■ KISÁLLAT
Kutyából és macskából izolált Malassezia pachydermatis törzsek in vitro érzékenységi vizsgálata
135. 351–356.
2013/6
Á. Jerzsele – B. Balázs – E. Kálmánfi – Z. Lajos – P. Gálfi – B. Gyetvai: In vitro susceptibility of Malassezia pachydermatis strains isolated from dogs and cats
Jerzsele Ákos1*, Balázs Bence2, Kálmánfi Eszter3, Lajos Zoltán4, Gálfi Péter1, Gyetvai Béla1 1] SZIE-ÁOTK, Gyógyszertani és Méregtani Tanszék. István u. 2. H-1078 Budapest. *E-mail: jerzsele.akos@ aotk.szie.hu 2] REX Állatkórház Kft. 3] V. évfolyamos állatorvostan-hallgató 4] DUO-BAKT Kft.
Összefoglalás. A szerzõk 32, külsõhallójárat-gyulladásban szenvedõ kutya és macska fülébõl izolált Malassezia pachydermatis törzs érzékenységét vizsgálták korongdiffúziós módszerrel flukonazolra, itrakonazolra, ketokonazolra, klotrimazolra, mikonazolra és terbinafinra. A korongdiffúziós módszer során ketokonazolra és terbinafinra minden általuk vizsgált törzs érzékenynek bizonyult. Itrakonazolra 28 érzékeny és 4 mérsékelten érzékeny törzset találtak. Mikonazolra 1 törzset értékeltek érzékenynek, 30-at mérsékelten érzékenynek, és 1-et rezisztensnek. Flukonazol esetén 4 érzékeny, 10 mérsékelten érzékeny és 18 rezisztens törzset találtak. Klotrimazollal szemben 21 törzs bizonyult érzékenynek és 11 mérsékelten érzékenynek. Az eredményekbõl kitûnik, hogy az általuk vizsgált M. pachydermatis törzsek ellen leghatásosabbnak a ketokonazol és a terbinafin bizonyult és ezekkel a hatóanyagokkal szemben egyetlen törzs sem volt rezisztens. Legkevésbé hatásosnak a mikonazolt és a flukonazolt találták. Ezekre a hatóanyagokra több törzs is rezisztens volt és néhány törzs esetében megfigyelték a keresztrezisztencia kialakulását is. Kiemelkedõ jelentõsége, ill. a malasseziák elleni kimagasló hatékonysága miatt a ketokonazol in vitro aktivitását mikrodilúciós módszerrel is vizsgálták 54, külsõhallójáratgyulladás, ill. bõrgyulladás tüneteit mutató kutyából és macskából izolált Malassezia pachydermatis törzs esetében. A CLSI (Clinical Laboratory Standards Institute) irányelvei alapján mikrodilúciós módszerrel végzett érzékenységi vizsgálatok során kapott minimális gátló koncentráció (MIC) értékek szerint az összes vizsgált törzs érzékenynek bizonyult ketokonazolra. Az 54-bõl 34 minta estében ≤0,032 µg/ml-es MIC-értéket mértek, ami megfelelt az általuk használt legnagyobb hígításnak, 18 minta esetén 0,063 µg/ml-es MIC-értéket kaptak, és mindössze 2 minta esetében találtak 0,125 µg/ ml-es MIC-értéket. Summary. The antifungal susceptibility of 32 M. pachydermatis strains isolated from cases of canine and feline otitis externa to fluconazole, clotrimazole, itraconazole, ketoconazole, miconazole and terbinafine was investigated applying the disc diffusion method. All the tested isolates were susceptible to ketoconazole and terbinafine. To itraconazole 28 susceptible and 4 intermediately susceptible strains were found. Miconazole was less active, 1 strain proved to be sensitive, 30 intermediately sensitive and 1 showed resistance. In case of fluconazole 4 strains were classified as susceptible, 10 as intermediate and 18 as resistant. 21 susceptible and 11 intermediately susceptible strains were found to clotrimazole. Based on their results, ketoconazole and terbinafine have been proved to be the most effective drugs against the tested isolates, while miconazole and fluconazole proved to be the least active with several resistant strains. Due to its importance and outstanding effectiveness against Malassezia ssp. the in vitro activity of ketoconazole was tested using a broth microdilution method as well, against 54 M. pachydermatis strains isolated from dogs or cats with otitis externa or dermatitis. Broth microdilution susceptibility testing was carried out and interpreted in accordance with CLSI (Clinical Laboratory Standards Institute) guidelines. Based on
Malassezia pachydermatis gombák gyógyszerérzékenysége
351 122
the CLSI breakpoints, all the M. pachydermatis strains involved in this study could be classified as susceptible, as they all had MICs of ≤0.125 µg/ml. Out of 54 isolates, 34 had a MIC of ≤0.032 µg/ml, 18 produced a MIC of 0.063 µg/ml, and only two strains had a MIC of 0.125 µg/ml.
