NANOSTŘÍBRO A STUDIUM

MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE

NANOSTŘÍBRO A STUDIUM JEHO VLIVU NA BEZOBRATLÉ ŽIVOČICHY Bakalářská práce

Martin Kunc

Vedoucí práce: Mgr. Monika Dušková, Ph.D.

Brno 2013

Bibliografický záznam Autor:

Martin Kunc Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie

Název práce:

Nanostříbro a studium jeho vlivu na bezobratlé živočichy

Studijní program:

Experimentální biologie

Studijní obor:

Speciální biologie

Vedoucí práce:

Mgr. Monika Dušková, Ph.D.

Akademický rok:

2012/2013

Počet stran:

52

Klíčová slova:

Stříbro, nanočástice, nanostříbro, bezobratlí živočichové, vliv nanočástic stříbra, stříbrné nanočástice.

Bibliographic Entry Author

Martin Kunc Faculty of Science, Masaryk University Department of Experimental Biology

Title of Thesis:

Nanosilver and study of its influence on invertebrates

Degree programme:

Experimental Biology

Field of Study:

Special Biology

Supervisor:

Mgr. Monika Dušková, Ph.D.

Academic Year:

2012/2013

Number of Pages:

52

Keywords:

Silver, nanoparticles, nanosilver, invertebrates, influence of silver nanoparticles, silver nanoparticles.

Abstrakt Nanotechnologie je v poslední době rychle se vyvíjející vědní obor s obrovským potenciálem využití v medicíně, biologických odvětvích, chemickém, stavebním nebo strojírenském průmyslu. Využívá částice o velikosti 1 – 100 nm (1 nm = 10-9 m). V biotechnologickém odvětví se využívají hlavně nanočástice stříbra kvůli jejich antimikrobiálním vlastnostem. Nejrozšířenější směry výroby nanočástic stříbra jsou metody top-down, bottom-up a green synthesis. Top-down postupy jsou rychlé a nezatěžují životní prostředí, ale jsou drahé. Bottom-up metody jsou jednoduché a často používané, ale pracují s nebezpečnými látkami. Takto vytvořené nanočástice obsahují rezidua těchto látek, které brání použití v biologii a medicíně. Metody green synthesis jsou levné, rychlé, jednoduché a nepoužívají nebezpečné látky, což z nich činí v současnosti nejpoužívanější metody pro výrobu nanočástic stříbra. Nanočástice vyrobené různými postupy mají odlišné vlastnosti, proto je důležité vědět, jak byly dané nanočástice vytvořeny. Další část práce se zabývá vlivem nanočástic stříbra na bezobratlé organismy. Tito živočichové představují 97 % všech druhů na Zemi a jejich ohrožení by znamenalo nebezpečí pro celý ekosystém. Popisuje působení nanočástic jak na půdní, tak vodní druhy bezobratlých. Vodní druhy jsou přitom ohroženější kvůli snadnému a rychlému transportu stříbrných nanočástic v tekutém prostředí. Na základě provedené literární rešerše se ukazuje, že tyto dopady jsou většinou nepříznivé. Nanočástice stříbra se mohou usazovat v buňkách, indukovat apoptózu, vytvářet reaktivní kyslíkové metabolity, poškozovat DNA nebo snižovat reprodukční schopnost. Současné studie zkoumají vliv nanočástic na bezobratlé v časovém horizontu asi 1 měsíce. Chybí tedy dlouhodobé studie vlivu nanočástic stříbra na bezobratlé organismy. Srovnání jednotlivých prací je také obtížné, protože každý autor používá nanočástice vyrobené jiným způsobem a tím pádem s odlišnými vlastnostmi.

Abstract Nanotechnology is rapidly evolving science with a great potential for application in medicine, biological industry, chemical, construction and engineering industry. It works with particles of 1 - 100 nm (1 nm = 10-9 m). In the biotechnology sector, mainly silver nanoparticles are used because of their antimicrobial qualities. The most common ways of production of silver nanoparticles are methods of top-down, bottom-up and green synthesis. The top-down processes are fast and saving the environment, but they are expensive. The bottom-up methods are simple and frequently used, but work with hazardous substances. Thus, formed nanoparticles contain residues of these substances that inhibit use in biology and medicine. The green synthesis methods are cheap, quick, simple and do not use dangerous substances, these attributes make these methods the most widely used for the production of silver nanoparticles. Nanoparticles produced by different methods have different qualities therefore it is important to know how the nanoparticles were created. The next part of the thesis deals with the influence of silver nanoparticles to invertebrates. These animals represent 97 % of all species on the Earth and their threat would mean danger for the entire ecosystem. The thesis describes the effect of nanoparticles to both soil and aquatic invertebrate species. Aquatic species are more vulnerable because of easy and rapid transport of silver nanoparticles in the liquid environment. Based on the literature review, it turns that these impacts are usually negative. Silver nanoparticles can accumulate in cells, induce apoptosis, create reactive oxygen species, cause DNA damage and reduce fertility. The current studies explore the influence of nanoparticles on invertebrates in the time frame of about one month. So there are missing the long-term studies of the effects of silver nanoparticles to invertebrates. The comparison of the outcomes is also difficult, because different authors use nanoparticles produced in different way and thus with different qualities.

Poděkování Na tomto místě bych chtěl poděkovat své vedoucí Mgr. Monice Duškové, Ph.D. za pomoc a přínosné rady při vytváření mé bakalářské práce. Dále bych chtěl poděkovat panu RNDr. Pavlu Hyršlovi, Ph.D. za poskytnutí pomoci při hledání zdrojů. Přátelům z oboru experimentální biologie za společné konzultace našich prací. A také svým ostatním přátelům a rodině za trpělivost, podporu a maximální ochotu mi pomoci.

Prohlášení Prohlašuji, že jsem svoji bakalářskou práci vypracoval samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány.

Brno 5. měsíc 2013

……………………………… Jméno Příjmení

Obsah

1.

Úvod .................................................................................................................................... 9

2.

Nanočástice ........................................................................................................................ 9

3.

Stříbro .............................................................................................................................. 10

4.

5.

3.1.

Historie a těžba stříbra ............................................................................................... 10

3.2.

Chemické vlastnosti stříbra ........................................................................................ 11

3.3.

Nanočástice stříbra ..................................................................................................... 11

3.4.

Syntéza nanočástic stříbra .......................................................................................... 12

3.4.1.

Top-down techniky ............................................................................................. 12

3.4.2.

Bottom-up techniky ............................................................................................ 17

3.4.3.

Green synthesis ................................................................................................... 22

3.5.

Antimikrobiální působení nanočástic stříbra ............................................................. 26

3.6.

Negativní působení AgNPs ........................................................................................ 27

Bezobratlí ......................................................................................................................... 29 4.1.

Vývoj bezobratlých .................................................................................................... 29

4.2.

Obecné znaky bezobratlých ....................................................................................... 29

Vliv AgNPs na bezobratlé organismy ............................................................................ 30 5.1.

Vliv na půdní bezobratlé ............................................................................................ 30

5.2.

Vliv na vodní bezobratlé ............................................................................................ 36

6.

Závěr ................................................................................................................................. 41

7.

Seznam zkratek ............................................................................................................... 44

8.

Seznam literatury ............................................................................................................ 45

9.

Seznam URL zdrojů ........................................................................................................ 52

8

1. Úvod Nanočástice jsou významnou strukturou, která v dnešní moderní společnosti hraje důležitou roli. Používají se již ve více než 1000 různých předmětech každodenní potřeby a jejich podíl na trhu stále roste. Odpady z těchto produktů však mohou způsobit závažné problémy v ekosystému, kam se z nich tyto nanočástice dokáží uvolnit. Největší význam mají stříbrné nanočástice, které svými speciálními vlastnostmi pomáhají bojovat proti bakteriálním infekcím. Čím dál častěji se používají jako náhrada za antibiotika, která postupně ztrácejí svoji účinnost. Průběh tvorby těchto částic není příliš složitý proces, ale existuje množství modifikací jejich tvorby. S každou takovou změnou mohou získat nové vlastnosti, což vede k jejich neustálému rozvoji. Jsou zde dynamické podmínky a jejich výzkumu se věnuje spousta skupin po celém světě. Pokouším se zde shrnout jednotlivé metody tvorby těchto částic a ukázat jejich výhody i nevýhody. Velice často je u nanočástic popsán antimikrobiální účinek, i když se stále neví, kde a jak přesně v bakteriálních buňkách působí, aby těchto vlastností dosáhly. V poslední době se objevily i studie, v nichž se zkoumaly jejich antivirové vlastnosti. Já se však věnuji jejich působení na bezobratlé organismy, kde již je situace trochu horší. Vzhledem k jejich velikosti a vlastnostem lehce pronikají i do eukaryotických buněk, ale jejich působení na organismus je stále nejasné. Zjistila se silná schopnost bioakumulace, ale dlouhodobé studie stále chybí. Právě na toto téma bych se zde chtěl zaměřit a shrnout dosavadní poznatky.

