrázoltuk volna – vagy [10*(DNS2) + DNS4]-et –, megkaptuk volna a tökéletes (r = 1) korrelációt zsírsav1-gyel. A közös termelésrıl árulkodó információ tehát továbbra is megtalálható az adatokban, csak éppen egyszerő összeadással való változószármazékoltatással könnyen kicsúszik a kezünkbıl eltérı volumenő termelıdések esetén, sıt, két-háromszoros termelési különbség esetén még a fı termelıvel mutatott jó korreláció felismerése is ellehetetlenülhet.

V/32. ábra. DNS-markerváltozók, származtatott összegváltozójuk és termelıik közös zsírsavmarkerének idıbeli változása a szimulált szukcesszióban. A zsírsavváltozó mennyiségét az azonos színő másodlagos tengelyhez igazítottuk. Az ábrán másodlagos tengelyen ábrázoltuk a zsírsavmarker mennyiségének alakulását, hogy jól összevethetı legyen a kisebb mennyiségő DNS-markerek mennyiségeivel. A két tengely skálaosztásának aránya épp tízszeres, hiszen tízszeres mennyiségi szorzóval termelte a nagyobb termeléső 2. faj a zsírsavat a DNSmarkerhez képest.

Sajnos be kellett látnunk, hogy az eltérı volumenő markertermelıdés a baktériumokban várhatóan nem könyvelhetı el esetlegesen jelentkezı, tolerálható hibaforrásként. Tudjuk

121


ugyanis, hogy a baktériumok nem csupán egyféle zsírsavat vagy kinont termelnek, hanem egyszerre többfélét, amelyek közül egyesek dominánsan, míg mások csupán minor komponensekként fordulnak elı bennük. Amelyik marker az egyik fajban fı komponens, a másikban könnyen lehet minor, és ekkor máris az eltérı markerprodukciós ráta esetével állunk szemben. Továbbá könnyő belátni azt is, hogy egy 1 µm átmérıjő kokkusz geometriai okokból közel feleannyi membránzsírsavat termel csupán, mint egy 1 µm átmérıjő, 2 µm hosszúságú bacillusz, miközben DNS-markereik mennyisége között ettıl nem lesz hasonló mennyiségi különbség. Az is tudható továbbá, hogy a baktériumok abban is eltérhetnek, hány riboszomális RNS-operon található a genomjukban (egytıl akár 15-ig is terjedhet az operonszám; Case és mtsai. 2007), ami akkor is befolyásolni fogja a 16S rDNS-markerek megjelenı mennyiségét, ha a preferenciális amplifikáció okozta hibákat nem is vesszük számításba. (Az operonszámbeli eltérések nyilván minden más genetikai markert ugyanígy érinthetnek.) Annak megoldásához, hogy a termelési ráta eltérései ellenére felismerhessük a markerek termelı szerinti összetartozását, ismernünk kellene a két ráta hányadosát [ahogyan a fentebbi példában is megállapítottuk a 10-es (vagy 1/10-es) szorzót], amellyel az eltérı zsírsavtermeléső fajok azonos ráta szerint termelt DNS-markereinek egyikét korrigálva visszakaptuk a várt korrelációt. Valós adatsorok esetében természetesen nem ismerjük a termelési ráták különbségeit. Ugyanakkor feltételezhetjük, hogy ha szorzók alkalmazásával változtatni tudtuk a két megfigyelt változó közötti korrelációs együttható értékét, akkor minden öszszehasonlított markerpár esetében létezik egy olyan arányosító faktor, amely mellett a korreláció közöttük maximális. Ha a példánkban kiválasztott változók esetében ábrázoljuk a Pearson-féle korrelációs együttható értékét (y-tengely) egy szorzó ellenében (ez lesz az xtengelyen ábrázolt futóparaméter), mellyel a DNS markerpár egyik tagjának mennyiségi értékeit összeszorozzuk, akkor egy olyan görbére számítunk, amelynek 0,1-nél vagy 10-nél maximuma van (attól függıen, hogy DNS2-t vagy DNS4-et szoroztuk a futóparaméterrel). Várakozásainknak megfelelıen valóban ilyen görbéket kaptunk (V/33. ábra).

122


r(DNS2*x+DNS4 ∟ zsírsav1)

1,5

a) r

1

1

0,9998

0,5

0,9996 r 0,9994 30

0

-0,5

0

10

20

40

50

0,9992 -1 0,999

-1,5

0

x szorzótényezı [0,001 - 50]

r(DNS4*x+DNS2 ∟ zsírsav1)

1,5

b)

r

0,9998

0,5

0,9996 r 0,9994 30

-0,5

0

10

20

20

30

1

1

0

10

40

50

0,9992 -1 0,999

-1,5 x szorzótényezı [0,001 - 50]

0

0,1

0,2

0,3

V/33. ábra. A Pearson-féle r korrelációs együttható értéke x szorzótényezı ellenében zsírsav1 marker és a: (DNS2*x + DNS4), b: (DNS4*x + DNS2) származtatott változóérték korrelációját vizsgálva. Az ábrák jobb oldalán kinagyítva a maximumhelyek láthatók. ∟ jellel a korrelációs összefüggést jelöltük.

A többi összefüggés ilyetén vizsgálata esetén is hasonló lefutású, egymaximumú görbéket kapunk (ezek bemutatásától terjedelmi okokból eltekintünk). Monoton növekvı, majd a következı szakaszon monoton csökkenı, egymaximumú összefüggések maximumhelyének optimális számú lépésben való kellıen pontos meghatározása könnyen algoritmizálható feladat egy számítógépes programozó számára. Ha szoftverünket továbbfejlesztve képessé tesszük arra, hogy az összegváltozók más változókkal való összehasonlításakor keresse meg azt az arányosító tényezıt is a tagokhoz, mellyel a vizsgált eset korrelációja maximális, leküzdhetjük a kemotaxonómiai markerek eltérı termelési rátáiból fakadó problémát, sıt megoldódik a DNS-markerek termelıjüket alul- vagy felülreprezentáló különbségeiben rejlı hibalehetıségek problémája is. Elvégeztük a szoftverfejlesztésnek ezt a következı lépését is. Jelen dolgozat írásáig csupán kéttagú összegekben képes korrelációt maximalizáló arányosító tényezıt keresni a programunk, az adatkezelés tesztelı bemutatására azonban ez is elegendı. A V/34.a. ábrán látható az új hasonlósági fa, ahol a DNS-markerek összeg-

123


változói már optimális aránytorzítással jelennek meg aszerint, hogy mely szorzótényezıvel mutatják a legnagyobb korrelációt egy-egy zsírsavmarkerrel.

a)

b)

c) V/34. ábra. Szoftverünk által készített hasonlósági fa eredeti és aránytorzított származtatott összegváltozókkal (Pearson korreláció, átlagos láncmódszer). A színes jelek az ábra a) részén a b) és c) részekben kinagyított részfákat jelölik. D/ és a piros szín a DNS-markereket mutatja, a számok a markerazonosítók markercsoporton belül. Zs/ és a zöld szín a zsírsavváltozókat jelöli hasonló módon. A származtatott változók eredeti markercsoportjuk halványított színét öröklik, a második tag neve elıtt olvasható a szorzótényezı, mely mellett maximális korrelációt talált egy zsírsavval a program. A tengelyen a korrelációs együttható értékei láthatók.

A zsírsavakat tartalmazó kinagyított részfákon (V/34.b. és c. ábra) látható, hogy zsírsav1 ezúttal már megtalálja a maximális korrelációját DNS2 és DNS4 összegével, minthogy a program megállapította és hozzárendelte a 0,1-es szorzót DNS4-hez, s ugyanígy tökéletes korrelációt mutat zsírsav3 is a (DNS1+0,01*DNS3) markerrel. A zsírsav2 marker esetében értelemszerően tökéletes a korreláció (1*DNS1) markerrel. A zsírsav4 marker (1*DNS2+1*DNS3+1*DNS4) összeggel mutatna tökéletes korrelációt, mivel azonban szoftverünk egyelıre nem képes kettınél több tagú összegekkel elvégezni a szorzótényezıs optimalizálást, ez a zsírsav a három DNS-marker kéttagú származékaival csoportosul ugyan egy ágra, mindegyiktıl erıs eltérést mutat azonban. Nem várt származtatott változók is feltőnnek a fán, a legnagyobb korrelációkat azonban a keresett kombinációk mutatják. A fa alsó szélén megjelenik egyszerő változóként a DNS2 marker 0,0002-szerese, ami nyilván-

124


valóan nem hordoz értelmes információt. Ez az adatszőrés további optimalizálásának igényére hívja fel figyelmünket. A három- és többtényezıs összegek korrelációsoptimum-keresésében már nem egy görbén, hanem egy tulajdonképpeni adatsíkon kell megtalálnunk a maximumpontot. Az összeg három tagjából egy továbbra is fix maradhat, és a második tag futóparaméteres szorzataival megkeressük a korreláció maximumát, ez után azonban a harmadik tagnak is változnia kell egy másik futóparaméterrel szorozva, s ennek következı értékénél újra meg kell vizsgálnunk az elsı két tag korrelációját a külsı markerrel. A kapott maximumhelyek egy másik tengely mentén új görbét jelölnek ki, ennek maximumát keressük. Természetesen ez idıigényes számítások sorát jelenti még a számítógépnek is, optimalizálás azonban itt is lehetséges. Négy tényezı esetén már csak négy dimenziós ábrán volna szemléltethetı egy adattér maximumpontjának keresése, a keresési metódus azonban nem különbözik lényegileg a háromtényezıs esettıl, csak a számításigény ugrik ismét többszörösére. Okkal vetıdhet fel a kérdés, hogy ha megváltoztatjuk a kiindulási változóinkat, sıt aktívan korrelációs maximumokat keresünk e megváltoztatott változók között, ráadásul oly módon tesszük ezt, hogy éppen az így kapott erıs korrelációkat tekintjük találatnak, azaz kinyert információnak, nem jár-e ez azzal a veszéllyel, hogy mi magunk állítunk elı hamis összefüggéseket, és adatkezelési mőtermékeket ismerünk majd fel a minták valóságáról üzenı információként. A fentebb bemutatott szimulált közösségtörténet adatain és más szimulált adatsorokon is ellenıriztük a nem összetartozó markerek és származtatott változók korrelációinak szorzóparamétertıl való függését (mint ahogyan az V/33. ábrán bemutatott módon néztük meg ugyanezt ismerten összetartozó változókra), és azt találtuk, hogy nem összetartozó markerek esetében vagy végig monoton változó, maximum nélküli görbéket kapunk x futóparaméter függvényében, vagy van a görbének maximuma, ám annak értéke távol esik 1-tıl, vagyis az arányeltolással elérhetı legjobb korreláció is elég rossz. Abban az esetben, amikor a markerek összetartozása „félig igaz”, azaz a származtatott összegváltozó egyik tagja a szimulációban valóban egyazon termelıtıl származik a külsı csoport változójával, míg a másikra ez nem áll, a korreláció egyes ritka esetekben mutatott 1-hez közeli maximumot, ami így hibás találat lehetıségét jelenti. Belátható módon azonban az ilyen esetekre is igaz az, hogy volt egy rejtett összegegyüttmozgás az adatsorban, és mi azt mutattuk ki. (Ne felejtsük, hogy az adatsor mentén sosem módosítottuk egy marker értékeit egymáshoz képest, csupán a teljes markeradatsoron lejátszódott mennyiségi változás más markerekéhez mért együttes arányán változtattunk, így kerestük az „arányfüggetlen” együttmozgásokat.) Mint tudjuk, korreláció adódhat ok-okozati összefüggés nélkül is, és ezt egyszerő korrelációs vizsgálatok értelmezésénél is figyelembe kell venni. A miénkhez hasonló adatkezelési fogásokat nélkülözı korrelációvizsgálatokban is megtréfálhatnak bennünket

