Syphilis Total Ab 1 lemezes – 96 5 lemezes – 480
72530 72531
A TREPONEMA PALLIDUM ELLENI ANTITEST HUMÁN SZÉRUMBAN VAGY PLAZMÁBAN ENZIM IMMUNPRÓBA TECHNIKÁVAL TÖRTÉNŐ KVALITATÍV KIMUTATÁSÁRA SZOLGÁLÓ KÉSZLETEK
883679 - 2014/11
TARTALOMJEGYZÉK 1.
RENDELTETÉS........................................................................................ 2
2.
A TESZT ÖSSZEFOGLALÁSA ÉS ISMERTETÉSE ..................................... 2
3.
AZ ELJÁRÁS ALAPELVEI ......................................................................... 2
4.
REAGENSEK ........................................................................................... 3
5.
FIGYELMEZTETÉS ÉS ÓVINTÉZKEDÉSEK .............................................. 4
6.
MINTÁK ................................................................................................... 6
7.
ELJÁRÁS ................................................................................................. 6
8.
A TESZT KORLÁTAI ................................................................................. 9
9.
TELJESÍTMÉNYJELLEMZŐK .................................................................... 9
10.
IRODALMI HIVATKOZÁSOK. .................................................................. 1 2
[HU] 1
1. RENDELTETÉS Ezek a készletek megfelelően képzett és gyakorlott személyzet által történő használatra szolgálnak a Treponema pallidum elleni antitestek humán szérumban és plazmában történő kvalitatív kimutatására. A termék használható véradók szűrésére használható, és elősegíti azoknak a betegeknek a diagnosztizálását, akiknél szifiliszfertőzés gyanúja áll fenn.
2. A TESZT ÖSSZEFOGLALÁSA ÉS ISMERTETÉSE A szifilisz krónikus fertőzés, amely a fertőzés jól elkülöníthető – elsődleges, másodlagos, harmadlagos és negyedleges – stádiumain át fejlődik. Ezek a stádiumok különböző klinikai tüneteket hoznak létre, jellemzően kezdeti fekélyeket (kemény fekélyek), majd szifiliszes kiütéseket eredményezve, amit hosszú nyugalmi állapot követ. A kezeletlen fertőzés végül kardiovaszkuláris problémákhoz és neuroszifiliszhez vezet. A fertőzést a spirochaeta Treponema pallidum okozza, és általában szexuális érintkezéssel terjed, bár a betegség átadható fertőzött vér transzfúziójával is. Méhen belüli fertőzés szintén előfordul. Az organizmus tenyésztése mesterséges táptalajon szinte lehetetlennek bizonyult, és a fertőzés diagnosztizálása általában az antitestek vérből történő kimutatásán múlik. Az antitestek röviddel az első fertőzés után megjelennek, és évekig megmaradhatnak. A szifiliszvizsgálatok négy kategóriába sorolhatók: közvetlen mikroszkópos vizsgálat, treponema elleni antitest vizsgálata, nem treponema elleni antitest vizsgálata és közvetlen antigénvizsgálat. Mivel a nyugalmi állapot hosszú és a nem treponema elleni antitestvizsgálat nem specifikus természetű, azok a módszerek, amelyek specifikus treponema elleni antitesteket mutatnak ki a vérmintában egyre népszerűbbekké válnak szűrés céljára. A Syphilis Total Ab ilyen teszt.
3. AZ ELJÁRÁS ALAPELVEI A Syphilis Total Ab három rekombináns antigént használ szendvics vizsgálatban. Az antigének kimutatják a T. pallidum-specifikus IgG, IgM és IgA antitesteket, ami lehetővé teszi, hogy a teszt a fertőzés összes stádiuma során kimutassa az antitesteket. A lyukakat 15Kd, 17Kd és 47Kd T. pallidum rekombináns antigénekkel vonják be. A szérum- vagy plazmamintában lévő specifikus antitestek kombinálódnak ezekkel az antigénekkel és ugyanazokkal a tormaperoxidázzal konjugált antigénekkel, amikor a konjugátumot olyan lyukhoz adják, amelyben inkubált minta van. Miután a nem reagáló anyagot mosással eltávolítják, a kötött enzim jelenlétét – amely a mintában specifikus antitestek jelenlétét mutatja – a szubsztrát/kromogén keverék színváltozása mutatja. A szín intenzitását a specifikus antitestek jelenlétének vagy hiányának meghatározása érdekében összehasonlítják a kontroll-lyukakéval.
