SYNTHESE EN RADIOLABELING VAN EEN LAT 1 INHIBITOR TER DETECTIE VAN LAAGGRADIGE GLIOMA

UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN Vakgroep Farmaceutische Analyse Laboratorium voor Radiofarmacie Academiejaar 2014-2015

SYNTHESE EN RADIOLABELING VAN EEN LAT 1 INHIBITOR TER DETECTIE VAN LAAGGRADIGE GLIOMA Ann-Sophie VANDER PLAETSEN

Eerste Master in de Farmaceutische Zorg Promotor

Prof. dr. apr. F. De Vos Commissarissen

dr. K. Kersemans dr. J. Courtyn

UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN Vakgroep Farmaceutische Analyse Laboratorium voor Radiofarmacie Academiejaar 2014-2015

SYNTHESE EN RADIOLABELING VAN EEN LAT 1 INHIBITOR TER DETECTIE VAN LAAGGRADIGE GLIOMA Ann-Sophie VANDER PLAETSEN

Eerste Master in de Farmaceutische Zorg Promotor

Prof. dr. apr. F. De Vos Commissarissen

dr. K. Kersemans dr. J. Courtyn

AUTEURSRECHT "De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze masterproef." 7 Mei, 2015

SAMENVATTING Om hersentumoren vroegtijdig te kunnen diagnosticeren, behandelen en opvolgen is het belangrijk dat ze correct in beeld gebracht worden. In dat opzicht vormen vooral laaggradige glioma veelal een probleem. Binnen de beeldvorming van hersentumoren speelt Positron Emission Tomography (PET) een belangrijke rol. Deze niet-invasieve, functionele beeldvormingstechniek is gebaseerd op het β+-verval van intraveneus geïnjecteerde radiofarmaca. Aangezien de meest gebruikte PET-tracer, 2-[18F]-Fluoro-2-deoxy-D-glucose ([18F]-FDG), echter niet de meest geschikte tracer is om hersentumoren in beeld te brengen, wordt er steeds meer onderzoek gedaan naar de ontwikkeling van radiogelabelde AZanalogen. Het doel van deze masterproef is daarom de ontwikkeling van een

18

F-gelabeld

Melphalan-analoog dat als inhibitor zal optreden ter hoogte van de LAT 1-transporter, die tot overexpressie komt in tumorcellen. Een vertraagde klaring van een radiogelabelde inhibitor ter hoogte van deze transporter zou tot een betere visualisatie van laaggradige glioma kunnen leiden via PET-scans. De ontwikkeling van dit

18

F-gelabeld Melphalan-analoog bestaat in eerste instantie

uit enkele koude synthesereacties waarbij de vorming van reactieproducten continu wordt opgevolgd met behulp van dunnelaagchromatografie (TLC). De werkelijke opzuivering van de gewenste reactieproducten wordt uitgevoerd door middel van silicagelkolomchromatografie waarna structuurbevestiging steeds mogelijk is met behulp van Elektrospray ionisatie massaspectrometrie (ESI-MS). Het tweede stadium bestaat vervolgens uit enkele succesvolle radiosyntheses waarbij er labeling met

18

F plaatsvindt. Na zure deprotectie van deze

18

F-

gelabelde reactieproducten wordt het gewenste eindproduct 2-amino-3(4-((2-fluoro[18F])ethyl)(2-hydroxyethyl)amino)pheny)propaanzuur uiteindelijk bekomen. Bijgevolg kan er geconcludeerd worden dat de poging om een

18

F-gelabeld

Melphalan-analoog te ontwikkelen, geslaagd is. Optimalisatie van de koude synthesereacties is echter wel noodzakelijk om in de toekomst hogere rendementen te bekomen. Als de affiniteit en de selectiviteit van deze molecule voor LAT 1 gunstig blijken te zijn in in vitro celtesten en de beeldvormingsmogelijkheden voor laaggradige glioma op PET-scans in in vivo proefdiertesten ook positieve uitkomsten vertonen, zou dit PET-radiofarmacon in de toekomst een belangrijke rol kunnen spelen in de beeldvorming van laaggradige glioma.

DANKWOORD Eerst en vooral ben ik Prof. dr. apr. F. De Vos dankbaar voor het ter beschikking stellen van het labo Radiofarmacie en om mij op deze manier de mogelijkheid te bieden om kennis te maken met dit boeiende vakgebied. Ook zou ik de professor willen bedanken voor de lessen kernchemie en medische stralingsfysica en voor het nalezen van mijn masterproef. Vervolgens zou ik mijn begeleider Apr. Jeroen Verhoeven erg willen bedanken voor de aangename sfeer in het labo, voor het delen van zijn kennis wat mijn interesse in het vakgebied deed groeien, voor het geduld wanneer ik geregeld binnenviel met vragen en/of technische probleempjes en om mij telkens opnieuw gerust te stellen wanneer de resultaten wat tegenvielen. Ook wil ik hem graag bedanken voor het nalezen en verbeteren van mijn masterproef. Ik wens hem nog veel succes in het verdere beloop van zijn doctoraat. Een woord van dank gaat ook uit naar dr. Ken Kersemans voor zijn hulp en zijn interesse in dit onderzoek en de bekomen resultaten. Ook mijn mede-masterproefstudenten verdienen zeker een bedankje omwille van hun aangename gezelschap tijdens de vele labo-uren en lessen. In het bijzonder wil ik mijn vriend bedanken die steeds in mij en mijn kunnen gelooft en me telkens weer oppepte als het even niet meezat. Ook bedank ik hem graag voor het nalezen van mijn masterproef. Daarnaast wil ik ook mijn vrienden enorm bedanken voor de oprechte steun en aanmoediging en voor de nodige ontspanning tijdens de gezellige middagpauzes en daarbuiten. Ten slotte wil ik mijn ouders heel erg bedanken voor hun steun en interesse in alles wat ik aanvang.

INHOUDSTAFEL 1.

INLEIDING ................................................................................................................. 1 1.1 HERSENTUMOREN.......................................................................................................... 1 1.2 BEELDVORMING VAN TUMOREN ................................................................................... 2 1.2.1 Inleiding .................................................................................................................. 2 1.2.2 Magnetic Resonance Imaging (MRI) ...................................................................... 2 1.2.3 Positron Emission Tomography (PET) .................................................................... 4 1.3 AMINOZUURTRANSPORT IN TUMORCELLEN ................................................................. 7 1.3.1 Algemeen ............................................................................................................... 7 1.3.2 Aminozuurtransportsystemen ............................................................................... 7 1.3.3 Systeem L................................................................................................................ 8 1.3.4 Aminozuurtransport in tumoren .......................................................................... 10 1.4 PET-TRACERS ................................................................................................................ 11 1.4.1 [18F]-FDG ............................................................................................................... 11 1.4.2 AZ-PET tracers ...................................................................................................... 12 1.4.2.1 Algemeen ....................................................................................................... 12 1.4.2.2 L-[methyl-11C]-methionine ............................................................................. 13 1.4.2.3 [18F]-fluoroethyl-tyrosine ............................................................................... 14 1.4.2.4

18

F-gelabeld Melphalan-analoog .................................................................... 15

2.

OBJECTIEVEN........................................................................................................... 16

3.

MATERIALEN EN METHODEN ................................................................................... 17 3.1 REAGENTIA ................................................................................................................... 17 3.2 APPARATUUR EN REACTIEMECHANISMEN .................................................................. 18 3.2.1 Toestellen ............................................................................................................. 18 3.2.2 Nucleofiele substitutiereactie: SN2 vs SN1 ............................................................ 18 3.2.3 Kolomchromatografie .......................................................................................... 19 3.2.4 Dunnelaagchromatografie (TLC) .......................................................................... 21 3.2.5 Massaspectroscopie (MS) .................................................................................... 22 3.2.6

18

F productie ......................................................................................................... 22

3.3 EXPERIMENTELE PROTOCOLS ....................................................................................... 24

3.3.1 Beschermingsreactie ............................................................................................ 24 3.3.2 SN2-reacties van verbinding 2 met 2- Chloroethyl p-tolueensulfonaat ............... 25 3.3.3 SN1-like reactie van verbinding 2 met ethyleenoxide .......................................... 27 3.3.4 Tosylering van verbinding 5 met behulp van p-tolueensulfonylchloride ............ 28 3.3.5 Radiosyntheses..................................................................................................... 28 3.3.5.1 Opzuivering van [18F]-Fluoride ....................................................................... 28 3.3.5.2 Radiosynthese van [18F]-Fluoroethyltosylaat ([18F]-FeTos) ............................ 29 3.3.5.3 Reactie van [18F]-FeTos met verbinding 4 ...................................................... 30 3.3.5.4 Fluorering van verbinding 7 ........................................................................... 30 3.3.6 Deprotectie........................................................................................................... 31 4.

RESULTATEN EN DISCUSSIE ...................................................................................... 32 4.1 BESCHERMINGSREACTIE .............................................................................................. 32 4.1.1 Opzuivering .......................................................................................................... 32 4.1.2 Rendement ........................................................................................................... 33 4.2 SN2-REACTIES VAN VERBINDING 2 MET 2-CHLOROETHYL P-TOLUEENSULFONAAT ..... 33 4.2.1 TLC ........................................................................................................................ 33 4.2.2 Opzuivering .......................................................................................................... 34 4.2.3 Besluit ................................................................................................................... 36 4.3 SN1-LIKE REACTIE VAN VERBINDING 2 MET ETHYLEENOXIDE....................................... 36 4.3.1 TLC ........................................................................................................................ 36 4.3.2 Opzuivering .......................................................................................................... 37 4.3.3 Rendement ........................................................................................................... 38 4.4 TOSYLERING VAN VERBINDING 5 MET BEHULP VAN P-TOLUEENSULFONYLCHLORIDE 39 4.4.1 TLC ........................................................................................................................ 39 4.4.2 Opzuivering .......................................................................................................... 40 4.4.3 Rendement ........................................................................................................... 41 4.5 RADIOSYNTHESES ......................................................................................................... 41 4.5.1 Opzuivering van [18F]-Fluoride ............................................................................. 41 4.5.2 Radiosynthese van [18F]-Fluoroethyltosylaat ([18F]-FeTos) .................................. 42 4.5.2.1 Opzuivering .................................................................................................... 42 4.5.2.2 TLC .................................................................................................................. 42

4.5.3 Reactie van [18F]-FeTos met verbinding 4 ............................................................ 43 4.5.4 Fluorering van verbinding 7 ................................................................................. 44 4.6 DEPROTECTIE................................................................................................................ 45 4.7 TOEKOMSTIG ONDERZOEK ........................................................................................... 47 5.

CONCLUSIE .............................................................................................................. 49

6.

LITERATUURLIJST..................................................................................................... 50

LIJST VAN AFKORTINGEN AZ

Aminozuur / aminozuren

BHB

Bloedhersenbarrière

AcN

Acetonitrile

Boc

tert-butyloxycarbonyl

CBC

Carbokation

CH2Cl2

Dichloromethaan

ClEtTos

2- Chloroethyl p-tolueensulfonaat

DMSO

Dimethylsulfoxide

EMS

Elektromagnetische straling

ESI

Elektrospray ionisatie

Et2O

Diethylether

EtOAc

Ethylacetaat

FDG

2-Fluoro-2-deoxy-D-glucose

FET

Fluoroethyl-tyrosine

FeTos

Fluoroethyl p-tolueensulfonaat

GLUT

Glucosetransporters

HCl

Waterstofchloride

K222

Kryptofix 2.2.2

K2CO3

Kaliumcarbonaat

LAT

L-type Aminozuur Transporters

LG

Leaving group

MeOH

Methanol

MET

L-methyl-methionine

MRI

Magnetic Resonance Imaging

MS

Massaspectrum

Na2CO3

Natriumcarbonaat

Na2SO4

Natriumsulfaat

PET

Positron Emission Tomography

RF

Radiofrequentie

Rf-waarde

Retentiefactor

ROI

Region Of Interest

SN1

Unimoleculaire nucleofiele substitutiereactie

SN2

Bimoleculaire nucleofiele substitutiereactie

tBu

tert-Butyl

TEA

Triethylamine

THF

Tetrahydrofuraan

TLC

Thin Layer Chromatography

TosCl

p-tolueensulfonylchloride

WHO

World Health Organization

In Bijlage 1 worden de structuren weergegeven van onderstaande verbindingen Verbinding 1

3-(4-aminophenyl)-2-((tert-butoxycarbonyl)amino)propaanzuur

Verbinding 2

tert-butyl 3-(4-aminophenyl)-2-((tert-butoxycarbonyl)amino)propanoaat

Verbinding 3

tert-butyl 2-((tert-butoxycarbonyl)amino)-3-(4-((2-chloroethyl)amino)phenyl) propanoaat

Verbinding 4

tert-butyl 2-((tert-butoxycarbonyl)amino)-3-(4-((2-hydroxyethyl)amino)phenyl) propanoaat

Verbinding 5

tert-butyl 3-(4-(bis(2-hydroxyethyl)amino)phenyl)-2-((tert-butoxycarbonyl) amino)propanoaat

Verbinding 6

tert-butyl 2-((tert-butoxycarbonyl)amino)-3-(4-((2-hydroxyethyl)(2-tosyloxy) ethyl)amino)phenyl)propanoaat

Verbinding 7

tert-butyl 3-(4-(bis(2-(tosyloxy)ethyl)amino)phenyl)-2-((tert-butoxycarbonyl) amino)propanoaat

Verbinding 8

tert-butyl 2-((tert-butoxycarbonyl)amino)-3-(4-((2-(fluoro-[18F])ethyl)(2-hydroxy ethyl)amino)phenyl)propanoaat

Verbinding 9

tert-butyl 2-((tert-butoxycarbonyl)amino)-3-(4-((2-(fluoro-[18F])ethyl)(2-(tosyl oxy)ethyl)amino)phenyl)propanoaat

Verbinding 10

2-amino-3 (4-((2-fluoro-[18F])ethyl)(2-hydroxyethyl)amino)pheny)propaanzuur

1.

INLEIDING

1.1

HERSENTUMOREN Hersentumoren kunnen gedefinieerd worden als intracraniale neoplasma of

gezwellen en worden gekenmerkt door hun ongecontroleerde celdeling en proliferatie [1]. Meest voorkomend zijn de glioma die ontstaan uit de glia- of steuncellen van de hersenen. Enerzijds worden hersenglioma volgens de World Health Organization (WHO) gegradeerd in twee categorieën: ten eerste laaggradige glioma die graad I en II omvatten en daarnaast hooggradige glioma die bestaan uit graad III en IV. Anderzijds kunnen glioma onderverdeeld worden in astrocytoma en oligodendroglioma welke beide zowel onder de vorm van laag- als hooggradige glioma kunnen voorkomen [2]. Laaggradige glioma, die een gemiddelde overleving van 5 à 10 jaar vertonen, komen voornamelijk voor bij jongere patiënten rond de 40 jaar en presenteren een betere prognose dan patiënten met hooggradige glioma. In 50-75 % van de gediagnosticeerde gevallen transformeren deze laaggradige glioma echter binnen de 5 jaar naar hooggradige waaronder maligne astrocytoma, anaplastische astrocytoma en glioblastoma multiforme (GBM) [3], [4]. Hooggradige glioma, die voornamelijk voorkomen bij patiënten rond de 60 jaar, kunnen zowel primair op zichzelf ontstaan als secundair uit laaggradige glioma. Zo zijn maligne astrocytoma, anaplastische astrocytoma, glioblastoma multiforme (GBM) en anaplastische oligodendroglioma de voornaamste. Aangezien deze tumoren veel agressiever van aard zijn, is de prognose aanzienlijk slechter dan voor laaggradige glioma. GBM, dat meer dan 80% van de maligne glioma en 45%-50% van alle glioma omvat, behoort tot de meest voorkomende primaire glioma. Met zijn gemiddelde overleving van 1 jaar en zijn gradering volgens WHO als graad IV wordt het daarenboven aanzien als de meest letale vorm van primaire glioma [1], [4]. De conventionele behandelingsstrategieën in de neuro-oncologie omvatten chirurgie, radiotherapie en chemotherapie. De behandeling van laaggradige en hooggradige glioma verschilt echter sterk. Bij patiënten met een laaggradige hersentumor is chirurgische resectie meestal niet mogelijk vermits de tumor kritische structuren bevat zoals taalzones, of omdat ze een te grote zone van de hersenen omvat [1].

