Dizertační práce byla vypracována na Biologickém ústavu Lékařské Fakulty Masarykovy univerzity v Brně v rámci kombinované formy doktorského studia
Doktorand: Mgr. Marek David, Biologický ústav, LF MU v Brně
Mgr. Marek David
Studium cytoskeletu a ultrastrukturální charakteristika vybraných patogenních kvasinek – - Malassezia pachydermatis a Cryptococcus laurentii
Školitel: Doc. MUDr. Miroslav Gabriel, CSc.
Oponenti: .… Prof. MUDr. Augustin Svoboda, CSc. ………………….……… .… MUDr. Vladislav Raclavský, Ph.D. ……………..………………
………………………………….…………………………………………. Autoreferát dizertace k získání vědecké hodnosti Ph.D.
Stanovisko k dizertaci vypracoval: Doc. ing. Petr Dvořák, CSc. přednosta Biologického ústavu, LF MU Brno
Autoreferát rozeslán dne:
Obhajoba dizertace se koná dne:
Vědní obor: Lékařská biologie 5103V022 S dizertační prací je možno se seznámit na Oddělení vědy a výzkumu děkanátu Lékařské fakulty Masarykovy univerzity v Brně
Brno 2007
Předseda komise pro obhajoby v oboru Lékařské biologie Doc. ing. Petr Dvořák, CSc. přednosta Biologického ústavu, LF MU Brno 2
OBSAH
1. ÚVOD
1. ÚVOD.................................................................................................................................4 1.1. Rod Malassezia ...........................................................................................................4 1.1.1. Charakteristika Malassezia pachydermatis ..........................................................5 2.2. Rod Cryptococcus .......................................................................................................5 2.2.1. Charakteristika Cryptococcus laurentii................................................................6 2.3. Cytoskelet u kvasinek..................................................................................................6 2. CÍLE PRÁCE .....................................................................................................................8 3. MATERIÁL A SEZNAM POUŽITÝCH METOD ............................................................9 4. VÝSLEDKY.....................................................................................................................10 4.1. Malassezia pachydermatis.........................................................................................10 4.1.1. Morfologie buněk Malassezia pachydermatis....................................................10 4.1.2. Ultrastruktura buněk Malassezia pachydermatis................................................10 4.1.3. Cytoskelet u Malassezia pachydermatis ............................................................11 4.2. Cryptococcus laurentii ..............................................................................................11 4.2.1. Morfologie buněk Cryptococcus laurentii .........................................................11 4.2.2. Ultrastruktura buněk Cryptococcus laurentii .....................................................12 4.2.3. Cytoskelet u Cryptococcus laurentii ..................................................................12 4.3. Saccharomyces cerevisiae .........................................................................................13 5. DISKUZE .........................................................................................................................14 5.1. Cytoskeletální struktury studovaných kvasinek.........................................................14 5.2. Mikroskopické a submikroskopické charakteristiky studovaných kvasinek..............15 6. SOUHRN..........................................................................................................................18 7. ABSTRACT .....................................................................................................................21 8. ZKRÁCENÝ SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY ........................................................24 9. SEZNAM PRACÍ AUTORA............................................................................................26
Kvasinková onemocnění se v posledních desetiletích stala vážným celosvětovým problémem (Hazen, 1995; Friedman et al., 2005). Ve většině případů se jedná o oportunní infekce, které mimo jiné souvisejí s masovým užíváním širokospektrých antibiotik, s dlouhotrvající katetrizací pacientů a se zvyšujícím se počtem nemocných, u nichž je z různých příčin navozený stav snížené imunity (Garber, 2001). Problém léčby kvasinkových onemocnění spočívá v eukaryontní povaze buněk patogenů, v toxickém účinku antimykotik na lidský organizmus a tedy i v omezeném množství těchto preparátů (Fridkin and Jarvis, 1996). Při hledání nových léčebných postupů se badatelské úsilí zaměřuje mimo jiné na vliv inhibitorů na cytoskeletální komponenty kvasinkových patogenů (Kopecká et al., 2001a, 2003; Woyke et al., 2002). Tomuto výzkumu však musí předcházet vývoj a optimalizace metodik detekce cytoskeletu a jeho charakterizace u jednotlivých patogenních druhů kvasinek. Předkládaná dizertační práce se zabývá uspořádáním cytoskeletálních struktur v průběhu buněčného cyklu dvou oportunně patogenních kvasinek -
Malassezia
pachydermatis
a
Cryptococcus
laurentii.
Vedle
fluorescenčního
a imunofluorescenčního značení cytoskeletu byla pro detailní poznání buněčného cyklu obou druhů prostudována jejich morfologie a ultrastruktura.
1.1. Rod Malassezia Kvasinky rodu Malassezia tvoří běžnou součást kožní mikroflóry většiny teplokrevných obratlovců, včetně člověka. Tyto bazidiomycetové mikroorganizmy jsou také nazývány lipofilní kvasinky, neboť jejich růst je stimulován mastnými kyselinami. Ve svém přirozeném
habitatu
lipofilní
kvasinky
většinou
perzistují
jako
saprofyté
(Midgley, 1989; Guillot and Bond, 1999). Ultrastrukturou lipofilních kvasinek se zabývalo několik prací. V rámci těchto studií bylo zjištěno, že se jedná o relativně malé mikroorganismy, které se vyznačují několika specifickými charakteristikami, jež je činí snadno rozlišitelnými od ostatních druhů kvasinek. Jmenovitě se jedná o monopolární pučení na poměrně široké bázi a o jedinečnou organizaci vnitřní strany relativně silné, lamelární buněčné stěny a plazmatické membrány. Organely a další vnitrobuněčné struktury jsou obdobné jako u jiných druhů kvasinek (Kreger–van Rij and Veenhuis, 1970; Takeo and Nakai, 1986; Nishimura et al., 1991;
3
4
Winiarczyk, 1992; Guillot et al., 1995). Jejich distribuci v buňkách v závislosti na stádiu
která
vykazuje
lamelární
charakter
(Kreger–van
buněčného cyklu však v žádné z ultrastrukturálních studií nebyla věnována pozornost.
Takeo et al., 1973, 1974; Sakaguchi et al., 1993).
Rij
and
Veenhuis,
1971;
Lipofilní kvasinky vyvolávají u člověka za určitých podmínek různá kožní
Onemocnění zapříčiněná zástupci rodu Cryptococcus se obecně označují jako
onemocnění, jako jsou pityriasis versicolor, seborhoeická dermatitida, atopická dermatitida,
kryptokokózy. Nejčastější a nejvíce problematické jsou nemoci, na nichž participuje
hnisavý
papilomatóza
C. neoformans. Nejzávažnější formou kryptokokóz je kryptokoková meningoencefalitida.
(Erchiga and Florencio, 2002). V posledních desetiletích jsou stále častěji zaznamenávány
Tyto kvasinky však vyvolávají i plicní a kožní kryptokokózy, záněty urogenitálního traktu
případy systémových malasseziálních mykóz (Ashbee and Evans, 2002).
či očí (Mitchell and Perfect, 1995; Bicanic and Harrison, 2004; Friedman et al., 2005).