[HU] 2
4. REAGENSEK 4.1. Leírás Címkejelzés
R1
Microplate
R2
Concentrated Washing Solution (20X)
R3
Negative control
R4
Positive control
R6
Conjugate
R8
Substrate buffer
R9
Chromogen: TMB solution (11X)
R10
Stopping solution
Leírás Mikrolemez 8 lyukból álló 12 csík, T. pallidum rekombináns antigénekkel (rAg) bevonva Saját azonosító = 97. Koncentrált mosóoldat (20x) Tris NaCl puffer, 7,4 pH Tartósítószer: Proclin™ 300 (0,04%) Negatív kontroll BSA-t (szarvasmarha szérum albumint) tartalmazó Tris puffer Tartósítószer: Proclin™ 300 (0,1%) Pozitív kontroll (humán) HIV1/2-re, HBs Ag-ra és HCV-re negatív, T. pallidum elleni antitesteket tartalmazó humán szérum, BSA-t (szarvasmarha szérum albumint) tartalmazó Tris pufferben hígítva Tartósítószer: Proclin™ 300 (0,1%) Konjugátum T.pallidum rAg / Peroxidáz Tartósítószer: Proclin™ 300 (0,05%) Szubsztrát puffer Citromsav és nátriumacetát oldat, pH 4,0, H2O2-t (0,015%) és DMSO-t (dimetilszulfoxidot) (4%) tartalmaz Kromogén: TMB oldat (rózsaszín) 3,3’-, 5,5’-tetrametilbenzidint (TMB) tartalmazó oldat Leállító oldat Kénsavoldat (H2SO4 1N)
Kiszerelés/előkészítés 72530
Kiszerelés/előkészítés 72531
1 lemez Használatra kész
5 lemez Használatra kész
1 üveg 70 ml Hígítandó
1 üveg 235 ml Hígítandó
1 üveg 2,1 ml Használatra kész
1 üveg 2,1 ml Használatra kész
1 üveg 1,6 ml Használatra kész
1 üveg 1,6 ml Használatra kész
1 üveg 8 ml Használatra kész
1 üveg 30 ml Használatra kész
1 üveg 60 ml Feloldandó
1 üveg 60 ml Feloldandó
1 üveg 5 ml Hígítandó
1 üveg 5 ml Hígítandó
1 üveg 28 ml Használatra kész
1 üveg 28 ml Használatra kész
[HU] 3
4.2. Tárolási és kezelési előírások A készletet +2–8 °C között kell tárolni. A készlet minden, +2–8 °C között tárolt tétele a csomagoláson jelzett lejárati dátumig használható fel (ha máshogy nincs jelezve). Felnyitás után és szennyeződés hiányában a +2–8 °C-on tárolt R3, R4, R6, R8, R9 és R10 reagensek a címkén jelzett lejárati dátumig használhatók fel. Azonosító
Tárolás
R1
A vákuummal lezárt tasak kinyitása után a +2–8 °C-on tárolt mikrolyukcsíkok 1 hónapig használhatók fel a gondosan visszazárt eredeti tasakjukban.
R2
A hígított mosóoldat +2–30 °C-on 2 hétig tárolható. A koncentrált mosóoldat (R2) +2–30 °C-on tárolható.
R8 + R9
Feloldás után a sötétben tárolt reagensek szobahőmérsékleten (18–30 °C) 6 órán át használhatók fel.
5. FIGYELMEZTETÉS ÉS ÓVINTÉZKEDÉSEK In vitro diagnosztikai használatra. Egészségügyi szakemberek általi használatra.
5.1. Munkavédelmi óvintézkedések: A tesztkészletet csak olyan szakképzett személy kezelheti, aki ismeri a laboratóriumi eljárásokat, és tisztában van azok lehetséges veszélyeivel. Mindig viseljen megfelelő védőöltözéket, védőkesztyűt, szem-/arcvédőt, és a megfelelő laboratóriumi gyakorlat előírásainak megfelelően kezelje az anyagokat. A tesztkészlet emberi vér alkotóelemeit tartalmazza. A reagensek elkészítése során használt emberi eredetű anyagokat megvizsgálták, és a hepatitis B felszíni antigénre (HBs Ag), a humán immundeficiencia vírusok (HIV-1 és HIV-2) elleni antitestekre és a hepatitis C-vírus (HCV) elleni antitestekre nem reaktívnak találták. Nincs olyan vizsgálati módszer, amivel teljes mértékben garantálható a fertőző ágensek hiánya, ezért minden emberi vérkészítményt, reagenst és emberi mintát fertőzőként kell kezelni a helyi, regionális és országos jogszabályokban a vér útján terjedő kórokozókkal kapcsolatban meghatározott általános óvintézkedések betartásával. Kiömlött biológiai anyagok: A kiömlött emberi eredetű anyagokat potenciálisan fertőzőként kell kezelni. A savat nem tartalmazó kiömlött anyagokat azonnal el kell takarítani, beleértve a kiömlés területét, az anyagokat és minden szennyezett felületet vagy felszerelést, az érintett minták által okozott potenciális biológiai veszélynek megfelelő hatékony kémiai fertőtlenítőszerrel (ez általában 1:10 arányban hígított háztartási fehérítő, 70–80%-os etanol vagy izopropanol és jodofór [például 0,5%-os Wescodyne™ Plus] stb.), majd szárazra kell törölni. A savat tartalmazó kiömlött anyagokat megfelelően fel kell itatni (fel kell törölni) vagy semlegesíteni kell, a területet le kell öblíteni vízzel, és szárazra kell törölni. Előfordulhat, hogy azok az anyagok, amelyeket a kiömlött anyag felitatására használtak, veszélyes hulladékként kezelendők. Ezt követően a területet vegyi fertőtlenítővel fertőtleníteni kell. MEGJEGYZÉS: Ne tegyen az autoklávba fehérítőt tartalmazó oldatokat! A teszt elvégzése során felhasznált valamennyi mintát és anyagot oly módon ártalmatlanítsa, mintha az fertőző hatású lenne. A laboratóriumi, kémiai és biológiailag veszélyes hulladék anyagokat a helyi, regionális és állami előírásoknak megfelelően kezelje és ártalmatlanítsa.