1

Aangezien de behandeling bijgevolg uitdagend is en er doorgaans weinig symptomen optreden gedurende de eerste jaren, wordt bij de meeste patiënten met laaggradige tumoren geopteerd voor een “watch and wait” beleid. Daarbij functioneren de patiënten veelal neurologisch normaal en kunnen de vaak voorkomende epileptische aanvallen in het algemeen tot een zekere graad onder controle gehouden worden met anticonvulsiva. Vermits de progressie van laaggradige naar hooggradige tumoren een veel voorkomend fenomeen is, wordt opvolging van de tumor verzekerd door het secuur waarnemen van de neurologische symptomen alsook het periodiek nemen van MRI/PET scans [5]. Hooggradige glioma komen wel onmiddellijk in aanmerking voor behandeling omdat deze tumoren sneller groeien en agressiever van aard zijn. Initieel zal een zo groot mogelijk deel van de tumor verwijderd worden door chirurgische resectie met zo weinig mogelijk nadelige effecten op de neurologische functies. Chirurgische resectie wordt gewoonlijk gevolgd door radiotherapie, met doorgaans een totale dosis van 60 Gy in fracties van 2 Gy per dag, en chemotherapie [1], [6] 1.2

BEELDVORMING VAN TUMOREN

1.2.1 Inleiding Om hersentumoren vroegtijdig te kunnen diagnosticeren, behandelen en opvolgen, is het belangrijk dat ze correct in beeld gebracht worden. Aan de hand van de steeds evoluerende niet-invasieve beeldvormingstechnieken kan een schatting gemaakt worden van de locatie en de omvang van de tumor wat kritisch is bij het bepalen van de aanpak van patiënten met glioma. Terwijl Computed Tomography (CT) en Magnetic Resonance Imaging (MRI) een goed beeld geven omtrent de morfologische en anatomische aspecten kunnen Positron Emission Tomography (PET) en Single Positron Emission Computed Tomography (SPECT) de twee voorgaande technieken aanvullen met metabolische, biochemische en functionele informatie over de tumor [2]. 1.2.2 Magnetic Resonance Imaging (MRI) De anatomische beeldvormingstechniek MRI vormt de gouden standaard voor de visualisatie van glioma en geeft informatie over de locatie en de grootte van de tumor. Het vormt de basis voor de initiële diagnose, behandelingsplanning en posttherapeutische

2

opvolging van hersentumoren. Het principe waarop MRI gebaseerd is, wordt hieronder weergegeven [7]. De meeste atomen in het menselijk lichaam bevatten een gelijke hoeveelheid neutronen en protonen die elk fungeren als een kleine magneet en elkaars magnetisatie bijgevolg opheffen. Bepaalde atomen in het lichaam bevatten echter een kern met een oneven aantal protonen of neutronen zoals bijvoorbeeld waterstof-1, koolstof-13 en natrium-23, waardoor de magnetische neutraliteit van deze kernen vervalt. In zijn geheel zal het lichaam echter geen netto magnetisatie vertonen aangezien de magnetische dipolen naar verschillende richtingen georiënteerd zijn wat een nettoresultaat van nul geeft [8]. Wanneer de patiënt zich in een MRI toestel bevindt, wordt hij/zij blootgesteld aan een uitwendig magnetisch veld waarmee de magnetisaties in het lichaam zich parallel of antiparallel zullen alligneren. Een kleine meerderheid van de atomen zal zich parallel richten ten opzichte van het veld wat immers overeenkomt met de lagere energetische toestand. Aan dit magnetisch veld wordt via een radiofrequentie (RF) een hoeveelheid energie toegevoegd die overeenstemt met het energieverschil tussen de parallelle en antiparallelle toestand. Hierdoor zullen de nucleï van die kleine meerderheid van atomen die zich eerst parallel alligneerden, na absorptie van deze energie, exciteren naar de hogere energietoestand en zullen de magnetisaties bijgevolg wijzigen van parallel naar antiparallel (Figuur 1.1) [9].

Figuur 1.1: Schematische voorstelling van de richting van de magnetisatie van de atomen ten opzichte van het uitwendig magnetisch veld B0. Wanneer een RF puls wordt toegevoegd, zal de magnetisatie wijzigen van parallel naar antiparallel wat overeenkomt met een hogere energietoestand [9].

3

Bij het stoppen van de RF puls zal relaxatie optreden naar de grondtoestand en wordt de geabsorbeerde energie terug vrijgesteld onder de vorm van RF energie die op zijn beurt opgevangen wordt door de ‘receiver coil’. De alternerende elektrische stroom die zo gegenereerd wordt, vormt het signaal waardoor een MRI beeld gereconstrueerd kan worden [9]. Het contrast tussen de grijze materie, de witte materie en het cerebrospinaal vocht kan versterkt worden door toediening van paramagnetische contraststoffen zoals complexen van gadolinium (Gd). Aangezien de bloedhersenbarrière (BHB) in de meeste gevallen doorbroken is bij hooggradige glioma kunnen de contrasstoffen hierdoorheen lekken om zo de hersentumor te bereiken. Op deze manier treedt er op MRI contrastversterking op daar waar de hersentumor gelocaliseerd is. Op MRI beelden van laaggradige glioma zal amper of geen contrastversterking waarneembaar zijn door Gd aangezien de BHB veelal niet doorbroken is en de contraststof de hersentumor bijgevolg niet kan bereiken [4], [10]. MRI kent echter ook enkele beperkingen. Een eerste beperking van MRI is dat een verhoogd contrast niet steeds met zekerheid te wijten is aan de aanwezigheid van hooggradige tumoren. Het is namelijk ook mogelijk dat de BHB doorbroken is ten gevolge van inflammatie, geïnduceerd door radiatie of chirurgie [7]. Een tweede beperking van MRI is

het

feit

dat

contrastversterking

geen

betrouwbare

aanwijzing

is

voor

de

posttherapeutische terugkeer van hersentumoren aangezien dit ook te wijten kan zijn aan therapie-geïnduceerde letsels zoals radiatie-necrose. Daarnaast vormt de onderschatting van de omranding van de volledige hersentumor op MRI, wat ook de Region Of Interest (ROI) genoemd wordt, een derde welbekend probleem aangezien de infiltratie van tumorcellen veelal verder reikt dan dat de ROI doet blijken [11]. 1.2.3 Positron Emission Tomography (PET) Positron Emission Tomography (PET) is een voorbeeld van niet-invasieve functionele beeldvorming die gebruik maakt van radiogelabelde tracers om het verhoogde glucose-, aminozuur- of lipidenmetabolisme van maligne tumoren in beeld te brengen. PET geeft dus de veranderingen in biochemische en fysiologische eigenschappen weer van tumorcellen soms nog voordat anatomische en dus morfologische wijzigingen waargenomen kunnen worden op bijvoorbeeld MRI. Door zijn goede resolutie, zijn hoge sensitiviteit en zijn 4

nauwkeurige kwantificatie is het gebruik van PET tegenwoordig van groot belang bij het stellen van de diagnose, het bepalen van de prognose en de keuze van de behandeling van verschillende soorten kankers waaronder ook hersentumoren. Veelal worden PET en MRI gecombineerd om de precisie van de tumorlocalisatie te verhogen [7], [12]. De visualisatie van hersentumoren met PET is gebaseerd op het β+ verval van intraveneus geïnjecteerde radiotracers. De nucleus van de gebruikte radio-isotopen moet steeds een protonenexcedent bezitten waardoor het protonengetal met één eenheid zal afnemen bij de omzetting van een proton naar een neutron. Gelijktijdig zullen er een β+ deeltje en een neutrino deeltje vrijkomen. De meest gebruikte PET radionucliden in de neuro-oncologie zijn 11C en 18F, welke dus β+ stralers zijn, en waarbij de keuze tussen beide vaak gebaseerd is op hun verschil in halfwaardetijd. Zo heeft

11

C een halfleven van slechts

20,3 min terwijl 18F een halfleven heeft van 109,8 min [12]. Voor de klinische toepassingen in de neuro-oncologie wordt het gebruik van

18

F-

gelabelde PET tracers meestal verkozen omwille van de langere halfwaardetijd, zeker indien het ziekenhuis geen on-site cyclotron bezit. Het positron of β+ deeltje dat uitgestraald wordt, heeft dezelfde massa als een elektron maar is afkomstig uit de kern en draagt de tegengestelde lading. De energie van het positron varieert tussen 0 en zijn maximale energetische waarde (Emax) die verschillend is voor elk radionuclide en weergegeven wordt voor enkele radionucliden in Tabel 1.1 [12], [13]. Tabel 1.1: Enkele radionucliden met hun bijhorende halfwaardetijd en maximale energetische waarden(Emax) [12].

Halfwaardetijd (min)

Emax van β+ (MeV)

20,3

0,961

F

109,8

0,634

O

2,1

1,732

9,97

1,190

Radionuclide 11

C

18 15

13

N

5

De radiogelabelde PET tracers accumuleren ter hoogte van de hersentumor en zenden β+ deeltjes uit die reageren met de omliggende materie via Coulomb interacties. Hierbij treden er excitaties en ionisaties op waardoor het positron energie verliest. Bij het bereiken van een energie-inhoud, gelijkaardig aan deze van een elektron, zal het positron met een elektron interageren volgens een proces dat omschreven wordt als annihilatie. Door de collisie van het positron met het elektron worden twee fotonen uitgestraald die elk een energetische waarde van 511 KeV hebben en onder een hoek van 180°  0,5° staan (Figuur 1.2A) [14].

Figuur 1.2: A) Annihilatie van een proton en een elektron met vrijstelling van 2 fotonen van elk 511 KeV in tegenovergestelde richting. B) Detectie van de fotonen met behulp van een ringvormige detector in de PET camera [12].

Wanneer deze twee fotonen op exact hetzelfde moment loodrecht tegenover elkaar invallen op de scintillatiedectoren van de PET camera, die in een ringvorm georiënteerd zijn, zal de energie geabsorbeerd worden door de detectoren en heruitgestraald worden onder de vorm van zichtbaar licht. Het lichtsignaal wordt dan omgezet naar een elektrische stroom, evenredig met de energie van de invallende fotonen (Figuur 1.2 B). Een benadering van de locatie van de tumor is mogelijk met PET dankzij deze simultane detectie van de annihilatiefotonen die ontstaan ter hoogte van de radiotracer. Uit de miljoenen annihilatieprocessen die plaatsvinden ter hoogte van de tumor kan een driedimensioneel beeld gecreëerd worden zodat de locatie en de omvang van de tumor waarneembaar worden [12], [15].

6

1.3

AMINOZUURTRANSPORT IN TUMORCELLEN

1.3.1 Algemeen Aangezien tumorcellen sneller delen en prolifereren dan normale cellen hebben ze een verhoogde nood aan aminozuren (AZ), die een belangrijke rol spelen in hun groei en overleving [16]. Om aan deze noden te voldoen, vertonen ze een overexpressie aan AZtransporters die het transmembranair transport van AZ mediëren. De opgenomen AZ kunnen enerzijds accumuleren in de tumorcellen, maar anderzijds ook geïncorporeerd worden in proteïnen tijdens de proliferatie. Na intraveneuze injectie van radiogelabelde AZ zal slechts een kleine fractie hiervan geïncorporeerd worden in proteïnen waardoor het belang van de proteïnesynthese minimaal blijkt voor de visualisatie van tumoren ten opzichte van het belang van het sterk verhoogde AZ-transport [17]. De accumulatie van AZ in maligne cellen ten gevolge van het verhoogd transport kan door twee factoren negatief beïnvloed worden. Enerzijds kan er efflux optreden van het AZ uit de cel en anderzijds is het mogelijk dat er vorming en efflux van metabolieten plaatsvindt. Aangezien de meeste AZ-transportsystemen ook niet-metaboliseerbare of synthetische AZ-analogen kunnen transporteren en er bij de beeldvorming van tumoren getracht wordt om gebruik te maken van niet-metaboliseerbare radiogelabelde AZ-analogen kan er bijgevolg geen efflux optreden van radiogelabelde metabolieten uit de cel. Daardoor zal de kwantificatie van de snelheid van het AZ-transport in deze gevallen mogelijk zijn op basis van relatief eenvoudige kinetische modellen [18]. 1.3.2 Aminozuurtransportsystemen Er bestaan verschillende transportmechanismen voor de opname van AZ in de cel waarbij het carrier-gemedieerd transport over de plasmamembraan de belangrijkste manier is. Hierbij zal een AZ op de specifieke katalytische site van het transportproteïne binden. Het verhoogd AZ-transport, dat kenmerkend is voor tumorcellen, kan op twee manieren ontstaan zijn. Dit kan zowel het gevolg zijn van een verhoogde affiniteit van het AZ voor het membraanproteïne enerzijds als van een verhoogde expressie van de transportcarriers op de membraan anderzijds [18].

7

Vermits er verschillende mechanismen bekend zijn van actief AZ-transport bestaat er een indeling van de AZ-transportsystemen op basis van substraatselectiviteit en Na+afhankelijkheid. De drie belangrijkste AZ transportsystemen: systeem A, systeem ASC en systeem L en hun specifieke werking worden weergegeven in Figuur 1.3. De Na+-afhankelijke systemen waaronder systeem A en systeem ASC zijn vrijwel in alle weefsels aanwezig en maken bij het transport van AZ gebruik van de vrije energie die voorkomt onder de vorm van een elektrochemische Na+-gradiënt over de plasmamembraan. Systeem A, met zijn voorkeur voor Alanine, en systeem ASC, met zijn voorkeur voor Alanine, Serine en Cysteïne, staan beiden in voor het transport van kleine neutrale AZ [2], [16]. Systeem A laat aan de hand van het Na+/AZ-symport directe aanconcentratie van een bepaald AZ toe en is trans-inhibited wat wil zeggen dat de opname van bepaalde AZ niet meer mogelijk is wanneer deze intracellulair in hoge aantallen aanwezig zijn. Systeem ASC waarvan de systeem ASC-AZ-transporters 1 en 2, respectievelijk ASCT 1 en ASCT 2, deel uitmaken, zal naast zijn afhankelijkheid van de Na+-gradiënt bovendien telkens een intracellulair AZ moeten uitwisselen voor elk opgenomen extracellulair AZ waardoor het dus enkel indirecte aanconcentratie van een specifiek AZ toelaat. Verschillend van systeem A zal systeem ASC net trans-stimulated zijn waarbij de aanwezigheid van intracellulaire AZ de opname van extracellulaire AZ net stimuleert [2], [18], 1.3.3 Systeem L Systeem L, dat een voorkeur heeft voor Leucine, onderscheidt zich van de voorgaande AZ-transporters door zijn onafhankelijkheid van Na+ en door zijn transport van volumineuze neutrale AZ met aromatische of vertakte zijketens. Het mechanisme van dit transportproteïne is gebaseerd op het antiport van AZ met een 1:1 stoichiometrie wat betekent dat voor elk opgenomen extracellulair AZ een intracellulair AZ de cel moet verlaten. Het efflux-substraat van systeem L is doorgaans een gemeenschappelijk substraat van een unidirectioneel systeem zoals systeem A dat hiervoor een gradiënt opbouwt met behulp van zijn Na+/AZ symport. Daarnaast ook kenmerkend voor systeem L is zijn gelijkaardige selectiviteit voor substraten intra- en extracellulair, maar zijn totaal asymmetrische affiniteit voor substraten waarbij de affiniteit intracellulair veel lager is dan extracellulair [19], [20].

8

Binnen systeem L krijgen we te maken met vier subtypes van L-type Aminozuur Transporters (LAT) namelijk LAT 1, LAT 2, LAT 3 en LAT 4. Aangezien systeem L actief is ter hoogte van de luminale zijde van de bloedhersenbarrière (BHB), is dit transportsysteem momenteel het meest geschikt voor de visualisatie van hersentumoren. Het laat de substraten van systeem L namelijk toe om ook die regio’s van glioma te kunnen binnendringen die niet toegankelijk zijn voor contraststoffen en bijgevolg niet contrastversterkend zijn op MRI [17].

Figuur 1.3: Schematische voorstelling van systeem A, systeem L en systeem ASC ter hoogte van de plasmamembraan. Systeem A is Na+-afhankelijk en vertoont Na+/AZ symport. Systeem ASC is ook Na+-afhankelijk maar is een AZ antiporter. Systeem L ten slotte is Na+-onafhankelijk en vertoont AZ- antiport met 1:1 stoichiometrie [2].

Om een substraat te zijn van LAT 1 moet het AZ of de AZ-gerelateerde verbinding aan twee voorwaarden voldoen. Enerzijds moet het substraat zowel een vrije -carboxylgroep als een vrije -aminogroep bevatten om binding te kunnen aangaan met LAT 1 aangezien de binding afhankelijk is van de interactie tussen de positieve en de negatieve ladingen van het substraat en de substraat-bindingssite. Anderzijds speelt de hydrofobiciteit van de AZ zijketen ook een belangrijke rol aangezien de stabiliteit van de binding van het substraat met LAT 1 sterk bepaald wordt door de hydrofobe interacties tussen de zijketen van het substraat en de substraat-bindingssite (Figuur 1.4). Wanneer de intraveneus geïnjecteerde radiogelabelde AZ-analogen aan deze voorwaarden voldoen, zullen ze accumuleren ter hoogte van de hersentumorcellen en zal visualisatie van de glioma bijgevolg mogelijk worden met PET [21], [22], [23]. 9

Aangezien vele variaties van het substraat aan deze vereisten voor substraatbinding voldoen, zal systeem L een brede substraatselectiviteit vertonen en zullen dus niet enkel natuurlijke AZ getransporteerd worden, maar ook niet-natuurlijke AZ-gerelateerde verbindingen zoals onder meer L- dopa, melphalan, gabapentine etc. Ook de radiogelabelde afgeleiden van aromatische AZ, waarvoor meestal geopteerd wordt bij het onderzoek naar een geschikte tracer voor tumorvisualisatie, worden door systeem L getransporteerd. Anderzijds zal een radiogelabeld AZ-analoog omwille van de overlap in substraatselectiviteit vaak gelijktijdig substraat zijn voor meerdere AZ-transportsystemen [16], [17], [21].

Figuur 1.4: Binding van het substraat met LAT 1 met aanduiding van de drie belangrijkste regio’s voor interactie. Enerzijds interactie tussen de positieve en de negatieve ladingen van het substraat en de bindingssite. Anderzijds hydrofobe interactie tussen de LAT 1 bindingssite en de zijketen van het substraat [22].