1.1.1. Charakteristika Malassezia pachydermatis
2.2.1. Charakteristika Cryptococcus laurentii
zánět
vlasového
míšku,
psoriáza,
onychomykóza
nebo
Malassezia pachydermatis (M. pachydermatis) se od ostatních lipofilních kvasinek liší
Cryptococcus laurentii (C. laurentii) je ubikvitní opouzdřený mikroorganizmus,
schopností růst i v běžných kultivačních médiích, neobsahujících mastné kyseliny. Člověka
vyskytující se v různých typech prostředí (Fell and Statzell-Tallman, 1998). Podobně jako
tento mikroorganizmus kolonizuje jen sporadicky. Většinou se vyskytuje na pokožce
u ostatních zástupců rodu Cryptococcus je pouzdro v případě C. laurentii považováno
a sliznicích jiných teplokrevných obratlovců. Jde zejména o domestikované a divoké šelmy
za hlavní ochranný a virulenční faktor (Bystrický et al., 2004). Cheng et al. (2001) v literatuře zaznamenali celkem patnáct případů patogenního
(Guillot and Bond, 1999). U tohoto druhu jsou publikovány četné případy jeho příležitostného patogenního působení. Do příčinné souvislosti s M. pachydermatis jsou nejčastěji dávány záněty vnějšího
působení této kvasinky. Příznaky a projevy se lišily v závislosti na místě infekce. C. laurentii může sporadicky vyvolávat i sepse (Johnson et al., 1998).
zvukovodu a záněty kůže psů (Batra et al., 2005). U člověka může způsobovat systémové infekce (Chen and Hill, 2005).
2.3. Cytoskelet u kvasinek Hlavními složkami kvasinkového cytoskeletu jsou mikrotubuly a aktinový
2.2. Rod Cryptococcus
cytoskelet.
Členové rodu Cryptococcus jsou bazidiomycetové mikroorganizmy s celosvětovým rozšířením. Někteří zástupci vytvářejí teleomorfní stádia, která jsou řazena do rodů
Modelovými
kvasinek dva
organizmy
askomycetové druhy
pro
studium
cytoskeletu
jsou
v rámci
- Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae)
a Schizosaccharomyces pombe (Sch. pombe) (Schott et al., 2002).
Filobasidium, Filobasidiella, Cystofilobasidium a dalších (Fell and Statzell-Tallman, 1998).
U kvasinek byly identifikovány dva typy mikrotubulů – cytoplazmatické a jaderné
V rámci rodu Cryptococcus byla většina ultrastrukturálních prací zaměřena
mikrotubuly. Jaderné mikrotubuly vytvářejí dělící vřeténko. Oba dva typy jsou nukleovány
nejvýznamnějšího
neoformans).
v organizačních centrech. V buňkách S. cerevisiae se nachází jediné organizační
menší
míře
centrum - spindle pole body (SPB) (Winsor and Schiebel, 1997). U Sch. pombe byla
(Kreger–van Rij and Veenhuis, 1971; Sakaguchi et al., 1993). Na ultrastrukturální úrovni
zjištěna další dvě organizační centra (Sato and Toda, 2004). Mikrotubuly u kvasinek
bylo zjištěno, že kvasinky rodu Cryptococcus (C. neoformans) vykazují bazidiomycetový
participují zejména na lokalizaci jádra v buňce a na jeho dělení (Schott et al., 2002).
na
Ostatním
členům
zástupce
rodu
byla
–
Cryptococcus
pozornost
neoformans
věnována
(C.
v mnohem
typ buněčného cyklu – jádro se před započetím mitotického dělení přesouvá do pupenu,
Aktinový cytoskelet, který u kvasinek vytváří aktinové tečky, aktinová vlákna
kde se také vytváří dělící vřeténko (Mochizuki et al., 1987; Kopecká et al., 2001b).
a kontraktilní cytokinetický prstenec, hraje v buňkách významnou úlohu zejména při jejich
Specifickou ultrastrukturální charakteristikou zástupců rodu Cryptococcus je přítomnost
polarizovaném růstu (Pruyne and Bretscher, 2000). Aktinové tečky se v buňkách zřejmě
partikulí, jejichž velikost se pohybuje kolem 20 nm, ve vnější vrstvě buněčné stěny,
podílejí na vzniku vchlípenin plazmatické membrány a participují na procesu endocytózy.
5
6
Jejich další možnou funkcí je účast při ukládání stěnového materiálu do nově vytvářené
2. CÍLE PRÁCE
buněčné stěny (Schott et al., 2002). Aktinová vlákna slouží pro transport sekrečních váčků do míst růstu buněk a podílejí se na distribuci organel v buňkách (Bretscher, 2003). Kontraktilní a
prstenec
zprostředkovává
zaškrcuje tak
oddělení
v průběhu dceřiných
cytokineze buněk
plazmatickou (Gabriel
et
1.
membránu al.,
1998;
vypracování metodiky pro vizualizaci mikrotubulů a aktinového cytoskeletu u bazidiomycetových kvasinek M. pachydermatis a C. laurentii
2.
May and Hyams, 1998).
popis upořádání mikrotubulů a aktinového cytoskeletu v průběhu buněčného cyklu M. pachydermatis
V případě lékařsky nejvýznamnějšího patogenu, dimorfní Candida albicans byly
3.
u její kvasinkové formy z mikrotubulů detekovány cytoplazmatické mikrotubuly směřující z SPB do cytoplazmy a dělící vřeténko, které se formuje v mateřské buňce. Pro tento
C. laurentii 4.
askomycetový mikroorganizmus je typické, že během mitotického dělení se v krčku buněk objevuje soubor krátkých mikrotubulů, které nejsou organizovány v SPB
studium morfologických charakteristik M. pachydermatis a C. laurentii pomocí světelné mikroskopie
5.
(Barton and Gull, 1988). Aktinový cytoskelet se v buňkách Candida albicans nalézá ve formě aktinových teček, aktinových vláken a cytokinetického prstence. Distribuce
popis distribuce mikrotubulů a aktinového cytoskeletu v průběhu buněčného cyklu
studium morfologických charakteristik M. pachydermatis a C. laurentii pomocí elektronové mikroskopie
6.
detekce cytoskeletu na ultrastrukturální úrovni
aktinových teček je u kvasinkové a hyfovité formy odlišná (Liu, 2001). Do současné doby byla cytoskeletu velké většiny bazidiomycetových druhů kvasinek věnována jen malá pozornost (Moore, 1998). Podrobně byla distribuce cytoskeletálních komponent popsána zejména u C. neoformans, dalšího významného lidského patogenu (Kopecká et al., 2001b). Uspořádání mikrotubulů v průběhu buněčného cyklu bazidiomycetových kvasinek je ve srovnání s askomycetovými druhy (S. cerevisiae) do jisté míry odlišné. Zatímco u askomycetových kvasinek zůstává jádro do začátku mitotického dělení v mateřské buňce a v ní se také formuje dělící vřeténko (Winsor
and
Schiebel,
1997),
je
pro
většinu
bazidiomycetových
druhů,
včetně C. neoformans, typické, že se jádro před započetím mitotického dělení přesouvá z mateřské buňky do pupenu a cytoplazmatické mikrotubuly se rozpadají. Dělící vřeténko, které se následně objevuje, se u nich vytváří v pupenu (Kopecká et al., 2001b; McLaughlin et al., 2004; Gabriel et al., 2006). U všech doposud studovaných bazidiomycetových kvasinek byly z aktinových struktur zjištěny aktinové tečky. Aktinová vlákna a cytokinetický prstenec v některých případech nebyly vizualizovány. U C. neoformans, v jehož buňkách byly zjištěny všechny tři aktinové struktury (Kopecká et al., 2001b), je rozložení aktinového cytoskeletu v průběhu buněčného cyklu podobné jako u S. cerevisiae (Winsor and Schiebel, 1997). U kvasinek rodu Malassezia ani u C. laurentii, jež jsou také řazeny mezi bazidiomycetové mikroorganizmy, cytoskelet doposud studován nebyl.