[HU] 4
A tesztkészletben fellelhető egyes kémiai összetevők kockázati és óvintézkedési ajánlásaihoz tekintse át a címkéken biztosított képjelzést (képjelzéseket) és a használati utasítás végén adott tájékoztatást. A biztonsági adatlap a következő címen érhető el: www.bio-rad.com.
5.2. Az eljárással kapcsolatos óvintézkedések 5.2.1. Előkészítés Az eredmények megbízhatósága a következő helyes laboratóriumi gyakorlatok megfelelő alkalmazásán múlik: • Ne használjon lejárt reagenst. • Ne keverjen vagy elegyítsen különböző csomagokból származó reagenseket egyazon tesztfuttatásban. • Használat előtt várjon 30 percig, amíg a reagensek szobahőmérsékleten (18–30 °C) stabilizálódnak. • A teszt neve és saját azonosító száma a mikrolemezek keretén található. Ez a saját azonosító szám az egyes csíkokon is megtalálható. Syphilis Total Ab: Saját azonosító = 97. Használat előtt ellenőrizze a saját azonosító számot. Ha az azonosító szám hiányzik, vagy eltér a vizsgálandó próbához tartozó, jelzett számtól, a csíkot nem szabad használni. MEGJEGYZÉS: A mosóoldat (R2, címkeazonosító: 20X zöld színű), a peroxidáz szubsztrát puffer (R8, címkeazonosító: TMB puffer, kék színű), a kromogén (R9, címkeazonosító: TMB 11X, lila színű) és a leállító oldat (R10, címkeazonosító: 1N, piros színű) esetén használható a készletben találhatótól eltérő tételszám, feltéve, ha ugyanazt a tételt használják egy adott tesztfuttatás során. Ezek a reagensek cégünk néhány más készítményével is használhatók. Részletes információért forduljon műszaki szolgálatunkhoz. • Gondosan oldja fel a reagenseket, kerülve a szennyeződést. • Használjon ionmentes vízzel alaposan elmosott és leöblített üvegeszközöket, vagy, ha lehet, eldobható anyagból készült eszközöket. • Ne hagyja, hogy a mikrolemez a mosási művelet vége és a reagensek elosztása között kiszáradjon. • Az enzimreakció nagyon érzékeny a fémionokra. Ebből következően ne hagyja, hogy bármilyen fémtárgy érintkezzen a különböző konjugátumokkal vagy szubsztrát oldatokkal. • Az előhívó oldatnak (szubsztrát puffer + kromogén) rózsaszínűnek kell lennie. Ennek a rózsaszín tónusnak a feloldás után néhány percen belüli módosulása azt jelzi, hogy a reagens nem használható, és le kell cserélni. Az előhívó oldat előkészítése elvégezhető tiszta, eldobható, egyszer használatos műanyag tálcán vagy üvegtartályban, amelyet először 1N HCl-dal előmostak, desztillált vízzel alaposan kiöblítettek és megszárítottak. A reagenst sötétben kell tárolni. • Ne használja ugyanazt a tartályt a konjugátum és az előhívó oldat elosztására.
5.2.2.
Feldolgozás
• Ne módosítsa a teszteljárást. • Ne végezze el a vizsgálatot a konjugátum enzimaktivitásának módosítására képes reaktív gőz (sav, lúgos, aldehidgőz) vagy por jelenlétében. • Minden mintához használjon új elosztóhegyet. • A megfelelő lemosás kritikus lépés ebben az eljárásban: tartsa be a mosási ciklusok javasolt számát, és győződjön meg arról, hogy minden lyuk teljesen feltöltődik, majd teljesen kiürül. A nem megfelelő mosás pontatlan eredményekhez vezethet. • A legjobb vizsgálati teljesítmény elérése érdekében gondosan kövesse a leírt mosási eljárást. Néhány berendezésnél szükség lehet a mosási eljárás optimalizálására (a mosási lépés ciklusszámának és/vagy az egyes ciklusok mosópuffer-mennyiségének növelésére) annak érdekében, hogy a negatív mintákhoz elfogadható szintű OD (optikai sűrűség) hátteret kapjanak. • Az adaptációkkal és speciális eljárásokkal kapcsolatban vegye fel a kapcsolatot cégünkkel.