1.3.4 Aminozuurtransport in tumoren Verscheidene AZ-transportsystemen vertonen upregulatie in kankercellen. Zo komen de AZ-transporters LAT 1 en ASCT2 simultaan tot overexpressie in een wijde range aan humane kankers waaronder glioma en spelen ze er een belangrijke rol in de groei en de proliferatie [2], [17]. Deze AZ-antiporters zouden instaan voor het behoud van evenwicht van de cytoplasmatische AZ-pool van tumorcellen. Volgens Fuchs et al., 2005, kan verondersteld worden dat ASCT 2, wat voornamelijk het transport van glutamine in de cel medieert, de cytoplasmatische AZ-pool onderhoudt [24]. Dit kan enerzijds celapoptose voorkomen en anderzijds de energiestatus van de cel onderhouden door de nettowinst van 10

glutamine. Daarnaast zal de evenwichtige cytoplasmatische AZ-pool ook LAT 1 stimuleren in zijn functie waardoor de cel voorzien wordt van essentiële AZ die de groei van kankercellen bevorderen. LAT 1 zou namelijk de mTOR signaalpathway stimuleren waarbij de proteïnetranslatie gereguleerd wordt door signalen zoals groeifactoren, de energiestatus van de cel en de aanwezige nutriëntenconcentraties [2], [17], [24]. Aangezien het nut van radiogelabelde AZ selectief voor systeem ASCT nog maar weinig getest is in het kader van tumorvisualisatie wordt de nadruk in het onderzoeksveld voornamelijk gelegd op radiogelabelde AZ-afgeleiden die substraat zijn van LAT 1 [2]. 1.4

PET-TRACERS

1.4.1 [18F]-FDG De beeldvorming van tumoren aan de hand van een intraveneuze injectie van het glucose analoog, 2-[18F]-Fluoro-2-deoxy-D-glucose ([18F]-FDG), vormt de eerste en meest gebruikte klinische toepassing van PET die, eventueel in combinatie met CT of MRI, uitgegroeid is tot een routinetechniek voor zowel de staging als de restaging van tumoren (Figuur 1.5) [11]. Het [18F]-FDG zal accumuleren in de tumorcellen aangezien deze als gevolg van hun sterke proliferatie en groei een verhoogd glucosemetabolisme bezitten en bijgevolg een gestegen expressie van de glucose transporters (GLUT) en het enzym hexokinase vertonen [7]. Net als glucose zal [18F]-FDG vanuit het plasma naar de weefsels getransporteerd worden met behulp van de Na+-afhankelijke glucosetransporter 1 (GLUT1), die aanwezig is in de celmembraan van de tumorcellen [11]. Binnen in de cel worden [18F]-FDG en glucose gefosforyleerd door hexokinase tot respectievelijk [18F]-FDG-6-fosfaat ([18F]-FDG-6-P) en glucose-6-fosfaat (Figuur 1.5). Door de aanwezigheid van een 18F-atoom in [18F]-FDG-P op de plaats van een O-atoom in glucose zal [18F]-FDG-6-P zich niet als een substraat gedragen voor de enzymatische degradatiepathways en is verdere metabolisatie bijgevolg uitgesloten. Bovendien zorgen de impermeabiliteit van de celmembraan voor gefosforyleerd [18F]-FDG en de nagenoeg afwezige activiteit van glucose-6-fosfatase samen voor de accumulatie van 18

F-FDG-6-P en zo ook voor de visualisatie van de maligne tumorcellen op PET [15]. Met betrekking tot de beeldvorming van hersentumoren bezit [18F]-FDG een

belangrijke beperking. Aangezien glucose de enige energiebron is voor de hersenen zullen 11

gezonde hersencellen reeds zelf een verhoogd glucosemetabolisme vertonen. [18F]-FDG zal bijgevolg ook in deze cellen accumuleren en het verschil in contrast tussen de tumorcellen en het omliggende gezonde hersenweefsel zal vervagen waardoor een nauwkeurige bepaling van de omranding van de volledige hersentumor moeilijk of zelfs onmogelijk zal worden met [18F]-FDG-PET. Een tweede limitatie van [18F]-FDG is de opname in inflammatoire cellen zoals macrofagen en neutrofielen wat kan leiden tot vals positieve resultaten op PET-scans [17]. Omwille van de beperkingen van [18F]-FDG wordt het onderzoek naar andere types van PET tracers, zoals radiogelabelde AZ-analogen, voor de beeldvorming van hersentumoren intensief verdergezet [2], [7].

Figuur 1.5: Schematische weergave van het carriergemedieerd transport van glucose en [18F]-FDG via GLUT1. [18F]-FDG en glucose worden gefosforyleerd door hexokinase (HK) en kunnen in normale cellen terug gedefosforyleerd worden door glucose-6-fosfatase (G6Pase) [25].

1.4.2 AZ-PET tracers 1.4.2.1 Algemeen AZ- en AZ-gerelateerde-PET tracers vertonen een hoge opname in het hersentumorweefsel en een lage opname in gezonde hersencellen wat de basis vormt van hun sensitievere detectie van hersentumoren op PET ten opzichte van [18F]-FDG. L-[methyl11

C]-methionine ([11C]-MET) en [18F]-fluoroethyl-tyrosine ([18F]-FET) zijn twee veel-

voorkomende AZ-PET tracers die gebruik maken van het transportmechanisme systeem L en een sterke correlatie vertonen wat betreft de informatie die af te leiden valt uit PET-scans. Zo zal er bijvoorbeeld een sterke correlatie zijn in de opname van beide tracers in primaire en terugkerende intracerebrale tumoren en glioma maar ook in het verschil in contrast tussen normaal- en tumorweefsel op PET-scans [7]. 12

Wat [11C]-MET-PET betreft, zal [11C]-MET na opname in de cel enerzijds grotendeels geïncorporeerd worden in proteïnen, en anderzijds ook verder gemetaboliseerd worden in verschillende pathways waardoor er veel radiogelabelde metabolieten ontstaan en de analyse van de kinetiek gecompliceerder wordt [2]. [18F]-FET daarentegen zal geen metabolisatie of proteïne-incorporatie ondergaan en louter onveranderd gecapteerd worden en accumuleren in de tumorcellen. Aangezien hoofdzakelijk de AZ-transportsnelheid gemeten wordt met [18F]-FET-PET zal de kinetiek van [18F]-FET relatief eenvoudig analyseerbaar zijn volgens een twee-compartimenteel model [7]. De verschillende AZ tracers kennen drie belangrijke toepassingen die naargelang de specifieke tracer meer of minder uitgesproken kunnen zijn. Zo spelen ze een rol in de gradering van tumoren, de omlijning van de ROI en de differentiatie tussen terugkerende tumoren en behandelingsgeïnduceerde veranderingen [11]. 1.4.2.2 L-[methyl-11C]-methionine Deze AZ-PET tracer, L-[methyl-11C]-methionine, bewijst hoofdzakelijk zijn waarde bij de correctere bepaling van de tumormarges in niet-contrastversterkende glioma op MRI waar [18F]-FDG niet zinvol blijkt te zijn (Figuur 1.6). Hypometabolische regio’s op [18F]-FDGPET kunnen immers zowel op laaggradige tumoren, posttherapeutische letsels als nietspecifieke informatie wijzen terwijl hypermetabolische regio’s op hooggradige tumoren duiden. [11C]-MET-PET zal in deze hypo- of isometabolische regio’s het tumorvolume beter kunnen definiëren in 88% van de gevallen van laaggradige tumoren wat ook de planning van radiotherapie ten goede komt. Wat betreft de differentiatie tussen radiotherapiegeïnduceerde letsels en terugkerende glioma is [11C]-MET-PET niet de eerste keuze aangezien het onderscheid tussen beide met deze tracer moeilijk te maken valt. Ook het korte halfleven van ongeveer 20 minuten, zoals reeds eerder vermeld, vormt een beperking van [11C]-MET [7], [26], [27].

Figuur 1.6: Structuurformule van L-[methyl-11C]-methionine.

13

1.4.2.3 [18F]-fluoroethyl-tyrosine Het niet-natuurlijk voorkomend AZ, [18F]-FET, met zijn halfleven van ongeveer 110 minuten en zijn uitstekende differentiatie tussen goedaardige radiotherapie-gerelateerde wonden en terugkerende glioma op [18F]-FET-PET is dus een goed alternatief ten opzichte van [11C]-MET voor dit doeleinde (Figuur 1.7). Wanneer er immers na screening met MRI een vermoeden is van terugkerende glioma kan [18F]-FET-PET duidelijkheid scheppen en zo onder-

en

overbehandeling,

met

hun

bijhorende

nevenwerkingen,

voorkomen.

Terugkerende tumoren worden namelijk gekenmerkt door een hoge centrale opname van [18F]-FET en posttherapeutische letsels eerder door een homogene opname van [18F]-FET rondom de holte, bekomen na resectie [4].

Figuur 1.7: Structuurformule van [18F]-fluoroethyl-tyrosine.

Verschillende studies suggereren dat er in het geval van terugkerende tumoren met behulp van [18F]-FET-PET een onderscheid gemaakt kan worden tussen hooggradige en laaggradige glioma door analyse van de kinetiek van [18F]-FET. Een vroege piekopname met een snelle washout van [18F]-FET ten opzichte van de normale cellen zou dan op hooggradige tumoren wijzen terwijl een tragere washout na een langzaam stijgende opnamekinetiek eerder laaggradige tumoren zou doen vermoeden [2],[17]. [18F]-FET vertoont verder ook nog enkele nadelen waaronder ten eerste dat het zowel getransporteerd wordt door het Na+-onafhankelijk systeem L als door de Na+afhankelijke systemen B0,+ en B0 waardoor het transportmechanisme van [18F]-FET als complex beschouwd mag worden. Daarnaast zijn er ook enkele aanwijzingen voor het feit dat [18F]-FET eerder selectief zou zijn voor LAT 2 en maar weinig door LAT 1 getransporteerd zou worden. [18F]-FET vertoont namelijk een opname in de spieren waar LAT 2 tot expressie komt, maar geen opname in de inflammatoire cellen waar LAT 2 niet tot expressie komt [2], [28]. Dit laatste kan gezien worden als een voordeel ten opzichte van [18F]-FDG en [11C]-MET die wel in de inflammatoire cellen opgenomen worden. Tenslotte kan ook de snelle 14

radiochemische synthese van [18F]-FET met een rendement van 40 % na ongeveer 1 uur als een extra voordeel aanzien worden [18], [29]. 1.4.2.4 18F-gelabeld Melphalan-analoog Het uiteindelijke doel van deze masterproef is om een

18

F-gelabeld Melphalan-

analoog te ontwikkelen. Melphalan, een afgeleide van het neutraal AZ L-phenylalanine behoort tot de stikstofmosterdverbindingen en verleent zijn nut in de oncologie als antitumoraal geneesmiddel (Figuur 1.6). Alhoewel Melphalan herkend wordt door de LAT 1 transporter en traag transport eventueel mogelijk is, wordt de verbinding niet aanzien als een goed substraat. Het 18F-gelabeld analoog zal zich namelijk net als Melphalan eerder als een inhibitor van LAT 1 gedragen die ter hoogte van de transporter gebonden blijft en zo hersenglioma in beeld kan brengen op PET [19],[22].

Figuur 1.6: Structuurformule van Melphalan [22].

15

2.

OBJECTIEVEN Om hersentumoren vroegtijdig te kunnen diagnosticeren, behandelen en opvolgen, is

het belangrijk dat ze correct in beeld gebracht worden. In dat opzicht vormen vooral laaggradige glioma veelal een probleem. Aangezien de meest gebruikte PET-tracer, 2-[18F]Fluoro-2-deoxy-D-glucose ([18F]-FDG), echter niet de meest geschikte tracer is om hersentumoren in beeld te brengen, wordt er steeds meer onderzoek gedaan naar de ontwikkeling van radiogelabelde AZ-analogen. Het doel van deze masterproef is daarom de ontwikkeling van een

18

F-gelabeld Melphalan-analoog dat als inhibitor zal optreden ter

hoogte van de LAT 1-transporter, die tot overexpressie komt in tumorcellen. Een vertraagde klaring van een radiogelabelde inhibitor ter hoogte van deze transporter zou tot een betere visualisatie van laaggradige glioma kunnen leiden via PET-scans. De synthese van het gewenste eindproduct, 2-amino-3 (4-((2-fluoro-[18F])ethyl)(2hydroxyethyl)amino)pheny)propaanzuur (verbinding 10), bestaat uit drie stadia, namelijk de koude synthese, de radiosynthese en de deprotectie. Tijdens de koude synthese wordt een opeenvolging van synthesereacties ingezet uitgaande van de aangekochte verbinding 3-(4aminophenyl)-2-((tert-butoxycarbonyl)amino)propaanzuur (verbinding 1). De vorming van reactieproducten wordt continu opgevolgd met behulp van dunnelaagchromatografie (TLC) waarna de opzuivering van de gewenste producten telkens uitgevoerd wordt door middel van

silicagel

kolomchromatografie.

Met

behulp

van

Elektrospray

ionisatie-

massaspectrometrie (ESI-MS) wordt de identiteit van de structuren ten slotte bevestigd. In het tweede stadium worden twee van de bekomen syntheseproducten onderworpen aan een labeling met 18F. Tijdens deze radiosyntheses wordt er zowel gebruik gemaakt van een prosthetische groep [18F]-Fluoroethyltosylaat ([18F]-FeTos) als van [18F]Fluoride. De zure deprotectie ten slotte vormt het laatste stadium in de ontwikkeling van de LAT 1 inhibitor. In deze laatste stap worden de amino- en de carboxylfunctie, die een belangrijke rol spelen in de substraatherkenning van LAT 1, beschikbaar gemaakt voor binding met deze transporter.

16

3.

MATERIALEN EN METHODEN

3.1

REAGENTIA Naam

AcN

Specificaties Producent HPLC grade; 99,9+; H2O 200 ppm Chem-Lab NV(Overijse, BE)

ammoniumacetaat

p.a.

Merck Millipore (Darmstadt, DE)

Azijnzuur

 99,7 %

Sigma-Aldrich (Bornem, BE)

Boc-L-4 aminophenylalanine

/

Peptech (Burlington, USA)

CH2Cl2

HPLC grade; 99,8+; H2O 100 ppm

Chem-Lab NV (Overijse, BE)

/

Sigma-Aldrich (Bornem, BE)

 99,8 %

Sigma-Aldrich (Bornem, BE)

DMF

Anhydrous

Fisher Chemical (Geel, BE)

DMSO

99,5 %

Merck Millipore (Darmstadt, DE)

97 %

Sigma-Aldrich (Bornem, BE)

Solution; 2,5-3,3 M in THF

Sigma Aldrich (Bornem, BE)

EtOAc

HPLC grade; 99,8+; H2O 200 ppm

Chem-Lab NV (Overijse, BE)

K222

98 %

Acros organics (Geel, BE)

K2CO3

Anhydrous;  99,0 %

Fluka-Chemika (Bornem, BE)

MeOH

HPLC; 99,9 %; max. 0,05 % water

Lab-Scan (Hasselt, BE)

Na2CO3

99,5+

Sigma-Aldrich (Bornem, BE)

Na2SO4

Anhydrous; granular;  99,0 %

Sigma-Aldrich (Bornem, BE)

NaCl

 99,5 %

Sigma-Aldrich (Bornem, BE)

NaHCO3

99,7-100,3 %

Sigma-Aldrich (Bornem, BE)

n-hexaan

99+ ; H2O 100 ppm

Chem-Lab NV (Overijse, BE)

2-chloroethyl ptolueensulfonaat diethylether

ethyleen-di(ptolueensulfonaat) Ethyleenoxide

Silicagel TEA tert butyl trichloroacetemidaat THF

230-400 mesh Poriëndiameter: 60 Å 99 %

Sigma-Aldrich (Bornem, BE) Acros organics (Geel, BE)

96 %

Sigma-Aldrich (Bornem, BE)

99,9 %; anhydrous

Sigma-Aldrich (Bornem, BE)

p-tolueensulfonylchloride

99 %

Sigma-Aldrich (Bornem, BE)

Zeezand

Partikelgrootte: 50-70 mesh

Sigma-Aldrich (Bornem, BE)

17

3.2

APPARATUUR EN REACTIEMECHANISMEN

3.2.1 Toestellen Toestel Alumina kolom

Specificaties SEP-Pak Alumina N Plus

Cyclotron

Cyclone 18/9 cyclotron

Dosiscalibrator Massaspectrometer

Capintec CRC-15R 2695XE-LCT Premier XE TM

MiniGITA QMA kolom Rotavapor

SEP-Pak QMA Büchi Rotavapor R-215

Silica-plaatjes UV-lamp UV-vis spectrofotometer

Spectroline ENF-260C/FE, 254 nm Schimadzu UV-2100

Producent Waters, Zellik, België IBA, Louvain-La-Neuve, België Capintec Instruments, USA Waters, Zellik, België Raytest Isotopenmeβgeräte GmbH, Duitsland Waters, Zellik, België Büchi, Flawil, Zwitserland Macherey-Nagel, Düren, Duitsland Cambridge, UK Schimadzu, Zwitserland

3.2.2 Nucleofiele substitutiereactie: SN2 vs SN1 Een nucleofiele substitutiereactie is een organische reactie waarbij een elektronenrijke verbinding, namelijk een nucleofiel, met zijn vrij elektronenpaar een koolstofatoom aanvalt en zo de gebonden leaving group (LG) substitueert (Figuur 3.1). Op basis van het verschil in reactiemechanisme wordt er een indeling gemaakt in bimoleculaire en unimoleculaire nucleofiele substitutiereacties, respectievelijk SN2 en SN1 [30], [31].

Figuur 3.1: Reactiemechanisme van een nucleofiele substitutiereactie.