2. Nanočástice Nanočástice nejsou novou strukturou, ale provází nás od počátků vesmíru. V poslední době se jim věnuje stále více výzkumů, díky jejich jedinečným vlastnostem. Vyrábějí se dnes ve velkém měřítku a jejich použití je velice rozsáhlé od průmyslu až po nejnovější léčebné postupy (Winchester et al., 2010). Za zakladatele nanotechnologie je nejčastěji považován Richard P. Feynman (1918 – 1988), který nastínil její principy na kongresu American Physical Society v roce 1959 svou přednáškou There's Plenty of Room at the Bottom (Tam dole je spousta místa). Vlastním tvůrcem názvu je Eric Drexler (1955) (Šrámek, 2011). O nanočásticích můžeme mluvit, pokud alespoň jeden rozměr částice nepřesahuje 100 nm. Většinou jsou jako nanočástice uznávány částice v rozměrech 1 – 100 nm. Předpona nano- pochází z řeckého „nanos“ (= trpaslík), ve vědecké terminologii znamená 1 miliardtinu metru tj. 10-9 m. 9

Za funkci nanočástic není zodpovědná pouze jejich velikost, ale také jejich tvar hraje významnou roli. Existují nejrůznější tvary od jednoduchých shluků (klastrů), přes nanotrubičky až po nanofilmy. Jejich použití je už nyní velice rozšířené a je jasné, že se bude díky jejich speciálním vlastnostem i nadále rozšiřovat (Hájková and Šmejkal, 2010).

3. Stříbro 3.1. Historie a těžba stříbra Stříbro bylo lidstvem objeveno již okolo roku 4000 př. n. l. a od té doby prochází celými dějinami často více ceněné než zlato. Stříbro se může v zemské kůře vyskytovat jako ryzí kov, ale častěji se vyskytuje jako součást rud. Nejdůležitější stříbrné rudy jsou argentit Ag2S, jasnorudek As2S3*3Ag2S a temnorudek Sb2S3*Ag2S. Stříbro se také vyskytuje jako součást rud jiných kovů, nejčastěji olova a mědi. Stříbro se z rud dostává odháněním, kdy se do roztavené směsi stříbra s jinými kovy vhání vzduch. Ten oxiduje ostatní kovy, ale stříbro zůstává nedotčeno a tím se dostává na dno taveniny, kde je odsáto jako poslední vrstva po předchozím odtoku horních lehčích vrstev. Získává se tak stříbro s čistotou cca 90 %. To se pak dále přečišťuje. V dnešní době se čím dál více prosazuje elektrolýza (Engels and Nowak, 1977) (Vaněk and Dalibor, 2007). Používání stříbra se datuje již do roku 2500 př. n. l. jako platidlo a šperky. Později si lidé v Římě všimli antimikrobiálních vlastností stříbra a vyráběli z něj nádoby, protože potraviny uložené ve stříbrných nádobách podléhaly později zkáze. Do nádob s vodou se vkládaly stříbrné mince, používaly se stříbrné příbory a všechny nádoby na svěcenou vodu byly stříbrné, aby se zpomalil proces kažení. Mezi válkami se používalo koloidní stříbro k léčbě přenosných chorob, dokud se neobjevila na trhu antibiotika. Toto koloidní stříbro bylo vyráběno pomocí elektrolytických metod ze stříbrných elektrod. Stabilizováno bylo pomocí kyseliny olejové (OA) a pozorováno světelným mikroskopem (URL1). Dále se stříbro používalo a dodnes používá ve formě sulfadiazinové masti na spáleniny a drobné oděrky. Bohužel se stříbro při dlouhodobém používání ukládá v tkáních, a tak se po objevu antibiotik téměř přestalo používat (Chen and Schluesener, 2008). Asi 1/3 vytěženého stříbra se používá pro fotografické účely. Používá se zde jeho sloučenina dusičnan stříbrný AgNO3. Dusičnan reaguje s halogenidem sodným za tvorby halogenidu stříbrného, jímž se potáhne fotografický film. Při dopadu fotonů se halogenid rozpadá a vzniká tak elementární stříbro, které způsobí ztmavnutí. Množství vyloučeného stříbra je přímo úměrné množství dopadajících fotonů (Greenwood and Earnshaw, 1993). 10

V současnosti se znovu začíná stříbro využívat, hlavně ve formě stříbrných nanočástic. Ty se rozšiřují zároveň s rozmachem nanotechnologií. Dostávají se do různých oborů, přičemž největší využití nacházejí v medicínských a kosmetických produktech kvůli jejich antimikrobiálním účinkům.

3.2. Chemické vlastnosti stříbra Chemická značka stříbra je Ag (z latinského argentum, původně z řeckého argos – lesklý, bílý). Stříbro je velice měkký a snadno kujný kov, který vyniká také svou výbornou elektrickou vodivostí. Stříbro má tendenci černat, což je způsobeno jeho velkou afinitou k síře, se kterou tvoří sloučeninu sulfid stříbrný Ag2S (Greenwood and Earnshaw, 1993). Další chemické vlastnosti stříbra jsou uvedené v Tab. 1. Vlastnost

Stříbro

Atomové číslo

47

Atomová hmotnost

107,8682 (±3)

Elektronová konfigurace

[Kr]4d105s1

Elektronegativita

1,9

Teplota tání

961 °C

Teplota varu

2155 °C

Hustota (20°C)/g*cm-3

10,49

Měrný elektrický odpor (20°C)/µΩ*cm

1,59

Tab. 1: Chemické vlastnosti stříbra

3.3. Nanočástice stříbra Díky nanorozměrům a vlastnostem s tím spojenými dochází k expanzi nanočástic stříbra. Velikost v měřítku nanometrů totiž dodává částicím zcela nové fyzikální i chemické vlastnosti. Obrovská rychlost výzkumu a povzbuzující výsledky přicházejí hlavně z medicínského využití nanočástic stříbra (AgNPs). Jejich pole působnosti je však mnohem větší. Používají se v textilním průmyslu, chemickém průmyslu jako různé detergenty či látky na purifikaci vody nebo ve stavebnictví jako antibakteriální nátěry nebo omítky budov pro zajištění zdravějšího prostředí. Vlastnosti AgNPs se neodvíjejí pouze od jejich velikosti, ale také od jejich tvaru. Morfologie těchto částic zahrnuje koule, tyče, dráty, krychle a různé mnohostěny. Díky zmenšení rozměrů se u nanočástic obrovsky zvětšuje povrch v poměru k objemu částice. Vzniká tím tedy velký prostor pro reakci, což právě zajišťuje jejich speciální antimikrobiální 11

vlastnosti, protože větší částice nejsou schopny reagovat stejně jako AgNPs. Navíc se mohou změnou syntetizačních procesů vytvořit částice s různým povrchovým nábojem potažené vrstvou jiného materiálu, nebo se dají vytvořit nanokompozity, kde je spojeno více různých prvků do jednoho materiálu (Chen and Schluesener, 2008; Hájková and Šmejkal, 2010). Všechny tyto možnosti mění vlastnosti stříbrných nanočástic a dále rozšiřují způsoby využití. Nanostříbro tak získává multioborovou působnost a prosazuje se prakticky ve všech odvětvích průmyslu.