125


véletlenül adódó jó korrelációk. Nem kell tehát szembenéznünk új típusú problémával itt sem. A véletlenül adódó erıs korrelációs kapcsolatok várhatóan nem jelentkeznek majd újra a kísérletek ismétléseiben, s az is várható, hogy a mintaszám esetleges bıvítésével illetve a monitorozási sor folytatásával fellazulnak. Érdemes megtekintenünk, milyen eredményre vezet, ha valós adatsorokon próbáljuk ki vázolt adatkezelési módszerünket, még ha jelenlegi programverziónk kettesével képes is csupán származtatott változókká alakítani a kijelölt változócsoport tagjait. A felfőtéses kísérleti minták kemotaxonómiai feldolgozásának egyik célja éppen az volt, hogy ezt megtehessük egy kellıen erıs változásokat mutató adatsorral, így hát az alábbiakban ezen a minta- illetve adatsoron mutatjuk be módszerünk alkalmazhatóságát. Ehhez azonban elıször megfelelı alakba kellett hoznunk az adatokat, hiszen a módszereket egymástól függetlenül alkalmazó kutatásokban általában fajlagos mennyiségek adatsoraival dolgoznak, sıt a TRFLP-vizsgálatokban már a mérési módszer optimalizálásakor kihasználják a fajlagosítás lehetıségét, így ilyen vizsgálatokban általában nem is jutunk teljes abszolút mennyiségi adatmátrixokhoz. A fajlagos mennyiségek azonban esetünkben – mint azt fentebb bizonyítottuk – nem alkalmazhatók, így valahogyan vissza kellett formálnunk az adatokat az eredeti mennyiségeket reprezentáló alakra. A kinonok esetében ez nem okozott nehézséget, mivel a HPLC-kromatogram görbe alatti területei egyértelmően arányosíthatók az egyes kinonok mintabeli mennyiségeivel. A zsírsavak esetében nehézség, hogy a gázkromatográfiás méréskor alkalmazott lángionizációs detektor alapvetıen az áthaladó szénmennyiség alapján ad jelet, így a csúcsok nagysága nem csak a mért zsírsav-metilészter mennyiségétıl, de a molekula méretétıl is függ. A mintabeli zsírsavmolekulák anyagmennyiségét ezért úgy becsültük vissza, hogy a mennyiségi nyersadatokat (görbe alatti területeket) minden zsírsav esetén elosztottuk annak szénatomszámával (a ligandumok illetve telítetlen kötések hatását elhanyagoltuk). Bár az így kapott adatok nem mennyiséget jelentenek, a mennyiségekkel mégis arányosak, s így az adatmátrixban egymástól független, abszolút adatokat biztosítanak. A legnehezebb a T-RFLP eredmények visszaalakítása volt, mivel már a méréskor olyan hígításban kerültek injektálásra a preparátumok, hogy a kis és nagy csúcsok egyaránt láthatóak legyenek (tekintet nélkül az eredetei amplikonmennyiségek visszakövethetıségére, mivel az általában nem szükséges). Ráadásul a külön reakcióban felszaporodó PCRtermékmennyiségek az egymás közötti mennyiségi összevetések céljára megbízhatatlanok. Ezért szükség esetén általában külön e célból alkalmazott kvantitatív PCR (Q-PCR) módszerrel végzik a felszaporítást, melybıl a kiindulási mennyiségek visszaszámolhatók. Esetünkben Q-PCR alkalmazására nem került sor. Megoldásként ezért azt választottuk, hogy mivel a foszfolipidek mennyiségét úgyis régóta alkalmazzák biomasszabecslésre (Tunlid és mtsai. 1985), mi is kihasználjuk ebbéli alkalmasságukat. A foszfolipid-zsírsavak abszolút

126


mennyiségeinek összegzésével a kiindulási mintabiomasszák mennyiségét reprezentáló adatokhoz jutottunk, amelyekkel mintánként visszaarányosítottuk a T-RF-csúcsok fajlagos értékeit (mintákon belül aránytartó módon). Ez a szükségmegoldás elvileg helyes ugyan, mégis annyi gyakorlati hiba lehetıségét rejti, hogy a jövıbeli hasonló vizsgálatok esetére mindenképpen javasolt Q-PCR vagy egyéb módszerek bevezetése az abszolutizált mennyiségi adatok visszanyerhetısége érdekében. Az itt tárgyalt elemzések erejéig azonban a fenti lehetıséggel kellett beérnünk, s az adatkezelésnek az így visszaalakított mennyiségeket vetettük alá. Mivel ahogy a szimulált adatsorok példáján is látható, a származtatott változókat is tartalmazó fán az eredeti markerek számát többszörösen meghaladó számú változó kerül feltüntetésre, a sokkal több adatot tartalmazó valódi adatsorok eredményfái temérdek adatot tartalmaznak. Programunk képes ugyan a fák részleteinek kinagyítására és pásztázására, a fák egészének ábrázolása nyomtatásban azonban igen nehezen volna kivitelezhetı. Rengeteg változó kap helyet a fán akkor is, ha csak a legerısebb 500 hasonlóság változói kerültek rá, és csupán a zsírsavakat, a kétféle DNS markertípust (Alu és Bsu T-RF-ek) és ezek kéttagú összegváltozóit tartalmazta az analízis (egy ilyen fát szemléltetı jelleggel bemutatunk a Függelékben: F/1 ábra). A nagymérető, egyszínő, markertípusra nézve homogén részfák sok helyet foglalnak el a fán, miközben ezek érdemi információt nem hordoznak számunkra. Ez az esetszőrés további fejlesztésének igényére mutat rá. Ha azonban megnézzük a markertípusokra nézve heterogén farészleteket, megtalálhatjuk a keresett markercsoportosulásokat. Az V/35. ábrán legfölül látható zsírsavmarker a C18:0, amely jó korrelációt mutat az (Alu236-37+0.3644*Alu243) összegváltozóval (r=0.9464), amelyben a két T-RF-marker épp a Levilinea saccharolitica illetve a Longilinea arvorisae rokonfajok azonosított markerei (V/2. táblázat, 93. old.). Az összegváltozó mellé csoportosul egy másik is, melyben ugyancsak az Alu243 marker szerepel az Alu159-cel együtt. A C18:0 zsírsav mintáink egyik állandó, jelentıs arányban elıforduló markermolekulája (V/19. ábra), ugyanakkor pedig az élıvilág egyik legáltalánosabb membránlipid-alkotója. Így nagyon is feltételezhetı, hogy a felfőtéshez adaptálódott közösségeink két igen jellemzı tagja hordozza ezt a molekulát, és mennyiségi arányváltozásaik eléggé megszabták az ugyancsak nagyarányú zsírsavmarker mennyiségének idıbeli lefutását ahhoz, hogy a korrelációs fán egymás mellé rendelıdjön a két DNSmarker és a zsírsav. (Ne feledjük, hogy a korrelációs hasonlóság érzéketlen az adatok abszolút értékére, így nem a mennyiségi dominancia ténye jelenik meg a hasonlóságban, csupán az idıbeli együttmozgások.) A közös ágon megjelenı harmadik T-RF (Alu159) vélhetıleg a zsírsav egy harmadik termelıjének markere, amely azért nem kapott helyet az elıbbi összegváltozóban, mert a programunk eddig csak két tényezı arányoptimáló összegzésére képes. Mint azt láttuk a szimulált közösségünk elemzésében (V/34. ábrán a zsírsav4

127


marker termelıinek esete), az összefüggésben szereplı egyéb markerek ilyen esetben is közeli ágra kerülhetnek egy másik összegváltozó részeként.

V/35. ábra. A felfőtéses kísérlet zsírsavai és összegzett T-RF adatai alapján készült hasonlósági fa kiemelt részlete.

Amennyiben elemzésünk a valóságot tükrözi, máris hozzárendelt egy fenotipikai bélyeget az egyébként tenyésztésbe még nem vont L. saccharolitica- és L. arvorisae-rokon fajokhoz, s a szorzótényezı értékébıl az is sejthetı, hogy elıbbi körülbelül háromszorosát termeli a C18:0 zsírsavnak, mint az utóbbi (legalábbis azonos mérvő T-RF-reprezentáltságuk esetén). Az eredmény emellett feloldani látszik a felfőtéses kísérletben tapasztalt ellentmondást a DNS-markerek erıs idıbeli változása és a zsírsavmarkerek viszonylagos állandósága között. Az átfedı termelıdések miatt az általánosabb markerek körében kikompenzálódhatnak a termelık mennyiségi ingadozásai. Eközben azonban az általuk hordozott információ nem vész el feltétlenül. További két zsírsav (izo C16:0 és anteizo C13:0) egyértemlően párba rendezıdik a fán egyegy összegváltozóval [(Bsu197-99+0,0535*Bsu263) illetve (Bsu255+0,6842*Bsu318), r = 0,9483 illetve 0,9600], egy zsírsav pedig (F/1. ábra, piros nyíl), az izo C14:0, amely párban áll az (Alu194+0,4704*A193) összegváltozóval (r = 0,9533). Ezek a zsírsavak ez alapján tehát egészében vagy fıként két termelıtıl származhatnak, melyeket a két T-RF-marker jelez. A farészleten látható többi zsírsavak (és az F/1. ábra néhány másik zsírsava) néhány T-RF markert variáló változócsoportokkal kerültek szomszédságba. Ezek valószínőleg kettınél több termelı szervezettıl származnak, s T-RF-értékeiket egy több tényezıs összegeket alkotó szoftver-verzió remélhetıleg egységes összegváltozóba lesz képes sőríteni.

128


Eddig csupán azt az adatpárosítási lehetıséget tanulmányoztuk, amikor zsírsavakat rendelünk valószínő termelıik DNS-markereinek összegéhez. Más adatpárosítási lehetıségek is adottak azonban, melyek közül több is értelmes felhasználás lehetıségét vetíti elıre: •

Zsírsavak párosítása T-RF -marker-összegekkel: ezt tanulmányoztuk eddig. Átfe-

dı zsírsavtermeléső közösségalkotókat párosít a közös zsírsavmarkerrel. •

Kinonok párosítása T-RF-marker-összegekkel: átfedı kinontermeléső közösség-

alkotókat párosít a közös kinonmarkerrel. •

Kinonok párosítása zsírsavösszegekkel vagy fordítva: Természetesen lehetséges,

hogy két faj ugyanazt a kinont termelje, miközben más zsírsavakat termelnek (vagy fordítva). Az ilyen összefüggések azonosítására alkalmas ez a párosítás. •

T-RF-markerek párosítása zsírsav- vagy kinonösszegekkel: az elıbbi logika meg-

fordítása. Akkor lehet értelme, ha például kis fajszámú közösség némely tagjában környezeti változások hatására markáns zsírsav- vagy kinontípusváltás történik. Ilyenkor a T-RFmarker mennyisége fog korrelálni a váltásban érintett kemotaxonómiai markerek összegével. •

T-RF-markerek párosítása másik típusú T-RF markerek összegeivel: amikor két

közösségalkotó az egyik hasítóenzimmel ugyanazt a T-RF markert adja, a másik hasítóenzimmel azonban elkülönülnek egymástól (ld. például a Defluviitoga tunisiensis és Aminobacterium colombiense esetét az V/2. táblázatban, 93. old.), akkor ez a viszony feltáródhat az elemzésben. Ezekkel a kombinációkkal is elvégeztük az elemzést és a legegyértelmőbb találatokat kigyőjtöttük (V/4. táblázat). Így mind a menakinonokhoz, mind az ubikinonokhoz találtunk néhány hozzárendelhetı T-RF-et. Különös módon a kinonok párosítása a zsírsavak összegváltozóival nem hoztak eredményt, jóllehet minden kinontermelı baktériumnak kell legyenek membránzsírsavai. Valószínőleg a respiratórikus kinonokat nem termelı fermentáló baktériumok dominanciája folytán az adatsorokra rakódó „kinonfüggetlen” zsírsavtömegek takarják el a keresett összefüggéseket. A hasonlósági fán az látható, hogy a kinon- és zsírsavváltozók gyakorlatilag nem keverednek, hanem homogén, távol álló ágakba tömörülnek a fán (ld. a Függelékben az F/2. ábrát). Ez az eredmény azonban kifejezetten megnyugtató abból a szempontból, hogy láthatóan nem jelennek meg tömegesen adatkezelési mőtermékként véletlenül adódó erıs korrelációk a fákon. Hasonló eredményre jutottunk, amikor TRF markereket rendeltünk zsírsavösszegekhez. A markertípusok külön csoportosultak a fán (ld. a Függelékben az F/3. ábrát). E szerint tehát nem történt módszerünkkel azonosítható zsírsav-váltás a közösségalkotó szervezetek egyikében sem.