7
8
3. MATERIÁL A SEZNAM POUŽITÝCH METOD V experimentech
byly
použity
kmeny
M.
pachydermatis
4. VÝSLEDKY CCY
C. laurentii CCY 17-3-5, C. laurentii CCY 17-3-6 a S. cerevisiae DBY 1690.
85-1-5,
4.1. Malassezia pachydermatis 4.1.1. Morfologie buněk Malassezia pachydermatis Velikost buněk nepřesahovala na délku 5,0 µm a na šířku 2,5 µm. V místě báze pučení
Metody:
byla při fluorescenčním barvení buněčné stěny pozorována intenzivní fluorescence
- stanovení dynamiky růstu kultur
a nacházel se zde nápadný límeček. Vyjma límečku nebyly na povrchu buněk pozorovány
- negativní barvení pouzdra
žádné jizvy po předchozích pučeních. V závislosti na velikosti pupenu a poloze jádra byla
- fluorescenční a imunofluorescenční mikroskopie
na ultrastrukturální úrovni odlišena jednotlivá stádia buněčného cyklu M. pachydermatis.
- fluorescenční barvení buněčných stěn, F-aktinu a jader - imunofluorescenční barvení mikrotubulů a F-aktinu - transmisní elektronová mikroskopie
Pupen vyrůstal z poměrně široké báze. Po dosažení určité velikosti pupenu se do něj z mateřské buňky přesunulo jádro. Následovalo mitotické dělení jádra a poté tvorba septa mezi dceřinými buňkami, obsahujícími po jednom jádru.
- příprava ultratenkých řezů pomocí: a) manganistanu draselného
4.1.2. Ultrastruktura buněk Malassezia pachydermatis
b) glutaraldehydu a oxidu osmičelého
Na ultratenkých řezech buněk M. pachydermatis fixovaných manganistanem
c) rutheniové červeně
draselným byly organely jasně ohraničeny membránami. U buněk, které byly post-fixovány
- imunoznačení na ultratenkých řezech
oxidem osmičelým, byly navíc v cytoplazmě patrné ribosomy a u vrcholu rostoucího pupenu
- mrazové lámání
byla zjištěna akumulace malých měchýřků. Silná lamelární buněčná stěna se na vnitřní
- rastrovací elektronová mikroskopie
straně vyznačovala pilovitým uspořádáním. Pilovité uspořádání stěny korespondovalo s výraznými invaginacemi plazmatické membrány. Při bázi pučení byly pozorovány výběžky plazmatické membrány, kde se naopak plazmatická membrána zanořovala do buněčné stěny. Centripetálně rostoucí septum bylo obdobně elektron-denzní jako původní buněčná stěna. U buněk zpracovaných mrazovým lámáním byly zjištěny tytéž organely jako v případě ultratenkých řezů. Invaginace plazmatické membrány, pozorované na ultratenkých řezech, se u buněk upravených mrazovým lámáním jevily jako vchlípeniny (PF plocha plazmatické membrány - protoplasmic fracture face), které byly ve směru od báze pučení k pólům buňky uspořádány do levotočivých spirál. Mezi nimi byly v cytoplazmě pozorovány drobné vezikly. Vchlípeniny plazmatické membrány korespondovaly s pravotočivě uspořádanými hřebeny vnitřního povrchu buněčné stěny (EF plocha plazmatické membrány - exoplasmic fracture face). Výběžky plazmatické membrány, které byly detekovány na ultratenkých řezech, se na PF ploše plazmatické membrány buněk zpracovaných technikou mrazového
9
10
lámání jevily jako ohrazené výdutě. V místě báze pučení se nacházelo prstencovité zduření
cyklu C. laurentii. Nepučící buňky měly kulovitý či elipsovitý tvar. Na počátku pučení se
plazmatické membrány. Buněčná stěna sestávala ze dvou vrstev.
na buňkách vytvořila krátká stopka. Po vzniku pupenu se stopka transformovala do krčku. Do pupenu se před zahájením mitotického dělení přemístilo jádro. V průběhu M-fáze se jádro rozdělilo ve dvě dceřiná jádra. Jedno z dceřiných jader se přesunulo do mateřské
4.1.3. Cytoskelet u Malassezia pachydermatis Změny v uspořádání cytoskeletálních struktur během buněčného cyklu studovaných kvasinek byly sledovány v závislosti na poloze jádra a na velikosti pupenu.
buňky a druhé zůstalo v pupenu. Mezi buňkami se poté vytvořilo septum a buňky se od sebe oddělily.
U M. pachydermatis byly v průběhu interfáze detekovány cytoplazmatické mikrotubuly, které v nepučících buňkách tvořily nepravidelnou síť. Po započetí pučení se
4.2.2. Ultrastruktura buněk Cryptococcus laurentii
cytoplazmatické mikrotubuly orientovaly do pupenu. Před zahájením mitotického dělení se
U buněk C. laurentii fixovaných manganistanem draselným byly na ultratenkých
jádro přemístilo z mateřské buňky do pupenu a cytoplazmatické mikrotubuly se rozpadly.
řezech zřetelně pozorovatelné membrány organel. Plazmatická membrána byla kontrastní
Místo nich byla pozorována difúzní fluorescence v pupenu. Jaderné dělení bylo
méně. V cytoplazmě buněk post-fixovaných oxidem osmičelým byly zjištěny ribosomy
charakterizováno vytvořením dělícího vřeténka s krátkými astrálními mikrotubuly. Dělící
a v jádře bylo pozorováno jadérko. Lamelární buněčná stěna byla na mateřské buňce
vřeténko po dokončení mitózy zaniklo a bylo nahrazeno cytoplazmatickými mikrotubuly.
zpravidla silnější. Vnitřní povrch stěny nevykazoval žádné specifické uspořádání. U buněk
Prostřednictvím
fluorescenčního
a
imunofluorescenčního
značení
nebyl
post-fixovaných oxidem osmičelým byly v buněčné stěně jasně rozlišitelné dvě vrstvy.
u M. pachydermatis aktinový cytoskelet, ani po modifikaci metodik, vizualizován. U většiny
Při úzké bázi pučení se na stěně některých mateřských buněk nacházel límeček. Septum,
buněk nebyla zaznamenána žádná interakce s látkami nesoucími fluorochromy nebo velmi
vytvářející se mezi dceřinými buňkami v průběhu cytokineze, obsahovalo obdobný
slabá
elektron-transparentní materiál jako vnější vrstva buněčné stěny.
difúzní
fluorescence,
patrně
při
jejich
povrchu.
Zcela
sporadicky
byly
ve fluorescenčně barvených buňkách zjištěny struktury podobné aktinovým tečkám
Vyjma struktur pozorovaných na ultratenkých řezech byly pomocí mrazového lámání
a cytokinetickému prstenci. Aktin byl u této kvasinky detekován pomocí imunoznačení
v buňkách C. laurentii detekovány jaderné póry v jaderném obalu. Na plazmatické
na ultratenkých řezech. Akumulace zlatých partikulí byla zjištěna v blízkosti plazmatické
membráně byly zaznamenány vchlípeniny. Vchlípeniny byly nahodile a nepravidelně
membrány. U rostoucího septa shluky partikulí pozorovány nebyly.
rozptýleny po celém povrchu plazmatické membrány. Ve vnější vrstvě buněčné stěny se nacházely partikule, velké přibližně 20 nm.
4.2. Cryptococcus laurentii 4.2.1. Morfologie buněk Cryptococcus laurentii
4.2.3. Cytoskelet u Cryptococcus laurentii
Velikost většiny buněk obou studovaných kmenů se pohybovala v rozmezí
Rozložení mikrotubulů v průběhu buněčného cyklu bylo sledováno u opouzdřeného
3,0 – 7,0 µm na délku a 2,0 – 3,0 µm na šířku, v závislosti na fázi buněčného cyklu.
kmene C. laurentii. Na počátku buněčného cyklu byly u kvasinky zaznamenány
Oba kmeny pučely na úzké bázi. Až na jizvy po předchozích pučeních a nevýrazného
cytoplazmatické mikrotubuly, vytvářející v nepučících buňkách nepravidelnou síť.
límečku byl povrch buněk obou kmenů hladký. Při detekci pouzdra pomocí negativního
Počátek pučení byl u C. laurentii charakterizován vytvořením krátké stopky,
barvení byla jeho přítomnost prokázána u buněk kmene C. laurentii CCY 17-3-5. Buňky
do níž začaly cytoplazmatické mikrotubuly směřovat. Na stopce následně vyrůstal
druhého kmene pouzdro postrádaly. Tyto závěry byly potvrzeny po zhotovení ultratenkých
pupen. Cytoplazmatické mikrotubuly se prodlužovaly z mateřské buňky do pupenu.