3.4. Syntéza nanočástic stříbra S rostoucím využitím nanočástic stříbra vzrůstá i počet metod, kterými se toto stříbro připravuje. Vznikají nové fyzikální, chemické a biochemické technické postupy výroby AgNPs (Amin et al., 2012). Vlastnosti AgNPs jsou ovlivněny hlavně tvarem a velikostí nanočástic, ale důležitým faktorem jsou také podmínky při syntéze. Proto je nutné vědět, jakým způsobem byly použité nanočástice vytvořeny a ne jen jejich rozměr a tvar, aby byla zachována reprodukovatelnost jednotlivých experimentů (Tilaki et al., 2006). Přechází se od elektrolýzy stříbrných solí až po přípravu redukčními činidly jako jsou monosacharidy (Panacek et al., 2006). V současné době se používají dva hlavní způsoby výroby AgNPs. Jsou to: techniky top-down, kdy se fyzikálními postupy vytvářejí stále menší částice z většího celku a bottom-up techniky, kdy se chemickými metodami agregují jednotlivé atomy až na požadovanou velikost, a které momentálně převažují při syntéze AgNPs (Tolaymat et al., 2010).

3.4.1.

Top-down techniky

Tyto techniky syntézy nanočástic jsou založené na fyzikálních procesech, kdy se z větších částic postupně stávají stále menší, až se velikost dostane na rozměr nanometrů. Tyto techniky se využívají v menší míře, ale jsou laboratoře, které preferují tyto způsoby výroby nanočástic (Tolaymat et al., 2010). Typickou top-down cestou je laserová ablace. Při této metodě je možno měnit několik experimentálních proměnných, které se vztahují jen k této metodě např. počet pulzů, výkon laseru nebo velikost laserového paprsku. Také se zde mohou měnit klasické podmínky jako stabilizační činidla a prostředí, ve kterém se experiment odehrává. Každá změna se může projevit odlišnými vlastnostmi výsledných nanočástic stříbra (Brito-Silva et al., 2010). Často se používala laserová ablace ve vakuu nebo v plynném prostředí. Byl tak vytvářen nanoprášek, který se pak dále využíval. Následně se tato metoda rozšířila v tekutém prostředí, protože zde nemusí být používáno složité zařízení pro vytváření vakua. 12

Tento postup má oproti chemickým metodám výhodu v tom, že zde může být použito méně přidaných látek. Vznikají tak čistější nanočástice, a právě tato čistota je výhodou v mnoha praktických využitích. Kvůli potřebě tvorby nanočástic o určitých přesných rozměrech je nutné stále zjišťovat a nově ustanovovat přesné podmínky laserové ablace. Na toto téma probíhá řada experimentů (Tilaki et al., 2006). Antonio M. Brito-Silva připravoval AgNPs v metanolu, acetonu, etylenglykolu, glycerinu, a deionizované vodě. Jako stabilizační činidlo použil poly(vinyl-pyrrolidon) (PVP). Ve vodě k tomuto účelu použil také poly(vinyl-alkohol) (PVA) a citrát sodný. Jako zdroj stříbrných iontů měl 4,71 × 10-2 mol · L-1 dusičnanu stříbrného, a ten užíval ve všech pokusech. Vytvořil roztok ze stabilizačního činidla a tekuté fáze, k ní přidal za stálého míchání stříbrný roztok a nechal 1 hodinu vřít pod refluxem. Stejný postup opakoval pro všechny kombinace. Výsledný roztok přenesl do kyvety a ozařoval jej laserem po dobu 30 minut. Laser měl výkon 0,085 J/puls. Puls byl dlouhý 8 ns, opakoval se s frekvencí 10 Hz a vlnovou délku měl 532 nm. Výsledné AgNPs byly sledovány pomocí TEM a bylo tak zjištěno, že se nejčastěji vyskytují nanočástice kulatého tvaru, ale vyskytoval se i eliptický tvar a tyčinky. Nanočástice, které byly vytvořeny pomocí PVA, zůstaly stabilní 8 dní, zatímco ty které byly vytvořeny pomocí PVP, setrvaly stabilní více než 5 měsíců. Velikost částic byla různá při použití rozdílných roztoků, ale vždy se pohybovala okolo určité střední hodnoty (obr.1) (Brito-Silva et al., 2010).

Obr. 1: Obrázek vytvořený pomocí TEM, kde je vidět velikostní rozmezí vytvořených nanočástic vzniklých z roztoku Metanol/PVP (Brito-Silva et al., 2010). 13

Tilaki připravoval AgNPs pomocí laserové ablace ze stříbrného terče. Ten měl čistotu 99,99 % a byl omyt etanolem a deionizovanou vodou, aby se zbavil organických nečistot. Následně byl vložen do skleněné nádoby a převrstven tekutým prostředím tak, že hladina spočívala 10 mm nad povrchem terče. Jako prostředí byla v tomto experimentu zvolena deionizovaná voda, etanol nebo aceton. Terč byl ručně otáčen a ozařován Nd:YAG laserem o vlnové délce 1064 nm. Pulsy probíhaly po dobu 5 minut v trvání 10 ns a frekvenci 10 Hz. Ihned po skončení ozařování bylo změřeno absorpční spektrum na UV-Vis spektrofotometru. Velikost a tvar částic byl zjištěn pomocí TEM. Při pokusu vznikaly částice nejčastěji kulovité a to ve všech médiích. Jejich průměr se lišil v závislosti na jednotlivém prostředí. V etanolu se pohyboval okolo 22 nm, v deionizované vodě kolem 13 nm a v acetonu okolo 5 nm. Velikost nanočástic je teda závislá na prostředí, ve kterém se AgNPs tvoří. Ve všech případech částice začaly agregovat, nejrychleji v etanolu, kde to způsobovaly dipól-dipól interakce a již po 48 hodinách bylo vše kompletně vysráženo. Pomaleji k tomu docházelo v deionizované vodě, částice se vysrážely až po 2 týdnech. V acetonu byl roztok nanočástic velice stabilní a žádné srážení nebylo pozorováno. Rychlost agregace závisí na polaritě prostředí, přičemž platí, že čím více polární, tím pomaleji dochází k agregaci (Tilaki et al., 2006). Tsuji ve svém experimentu dokázal, že nejen rozdílné prostředí, ve kterém top-down syntéza probíhá, ale také rozdílné vlnové délky použitého laseru mají vliv na velikost nanočástic. Sestavil si aparaturu tak, že do kádinky nalil 5 ml deionizované vody, pak do ní ponořil sítko a na ně vložil stříbrný terč o čistotě 99,99 %. Laserový paprsek byl zaměřen na stříbrný terč pomocí čočky a roztok byl neustále míchán magnetickým míchadlem. Byly použity 3 různé vlnové délky a to: 355 nm, 532 nm a 1064 nm. Stříbrný terč byl vystaven laserovým pulsům po dobu 30 minut a jejich energie byla 0,012 J/puls. Výsledný roztok nanočástic stříbra byl pozorován pomocí TEM a bylo změřeno absorpční spektrum roztoku. Jak je vidět na obr. 2 tak zmenšující se vlnovou délkou vznikají menší nanočástice. Toho se dá využít při potřebě směsi různých velikostí nanočástic, kdy se tato směs nemusí míchat z jednotlivých složek, ale stačí měnit vlnovou délku dopadajícího laseru při výrobě. Jak funguje efekt změny velikosti v závislosti na vlnové délce, vysvětlil Tsuji absorbancí určité energie samotnými nanočásticemi. V kapalném prostředí se pohybují pomaleji než v plynu a zůstávají tak určitý čas nad povrchem terče. Absorbují tady část energie vyzářené laserem a na povrch terče dopadá slabší záření. Lépe absorbují kratší vlnové délky, tudíž schopnost ablace těchto délek je oproti vyšším snížena (Tsuji et al., 2002).

14

Obr. 2: Zobrazení nanočástic pomocí TEM připravených různou vlnovou délkou laseru a jejich velikostní rozsah (Tsuji et al., 2002). Pyatenko se zaměřil na syntézu nanočástic pomocí laserové ablace v čisté vodě. Schematické znázornění jeho aparatury je ukázáno na obr. 3. Použil k tomu Nd:YAG laser, který byl soustředěn přes čočku na stříbrný terč o čistotě 99,99 % a síle 1 mm. Uvnitř aparatury bylo 170 ml čisté vody a terč se pomalu otáčel. Laserové pulsy trvaly 10 ns při frekvenci 10 Hz a maximální energii 0,34 J/puls. Takto byl terč ozařován po dobu 5 minut. Při svém pokusu mohl ovlivňovat velikost dopadajícího paprsku. Okamžitě po ukončení ozařování byla změřena absorbance na UV-Vis spektrofotometru a velikost a tvar byl určen pomocí TEM.