129

V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK önállóan vizsgált változó

a származtatott öszszegváltozó elsı tagja

szorzótényezı

a származtatott összegváltozó második (szorzott) tagja

a korrelációs együttható (r) értéke

izo C16:0 anteizo C13:0

Bsu197-99 Bsu255

+ +

0,0535* 0,6842*

Bsu263 Bru318

0,9483 0,9600

C16:0 ω7c

Bsu280

+

0,5401*

Bsu504-05

0,9802

izo C14:0 anteizo C17:0

Alu149 Alu159

+ +

0,7404* 0,0064*

Alu197 Alu243

0,9533 0,9874

C18:0

Alu236-37 Alu159 Bsu255 Bsu325 Bsu297 Alu159 Alu159 Alu159

+ + + + + + + +

0,3644* 0,0239* 0,1245* 1,0235* 0,7547* 0,8626* 0,1579* 0,1139*

Alu243 Alu243 Bsu519-22 Bsu519-22 Bsu519-22 Alu193 Alu504-05 Alu504-05

0,9463 0,9741 0,9773 0,9669 0,9783 0,9550 0,9531 0,9619

C20:0

Bsu219-20 Bsu201 Alu233

+ + +

7,6987* 0,1277* 4,0771*

Bsu282 Bsu219-20 Alu197

0,9675 0,9670 0,8825

C20:1 ω9c

Bsu228 Bsu228 Bsu228 Bsu228

+ + + +

0,6910* 0,1437* 0,1021* 1,1219*

Bsu255 Bsu297 Bsu325 Bsu22

0,9650 0,9808 0,9873 0,8852

MK5(H2) MK10(H6)

Alu066 Alu066

+ +

0,1029* 0,0565*

Alu526 Alu083simC.p.

0,8501 0,9503

MK6(H4)

Bsu076

+

0,0271*

Bsu304-05simD.t.

0,8730

MK5

Bsu185

+

0,0900*

Bsu236

0,8568

Q9+2 unid

Alu094

+

0,1223*

Alu147

0,9972

Q7 Q8

Bsu203 Bsu228

+ +

0,1032* 1,6193*

Bsu294 Bsu282

0,9719 0,9248

Alu225 Bsu230

Bsu185 Alu236-37 L.s.

+ +

2,0929* 0,1777*

Bsu203 Alu519-21

0,9980 0,9857

izo C13:0

izo C15:0

V/4. táblázat. Kiemelten erıs csoportosulások eredeti és származtatott változók között. A zsírsavakhoz öt ízben több származtatott T-RF-összegváltozó is járul egy közös ágon. A származtatott összegváltozók tagjai tetszılegesen felcserélhetık, ebben az esetben a szorzótényezı reciproka érvényes.

A kinonok T-RF markerekkel keresett összefüggéseiben is találtunk közeli korrelációkat (V/4. táblázat). Az esetek többségében taxonómiailag nem rokonított T-RF-markerekkel adódtak összefüggések, két esetben azonban az Alu083 (C. proteoliticus) és a Bsu304-05 (D. tunisiensis) markerei korreláló összegváltozóbba kerültek kis szorzóval. A C. proteoliticus esetében a MK10(H6) kinon termelése nem várható, mivel ez a faj obligát fermentáló (Ollivier és mtsai. 1985), nem zárható ki teljességgel ugyanakkor, hogy anaerob légzésre is képes közeli rokona él közösségeinkben. A D. tunisiensis esetében azonban egyenesen várjuk kinonmarker megjelenését, mivel kénlégzı szervezetrıl van szó (Hania és mtsai. 2011), így a MK6(H4) megléte elfogadható. (A fajleírás sajnos nem számol be

130


kinonvizsgálatról). Ha így is van, a kinont mindenképpen jóval kisebb arányban termeli (0,0271 szorzóval került a változóba), mint a Bsu076 marker gazdája, akirıl jelenléte tényén kívül sajnos nem tudunk semmit. A T-RF-markerek másik T-RF-markercsoporttal keresett összefüggéseiben szintén találtunk néhány markáns összefüggést. Az egyetlen olyan összefüggés, amelyre elıre számíthattunk a klónok vizsgálata alapján, az a Defluviitoga tunisiensis és Aminobacterium colombiense-rokon fajok által egyaránt termelt Alu75-ös marker várható csoportosulása lenne a két szervezet külön Bsu-T-RF-ének arányoptimált összegével (Alu305+x*Alu279). Valószínő, hogy az A. colombiense kis mennyiségi aránya miatt nem találtuk meg ezt az összefüggést, ehelyett az Alu75 marker a (Bsu304-05+6,3555*Bsu504-05) származékváltozóval áll párban. A Defluviitoga tunisiensis esetében fennálló összefüggés tehát kiderül, hisz a származtatott változó elsı tagja ennek a szervezetnek a markere, ugyanakkor felhívja a figyelmünket az eredmény, hogy az Alu75-ös markernek lehetett egy igen jelentıs harmadik termelıje is a közösségben, melyet klónból nem sikerült azonosítani, Bsu enzimmel ugyanakkor ez adhatja a Bsu504-05-ös T-RF-et. Ez arra figyelmeztet, hogy az Alu75-ös fragment mennyiségei alapján akkor se vonjunk le bátor következtetést a D. tunisiensis faj abundanciaváltozásait illetıen, ha a másik enzimmel adott T-RF-ek alapján az A. colombiense-rokon szervezet miatt ezt akár meg is tehetnénk. Hogy megbízhatóbb és finomabban kirajzolódó eredményeket kapjunk, illetve hogy az értelmezés esetlegességeitıl minél jobban megszabadulhassunk, többféle optimalizációs lehetıségünk kínálkozik a jövıre nézve. A mintakezelés és preparálás szintjén fokozottan kell ügyelni a pontosságra a megkívánt abszolút mennyiségi adatok megbízhatósága érdekében. A DNS-amplifikáció mennyiségi követhetıségét minél inkább biztosítani kell (pl. kvantitatív PCR alkalmazásával). A szoftverfejlesztés szintjén megoldandó a három- és többtagú összegváltozók arányoptimáló elıállítása, valamint a feleslegesen generált változók hatékonyabb szőrése. Mesterségesen szimulált, nagy faj- és markerszámú közösségek idısori adatainak elemzésével valamint mesterségesen elıállított, ismert fajkészlető és abundanciaarányú baktériumkeverékek gyakorlati analízisével tesztelni lehetne az adatkezelési illetve egyéb (pl. preparációs) módszertani korlátokat, jel-zaj arányokat, meg lehetne állapítani szükséges korrekciós faktorokat és a következtetésekben alkalmazandó hihetıségi küszöböket is.

131

VI. ÖSSZEFOGLALÁS

VI. ÖSSZEFOGLALÁS A metántartalmú biogáz termelıdésének mikrobiológiai háttere elméleti és gyakorlati szempontból egyaránt fontos kérdéseket vet fel a tudomány számára. Mivel a biogáz termelését mindig egy komplex mikrobaközösség végzi, melynek tagjai bonyolult kölcsönhatásrendszerben mőködnek együtt, érdemes a közösséget magát vizsgálnunk, mintsem izolált tagjait külön-külön. Erre kínálnak lehetıséget a régóta alkalmazott ujjlenyomat-módszerek, melyek a közösség taxonómiai összetételére és/vagy metabolikus állapotára jellemzı mintázatokat adnak. Ezen mintázatok azután összevethetık, és – a módszer jellegének megfelelıen – értelmezhetık. Alkalmazásukat nagyban megkönnyítik az ellenırizhetı körülményeket és több párhuzamos vizsgálat lehetıségét biztosító laboratóriumi léptékő kísérleti modellrendszerek (kis térfogatú biogázreaktorok). Utóbbiak mőködési állapotáról gáztermelésük mérése alapján nyerhetünk legegyszerőbben információt. Ezen szempontoknak megfelelıen egyik célunk egy modellreaktorok gázhozamának mérésére alkalmas, egyszerő mérési módszer kidolgozása volt. További célunk biogáztermelı közösségek vizsgálata volt ujjlenyomatmódszerekkel: (a) egy mezofil és egy termofil

biogáztermlı

mikrobaközösség összehasonlítása,

(b)

könnyen

bontható

szubsztrátok adagolásának hatásvizsgálata mezofil közösségeken, és (c) egy mezofilról termofil hımérsékletre való felfőtési folyamat hatásának monitorozása. Utóbbi munkáinkhoz kapcsolódóan célunk volt végül egy adatkezelési módszer kidolgozása is, melynek alkalmazásával kimutathatjuk a különbözı módszerekkel létrehozott közösségi mintázatok elemeinek közös termelı szervezetektıl való származását. Munkánk során sikerrel kifejlesztettünk, kalibráltunk és teszteltünk egy buborékszámláláson és -mérésen, valamint mintázatfelismerı számítógépes program használatán alapuló volumetriás gázhozammérési módszert. Sikeresen feltártuk egy mezofil és egy termofil hımérsékletoptimumú biogáztartermelı mikrobaközösség szerkezetét, s összetételükben, valamint marker-készletükben is jellegzetes különbségeket állapítottunk meg. A gázhozam és a mikrobiológiai markerkészlet alakulásában is tetten értük a könnyen bontható szubsztrátok adagolásának hatását modellrendszerünkben. Bacteroidetes dominanciájú közösségünk ugyanakkor igen stabilnak bizonyult, így a szubsztrátváltások csak csekély változásokat okoztak a közösség összetételében. A korábban említett markermolekulák vizsgálatával követtük nyomon két félüzemi reaktor felfőtésének folyamatát, s az ezzel járó közösségátrendezıdést. Mindhárom markertípus (kinonok, zsírsavak és DNS-markerek) koherensen leképezte a közösségváltozást. Végül kidolgoztunk és szimulált adatsorokon teszteltünk egy sokváltozós adatkezelési módszert, mely több, párhuzamosan alkalmazott ujjlenyomatmódszer eredményének közös elemzésére alkalmas. Lényege, hogy eredeti mar-

132

VI. ÖSSZEFOGLALÁS

kermennyiségek és eltérı markertípusok elemeibıl származtatott összegváltozók mintasori mennyiségeinek aránytorzító összevetésekor korrelációs optimumokat keres, így kimutatja azokat az idıbeli együttmozgásokat, melyek az átfedı markertermelések miatt rejtve maradtak az eredeti adatsorokban, s közös termelı szervezet létére utalnak. Ilyen analízisnek alávetve felfőtéses vizsgálatunk nyersadatait, az elvi megfontolások és a szakirodalmi adatok tükrében is jól értelmezhetı, ígéretes eredményeket kaptunk.