[HU] 5
6. MINTÁK Az aktuális gyakorlat szerint vegyen vérmintát. A vizsgálatokat hígítatlan (EDTA-s, nátrium-citrátos, nátrium-heparinos vagy ACD-s csőbe gyűjtött) szérumon vagy plazmán kell elvégezni. Az összecsapzódást tartalmazó mintákat centrifugálással deríteni kell a vizsgálat előtt. A mintákat +2– 8 °C-on kell tárolni, ha a vizsgálatra 7 napon belül kerül sor, vagy hosszabb időre –20 °C-on kell tárolni. Ne ismételjen 5-nél több fagyasztási/kiolvasztási ciklust. 1/2 óráig 56 °C-on hővel kezelt minták használhatók. A legfeljebb 120 g/l albumint, 200 mg/l bilirubint, 33 g/l trioleint vagy 2 g/l hemoglobint tartalmazó minták nem befolyásolják az eredményeket. Nem javasolt azonban hiperlipaemiás vagy hiperhemolizált szérum- vagy plazmamintát használni. A mintákat a vizsgálat előtt ki kell olvasztani és jól össze kell keverni. Ha a mintákat szállítani kell, az etiológiai ágensek szállítására vonatkozóan érvényben lévő szabályozások szerint kell csomagolni, és lehetőleg fagyasztva kell szállítani azokat.
7. ELJÁRÁS 7.1. Szükséges, de nem biztosított anyagok • Desztillált víz. • Nátrium-hipoklorit (háztartási fehérítő) és nátrium-bikarbonát. • Papírtörlő. • Eldobható védőkesztyű. • Védőszemüveg. • Eldobható csövek. • Automata vagy félautomata, állítható vagy előre beállított pipetták vagy multipipetták 50 µl, 1 ml és 10 ml mérésére és elosztására. • Beosztással ellátott, 100 ml és 1 l űrtartalmú mérőhengerek. • Automata, félautomata vagy manuális mikrolemezmosó rendszer (*). • Mikrolemez inkubátor, hőszabályozóval 37 °C ± 1 °C-ra állítva (*). • Biológiailag veszélyes hulladék tárolására szolgáló tartály. • 450 nm-es, 490 nm-es és 620–700 nm-es szűrőkkel felszerelt mikrolemez-leolvasó (*). (*) A műszaki osztályunk által javasolt berendezésre vonatkozó részletes információkkal kapcsolatban forduljon hozzánk.
7.2. A reagensek előkészítése 7.2.1. Használatra kész reagensek 1. reagens (R1): Mikrolemez A 12 csíkot tartalmazó minden egyes keret zárt fóliatasakba van csomagolva. Ollóval vagy szikével vágja el a tasakot a lezárás fölött 0,5–1 cm-rel. Nyissa ki a tasakot, és vegye ki a keretet. Tegye vissza a nem használt csíkokat a tasakba. Gondosan zárja le a tasakot, és tegye vissza +2–8 °C-os helyre. 3. reagens (R3): Negatív kontroll 4. reagens (R4): Pozitív kontroll 6. reagens (R6): Konjugátum Használat előtt fordítsa meg a homogenizáláshoz. 10. reagens (R10): Leállító oldat
[HU] 6
7.2.2. Feloldandó reagensek 2. reagens (R2): Koncentrált mosóoldat (20x) A használatra kész mosóoldat kinyeréséhez hígítsa desztillált vízben 1:20 arányban. Egy 12 csíkot tartalmazó lemezhez készítsen 800 ml-t. 8. reagens (R8) + 9. reagens (R9): Enzimelőhívó oldat Hígítsa 1:11 arányban a kromogént (R9) a szubsztrát pufferben (pl. 1 ml R9 reagens + 10 ml R8 reagens), feltéve, hogy 10 ml szükséges és elégséges 12 csík kezeléséhez. Homogenizálja.