Obr. 3: Schematické znázornění použité aparatury (Pyatenko et al., 2004). 15

Ve výsledku zjistil, že při použití úzkého laserového paprsku (0,6 – 0,7 mm) vznikaly malé kulovité nanočástice s průměrem asi 2 – 5 nm. Ve velmi malé míře se zde vyskytovaly i větší částice, které byly menšími obklopovány. Tento roztok byl stabilní po několik měsíců. Při zvětšení průměru dopadajícího paprsku na asi 1,5 mm se s převahou vyskytovaly nanočástice o velikosti 20 nm a více, zatímco menší byly skoro úplně potlačeny. Tento roztok však byl málo stabilní, protože větší částice tvoří snadněji agregační centra. Během 1 týdne se z roztoku nanočástice vysrážely a vytvořily černou vrstvu na dně (Pyatenko et al., 2004). Alonso ve své práci vytvářel nanočástice stříbra pomocí laserové ablace ve vakuu. Jeho terč měl čistotu 99,99 % a tloušťku 6,5 mm. Použil Nd:YAG laser vlnové délky 355 nm. Délka pulsů byla 10 nm s frekvencí 5 Hz nebo 10 Hz a o energii 0,005 J/puls. Nepoužíval časovou osu, ale rozdělil částice podle počtu pulsů, kterými na ně působil. Vzorky odebíral po 500, 5000, 10000 a 15000 pulsech. Pokus probíhal v prostoru se sníženým tlakem na 1 * 10-5 Torr. Výsledné nanočástice byly pozorovány pomocí TEM. Zjistil, že při 500 pulsech měly částice kulatý tvar o průměru kolem 5 nm. Při větším počtu pulsů se poloměr částic zvětšoval a navíc se měnil i jejich tvar. Po 5000 pulsech měly spíše eliptický tvar, po 10000 pulsech získaly fazolovitý tvar. Dospěl tedy k názoru, že lze kontrolovat tvar a velikost nanočástic pomocí počtu laserových pulsů, kterým budou vystaveny (Alonso et al., 2009). Jako další top-down metody se v menším měřítku používají také ultrafialové záření, laserová litografie nebo ultrazvukové metody. Všechny tyto postupy se používají v malém měřítku pro svou nespecifickou tvorbu nanočástic. Jsou to v dnešní době okrajové metody, ale v budoucnu se možná některé z nich prosadí (Narayanan and Sakthivel, 2010). Ze všech těchto jednotlivých experimentů je vidět snaha o vytváření nanočástic o určitých rozměrech, tvarech a vlastnostech, aby mohly být použity pro specifické účely v jakémkoliv průmyslovém a vědeckém odvětví. Těchto vlastností se dá dosáhnout změnami podmínek v jednotlivých experimentech. Je zde vidět, že se dá změnit mnoho parametrů, od použitých chemických látek přes jednotlivé parametry použitého laseru, až třeba po dobu působení laseru. Tyto techniky se stále rozvíjejí a snaží se dosáhnout perfektního výsledku.

16

3.4.2.

Bottom-up techniky

Jsou to techniky založené hlavně na chemických metodách syntézy nanočástic. Jsou více rozšířené než výše popsané top-down techniky a využívají např. chemické redukce, elektrochemické a fotochemické techniky. Studie prokázaly, že velikost, tvar a vlastnosti závisí hlavně na experimentálních podmínkách, na kinetice reakcí, redukčních činidlech, stabilizačních činidlech a ostatních látkách přidaných do procesu tvorby nanočástic (Sharma et al., 2009). Používají se zde různě silná redukční činidla od těch silných (tetrahydridoboritan) až po ty slabší (citrát sodný). Používání takových chemických látek však s sebou nese i rizika biologického hazardu při úniku, nebo se takto vyrobené částice kvůli reziduím na nich usazených nedají použít v biologických metodách (Panacek et al., 2006). Chou ve svém experimentu používal jako prekurzor nanočástic dusičnan stříbrný (AgNO3). K němu následně přidával poly(vinyl-pyrrolidon) (PVP) nebo poly(vinyl-alkohol) (PVA) jako stabilizační činidlo. Využíval zde 2 M formaldehyd (CH2O), který fungoval jako redukční

činidlo.

Nejprve

zkoumal

efekt

různého

množství

redukčního

činidla

[CH2O]/[AgNO3] = 1 - 120. Ale tyto změny měly jen zanedbatelné účinky. Nakonec používal [CH2O]/[AgNO3] = 4. Tento poměr dokázal zredukovat všechny stříbrné ionty v roztoku. Pokud však používal pouze formaldehyd, trvalo formování nanočástic při pokojové teplotě dlouhou dobu vzhledem k nízkému pH směsi. Proto přidával různé množství alkalického roztoku složeného z NaOH a Na2CO3. Díky tomu se AgNPs zformoval za méně než hodinu. Reakce mezi formaldehydem a stříbrnými ionty je popsána v následujících rovnicích: 2Ag+ + HCHO + 3OH- → 2Ag + HCOO- + 2H2O 2Ag+ + HCHO + OH− → Ag + HCOOH + 1/2H2 Při průběhu reakce nebylo pH konstantní, ale klesalo. Pokud kleslo pod 5 byla reakce extrémně pomalá, a proto se používal alkalický roztok k jeho udržení v optimálních hodnotách. Vznikal zde i druhý extrém, kdy došlo při příliš vysokém pH ke vzniku velké sraženiny, která se usadila na dně, a to i v přítomnosti PVP použitého jako stabilizačního činidla. Na obr. 4 vidíme distribuci velikosti nanočástic v přítomnosti rozdílných koncentrací PVP. Obecně bylo sledováno, že čím více PVP bylo přidáno, tím pomaleji reakce probíhala. Takže PVP není jen dobé stabilizační činidlo, ale může fungovat také jako bariéra při růstu nanočástic. Při srovnání PVP a PVA došel Chou k názoru, že PVP má lepší vlastnosti a delší stabilizační schopnosti než PVA.

17

Obr. 4: Vliv rozdílného podílu PVP v reakční směsi na velikost vytvořených nanočástic při zachování ostatních podmínek konstantních (Chou and Ren, 2000). Při zkoumání pomocí TEM bylo zřejmé, že nanočástice mají kulatý tvar a velikost 5 – 10 nm. Vzhledem k rozměrům se nedá AgNPs oddělit běžnou centrifugací. Bylo to vyřešeno přidáním acetonu minimálně o stejném objemu jako vzorek. Pak se směs centrifugovala a filtrovala. Vzhledem k špatné rozpustnosti PVP v acetonu byly AgNPs ochráněny před aglomerací a následně znovu rozsuspendovány v deionizované vodě. Velikost částic po tomto kroku vzrostla, ale udržela se v rozměru nanometrů, jak je patrno z obr. 5. Takto vzniklé rozdíly ve velikosti nanočástic jsou však častým problémem při nutnosti zachovat jejich přesnou velikost pro pokusy na tuto výrobu navazující. Bohužel nutnost odstranit přebytečné nebezpečné chemikálie je také důležitá vzhledem k použití nanočástic v biologických disciplínách. Proto jsou tyto metody postupně opouštěny a nebezpečné látky se nahrazují látkami biologicky méně škodlivými (Chou and Ren, 2000).