133

VII. SUMMARY

VII. SUMMARY The microbial background of the production of methane containing biogas raises a series of important scientific questions of both theoretical and practical nature. As biogas is always produced by a complex microbial consortium ruled by complicated interactions, it is worth to investigate the community itself rather than the individual members separately. The well-established fingerprint-methods provide an opportunity to do this. These methods produce specific patterns according to the taxonomic composition and/or the methabolic state of the microbial community. These patterns can be compared to each other and interpreted depending on the nature of the method used. Laboratory-scale biogas producing model systems offer highly controllable circumstances and the opportunity of several parallel experiments, thereby facilitating the application of fingerprint methods. Information on the operating status of these small volume reactors can be easily obtained by measuring their gas production. Based on the above considerations the first aim of our work was to develop a simple, easy-to-use method for measuring the gas yield of small scale bioreactors. The second aim was to investigate biogas producing microbial communities using fingerprinting methods: (a) comparing a mesophilic and a thermophilic community of a biogas reactor, (b) studying the effect of easily degradable substrate feeding on mesophilic communities, and (c) monitoring the effect of a heating up process from mesophilic to thermophilic temperature. Connected to the latter work, a final objective was to develop a data management method which enables us to demontsrate the existence of common producers of individual elements making up the different fingerprint patterns. As a result we successfully developed, calibrated and tested a volumetric gas yield measurement system based on counting and measuring bubbles, utilizing a pattern recognition software. The structure of a mesophilic and a thermophilic biogas producing microbial community was successfully explored and characteristic differences were established both in the taxonomic composition and the marker set of the samples. The effect of easily degradable substrate feeding was observable in the changes of gas yield and marker set as well. The investigated communities were dominated mainly by Bacteroidetes, they proved to be highly stable, so that substrate shifts led only to slight changes in the composition. The heating up process and the following community structure change was monitored using three molecular marker types. All three marker types (quinones, fatty acids and DNA-biomarkers) coherently reflected the community change. Finally, a multivariate data analysis method was developed and tested with simulated data rows. The essence of the method is to search for correlation optima in a comparison process, during which

134

VII. SUMMARY

original data variables and derived sum-variables from several marker types are compared in a ratio distorting way. With the help of this method several co-movements over the time can be pointed out in the marker population, which remain hidden in the original data structure, but suggest the existence of common producing organisms. The raw data from the heating up experiment were analyzed in this manner and the results were well interpretable in the light of theoretical considerations and the literature.

135

VIII. IRODALOMJEGYZÉK

VIII. IRODALOMJEGYZÉK Abbasi T., Tauseef S. M., Abbasi S. A. (2012) A brief history of anaerobic digestion and “biogas”. In: Biogas and Biogas Energy, SpringerBriefs in Environmental Science, 11-23 Ahmed Z., Cho J., Lim B. R., Song K. G., Ahn K. H. (2007) Effects of sludge retention time on membrane fouling and microbial community structure in a membrane bioreactor. J. Membr. Sci. 287(2): 211-218 Ahn J. H., Mathiesen N. L. (2002) The effect of temperature variations on the performance of mesophilic and thermophilic anaerobic filters treating a simulated papermill wastewater. Process Biochem. 37(6): 589-594 Aitchison J. (2003) A concise guide to compositional data analysis. CDA Workshop, Girona Altschul S. F., Madden T. L., Schäffer A. A., Zhang J., Zhang Z., Miller W., Lipman D. J. (1997) Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402 Amir S., Merlina G., Pinelli E., Winterton P., Revel J. C., Hafidi M. (2008) Microbial community dynamics during composting of sewage sludge and straw studied through phospholipid and neutral lipid analysis. J. Hazard. Mater. 159(2): 593-601 Angelidaki I., Ellegaard L., Ahring B. K. (1992) Compact automated displacement gas metering system for measurement of low gas rates from laboratory fermentors. Biotechnol. Bioeng. 39(3): 351-353 Ariesyady H. D., Ito T., Okabe S. (2007) Functional bacterial and archaeal community structures of major trophic groups in a full-scale anaerobic sludge digester. Water Res. 41(7): 1554-1568 Ashelford K. E., Chuzhanova N. A., Fry J. C., Jones A. J., Weightman A. J. (2006) New screening software shows that most recent large 16S rRNA gene clone libraries contain chimeras. Appl. Environ. Microbiol. 2(9): 5734-5741 Baena S., Fardeau M. L., Labat M., Ollivier B., Thomas P., Garcia J. L., Patel B. K. C. (1998) Aminobacterium colombiense gen. nov. sp. nov., an amino acid-degrading anaerobe isolated from anaerobic sludge. Anaerobe 4(5): 241-250 Bardgett R. D., Leemans D. K., Cook R., Hobbs P. J. (1997) Seasonality of the soil biota of grazed and ungrazed hill grasslands. Soil Biol. Biochem. 29(8): 1285-1294 Beaubien A., Jolicoeur C., Alary J. F. (1988) Automated high sensitivity gas metering system for biological processes. Biotechnol. Bioeng. 32(1): 105-109 Beeftink H. H., Staugaard P. (1986) Structure and dynamics of anaerobic bacterial aggregates in a gas-lift reactor. Appl. Environ. Microbiol. 52(5): 1139-1146 Bischoff M. (2009) Erkenntnisse beim Einsatz von Zusatz- und Hilfsstoffen sowie von Spurenelementen in Biogasanlagen. VDI-Ber 2057:111-123 Bligh E.G., Dyer W.J. (1959) A rapid method of total lipid extraction and purification. . J. of Biochem. 37(8): 911-917 Boadi D., Benchaar C., Chiquette J., Massé D. (2004) Mitigation strategies to reduce enteric methane emissions from dairy cows: Update review. Can. J. Anim. Sci. 84(3): 319-335 Boga H. I., Brune A. (2003) Hydrogen-dependent oxygen reduction by homoacetogenic bacteria isolated from termite guts. Appl. Environ. Microbiol. 69(2): 779-786 Burns S.J., Fleitmann D., Mudelsee M., Neff U., Matter A., Mangini A. (2002) A 780-year annually resolved record of Indian Ocean monsoon precipitation from a speleothem from south Oman. J. Geophys. Res. 107(D20): 4434 Case R. J., Boucher Y., Dahllöf I., Holmström C., Doolittle W. F., Kjelleberg S. (2007) Use of 16S rRNA and rpoB genes as molecular markers for microbial ecology studies. Appl. Environ. Microbiol. 73(1): 278-288

136


Chouari R., Le Paslier D., Daegelen P., Ginestet P., Weissenbach J., Sghir A. (2005a) Novel predominant archaeal and bacterial groups revealed by molecular analysis of an anaerobic sludge digester. Environ. Microbiol. 7(8): 1104-1115 Chouari R., Le Paslier D., Dauga C., Daegelen P., Weissenbach J., Sghir A. (2005b) Novel major bacterial candidate division within a municipal anaerobic sludge digester. Appl. Environ. Microbiol. 71(4): 2145-2153 Collins M. D., Jones D. (1981) Distribution of isoprenoid quinone structural types in bacteria and their taxonomic implication. Microbiol. Rev. 45(2): 316-354 Córdova-Kreylos A. L., Cao Y., Green P. G., Hwang H. M., Kuivila K. M., LaMontagne M. G., Van De Werfhorst L. C. Holden, P. A., Scow, K. M. (2006) Diversity, composition, and geographical distribution of microbial communities in California salt marsh sediments. Appl. Environ. Microbiol. 72(5): 3357-3366 Crosby L. D., Criddle C. S. (2003) Understanding bias in microbial community analysis techniques due to rrn operon copy number heterogeneity. Biotechniques 34(4): 790-803 Czigler A. (2010) Mikrobiális ujjlenyomatmódszerek változóinak összefüggés-vizsgálata. Szakdolgozat. Eötvös Loránd Tudományegyetem, Numerikus Analízis Tanszék, Budapest Czupy I., Vágvölgyi A. (2011) Mezıgazdasági (növénytermesztés, állattartás, erdészeti) hulladékok kezelése és hasznosítása. Pannon Egyetem, Környezetmérnöki Intézet. http://www.tankonyvtar.hu/hu/tartalom/ tamop425/0021_Mezogazdasag_hulladekai/adatok.html Dean F. B., Hosono S., Fang L., Wu X., Faruqi A. F., Bray-Ward P., Lasken R. S. (2002) Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification. Proc. Natl. Acad. Sci. 99(8): 5261-5266 Dissing U., Ling T. G. I., Mattiasson B. (1984) Monitoring of methanogenic processes with an immobilized mixed culture in combination with a gas-flow meter. Anal. Chim. Acta 163:127-133 Djukic I., Zehetner F., Mentler A., Gerzabek M. H. (2010) Microbial community composition and activity in different Alpine vegetation zones. Soil Biol. Biochem. 42(2): 155-161 Elhottová D., Koubová A., Šimek M., Cajthaml T., Jirout J., Esperschuetz J., Schloter M., Gattinger, A. (2012) Changes in soil microbial communities as affected by intensive cattle husbandry. Appl. Soil Ecol. 58: 56-65 Esposito G., Weijma J., Pirozzi F., Lens P. N. L. (2003) Effect of the sludge retention time on H2 utilization in a sulphate reducing gas-lift reactor. Process. Biochemistry. 30(4): 491498 Etchebehere C., Pavan M. E., Zorzopulos J., Soubes M., Muxi L. (1998) Coprothermobacter platensis sp. nov. a new anaerobic proteolytic thermophilic bacterium isolated from an anaerobic mesophilic sludge. Int. J. Syst. Bacteriol. 48(4): 1297-1304 Exner F. (1875) Über den Durchgang der Gase durch Flüssigkeitslamellen. Pogg. Ann. 155:321-336 Fernandez A. S., Hashsham S. A., Dollhopf S. L., Raskin L., Glagoleva O., Dazzo F. B., Tiedje J. M. (2000) Flexible community structure correlates with stable community function in methanogenic bioreactor communities perturbed by glucose. Appl. Environ. Microbiol. 66(9): 4058-4067 Ferry J. G. (1994) Fermentation of acetate. In: Methanogenesis: Ecology, Physiology, Biochemistry, Genetics, ed. Ferry, J. G., Chapman and Hall, New York Findlay R. H. (1996) The use of phospholipid fatty acids to determine microbial community structure. Molecular Microbial Ecology Manual 4(4): 1-17