7.3. Vizsgálati eljárás Szigorúan kövesse az eljárást. A vizsgálat minőségének validálása érdekében használjon minden vizsgálathoz negatív és pozitív kontrollszérumokat. Kövesse a következő helyes laboratóriumi gyakorlatokat: 1) Körültekintően alakítsa ki a mintaelosztási és -azonosítási tervet. 2) Készítse el a hígított R2 mosóoldatot. 3) Vegye ki a védőcsomagolásból a keretet és a szükséges számú csíkot (R1). Tegye vissza a nem használt csíkokat a csomagolásba. Zárja le a tasakot, és tegye vissza +2–8 °C-ra. 4) Ossza el a lyukakban a következő sorrendben (javasolt lemezelosztás): • 50 μl negatív kontroll (R3) az A1, B1 és C1 lyukakba • 50 μl pozitív kontroll (R4) a D1 és E1 lyukba • 50 µl hígítatlan minta minden lyukba, F1, G1 stb. • 50 μl konjugátum (R6) minden lyukba A használt rendszertől függően lehetséges a kontrollok elhelyezkedésének vagy az elosztás rendjének módosítása. Homogenizálja a reakciókeveréket legalább 3 aspirációval vagy mikrolemezrázóval 5 másodpercig. MEGJEGYZÉS: A minta és a kontrollok elosztása ennél a lépésnél szemrevételezéssel ellenőrizhető. Az üres lyukak és a mintát tartalmazó lyukak festődése különbözik. Ossza el a konjugátumot a minta elosztásától számított 5 percen belül. Egyértelmű különbség van az üres lyuk és a piros konjugátum oldatot (R6) tartalmazó lyuk elszíneződése között (lásd 7.7. fejezet). 5) Amikor csak lehetséges, takarja le a lemezt új ragasztószalaggal. 6) Inkubálja a mikrolemezt 30-35 percen át 37 °C ± 1 °C hőmérsékleten. 7) Ha szükséges, vegye le a ragasztószalagot. Szívja le az összes lyuk tartalmát folyékonyhulladék-tárolóba, és adjon az egyes lyukakhoz legalább 370 µl mosóoldatot. Szívja le újra, és ismételje meg a lemosást legalább 4-szer (összesen 5 mosóciklus). A maradék mennyiségnek 10 µl-nél kevesebbnek kell lennie (ha szükséges, papírtörlőn lefelé fordítva szárítsa meg a csíkokat). Ha automata mosóval rendelkezik, kövesse ugyanezt az üzemi ciklust. MEGJEGYZÉS: Folytassa 20 percen belül a mosási lépéssel. 8) Készítse el az előhívó oldatot (R8 + R9 reagens). 9) Gyorsan osszon el minden lyukba 50 µl elkészített előhívó oldatot (R8 + R9), amelyet használat előtt frissen készített el. Hagyja, hogy a reakció a sötétben, szobahőmérsékleten (18–30 °C), 25–35 perc alatt kialakuljon. Ebben az inkubálási fázisban ne tegyen a lemezre ragasztószalagot. MEGJEGYZÉS: A rózsaszín előhívó oldat elosztása ennél a lépésnél szemrevételezéssel ellenőrizhető. Egyértelmű különbség van az üres lyuk és a rózsaszín szubsztrát oldatot tartalmazó lyuk elszíneződése között. (Lásd 7.7. fejezet). 10) Adjon 50 µl leállító oldatot (R10) ugyanazzal a sorrenddel és elosztási sebességgel, mint a szubsztrát oldatnál. Homogenizálja a reakciókeveréket.
[HU] 7
MEGJEGYZÉS: A színtelen leállító oldat eloszlása ennél a stádiumnál szemrevételezéssel ellenőrizhető. A szubsztrát színe – a negatív minták esetében a rózsaszín, a pozitív minták esetében a kék – elhalványul a lyukakban, amelyek színtelenek (a negatív minták esetén) vagy sárgák (a pozitív minták esetén) lesznek a leállító oldat hozzáadása után. 11) Alaposan törölje ki az egyes lemezek alját. A leállító oldat hozzáadása után várjon legalább 4 percig, és a reakció leállítása után 30 percen belül lemezleolvasóval olvassa le az optikai sűrűséget 450/620-690 nm-en. 12) Ellenőrizze a spektrofotometria és a vizuális leolvasás közti egyezést a lemez, illetve a mintaelosztási és -azonosítási tervhez képest.