A normál bõrflóra részét képezõ, az élesztõgombák közé sorolt Malassezia
Az állatorvosi bõrgyógyászatban az élesztõgombák szerepe lényeges
A gombaellenes szerek közül jó hatékonyságúak az azolok és az allilaminok
pachydermatis fõként kutyák, ritkábban macskák bõrén, külsõ hallójáratában elszaporodva okozhat megbetegedéseket, így az állatorvosi bõrgyógyászatban kiemelt a szerepe. Számos megbetegedés, fõként allergiás bõrbetegségek, ectoparasitosisok, hormonális kórképek esetében okoz másodlagos fertõzést. Hazánkban nem áll rendelkezésre naprakész adat, amely átfogóan értékelné ennek az igen fontos kórokozónak az állatorvoslásban leggyakrabban alkalmazott gombaellenes szerekkel szembeni érzékenységét. EICHENBERG és mtsai (5) 82, otitis externában szenvedõ kutyából izolált M. pachydermatis törzset vizsgáltak. Eredményeik alapján az itrakonazol bizonyult a leghatékonyabbnak a kórokozó ellen, 0,007-0,125 µg/ ml-es MIC-értékekkel (minimális gátló koncentráció), erre a hatóanyagra minden vizsgált törzs érzékeny volt. A ketokonazol esetében hasonlóan kis értékeket kaptak (0,015–0,25 µg/ml), 3 törzs bizonyult rezisztensnek a hatóanyagra. Ugyanebben a vizsgálatban a flukonazolt találták a legkevésbé hatékonynak, 1–32 µg/ml-es MICértékekkel. GARAU és mtsai (6) 10 M. pachydermatis törzset vizsgáltak. Ketokonazol esetén a MIC-értékek minden törzsnél ≤0,03 µg/ml alatt voltak, itrakonazol esetén 8 törzsnél találtak 0,03 µg/ml-nél kisebb értéket, flukonazolnál a minimális gátló koncentráció minden törzs esetében 4 µg/ml volt. A CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) irányelveiben meghatározott határértékek alapján, egyik törzs sem bizonyult rezisztensnek egyik vizsgált hatóanyagra sem. BRITO és mtsai (1) M. pachydermatis és több Candida-faj érzékenységét vizsgálták ketokonazolra, itrakonazolra, flukonazolra és amphotericin-B-re. Megfigyelték, hogy míg az M. pachydermatis érzékeny volt az összes vizsgált hatóanyagra (a kapott MIC-értékek ketokonazolra és itrakonazolra kisebbek voltak, mint 0,0075 µg/ml, flukonazol esetén 1–16 µg/ml között voltak), a Candida-törzsek közül sok mutatott rezisztenciát az azolokra. JESUS és mtsai (7) 30 M. pachydermatis törzs érzékenységét vizsgálták flukonazolra, itrakonazolra, ketokonazolra és vorikonazolra, a MIC-értékek rendre 0,01–4 µg/ml, 0,01–1 µg/ml, 0,01–1 µg/ml és 0,01–4 µg/ml voltak. PEANO és mtsai (10) M. pachydermatis törzsek érzékenységét vizsgálták mikonazolra, klotrimazolra és tiabendazolra. Az összes törzs érzékenynek bizonyult a vizsgált hatóanyagokra, az általuk mért MIC-értékek klotrimazol esetében 2–8 µg/ml, mikonazol esetében 1–4 µg/ml, tiabendazol vizsgálatakor 16–32 µg/ml voltak. CAFARCHIA és mtsai (2) 62, kutyából izolált M. pachydermatis törzs érzékenységét vizsgálták, a MICértéktartományok itrakonazolra 0,008–0,016 µg/ml, ketokonazolra 0,008–0,06 µg/ ml, posakonazolra 0,008–0,06 µg/ml, terbinafinra 0,03–0,25 µg/ml, mikonazolra 0,125–2 µg/ml, míg flukonazolra 4–64 µg/ml voltak. Az irodalmi adatok alapján összességében elmondható, hogy az M. pachydermatis törzsek túlnyomó többsége érzékeny az azolok és allilaminok már kis koncentrációjára is. In vitro körülmények között leghatékonyabbnak a ketokonazol és az itrakonazol, míg legkevésbé hatékonynak a flukonazol bizonyult.