18

Obr. 5: Velikost nanočástic v originálním vzorku (a) a po následném rozsuspendování v deionizované vodě (b) (Chou and Ren, 2000). Wang pro svůj experiment také používá AgNO3 jako prekurzor pro vznik nanočástic. Stabilizační roztok je PVP ve vodném prostředí a jako urychlovač reakce NaOH. Ale jako redukční činidlo využívá glukózu (C6H12O6). Pro pokus si připravil 2 roztoky. Roztok A, kde rozpustil 3,4 g AgNO3 ve 20 ml destilované vody a roztok B, kde rozpustil PVP, glukózu a NaOH v 60 ml destilované vody. Roztok B zahřál na 60 ºC a za stálého míchání přidával po kapkách roztok A. Po přidání celého objemu ještě směs 10 min míchal, pak centrifugací oddělil nanočástice a produkt promyl destilovanou vodou. Vytvořil tak nanočástice s kulatým tvarem a velikostí 20 – 80 nm. Také zjistil vliv pH na tvorbu a následnou stabilitu nanočástic v roztoku. Podle jeho tvrzení je potřeba k tomu, aby nedocházelo k aglomeraci, mít poměr PVP:AgNO3 více než 1,5. Tento poměr zajistí jednotlivé rozptýlení nanočástic stříbra v roztoku. Dále objevil závislost rychlosti přidávání roztoku A na tvorbu AgNPs. Pokud byla příliš vysoká tj. více než 1 kapka za sekundu, nanočástice se netvořily, ale vznikal Ag2O, který zůstával nerozpuštěný ve formě větších částic (Wang et al., 2005). Bonet používal ve svých pokusech AgNO3 jako prekurzor a monohydrát kyseliny tetrachlorzlatité jako redukční činidlo. Stabilizačním činidlem bylo PVP. Výsledek pak pozoroval pomocí TEM a SEM (Obr. 6). Vytvořil tak nanočástice o velikosti přibližně 20 nm a přirozeně sférickém tvaru. Aby získal snímky z elektronové mikroskopie musel dát malou kapku roztoku na uhlíkovou mřížku, nechat odpařit přebytečnou tekutinu, a teprve poté mohl pozorovat tvar a velikost vytvořených nanočástic. Pomocí XPS (rentgenová fotoelektronová spektroskopie) na částicích zjistil přítomnost povlaku tvořeného z etylenglykolu a PVP (Bonet et al., 2000). 19

Obr. 6: Snímek z TEM (a) a SEM (b) nanočástic stříbra o velikosti přibližně 20 nm (Bonet et al., 2000). K metodám bottom-up se také dá přiřadit výroba AgNPs pomocí elektrolýzy. Tento způsob výroby stříbrných nanočástic je nejstarší a v dnešní době spíš ustupuje do pozadí. Některé pracovní skupiny ho ale stále využívají, např. Cheon et al. 2011. Ten používal 2 stříbrné plíšky o čistotě 90 % jako elektrody. Umístil je proti sobě do vzdálenosti 20 mm v elektrolytu. Ten se skládal z kyseliny citronové (C6H8O7), stabilizačního činidla (PVP) a hydrazin monohydrátu (N2H4) v deionizované vodě. Reakční doba byla stále stejná (30 min), ale aby zjistil vliv podmínek při přípravě na výsledné AgNPs měnil napětí (100, 200, 300 V), teplotu (60, 80, 90 °C) a množství hydrazinu (10, 20, 40 mM). Mechanismus vzniku nanočástic a skladba aparatury jsou znázorněny na obr. 7. Je zde vidět, že se z anody uvolňují stříbrné kationty, které putují ke katodě. V roztoku je jim však díky hydrazinu dodán elektron, a tím se mění na atomy stříbra, které agregují. Velikost je pak kontrolována přidáním PVP jako stabilizačního činidla (Cheon et al., 2011).

20

Obr. 7: (a) Schematický diagram vzniku AgNPs pomocí elektrolytických metod. (b) Mechanismus syntézy nanočástic (Cheon et al., 2011). Výsledné AgNPs následně zkoumal pomocí TEM. Jak můžeme vidět na obr. 8 (a) velikost nanočástic klesala od 55 – 31 nm v závislosti na zvyšujícím se napětí 100 – 300 V. Při teplotách elektrolytu 60, 80 a 90 °C byly průměrné velikosti AgNPs 59, 37 a 23 nm (obr. 8 (b)). Zato při změnách koncentrace hydrazinu zůstávala velikost celkem stabilní kolem 35 nm (obr. 8 (c)). Velikost vznikajících AgNPs se tedy dá ovlivňovat teplotou a napětím, ale nikoliv změnou koncentrace hydrazinu (Cheon et al., 2011).

Obr. 8: Velikost AgNPs v závislosti na napětí (a), teplotě (b), a koncentraci hydrazinu (c) (Cheon et al., 2011).

21

Syntézy pomocí metody bottom-up se ve většině prací opakují, pouze se mění jednotlivé podmínky reakce. Používají se různé prekurzory, z nichž nejčastější je dusičnan stříbrný (AgNO3). K nim se přidávají stabilizační činidla, která brání aglomeraci nanočástic a udržují je ve vymezeném intervalu velikosti. Jsou to např. PVP, PVA nebo Daxad 19. Jako poslední složka se přidávají různá redukční činidla. Do reakce se ještě dodávají látky, které optimalizují pH, jehož hodnota je v reakcích důležitá. Následně záleží už jen na pracovnících, jak velké chtějí částice vyrobit. Při tvorbě AgNPs pomocí elektrolýzy se mohou měnit také parametry napětí a teploty. Všechny tyto metody mají chemický základ a používají látky, které mohou být nebezpečné pro životní prostředí. Proto jsou postupně vytlačovány novými možnostmi výroby AgNPs pomocí „eco-friendly“ látek a postupů green synthesis (Khanna and Subbarao, 2003; Gwo et al., 2012; Sondi et al., 2003).

3.4.3.

Green synthesis

Tyto metody se celosvětově prosazují ve stále větším měřítku vzhledem k jejich přívětivosti k životnímu prostředí. Chemické odvětví tak řeší problém zvyšující se kontaminace přírody nebezpečnými odpadními látkami. Postupy založené na green synthesis se prosazují i v tvorbě nanočástic, kde se vědci snaží snižovat toxický vliv výrobních procesů (Kharissova et al., 2013). Toho dosahují hlavně používáním netoxických rozpouštědel, přirozeně se vyskytujících činidel a uzavřených reakčních prostředí, kde nedochází ke styku média s okolním vzduchem. K výrobě se mohou používat i živé organismy jako bakterie, houby nebo rostliny a každý tento systém má vlastní výhody oproti klasickým metodám (Ramamurthy et al., 2013). Metody green synthesis v poslední době převažují nad klasickými chemickými metodami. Je to hlavně díky tomu, že jsou oproti nim levnější a lépe reprodukovatelné, protože se zde nemusejí používat drahé a nebezpečné látky. Spojení green synthesis metod a nanotechnologie vedlo ke vzniku nanobiotechnologie jako hlavního prostředku ke tvorbě nanočástic (Prasad et al., 2013). Philip využil ve svém experimentu výtažky z listů rostliny Murraya Koenigii (Kari list). Použil 9 g listů, které nadrobno nakrájel, smíchal s 200 ml deionizované vody o teplotě 26,85 °C, nechal je po dobu 1 min louhovat a pak extrakt zfiltroval. Takto získaný filtrát použil jako redukční i stabilizační činidlo. 5 ml tohoto extraktu přidal za stálého míchání do 25 ml vodného roztoku AgNO3 a po dobu 2 min pokračoval v míchání. Redukce proběhla při 26,85 °C velice rychle a již po 10 min byla reakce hotová, což se projevilo stabilním zeleno-žlutým zabarvením roztoku. 22

Pokus byl opakován s různým množstvím přidávaného extraktu (10 ml a 15 ml) (Philip et al., 2011). Extrakt z rostliny Murraya Koenigii obsahuje aktivní farmakologické látky jako karbazolové alkaloidy, flavonoidy a polyfenoly. Tyto ve vodě rozpustné ingredience jsou zodpovědné za redukci a následnou efektivní stabilizaci nanočástic (Kesari et al., 2007). Takto vzniklé nanočástice byly zkoumány pomocí TEM a Uv – Vis spektrofotometrie. Všechny měly kulatý tvar a jejich velikost byla různá. Největší byly při přidání pouze 5 ml extraktu, naopak nejmenší okolo 10 nm při přidání 15 ml extraktu. Tento jev si Philip vysvětloval nedostatkem stabilizačních látek obsažených v 5 ml extraktu. Nanočástice tak byly připraveny jednoduchou metodou při použití extraktu z běžně dostupné rostliny a za téměř pokojové teploty (Philip et al., 2011). Dalším příkladem, kdy se při syntéze AgNPs používají rostlinné extrakty, je práce vedoucího laboratoře Tollamadugu z Univerzity Andhra (Visakhapatnam, Indie), který používá hnědou mořskou řasu Cystophora moniliformis. Listy této řasy zbavil všech nečistot a vysušil je při 40 °C po dobu 72 hod. Listy následně rozdrtil a prosel, aby získal jemný prášek. 20 g tohoto prášku rozmíchal v destilované vodě, kterou zahřál na 100 °C, zfiltroval a získaný filtrát skladoval při 4 °C. K 10 ml filtrátu následně přidal roztok AgNO3 tak, aby získal výsledný objem 100 ml. Tento roztok po dobu 30 min vystavoval různým řízeným teplotám a sledoval tvorbu nanočástic. To, že AgNPs vznikly, se projevilo změnou barvy roztoku (Obr. 9.).