7.4. Minőség-ellenőrzés A teszteredmények validálásához használja az egyes futtatásoknál a negatív (R3) és a pozitív (R4) kontrollokat. (Lásd 7.5. fejezet)
7.5. A teszt érvényességének feltételei Ez a teszt akkor érvényes, ha az alábbi feltételeket betartották: 1) Az R3 negatív kontrollra vonatkozóan: OD R3 ≤ 0,080 Ha egy kontroll értéke ezen érték fölött van, hagyja figyelmen kívül, és végezze el a számítást a két fennmaradó negatív kontroll értékével. 2) Az R4 pozitív kontrollra vonatkozóan: OD R4 ≥ 0,700
7.6. Az eredmények kiszámítása/értelmezése A cut-off értéke az R3 negatív kontrollal kerül meghatározásra: Számítsa ki az abszorpcióképesség átlagos mért értékét az R3 negatív kontrollra, és számítsa ki a cut-off értéket (COV) a következőképpen: COV = átlag OD R3 + 0,100 A cut-off értéknél alacsonyabb optikai sűrűségű minták negatívnak tekinthetők a Syphilis Total Ab-vel. Az éppen a cut-off érték alatti eredmények (COV -10% < OD < COV) azonban körültekintéssel értelmezendők. Javasoljuk, hogy amikor a rendszer és a laboratóriumi eljárások engedik, újra vizsgálják meg a vonatkozó mintákat két példányban. A cut-off értékkel megegyező vagy annál nagyobb optikai sűrűségű minták pozitívnak tekinthetők a Syphilis Total Ab teszttel, és a végső értelmezés előtt két példányban újra kell azokat tesztelni. Azok az újratesztelt minták, amelyek a cut-off érték fölöttiek a két példány legalább egyikében, pozitívnak tekintendők, és tovább kell vizsgálni őket. Azok a minták, amelyek mindkét példányban a cut-off érték alatt vannak, negatívnak tekinthetők. Nagyon alacsony optikai sűrűségű vizsgált minták esetén (negatív OD), és ha a mintákat és a reagenseket tartalmazó lyukak jelenléte ellenőrzött, az eredmények negatívként értelmezhetők. Javasolt a pozitív minták megerősítése az érvényben lévő országos javaslatok és algoritmusok szerint.
7.7. A minta és a konjugátum pipettálásának spektrofotometriás ellenőrzése (opcionális) Minták és kontrollok A minták és kontrollok jelenléte a lyukakban 450/620 nm-en történő automatikus leolvasással ellenőrizhető. A mintát tartalmazó lyuk optikai sűrűsége 0,050 és 1,100 között lesz.
[HU] 8
Konjugátum A konjugátum piros színű. A konjugátum jelenléte a lyukakban 450/620 nm-en történő automatikus leolvasással ellenőrizhető. A mintát és konjugátumot tartalmazó lyuk optikai sűrűsége ≥1,200 lesz. Az előhívó oldat pipettálásának ellenőrzése 492 nm-en történő automatikus leolvasással ellenőrizhető a rózsaszín előhívó oldat jelenléte a lyukakban. Az előhívó oldatot tartalmazó lyuk optikai sűrűségének >0,100-nak kell lennie (alacsonyabb OD az előhívó oldat rossz eloszlását mutatja).
8. A TESZT KORLÁTAI Mint minden más szifilisz szerológiai tesztnél, az átfogó klinikai diagnózis felállításához a Syphilis Total Ab EIA próbával kapott eredmények értelmezését is a beteg klinikai tüneteivel, kórtörténetével és más laboreredményeivel együtt kell végezni. Nem áll rendelkezésre egyetlen teszt vagy döntő referenciastandard a betegség összes stádiumához, ezért a szifilisz diagnózisa elsősorban szerológiai vizsgálaton alapul, amelyhez nem treponema és treponema módszerek eredményei egyaránt szükségesek. Nincs olyan diagnosztikai vizsgálat, amely abszolút garanciát adna arra, hogy a minta nem tartalmaz nagyon alacsony T. pallium-antitest-szintet, amely a fertőzés nagyon korai stádiumában van jelen, ezért a bármikor kapott negatív eredmény nem zárja ki a szifiliszfertőzés expozíciójának lehetőségét. Bármely ELISA technika adhat álpozitív eredményeket. Javasoljuk, hogy megfelelő módszer alkalmazásával ellenőrizzék az ismételten pozitívnak talált bármilyen minta reakciójának specificitását a Syphilis Total Ab készlet értelmezési kritériumai szerint: Treponema pallidum hemagglutinációs vizsgálat. A treponemafertőzés után minden treponemavizsgálati eredmény hajlamos reaktívnak maradni, ezért nem használhatók a terápiára adott válasz értékelésére. Mivel a reaktivitás általában a beteg egész életében megmarad, a treponemavizsgálatok nem értékelhetők a relapszus vagy az újbóli fertőzés meghatározására olyan betegnél, akinek reaktív eredménye volt. Javasoljuk, hogy ebben az esetben alkalmazzanak más vizsgálatokat: Syphilis IgM EIA-t, RPR-t és TPHA-t. A spektrofotometriás módszer a minták és a konjugátum előhívó oldat ülepedésének ellenőrzésére nem teszi lehetővé, hogy ellenőrizzék a minták és a konjugátum elosztott mennyiségének pontosságát. Ez a módszer csak a minta és a konjugátum jelenlétét mutatja meg. E módszer hibaaránya szorosan kapcsolódik az alkalmazott rendszer pontosságához (az elosztás és a leolvasás 10%-nál nagyobb kumulált variációs együtthatója jelentősen csökkenti a lépés minőségét).
9. TELJESÍTMÉNYJELLEMZŐK 9.1. Precíziós mérés A megismételhetőséget és a köztes precizitást különböző szifilisz antitest-koncentrációjú minták felhasználásával határozták meg. A megismételhetőség meghatározása érdekében a mintákat 30szor vizsgálták meg ugyanabban a vizsgálatsorozatban. A mintákat 20 nap alatt, napi 2 vizsgálattal, két példányban is megvizsgálták. Az átlagos arányt, a szórást és a variációs együtthatót (CV) számították ki.