Een SN2-reactie is een bimoleculaire éénstapsreactie zonder intermediairen waarbij de concentratie van beide reagentia een rol speelt in de transitietoestand van de snelheidsbepalende stap (SBS). De transitietoestand is deze toestand waarbij het nucleofiel en het koolstofatoom nog niet volledig gebonden zijn en de binding tussen het koolstofatoom en de LG nog niet volledig verbroken is [30], [31].

18

Verder zijn er enkele factoren die de snelheid van een SN2-reactie beïnvloeden. Ten eerste zal de reactiviteit van het halogeenalkaan van groot belang zijn, deze daalt in volgende volgorde: methyl > primair > secundair > tertiair, wegens sterische hinder bij de aanval van het nucleofiel. Ten tweede zal een sterker nucleofiel resulteren in een hogere reactiesnelheid. Wanneer verbindingen met gelijkaardige afmetingen worden vergeleken, is de sterkere base steeds het beter nucleofiel. Wanneer de omvang niet vergelijkbaar is, wordt de nucleofiliciteit bepaald door de polariseerbaarheid van de molecule. Een derde beïnvloedende factor is de sterkte van de LG waarbij een lagere basiciteit overeenstemt met een betere LG. Ten slotte zal ook het solvent een invloed hebben op de reactiesnelheid waarbij polair aprotische solventen (vb. dimethylfuraan (DMF), dimethylsulfoxide (DMSO), dichloromethaan (CH2Cl2), diethylether (Et2O), tetrahydrofuraan (THF) en n-hexaan) de voorkeur genieten [30], [31]. Een SN1-reactie is een unimoleculaire tweestapsreactie met als eerste en snelheidsbepalende stap de vorming van het carbokation (CBC) door afsplitsing van de LG. Een goede LG is dus van groot belang bij een SN1-reactie. Daarnaast zal de stabiliteit van het gevormde CBC ook een grote invloed hebben op de snelheid van de reactie waardoor de reactiviteit van de halogeenalkanen, i.t.t. SN2-reacties, zal toenemen in volgende volgorde: methyl < primair < secundair < tertiair, aangezien een tertiair CBC het meest stabiel is. Verder zal ook de aanwezigheid van polaire solventen de stabiliteit van het CBC bevorderen door middel van solvatatie. Tijdens de tweede stap zal het nucleofiel vervolgens aan dit CBC binden. Vermits het nucleofiel geen rol speelt in de snelheidsbepalende stap mag het een neutrale vorm aannemen. Indien het nucleofiel immers basisch zou zijn, zou een competitieve eliminatiereactie, E1, kunnen optreden [30], [31]. 3.2.3 Kolomchromatografie Kolomchromatografie wordt veelal gebruikt bij de scheiding van verschillende substanties in een mengsel om een zuiver staal te bekomen. Hierbij wordt een staal aangebracht bovenop de stationaire of stilstaande fase, die zich in een kolom bevindt. De mobiele fase elueert continu over deze kolom. Aangezien de substituenten verschillende affiniteiten vertonen voor de stationaire fase en ermee interageren, worden ze selectief vertraagd en elueren ze bijgevolg elk op een ander tijdstip. Na de verscheidene synthesestappen, die verder aan bod komen, kon op deze manier het gewenste 19

reactieproduct telkens geïsoleerd worden van de niet-gereageerde of ongewenste componenten. Kolomchromatografie was hiervoor de geschikte scheidingsmethode omwille van zijn eenvoudige en snelle werking [32], [33]. In deze masterproef werd gebruik gemaakt van “Normal phase” vloeistof-vaste fase chromatografie (NP-LSC) met het polaire silicagel als stationaire fase. Na elke synthesereactie werd een nieuwe kolom aangemaakt om het gewenste reactieproduct te kunnen isoleren. Zoals weergegeven in Figuur 3.3 bevond zich onderaan de kolom een prop glaswol gevolgd door een laagje zand (1,5 cm) waarboven een suspensie van silicagel in nhexaan van ongeveer 20 cm hoog aangebracht werd. Dit werd na volledig uitzakken van de partikels gevolgd door een laagje zand, het poedervormig te scheiden staal en opnieuw een laagje zand.

Figuur 3.3: Weergave van de verschillende onderdelen die deel uitmaken van de kolom bij de scheiding van een poedervormige op te zuiveren stof met behulp van kolomchromatografie.

Om van het vloeibare reactiemengsel, dat bekomen werd na iedere synthesereactie, een poedervormig staal te verkrijgen, werd het mengsel onder verlaagde druk uitgedampt. Dit kon plaatsvinden met behulp van een rotavapor na toevoegen van een kleine hoeveelheid silicagel. Bovenop dit alles werd een mobiele fase gegoten die steeds bestond uit een mengsel van Ethylacetaat (EtOAc) en n-hexaan. De exacte verhouding tussen beide wordt verder weergegeven bij de verschillende synthesereacties. Het eluaat werd na doorlopen van de kolom opgevangen in proefbuisjes. 20

3.2.4 Dunnelaagchromatografie (TLC) Dunnelaagchromatografie (TLC) is een voorbeeld van planaire chromatografie. Dit is een scheidingstechniek die gebruikmaakt van een vlakke drager bij de scheiding van mengsels. De drager kan zowel polair als apolair zijn en was in dit onderzoek bedekt met een 0,20 mm dik laagje polair silica als stationaire fase waardoor er bijgevolg sprake was van “Normal

Phase”

TLC.

Aangezien

TLC

vergelijkbare

prestaties

vertoont

als

kolomchromatografie, een lage kostprijs heeft en eenvoudig is in gebruik, werd het steeds toegepast als eerste controle op de vorming van reactieproducten bij de verschillende synthesereacties [34], [35]. Het reactiemengsel werd onderaan het TLC-plaatje gespot waarna de drager in de, met mobiele fase verzadigde, glazen chromatografiekamer geplaatst werd. De mobiele fase liep over het TLC-plaatje door middel van capillaire krachten waarbij de substanties aanwezig in het mengsel verschillende migratiesnelheden vertoonden en zo gescheiden konden worden op basis van hun verdeling tussen de stationaire en de mobiele fase. Als mobiele fase werd voornamelijk gebruik gemaakt van een procentuele verhouding tussen EtOAc en n-hexaan of in sommige gevallen van een verhouding AcN en water waaraan een buffer toegevoegd was [36], [35]. De

visualisatie

van

de

verschillende

componenten

met

hun

individuele

migratiesnelheden werd na drogen van de drager mogelijk onder een UV-lamp met golflengte 254 nm. Veelal werd het TLC-plaatje bovendien gekleurd met ninhydrine om een specifieke kleuring te verkrijgen van de verschillende componenten. De reactie tussen ninhydrine (2,2-dihydroxy-1,3,-indandione), weergegeven in Figuur 3.4, en een amine geeft namelijk aanleiding tot de vorming van een bepaald intermediair. Dit intermediair condenseert vervolgens met een nieuwe ninhydrine molecule waardoor een chromofore verbinding, Ruhemann’s Purple, gevormd wordt en kleuring van de componenten optreedt (Figuur 3.4). Ninhydrine levert specifieke kleuren op op basis van de aanwezigheid van en bijgevolg de reactie met primaire, secundaire of tertiaire aminogroepen. Deze kleuren, na drogen met warme lucht, respectievelijk paars, oranje-bruin en blauw-grijs [37].

21

Figuur 3.4: Structuurformule van Ninhydrine (links) en Ruhemann’s Purple (rechts).

Ook bij kolomchromatografie werd er gebruik gemaakt van TLC met de intentie aan te kunnen geven welke proefbuisjes een component bevatten en welke niet. Dit werd uitgevoerd door elke proefbuis te spotten op een in hokjes verdeeld TLC-plaatje en dit onder de UV-lamp te bestuderen. Wanneer een hokje een donkere vlek vertoonde onder UV-licht, kon daaruit besloten worden dat de overeenstemmende proefbuis een bepaalde component bevatte. 3.2.5 Massaspectroscopie (MS) Op verscheidene momenten in dit onderzoek werd massaspectrometrie (MS) uitgevoerd door het labo medicinale chemie ter bevestiging van de identiteit van de bekomen componenten. MS is gebaseerd op de vorming van positieve en/of negatieve ionen door middel van een ionisatieproces. De vorming van de ionen is in dit onderzoek mogelijk gemaakt door middel van Elektrospray ionisatie (ESI) waarbij zowel positieve als negatieve ionen ontstaan. Naast het moleculair ion ontstaan ook fragmentionen door fragmentatie van de molecule. Deze ionen worden vervolgens gescheiden op basis van hun massa-overladingsverhouding (m/z) waarna de detectie en de registratie plaatsvindt. Een massaspectrum zet de procentuele hoeveelheid van de verschillende ionen uit in functie van hun m/z en is karakteristiek voor een specifieke organische molecule [38], [39]. 3.2.6

18

F productie

Om de synthese van

18

F-gelabelde AZ-analogen mogelijk te maken, dient eerst

18

F

geproduceerd te worden. Deze +-straler wordt aangemaakt in een cyclotron of deeltjesversneller volgens de kernreactie: 18O (p,n) 18F. De stabiele isotoop 18O wordt onder de vorm van [18O]-H2O, dat meer dan 95 % verrijkt is, bestraald met protonen die een kinetische energie van 18 MeV bezitten na versnelling in het cyclotron. Deze energie-inhoud is noodzakelijk opdat het proton de Coulombbarrière zou kunnen overwinnen bij de aanval van de eveneens positief geladen kern van 18O [13], [40]. 22

De opstelling van een cyclotron wordt weergegeven in Figuur 3.5 en bevindt zich in een vacuüm. De twee D-vormige elektroden (D’s), die zich tussen de twee polen van de elektromagneet bevinden, zijn verbonden door een radiofrequentie oscillator waardoor een potentiaalverschil aangelegd wordt met alternerende polariteit. In de opening tussen deze D’s wordt een ionenbron geplaatst die ontstaan is door een potentiaalverschil aan te leggen tussen een elektronenboog en daar een H2-gas doorheen te leiden. Het gas zal dan ionisaties ondergaan waarbij H-- en H+- ionen ontstaan. De protonen worden afgevoerd met de continue stroom van H2-gas terwijl de hydride-ionen aangetrokken worden naar de positief geladen D-elektrode [13], [41], [42].

Figuur 3.5: schematische weergave van de opstelling en de werking van het cyclotron. (http://www.yourdictionary.com//images/science/AScyclot.jpg (06-05-2015)) 1

Eens binnen in de D is het hydride-ion enkel nog onderhevig aan het magnetisch veld, dat loodrecht op het oppervlak van de D’s staat, en zal het een cirkelvormige baan afleggen. Telkens wanneer het hydride-ion de opening tussen de D’s opnieuw bereikt, zal de polariteit van het elektrisch veld gewijzigd worden waardoor het ion aangetrokken wordt naar de andere D en zijn kinetische energie steeds toeneemt. Na elke versnelling die optreedt in het elektrisch veld, neemt de straal van de cirkelvormige baan toe tot er een finale kinetische energie van 18 MeV bekomen wordt. Eenmaal de periferie bereikt is, worden de hydride-ionen doorheen een stripper geleid die de elektronen van de H-- ionen verwijdert en verlaten de zo ontstane protonen het magnetisch veld om met een kinetische energie van 18 MeV de target aan te vallen. Een cilinder, bestaande uit 99,9 % puur zilver of 99,9 % puur niobium, presenteert het verrijkte water aan de versnelde protonen waardoor de kernreactie doorgaat en het [18F]-fluoride-ion 23

ontstaat. Aangezien er in het verrijkte water steeds nog een kleine hoeveelheid 16O aanwezig is, zal

13

N als nevenproduct ontstaan volgens de nucleaire reactie:

16

O (p,)

13

N [40], [41],

[42]. 3.3

EXPERIMENTELE PROTOCOLS

3.3.1 Beschermingsreactie Tijdens de organische synthesereacties moet de vorming van ongewenste bindingen en nevenproducten ten allen tijde vermeden worden. Vrije amino- en carboxylfuncties zijn zeer reactief en dienen bijgevolg afgeschermd te worden om selectieve bindingen toe te staan. Een goede beschermende groep is voldaan aan drie voorwaarden: ze moet ten eerste gemakkelijk op de functionele groep binden, is ten tweede stabiel onder verschillende reactiecondities en kan ten derde op een eenvoudige manier verwijderd worden wanneer het gewenste product bekomen is. Wat betreft AZ wordt de amino- en de carboxylfunctie veelal beschermd door respectievelijk een tert-butyloxycarbonyl-groep (Boc) en een tertButyl-groep (tBu) [43]. Het

startproduct,

3-(4-aminophenyl)-2-((tert-butoxycarbonyl)amino)propaanzuur

(verbinding 1), droeg reeds een Boc beschermingsgroep, maar de carboxylfunctie was nog onbeschermd. Via de methode beschreven door J. Thiery et al., 1998, werd de reactieve carboxylfunctie veresterd met een tBu-groep wat leidde tot de vorming van tert-butyl 3-(4aminophenyl)-2-((tert-butoxycarbonyl)amino)propanoaat (verbinding 2). Een reactie van verbinding 1 met 4 equivalenten tBu trichloroacetemidaat in 10 mL dichloromethaan (CH2Cl2) per mmol precursor werd ingezet en reageerde 24 uur op een roerplaat bij kamertemperatuur (Figuur 3.6). De exacte hoeveelheden van de reagentia worden weergegeven in Tabel 3.1 [44].

t-Bu trichloroacetemidaat CH2Cl2

24h

Figuur 3.6: Beschermingreactie van verbinding 1 en t-butyl trichloroacetemidaat in CH2Cl2 met vorming van verbinding 2.

24

Tabel 3.1: Hoeveelheden van de reagentia ingezet tijdens de beschermingsreacties.

1 2 3 4

Verbinding 1 (g) 0,5097 0,5059 0,8140 0,8143

tBu trichloroacetemidaat (g) 1,0748 1,5460 2,4940 2,5142

CH2Cl2 (mL) 30 19 28 35

Na afloop van de reactie werd de inhoud van de kolf opgezuiverd door middel van silicagel kolomchromatografie met als mobiele fases achtereenvolgend 20% EtOAc/ 80% nhexaan, 30% EtOAc/ 70% n-hexaan en 40% EtOAc/ 60% n-hexaan. Zowel van verbinding 1 als van de gevormde verbinding 2 werd er een staal genomen van 1 mg opgelost in 1 mL AcN. Beide stalen werden nadien geanalyseerd met behulp van ESI-MS. 3.3.2 SN2-reacties van verbinding 2 met 2- Chloroethyl p-tolueensulfonaat Equimolaire hoeveelheden van verbinding 2 en 2- Chloroethyl p-tolueensulfonaat (ClEtTos) werden ingezet gedurende 1,5 uur onder constant roeren in een oliebad van 65 °C in vijf verschillende solventen: Methanol (MeOH), THF, Acetonitrile (AcN), DMSO en Et2O met de intentie om tert-butyl 2-((tert-butoxycarbonyl)amino)-3-(4-((2-chloroethyl)amino) phenyl)propanoaat (verbinding 3) te vormen (Figuur 3.7). De exacte hoeveelheden van de reagentia worden weergegeven in Tabel 3.2. Elke reactie werd opgevolgd door het reactiemengsel op een TLC-plaatje te spotten, deze te ontwikkelen in 40 % EtOAc/60 % nhexaan en vervolgens te kleuren met ninhydrine.

2- Chloroethyl ptolueensulfonaat + solvent

1,5 h 65 °C

Figuur 3.7: SN2-reactie van verbinding 2 en 2-Chloroethyl p-tolueensulfonaat met vorming van verbinding 3.

De reactie in MeOH werd opgezuiverd met behulp van silicagel kolomchromatografie waarbij een mobiele fase van 40 % EtOAc/60 % n-hexaan gebruikt werd voor de elutie van de twee bovenste fracties waarna overgeschakeld werd naar MeOH voor de elutie van de 25

onderste gewenste fractie. Na indampen met de rotavapor en overnacht uitharden werd een staal genomen van 1 mg opgelost in 1 mL MeOH dat geanalyseerd werd met behulp van ESI-MS. Tabel 3.2: Waarden van de reagentia ingezet tijdens de vijf syntheses van verbinding 3 met bijhorende solventen.

Verbinding 2 (mg) R1 R2 R3 R4 R5

10,7 10,2 10,3 10,4 10,2

2- Chloroethyl ptolueensulfonaat (mg) 17,4 18,5 12,0 9,9 11,9

Solvent MeOH THF AcN DMSO Et2O

Vervolgens werden de condities van de reactie in THF aangepast. Een nieuwe reactie, R6, werd ingezet van verbinding 2 (12,8 mg) met ClEtTos (10 mg) in 200 µL THF waaraan 4 µL triethylamine (TEA) werd toegevoegd per 10 mg precursor. Daarnaast werden er ook twee reacties ingezet waarbij er gebruik gemaakt werd van grotere hoeveelheden reagentia. Bij de ene reactie (R7) werd er opnieuw gekozen voor equimolaire hoeveelheden van verbinding 2 (51,7 mg) en ClEtTos (43,9 mg) in 500 µL THF met toevoeging van TEA (20 µL). Bij de andere reactie (R8) werden 5 equivalenten van ClEtTos (175,4 mg) toegevoegd aan een hoeveelheid van verbinding 2 (51,7 mg) in 500 µL THF met toevoeging van TEA (20 µL). Deze reacties reageerden 1 dag onder constant roeren in een oliebad van 65 °C. R6 en R8 werden opgezuiverd met behulp van silicagel kolomchromatografie waarbij de mobiele fase gradueel steeg van 10-40 % EtOAc in n-hexaan in stappen van 10 %. De gewenste fracties werden ingedampt met de rotavapor en overnacht uitgehard waarna van beide kolven een staal genomen werd van 1 mg opgelost in 1 mL MeOH voor analyse met behulp van ESI-MS. Gebaseerd op het artikel van R. N. Salvatore et al., 2001, werd daarnaast een reactie, R9, van verbinding 2 (14,7 mg) met ClEtTos (12,4 mg) en K2CO3 (4,9 mg) ingezet bij 80°C in 200 µL DMSO gedurende 13 uur [45]. Het reactiemengsel werd nadien gespot op een TLCplaatje dat ontwikkeld werd in 40 % EtOAc/60 % n-hexaan.