řezů, připravených za použití rutheniové červeně. Při fluorescenčním barvení buněčné stěny
Když pupen dorostl zhruba do poloviny velikosti mateřské buňky, přesunulo se do něj jádro.
byla zjištěna silná fluorescence v místě úzké báze pučení. Na ultrastrukturální úrovni byla
Současně došlo k postupné dezintegraci cytoplazmatických mikrotubulů. Po jejich rozpadu
v závislosti na fázi vývoje pupenu a poloze jádra rozlišena jednotlivá stádia buněčného
byla detekována difúzní fluorescence v pupenu. Posléze bylo v jádře zřetelné dělící
11
12
vřeténko, které se postupně prodlužovalo. Na koncích dělícího vřeténka byly pozorovány
5. DISKUZE
astrální mikrotubuly. Po dokončení mitózy se dělící vřeténko rozpadlo a v buňkách se rekonstruovala síť cytoplazmatických mikrotubulů. Vizualizace aktinového cytoskeletu pomocí fluorescenčního a imunofluorescenčního značení byla u opouzdřeného kmene C. laurentii CCY 17-3-5 velmi problematická. Převážná většina buněk vykazovala při svém povrchu difúzní fluorescenční signál a jen u malého procenta buněk byly imunofluorescenčně detekovány aktinové tečky. Jejich velikost nebyla standardní. Tyto aktinové tečky byly, jak v mateřské buňce tak v pupenu, většinou nepravidelně rozmístěny. Po rozdělení jader se aktinové tečky nacházely zejména v blízkosti krčku. Aktinová vlákna ani cytokinetický prstenec u tohoto kmene pozorovány nebyly.
5.1. Cytoskeletální struktury studovaných kvasinek Prezentované výsledky představují prvotní nálezy mikrotubulů u M. pachydermatis a C. laurentii. V jejich buňkách byly zjištěny cytoplazmatické mikrotubuly během interfáze, difúzní fluorescence v pupenu před zahájením mitotického dělení a dělící vřeténko s astrálními mikrotubuly při mitotickém dělení. Uspořádání mikrotubulů v průběhu buněčného cyklu je u obou kvasinek prakticky stejné. Příslušnost obou druhů k bazidiomycetovým organizmům naznačuje pozorovaná migrace jádra do pupenu před mitotickým dělením, která byla prokázána také na ultrastrukturální úrovni. Přesun jádra do pupenu před jeho rozdělením byl zjištěn u většiny doposud studovaných
V buňkách neopouzdřeného kmene C. laurentii CCY 17-3-6 byl aktinový cytoskelet detekován fluorescenčně. V nepučících buňkách se pod plazmatickou membránou vyskytovaly aktinové tečky. Aktinové tečky byly v mateřské buňce přítomny i v dalších stádiích buněčného cyklu. Během následujícího vývoje buněk byla pozorována krátká aktinová vlákna, orientovaná do stopky, která vykazovala silnou fluorescenci. Aktinová vlákna směřovala i do rostoucího pupenu, po jeho vytvoření. V pupenu byly akumulovány aktinové tečky. Toto uspořádání aktinového cytoskeletu přetrvávalo i během přesunu jádra do pupenu a v průběhu mitózy. Na počátku cytokineze se při bázi pupenu vytvořil cytokinetický prstenec. Aktinové tečky byly přítomny v obou dělících se buňkách. Aktinová vlákna nebyla v tomto stádiu buněčného cyklu pozorována.
bazidiomycetových kvasinek (McLaughlin et al., 1995, 2004; Kopecká et al., 2001b; Gabriel et al., 2006). Mikrotubuly C. laurentii a kontrolních buněk (S. cerevisiae) byly vizualizovány bez větších potíží. U M. pachydermatis způsobovala při detekci mikrotubulů značné problémy malá velikost buněk. Patrně se jedná o nejmenší kvasinku, u které byla distribuce mikrotubulů charakterizována v průběhu buněčného cyklu (Kopecká et al., 2001b; McLaughlin et al., 2004; Gabriel et al., 2006). Další potíží byla samotná vizualizace mikrotubulů. Mikrotubuly byly u tohoto mikroorganizmu detekovány až po prodloužené inkubaci buněk se suspenzí stěnových lytických enzymů. Příčinou je zřejmě silná a kompaktní buněčná stěna (Winiarczyk, 1992; Guillot et al., 1995). Aktinový
4.3. Saccharomyces cerevisiae
cytoskelet
byl
prokázán
v
buňkách
obou
studovaných
druhů – u M. pachydermatis byl detekován na ultrastrukturální úrovni pomocí imunoznačení
Pro ověření správnosti postupu při vizualizaci cytoskeletu M. pachydermatis
a u C. laurentii fluorescenčním a imunofluorescenčním značením. Bezchybnost
a C. laurentii fluorescenčními technikami byly mikrotubuly (imunofluorescenčně)
standardního postupu při fluorescenčním značení F-aktinu byla potvrzena na kontrolních
a F-aktin (fluorescenčně) detekovány v buňkách S. cerevisiae. U tohoto mikroorganizmu
buňkách (S. cerevisiae).
byly pozorovány všechny struktury typické pro kvasinkové buňky. Z mikrotubulů byly
F-aktin
nebyl
v buňkách
M.
pachydermatis
pomocí
fluorescenčního
zjištěny cytoplazmatické mikrotubuly v průběhu interfáze a dělící vřeténko s astrálními
a imunofluorescenčního značení zjištěn. Důvody, které zapříčinily nezdar při jeho
mikrotubuly při mitotickém dělení. Difúzní fluorescence v pupenu a migrace jádra do něj,
vizualizaci, jsou možná obdobné jako okolnosti ztěžující detekci mikrotubulů u tohoto
před započetím mitózy, zaznamenány nebyly. Při detekci F-aktinu byly v buňkách
mikroorganizmu. Na ultrastrukturální úrovni byla u M. pachydermatis pozorována
S. cerevisiae pozorovány aktinové tečky, aktinová vlákna a po rozdělení jader cytokinetický
akumulace partikulí zlata, detekujících aktin, v blízkosti plazmatické membrány.
prstenec.
Tyto struktury by mohly odpovídat aktinovým tečkám, které byly u jiných druhů kvasinek
13
14
na ultrastrukturální úrovni pozorovány jako spirály aktinových mikrofilament, obtáčející
produkovat
prstovité invaginace plazmatické membrány (Mulholland et al., 1994) nebo jako
Přítomnost, respektive absence pouzdra byla pozorována jak na tušových preparátech,
kónické a kupovité struktury složené z krátkých, vzájemně se křížících, mikrofilament
tak i na ultrastrukturální úrovni po aplikaci rutheniové červeně. Tyto výsledky jsou
(Rodal et al., 2005).
ve shodě s dříve publikovanými daty (Kolarova et al., 1997; Dudíková and Kolarova, 2006).
U neopouzdřeného kmene C. laurentii byly vizualizovány všechny aktinové struktury
extracelulární
polysacharidy
(Dudíková
and
Kolarova,
2006).