Obr. 9: Rozdíl barvy roztoku před a po vzniku nanočástic stříbra (Prasad et al., 2013). Rozmezí teplot, které používal, bylo 65 – 95 °C a jednotlivé vzorky následně zkoumal pomocí SEM. Zjistil, že při teplotách 65 – 75 °C vznikaly pravidelné AgNPs o velikosti 23

50 – 100 nm. Čím však byla teplota vyšší, tím větší částice vznikaly. Při rozmezí 85 – 95 °C měly částice více než 2 µm v průměru. Tuto rychlou a velkou aglomeraci připisoval bouřlivé redukční reakci při vyšších teplotách, a s tím související neschopnosti stabilizačních látek zamezit růstu velikosti částice (Prasad et al., 2013). AgNPs se dají vyrobit i pomocí velice známé bakterie Escherichia Coli, jak dokazuje ve své práci Zaki. Ten si nakultivoval bakterii izolovanou z odpadních vod v Alexandrii na tekutém LB mediu. Takto nakultivované bakterie následně centrifugoval a zjišťoval rozdíly ve schopnosti vytvořit nanočástice mezi použitím media jako celku, buněk prostým supernatantem a peletem, rozsuspendovaným v deionizované vodě. Jako výchozí zdroj stříbrných iontů používal AgNO3. Vzorky byly kontrolovány pomocí UV – Vis spektrofotometru a reakce probíhala různě dlouhou dobu (24 hod – 7 dní). Výsledné nanočástice byly centrifugovány a vysušeny ve vakuové sušičce při 60 °C přes noc. Ve svém výzkumu dále zjistil, že nejvíce nanočástic bylo vytvořeno při použití celého media jako redukční a stabilizační složky (obr. 10). Naopak nejméně AgNPs vzniklo při použití znovu rozsuspendovaných buněk. K největšímu nárustu počtu nanočástic došlo okolo 7 dne inkubace, což si vysvětlil a následně i prakticky prokázal tak, že v tomto období dochází ke zvýšení produkce enzymu nitrátreduktázy zodpovědného za redukci AgNO3. Prokázal to změřením produkce enzymu v jednotlivých fázích pokusu. Vyšlo mu, že zatímco se během prvních 5 dnů držela hladina enzymu okolo 150 jednotek/ml, v průběhu 6. a 7. dne se zvedal až na 600 jednotek/ml. Vytvořil tak nanočástice za pomoci známé a volně dostupné bakterie (Zaki et al., 2012).

Obr. 10: Koncentrace nanočástic obsažených v roztoku při použití buněk prostého supernatantu, media jako celku a rozsuspendovaného peletu (Zaki et al., 2012). 24

Nanočástice však nemusí vznikat jen vně bakteriálních buněk, ale třeba také na jejich povrchu. Tento jev ukazuje práce vytvořená Zhangem, který používá Corynebcterium SH09 izolovanou z půdy v okolí stříbrného dolu Fujian, Čína. Bakterii nechal narůst a následně centrifugoval, výsledný pelet ještě 3x centrifugoval s deionizovanou vodou. Tento pelet následně rozsuspendoval ve vodném roztoku a přidal diamino stříbrný ion ([Ag(NH3)2]+) jako zdroj stříbrných iontů. Vzorky nechal inkubovat ve tmě po různě dlouhou dobu (12 – 96 hod) při teplotě 60 °C. Nejlepších výsledků bylo dosaženo po 96 hodinové inkubaci vzorků, což koreluje s běžnými bottom-up metodami, kde se lepších výsledků dosahuje při delších časových intervalech. Při pozorování pomocí TEM zjistil, že při menším zvětšení jsou vidět na povrchu bakterie shluky AgNPs o velikosti asi 100 nm (obr. 11). Při větším přiblížení však objevil, že tyto shluky sestávají z jednotlivých AgNPs o velikosti přibližně 10 nm (Zhang et al., 2005).

Obr. 11: Obrázek zachycený pomocí TEM. Vidíme buňku bakterie s výraznými shluky AgNPs na povrchu o velikosti přibližně 100 nm (Zhang et al., 2005). Metody „Green synthesis“ jsou v dnešní době nejrychleji se rozvíjející postupy pro tvorbu nanočástic stříbra a nanočástic všech ušlechtilých kovů obecně. Jsou rozšířené hlavně díky snaze vytvářet co nejméně nebezpečných odpadů v chemickém odvětví. Pro tento účel se hodí dokonale, protože pracují jen s přirozeně se vyskytujícími látkami. Také mají výhodu, že

25

jsou oproti klasickým metodám rychlejší a dokonce i levnější vzhledem k volně dostupnému materiálu a zbavení se nutnosti skladovat nebezpečné chemikálie. V tomto odvětví nanobiotechnologie se využívají chemické látky přírodní povahy. Jako rozpouštědlo se používá čistá voda. Redukční látky jsou různé bílkoviny, polysacharidy (glukóza, fruktóza, maltóza), jednotlivé aminokyseliny, aldehydy nebo enzymy. Využívají se i extrakty z různých rostlin, které v sobě obsahují jak redukční, tak stabilizační činidla např. Zea Mays, Vigna Radiata, Cyamopsis Tetragonoloba atd. nebo z hub např. Verticillium sp., Trichothecium sp., Phoma sp.. Také se mohou použít bakterie, a to jak jejich lyzát, tak se mohou AgNPs tvořit na jejich povrchu např. Escherichia Coli, Bacillus Subtilis Plectonema Boryanum atd. Je zde tedy možnost využít velké množství prostředků za málo peněz a to posouvá techniky green synthesis na vrchol zájmu (Prasad et al., 2013; Narayanan and Sakthivel, 2010; Sharma et al., 2009; Panacek et al., 2006; Kharissova et al.).

3.5. Antimikrobiální působení nanočástic stříbra Se vzrůstajícím počtem bakterií, které si vyvinuly rezistenci vůči klasickým antibiotickým prostředkům, vzrůstá i potřeba nových léčiv. Proto se v dnešní době obrací pozornost na alternativní způsoby léčby bakteriálních infekcí, jako je použití nanočástic stříbra. Tyto antimikrobiální účinky však nejsou objevem poslední doby, ale první zmínky o nich se objevují okolo roku 1000 př. n. l., kdy se přidávalo stříbro do vody, aby vydržela déle čerstvá (Rai et al., 2009). Antibakteriální vlastnosti však nemají jen nanočástice, ale také stříbrné ionty. Způsob jejich působení na bakteriální buňky je dlouhodobě zkoumán, ale zatím se dospělo pouze k omezeným znalostem o způsobu, jakým fungují. Mechanismy působení AgNPs jsou prozkoumány ještě méně (Radzig et al., 2013). Při zkoumání těchto vlastností se nejčastěji používají různé bakterie jako Escherichia coli, Bacillus subtilis nebo Staphylococcus epidermidis (Lee and Lee, 2006). Ve většině těchto experimentů se nechávají působit různé koncentrace AgNPs na bakteriální kultury a měří se minimální inhibiční koncentrace (MIC) (Radzig et al., 2013). Přesný mechanismus působení stříbrných iontů a nanočástic stále není jasný, ale byly navrženy různé teorie vysvětlující toto působení. Při použití stříbra se velice často projevují různé strukturální a morfologické změny na buňce, což může vést ke smrti. Také se prověřuje teorie, že když proniknou stříbrné ionty do buňky, proběhne kondensace DNA, a proto dojde ke ztrátě replikační schopnosti, což vede až ke smrti buňky (Feng et al., 2000). Nebo dochází k navázání částic na membránu buňky, která ztrácí svoji semipermeabilní schopnost a buňka odumírá (obr. 12) (Sondi and Salopek-Sondi, 2004). AgNPs také narušují dýchací řetězec 26

a buněčné dělení (Morones et al., 2005), nebo mohou tvořit nadměrné množství nebezpečných kyslíkových radikálů (ROS) (Chairuangkitti et al., 2013). Baktericidní vlastnosti závisí i na velikosti AgNPs a to tak, že čím menší jsou, tím větší baktericidní schopnost mají (Rai et al., 2009).