137


Frey B., Stemmer M., Widmer F., Luster J., Sperisen C. (2006) Microbial activity and community structure of a soil after heavy metal contamination in a model forest ecosystem. Soil Biol. Biochem. 38(7): 1745-1756 Frostegård Å., Tunlid A., Bååth E. (1993) Phospholipid fatty acid composition, biomass, and activity of microbial communities from two soil types experimentally exposed to different heavy metals. Appl. Environ. Microbiol. 59(11): 3605-3617 Fujie K., Hu H. Y., Tanaka H., Urano K., Saitou K., Katayama A. (1998) Analysis of respiratory quinones in soil for characterization of microbiota. Soil Sci. Plant Nutr. 44(3): 393-404 Gao B., Gupta R. S. (2007) Phylogenomic analysis of proteins that are distinctive of Archaea and its main subgroups and the origin of methanogenesis. BMC genomics 8(1): 86 Gattinger A., Günthner A., Schloter M., Munch J. C. (2003) Characterisation of Archaea in soils by polar lipid analysis. Acta Biotechnol. 23(1): 21-28 Gehron M. J., David C W. (1983) Sensitive assay of phospholipid glycerol in environmental samples. J. Microbiol. Methods 1(1): 23-32 Gibbs R. D. (1974) Chemotaxonomy of flowering plants. I-IV. McGill-Queen's univ Press. Montreal London, 1-680 Glauser M., Jenni B., Aragno M. (1984) An inexpensive, automatic gas meter for laboratoryscale methane digesters and other gas-evolving systems. J. Microbiol. Meth. 2(3): 159164 Gómez-Brandón M., Lores M., Domínguez J. (2010) A new combination of extraction and derivatization methods that reduces the complexity and preparation time in determining phospholipid fatty acids in solid environmental samples. Biores. Tech. 101(4): 1348-1354 Gorin P. A. J., Spencer J. F. T. (1970) Proton magnetic resonance spectroscopy–an aid in identification and chemotaxonomy of yeasts. Adv. Appl. Microbiol. 13:25-89 Green C. T., Scow K. M. (2000) Analysis of phospholipid fatty acids (PLFA) to characterize microbial communities in aquifers. Hydrogeol. J. 8(1): 126-141 Grimes D. J., Atwell R. W., Brayton P. R., Palmer L. M., Rollins D. M., Roszak D. B., Colwell R. R. (1986) The fate of enteric pathogenic bacteria in estuarine and marine environments. Microbiol. Sci. 3(11): 324 Hammer Ř., Harper D. A. T., Ryan P. D. (2001) PAST: Paleontological statistics software package for education and data analysis. . Paleontol. Elecrtonica 4(1): 1-9 Hania W. B., Godbane R., Postec A., Hamdi M., Ollivier B., Fardeau M. L. (2011) Isolation and characterization of Defluviitoga tunisiensis gen. nov, sp. nov., a novel thermophilic bacterium pertaining to the order Thermotogales, isolated from a mesothermic anaerobic reactor treating cheese whey in Tunisia. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. doi: 10.1099/ijs.0.033720-0 Hanif M., Atsuta Y., Fujie K., Daimon H. (2012) Supercritical Fluid Extraction and Ultra Performance Liquid Chromatography of Respiratory Quinones for Microbial Community Analysis in Environmental and Biological Samples. Molecules 17(3): 2628-2642 Harborne J. B., Boulter D. Turner, B. L. (1971) Chemotaxonomy of the Leguminosae. Academic Press, London and New York Hawksworth D. L. (1976) Lichen chemotaxonomy. In: Lichenology: progress and problems, ed. Brown D. H., Hawksworth D. L., Bailey R. H., Academic Press, London, 139-184 Hedrick D. B., White D. C. (1986) Microbial respiratory quinones in the environment: I. A sensitive liquid chromatographic method. J. Microbiol. Methods 5(5): 243-254 Hiraishi A., Morishima Y., Takeuchi J. I. (1991) Numerical analysis of lipoquinone patterns in monitoring bacterial community dynamics in wastewater treatment systems. J. Gen. Appl. Microbiol. 37(1): 57-70

138


Höfle M. G. (1988) Taxonomic structure of bacterial communities in mixed cultures as measured by low molecular weight RNA profiles. Arch. Hydrobiol. Beih. Ergebn. Limnol 31:71-77 Hu H. Y., Fujie K., Nakagome H., Urano K., Katayama A. (1999a) Quantitative analyses of the change in microbial diversity in a bioreactor for wastewater treatment based on respiratory quinones. Water Res. 33(15): 3263-3270 Hu H. Y., Fujie K., Urano K. (1999b) Development of a novel solid phase extraction method for the analysis of bacterial quinones in activated sludge with a higher reliability. J. Biosci. Bioeng. 87(3): 378-382 Ibekwe A., Kennedy A. C. (1998) Phospholipid fatty acid profiles and carbon utilization patterns for analysis of microbial community structure under field and greenhouse conditions. FEMS Microbiol. Ecol. 26(2): 151-163 Inatomi K., Kamagata K. Y., Nakamura K. (1993) Membrane ATPase from the aceticlastic methanogen Methanothrix thermophila.. J. Bacteriol. 175(1): 80-84 Ince B. K., Ince O., Oz N. A. (2003) Changes in acetoclastic methanogenic activity and microbial composition in an upflow anaerobic filter. Water Air Soil Poll. 144(1): 301-315 Isa Z., Grusenmeyer S., Verstraete W. (1986) Sulfate reduction relative to methane production in high-rate anaerobic digestion: Technical aspects. Appl. Environ. Microbiol. 51(3): 572-579 Ishii K., Fukui M. (2001) Optimization of annealing temperature to reduce bias caused by a primer mismatch in multitemplate PCR. Appl. Environ. Microbiol. 67(8): 3753-3755 Jawed M., Tare V. (1999) Microbial composition assessment of anaerobic biomass through methanogenic activity tests. Water SA 25(3): 345-350 Jin T., Xu B., Tang K., Hong J. P. (2008) Bubble counter based on photoelectric technique for leakage detection of cryogenic valves. J. Zhejiang Univ-Sc. A. 9 (1): 88-92 Kampmann K., Ratering S., Kramer I., Schmidt M., Zerr W., Schnell S. (2012) Unexpected stability of Bacteroidetes and Firmicutes communities in laboratory biogas reactors fed with different defined substrates. Appl. Environ. Microbiol. 78(7): 2106-2119 Kaplan C. W., Kitts C. L. (2003) Variation between observed and true terminal restriction fragment length is dependent on true TRF length and purine content. J. Microbiol. Methods 54(1): 121-125 Kashyap D. R., Dadhich K. S., Sharma S. K. (2003) Biomethanation under psychrophilic conditions: a review. Biores. Tech. 87(2): 147-153 Kaster A. K., Moll J., Parey K., Thauer R. K. (2011) Coupling of ferredoxin and heterodisulfide reduction via electron bifurcation in hydrogenotrophic methanogenic archaea. P. Natl. Acad. Sci. USA 08(7):2981-2986 Keltjens J. T., Vogels G. D. (1994) Conversion of methanol and methanolamines. In: Methanogenesis: Ecology, Physiology, Biochemistry, Genetics, ed. Ferry, J. G., Chapman and Hall, New York Kersters I., Maestrojuan G. M., Torck U., Vancanneyt M., Kersters K., Verstreate W. (1994) Isolation of Coprothermobacter proteolyticus from an anaerobic digest and further characterization of the species. Syst. Appl. Microbiol. 17(2): 289-295 Khalid A., Arshad M., Anjum M., Mahmood T., Dawson L. (2011) The anaerobic digestion of solid organic waste. Waste Manage. 31(8): 1737-1744 Kieft T. L., Ringelberg D. B., White D. C. (1994) Changes in ester-linked phospholipid fatty acid profiles of subsurface bacteria during starvation and desiccation in a porous medium. Appl. Environ. Microbiol. 60(9): 3292-3299 Kim O. S., Cho Y. J., Lee K., Yoon S. H., Kim M., Na H., Chun J. (2012) Introducing EzTaxon-e: a prokaryotic 16S rRNA gene sequence database with phylotypes that represent uncultured species. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 62(Pt 3): 716-721

139


Kiss B. (2007) Biogáz termelı mikrobióta hımérsékletfüggésének vizsgálata molekuláris módszerekkel. Szakdolgozat.. Eötvös Loránd Tudományegyetem, Mikrobiológiai Tanszék, Budapest Klug M. J., Tiedje J. M. (1993) Response of microbial communities to changing environmental conditions: chemical and physiological approaches. In: Trends in Microbiology and Ecology, ed. Guerrero R., Pedrós-Alió C., Spanish Society for Microbiology, Barcelona, 371–378 Kurr, M., Huber, R., König H., Jannasch, H. W., Fricke, H., Trincone, A. (1991) Methanopyrus kandleri, gen. and sp. nov. represents a novel group of hyperthermophilic methanogens, growing at 110°C. Arch. Microbiol. 156(4): 239-247 Lashkari S., Kruczek B. (2008) Development of a fully automated soap flowmeter for micro flow measurements. Flow. Meas. Instrum. 19 (6): 397-403 Lechevalier H. A., Solotorovsky M. (1965) Three centuries of microbiology. McGraw-Hill, New York Lechevalier M. P., De Bievre C., Lechevalier H. (1977) Chemotaxonomy of aerobic actinomycetes: phospholipid composition. Biochem. Syst. Ecol. 5(4): 249-260 Lechevalier H., Lechevalier M. P. (1988) Chemotaxonomic use of lipids—an overview. Microbial lipids 1(1): 869-902 Lee C., Kim J., Hwang K., O'Flaherty V., Hwang S. (2009) Quantitative analysis of methanogenic community dynamics in three anaerobic batch digesters treating different wastewaters. Water Res. 43(1): 157-165 Lee S. H., Kang H. J., Lee Y. H., Lee T. J., Han K., Choi Y., Park H. D. (2012) Monitoring bacterial community structure and variability in time scale in full-scale anaerobic digesters. J. Environ. Monitor. 14(7): 1893-1905 Li H., Yang M., Zhang Y., Yu T., Kamagata Y. (2006) Nitrification performance and microbial community dynamics in a submerged membrane bioreactor with complete sludge retention. J. Biotechnol. 123(1): 60-70 Li Y., Zhang J., Chen Q., Yang G., Cai S., He J., Li S. P. (2012) Dokdonella kunshanensis sp. nov., isolated from activated sludge and emended description of the genus Dokdonella. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. in press. Liao M., Chen C. L., Zeng L. S., Huang C. Y. (2007) Influence of lead acetate on soil microbial biomass and community structure in two different soils with the growth of Chinese cabbage (Brassica chinensis). Chemosphere 66(7): 1197-1205 Lier J. B., Grolle K. C., Stams A. J., Macario E. C., Lettinga G. (1992) Start-up of a thermophilic upflow anaerobic sludge bed (UASB) reactor with mesophilic granular sludge. Appl. Microbiol. Biotechnol. 37(1): 130-135 Liu W. T., Linning K. D., Nakamura K., Mino T., Matsuo T., Forney L. J. (2000) Microbial community changes in biological phosphate-removal systems on altering sludge phosphorus content. Microbiology 146(5): 1099-1107 Liu J., Olsson G., Matthiasson B. (2004) A volumetric meter for monitoring of low gas flow rate from laboratory-scale biogas reactors. Sensor. Actuat. B-Chem. 97(2): 369-372 Liu F. H., Wang S. B., Zhang J. S., Zhang J., Yan X., Zhou H. K., Zhao, G. P., Zhou, Z. H. (2009) The structure of the bacterial and archaeal community in a biogas digester as revealed by denaturing gradient gel electrophoresis and 16S rDNA sequencing analysis. J. Appl. Microbiol. 106(3): 952-966 Lueders T., Friedrich M. W. (2003) Evaluation of PCR amplification bias by terminal restriction fragment length polymorphism analysis of small-subunit rRNA and mcrA genes by using defined template mixtures of methanogenic pure cultures and soil DNA extracts. Appl. Environ. Microbiol. 9(1): 320-326