Na buněčné stěně mateřských buněk obou druhů se při bázi pučení vytvářel límeček.
typické pro kvasinky – aktinové tečky, vyskytující se v buňkách během celého buněčného
V případě M. pachydermatis byl límeček více nápadný. Jeho velikost závisí na počtu pučení
cyklu; aktinová vlákna, směřující do oblastí růstu; cytokinetický prstenec, objevující se
(Kreger–van Rij and Veenhuis, 1970). Při barvení buněčné stěny studovaných druhů byla
před započetím cytokineze (Schott et al., 2002). V porovnání s F-aktinem u příbuzné
nejintenzivnější fluorescence zjištěna v místě báze pučení, kde lze, vzhledem k afinitě obou
kvasinky C. neoformans však byl aktinový cytoskelet neopouzdřeného kmene C. laurentii
použitých barviv (Pringle, 1991; Raclavský et al., 1999), předpokládat největší koncentraci
chudší (Kopecká et al., 2001b). V buňkách opouzdřeného kmene C. laurentii byly
chitinu. Chitin je pravděpodobně soustředěn v jizvě po pučení na mateřské buňce, která se
pomocí imunofluorescenčního značení zjištěny aktinové tečky v místech intenzivního růstu.
promítá do límečku.
Sporadicky byly aktinové tečky pozorovány také v mateřské buňce. Aktinová vlákna
Buněčná
stěna
M.
pachydermatis
byla
ve
srovnání
s
buňkami
ani cytokinetický prstenec při použití této metodiky pozorovány nebyly. Fluorescenční
C. laurentii relativně silná. Podobně jako u jiných bazidiomycetových druhů
značení F-aktinu u opouzdřeného kmene selhalo. Pouzdro se, vyjma obrany před predátory
(Kreger–van Rij and Veenhuis, 1971; Simmons and Ahearn, 1987; Gabriel et al., 2006) byl
(Steenbergen and Casadevall, 2003), pravděpodobně také podílí na ochraně buňky
u obou mikroorganizmů na ultratenkých řezech detekován lamelární charakter buněčné
před toxickým účinkem některých látek, jako je například faloidin.
stěny. V buněčné stěně kvasinek lze rozeznat dvě a více vrstev (Winiarczyk, 1992; Guillot et al., 1995; Sakaguchi et al., 1993). V této studii byly na ultratenkých řezech buněk
5.2.
Mikroskopické
a
submikroskopické
charakteristiky
studovaných
Ve vnější vrstvě buněčné stěny byly na preparátech připravených mrazovým lámáním
kvasinek Všechna
C. laurentii post-fixovaných oxidem osmičelým detekovány dvě vrstvy buněčné stěny.
stádia
buněčného
cyklu
obou
druhů,
která
byla
rozlišena
pomocí fluorescenční mikroskopie, byla pozorována také na ultrastrukturální úrovni. Pupen u M. pachydermatis rostl na široké bázi. Takový způsob růstu pupenu lze
pozorovány partikule, velké okolo 20 nm. Jejich přítomnost v buněčné stěně je dávána do souvislosti se schopností mikroorganizmu vytvářet pouzdro, respektive produkovat extracelulární polysacharidy (Takeo et al., 1973, 1974). Ve srovnání s M. pachydermatis
interpretovat jako určitý přechod mezi klasickým pučením a vznikem nové buňky
bylo septum buněk C. laurentii méně elektron-denzní. Na ultratenkých řezech buněk
u štěpících kvasinek (Takeo and Nakai, 1986). Báze pučení C. laurentii byla naopak úzká.
post-fixovaných oxidem osmičelým byla jeho denzita srovnatelná s denzitou vnější vrstvy
Na buňkách se při zahájení pučení nejprve zformovala krátká stopka a ta se po vzniku
buněčné stěny. Centripetální růst septa byl u rodu Malassezia i Cryptococcus pozorován
pupenu transformovala do krčku. Vznik pupenu byl u tohoto mikroorganizmu shodný
již dříve (Kreger–van Rij and Veenhuis, 1970, 1971; Nishimura et al., 1991).
jako v případě C. neoformans (Kopecká et al., 2001b) a Cryptococcus diffluens
V souladu s dříve publikovanými ultrastrukturálními studiemi byla u studovaného
(Kreger–van Rij and Veenhuis, 1971). Následující stádia buněčného cyklu byla
kmene M. pachydermatis zjištěna jedinečná organizace buněčné stěny a plazmatické
u obou mikroorganizmů totožná. Přesun jádra do pupenu před jeho rozdělením ukazuje
membrány, jež je charakteristická pro všechny zástupce rodu Malassezia. Na vnitřní straně
na bazidiomycetový typ buněčného cyklu (McLaughlin et al., 1995; Moore, 1998).
buněčné stěny (EF plocha plazmatické membrány) byly pozorovány spirálovitě uspořádané
U kmene C. laurentii CCY 17-3-5 bylo na povrchu buněk přítomno pouzdro. Kmen
hřebeny, které korespondovaly se spirálovitě uspořádanými vchlípeninami plazmatické
C. laurentii CCY 17-3-6 tuto strukturu postrádal, ačkoliv u něj byla popsána schopnost
membrány (PF plocha plazmatické membrány). Na PF ploše plazmatické membrány byly v blízkosti báze pučení detekovány ohrazené výdutě. Prstencovité zduření plazmatické
15
16
membrány, tvořící hranici mezi mateřskou buňkou a pupenem, je strukturou, která se vyskytuje
pouze
u
buněk
M.
pachydermatis
(Takeo
and
Nakai,
6. SOUHRN
1986;
Nishimura et al., 1991). U C. laurentii nebylo na ultratenkých řezech pozorováno žádné
Předkládaná
disertační
práce
byla
zaměřena
morfologie
dvou
potenciálně
na
specifické uspořádání vnitřního povrchu buněčné stěny ani plazmatické membrány.
ultrastruktury
Nahodilá distribuce vchlípenin plazmatické membrány, jež byly detekovány na preparátech
kvasinek – Malassezia pachydermatis a Cryptococcus laurentii.
připravených mrazovým lámáním, byla obdobná jako u jiných zástupců rodu Cryptococcus (Takeo et al., 1973, 1974).
a
studium
patogenních,
cytoskeletu,
bazidiomycetových
Z cytoskeletálních struktur byly imunofluorescenčně u obou mikroorganizmů identifikovány
mikrotubuly
a
byla
poznána
jejich
distribuce
a
dynamika
Podobně jako v dalších ultrastrukturálních studiích zástupců rodů Malassezia
v průběhu buněčného cyklu. V buňkách byly pozorovány cytoplazmatické mikrotubuly
a Cryptococcus (Nishimura et al., 1991; Sakaguchi et al., 1993) byly v buňkách
během interfáze, difúzní fluorescence v pupenu před započetím mitotického dělení
obou
buňky.
a dělící vřeténko s astrálními mikrotubuly v M-fázi. U obou studovaných druhů
U M. pachydermatis nebylo vizualizováno jadérko, ačkoliv někteří autoři přítomnost
bazidiomycetových kvasinek byl zjištěn přesun jádra do pupenu před jeho rozdělením. Pro
této struktury v jádře lipofilních kvasinek prokázali (Winiarczyk, 1992).
vizualizaci mikrotubulů u Malassezia pachydermatis byla nezbytná prodloužená inkubace
studovaných
druhů
zjištěny
organely
typické
pro
kvasinkové
buněk se stěnovými lytickými enzymy. Fluorescenční
a
imunofluorescenční
barvení
aktinového
cytoskeletu
Malassezia pachydermatis se nezdařilo. Aktin byl u této kvasinky identifikován pouze imunoznačením na ultrastrukturální úrovni. Zjištěný aktin byl převážně asociován s plazmatickou membránou. U opouzdřeného kmene Cryptococcus laurentii byly imunofluorescenčním značením prokázány aktinové tečky, lokalizované zejména v rychle rostoucích částech buněk a během cytokineze při bázi pučení. Při fluorescenčním barvení rhodamin-faloidinem nebyly v buňkách tohoto kmene aktinové struktury prokázány. Barvivo se zřejmě vázalo na komponenty pouzdra. Fluorescenčně byl F-aktin identifikován a jeho distribuce a dynamika byly poznány v průběhu
buněčného
cyklu
neopouzdřeného
kmene
Cryptococcus
laurentii.