26

3.3.3 SN1-like reactie van verbinding 2 met ethyleenoxide Op basis van de methode beschreven door Bergel en Stock in 1954, werd vervolgens geopteerd voor een ander reactiemechanisme dat ook leidde tot de alkylering van het primair stikstofatoom op de benzeenring van verbinding 2 [46]. Volgens dit protocol dienden er aan een hoeveelheid van verbinding 2 (205,0 mg), opgelost in H2O (2,4 mL) en azijnzuur (1,6 mL), 2 equivalenten ethyleenoxide-oplossing (420 µL) toegevoegd te worden om na 24 uur reageren bij kamertemperatuur tert-butyl 2-((tert-butoxycarbonyl)amino)-3-(4-((2hydroxyethyl)amino)phenyl)propanoaat (verbinding 4) en tert-butyl 3-(4-(bis(2-hydroxy ethyl) amino) phenyl)-2-((tert-butoxycarbonyl)amino)propanoaat (verbinding 5) te bekomen (Figuur 3.8). Deze reactie werd tweemaal ingezet.

Ethyleenoxide azijnzuur H2O + 24 h

Figuur 3.8: SN1-like reactie van verbinding 2 en 2 equivalenten ethyleenoxide in azijnzuur en water met vorming van verbinding 4 (links) en verbinding 5 (rechts).

Dit reactiemengsel werd gespot op een TLC-plaatje dat ontwikkeld werd in 50 % EtOAc/50 % n-hexaan en vervolgens gekleurd werd met ninhydrine. Na het reageren werd de inhoud van de kolf verdund met 20 mL water en werd de pH geneutraliseerd door toevoeging Na2CO3. Dit reactiemengsel onderging vervolgens vloeistof-vloeistof extractie waarbij de waterfase drie maal gewassen werd met 5 mL EtOAc. De organische fase kon dan gedroogd worden met behulp van Na2SO4 waarna het bekomen filtraat onderworpen werd aan silicagel kolomchromatografie met als mobiele fase 50 % EtOAc/50 % n-hexaan. Na indampen met de rotavapor en overnacht uitharden van de twee opgezuiverde fracties werd van elke kolf een staal genomen van 1 mg opgelost in 1 mL MeOH die vervolgens geanalyseerd werden met behulp van ESI-MS.

27

3.3.4 Tosylering van verbinding 5 met behulp van p-tolueensulfonylchloride De tosyleringsreactie is gebaseerd op een methode beschreven door L. Wang et al., 2011 [47]. Aan een oplossing van verbinding 5 (100,5 mg) in EtOAc (2,684 mL) werden 3 equivalenten TEA (99 µL) en 1,4 equivalenten p-tolueensulfonylchloride (TosCl) (54,2 mg) toegevoegd. Na 20 uur reageren onder constant roeren bij kamertemperatuur werden zowel tert-butyl2-((tert-butoxycarbonyl)amino)-3-(4-((2-hydroxyethyl)(2-tosyloxy)ethyl)amino) phenyl)propanoaat (verbinding 6) als tert-butyl 3-(4-(bis(2-(tosyloxy)ethyl)amino)phenyl)-2((tert-butoxy carbonyl)amino)propanoaat (verbinding 7) gevormd (Figuur 3.10). Deze reactie werd op verschillende ogenblikken gespot op een TLC-plaatje dat ontwikkeld werd in 50 % EtOAc/50 % n-hexaan en nadien gekleurd werd met ninhydrine.

TosCl TEA EtOAc + 20 h

Figuur 3.10:Tosylering van verbinding 5 met behulp van TosCl met vorming van verbinding 6 (links) en verbinding 7 (rechts).

Na afloop van de reactie werd het reactiemengsel aangelengd met EtOAc tot 10 mL en vervolgens onderworpen aan vloeistof-vloeistof extractie. Hierbij werd de organische fase driemaal gewassen met 10 mL verzadigd Na2CO3 en eenmaal met 10 mL pekel. De organische fase werd vervolgens gedroogd over Na2SO4, gefiltreerd en ingedampt met silicagel voor de opzuivering met behulp van silicagel kolomchromatografie. De opgezuiverde fracties werden ingedampt met de rotavapor en overnacht uitgehard waarna van elke kolf een staal genomen werd van 1 mg opgelost in 1 mL MeOH. Deze stalen werden geanalyseerd met behulp van ESI-MS. 3.3.5 Radiosyntheses 3.3.5.1 Opzuivering van [18F]-Fluoride Het [18F]-fluoride-ion, bekomen na de kernreactie in het cyclotron, werd opgezuiverd met behulp van de QMA-kolom die gepreconditioneerd werd met 5 mL K2CO3 en 5 mL ultrapure water van het type 1 (Milli-Q) waarna enkele malen lucht doorheen de QMA 28

geblazen werd. Vervolgens werd de oplossing van [18F]-Fluoride in verrijkt water opgetrokken met een 20 G naald en over de kolom gelueerd in de waste waarna opnieuw enkele malen lucht doorheen de QMA gestuurd werd. Een mengsel van 0,9 mL Kryptofix 2.2.2 (K222) (400 mg/18 mL AcN) en 0,1 mL K2CO3 (400 mg/20 mL AcN) werd dan over de kolom gebracht, opnieuw gevolgd door lucht, waarbij het [18F]-fluoride van de QMA-kolom elueerde en opgevangen werd in een propere vial. De bekomen oplossing, die het [18F]-fluoride bevatte, werd ingedampt in een oliebad van 100 °C waarna twee maal 0,5 mL droge AcN werd toegevoegd dat ook telkens ingedampt werd bij 100 °C. Het bekomen droge [18F]-fluoride werd afgekoeld in een ijsbad [48]. 3.3.5.2 Radiosynthese van [18F]-Fluoroethyltosylaat ([18F]-FeTos) Met behulp van het opgezuiverde [18F]-fluoride kon vervolgens [18F]-2-fluoroethyl 4methylbenzeensulfonaat ([18F]-FeTos) gesynthetiseerd worden. Allereerst werd een oplossing aangemaakt van 5 mg ethyleen-di(p-tolueensulfonaat) in 1 mL droge AcN die vervolgens toegevoegd werd aan het afgekoelde [18F]-fluoride. Deze reactie ging 10 min door in een oliebad van 100 °C waarna het reactiemengsel afgekoeld werd in een ijsbad en gespot werd op een TLC-plaatje dat ontwikkeld werd in 4:1 (v/v) AcN:0,1M ammoniumacetaat (Figuur 3.11) [49].

18

[ F]-KF, K222 AcN 10 min 100 °C

Figuur 3.11: SN2-reactie van ethyleen-di-(p-tolueensulfonaat) en [18F]-fluoride in droge AcN met vorming van [18F]-FeTos.

Het reactiemengsel werd vervolgens over de Aluminakolom gebracht, die vooraf gepreconditioneerd werd met 5 mL droge AcN, waarbij het [18F]-FeTos meteen van de kolom elueerde en opgevangen werd in een propere vial. Daarna werd nogmaals 1 mL droge AcN over de Aluminakolom geëlueerd in dezelfde vial, gevolgd door lucht, en werd het opgezuiverde [18F]-FeTos gespot op een TLC-plaatje dat eveneens ontwikkeld werd in 4:1 (v/v) AcN:0,1M ammoniumacetaat. 29

3.3.5.3 Reactie van [18F]-FeTos met verbinding 4 Als eerste poging tot de vorming van een

18

F-gelabeld melphalan-analoog werd een

reactie ingezet van het opgezuiverde [18F]-FeTos met verbinding 4 waarbij tert-butyl 2-((tertbutoxycarbonyl)amino)-3-(4-((2-(fluoro-[18F])ethyl)(2-hydroxyethyl)amino)phenyl)propanoaat (verbinding 8) bekomen werd als reactieproduct (Figuur 3.12). De reactie van verbinding 4 (10 mg), opgelost in 400 µL droge AcN, met het opgezuiverde [18F]-FeTos dat van de Aluminakolom geëlueerd was, ging 10 minuten door in een oliebad van 100 °C. Na afkoelen in het ijsbad werd het reactiemengsel gespot op een TLC-plaatje dat in 40 % EtOAc/60 % nhexaan ontwikkeld werd.

18

[ F]-FeTos AcN

10 min 100 °C

Figuur 3.12: SN2-reactie van verbinding 4 en [18F]-FeTos in droge AcN met vorming van verbinding 8.

3.3.5.4 Fluorering van verbinding 7 Als tweede poging tot de vorming van een 18F-gelabeld Melphalan-analoog werd een fluorering uitgevoerd van verbinding 7 met vorming van tert-butyl 2-((tert-butoxycarbonyl) amino)-3-(4-((2-(fluoro-[18F])ethyl)(2-(tosyloxy)ethyl)amino)phenyl)propanoaat

(verbinding

9) (Figuur 3.13). De reactie van verbinding 7 (10 mg), opgelost in 400 µL droge AcN, met het opgezuiverde [18F]-fluoride ging 10 minuten door in een oliebad van 100 °C. Na afkoelen in het ijsbad werd het reactiemengsel gespot op een TLC-plaatje dat ontwikkeld werd in 40 % EtOAc/60 % n-hexaan. Dezelfde handeling werd uitgevoerd na 20 en na 30 minuten reageren.

30

18

[ F]-KF, K222 AcN 10,20,30 min 100 °C

Figuur 3.13: SN2-reactie van verbinding 7 en [18F]-fluoride in AcN met vorming van verbinding 9.

3.3.6 Deprotectie De allerlaatste stap in de ontwikkeling van het 18F-gelabeld Melphalan-analoog is de deprotectiestap. Verbinding 8 en verbinding 9 werden onder identieke condities gedeprotecteerd door toevoeging van 6 M HCl (400 µL) met vorming van 4-((2-(fluoro[18F])ethyl)(2-hydroxyethyl)amino)fenylalanine (verbinding 10) (Figuur 3.14). Deze reactie ging 15 minuten door in een oliebad van 100 °C waarna beide vials ter afkoeling in een ijsbad geplaatst werden. Deze vials werden gespot op een TLC-plaatje dat ontwikkeld werd in 40 % EtOAc/60 % n-hexaan.

6 M HCl 15 min 100 °C

A 6 M HCl

15 min 100 °C

B Figuur 3.14: Deprotectie van verbinding 8 (A) en verbinding 9 (B) in 6 M HCl met vorming van het eindproduct verbinding 10.

31

4.

RESULTATEN EN DISCUSSIE

4.1

BESCHERMINGSREACTIE

4.1.1 Opzuivering Tijdens de opzuivering van beschermingsreactie 2 door middel van silicagel kolomchromatografie werden de fracties 25-38, die elueerden met 40 % EtOAc/60 % nhexaan, gespot op een TLC-plaatje dat ontwikkeld werd in diezelfde mobiele fase (Figuur 4.1). Fracties 27-38 vertoonden allen een vlek met een gelijke retentiefactor (Rf-waarde) van 0,51. Deze factor stelt de verhouding voor van de loopafstand van de component op de totale loopafstand van het solvent [50]. Fracties 27, 28 en 29 vertoonden daarnaast echter ook nog een vlek met een hogere Rf-waarde en waren dus niet zuiver. Bijgevolg werden enkel de zuivere fracties 30-38 uitgedampt met behulp van de rotavapor en overnacht uitgehard met vorming van een wit poeder.

Figuur 4.1: TLC ontwikkeld in 40 % EtOAc/60 % n-hexaan en gekleurd met ninhydrine. Fracties 30-38 bevatten verbinding 2 (Rf=0,51) wat een meer apolaire verbinding is ten opzichte van zijn precursor (P), verbinding 1 (Rf = 0).

De hogere Rf-waarde (Rf = 0,51) van verbinding 2 ten opzichte van deze van verbinding 1 (Rf = 0) kan verklaard worden door de aanwezigheid van de tBu-groep in verbinding 2 die hierdoor meer apolair is en bijgevolg minder affiniteit vertoont voor het polaire silica dan verbinding 1. Daarom elueerde verbinding 2 verder op het TLC-plaatje wat resulteerde in een hogere Rf-waarde. Tijdens de beschermingsreactie ontstond er tevens een witte neerslag in het reactiemengsel die volgens het artikel van J. Thierry et al. toegeschreven kon worden aan de vorming van trichloroacetemidaat [44]. 32

Het MS “JV-BocMtB”, dat bekomen werd na analyse van deze uitgedampte fractie m.b.v. ESI-MS, bevestigde de overeenstemming van dit staal met verbinding 2 (Bijlage 2). Daarnaast kon na de analyse van de precursor die weergegeven wordt in het ESI-MS “JV4_Aph” eveneens met zekerheid gesteld worden dat de aangekochte precursor overeenkwam met verbinding 1 (Bijlage 3). 4.1.2 Rendement Het rendement van de beschermingsreactie werd berekend en weergegeven in Tabel 4.1. De tweede beschermingsreactie die werd ingezet, had een rendement van 64,67 % terwijl de vierde een rendement van 78,52 % vertoonde. Tabel 4.1: Berekening van het rendement van de beschermingsreactie.

Reactie 1 Reactie 2 Reactie 3 Reactie 4

4.2

Verbinding 1 mg mmol 509,7 1,818 505,9 1,805 814,0 2,904 814,3 2,905

Reagentia tBu trichloroacetemidaat g 1,0748 1,5460 2,4940 2,5142

mg

Reactieproduct Verbinding 2 mmol Rendement(%)

392,7

1,167

64,67

767,6

2,281

78,52

SN2-REACTIES VAN VERBINDING 2 MET 2-CHLOROETHYL P-TOLUEENSULFONAAT

4.2.1 TLC Aan de hand van de TLC-plaatjes, die ontwikkeld werden in 40 % EtOAc/60 % nhexaan kon voor elk van de ingezette reacties: R1, R2, R3, R4 en R5, afgeleid worden of er vorming opgetreden was van verbinding 3. De duur van de reacties in AcN, MeOH, THF en DMSO werd opgedreven naar 3 dagen terwijl de reactie in Et 2O niet verder bestudeerd werd aangezien de dop van de reactievial losgesprongen was door de gasvorming van het solvent bij hogere temperaturen. Na drie dagen reageren werd er van de overige reacties opnieuw een TLC-plaatje ontwikkeld in dezelfde mobiele fase waarbij verbinding 2 en 2-Chloroethyl ptolueensulfonaat (ClEtTos) mee geëlueerd werden als referenties (Figuur 4.2). De Rfwaarden van de verschillende componenten konden berekend worden uit deze TLC-plaatjes en worden weergegeven in Tabel 4.2. Aangezien de Rf-waarden van de reactie in AcN gelijkaardig waren aan de referentie-Rf-waarden, kon geconcludeerd worden dat er geen 33

vorming optrad van verbinding 3 waardoor er bijgevolg geen verdere reacties in dit solvent bestudeerd werden. De reacties in THF en DMSO vertoonden daarentegen wel een vlek met een Rf-waarde verschillend van deze van referentie-Rf-waarden waardoor deze solventen als aantrekkelijk bevonden werden om verdere reacties mee in te zetten. R1

R3

R2

R4

Figuur 4.2: De reactiemengsels van de SN2-reacties van verbinding 2 met CletTos gespot op TLCplaatjes en ontwikkeld in 40 % EtOAc/60 % n-hexaan. Van links naar rechts: R1, R2, R3 en R4. “P” staat voor precursor(= verbinding 2), “DMSOZ” en “THFZ” staan respectievelijk voor zuiver solvent DMSO en THF.

Bij het inzetten van de drie nieuwe reacties in THF, nl. R6, R7 en R8, werd aan elke reactie TEA toegevoegd. Deze base diende om de nucleofiliciteit en dus ook de reactiviteit van het stikstofatoom in verbinding 2 te doen toenemen waardoor de S N2-reactie sneller en beter zou moeten doorgaan. De Rf-waarden op TLC, ontwikkeld in 40 % EtOAc/60 % nhexaan, konden vervolgens berekend worden na 1 dag reageren en worden weergegeven in Tabel 4.2. Zowel in reactie R6, R7 als R8 ontstond er een component met een Rf-waarde van respectievelijk 0,95, 0,89 en 0,88 die hoger lag dan de referentie-Rf-waarde van ClEtTos (Rf = 0,82) en tevens ook verkleurde met ninhydrine i.t.t. het referentie-ClEtTos. De nieuw ingezette reactie in DMSO, namelijk R9, leverde weinig resultaat op aangezien de gevormde componenten heel moeilijk gescheiden konden worden met TLC. Deze reactie werd bijgevolg niet verder bestudeerd. 4.2.2 Opzuivering Vermits de onderste fractie (Rf = 0) op het TLC-plaatje van de reactie R1 in MeOH sterk bruin verkleurde na kleuring met ninhydrine werd deze fractie opgezuiverd met silicagel kolomchromatografie. Omwille van de sterke polariteit van deze component diende 34

MeOH gebruikt te worden als mobiele fase. Volgens het massaspectrum, dat bekomen werd bij de analyse van deze opgezuiverde component met ESI-MS, kwam deze fractie niet overeen met verbinding 3. Tabel 4.2: Rf-waarden van de SN2-reacties van verbinding 2 met ClEtTos in verschillende solventen.