140


Luo H., Sun Z., Arndt W., Shi J., Friedman R., Tang J. (2009) Gene order phylogeny and the evolution of methanogens. PLoS One 4(6): 6069 Maazoun R., Lanotte G., Pasteur N., Rioux J. A., Kennou M. F., Pratlong F. (1981) Ecology of leishmaniasis in southern France. 16. Ann. Parasit. Hum. Comp. 56(2): 131 MacLeod F. A., Guiot S. R., Costerton J. W. (1990) Layered structure of bacterial aggregates produced in an upflow anaerobic sludge bed and filter reactor. Appl. Environ. Microbiol. 56(6): 1598-1607 Márialigeti K., Gorál R., Pohner Zs., Székely A., Tauber T., Tóth E. (2006) Use of molecular fingerprint techniques in the optimisation of sewage treatment biotechnologies. In: Proceedings of the Annual General Meeting of the European Culture Collections’ Organisation, Budapest, 81-92 Mata-Alvarez J., Macé S., Llabrés P. (2000) Anaerobic digestion of organic solid wastes. An overview of research achievements and perspectives. Biores. Tech. 74(1): 3-16 Mathiesen N. L. (1989) Ca and/or Mg soap solution in biogas production. WO Patent 8900548 Mayberry W. R., Lambe D. W., Ferguson K. P. (1982) Identification of Bacteroides species by cellular fatty acid profiles. Int. J. Syst. Bacteriol. 32(1): 21-27 Millar A. A., Smith M. A., Kunst L. (2000) All fatty acids are not equal: discrimination in plant membrane lipids. Trends Plant Sci. 5(3): 95-101 Minnikin D. E., Goodfellow M. (1981) Lipids in the classification of Bacillus and related taxa. In: The Aerobic Endospore-Forming Bacteria, ed. Berkeley R. C. W., Goodfellow M., Special Publication of the Society for General Microbiology, Academic Press, London, 4: 59–90 Minnikin D. E., O'donnell A. G., Goodfellow M., Alderson G., Athalye M., Schaal A., Parlett J. H. (1984) An integrated procedure for the extraction of bacterial isoprenoid quinones and polar lipids. J. Microbiol. Methods 2(5): 233-241 Moletta R., Albagnac G. (1982) A gas meter for low rates of gas flow: application to methane fermentation. Biotechnol. Lett. 4(5): 319-322 Mullis K. B., Faloona F. A., Scharf S. J., Saiki R. K., Horn G. T., Erlich H. (1986) Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 51: 263-273 Muyzer G. (1999) Genetic fingerprinting of microbial communities–present status and future perspectives. In: Microbial biosystems: new frontiers. Proceedings of the 8th International Symposium on Microbial Ecology. Atlantic Canada Society for Microbial Ecology, Halifax Muyzer G., Stams A. J. M. (2008) The ecology and biotechnology of sulphate-reducing bacteria. Nat. Rev. Microbiol. 6(6): 441-454 Nahaie M. R., Goodfellow M., Minnikin D. E., Hajek V. (1984) Polar lipid and isoprenoid quinone composition in the classification of Staphylococcus. J. Gen. Microbiol. 130(9): 2427-2437 Nakao S. (2006) Development of the P V T t system for very low gas flow rates. Flow. Meas. Instrum. 17 (3): 193-200 Nichols D. (2007) Cultivation gives context to the microbial ecologist. FEMS Microbiol. Ecol. 60(3): 351-357 Nikolausz M., Walter R. F. H., Sträuber H., Liebetrau J., Schmidt T., Kleinsteuber S., Bratfisch, F., Günther, U., Richnow, H. H. (2012) Evaluation of stable isotope fingerprinting techniques for the assessment of the predominant methanogenic pathways in anaerobic digesters. Appl. Microbiol. Biotechnol. 97(5): 2251-2262 Nilsson B. K., Bjerle I., Karlsson H. T. (1988) A simple meter with zero pressure drop for gas flows. Ind. Eng. Chem. Res. 27(8): 1553-1555

141


Ollivier B. M., Mah R. A., Ferguson T. J., Boone D. R., Garcia J. L., Robinson R. (1985) Emendation of the genus Thermobacteroides: Thermobacteroides proteolyticus sp. nov., a proteolytic acetogen from a methanogenic enrichment. Int. J. Syst. Bacteriol. 5(4): 425428 Palatinszky M., Nikolausz M., Sváb D., Márialigeti K. (2011) Preferential ligation during TA-cloning of multitemplate PCR products—A factor causing bias in microbial community structure analysis. J. Microbiol. Methods 85(2): 131-136 Parawira W., Murto M., Read J. S., Mattiasson B. (2005) Profile of hydrolases and biogas production during two-stage mesophilic anaerobic digestion of solid potato waste. Process Biochem. 40(9): 2945-2952 Penn M., Dworkin M. (1976) Robert Koch and two visions of microbiology. Bacteriol Rev. 40(2): 276-283 Penning H., Claus P., Casper P., Conrad R. (2006) Carbon isotope fractionation during acetoclastic methanogenesis by Methanosaeta concilii in culture and a lake sediment. Appl. Environ. Microbiol. 72(8): 5648-5652 Pereda R. O. C., Munoz E. M. R., Ruiz G. H. (2010) Automatic volumetric gas flow meter for monitoring biogas production from laboratory-scale anaerobic digester. Sensor. Actuat. B-Chem. 147(1): 10-14 Peters R. W., Alleman J. E. (1983) The history of fixed-film wastewater treatment systems. In: Fixed-film Biological Processes for Wastewater Treatment, ed. Wu Y. C., Smith E. D., Park Ridge, Noyes (NJ), 60-88 Polz M. F., Cavanaugh C. M. (1998) Bias in template-to-product ratios in multitemplate PCR. Appl. Environ. Microbiol. 64(10): 3724-3730 Rainey F. A., Stackebrandt E. (1993) Transfer of the type species of the genus Thermobacteroides to the genus Thermoanaerobacter as Thermoanaerobacter acetoethylicus (Ben-Bassat and Zeikus 1981) comb. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 43(4): 857-859 Ramsey P. W., Rillig M. C., Feris K. P., Holben W. E., Gannon J. E. (2006) Choice of methods for soil microbial community analysis: PLFA maximizes power compared to CLPP and PCR-based approaches. Edobiologia 50(3): 275-280 Ranjard L., Poly F., Nazaret S. (2000) Monitoring complex bacterial communities using culture-independent molecular techniques: application to soil environment. Res. Microbiol. 151(3): 167-177 Ravit B., Ehenfeld J. G., Häggblom M. M. (2006) Effects of vegetation on root-associated microbial communities: A comparison of disturbed versus undisturbed estuarine sediments. Soil Biol. Biochem. 38(8): 2359-2371 Reichardt W., Mascarina G., Padre B., Doll J. (1997) Microbial communities of continuously cropped, irrigated rice fields. Appl. Environ. Microbiol. 63(1): 233-238 Ritchie N. J., Schutter M. E., Dick R. P., Myrold D. D. (2000) Use of length heterogeneity PCR and fatty acid methyl ester profiles to characterize microbial communities in soil. Appl. Environ. Microbiol. 66(4): 1668-1675 Ryu S. H., Park M., Jeon Y., Lee J. R., Park W., Jeon C. O. (2007) Flavobacterium filum sp. nov., isolated from a wastewater treatment plant in Korea. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 57(9): 2026-2030 Sáez A. E., Marquez M. A., Roberts G. W., Carbonell R. G. (1998) Hydrodynamic model for gas-lift reactors. AIChE journal 44(6): 1413-1423 Sahlström L. (2003) A review of survival of pathogenic bacteria in organic waste used in biogas plants. Biores. Tech. 87(2): 161-166

142


Schade M., Beimfohr C., Lemmer H. (2002) Phylogenetic and physiological characterization of a "Nostocoida limicola"-like organism isolated from activated sludge. Water Sci. Technol. 46(1-2): 91-97 Schimpf U., Valbuena R. (2009) Increase in efficiency of biomethanation by enzyme application. Bornimer Agrartechnische Berichte 68: 44-56 Schink B. (1984) Clostridium magnum sp. nov., a non-autotrophic homoacetogenic bacterium. Arch. Microbiol. 137(3): 250-255 Schink B. (1997) Energetics of syntrophic cooperation in methanogenic degradation. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 61(2): 262-280 Schink B, Stams A. J. M. (2001) Obligately syntrophic bacteria: cultivation and biochemical studies. In: The prokariotes: an evolving electronic resource for the microbiological community, ed. Dworkin M., Springer-Verlag, New York Schlüter A., Bekel T., Diaz N. N., Dondrup M., Eichenlaub R., Gartemann K. H., Krahn, I., Krause, L., Krömeke, H., Kruse, O., Mussgnug, J. H., Neuweger, H., Niehaus, K., Pühler, A., Runte, K. J., Szczepanowski, R., Tauch, A., Tilker, A., Viehöver, P., Goesmann, A. (2008) The metagenome of a biogas-producing microbial community of a productionscale biogas plant fermenter analysed by the 454-pyrosequencing technology. J. Biotechnol. 136: 77-90 Schmitz-Esser S., Tischler P., Arnold R., Montanaro J., Wagner M., Rattei T., Horn M. (2010) The genome of the amoeba symbiont “Candidatus Amoebophilus asiaticus” reveals common mechanisms for host cell interaction among amoeba-associated bacteria. J. Bacteriol. 192(4): 1045-1057 Schulze R., Spring S., Amann R., Huber I., Ludwig W., Schleifer K. H., Kämpfer P. (1999) Genotypic diversity of Acidovorax strains isolated from activated sludge and description of Acidovorax defluvii sp. Nov.. Syst. Appl. Microbiol. 22(2): 205-214 Shigematsu T., YueQin T., Kida K. (2009) Microbial communities related to methane fermentation processes-monograph. Seibutsu-kogaku Kaishi 7(12): 570-596 Shumway R. H., Stoffer D. S. (2000) Time Series Analysis and its Applications. SpringerVerlag, New York Simpson P. G., Whitman W. B. (1994) Anabolic pathways in methanogens. In: Methanogenesis: Ecology, Physiology, Biochemistry, Genetics, ed. Ferry, J. G., Chapman and Hall, New York Sipos R., Székely A. J., Palatinszky M., Révész S., Márialigeti K., Nikolausz M. (2007) Effect of primer mismatch, annealing temperature and PCR cycle number on 16S rRNA gene targetting bacterial community analysis. FEMS Microbiol. Ecol. 60(2): 341-350 Sipos R. (2009) Mikroba közösségek fajösszetétel-vizsgálata: A multitemplát PCR és a DGGE elemzése. Doktori értekezés. Eötvös Loránd Tudományegyetem, Mikrobiológiai Tanszék, Budapest, 3-18 Smith C. J., Danilowicz B. S., Clear A. K., Costello F. J., Wilson B., Meijer W. G. (2006) TAlign, a web based tool for comparison of multiple terminal restriction fragment length polymorphism profiles. FEMS Microbiol. Ecol. 54(3): 375-380 Sonne-Hansen J., Westermann P., Ahring B. K. (1999) Kinetics of sulfate and hydrogen uptake by the thermophilic sulfate-reducing bacteria Thermodesulfobacterium sp. Strain JSP and Thermodesulfovibrio sp. Strain R1Ha3. Appl. Environ. Microbiol. 65(3): 13041307 Sorokin D. Y., Tourova T. P., Panteleeva A. N., Muyzer G. (2012) Desulfonatronobacter acidivorans gen. nov., sp. nov. and Desulfobulbus alkaliphilus sp. nov., haloalkaliphilic heterotrophic sulfate-reducing bacteria from soda lakes. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2(9): 2107-2113