Absence pouzdra na buněčném povrchu byla u tohoto kmene potvrzena jak na tušových preparátech, tak pomocí rutheniové červeně na ultratenkých řezech. V buňkách se během celého buněčného cyklu nacházely aktinové tečky a to především akumulované v místech intenzivního růstu. U pučících buněk byla identifikována aktinová vlákna, která z mateřské buňky směřovala nejprve do krátké stopky a následně do rostoucího pupenu, jenž se na stopce vytvářel. Po dokončení mitotického dělení aktinová vlákna zanikla a při bázi pučení se vytvořil cytokinetický prstenec. Rozložení a dynamika aktinového
17
18
cytoskeletu
Cryptococcus
laurentii
byly
podobné
jako
u
příbuzného
druhu
Cryptococcus neoformans. U Cryptococcus laurentii však byl F-aktin chudší.
Buňky Cryptococcus laurentii ohrazené výdutě a prstencovité zduření plazmatické membrány postrádaly.
Stádia buněčného cyklu, která byla u studovaných druhů rozlišitelná prostřednictvím
V buňkách
obou
studovaných
druhů
byly
potvrzeny
organely
typické
fluorescenční mikroskopie, byla detekována také na ultrastrukturální úrovni, včetně přesunu
pro kvasinky - jádro, mitochondrie, vakuoly, endoplazmatické retikulum a Golgiho aparát.
jádra do pupenu před zahájením mitotického dělení. Na rozdíl od Cryptococcus laurentii
Dále byly pozorovány ribosomy v cytoplazmě, jaderné póry v jaderné membráně a kristy
pučely buňky Malassezia pachydermatis monopolárně na široké bázi a nevytvářela se na
uvnitř mitochondrií. U buněk Malassezia pachydermatis byla mimoto zjištěna
nich stopka. Pupen se u tohoto druhu odděloval od mateřské buňky štěpením.
akumulace malých měchýřků při vrcholu pupenu a přítomnost drobných veziklů
Na povrchu buněk Malassezia pachydermatis nebyly vyjma límečku zaznamenány žádné jizvy po předchozích pučeních. U Cryptococcus laurentii byl límeček méně výrazný
mezi sousedními vchlípeninami plazmatické membrány. Jadérko bylo detekováno pouze u Cryptococcus laurentii.
a na povrchu buněčné stěny se vyskytovaly další jizvy. V límečku buněk obou studovaných
Distribuce mikrotubulů identifikovaná v průběhu buněčného cyklu obou studovaných
kvasinek a v jizvách u Cryptococcus laurentii byl pravděpodobně akumulován chitin,
druhů je obdobná jako u dalších bazidiomycetových kvasinek. Aktinový cytoskelet
soudě podle intenzivní fluorescence v těchto místech při barvení buněčné stěny a afinitě
Cryptococcus laurentii obsahuje všechny tři typy F-aktinových struktur, které jsou
použitých barviv k chitinu.
pro kvasinky typické. V buňkách Malassezia pachydermatis by prokázaný aktin
Oproti Cryptococcus laurentii měly buňky Malassezia pachydermatis buněčnou stěnu
mohl souviset s jedinečným uspořádáním plazmatické membrány a vnitřního povrchu
silnou a kompaktní. Bylo potvrzeno, že buněčná stěna obou kvasinek má lamelární charakter
buněčné stěny. Potíže při vizualizaci jednotlivých složek cytoskeletu studovaných
a jsou v ní rozlišitelné jednotlivé vrstvy. Přítomnost partikulí ve vnější vrstvě buněčné stěny
druhů
Cryptococcus laurentii by mohla souviset s produkcí extracelulárních polysacharidů.
Malassezia pachydermatis je zřejmě příčinou těchto potíží silná buněčná stěna
Centripetálně
a u Cryptococcus laurentii pouzdro.
rostoucí
septum,
které
se
vytvářelo
při
cytokinezi,
mělo
jsou
patrně
zapříčiněny
extracelulárními
u Malassezia pachydermatis obdobnou denzitu jako původní buněčná stěna. Septum buněk Cryptococcus laurentii bylo elektron-denzní méně. Jeho denzita byla srovnatelná s denzitou vnější vrstvy buněčné stěny této kvasinky. U Malassezia pachydermatis byla potvrzena jedinečná organizace vnitřního povrchu buněčné stěny a plazmatické membrány. Na vnitřní straně buněčné stěny se nacházely hřebeny, uspořádané do spirál, které korespondovaly se spirálovitě uspořádanými vchlípeninami plazmatické membrány. Absence těchto struktur byla zaznamenána při bázi pučení a na vrcholu pupenu. U buněk Cryptococcus laurentii se tato jedinečná organizace povrchů nevyskytovala. Byly zde pouze jednotlivé vchlípeniny (invaginace) plazmatické membrány, které byly rozmístěny nahodile. Další dvě specifické struktury, které byly na plazmatické membráně buněk Malassezia pachydermatis potvrzeny, byly ohrazené výdutě a prstencovité zduření. Ohrazené výdutě se nacházely při bázi pučení mezi sousedními vchlípeninami membrány. V místě jejich výskytu byla buněčná stěna kvasinky nejtenší. Předěl mezi mateřskou buňkou a pupenem u tohoto mikroorganizmu tvořilo prstencovité zduření plazmatické membrány.
19
20
strukturami
buněk.
V případě
All stages of cell cycle, as detected by fluorescence microscopy, were also seen
7. ABSTRACT
in both species at the ultrastructural level, including migration of the nucleus In the present thesis, the microtubular and actin cytoskeletons, ultrastructural
to the bud before mitosis. In contrast to Cryptococcus laurentii cells, the budding
characteristics and morphology of two potentially pathogenic basidiomycetous yeasts
of Malassezia pachydermatis was monopolar on a broad base without development
Malassezia pachydermatis and Cryptococcus laurentii were investigated.
of sterigma and the bud separated from the mother cell by fission.
At studied species, the distribution of microtubules was described in relation
On surface of Malassezia pachydermatis cells, apart from collar at the budding base,
immunofluorescence,
no bud scars were observed. Collar of Cryptococcus laurentii cells was not so marked.
cytoplasmic microtubules were detected in interphase and a spindle with astral microtubules
At this yeast, other bud scars were also presented on the cell wall surface. In both, the collar
was seen in M-phase. The disintegration of cytoplasmic microtubules and migration
and the bud scars, chitin was probably accumulated there, inferring due to a strong
of the nucleus to the bud before mitosis were characteristic features of both basidiomycetous
fluorescence at these sites after staining of the cell wall and affinity of used dyes to chitin.
to
nucleus
position
and
bud
development.