Reactie R1

R2

R3

R4

R6

R7 + R8

Stof Precursor ClEtTos Reactie 1 in MeOH Precursor ClEtTos THF Z Reactie 2 in THF Precursor ClEtTos Reactie 3 in AcN Precursor ClEtTos DMSO Z Reactie 4 in DMSO Precursor Reactie 6 in THF Precursor ClEtTos Reactie 7 in THF Reactie 8 in THF

Rf-waarden 0,6 0,93 0

0,62

0,90

0,57 0,03

0,89 0,95

0,27 0,66

0,03

0,93 0,93

0,62 0,69

0,93 0,04 0,14 0,03

0,59 0,46 0,57 0,53 0,56

0,93 0,82 0,82

0,95

0,80 0,79 0,80

0,89 0,88

De bovenste fractie (Rf = 0,95) van reactie R6 elueerde van de silicagel kolom met 40 % EtOAc/60 % n-hexaan en werd opgevangen in proefbuisjes. Het massaspectrum dat bekomen werd bij de analyse van deze ingedampte fractie met behulp van ESI-MS kon opnieuw geen overeenstemming aantonen tussen de aanwezige component en de gewenste verbinding 3. Vervolgens werd ook de reactie R8 onderworpen aan silicagel kolomchromatografie voor de opzuivering van de bovenste fractie (Rf = 0,88). Op het TLC-plaatje kleurde de vlek met deze Rf-waarde bij R8 namelijk iets intenser dan bij R7. De fractie elueerde met 40 % EtOAc/60 % n-hexaan en werd opgevangen in proefbuisjes. Bij de analyse van deze 35

ingedampte fractie met ESI-MS werd een massaspectrum bekomen, dat de aanwezigheid van verbinding 3 in het staal wederom niet kon bevestigen. 4.2.3 Besluit De verschillende pogingen om verbinding 3 te vormen volgens het principe van een SN2-reactie tussen verbinding 2 en ClEtTos is niet geslaagd. De moeilijkheid van deze specifieke SN2-reactie wordt ondersteund door het feit dat hieromtrent weinig of niets beschreven staat in de literatuur. 4.3

SN1-LIKE REACTIE VAN VERBINDING 2 MET ETHYLEENOXIDE

4.3.1 TLC Op basis van de reactiecondities uit het artikel van Springer C. et al., 1994, werd er besloten om deze SN1-like reactie 4,5 dagen te laten doorgaan in plaats van 24 uur [51]. Uit het TLC-plaatje, dat ontwikkeld werd in 50 % EtOAc/50 % n-hexaan om het verloop van de reactie na te gaan, kon er afgeleid worden dat er vorming was opgetreden van twee reactieproducten (Figuur 4.3).

Figuur 4.3: TLC van de SN1-like reactie van verbinding 2 met ethyleenoxide. De bovenste paarse vlek (Rf = 0,60) is verbinding 2, de middenste oranje-bruine vlek (Rf = 0,34) is verbinding 4 en de onderste blauw-grijze vlek (Rf = 0,13) is verbinding 5.

Aangezien de Rf-waarde van de bovenste fractie (Rf = 0,60) gelijkaardig was aan deze van verbinding 2 (Rf = 0,69) en beide vlekken paars kleurden, werd er geconcludeerd dat dit precursor was. Van de oranje-bruine vlek, met een Rf-waarde van 0,34, werd er verondersteld dat dit verbinding 4 was, enerzijds omdat deze kleur op een secundair amine wijst en anderzijds omdat deze molecule een lagere Rf-waarde vertoonde dan de precursor. 36

De lagere Rf-waarde van verbinding 4 kan immers verklaard worden door de aanwezigheid van een extra vrije hydroxylfunctie ten opzichte van verbinding 2. Dit laat de polariteit van de molecule toenemen waardoor er bijgevolg meer retentie optrad op TLC. Van de onderste blauw-grijze fractie, met een Rf-waarde van 0,13, werd er verondersteld dat het verbinding 5 was aangezien deze molecule twee vrije hydroxylfuncties bezit, bijgevolg nog meer polair is dan verbinding 4 en dus nog meer affiniteit vertoonde voor het polaire silicagel op het TLC-plaatje. De blauw-grijze kleur is tevens typerend voor een tertiair amine. Deze reactie van verbinding 2 met ethyleenoxide was gebaseerd op het SN1-like reactiemechanisme dat gelijkaardig is aan een SN1-reactie maar dan zonder de vorming van een CBC. Een SN1-like reactie gaat door in zuur milieu, in dit geval azijnzuur, waardoor het epoxide geprotoneerd en bijgevolg meer elektrofiel wordt. Aangezien het geprotoneerde Oatoom nu een betere LG is, zal de C-O binding reeds beginnen breken nog voor het nucleofiel het C-atoom aanvalt, maar dit zonder het ontstaan van een intermediair CBC. Het uiteindelijke resultaat is de opening van de epoxidering met vorming van een neutraal alcohol (Figuur 4.4) [52], (http://www.mhhe.com/physsci/chemistry/carey/student/olc/ch16 reactionsepoxides.html (23-03-’15))2.

Figuur 4.4: Weergave van het SN1-like reactiemechanisme met opening van de geprotoneerde epoxidering.

4.3.2 Opzuivering Bij de opzuivering door middel van silicagel kolomchromatografie werd de kolom geëlueerd met 50 % EtOAc/50 % n-hexaan en werden de gewenste fracties opgevangen in proefbuisjes. Fracties 30-44 werden gespot op een TLC-plaat en ontwikkeld in dezelfde mobiele fase (Figuur 4.5). Deze fracties vertoonden elk een oranje-bruine vlek met een Rfwaarde van 0,35 en werden vervolgens ingedampt met behulp van de rotavapor en 37

overnacht uitgehard tot een donkergele, viskeuze olie. Bij de analyse van dit staal met behulp van ESI-MS kon de veronderstelling van de aanwezigheid van verbinding 4 in deze fracties bevestigd worden door het bekomen massaspectrum. Dit massaspectrum werd gelabeld als “JV-MAP” en wordt weergegeven in Bijlage 4. Fracties 62-69 elueerden van de kolom met MeOH als mobiele fase en werden gespot op een TLC-plaat die opnieuw ontwikkeld werd in 50 % EtOAc/50 % n-hexaan (Figuur 4.5). Fracties 64-67 vertoonden duidelijk een blauw-grijze vlek met een Rf-waarde van 0,13 en werden vervolgens ingedampt met de rotavapor. Na overnacht uitharden werd opnieuw een donkergeel, olieachtig resultaat bekomen waarvan een staal, “JV-DAP”, genomen werd. Ook hier werd de veronderstelling van de aanwezigheid van verbinding 5 in het staal bevestigd door de analyse met ESI-MS (Bijlage 5).

Figuur 4.5: TLC ontwikkeld in 50 % EtOAc/50 % n-hexaan en gekleurd met ninhydrine. Links: Fracties 30-44 (Rf = 0,35) zijn oranje-bruin en bevatten verbinding 4. Rechts: Fracties 64-67 (Rf = 0,13) zijn blauw-grijs en bevatten verbinding 5.

4.3.3 Rendement Het rendement van de reactie werd berekend voor verbinding 4 en verbinding 5 van de twee ingezette reacties (Tabel 4.3). Het feit dat het rendement van verbinding 4 een stuk lager lag in de tweede reactie (13,6 %) ten opzichte van de eerste (31,0 %), kon verklaard worden door een verlies dat was opgetreden door overkoken tijdens het indampen met de rotavapor. Verbinding 5 vertoonde een rendement van 16,1 % in de eerste reactie en 18,5 % in de tweede. Bij toekomstig onderzoek is het aanbevolen om deze SN1-like reactie met ethyleenoxide te optimaliseren zodat hogere rendementen verkregen worden.

38

Tabel 4.3: Rendementsberekening van verbinding 4 en verbinding 5 tijdens de twee ingezette reacties van verbinding 2 met ethyleenoxide.

1 2

Reagentia Verbinding 2 Ethyleenoxide mg mmol mL 205,0 0,609 0,420 800,0 2,38 1,585 4.4

Reactieproducten mg 71,8 123

Verbinding 4 Verbinding 5 mmol Rendement (%) mg mmol Rendement (%) 0,189 31,0 41,7 0,0982 16,1 0,324 13,6 187 0,440 18,5

TOSYLERING VAN VERBINDING 5 MET BEHULP VAN P-TOLUEENSULFONYLCHLORIDE

4.4.1 TLC Vermits er op verschillende ogenblikken een TLC ontwikkeld werd van het reactiemengsel in 50 % EtOAc/50 % n-hexaan kon de evolutie van de reactie gevolgd worden (Figuur 4.6). Uit het eerste TLC-plaatje dat ontwikkeld werd na 20 uur reageren, kon er reeds afgeleid worden dat er twee reactieproducten gevormd werden (Figuur 4.6 (1)). De drie vlekken, die ontstaan waren na kleuring met ninhydrine, kleurden allen blauw-grijs wat wees op de aanwezigheid van een tertiar amine in elke component. De onderste vlek (Rf = 0,08) vertoonde dezelfde Rf-waarde als de precursor, verbinding 5, die mee was geëlueerd als referentie, waardoor aangenomen werd dat deze fractie precursor was. De middenste vlek (Rf = 0,45) bezat een hogere Rf-waarde dan de precursor waaruit geconcludeerd kon worden dat deze component meer apolair was dan verbinding 5 en bijgevolg minder retentie vertoonde op TLC. Er werd verondersteld dat deze vlek verbinding 6 was aangezien er in dat geval één OH-groep vervangen is door een meer apolaire tosylgroep. De bovenste vlek (Rf = 80) vertoonde een lichte blauw-grijze verkleuring. Om een Rfwaarde te kunnen bezitten die nog hoger was dan verbinding 6 diende deze component nog minder affiniteit te bezitten voor het polaire silicagel en bijgevolg nog meer apolair te zijn. Hieruit werd verondersteld dat deze fractie verbinding 7 bevatte aangezien in dat geval beide OH-groepen vervangen zijn door een minder polaire tosylgroep. Uit het TLC-plaatje dat na 24 uur reageren, ontwikkeld werd in 50 % EtOAc/50 % nhexaan, kon opgemerkt worden dat de bovenste blauw-grijze vlek, die dezelfde Rf-waarde vertoonde als TosCl (Rf = 0,80), intenser geworden was (Figuur 4.6 (2)). Om de vorming van 39

deze verbinding 7 uiterst te bevorderen werden nogmaals 3 equivalenten TEA (99 µL) en 1,2 equivalenten TosCl (50,0 mg) toegevoegd aan het reactiemengsel en werd de reactieduur verlengd met 24 uur. Na een totale reactieduur van twee dagen was de bovenste vlek (Rf = 0,80) zichtbaar intenser geworden van kleur waarbij de intensiteit van de onderste vlek (Rf = 0,08), wat de precursor voorstelde, tegelijk afgenomen was (Figuur 4.6 (3)). 1

2

3

Figuur 4.6: TLC van de tosylering van verbinding 5 met telkens links verbinding 5 gespot en rechts het reactiemengsel. Het reactiemengsel werd gespot na 20 uur (1), na 24 uur (2) en na 2 dagen (3).

4.4.2 Opzuivering Bij de opzuivering door middel van silicagel kolomchromatografie elueerden fracties 13-23 van de kolom met 50 % EtOAc/50 % n-hexaan (Figuur 4.7). Deze proefbuisjes werden gespot op een TLC-plaat die ontwikkeld werd in dezelfde mobiele fase. Aangezien TosCl een gelijkaardige Rf-waarde bezat als verbinding 7, mochten enkel die fracties, die verkleurden met ninhydrine, geïsoleerd worden. Zo werden fracties 15-19 ingedampt met de rotavapor en overnacht uitgehard tot een donkergele, viskeuze olie bekomen werd. Vervolgens elueerden fracties 24-32 van de kolom met behulp van 50 % EtOAc/50 % n-hexaan waarna volgens hetzelfde principe als voorheen een TLC-plaat ontwikkeld werd. Fracties 24-30 bezaten een blauw-grijze kleur en werden bijgevolg ingedampt met de rotavapor en overnacht uitgehard tot opnieuw een donkergele, olieachtige substantie bekomen werd. Bij de analyse van de opgezuiverde fracties met behulp van ESI-MS, bevestigde het massaspectrum “JV-DTosM”, dat weergegeven wordt in Bijlage 6, de overeenstemming van

40

verbinding 7 met de opgezuiverde fracties 15-19, terwijl de veronderstelling van de aanwezigheid van verbinding 6 in de fracties 24-30 niet bevestigd kon worden.

Figuur 4.7: TLC ontwikkeld in 50 % EtOAc/50 % n-hexaan en gekleurd met ninhydrine. Links: Fracties 15-19 zijn gekleurd en bevatten verbinding 7. Rechts: Fracties 24-30 zijn blauw-grijs en bevatten verbinding 6.

4.4.3 Rendement Het rendement van de tosyleringsreactie werd berekend voor verbinding 6 en verbinding 7 en wordt weergegeven in Tabel 4.4. Deze waarden, respectievelijk 5,0 % en 12,6 %, lagen vrij laag waaruit besloten kon worden dat in toekomstig onderzoek ook hier optimalisatie van de reactie noodzakelijk is om hogere rendementen te verkrijgen. Tabel 4.4: Rendementsberekening van verbinding 6 en verbinding 7 na de reactie van verbinding 5 met TosCl.

Reagentia Verbinding 5 TosCl mg mmol mg 100,5 0,237 104,200 4.5

Reactieproducten Verbinding 6 Verbinding 7 mg mmol Rendement (%) mg mmol Rendement (%) 6,80 0,012 5,0 21,91 0,0299 12,6

RADIOSYNTHESES

4.5.1 Opzuivering van [18F]-Fluoride Aangezien het [18F]-fluoride-ion, bekomen na de kernreactie in het cyclotron, enkel in watervrij milieu als nucleofiel kan optreden in SN2-reacties, diende het [18O]-H2O waarin het zich bevond, verwijderd te worden. Dit werd uitgevoerd door middel van de QMA kolom, wat een anionenuitwisselaar is waarop CO32- gebonden werd tijdens de preconditionering [15], [48]. 41

Wanneer het verrijkte water met 18F op de QMA-kolom werd gebracht, nam het [18F]fluoride de plaats van het CO32- in op de anionenuitwisselaar terwijl het verrijkte water van de kolom elueerde en eventueel gerecupereerd kon worden. Met behulp van het mengsel van K222 en K2CO3 elueerde vervolgens ook het [18F]-fluoride van de kolom in een propere vial. De radioactiviteit werd tijdens deze handeling op verschillende momenten nagemeten met een dosiscalibrator. Uit deze waarden, die weergegeven worden in Tabel 4.5, kon geconcludeerd worden dat de opzuivering door middel van de QMA-kolom met weinig verlies van [18F]-fluoride gepaard ging. Van de totale hoeveelheid [18F]-fluoride op de QMAkolom bleef slechts 0,34 % achter na elutie. Tabel 4.5: Radioactiviteit (mCi) op verschillende momenten tijdens de opzuivering met de QMAkolom.

18

Verrijkt water met F [18F]-Fluoride op de QMA-kolom QMA-kolom na elutie van [18F]-Fluoride Opgezuiverd [18F]-Fluoride

Radioactiviteit (mCi) 10,12 8,76 0,03 8,73

Het [18F]-KF, dat van de QMA-kolom elueerde en op zich onoplosbaar is in apolaire solventen zoals AcN, ging toch in oplossing door de vorming van complexen met het aminopolyether: K222. Het azeotropisch drogen met behulp van droge AcN was daarnaast noodzakelijk om de afwezigheid van water in het milieu te garanderen en daarmee ook de reactiviteit van het [18F]-fluoride te bevorderen. 4.5.2 Radiosynthese van [18F]-Fluoroethyltosylaat ([18F]-FeTos) 4.5.2.1 Opzuivering Na 10 minuten reageren volgens een SN2-reactiemechanisme werd [18F]-FeTos gesynthetiseerd [48]. Het bekomen reactiemengsel diende geëlueerd te worden over een Aluminakolom om het gevormde [18F]-FeTos te isoleren van het niet-gereageerde [18F]fluoride. Het [18F]-fluoride vertoonde namelijk affiniteit voor deze kolom waardoor het hierop bleef zitten en enkel het [18F]-FeTos van de kolom elueerde in een propere vial. 4.5.2.2 TLC De TLC-plaatjes, die zowel voor als na de opzuivering over de Alumina-kolom ontwikkeld werden in 4:1 (v/v) AcN:0,1M ammoniumacetaat, konden geanalyseerd worden 42

met behulp van de MiniGITA waarbij zowel de Rf-waarden als de procentuele verhouding van de aanwezige componenten afgeleid konden worden (Figuur 4.8).

Figuur 4.8: Links: TLC van het reactiemengsel vóór de opzuivering met de Aluminakolom (Rf = 0,80). Rechts: TLC van het reactiemengsel ná de opzuivering met de Aluminakolom (Rf = 0,85).