Saját vizsgálat Jelen vizsgálat célja az volt, hogy Magyarországon, kutyából és macskából izolált Malassezia pachydermatis törzsek érzékenységét vizsgáljuk különbözõ azolokra és allilaminokra, így flukonazolra, itrakonazolra, ketokonazolra, klotrimazolra, mikonazolra és terbinafinra korongdiffúziós módszerrel. Ezek hazánkban az állatgyógyászatban leggyakrabban alkalmazott gombaellenes szerek, fõként fülcseppek, külsõleges oldatok és samponok hatóanyagai. Kiemelkedõ jelentõsége, ill. az M. pachydermatis elleni kimagasló hatékonysága miatt, a ketokonazol in vitro aktivitását mikrohígításos módszerrel is meghatároztuk. 122 352
Magyar Állatorvosok Lapja 2013. június
Anyag és módszer
M. pachydermatis törzsek érzékenységi vizsgálatát végezték el – ketokonazol, – flukonazol, – itrakonazol, – mikonazol, – klotrimazol, – terbinafin gombaellenes szerekre
32 törzs esetében korongdiffúziós módszert alkalmaztak
Kísérletünkbe 54, külsõhallójárat-gyulladásban, ill. bõrgyulladásban szenvedõ kutyából (48 törzs) és macskából (6 törzs) izolált M. pachydermatis törzset vontunk be, amelyeket a Duo-Bakt Kft. (Budapest, Magyarország) biztosított. A kórkép macskákban igen ritka, ezért csak kevés törzs vizsgálatára kerülhetett sor. Kísérleteink során két módszert alkalmaztunk a törzsek gombaellenes szerekkel szembeni érzékenységének meghatározásához. A korongdiffúziós módszer szemikvantitatív, eredményét számos tényezõ befolyásolja, viszont gyors és viszonylag megbízható eredményt ad, így a klinikai munka során gyakran alkalmazzák. A mikrohígításos módszer kvantitatív, pontos minimális gátló koncentráció (minimum inhibitory concentration–MIC) értékek meghatározását teszi lehetõvé. Utóbbi vizsgálatot az egyik legrégebben és legelterjedtebben használt hatóanyag, a ketokonazol esetében végeztük el. Mindkét kísérletsorozatban ugyanazokat a törzseket vizsgáltuk, de a korongdiffúziós módszer során – a törzsek pusztulása miatt – csak kisebb számú izolátum értékelésére adódott lehetõségünk. A kísérletek tervezésével és az eredmények kiértékelésével kapcsolatban megemlítjük, hogy a CLSI az élesztõgombák vizsgálatára vonatkozó irányelveket (4) a Candida nemzetségre dolgozta ki, azok csak változtatásokkal alkalmazhatók Malassezia-fajokra, azok lipofil tulajdonsága és lassabb növekedése miatt. Korábbi vizsgálatokban megfigyelték, hogy lipideket tartalmazó táptalajon ez a faj jobban tenyészthetõ (5). A Candida-fajoknál javasolt 48 óra inkubálási idõt vizsgálatunkban 72 órára növeltük, ezzel kompenzálva azok lassabb növekedését. Az eredmények kiértékelése szintén akadályokba ütközik, mivel az irányadó ún. breakpoint MICértékek is a Candida-fajokra vonatkoznak. Korongdiffúziós módszer A vizsgálat megkezdése elõtt az izolált törzseket klóramfenikoltartalmú Sabouraudféle dextrózlevesben (Biolab Zrt., Budapest, Magyarország) szaporítottuk el, 72 órán át 37 °C-os termosztátban történõ inkubálással. A szuszpenzió optikai sûrûségét 600 nm-en 0,1-re állítottuk be, amely megfelel 107 telepformáló egység (CFU)/ ml gombasûrûségnek, és 1 MacFarland-os turbiditási standardnak. Ezt követõen húszszoros hígítással 5x105 CFU/ml sûrûségû szuszpenziót készítettünk (10). Korongdiffúziós módszerrel 32, otitis externában szenvedõ kutya fülébõl izolált törzs érzékenységét vizsgáltuk ketokonazolra, flukonazolra, itrakonazolra, mikonazolra, klotrimazolra és terbinafinre. A gombaellenes szereket tartalmazó korongok a Biolab Zrt.