[HU] 9
9.1.1. Megismételhetőség: Minták
N
Arányok átlaga
Szórás
CV %
Gyengén negatív
30
0,14
0,014
9,5%
Erősen negatív
30
0,68
0,051
7,5%
Gyengén pozitív szifilisz antitest
30
1,90
0,070
3,7%
Pozitív szifilisz antitest
30
3,76
0,130
3,5%
A pozitív mintákon kapott CV kevesebb, mint 10%.
9.1.2. Köztes precizitás
Minták Gyengén negatív Erősen negatív Gyengén pozitív szifilisz antitest Pozitív szifilisz antitest
N
Arányok átlaga
Vizsgálaton belül
Vizsgálatok/kezelők között
Napok között
Teljes reprodukálhatóság
Szórás
CV %
Szórás
CV %
Szórás
CV %
Szórás
CV %
80
0,15
0,035
22,5%
0,023
14,7%
0,017
10,9%
0,045
29,0%
80
0,74
0,038
5,1%
0,074
10,0%
0,006
0,8%
0,084
11,2%
80
2,30
0,112
4,9%
0,312
13,5%
0,099
4,3%
0,346
15,0%
80
4,13
0,180
4,3%
0,543
13,1%
0,195
4,7%
0,604
14,6%
A pozitív mintákon kapott CV kevesebb, mint 15%, vagy egyenlő azzal.
9.2. Klinikai teljesítmény A Syphilis Total Ab próba klinikai teljesítményét prospektív és retrospektív vizsgálatokból származó minták vizsgálatával határozták meg: Prospektív vizsgálat: - 5195 minta véletlenszerűen kiválasztott véradóktól; - 460 minta olyan betegektől, akiknél szifiliszt gyanítottak Retrospektív vizsgálat: - 350 minta szexuális úton terjedő betegségekben szenvedő betegektől. A vizsgálatokat 2 véradó helyen, egy szexuális úton terjedő betegségekkel foglalkozó központban és a Bio-Rad vizsgálóhelyén végezték.
9.2.1. Diagnosztikai specificitás A vizsgálatot 2 franciaországi vérbankban, véletlenszerűen kiválasztott véradóktól vett szérum- és EDTA-s plazmamintákon végezték. Specificitási vizsgálatot is végeztek betegektől vett mintákon. Minden eredményt összehasonlítottak olyan eredményekkel, amelyeket más, CE-jelzéssel ellátott szifiliszteszttel kaptak.
[HU] 10
1. táblázat: Specificitási vizsgálat (ER = Elsőként reaktív, IR = Ismételten reaktív) Populáció
Véradók
Betegek
Helyszín
1. 2.
3.
Teljes mintaszám
Elsőként reaktív (ER)
Ismételten reaktív (IR)
IR specificitás (%)
SST szérum
3127
2
2*
3125/3125
EDTA K2 plazma
2068
2
2*
2066/2066
Összesen
5195
4
4*
Szérum
351
1
1
Minta típusa
100% 5191/5191 99,72% 350/351
95% CI (%)
99,93% – 100% 98,42–100%
*Az ismételten reaktív, CE-jelzéssel ellátott egyéb EIA szifiliszteszttel pozitívnak talált mintákat kizárták a diagnosztikai specificitási számításból
9.2.2. Diagnosztikai érzékenység Retrospektív vizsgálat: A vizsgálatot 350 fagyasztott mintán végezték, amelyek közül 2-t negatívnak, 348-at igazoltan pozitívnak találtak a CE-jelzéssel rendelkező szifilisztesztekkel. A 348 pozitív minta közül 7 minta származott a fertőzés korai stádiumában lévő betegektől. A Bio-Rad Syphilis Total Ab próbával mind a 348 mintát pozitívnak találták. Prospektív vizsgálat: Összesen 460 friss mintát értékeltek a Bio-Rad Syphilis Total Ab próbával, és hasonlították össze a CE-jelzéssel rendelkező szifilisztesztekkel. 348-at negatívnak találtak a Bio-Rad és a referenciatesztekkel egyaránt (két mintát álpozitívnak minősítettek a referencia EIA teszttel) 109-et mindkét teszttel pozitívnak találtak. 3 minta ellentmondó eredményeket mutatott (a Bio-Rad próbával végzett újratesztelés után): • 1 minta pozitív volt a Bio-Rad próbával, és erősen negatív a referenciatesztekkel. Ez az alacsony szifiliszarányú minta a cut-off határértékén volt mindkét EIA tesztnél: • 1 minta pozitív volt a referenciatesztekkel, negatív a Bio-Rad próbával (1 tünetmentes betegtől) • 1 minta pozitív a referenciatesztekkel, negatív ER és pozitív a Bio-Rad próbával végzett újratesztelésnél. Retrospektív és prospektív vizsgálatok: Az átfogó diagnosztikai érzékenység 99,56% (457/459) 95%-os konfidencia intervallum mellett [98,44% – 99,95%]. Klinikai érzékenység A klinikai érzékenységet szintén vizsgálták 3 kereskedelmi forgalomban lévő panelen és 1 szerokonverziós panelen. A Bio-Rad Syphilis Total Ab próbát összehasonlították egy CE-jelzéssel rendelkező szifiliszpróbával. A panel egyes mintáinak kimutatása a Bio-Rad próba és a szifilisz referenciapróba esetén megegyezett.