Obr. 12: Buňka bakterie E Coli a na její membráně navázané AgNPs (Sondi and SalopekSondi, 2004).

3.6. Negativní působení AgNPs Přestože se tradičně tvrdí, že stříbro je netoxický materiál, tak díky svým rozměrům a speciálním vlastnostem stříbro lehce proniká do tkání a buněk organismů (Chen and Schluesener, 2008). Například WHO (světová zdravotnická organizace) omezuje koncentraci stříbrných iontů v pitné vodě na 0,1 mg/l (Pelkonen et al., 2003). K alergickým reakcím na stříbro dochází zřídka, proto je také považováno za netoxický materiál, ale byly provedeny studie, kde se zkoumal vliv nanočástic stříbra např. na buňky myších jater. Po tomto experimentu byla zjištěna abnormální velikost mitochondrií, smršťování a nepravidelný tvar buňky. Také byly provedeny podobné studie pro lidské keratinocyty a fibroblasty s podobnými výsledky. Stále však chybí dlouhodobé studie, které by prokázaly nebo vyvrátily škodlivost pro savce (Rai et al., 2009). Stříbrné ionty a nanočástice mohou procházet krevně-mozkovou bariérou a byl prokázán jejich výskyt v mozkomíšním moku u myší, které byly vystaveny jejich působení. 27

Stříbro

se

hromadí

v myofibrilách,

může

způsobovat

nekrózy

a

díky

svému

antimikrobiálnímu působení může poškozovat střevní mikroflóru. Bohužel i tyto výzkumy jsou ojedinělé a prováděné s velkými koncentracemi AgNPs, proto nevypovídají o dlouhodobém působení nižších dávek. Také se spekuluje, zda AgNPs neovlivňují negativně přirozenou střevní mikroflóru. Ztráta těchto symbiotických bakterií na sliznici střeva může vést k mnoha problémům (Pelkonen et al., 2003). Při dlouhodobém vystavení účinkům stříbrných iontů nebo nanočástic vzniká onemocnění, které se nazývá argyrie. Nemusí být způsobeno pouze nadměrnými dávkami léků, ale také mohou být příčinou vysoké dávky nanočástic stříbra z kontaminovaného prostředí, např. stříbrné doly nebo podniky, kde se stříbro zpracovává. Projevem tohoto onemocnění je výskyt stříbrných granulí v buňkách kůže, různých sliznic, vnitřních orgánech, a dokonce i v nervové tkáni. Stříbro uložené v kůži se projevuje jejím zabarvením do stříbřitošedé barvy (obr. 13). Tento efekt se nejčastěji projevuje na kůži, která je vystavena slunečnímu záření (hlava, krk, ramena), ale je důležitější velikost expozice AgNPs než slunečnímu záření. Zatím nebyly prokázány žádné negativní účinky stříbra uloženého ve vnitřních orgánech, ale studie stále pokračují. Poté, co přestane být organismus vystaven působení AgNPs, zabarvení kůže trochu zesvětlá, ale již nikdy zcela nevymizí. Argyrie má 2 možné formy, a to lokální nebo systémovou. Při systémové je postižen celý organismus, při lokální jen určitá část. Nejčastější lokální formou je oční argyrie. Dochází zde k ukládání stříbrných solí v oku a jeho následnému zabarvení. Jsou tím postiženy všechny části oka kromě sítnice, čočky a sklivce (URL 2, URL 3). Argyrie je sice vzácná nemoc, ale ukazuje, že stříbro může mít negativní vedlejší účinky na organismus. Právě z tohoto důvodu by měly být provedeny dlouhodobé studie zabývající se působením stříbrných nanočástic a iontů na organismus.

Obr. 13: Paul Karason – člověk postižený argyrií. 28

4. Bezobratlí Jsou to nejčastěji se vyskytující živočichové na Zemi. Jsou nesmírně rozmanití a rozšíření, představují přibližně 97 % všech známých živočišných druhů. Byli to první živočichové, kteří se na Zemi objevili a v dnešní době se vyskytují ve všech typech životního prostředí. Taxon je tak obsáhlý proto, že je extrémně parafyletický, řadíme sem živočichy z celkově 27 kmenů od houbovců, žahavců a žebernatek, přes ploštěnky hlístice a členovce až po kroužkovce či měkkýše.

4.1. Vývoj bezobratlých Vývoj bezobratlých není přesně znám. Předchůdci byli pravděpodobně jednobuněční, kteří se postupem evoluce shlukovali a vytvářeli symbiotické vztahy. Dosáhli tak určitého bodu organizace, který byl pro přežití výhodnější, než udržet samostatnost buňky. První bezobratlí měli měkké tělo, které nezkamenělo a tak po sobě zanechali málo fosilních důkazů. Nejstarší doklady o nich jsou nepřímé jako např. zkamenělé stopy pohybu. První opravdové důkazy v podobě zkamenělin se našly z období před asi 600 miliony let, kdy bezobratlí získali tvrdé tělesné schránky (ulity, lastury, atd.), které dobře fosilizují. V období kambria došlo k urychlení evoluce známé jako kambrická exploze. Vyvinuly se zde druhy, které můžeme sledovat do dnešní doby, protože jejich potomci stále žijí.

4.2. Obecné znaky bezobratlých Nejdůležitější znak, který všechny tyto živočichy spojuje je to, že nemají obratle, jak již vyplývá z názvu taxonu. Postrádají tedy páteř a celkově kostní tkáně nebo pravé čelisti. Jejich velká rozmanitost zasahuje až k živočichům, které bychom na první pohled označili jako rostliny. Přes tuto diverzitu jsou bezobratlí založeni na podobném schématu a to hlavně na buněčné úrovni. Existuje zde buněčná segregace, kde buňky tvoří tkáně, orgány a další systémy. Tato buněčná segregace začíná hned po oplození na základě genetické informace. Tyto poznatky však nemohou být zcela generalizovány s ohledem na to, že bezobratlí zahrnují i jednobuněčné organismy. Čím vyššího stupně vývoje organismus dosáhl, tím více se blíží těmto obecným poznatkům. Dalším znakem je, že se u nich objevuje symetrie těla, ať už radiální či bilaterální. Bezobratlí nemají kostní tkáň, ale opornou funkci může zastat skelet, ať už vnější nebo vnitřní. Skelet nemusí být jen z pevných tkání, ale může jej tvořit i např. hydrostatický tlak u některých bezobratlých.

29

I když mají tito živočichové často jednoduchou tělesnou stavbu, jsou velice odolní. O tom svědčí fakt, že dokázali přežít a přizpůsobit se mnoha životním prostředím, kde prosperují až do dnešní doby (Kotpal, 2012; Sharma, 2005; Lal, 2009; Gunn, 2009; Kozloff, 1990; Pechenik, 1996).

5. Vliv AgNPs na bezobratlé organismy Nejistota ohledně možných negativních důsledků uměle vytvořených stříbrných nanočástic na životní prostředí vedla ke spuštění mnoha výzkumů na toto téma. Nanočástice se mohou uvolňovat do okolí během používání, nebo když předmět skončí na skládce. Mohou pronikat do půdy, vodních zdrojů i do ovzduší. Nejvíce experimentů se provádí ve vodném prostředí, protože zde dochází velice snadno k expozici nanočásticím. Důležité jsou však i výzkumy prováděné v ostatních prostředích (Lapied et al., 2010; Fabrega et al., 2011; Tourinho et al., 2012). Studovat tyto částice na bezobratlých má zásadní význam s přihlédnutím k tomu, že bezobratlí tvoří 97 % všech známých druhů. Pokud by tedy byli postiženi negativními důsledky vlivem AgNPs, znamenalo by to obrovský zásah do ekosystému naší planety.