By
indirect
yeasts. To detect microtubules in Malassezia pachydermatis cells, a prolonged incubation
showed relatively thick and compact cell wall. The cell wall of both yeasts was
with lysing enzymes was necessary. The
visualisation
of
In comparison with Cryptococcus laurentii, the Malassezia pachydermatis cells
F-actin
structures
in
Malassezia
pachydermatis
multilamellar with some discernible layers. The presence of particles in the rough
antibody
outer layer of Cryptococcus laurentii cell wall could be probably associated
and rhodamine-phalloidin, failed. However, actin was detected by electron microscopy
with production of extracellular polysaccharides. At Malassezia pachydermatis cells,
with immunogold labelling. Clusters of gold particles indicating actin structures were
the density of centripetal growing septum that was forming during cytokinesis was similar
detected mainly at the plasma membrane. A possible association of the actin cytoskeleton
as the density of the cell wall. The septum of Cryptococcus laurentii cells was more
with unique cortical features characteristic of the genus Malassezia was suggested.
electron-transparent. Its density was comparable to the density of outer cell wall layer.
cells
by
fluorescence
microscopy,
using
both
monoclonal
anti-actin
strain
It was confirmed that the inner surface of the cell wall and the plasma membrane
of Cryptococcus laurentii by rhodamine-phalloidin was not successful. A possible
of Malassezia pachydermatis cells showed the unique pattern. Right-handed spiral ridges
explanation is a potential non-specific interaction of rhodamine-phalloidin with capsular
on the inner side of the cell wall corresponded to left-handed spiral grooves of the plasma
polysaccharides. Using indirect immunofluorescence, actin patches were demonstrated
membrane. They were missing only on the broad budding base and on the bud apex.
in encapsulated strain cells. During budding, they were accumulated in growing bud
In Cryptococcus laurentii cells, the unique pattern of spiral grooves was absent
and after nuclear division, they occurred at the budding base.
and the plasma membrane invaginations were distributed irregularly.
The
detection
of
actin
cytoskeleton
in
an
encapsulated
The distribution of F-actin structures during the cell cycle of an acapsular strain
Two further unusual structures were confirmed on the plasma membrane
Cryptococcus laurentii was described. The absence of a capsule was confirmed by India ink
of Malassezia pachydermatis cells. Near the budding base between neighbouring grooves
staining and by ruthenium red staining in ultrathin sections. Using rhodamine-phalloidin,
of the plasma membrane, circumvallate bulgings were detected. The cell wall in these
all structures typical of yeast cells were observed, i.e., actin patches detected in the course
regions was the thinnest. Moreover, the plasma membrane of this yeast formed
of whole cell cycle, actin cables extending from the mother cell to sterigma
a ring-like swelling in the budding base (between the mother cell and the bud). Both,
and subsequently to growing bud and cytokinetic ring during cytokinesis. The distribution
the circumvallate bulgings and the ring-like swelling, were absent on the plasma membrane
of
of Cryptococcus laurentii cells.
actin
cytoskeleton
in
Cryptococcus
laurentii
was
similar
to
those
The presence of organelles typical for yeasts, i.e., nucleus, mitochondria, vacuoles,
in Cryptococcus neoformans, but poorer.
endoplasmic reticulum and Golgi apparatus, in cells of investigated species was confirmed.
21
22
Furthermore, ribosomes in cytoplasm, nuclear pores in nuclear envelope and cristae
8. ZKRÁCENÝ SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY
inside mitochondria were discernible. In Malassezia pachydermatis cells, small vesicles
Ashbee H. R., Evans E. G. V. (2002): Immunology of diseases associated with Malassezia species. Clin Microbiol Rev 15, 21–57. Batra R., Boekhout T., Guého E., Cabañes F. J., Dawson T. L., Gupta A. K. (2005): Malassezia Baillon, emerging clinical yeasts. FEMS Yeast Res 5, 1101-1113. Barton R., Gull K. (1988): Variation in cytoplasmic microtubule organization and spindle length between the two forms of the dimorphic fungus Candida albicans. J Cell Sci 91, 211-220. Bicanic T., Harrison T. S. (2004): Cryptococcal meningitis. Br Med Bull 72, 99-118. Bretscher A. (2003): Polarized growth and organelle segregation in yeast: the tracks, motors, and receptors. J Cell Biol 160, 811-816. Bystrický S., Paulovicová E., Machová E. (2004): Synthesis and immunogenicity of polysaccharide-protein conjugate composed of galactoglucoxylomannan of Cryptococcus laurentii. FEMS Microbiol Lett 235, 311–314. Dudíková J., Kolarova N. (2006): Extracellular polysaccharides produced by acapsular mutant of Cryptococcus laurentii. Chem Pap 60, 69-70. Erchiga V. C., Florencio V. D. (2002): Malassezia species in skin diseases. Curr Opin Infect Dis 15, 133–142. Fell J. W., Statzell-Tallman A. (1998): Cryptococcus Vuillemin. In: Kurtzman C. P., Fell J. W. (eds.), The yeasts, a taxonomic study, 4th edn., Elsevier, Amsterdam, 742–763. Fridkin S. K., Jarvis W. R. (1996): Epidemiology of nosocomial fungal infections. Clin Microbiol Rev 9, 499-511. Friedman G. D., Fessel W. J., Udaltsova N. V., Hurley L. B. (2005): Cryptococcosis: the 1981-2000 epidemic. Mycoses 48, 122-125. Gabriel M., Horký D., Svoboda A., Kopecká M. (1998): Cytochalasin D interferes with contractile actin ring and septum formation in Schizosaccharomyces japonicus var. versatilis. Microbiology 144, 2331-2344. Gabriel M., Kopecká M., Yamaguchi M., Svoboda A., Takeo K., Yoshida S., Ohkusu M., Sugita T., Nakase T. (2006): The cytoskeleton in the unique cell reproduction by conidiogenesis of the long-neck yeast Fellomyces (Sterigmatomyces) fuzhouensis. Protoplasma 22, 33-44. Garber G. (2001): An overview of fungal infections. Drugs 61, 1-12. Guillot J., Bond R. (1999): Malassezia pachydermatis: a review. Med Mycol 37, 295–306. Guillot J., Guého E., Prévost M. C. (1995): Ultrastructural features of the dimorphic yeast Malassezia furfur. J Mycol Méd 5, 86–91. Hazen K. C. (1995): New and emerging yeast pathogens. Clin Microb Rev 8, 462–478. Chen T.-A., Hill P. B. (2005): The biology of Malassezia organisms and their ability to induce immune responses and skin disease. Vet Dermatol 16, 4-26. Cheng M.–F., Chiou Ch. C., Liu Y.–Ch., Wang H.–Z., Hsieh K.–S. (2001): Cryptococcus laurentii fungemia in a premature neaonate. J Clin Microbiol 39, 1608–1611. Johnson L. B., Bradley S. F., Kauffman C. A. (1998): Fungemia due to Cryptococcus laurentii and a review of non-neoformans cryptococcaemia. Mycoses 41, 277–280. Kolarova N., Matulová M., Capek P. (1997): Structure of glucomannan-protein from the yeast Cryptococcus laurentii. J Carbohydr Chem 16, 609-623. Kopecká M., Gabriel M., Svoboda A., Takeo K., Yamaguchi M., Hata K., Yoshida S., Ohkusu M. (2001a): Cytoskeleton in human pathogenic yeasts Cryptococcus neoformans and Aureobasidium pullulans and the effect of cytoskeletal inhibitors. Yeast 18, S207. Kopecká M., Gabriel M., Takeo K., Yamaguchi M., Svoboda A., Hata K. (2003): Analysis of microtubules and conidia development of the opportunistic human pathogenic black yeast Aureobasidium pullulans. Microbiology 149, 865 - 876. Kopecká M., Gabriel M., Takeo K., Yamaguchi M., Svoboda A., Ohkusu M., Hata K., Yoshida S. (2001b): Microtubules and actin cytoskeleton in Cryptococcus neoformans compared with ascomycetous budding and fission yeasts. Eur J Cell Biol 80, 303–311. Kreger-van Rij N. J., Veenhuis M. (1970): An electron microscope study of the yeast Pityrosporum ovale. Arch Microbiol 71, 123-131.
were detected at the apex of the growing bud and between neighbouring grooves of plasma membrane. The nucleolus was revealed only at Cryptococcus laurentii. At studied species, the distribution and the dynamics of identified microtubules are similar to those in other basidiomycetous yeasts. In Cryptococcus laurentii cells, all F-actin structures characteristic of yeast cells were observed, but the actin equipment is poorer than that one of Cryptococcus neoformans. In Malassezia pachydermatis cells the demonstrated actin may be associated with unique pattern of the plasma membrane and corresponding inner cell wall surface. The failure of cytoskeletal structures’ detection
in
studied
yeasts
can
be
related
to
their
extracellular
structures.