9.3. Analitikai érzékenység Az analitikai érzékenységet 2 NIBSC szabványon értékelték, és a cut-off értéken számították ki regresszióval: 1. Az IgG / IgM kimutatási határát a Syphilis Total Ab próba 3 tételszámán értékelték, és 0,53 mNE/ml-nél állapították meg 95%-os konfidencia intervallum [0,10 mNE/ml–1,30 mNE/ml] mellett a WHO IgM/IgG-szabványával (NIBSC kód: 05/132). 2. Az IgG kimutatási határát a Syphilis Total Ab próba 1 tételszámán értékelték, és 0,11 mNE/ml-nél állapították meg 95%-os konfidencia intervallum [0,02 mNE/ml–0,27 mNE/ml] mellett a WHO IgG-szabványával (NIBSC kód: 05/122).
[HU] 11
9.4. Analitikai specificitás/Keresztreaktivitási vizsgálat Összesen 125, potenciálisan zavaró olyan mintát vizsgáltak a Syphilis Total Ab próbával, amelyek fertőző betegségekhez (Lyme-kór, toxoplasmosis, EBV, leptospirosis, SLE (lupus)) vezető kórokozók elleni antitesteket (hepatitis A-antitest, hepatitis B-antitest, hepatitis C-antitest, HTLV I/II és HIV) tartalmaztak, melyek kockázatnak kitett betegektől (terhes nők, többször szült nők) vagy immunrendszeri betegségben szenvedő betegektől (rheumatoid faktor) származtak. A vizsgált 125 mintából 1 mintát találtak ismételten pozitívnak a Syphilis Total Ab próbával. Ez a minta igazoltan valódi pozitív volt más, CE-jelzéssel rendelkező szifilisz EIA és megerősítő próbákkal. Az e célpopuláción megfigyelt specificitás 100% (124/124) volt, 95%-os konfidencia intervallum [97,1% – 100,0%] mellett.
9.5. Kioltási effektus Az esetleges kioltási effektus meglétét 6 magas titerű, szifiliszre pozitív minta különböző hígításának tesztelésével vizsgálták. A nem hígított és hígított minták közt megfigyelt eredmények egyezősége a kioltási effektus hiányát mutatta a vizsgált mintákon.
10. IRODALMI HIVATKOZÁSOK. 1. Levinson SS. The Nature of Heterophilic Antibodies and Their Role in Immunoassay Interference. J. Clin. Immunoassay 15: 108-115,1992. 2. Norris S.J. Plypeptides of Treponema pallidum: Progress toward understanding their structural, functional and immunological role. Microbiological Reviews, Setpt. 1993 Vol 57. 3. Larsen SA, Steiner BM, and Rudolph AH. Laboratory diagnosis and interpretation of tests for syphilis. Clin Microbiol Rev. 1995 Jan; 8(1):1–21. 4. Zrein M, Maure I, Boursier F, Soufflet L. Recombinant antigen-based enzyme immunoassay for screening of Treponema pallidum antibodies in blood bank routine. J Clin Microbol. 1995 Mar; 33(3):525–7. 5. Singh AE and Romanowski. Syphilis: Review with emphasis on clinical, epidemiological, and some biologic features. Clin Microbiol Rev. 1999 Apr; 12(2):187–209. 6. Stability of selected serum proteins after long-term storage in the Janus Serum Bank. Clin Chem Lab Med. 2009. 47:596-606. 7. International Journal of STD & AIDS 2009; 20: 300–309. 8. Screening donated Blood for Transfusion-Transmissible infections. World Health Organization. 2009 9. M. J. Loeffelholz, and M. J. Binnicker, ‘It Is Time to Use Treponema-Specific Antibody Screening Tests for Diagnosis of Syphilis’, J Clin Microbiol, 50 (2012), 2-6.
[HU] 12
[HU] 13
[HU] 14
[HU] 15
[HU] 16
Bio-Rad 3, Boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette, Franciaország Tel.: +33 (0) 1 47 95 60 00 Fax: +33 (0) 1 47 41 91 33 www.bio-rad.com
2014/11 883679
[HU] 17