143


Staley J. T., Konopka A. (1985) Measurement of in situ activities of nonphotosynthetic microorganisms in aquatic and terrestrial habitats. Annu. Rev. Microbiol. 39(1): 321-346 Sterling Jr. M. C., Lacey R. E., Engler C. R., Ricke S. C. (2001) Effects of ammonia nitrogen on H2 and CH4 production during anaerobic digestion of dairy cattle manure. Biores. Technol. 77(1): 9-18 Taherzadeh M. J., Karimi K. (2008) Pretreatment of lignocellulosic wastes to improve ethanol and biogas production: a review. Int. J. Mol. Sci. 9(9): 1621-1651 Takasu H., Kunihiro T., Nakano S. L. (2012) Vertical community structure of bacteria and phytoplankton in Lake Biwa using respiratory quinone and pigment analysis. In: Studies on Environmental Chemistry—Environmental Pollution and Ecotoxicology, ed. Kawaguchi M., Misaki K., Sato H., Yokokawa T., Itai T., Nguyen T. M., Ono J., Tanabe S., 6: 377–385 Tauber T., Berta B., Székely A. J., Gyarmati I., Kékesi K., Márialigeti K., Tóth E. (2006) Characterisation of community structure of bacteria in parallel mesophilic and thermophilic pilot scale anaerobe sludge digesters. Acta. Microbiol. Immun. Hung. 54 (1): 47-55 Tauber T., Berta B., Szabó Z., Kovács J., Márialigeti K., Tóth E. M. (2011) A simple and novel volumetric method to metre low gas flows from laboratory-scale bioreactors and its application on laboratory sludge digesters. Appl. Microbiol. Biotechnol. 90(4): 1453-1461 Tauber T., Wirth B., Nikolausz M., Palatinszky M., Schumann P., Márialigeti K., Tóth M. E. (2013) The effect of easily degradable substrate feeding on the community structure of laboratory-scale wastewater sludge digesters. Acta Microbiol. Imm. H. 60(3): in press. Taylor J., Parkes R. J. (1983) The cellular fatty acids of the sulphate-reducing bacteria, Desulfobacter sp., Desulfobulbus sp. and Desulfovibrio desulfuricans. J. Gen. Microbiol. 129(11): 3303-3309 Thauer R. K., Hedderich R., Fischer R. (1994) Methanogenesis from CO2 and H2. In: Methanogenesis: Ecology, Physiology, Biochemistry, Genetics, ed. Ferry, J. G., Chapman and Hall, New York Toda Y., Saiki T., Uozumi T., Beppu T. (1988) Isolation and characterization of a proteaseproducing, thermophilic, anaerobic bacterium, Thermobacteroides leptospartum sp. nov. (Microbiology Fermentation Industry). Agr. Biol. Chem. 52(6): 1339-1344 Topolnicki J., Kudasik M., Skoczylas N., Sobczyk J. (2009) Low cost capillary flow meter. Sensor. Actuat. A-Phys. 152 (2): 146-150 Torsvik V., Goksøyr J., Daae F. L. (1990) High diversity in DNA of soil bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 56(3): 782-787 Touzel J. P., Albagnac G. (1983) Isolation and characterization of Methanococcus mazei strain MC3. FEMS Microbiol. Lett. 16(2-3): 241-245 Tunlid A., Baird B. H., Trexler M. B., Olsson S., Findlay R. H., Odham G., White D. C. (1985) Determination of phospholipid ester-linked fatty acids and poly β-hydroxybutyrate for the estimation of bacterial biomass and activity in the rhizosphere of the rape plant Brassica napus (L.). Can. J. Microbiol. 31(12): 1113-1119 Tüzes D, Papp L. (2007) Buborék mozgásának vizsgálata Mikola csıben. http://www.linkgroup.hu /tuzes/alaplab/mikola.pdf Ueki A., Akasaka H., Suzuki D., Ueki K. (2006) Paludibacter propionicigenes gen. nov., sp. nov., a novel strictly anaerobic, Gram-negative, propionate-producing bacterium isolated from plant residue in irrigated rice-field soil in Japan. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 6(1): 39-44 Van den Berg L., Lentz C. P., Athey R. J., Rooke E. A. (1974) Assessment of methanogenic activity in anaerobic digestion. Apparatus and method. Biotechnol Bioeng 16(11): 14591469

144


Vargas Gil S., Meriles J., Conforto C., Basanta M., Radl V., Hagn A., Schloter M., March, G. J. (2011) Response of soil microbial communities to different management practices in surface soils of a soybean agroecosystem in Argentina. Eur. J. Soil Biol. 47(1): 55-60 Vaughan J. G., Denford K. E. (1968) An acrylamide gel electrophoretic study of the seed proteins of Brassica and Sinapis species, with special reference to their taxonomic value. J. Exp. Bot. 19(4): 724-732 Wagner M., Amann R., Lemmer H., Schleifer K. H. (1993) Probing activated sludge with oligonucleotides specific for proteobacteria: inadequacy of culture-dependent methods for describing microbial community structure. Appl. Environ. Microbiol. 59(5): 1520-1525 Wagner D., Gattinger A., Embacher A., Pfeiffer E. M., Scholter M., Lipski A. (2007) Methanogenic activity and biomass in Holocene permafrost deposits of the Lena Delta, Siberian Arctic and its implication for the global methane budget. Glob. Change Biol. 13(5): 1089-1099 Wagner M., Assmus B., Hartmann A., Hutzler P., Amann R. (2011) In situ analysis of microbial consortia in activated sludge using fluorescently labelled, rRNA-targeted oligonucleotide probes and confocal scanning laser microscopy. J. Microsc. 176(3): 181187 Walker M., Zhang Y., Heaven S., Banks C. (2009) Potential errors in the quantitative evaluation of biogas production in anaerobic digestion processes. Biores. Technol. 100(24): 6339-6346 Wang H., Wang F. Y., Wei Z. Q., Hu H. Y. (2011) Quinone profiles of microbial communities in sediments of Haihe River–Bohai Bay as influenced by heavy metals and environmental factors. Environ. Monit. Assess. 176(1): 157-167 Weisenburger G. A., Barnhart R. W., Steeno G. S. (2008) Measurement of gas flow rates from small-scale reactions. Org. Process. Res. Dev. 12 (6): 1299-1304 Welch D. F. (1991) Applications of cellular fatty acid analysis. Clin. Microbiol. Rev. 4(4): 422-438 White D. C., Davis W. M., Nickels J. S., King J. D., Bobbie R. J. (1979) Determination of the sedimentary microbial biomass by extractable lipid phosphate. Oecologia 40(1): 51-62 White D. C. (1988) Validation of quantitative analysis for microbial biomass, community structure, and metabolic activity. Adv. Limnol. 31(1): 1-18 Wiertelak J. (1931) Chemical composition. The chemical composition of wood of Trochodendron araloides. Trop. Woods, 25: 29 Wilke B. M., Gattinger A., Fröhlich E., Zelles L., Gong P. (2004) Phospholipid fatty acid composition of a 2, 4, 6-trinitrotolune contaminated soil and an uncontaminated soil as affected by a humification remediation process. Soil Biol. Biochem- 36(4): 725-729 Wirth R., Kovács E., Maróti G., Bagi Z., Rákhely G., Kovács K. L. (2012) Characterization of a biogas-producing microbial community by short-read next generation DNA sequencing. Biotechnol. Biofuels 5(1): 1-16 Witt A., Schumann Y. (2005) Holocene climate variability on millennial scales recorded in Greenland ice cores. Nonlinear Proc. Geoph. 12(3): 345-352 Woese C. R. (1987) Bacterial evolution. Microbiol. Rev. 51(2): 221-271 Wolfe R. S. (1993) A historical owerview of methanogenesis. In: Methanogenesis: Ecology, Physiology, Biochemistry, Genetics, ed. Ferry, J. G., Chapman and Hall, New York Wright A. D. G., Pimm C. (2003) Improved strategy for presumptive identification of methanogens using 16S riboprinting. J. Microbiol. Methods 55(2): 337-349 Wu Y., Ding N., Wang G., Xu J., Wu J., Brookes P. C. (2009) Effects of different soil weights, storage times and extraction methods on soil phospholipid fatty acid analyses. Geoderma 150(1): 171-178

145


Xing D., Ren N., Li Q., Lin M., Wang A., Zhao L. (2006) Ethanoligenens harbinense gen. nov., sp. nov., isolated from molasses wastewater. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 56(4): 755-760 Yadvika S., Sreekrishnan R. S., Kohli S., Rana V. (2004) Enhancement of biogas production from solid substrates using different techniques – A review. Biores. Tech. 95(1): 1-10 Yamada T., Sekiguchi Y., Hanada S., Imachi H., Ohashi A., Harada H., Kamagata Y. (2006) Anaerolinea thermolimosa sp. nov., Levilinea saccharolytica gen. nov., sp. nov. and Leptolinea tardivitalis gen. nov., sp. nov., novel filamentous anaerobes, and description of the new classes Anaerolineae classis nov. and Caldilineae classis nov. in the bacterial phylum Chloroflexi. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 56(6): 1331-1340 Yamada T., Imachi H., Ohashi A., Harada H., Hanada S., Kamagata Y., Sekiguchi Y. (2007) Bellilinea caldifistulae gen. nov., sp. nov., an amino acid-degrading anaerobe isolated from anaerobic sludge. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 57(10): 2299-2306 Yao H., Thornton B., Paterson E. (2012) Incorporation of 13C-labelled rice rhizodeposition carbon into soil microbial communities under different water status. Soil Biol. Biochem. 53: 72-77 Yu H., Zeng G., Huang H., Xi X., Wang R., Huang D., Huang G., Li, J. (2007) Microbial community succession and lignocellulose degradation during agricultural waste composting. Biodegradation 18(6): 793-802 Zelles L., Bai Q. Y., Beck T., Beese F. (1992) Signature fatty acids in phospholipids and lipopolysaccharides as indicators of microbial biomass and community structure in agricultural soils. Soil Biol. Biochem. 24(4): 317-323 Zelles L., Bai Q. Y. (1993) Fractionation of fatty acids derived from soil lipids by solid phase extraction and their quantitative analysis by GC-MS. Soil Biol. Biochem. 25(4): 495-507 Zelles L. (1999) Fatty acid patterns of phospholipids and lipopolysaccharides in the characterisation of microbial communities in soil: a review. Biol. Fertil. Soils 29(2): 111129 Zhang C., Xu J., Liu X., Dong F., Kong Z., Sheng Y., Zheng Y. (2010) Impact of imazethapyr on the microbial community structure in agricultural soils. Chemosphere 81(6): 800-806 Zinder S. H., Sowers K. R., Ferry J. G. (1985) NOTES: Methanosarcina thermophila sp. nov., a Thermophilic, Acetotrophic, Methane-Producing Bacterium. Int. J. Syst. Evol. Micr. 35(4): 522-523 Zinder S. H. (1994) Physiological ecology of methanogens. In: Methanogenesis: Ecology, Physiology, Biochemistry, Genetics, ed. Ferry, J. G., Chapman and Hall, New York http://mikrobiologia.elte.hu/Miscell.html

146

FÜGGELÉK

FÜGGELÉK (A fı részek számozása „Ad” prepozícióval a fıszöveg vonatkozó alfejezeteire utal vissza.)