-tõl (Budapest, Magyarország) származtak. A vizsgálatban felhasznált törzseket elõször Sabouraud-féle dextrózagaron szaporítottuk el, majd termosztátban inkubáltuk 37 °C-on, 72 órán át. Ezután az élesztõket Sabouraud–klóramfenikol-levesbe oltottuk. Steril fülkében 3 ml levest mértünk a steril kémcsövekbe, majd ezekbe oltottunk telepeket, leégetett fémkaccsal. A beoltott leveseket 37 °C-os termosztátba helyeztük és 72 órán át inkubáltuk, majd homogenizálást követõen, steril szélesztõtamponnal vittünk fel a gombaszuszpenziókból üres Sabouraud–agarlemezekre. Ezután az antimikotikumokat tartalmazó korongok (ketokonazol: 10 µg, itrakonazol: 10 µg, flukonazol: 10 µg, klotrimazol: 10 µg, mikonazol: 10 µg, és terbinafin: 30 µg) kerültek felhelyezésre, steril csipesz segítségével, egymástól kb. egyenlõ távolságra. Az agarlemezeket ezután termosztátba helyeztük és 37 °C-on ismét 72 óráig inkubáltuk. Az inkubációs idõ letelte után a kialakult gátlási gyûrûket milliméterben adtuk meg. A mikrodilúciós módszer A vizsgált 54 törzs esetében a ketokonazolra vonatkozó MIC-értékek meghatározásához (4) kettes alapú hígítási sort készítettünk 96 lyukú, steril tenyésztõedényekben. A vizsgált ketokonazolkoncentrációk 16,0, 8,0, 4,0, 2,0, 1,0, 0,5, 0,25, 0,125, 0,0625 és 0,03125 µg/ml voltak. A pozitív kontrollok csak Sabouraud-levest tartalmaztak az adott élesztõtörzzsel, a negatív kontroll csak Sabouraud-levest, hatóanyagok Malassezia pachydermatis gombák gyógyszerérzékenysége
353 122
Ketokanozol esetében mikrohigításos módszerel állapították meg a gátló koncentrációt
és élesztõgombák nélkül. A törzsek beoltása után a tenyésztõedényeket 37 °C-os termosztátba helyeztük 72 órára. Az inkubációs idõ lejárta után szabad szemmel vizsgáltuk a mintákat. A zavarosodás mértéke szerint megkülönböztettünk negatív és +, ++, +++ pozitív mintákat. Mindhárom utóbbi esetben az élesztõgombák növekedését pozitívnak tekintettük, a gátló koncentrációt a kizárólag teljesen áttetszõ tápoldat esetén állapítottuk meg. Vizsgáltuk a minimális gátló koncentrációt, a MIC50-et, és a MIC90-et. A minimális gátló koncentráció (MIC) az a legkisebb hatóanyag-koncentráció, amely gátolni képes a vizsgált élesztõtörzs növekedését. A MIC50 és MIC90 azok a hatóanyag-koncentrációk, amelyek a vizsgált törzsek 50, ill. 90%-át gátolják a növekedésben. A MIC-értékek ismeretében − a CLSI által Candida-fajokra ajánlott határértékek alapján − határoztuk meg az M. pachydermatis törzsek érzékenységének mértékét. Megkülönböztettünk érzékeny, mérsékelten érzékeny és rezisztens törzseket. Ketokonazol esetében 0,125 µg/ml MIC-értéken vagy ez alatt érzékenynek számított az adott gombatörzs, 0,25 µg/ml MIC-értéken mérsékelten érzékenynek és 0,5 µg/ml MIC-értéken vagy efelett pedig rezisztensnek.