Het [18F]-fluoride vertoonde een Rf-waarde van 0,10 en bleef dus aan de basis van het polaire silicaplaatje omwille van zijn sterk polair karakter. De tweede component vertoonde daarentegen veel minder affiniteit voor het polaire silica en elueerde bij een Rfwaarde van 0,80. De veronderstelling dat deze component overeenstemde met het gewenste [18F]-FeTos werd enerzijds ondersteund door de aanwezigheid van de apolaire tosylgroep waardoor de molecule minder retentie vertoonde. Anderzijds kon de aanwezigheid van [18F]-FeTos ook bevestigd worden door een TLC-plaatje te spotten met koud Fetos en dit onder dezelfde condities te ontwikkelen. De hieruit berekende Rf-waarde van 0,78 stemde overeen met deze van [18F]-FeTos wat de vorming van dit reactieproduct bevestigde. Uit de vergelijking van het procentuele aandeel van de aanwezige componenten vóór en ná deze opzuivering kon afgeleid worden dat de grootste hoeveelheid van het [18F]fluoride (Rf = 0,10) verwijderd kon worden door middel van deze handeling. 4.5.3 Reactie van [18F]-FeTos met verbinding 4 Bij de analyse van het TLC-plaatje, ontwikkeld in 40 % EtOAc/60 % n-hexaan, kon de vorming van een 18F-gelabeld reactieproduct (Rf = 0,52) opgemerkt worden (Figuur 4.8). Om met zekerheid te kunnen stellen dat deze piek niet afkomstig was van [ 18F]-FeTos werd er een TLC ontwikkeld van koud FeTos in dezelfde mobiele fase waaruit een Rf-waarde van 0,75 berekend kon worden. Hierdoor werd er verondersteld dat er vorming was opgetreden van 43

verbinding 8 volgens het vooropgestelde SN2-reactiemechanisme aangezien deze verbinding, omwille van zijn vrije hydroxylfunctie, meer polair is dan FeTos en bijgevolg meer retentie vertoonde op TLC. De piek bij de Rf-waarde van 0,10 was waarschijnlijk afkomstig van het nog resterende [18F]-fluoride in het reactiemengsel.

Figuur 4.8: TLC van het reactiemengsel na de SN2-reactie van [18F]-FeTos en verbinding 4 met vorming van verbinding 8 (Rf = 0,52).

4.5.4 Fluorering van verbinding 7 De drie TLC-plaatjes werden na ontwikkeling in 40 % EtOAc/60 % n-hexaan geanalyseerd met behulp van de MiniGITA (Figuur 4.9). Daaruit kon verondersteld worden dat verbinding 9 als reactieproduct gevormd was volgens het vooropgestelde SN2reactiemechanisme aangezien er naast de piek van het niet-gereageerde [18F]-fluoride (Rf = 0,10) ook een component elueerde met een Rf-waarde van 0,65. De veronderstelling van de overeenstemming van dit reactieproduct met verbinding 9 was gebaseerd op de ligging van de Rf-waarde. Deze waarde was namelijk iets hoger dan deze van verbinding 8 wat vermoedelijk het gevolg was van de aanwezigheid van de meer apolaire tosylgroep in verbinding 9 en de afwezigheid van de polaire hydroxylgroep van verbinding 8.

Figuur 4.9: TLC van het reactiemengsel na de SN2-reactie van [18F]-Fluoride en verbinding 7 met vorming van verbinding 9 (Rf = 0,65) na 20 minuten reageren.

44

Wanneer de procentuele hoeveelheden van het reactieproduct en het [18F]-fluoride vergeleken werden na 10, 20 en 30 minuten kon er waargenomen worden dat er reeds een maximale hoeveelheid reactieproduct gevormd was na 20 minuten en dat langer reageren bijgevolg geen voordeel meer met zich meebracht (Figuur 4.10). De procentuele hoeveelheid van verbinding 9 vertoonde een toename tussen 10 (62,2 %) en 20 minuten reageren (76,5 %) terwijl deze van [18F]-Fluoride net afnam van 37,7 % naar 23,4 %.

Procentuele hoeveelheid (%)

100 80 60 40 20 0 0

10

20 Tijd (min)

30

Verbinding 9 [18F]-Fluoride

Figuur 4.10: Grafiek die de procentuele hoeveelheden van verbinding 9 en [18F]-Fluoride weergeeft in functie van de tijd.

4.6

DEPROTECTIE Het TLC-plaatje waarop de deprotectiereactie van verbinding 9 gespot was, werd na

ontwikkeling in 40 % EtOAc/60 % n-hexaan geanalyseerd met behulp van de MiniGITA (Figuur 4.11). Op dit plaatje werd een piek waargenomen met een procentuele hoeveelheid van 92,1 % bij een Rf-waarde van 0,10. Een kleine resterende hoeveelheid van verbinding 9 (7,8 %) elueerde bij zijn specifieke Rf-waarde van 0,65.

Figuur 4.11: TLC van de deprotectiereactie van verbinding 9 (Rf = 0,65) met vorming van verbinding 10 (Rf = 0,10).

45

Van de component die elueerde bij de Rf-waarde 0,10 werd er verondersteld dat het verbinding 10 was aangezien deze molecule, door de afsplitsing van de beschermingsgroepen tijdens de deprotectiereactie, opnieuw een polaire carboxylgroep bezit. De tosylgroep werd eveneens afgesplitst waardoor er nog een bijkomende hydroxylfunctie ontstond. De aanwezigheid van deze polaire groepen veroorzaakte een grote affiniteit van verbinding 10 voor het polaire silica waardoor deze component bijgevolg ter hoogte van de basis bleef. Om zeker te zijn dat de piek met Rf-waarde 0,10 niet afkomstig was van vrijgekomen [18F]-Fluoride werd het TLC-plaatje gekleurd met ninhydrine (Figuur 4.12). Hierop werd een gekleurde vlek waargenomen ter hoogte van de basislijn waardoor er met zekerheid gesteld kon worden dat er een AZ aanwezig was op die plaats. In de toekomst is het aangewezen om het reactiemengsel na deprotectie nogmaals te ontwikkelen op TLC met behulp van een betere mobiele fase waarbij het gedeprotecteerde AZ een iets hogere Rf-waarde vertoont. Zo kan er namelijk verzekerd worden dat het geen [18F]-Fluoride is dat ontstaan is.

Figuur 4.12: TLC van de deprotectie van verbinding 9 (links) en verbinding 8 (rechts) gekleurd met ninhydrine.

Er kon besloten worden dat de deprotectie van verbinding 9 succesvol was en er zeer waarschijnlijk vorming was opgetreden van het gewenste

18

F-gelabeld Melphalan-analoog,

verbinding 10. Deze deprotectiestap is uitermate van belang aangezien de amino- en de carboxylfunctie, die een cruciale rol spelen in de substraatherkenning van LAT 1, op deze manier opnieuw beschikbaar worden voor binding met deze transporter. Het TLC-plaatje waarop de deprotectiereactie van verbinding 8 gespot was, werd na ontwikkeling in 40 % EtOAc/60 % n-hexaan ook geanalyseerd met behulp van de MiniGITA (Figuur 4.13). Hierop konden pieken waargenomen worden bij de Rf-waarden 0,10 en 0,58 46

met een procentueel voorkomen van respectievelijk 18,6 % en 81,3 %. De piek die bij de Rfwaarde van 0,58 elueerde was vermoedelijk de niet-gedeprotecteerde verbinding 8 terwijl de piek bij de gewenste Rf-waarde van 0,10 waarschijnlijk afkomstig was van het nog resterende [18F]-fluoride in het reactiemengsel. Het procentueel aandeel van deze piek was bovendien onvoldoende groot om de deprotectie van verbinding 8 met vorming van verbinding 10 te kunnen bevestigen.

Figuur 4.13: TLC van de deprotectiereactie van verbinding 8 (Rf = 0,58)

Na kleuring van dit TLC-plaatje met ninhydrine kon echter enkel een gekleurde vlek waargenomen worden ter hoogte van de basis wat wees op de aanwezigheid van AZ op die plaats (Figuur 4.12). Mogelijks waren dit niet-gelabelde gedeprotecteerde AZ. De piek bij de Rf-waarde van 0,58 kon niet waargenomen worden op het gekleurde TLC-plaatje, wat mogelijks te wijten was aan het feit dat slechts een heel lage hoeveelheid van verbinding 8 aanwezig was die bijgevolg niet gekleurd kon worden met ninhydrine. De vorming van verbinding 10 door deprotectie van verbinding 8 kon tot slot niet bevestigd worden uit deze TLC-plaatjes. 4.7

TOEKOMSTIG ONDERZOEK In toekomstig onderzoek omtrent deze radiogelabelde inhibitor van LAT 1 zal

optimalisatie van de synthesereacties noodzakelijk zijn om meer rendabele reacties te bekomen. Zo kunnen verschillende reactietijden, reactietemperaturen en hoeveelheden van de ingezette reagentia uitgetest worden tot een hoger rendement verkregen wordt. Vervolgens zal het noodzakelijk zijn om de specificiteit en de affiniteit van verbinding 10 voor de LAT 1-transporter na te gaan door middel van in vitro celtesten. Er wordt verwacht dat deze gelijkaardig zullen zijn aan de affiniteit en de specificiteit van Melphalan 47

aangezien de postitief geladen aminogroep, de negatief geladen carboxylgroep en de apolaire zijketen ook in deze verbinding aanwezig zijn. Daarnaast ligt de verwachting dat deze radiogelabelde molecule tijdens de celtesten als inhibitor van LAT 1 zal optreden eveneens hoog. Volgens het artikel van H. Uchino et al., 2002, wordt namelijk gesteld dat een substraat van LAT 1 een inhibitor wordt wanneer de Connolly accessible area van deze molecule groter is dan 500 Ų [22]. Om de Connolly accessible area van een molecule te verkrijgen, wordt er gebruik gemaakt van het programma “Chem3D Pro”. Hiermee wordt er een MM2 berekening gedaan waarbij de minimale energie van verbinding 10 berekend wordt tot een minimum RMS-gradiënt van 0,000. De bekomen minimale energie van 18,4618 kcal/mol stemt overeen met een 3D-structuur waarbij de molecule zijn meest stabiele toestand aanneemt. Voor verbinding 10 komt dit neer op een grote afstand tussen het 18F-atoom en de OH-groep en vorming van waterstofbruggen tussen de amino- en de carboxylfunctie die dichter bijeen blijven. Op basis van deze structuur wordt vervolgens de Connolly accessible area van 508,499 Ų berekend waarbij de probe radius 1,4 Å is. Dezelfde handeling wordt uitgevoerd voor Melphalan waarbij een minimale energie van 19,6162 kcal/mol berekend wordt en de overeenkomstige 3D-structuur een Connolly accessible area van 537,378 Ų vertoont. Aangezien de structuur van verbinding 10 slechts kleine verschillen vertoont tegenover deze van Melphalan en de Connolly accessible areas dicht bijeen liggen en bovendien groter zijn dan 500 Ų wordt er verwacht dat verbinding 10 net als Melphalan als inhibitor zal optreden ter hoogte van LAT 1. Ten slotte dienen er ook in vivo testen uitgevoerd te worden op proefdieren om de beeldvormingsmogelijkheden voor laaggradige glioma op PET-scans na te gaan na intraveneuze injectie van de radiogelabelde inhibitor. Om intraveneuze injectie mogelijk te maken, dient het reactiemengsel, bekomen na de deprotectie, eerst verder opgezuiverd te worden waarna het terug aangevuld wordt met fysiologische oplossing. Deze oplossing dient vervolgens onderworpen te worden aan een uitgebreide kwaliteitscontrole waarbij de totale activiteit, het uitzicht, de pH, de radiochemische en chemische zuiverheid, de radionuclidische identiteit en zuiverheid, de steriliteit en het residuele gehalte aan K 222 en AcN nagegaan worden.

48

5.

CONCLUSIE Tijdens de koude synthese werd er allereerst een succesvolle beschermingsreactie

uitgevoerd op het aangekochte startproduct met een rendement van 78,52 % waardoor de vorming van ongewenste bindingen en nevenproducten in verdere synthesereacties vermeden kon worden. Het product van de beschermingsreactie werd vervolgens ingezet onder verschillende reactiecondities met 2-Chloroethyl p-tolueensulfonaat om vorming te verkijgen van verbinding 3. Het ontstaan van deze verbinding kon in geen van de ingezette reacties bevestigd worden met ESI-MS wat de afwezigheid van deze SN2-reactie in de literatuur ondersteunt. De SN1-like reactie van het beschermde startproduct met ethyleenoxide leverde daarentegen wel vorming op van twee reactieproducten waarvan de structuur bevestigd werd met ESI-MS. De bijhorende rendementen waren 31 % en 18,5 %. Één van deze syntheseproducten kon vervolgens getosyleerd worden met p-tolueensufonylchloride waarbij het rendement van de reactie 12,6 % bedroeg en de structuur wederom bevestigd kon worden met ESI-MS. Aangezien de rendementen van beide synthesereacties vrij laag waren, werd geconcludeerd dat optimalisatie van deze reacties met oog op hogere rendementen aangeraden is in toekomstig onderzoek. Na de succesvolle radiosynthese van [18F]-Fetos, was ook de reactie van [18F]-Fetos met een van de syntheseproducten van de SN1-like reactie geslaagd in zijn opzet. De labeling van het reactieproduct van de tosyleringsreactie met [18F]-Fluoride ging daarnaast eveneens goed door. Meteen volgend op deze geslaagde radiosyntheses werden beide

18

F-gelabelde

producten gedeprotecteerd waarbij enkel de deprotectie van dit laatste product met vrij grote zekerheid resulteerde in de vorming van het gewenste eindproduct 2-amino-3(4-((2fluoro-[18F])ethyl)(2-hydroxyethyl)amino)pheny)propaanzuur, verbinding 10. Zo kon er ten slotte geconcludeerd worden dat de poging om in deze masterproef een

18

F-gelabeld Melphalan-analoog te ontwikkelen, geslaagd is. In toekomstig onderzoek

dient het eindproduct verder opgezuiverd te worden en zal de selectiviteit en de affiniteit voor LAT 1 door middel van in vitro celtesten onderzocht moeten worden. Daarnaast zullen ook in vivo proefdiertesten noodzakelijk zijn om na intraveneuze injectie van deze molecule de beeldvormingsmogelijkheden voor laaggradige glioma op PET-scans na te gaan. 49

6.

LITERATUURLIJST

6.1

LITERATUUR

[1]

L. M. DeAngelis and M.D., “Brain Tumors,” N. Engl. J. Med., vol. 344, no. 2, pp. 114– 123, 2001.

[2]

J. McConathy and M. M. Goodman, “Non natural aminoacids for tumor imaging using PET and SPECT,” Cancer Metastasis Rev, pp. 555–557, 2008.

[3]

D. Rotariu, S. Gaivas, Z. Faiyad, D. Haba, B. Iliescu, and I. Poeata, “Malignant transformation of low grade gliomas into glioblastoma a series of 10 cases and review of the literature,” pp. 403–412, 2010.

[4]

W. Chen, “Clinical applications of PET in brain tumors.,” J. Nucl. Med., vol. 48, no. 9, pp. 1468–1481, 2007.

[5]

I. R. Whittle, “The dilemma of low grade glioma.,” J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry, vol. 75 Suppl 2, no. Suppl II, pp. ii31–i36, 2004.

[6]

S. J. Nelson, “Assessment of therapeutic response and treatment planning for brain tumors using metabolic and physiological MRI,” NMR Biomed., vol. 24, no. July 2010, pp. 734–749, 2011.

[7]

C. Juhasz, S. Dwivedi, D. O. Kamson, S. K. Michelhaugh, and S. Mittal, “Comparison of Amino Acid Positron Emission Tomographic Radiotracers for Molecular Imaging of Primary and Metastatic Brain Tumors,” Mol. Imaging, vol. 13, pp. 1–16, 2014.

[8]

I. Gielen, “Diagnostic Imaging in Laboratory Animals,” pp. 1–21, 2013.

[9]

R. R. Edelman and S. Warach, “Magnetic Resonance Imaging,” N. Engl. J. Med., vol. 328, no. 10, pp. 708–716, 1993.

[10]

S. Puttick, C. Bell, N. Dowson, S. Rose, and M. Fay, “PET, MRI, and simultaneous PET/MRI in the development of diagnostic and therapeutic strategies for glioma,” Drug Discov. Today, vol. 00, no. 00, pp. 1–12, 2014.

[11]

C. Plathow and W. a Weber, “Tumor cell metabolism imaging.,” J. Nucl. Med., vol. 49 Suppl 2, p. 43S–63S, 2008.

[12]

Z. Li and P. S. Conti, “Radiopharmaceutical chemistry for positron emission tomography(PET),” Adv. Drug Deliv. Rev., vol. 62, no. 11, pp. 1031–1051, 2010.

[13]

F. De Vos, “Cursus medische stralingsfysica en kernchemie.” 2014.

[14]

D. W. Townsend, “Physical principles and technology of clinical PET imaging.,” Ann. Acad. Med. Singapore, vol. 33, no. 2, pp. 133–145, 2004. 50

[15]

P. W. Miller, N. J. Long, R. Vilar, and A. D. Gee, “Synthesis of11C, 18F, 15O, and 13N radiolabels for positron emission tomography,” Angew. Chemie - Int. Ed., vol. 47, pp. 8998–9033, 2008.

[16]

H. N. Christensen, “Role of amino acid transport and countertransport in nutrition and metabolism.,” Physiol. Rev., vol. 70, no. 1, pp. 43–77, 1990.