At Malassezia pachydermatis, the most likely cause is the thick cell wall and at Cryptococcus laurentii it is the capsule.
23
24
Kreger-van Rij N. J., Veenhuis M. (1971): A comparative study of the cell wall structure of basidiomycetous and related yeasts. J Gen Microbiol 68, 87-95. Liu H. (2001): Transcriptional control of dimorphism in Candida albicans. Curr Opin Microbiol 4, 728-735. May K. M., Hyams J. S. (1998): The yeast cytoskeleton: The closer we look, the more we see. Fung Genet Biol 24, 110-122. McLaughlin D. J., Frieders E. M., Lü H. (1995): A microscopist s view of heterobasidiomycete phylogeny. Stud Mycol 38, 91-109. McLaughlin D. J., Hanson R. W., Frieders E. M., Swann E. C., Szabo L. J. (2004): Mitosis in the yeast phase of the basidiomycetes Bensingtonia yuccicola and Stilbum vulgare and its phylogenetic implications. Am J Bot 91, 808-815. Midgley G. (1989): The diversity of Pityrosporum (Malassezia) yeasts in vivo and in vitro. Mycopathologia 106, 143–153. Mitchell T. G., Perfect J. R. (1995): Cryptococcosis in the era of AIDS – 100 years after the discovery of Cryptococcus neoformans. Clin Microbiol Rev 8, 515-548. Mochizuki T., Tanaka S., Watanabe S. (1987): Ultrastructure of the mitotic apparatus in Cryptococcus neoformans. J Med Vet Mycol 25, 223–233. Moore R. T. (1998): Cytology and ultrastructure of yeasts and yeastlike fungi. In: Kurtzman C. P., Fell J. W. (eds.), The yeasts, a taxonomic study, 4th edn., Elsevier, Amsterdam, 33–44. Mulholland J., Preuss D., Moon A., Wong A., Drubin D., Botstein D. (1994): Ultrastructure of the yeast actin cytoskeleton and its association with the plasma membrane. J Cell Biol 125, 381-391. Nishimura K., Asada Y., Tanaka S., Watanabe S. (1991): Ultrastructure of budding process of Malassezia pachydermatis. J Med Vet Mycol 29, 387–393. Pringle J. R. (1991): Staining of bud scars and other cell wall chitin with Calcofluor. Methods Enzymol 194, 732-735. Pruyne D., Bretscher A. (2000): Polarization of cell growth in yeast. II. The role of the cortical actin cytoskeleton. J Cell Sci 113, 571-585. Raclavský V., Novotný R., Šmígová J., Vojkůvka Z. (1999): Nikkomycin Z counteracts Rylux BSU and Congo red inhibition of Saccharomyces cerevisiae growth but does not prevent formation of abberant cell walls. Folia Microbiol 44, 663-668. Rodal A. A., Kozubowski L., Goode B. L., Drubin D. G., Hartwig J. H. (2005): Actin and septin ultrastructures at the budding yeast cell cortex. Mol Biol Cell 16, 372-384. Sakaguchi N., Baba T., Fukuzawa M., Ohno S. (1993): Ultrastructural study of Cryptococcus neoformans by quick-freezing and deep-etching method. Mycopathologia 121, 133-141. Sato M., Toda T. (2004): Reconstruction of microtubules: Entry into interphase. Dev Cell 6, 456-458. Schott D., Huffaker T., Bretscher A. (2002): Microfilaments and microtubules: the news from yeast. Curr Opin Microbiol 5, 564–574. Simmons R. B., Ahearn D. G. (1987): Cell wall ultrastructure and diazonium blue B reaction of Sporopachydermia quercuum, Bullera tsugae and Malassezia spp. Mycologia 79, 38–43. Steenbergen J. N., Casadevall A. (2003): The origin and maintenance of virulence for the human pathogenic fungus Cryptococcus neoformans. Microbes Infect 5, 667-675. Takeo K., Nakai E. (1986): Mode of cell growth of Malassezia (Pityrosporum) as revealed by using plasma membrane configurations as natural markers. Can J Microbiol 32, 389–394. Takeo K., Uesaka I., Nishiura M. (1974): The wall particle of the genus Cryptococcus: Large size and characteristic distribution. J Gen Microbiol 84, 223–225. Takeo K., Uesaka I., Uehira K. Nishiura M. (1973): Fine structure of Cryptococcus neoformans grown in vitro as observed by freeze-etching. J Bacteriol 113, 1442-1448. Winiarczyk S. (1992): The ultrastructure of Pityrosporum pachydermatis. Archivum Veterinarium Polonicum 32, 5–13. Winsor B., Schiebel E. (1997): An overview of the Saccharomyces cerevisiae microtubule and microfilament cytoskeleton. Yeast 13, 399-434. Woyke T., Roberson R. W., Pettit G. R., Winkelmann G., Pettit R. K. (2002): Effect of auristatin PHE on microtubule integrity and nuclear localization in Cryptococcus neoformans. Antimicrob Agents Chemother 46, 3802–3808.
25
9. SEZNAM PRACÍ AUTORA Publikace: David M., Gabriel M., Kopecká M. (2003): Unusual ultrastructural characteristics of the yeast Malassezia pachydermatis. Scripta Medica (Brno) 76, 173-186. David M., Gabriel M., Kopecká M. (2007): Microtubular and actin cytoskeletons and ultrastructural characteristics of the potentially pathogenic basidiomycetous yeast Malassezia pachydermatis. Cell Biol Int 31, 16-23. doi: 10.1016/j.cellbi.2006.09.001. David M., Gabriel M., Kopecká M. Cytoskeletal structures, ultrastructural characteristics and the capsule of the basidiomycetous yeast Cryptococcus laurentii. Antonie van Leeuwenhoek, in press. doi: 10.1007/s10482-006-9131-5.
Abstrakta z konferencí: David M., Gabriel M., Kopecká M. (2002): The study of potentially pathogenic lipophilic yeast Malassezia pachydermatis. In: 30nd annual konference on yeasts; Smolenice; Yeast Commission, Czechoslovak Society for Microbiology; p. 58. David M., Gabriel M., Kopecká M. (2003): The first findings on the microtubule cytoskeleton in Malassezia pachydermatis. In: XI. Cytoskeletální klub Vranovská Ves 23. 4. - 25. 4. 2003; Brno; Biologický ústav LF MU v Brně a Společnost pro buněčnou biologii při Československé biologické společnosti; p. 21. David M., Gabriel M., Kopecká M. (2003): Microtubular structures in two basidiomycetous yeasts Malassezia pachydermatis and Cryptococcus laurentii. In: Memory in living systems; Brno; Masarykova univerzita; p. 50. David M., Gabriel M., Kopecká M. (2004): Mikrotubules and actin structures in the basidiomycetous yeast, Cryptococcus laurentii. In: 32nd annual konference on yeasts; Smolenice; Yeast Commission, Czechoslovak Society for Mikrobiology; p. 39. David M., Gabriel M., Kopecká M. (2005): Cytoskeleton during the cell division cycle of the yeast Cryptococcus laurentii. In: XIII. Cytoskeletální klub, Hotel SKI, Nové Město na Moravě 27. 4. - 29. 4. 2005; p. 26. David M., Gabriel M., Kopecká M. (2006): Actin in Malassezia pachydermatis detected by immunogold labeling for electron microscopy. In: XVI. Cytoskeletální klub Vranovská Ves 17. 5. - 19.5. 2006; p. 20. Ostatní: Uveřejnění fotografie ultrastruktury Malassezia pachydermatis v knize Webster J., Weber R. W. S. (2007): Introduction to Fungi, 3rd edn., Cambridge University Press, Cambridge. (v průběhu letošního roku)
26