Eredmények Az M. pachydermatis érzékenysége klotrimazolra, flukonazolra, itrakonazolra, ketokonazolra, mikonazolra és terbinafinra korongdiffúziós módszerrel A vizsgált M. pachydermatis törzsek vizsgálatakor tapasztalt gátlási gyûrûk minimum-maximum értéktartományát és átlagát az 1. táblázat tartalmazza. A gátlási gyûrûk átmérõjét a CLSI által megadott határértékek alapján értékeltük, eredményeinket a 2. táblázatban mutatjuk be. A CLSI irányelveiben meghatározottak szerint, topicalis kezelésnél azoloknál és terbinafin esetén hasonló elveket alkalmaztunk. Ha a gátlási gyûrû átmérõje 11 mm vagy kevesebb volt, akkor az adott törzset rezisztens1. táblázat. A vizsgált gombaellenes szereket tartalmazó korongok körül kialakult gátlási gyûrûk átmérõjének nek értékeltük, 12–19 mm-es értéken mérsékelten értéktartománya és átlaga, a vizsgálatba vont Malassezia érzékenynek, míg 20 mm vagy afölötti érték esetén pachydermatis törzsek esetén (n=32) érzékenynek tekintettük. Table 1. Inhibition zone intervals and mean values (in mm) A kapott eredményekbõl jól látszik, hogy a around different antimicotic impregnated discs in case of ketokonazol, ill. a terbinafin tekinthetõek az általunk Malassezia pachydermatis strains (n=32) vizsgált gombaellenes szerek közül a leghatékonyabbHatóanyag Gátlási gyûrûk Gátlási gyûrûk nak Malassezia pachydermatis ellen, míg a flukonazol értéktartománya átlaga (mm) és a mikonazol a legkevésbé hatékonynak. (mm)
Klotrimazol
13–37
24,9±6,0
Flukonazol
0–23
11,9±4,3
Itrakonazol
17–29
23,8±3,1
Ketokonazol
45–67
58,4±6,3
Mikonazol
7–20
15,4±2,6
Terbinafin
45–75
55,1±5,2
Az M. pachydermatis érzékenysége ketokonazolra mikrohígításos módszerrel – minimális gátló koncentrációk A vizsgálatban kapott MIC-értékek szerint az öszszes általunk vizsgált Malassezia pachydermatis törzs érzékenynek bizonyult ketokonazolra (ábra).
2. táblázat. A vizsgálatba vont Malassezia pachydermatis törzseket tartalmazó minták érzékenysége a vizsgált gombaellenes szerekre a CLSI által ajánlott határértékek szerint (n=54) Table 2. Sensitivity of the investigated Malassezia pachydermatis strains to certain antifungals according to CLSI breakpoints (n=54) Érzékenység foka
Hatóanyagra érzékeny minták száma CLT
FLU
ITR
KTZ
MCZ
TRB 32
Érzékeny
21
4
28
32
1
Mérsékelten érzékeny
11
10
4
0
30
0
0
18
0
0
1
0
Rezisztens
CLT=klotrimazol, FLU=flukonazol, ITR=itrakonazol, KTZ=ketokonazol, MCZ=mikonazol, TRB=terbinafin
122 354
Magyar Állatorvosok Lapja 2013. június
Ábra. A ketokonazol minimális gátló koncentrációinak értékei a vizsgált Malassezia pachydermatis törzsek esetében (n=54) A fehér cellák az érzékeny, a világosszürke és a sötétszürke cellák a mérsékelten érzékeny, ill. rezisztens törzsek számát mutatják, a CLSI határértékei alapján Figure. Minimum inhibitory concentration values of ketoconazole in the investigated Malassezia pachydermatis strains (n=54) White cells represent the number of sensitive strains, while light and dark gray cells show the number of moderately sensitive and resistant strains according to CLSI breakpoints Minimális gátló koncentrációk – ketokonazol (µg/ml) 16
8
4
2
1
0.5
0.25
0.125
0.063
≤0,032
0
0
0
0
0
0
0
2
18
34
Malassezia pachydermatis törzsek száma az adott MIC-értéken
A minták 63%-ában (34 db) 0,032 µg/ml-es, ill. annál kisebb MIC-értéket mértünk, és mindössze 2 minta esetében (<4%) találkoztunk a legnagyobb, 0,125 µg/ml MIC-értékkel, amely a CLSI irányelvek alapján még szintén az érzékeny kategóriába tartozik. A kapott MIC-értéktartomány ketokonazolra 0,032–0,125 µg/ml volt. A MIC50-érték ≤0,032 µg/ml-nek, a MIC90 pedig 0,063 µg/ml-nek bizonyult. Az adatokat elemezve megállapíthatjuk, hogy a Malassezia pachydermatis kifejezetten érzékeny volt ketokonazolra, az imidazolra az összes izolátum érzékenynek bizonyult. Nem találtunk jelentõs különbséget a kutyából és macskából izolált törzsek érzékenysége között.