[17]

C. Huang and J. McConathy, “Fluorine-18 labeled amino acids for oncologic imaging with positron emission tomography,” Curr. Top. Med. Chem., vol. 13, pp. 871–891, 2013.

[18]

P. Laverman, O. C. Boerman, F. H. M. Corstens, and W. J. G. Oyen, “Fluorinated amino acids for tumour imaging with positron emission tomography,” Eur. J. Nucl. Med., vol. 29, no. 5, pp. 681–690, 2002.

[19]

E. M. del Amo, A. Urtti, and M. Yliperttula, “Pharmacokinetic role of L-type amino acid transporters LAT1 and LAT2,” Eur. J. Pharm. Sci., vol. 35, pp. 161–174, 2008.

[20]

F. Verrey, “System L: heteromeric exchangers of large, neutral amino acids involved in directional transport.,” Pflugers Arch., vol. 445, no. 5, pp. 529–533, 2003.

[21]

Y. Kanai and H. Endou, “Functional properties of multispecific amino acid transporters and their implications to transporter-mediated toxicity.,” J. Toxicol. Sci., vol. 28, no. 1, pp. 1–17, 2003.

[22]

H. Uchino, Y. Kanai, D. K. Kim, M. F. Wempe, A. Chairoungdua, E. Morimoto, M. W. Anders, and H. Endou, “Transport of amino acid-related compounds mediated by Ltype amino acid transporter 1 (LAT1): insights into the mechanisms of substrate recognition.,” Mol. Pharmacol., vol. 61, no. 4, pp. 729–737, 2002.

[23]

J. Rautio, J. Kärkkäinen, K. M. Huttunen, and M. Gynther, “Amino acid ester prodrugs conjugated to the α-carboxylic acid group do not display affinity for the L-type amino acid transporter 1 (LAT1),” Eur. J. Pharm. Sci., vol. 66, pp. 36–40, 2015.

[24]

B. C. Fuchs and B. P. Bode, “Amino acid transporters ASCT2 and LAT1 in cancer: Partners in crime?,” Semin. Cancer Biol., vol. 15, no. 2005, pp. 254–266, 2005.

[25]

K. Izuishi, Y. Yamamoto, H. Mori, R. Kameyama, S. Fujihara, T. Masaki, and Y. Suzuki, “Molecular mechanisms of *18F+fluorodeoxyglucose accumulation in liver cancer,” Oncol. Rep., vol. 31, pp. 701–706, 2014.

[26]

J. K. Chung, Y. Kim, S. K. Kim, Y. Lee, S. Paek, J. Yeo, J. Jeong, D. Lee, H. Jung, and M. Lee, “Usefulness of 11C-methionine PET in the evaluation of brain lesions that are hypo- or isometabolic on 18F-FDG PET,” Eur. J. Nucl. Med., vol. 29, no. 2, pp. 176–182, 2002.

51

[27]

O. De Witte, I. Goldberg, D. Wikler, S. Rorive, P. Damhaut, M. Monclus, I. Salmon, J. Brotchi, and S. Goldman, “Positron emission tomography with injection of methionine as a prognostic factor in glioma.,” J. Neurosurg., vol. 95, no. 5, pp. 746–750, 2001.

[28]

K. J. Langen, K. Hamacher, M. Weckesser, F. Floeth, G. Stoffels, D. Bauer, H. H. Coenen, and D. Pauleit, “O-(2-[18F]fluoroethyl)-l-tyrosine: uptake mechanisms and clinical applications,” Nucl. Med. Biol., vol. 33, no. 3, pp. 287–294, 2006.

[29]

J. Hans, “Synthesis and radiopharmocology of 0- ( 2- [ 18F ] fluoroethyl ) -L-Tyrosine for tumor imaging,” 1999.

[30]

P. Y. Bruice, “Substitution Reactions Of Alkyl Halides,” in Organic Chemistry, 6th ed., pp. 332–374.

[31]

J. McMurry, “Reactions of Alkyl Halides: Nucleophilic Substitutions and Eliminations,” in Organic Chemistry, 7th ed., pp. 360–380.

[32]

“2.2.29 Liquid Chromatography,” in Ph. Eur. 8.0, .

[33]

K. Robards, P. R. Haddad, and P. E. Jackson, “Introduction and overview,” in Principles and Practice of Modern Chromatographic Methods, 1994, pp. 1–34.

[34]

C. F. Poole, “Planar chromatography at the turn of the century,” J Chromatogr.A, vol. 856, no. 1–2, pp. 399–427, 1999.

[35]

B. Fried and J. Sherma, Thin-Layer Chromatography, Revised And Expanded, 4th ed. 1999.

[36]

“2.2.27 Thin-Layer Chromatography,” in Ph. Eur. 8.0, .

[37]

C. B. Bottom, S. S. Hanna, and D. J. Siehr, “Mechanism of the ninhydrin reaction,” Biochem. Educ., vol. 6, no. 1, pp. 4–5, 1978.

[38]

“2.2.43 Mass Spectrometry,” in Ph.Eur. 8.0, .

[39]

P. Y. Bruice, “Mass spectrometry, infrared Spectroscopy, and ultraviolet/visible spectroscopie,” in Organic Chemistry, 6th ed., pp. 500–515.

[40]

G. B. Saha, W. J. MacIntyre, and R. T. Go, “Cyclotrons and positron emission tomography radiopharmaceuticals for clinical imaging.,” Semin. Nucl. Med., vol. 22, no. 3, pp. 150–161, 1992.

[41]

K. Strijckmans, “The isochronous cyclotron: Principles and recent developments,” Comput. Med. Imaging Graph., vol. 25, no. 2, pp. 69–78, 2001.

[42]

IBA, “Product Description Cyclone 18/9,” pp. 1–63, 2005.

52

[43]

A. Isidro-llobet and A. Mercedes, “Amino Acid-Protecting Groups,” pp. 2455–2504, 2009.

[44]

J. Thierry, C. Yue, and P. Potier, “2-Phenyl isopropyl and t-butyl trichloroacetimidates: Useful reagents for ester preparation of N-protected amino acids under neutral conditions,” Tetrahedron Lett., vol. 39, pp. 1557–1560, 1998.

[45]

R. N. Salvatore, C. H. Yoon, and K. W. Jung, “Synthesis of secondary amines,” Tetrahedron, vol. 57, no. 37, pp. 7785–7811, 2001.

[46]

F. Bergel and J. A. Stock, “Cyto-active amino acid and peptide derivatives part I. Substituted phenylalanines,” pp. 2409–2417, 1954.

[47]

L. Wang, W. Qu, B. P. Lieberman, K. Plössl, and H. F. Kung, “Synthesis, uptake mechanism characterization and biological evaluation of 18F labeled fluoroalkyl phenylalanine analogs as potential PET imaging agents,” Nucl. Med. Biol., vol. 38, no. 1, pp. 53–62, 2011.

[48]

P. Elsinga, “Radiopharmaceutical chemistry for positron emission tomography,” Methods, vol. 27, no. 3, pp. 208–217, Jul. 2002.

[49]

B. W. Schoultz, B. J. Reed, J. Marton, F. Willoch, and G. Henriksen, “A fully automated radiosynthesis of [18F]fluoroethyl- diprenorphine on a single module by use of spe cartridges for preparation of high quality 2-*18F+fluoroethyl tosylate,” Molecules, vol. 18, no. 6, pp. 7271–7278, 2013.

[50]

K. Robards, P. R. Haddad, and P. E. Jackson, “Theory of Chromatography,” in Principles and Practice of Modern Chromatographic Methods, 1994, pp. 44–45.

[51]

C. J. Springer, I. Niculescu-Duvaz, and R. B. Pedley, “Novel prodrugs of alkylating agents derived from 2-Fluoro- and 3-Fluorobenzoic acids for antibody-directed enzyme prodrug therapy,” Med.Chem., vol. 37, no. 15, pp. 2361–2370, 1994.

[52]

P. Y. Bruice, “Reactions of alcohols, ethers, epoxides , amines, and sulfur-containing compounds,” in Organic Chemistry, 6th ed., pp. 430–434.

6.2

INTERNETBRONNEN 1. http://www.yourdictionary.com//images/science/AScyclot.jpg (06-05-2015) 2. http://www.mhhe.com/physsci/chemistry/carey/student/olc/ch16reactionsepoxides .html (23-03- ’ 15)

53

BIJLAGE 1: Weergave van de structuren van verbinding 1 – verbinding 10

Verbinding 1 3-(4-aminophenyl)-2-((tertbutoxycarbonyl)amino)propaanzuur

Verbinding 2 tert-butyl 3-(4-aminophenyl)-2-((tertbutoxycarbonyl)amino)propanoaat

Verbinding 3

tert-butyl 2-((tertbutoxycarbonyl)amino)-3-(4-((2chloroethyl)amino)phenyl)propanoaat

Verbinding 4

tert-butyl 2-((tertbutoxycarbonyl)amino)-3-(4-((2hydroxyethyl)amino)phenyl)propanoaat

Verbinding 5

tert-butyl 3-(4-(bis(2hydroxyethyl)amino)phenyl)-2-((tertbutoxycarbonyl)amino)propanoaat

BIJLAGEN

Verbinding 6

tert-butyl 2-((tertbutoxycarbonyl)amino)-3-(4-((2hydroxyethyl)(2(tosyloxy)ethyl)amino)phenyl)propanoaat

Verbinding 7

tert-butyl 3-(4-(bis(2(tosyloxy)ethyl)amino)phenyl)-2-((tertbutoxycarbonyl)amino)propanoaat

Verbinding 8

tert-butyl 2-((tertbutoxycarbonyl)amino)-3-(4-((2-(fluoro18

F)ethyl)(2-

hydroxyethyl)amino)phenyl)propanoaat

tert-butyl 2-((tert-

Verbinding 9

butoxycarbonyl)amino)-3-(4-((2-(fluoro18

F)ethyl)(2-

(tosyloxy)ethyl)amino)phenyl)propanoaat

Verbinding 10

tert-butyl 2-((tertbutoxycarbonyl)amino)-3-(4-((2-(fluoro18

F)ethyl)(2-

hydroxyethyl)amino)phenyl)propanoaat

BIJLAGEN

BIJLAGE 2: Het massaspectrum JV-BocMtb bevestigt de aanwezigheid van verbinding 2.

BIJLAGEN

BIJLAGE 3: Het massaspectrum JV4_APh bevestigt de aanwezigheid van verbinding 1.

BIJLAGEN

BIJLAGE 4: Het massaspectrum JV-MAP bevestigt de aanwezigheid van verbinding 4.

BIJLAGEN

BIJLAGE 5: Het massaspectrum JV-DAP bevestigt de aanwezigheid van verbinding 5.

BIJLAGEN

BIJLAGE 6: Het massaspectrum JV-DTosM bevestigt de aanwezigheid van verbinding 7.

BIJLAGEN

BIJLAGE 7: Verslagen van Internationalisation at Home (I@H) lezingen Lezing 1: Research on the causes of human cancer and scientific strategies for cancer prevention and control (Dr. Inge Huybrechts) In deze lezing had Dr. Inge Huybrechts het over het onderzoek naar de oorzaken van humane kanker en de wetenschappelijke strategiën voor kankerpreventie en –controle. Ze vatte de lezing aan met enkele feiten omtrent kanker waarna de risicofactoren besproken werden. Zo werd erop gewezen dat er 8 risicofactoren zijn die instaan voor 50% van het aantal doden door kanker waarbij tabak bovenaan de lijst staat. Ook werd er aangetoond dat er grote verschillen bestaan tussen low and middle income countries (LMICs) en high income countries (HICs) op vlak van kanker mortaliteit, kanker incidentie en het voorkomen van de verschillende kankertypes. Er werd verder beschreven welke internationale organisaties en overheidsinstituten zoal een rol spelen in Global Cancer Control waarbij er dieper werd ingegaan op het International Agency for Research on Cancer (IARC). Dit is een UN organisatie die een classificatie opstelt van alle kanker ‘hazards’ waarbij een hazard omschreven wordt als een agens waaraan de mens blootgesteld kan worden en dat onder bepaalde omstandigheden kanker kan veroorzaken. De IARC monografieën zijn een reeks aan wetenschappelijke reviews waarin deze omgevingsfactoren, die het risico op kanker kunnen verhogen, geïdentificeerd worden. De verschillende agentia/omgevingsfactoren, die gereviewd werden in de monografieën, worden onderverdeeld in 5 klasses gebaseerd op de sterkte van het wetenschappelijk bewijs dat blootstelling mogelijks een kanker hazard kan zijn. Tot slot werd er een overzicht gegeven van wetenschappelijke strategieën voor kankerpreventie en –controle. Hierbij ligt de focus op levensstijl interventie strategieën zoals een gezond gewicht behouden, fysiek actief blijven en een gezond dieet toepassen. Deze maatregelen kunnen namelijk het risico op het ontwikkelen van kanker reduceren en de gezondheid en de overleving na kankerdiagnose beïnvloeden. Hierbij werden er nog enkele IARC voorbeelden gegeven waarbij de focus op deze levensstijl interventie strategieën lag. Lezing 2: The evolution of microbiology in cystic fibrosis (Prof. John LiPuma) Dr. LiPuma, die op 21 maart 2015 een eredoctoraat van de UGent ontving, vatte zijn lezing aan met enkele feiten omtrent mucoviscidose of Cystic Fibrosis (CF). Dit is een autosomale recessieve aandoening en de meest voorkomende letale genetische aandoening bij blanken. Door de gewijzigde functie van het ionenkanaal CFTR uit deze aandoening zich op verschillende plaatsen in het lichaam waaronder ook pulmonair. Door de neerwaartse spiraal van obstructie, infectie en inflammatie leidt CF heel vaak tot longinfecties en pulmonaire insufficiëntie wat uiteindelijk kan resulteren in respiratoir falen. Aan de hand van een tijdlijn werden ons de verschillende mijlpalen van CF aangeduid. Zo vatte in 1950, na de erkenning van het belang van infectie bij CF, de ‘Antibiotica Era’ aan waarbij heel wat antibiotica gecombineerd werden en de overleving van CF begon toe te nemen. Rond 1970 werd aan de hand van antibiotica susceptibiliteitstesten de respons van patiënten op een behandeling voorspeld. Vervolgens trad er een shift op in de CF microbiologie en was de BIJLAGEN

“Pseudomonas Era” een feit waar vroeger Staphylococcus als het belangrijkste pathogeen werd aanzien in CF. De biologie achter P. aeruginosa werd onderzocht waarbij voornamelijk de aanpassing van deze bacterie aan de omstandigheden in het lichaam werd aangetoond. Zo vormt deze bacterie een biofilm en vertoont het quorum sensing en virulentie. Binnen deze era werden er opnieuw heel veel antibiotica toegepast maar werd ook de reproduceerbaarheid van de susceptibiliteitstesten nagegaan. Hieruit kon geconcludeerd worden dat deze testen geen goede reproduceerbaarheid hadden en ze dus de respons op antibioticabehandeling niet kunnen voorspellen. Vervolgens is er een vooruitgang opgetreden in de identificatie van de micro-organismen door toepassing van methoden die geen gebruik meer maken van het in cultuur brengen van de bacteriën. Door deze innovatievere methoden werd er ontdekt dat er naast de twee voorgaande bacteriën ook nog tal van ander micro-organismen aanwezig zijn in CF luchtwegen. Tegenwoordig wordt er meer en meer getracht om door middel van een benadering van de biologie van de systemen, de complexiteit van de CF luchtwegen microbiologie te begrijpen. Lezing 3: Zijn managementvaardigheden in farmaceutische zorg belangrijk voor de toekomst? Een kijk vanuit NederBelgisch perspectief (Apr. Hendrik de Rocker) Dr. Hendrik de Rocker vatte de lezing aan door ons erop te wijzen dat er de afgelopen jaren sterke evoluties zijn opgetreden in het zorglandschap. Zo is er een verschuiving opgetreden van acute zorg naar chronische zorg met een simultane overgang van ‘genezen’ naar ‘voorkomen’. Ook staat tegenwoordig de patiënt centraal daar waar vroeger het geneesmiddel centraal stond en is het zorglandschap meer maatschappelijk gedreven t.o.v. de vroegere industrie gedreven ingesteldheid. Omwille van deze overgang is de rol van de apotheker en de patiënt in België en in Nederland mee veranderd. In die context werd de term ‘management’ geïntroduceerd waarbij zowel management op vlak van de verschillende facetten van een apotheek, op vlak van communicatie tussen personeel, artsen, verpleging, etc., en zeker ook op vlak van medicatie steeds belangrijker wordt. Aan de hand van enkele praktijkvoorbeelden van Farmaceutische Patiënten Zorg (FPZ), waarin Nederland één van de voorlopers is, werd de meerwaarde aangetoond van medicatiereview, Geïntegreerde Farmaceutische Zorg (GFZ) en Farmacotherapeutisch overleg (FTO). Bij GFZ zullen de arts, de patiënt en de apotheker elkaar versterken. In België staat men nog niet zo ver in FPZ en bestaat de uitdaging erin om de kerntaak van medicatieaflevering te doen evolueren naar hoofdzakelijk medicatieopvolging. Naar de toekomst toe is het ten slotte uitermate van belang dat de apotheker steeds meer een scharnierfunctie zal innemen in het managen en beperken van de impact van chronische ziekten op de populatie. De laagdrempeligheid van de apotheker, de specifieke competenties en kennis omtrent medicatie en de communicatie met artsen en verpleging leiden ertoe dat de apotheker deze centrale rol zou kunnen innemen.

BIJLAGEN