Ad III. B. 8. A 16S rDNS PCR és hıprofilja a mezofil-termofil közösség-összehasonlításban: Reagensek: (Bacteria) mintánként: 10X PCR puffer (Fermentas) 5µl MgCl2 (Fermentas) 4µl dNTP (Fermentas) 10µl H2O (DEPC kezelt) 27µl 27f (0,2 µg/µl) 0,5µl TET-519r (0,2 µg/µl) 0,5µl Taq polimeráz (1U/µl; Fermentas) 1µl DNS templát 2µl Össztérfogat 50µl

p r e m i x

Reagensek: (Archaea) mintánként: 10X PCR puffer (Fermentas) 5µl MgCl2 (Fermentas) 4µl dNTP (Fermentas) 10µl H2O (DEPC kezelt) 27µl HEX-A344f (0,2 µg/µl) 0,5µl A934r (0,2 µg/µl) 0,5µl Taq polimeráz (1U/µl; Fermentas) 1µl DNS templát 2µl Össztérfogat 50µl

p r e m i x

A PCR reakció hıprofilja: kezdeti denaturáció 98°C 5 min Taq bemérés 94°C 10 sec anelláció 52°C 30 sec extenzió 72°C 30 sec 30 ciklus denaturáció 94°C 30 sec végsı extenzó 72°C 10 min hőtés 4°C ∞

A 16S rDNS PCR pimerei, premixei és hıprofilja a könnyen bontható szubsztrátok adagolásvizsgálatában. Használt primerek: 27f: 5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’ 1492r: 5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’ mlas: 5’-GGTGGTGTMGGDTTCACMCARTA-3’ mcrA-rev: 5’-CGTTCATBGCGTAGTTVGGRTAGT-3’ Betőkódok: M: A/C; W: A/T; K: G/T; S: G/C; Y: C/T; R: A/G Reagensek: (Archaea) mintánként: 10X PCR puffer (CoralLoad) 2,5µl dNTP (CoralLoad) 0,5µl 16,875µl H2O (DEPC kezelt) mlas (0,2 µg/µl) 2 µl mcrA-rev (0,2 µg/µl) 2 µl Taq polimeráz (1U/µl; CoralLoad) 0,125 µl DNS templát 1 µl Össztérfogat 25 µl

p r e m i x

A PCR reakció hıprofilja: kezdeti denaturáció 98°C 5 min Taq bemérés 94°C 10 sec anelláció 52°C 30 sec extenzió 72°C 30 sec 30 ciklus denaturáció 94°C 30 sec végsı extenzó 72°C 10 min hőtés 4°C ∞

I

Reagensek: (Bacteria) mintánként: 10X PCR puffer (Fermentas) 5µl dNTP (Fermentas) 10µl H2O (DEPC kezelt) 27µl 27f (0,2 µg/µl) 0,5µl 1492r (0,2 µg/µl) 0,5µl Taq polimeráz (1U/µl; Fermentas) 1µl DNS templát 2µl Össztérfogat 50µl

p r e m i x

FÜGGELÉK

A 16S rDNS PCR pimerei, premixei és hıprofilja a felfőtéses kísérletben Használt primerek bázissorrendje 27f: 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3' HEX-27f: (HEX)-5'AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3' 519r: 5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3' A109f: 5’-ACKGCTCAGTAACACGT-3’ A340f: 5’-CCCTAYGGGGYGCASCAG-3’ HEX-A340f: (HEX)-5’CCCTAYGGGGYGCASCAG-3’ A1000r: 5’-GGCCATGCACYWCYTCTC-3’ Betőkódok: M: A/C; W: A/T; K: G/T; S: G/C; Y: C/T; R: A/G PCR reakciók összetétele és hıprofilja: Bacteria és Archaea 16S rDNS PCR összetétele Dream Taq polimeráz (Fermentas) 10x puffer (Fermentas) MgCl2 (Fermentas) reverz primer forward primer dNTP DEPC víz templát

1,00 µl 2,50 µl 2,00 µl 0,25 µl 0,25 µl 5,00 µl 13,00 µl 1,00 µl

Bacteria 16S rDNS PCR hıprofilja: kezdeti denaturáció 98 oC denaturáció 94 oC anneláció 52 oC extenzió 72 oC végsı extenzió 72 oC hőtés 4 °C

5perc 0:30 perc 0:30 perc 0:30 perc 10 perc ∞

Archaea 16S rDNS PCR-ek hıprofilja: kezdeti denaturáció 98 oC 5perc denaturáció 94 oC 0:30 perc anneláció 60 oC 0:30 perc ciklusonként 0,5 °C-kal csökkentve extenzió 72 oC 1:00 perc denaturáció 94 oC 0:30 perc anneláció 50 oC 0:30 perc extenzió 72 oC 1:00 perc végsı extenzió 72 oC 10 perc hőtés 4 °C ∞

premix

végtérfogat: 25,00 µl

32 ciklus

20 ciklus

15 ciklus

A PCR-ek ciklusszámának csökkentésének oka a „Taq dadogás” (Miller és Yuan 1997) hatásának minimalizálása volt, melynek eredménye lehet az eredetileg egyazon szekvenciából keletkezı, 1-2 bázis hosszbeli különbséggel rendelkezı T-RF-ek (terminális restrikciós fragment) megléte.

II

FÜGGELÉK

A klónozott génszakaszok felszaporítása PCR-rel mezofil-termofil közösségösszehasonlításban primerek: M13/pUCf: 5’-GTAAAACGACGGCCAG-3’ és M13/pUCr: 5’CAGGAAACAGCTATGAC-3’ A PCR összetétele:

A PCR hıprofilja:

reagensek: 10x puffer MgCl2 dNTP dH2O 344f(-HEX) 934r

mintánként: 2,5 µl 2 µl 5 µl premix 13,5 µl 0,25 µl 0,25 µl

Taq polimeráz DNS templát

0,5 µl 1 µl 25 µl

kezdeti denat. anelláció elongáció denaturáció végsı extenzió hőtés

95°C 58°C 72°C 94°C 72°C 4°C

3 min 30 sec 30 sec 30 sec 10 min ∞

10 ciklus

Ad III. B. 11. Az etanolos precipitáció menete: 1. Minden emésztett mintához 62,5 µl 95%-os etanolt, 14,5 µl dH2O-t és 3 µl 3M Naacetát oldatot (pH=4,6) mértünk. Ezután 20 perces inkubáció következett szobahımérsékleten. Ennek során kicsapódik a DNS és a fehérjék is. 2. A csöveket ezután 14000 g-n és 4°C-on, 20 percig centrifugáltuk. 3. A felülúszót leöntöttük, és a pelletekhez 250 µl 70%-os alkoholt adtunk, majd alaposan vortexeltük. 4. A mintákat 14000 g-n 4°C-on 10 percig centrifugáltuk. 5. A 70%-os alkoholban csak a DNS precipitálódik, így a felülúszót leöntve megkapjuk a tisztított mintánkat. 6. Az etanol eltávolításához Jouan RC 10.09. centrifugát használtunk Edwards Modulyo fagyasztva-szárító berendezéssel és vákuumpumpával kiegészítve. A restrikciós emésztés enzimei és elegyei mezofil-termofil közösség-összehasonlításban reagens:

mintánként:

enzim puffer dH2O

0,3 µl 2 µl 9,7 µl

Enzim premixbe összemérve

AluI Hin6I MspI

Hasítási hely 5' AG↓CT 5' G↓CGC 5' C↓CCG

Optimális hıfok 37°C 37°C 37°C

fluoreszcensen jelölt templát 8 µl 20 µl

A puffer: 33 mM Tris-acetát (pH 7,9), 10 mM Mg-acetát, 66 mM Na-acetát, 0,1 mg/mL BSA

III

FÜGGELÉK

A restrikciós emésztés enzimei és elegyei a könnyen bontható szubsztrátok adagolásvizsgálatában. reagens:

mintánként:

enzim puffer dH2O

1 µl 1 µl 7 µl

fluoreszcensen jelölt templát


HaeIII MspI

Hasítási hely 5' GG↓CC 5' C↓CCG

Optimális hıfok 37°C 37°C

1 µl 10 µl

MspI puffer: 33 mM Tris-acetát (pH 7,9), 10 mM Mg-acetát, 66 mM Na-acetát, 0,1 mg/ml BSA HaeIII puffer: 10 mM Tris-HCl (pH 8), 5 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0,1 mg/ml BSA A restrikciós emésztés enzimei és elegyei a felfőtéses kísérletben Az elegyek és pufferek összetétele: reagens:

mintánként:

enzim puffer dH2O

0,3 µl 2 µl 9,7 µl


AluI BsuRI MspI

Hasítási hely 5' AG↓CT 5' GG↓CC 5' C↓CCG

Optimális hıfok 37°C 37°C 37°C

fluoreszcensen jelölt templát 8 µl 20 µl

AluI puffer: 33 mM Tris-acetát (pH 7,9), 10 mM Mg-acetát, 66 mM Na-acetát, 0,1 mg/ml BSA MspI (HpaII) puffer: 33 mM Tris-acetát (pH 7,9) 10 mM Mg-acetát, 66 mM K-acetát, 0,1 mg/mL BSA TaqI puffer: 10 mM Tris-HCl (pH 8), 5 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0,1 mg/ml BSA

Ad III. B. 14. A szekvenáló reakció összetétele és hıprofilja három vizsgálatban A szekvenáló reakció összetétele:

A reakció hıprofilja:

reagensek: Big DyeTM Terminator Big Dye puffer dH2O primer templát

denaturáció anelláció extenzió hőtés

mintánként: 2 µl premixbe 3 µl összemérve 7 µl 1 µl 7 µl 20 µl

96°C 50°C 60°C 4°C

10 sec 5 sec 4 min ∞

30 ciklus

A Big DyeTM Terminator oldat (Applied Biosystems) tartalmazza a dezoxi és fluoreszcensen jelölt dideoxi nukleotidokat, a MgCl2-ot és a módosított Taq polimerázt. A primereket a fıszövegben ismertetjük.

IV

FÜGGELÉK

Ad V. B. 3. 3. Nagy mérető fák eredeti és származtatott összegváltozókkal: 0.4100

0.6676

0.7060

0.8525

1.000

F/1. ábra. A felfőtéses kísérlet zsírsav és T-RF adatai alapján készült hasonlósági fa a DNSmarkerek kéttagú, aránytorzított összegváltozóival (Pearson korreláció, átlagos láncmódszer; az 500 legerısebb kapcsolat változóival). Kék színnel a zsírsavak, pirossal az Alu-, zölddel a Bsu-T-RF-ek neve látható (ha nem is olvasható). A piros keret egy, a fıszövegben kiemelten tárgyalt farészletet emel ki, a piros nyíl az egyértelmően párban álló, szintén tárgyalt izo C14:0 zsírsav és (Alu149 + 0,4704*Alu194) összegváltozó pozícióját jelöli. A tengelyen a korrelációs együttható értékei láthatók.

V

FÜGGELÉK

F/2. ábra. A felfőtéses kísérlet menakinon- és zsírsav-adatai alapján készült hasonlósági fa a zsírsav-markerek kéttagú, aránytorzított összegváltozóival (Pearson korreláció, átlagos láncmódszer; az 500 legerısebb kapcsolat változóival). Piros színnel a menakinonok, zölddel a zsírsavak neve látható.

VI

FÜGGELÉK

F/3. ábra. A felfőtéses kísérlet T-RF és zsírsav-adatai alapján készült hasonlósági fa a zsírsav-markerek kéttagú, aránytorzított összegváltozóival (Pearson korreláció, átlagos láncmódszer; az 500 legerısebb kapcsolat változóival). Piros színnel az Alu, zölddel a Bsu TRF-ek neve látható, kékkel a zsírsavak nevei.

VII

SZENNYVÍZISZAP-ROTHASZTÓ MIKROBA-

Recommend Documents