Következtetések
A leghatékonyabb gombaellenes szernek – a ketokanozol, – a terbinafin, – az itrakonazol bizonyult
Legkevésbé a flukonazol volt hatékony
Az általunk kapott eredményekbõl kitûnik, hogy a ketokonazol, a terbinafin és az itrakonazol bizonyultak a leghatásosabb szereknek a vizsgált Malassezia pachydermatis törzsek ellen. Ez összhangban van a nemzetközi irodalmi adatokkal azzal a különbséggel, hogy azok többségében az itrakonazol, (1, 2, 5, 9, 12), a mi vizsgálatunkban a ketokonazol és a terbinafin bizonyult a leghatékonyabbnak. A CLSI-határértékek alapján itrakonazolra 4 mérsékelten érzékeny törzset is találtunk, míg ketokonazol és terbinafin esetén egyet sem. Azokban a tanulmányokban, ahol ezeket a hatóanyagokat együtt vizsgálták, a terbinafin aktivitása elmaradt a ketokonazolétól és az itrakonazolétól (2, 12), míg a mi vizsgálatunkban a terbinafinkorongok körül kialakult gátlási gyûrûk átlaga (55,1 mm) alig volt kisebb a ketokonazolénál (58,4 mm), és lényegesen nagyobb volt az itrakonazolénál (23,8 mm). Legkevésbé hatékony azolnak a flukonazol bizonyult, amelynél az átlagos gátlási zóna átmérõje mindössze 11,9 mm volt. A flukonazol aktivitására vonatkozó eredményünk egyezik az irodalmi adatokkal, miszerint a flukonazol bizonyult a legkevésbé hatásosnak M. pachydermatis ellen (1, 2, 5, 6, 7, 9, 12). Több tanulmányban számoltak be flukonazolrezisztencia kialakulásáról, amely a keresztrezisztencia kialakulása miatt nagyobb MIC-értékeket eredményezett más azolok esetében is (7, 11). Ez saját korongdiffúziós vizsgálatunkban is megmutatkozott egyes törzsek esetén. A flukonazolra rezisztens törzseknél gyakran találtunk az átlagosnál kisebb gátlási gyûrûket, különösen a mikonazoltartalmú korong körül. Vizsgálatunkban mérsékelten hatékonynak bizonyult a klotrimazol és a mikonazol. Eredményeink alapján a klotrimazol jóval hatékonyabbnak bizonyult a mikonazolnál, ezt az általunk vizsgált irodalmi adatok nem támasztották alá. Ez leginkább annak tulajdonítható, hogy kevés releváns tanulmányban vizsgálták egy idõben a két hatóanyagot, ahol pedig ez elõfordult, ott a mikonazol bizonyult hatékonyabbnak (10), átlagosan fele akkora MIC-értékekkel, mint a klotrimazol esetében. Vizsgálatunkban a klotrimazol átlagosan 24,9 mm-es átmérõjû gátlási gyûrût alakított ki, míg a mikonazol csak 15,4 mm-est. Az érzékenységi vizsgálatok eredményeinek összehasonlítása Malassezia-fajok esetén nem könnyû feladat, mert a mai napig nem született egységes vizsgálati és értékelési rendszer, ami megkönnyítené a kutatók munkáját. Malassezia pachydermatis gombák gyógyszerérzékenysége
355 122
A gombák biofilm-képzése a gyógyszerérzékenységet csökkenti
A leggyakrabban alkalmazott CLSI ajánlások az élesztõk közül csak Candida-fajokra vonatkoznak, amelyek malasseziákra csak módosításokkal alkalmazhatóak. A ketokonazol in vitro aktivitását mikrodilúciós módszerrel is vizsgáltuk. Ennek az eredményei már jobb összevethetõséget tettek lehetõvé. Eredményeink szerint az összes általunk vizsgált M. pachydermatis törzs érzékenynek bizonyult ketokonazolra a külföldi tanulmányokban is használt CLSI-határértékek alapján. Az 54 mintából 34 esetén mértünk 0,032 µg/ml-nél kisebb MIC-értéket, ami vizsgálatunkban a legnagyobb hígításnak felelt meg (legkisebb hatóanyag-koncentráció). A minimális gátló koncentráció 28 minta esetében 0,063 µg/ml, 2 minta estében 0,125 µg/ ml volt. Külföldi tanulmányokban mértek ennél nagyobb MIC-értékeket is, de általában nem nagyobbat 0,25 µg/ml-nél (5), és ott, ahol nagyobb hígításokat is használtak, nemritkán kaptak ≤0,0075 µg/ml-es MIC-értéket is (1, 2). Ezzel együtt elmondható, hogy a mikrodilúciós vizsgálatunkban kapott eredményeink összhangban vannak az irodalmi adatokkal. Többen vitatják az in vitro érzékenységi vizsgálatok és a klinikum kapcsolatát amiatt, hogy a gombaellenes hatóanyagokat tartalmazó termékek (fülcseppek, samponok stb.) akár többezerszeres koncentrációban tartalmazhatják az adott hatóanyagot, mint akár a legnagyobb in vitro mért MIC-értékek (10). Felületi kezelések esetén a rendkívül nagy hatóanyag-koncentráció azért is indokolt, mert jelentõs lehet a kimosódási veszteség, bõrön keresztüli felszívódás, fizikai, kémiai inaktiválódás, ami csökkentheti a szer hatékonyságát. Egy másik ok, ami miatt érdemes nagy hatóanyag-koncentrációkat használni, hogy az élesztõgombák, így a Malassezia pachydermatis is képes biofilmképzésre, ami akár 500–2000-szeres érzékenységcsökkenést is okozhat (8, 11). Köszönetnyilvánítás A közleményben ismertetett vizsgálatok a TÁMOP–4.2.2. B–10/1 és a TÁMOP–4.2.1.B–11/2/ KMR-2011-0003 projektek támogatásával készültek.
IRODALOM 1. BRITO, E. H. S. – FRONTENELLE, R. O. S. et al.: Phenotypic characterization and in vitro antifungal sensitivity of Candida ssp. and Malassezia pachydermatis strains from dogs. Vet. J., 2007. 174. 147–153. 2. CAFARCHIA, C. – FIGUEREDO, L. A. et al.: In vitro antifungal susceptibility of Malassezia pachydermatis from dogs with and without skin lesions. Vet. Microbiol., 2012. 155. 395−398. 3. CLSI-guidline M27-A3 – Reference Method for Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeast; Approved Standard. 2008. 4. CLSI-guideline M31-A3 – Performance Standards for Antimicrobial Disc and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated From Animals; Approved Standard. 2009. 5. EICHENBERG, M. L. – APPELT, C. E. et al.: Susceptibility of Malassezia pachydermatis to azole antifungal agents evaluated by a new microdilution broth method. Acta Sci. Vet., 2003. 31. 75−80. 6. GARAU, M. – PEREIRO, M. JR. et al.: In vitro susceptibilities of Malassezia species to a new triazole, albaconazole (UR-9825), and other antifungal compounds. Antimicrob, Agents Chemother., 2003. 47. 2342−2344. 7. JESUS, F. P. K. – LAUTERT, C. et al.: In vitro susceptibility of fluconazole-susceptible and -resistant isolates 122 356
Magyar Állatorvosok Lapja 2013. június
8.
9.
10.
11.
12.
of Malassezia pachydermatis against azoles. Vet. Microbiol., 2011. 152. 161−164. MARTINEZ, L. R. – FRIES, B. C.: Fungal biofilms: Relevance in the setting of human disease. Curr. Fungal Infec. Rep., 2010. 4. 266−275. MIRANDA, K. C. – DE ARAUJO, C. R. et al.: Antifungal activities of azole agents against the Malassezia species. Int. J. Antimicrob. Ag., 2007. 29. 281−284. PEANO, A. – BECCATI, M. et al.: Evaluation of the antifungal susceptibility of Malassezia pachydermatis to clotrimazole, miconazole and thiabendazole using a modified CLSI M27-A3 microdilution method. Vet. Dermatol., 2012. 23. 131−135. ROBSON, D.: Malassezia: mechanisms of possible drug resistance. Dermatology Chapter of the ACVSc Science Week Proceedings, 2007. 63−67. VELEGRAKI, A. – ALEXOPOULOS, E. C. et al.: Use of fatty acid RPMI 1640 media for testing susceptibilities of eight Malassezia species to the new triazole posaconazole and to six established antifungal agents by a modified NCCLS M27-A2 microdilution method and etest. J. Clin. Microbiol., 2004. 42. 3589−3593.
Közlésre érk.: 2013. febr. 19.