5.1. Vliv na půdní bezobratlé Lapied ve své práci použil druh Lumbricus terrestris (žížala obecná) jakožto velice důležitého živočicha v půdním prostředí. Používal 2 roztoky AgNPs, kde jeden obsahoval nanočástice o velikosti přibližně 20 nm (roztok 1) a druhý obsahoval nanočástice o velikosti přibližně 9 nm (roztok 2). Experiment byl rozdělen do 3 částí a v každé části byli použiti jedinci L. terrestris dříve nevystaveni pesticidům z farmy Norwegian University of Life Sciences [Norway]. Při prvním pokusu použil vodné prostředí s různou koncentrací nanočástic. Používal odděleně roztok 1 a roztok 2 a pokus probíhal po dobu 24 hod. Každé použité koncentraci vystavil 5 žížal a z nich pak vybral zástupce na analýzu. Druhý pokus byl založen na podání stříbra v krmivu, kdy používal jako krmivo koňský hnůj. Ten byl smíchán s roztoky stříbra o různé koncentraci. Potravu podával týdně a vzorky sbíral po 2, 4 a 8 týdnech od zahájení experimentu. Třetí pokus trval 4 týdny a tentokrát byla různou koncentrací stříbra napuštěna zemina, ve které byly žížaly chovány. Na konci každého experimentu byly všechny vybrané žížaly fixovány 5 % formaldehydem. V každém experimentu byla sledována mortalita. U všech

30

vybraných žížal byla následně zkoumána apoptóza buněk, a to jak mikroskopickými, tak imunologickými metodami. Při počítání mortality vyšlo najevo, že pokud byly vystaveny nanočásticím v potravě nebo půdě, tak všechny žížaly přežily až do konce experimentu. Ale při vystavení ve vodě byla mortalita 50 % pro roztok 1 při koncentraci 100 mg/l. Při nižších koncentracích (1 mg/l a 10 mg/l) všechny žížaly přežily. Při použití roztoku 2 byla mortalita 80 % při koncentraci 20 mg/l a 40 % při 10 mg/l. Při sledování apoptózy zjistil, že při vystavení ve vodním prostředí byla apoptóza zvýšena při nejvyšších koncentracích nanočástic (20 mg/l roztok 2, 100 mg/l roztok 1), a to na hodnotu asi 33,2 buněk/mm2. Jinak byla apoptóza velice vyrovnaná a blízko kontrolnímu vzorku asi 2,5 buněk/mm2. Při vystavení potravou se hodnota apoptózy statisticky významně nezvýšila. Když zkoumal přímou expozici v prostředí, byla hodnota apoptózy mírně zvýšená asi na 9,57 buněk/mm2 při nejvyšší koncentraci (Lapied et al., 2010). Lim ve své práci použil jako modelového živočicha Caenorhabditis elegans (háďátko obecné). Háďátka rostla na Petriho miskách při 20 °C po dobu 3 dnů. Jako potravu použil OP50 Escherichia coli. Zkoumal hlavně vliv ROS jakožto nejčastějšího toxického mechanismu způsobeného AgNPs. Háďátka byla inkubována s roztokem AgNPs (20 – 30 nm) o koncentraci 1 mg/l po dobu 1, 4, 24 hodin. Následně byly přeneseny do roztoku, který obsahoval 30 µM 2, 7 dichlórfluorescein diacetátu (DCFH-DA), jenž působí jako detektor reaktivních kyslíkových metabolitů (ROS). Háďátka pak pozoroval pomocí fluorescenčního mikroskopu, aby zjistil hodnotu ROS. Ve výsledku zaznamenal zvýšení výskytu ROS v těle háďátka a zároveň s tím zjistil i zmenšenou reprodukční schopnost (obr. 14). Zvýšení ROS se projevilo ve všech inkubačních časech, ale nejmarkantnější bylo po 24 hodinové inkubaci (Lim et al., 2012). a

b

Obr. 14: Foto z fluorescenčního mikroskopu po 24 hodinové inkubaci kontrolní skupina (a) a inkubovaný vzorek (b) (Lim et al., 2012). 31

Shoults-Wilson se ve své práci snaží zjistit, jaká koncentrace nanočástic má nepříznivý vliv na růst, reprodukci a mortalitu Eisenia fetida (žížala hnojní). Aby dosáhl výsledku, který je dostatečně vypovídající, použil reprodukční test toxicity standardizovaný podle Organizace pro hospodářskou spolupráci a rozvoj (OECD). Používal AgNPs o velikosti 30 – 50 nm stabilizované pomocí PVP nebo OA. Koncentrace, které zvolil, byly 10, 100 a 1000 mg/kg suché zeminy. Do takto připravené zeminy vložil 10 pokusných žížal. Pokus probíhal v místnosti o teplotě 20 °C a s 12 hod světla, aby napodobil střídání dne a noci. Doba expozice byla 28 dní a na konci každého týdne sledoval mortalitu. Po skončení byly žížaly vytaženy, očištěny a ponechány na Petriho misce o dobu 24 hodin, aby se jim vyprázdnily střeva a následně byly usmrceny. Při zkoumání růstu a mortality pozoroval, že téměř všichni jedinci přežili a nebyly zde ani rozdíly v růstu ve srovnání s kontrolním vzorkem. Žádná z koncentrací AgNPs nijak nevybočovala z průměru daného kontrolou. Docházelo k ukládání AgNPs do tkání, kde platilo, že čím menší částice, tím lépe do tkání pronikaly. Nebyl zde rozdíl mezi AgNPs stabilizovanými pomocí PVP nebo OA. V celém experimentu pozoroval pouze snížení reprodukční schopnosti při koncentraci 1000 mg/kg AgNPs (PVP i OA) oproti kontrole. Neprokázal tedy toxicitu AgNPs v uvedených koncentracích na Eisenia fetida. Pozoroval pouze mírnou bioakumulaci částic ve tkáních a sníženou schopnost reprodukce (ShoultsWilson et al., 2011). Heckmann využil také Eisenia fetida jako pokusného živočicha k testu toxicity AgNPs podle OECD. K tomuto účelu použil nanočástice o velikosti 30 – 50 nm, tuto velikost stabilizoval pomocí PVP. Připravil si pouze jednu koncentraci AgNPs, a to 1000 mg/kg suchého substrátu. V tomto substrátu kultivoval deset dospělých jedinců Eisenia fetida. Experiment probíhal po dobu 28 dní a při teplotě 20 °C. Střídal zde osvětlení a tmu po 12 hodinách podle předpisu OECD. Při pozorování počtu přežívajících jedinců dospěl k podobnému závěru jako ShoultsWilson. Přežívalo zde 97,5 ± 2,5 % jedinců. Na rozdíl od Shoults-Wilson však nepozoroval jen snížení schopnosti reprodukce, ale její totální potlačení. Po konci experimentu totiž v substrátu nenašel ani jeden kokon nebo juvenilního jedince. V svém experimentu nesledoval bioakumulaci částic, tudíž toto srovnání chybí (Heckmann et al., 2011). Kim použil ve svém pokusu Caenorhabditis elegans (háďátko obecné). Tyto háďátka choval na růstovém mediu pro nematoda (NGM) a jako potravu jim dodával OP50 E. coli. Velikost použitých AgNPs bylo 40 - 70 nm. Háďátka byla vystavena působení AgNPs na

32

NGM. Po dobu 24 a 48 hodin. Pro test přežití použil koncentrace 0, 10, 50, 100, 500 a 1000 mg/l a pro test reprodukce 0, 1, 5, 10, 50 a 100 mg/l.

Obr. 15: Bílými šipkami označené nekrózy při koncentraci AgNPs 100 mg/l (Kim et al., 2012). Při použití koncentrace 100 mg/l v testu přežití dosáhl LC50. Při zvyšování koncentrace AgNPs však nedocházelo ke zvyšování počtu odumřelých jedinců. V testu reprodukce dosáhl EC50 při koncentraci 10 mg/l. Ale ani tady se při zvyšování koncentrace neprojevily zvýšené důsledky. Háďátka, která prošla testem, ještě dále pozoroval pomocí SEM. Zde odhalil nekrózy na jejich tělech při koncentraci AgNPs 100 mg/l (obr. 15) (Kim et al., 2012). Klasický modelový organismus Drosophila melanogaster se objevila v práci Armstronga. Ty získal z Drosophila Stock Center v Bloomington, Indiana. Armstrong na nich zkoumal hlavně vliv AgNPs na aktivitu tyrosinasy a vliv na životaschopnost. Používal nanočástice stabilizované pomocí citrátu na velikost 25,2 ± 9,3 nm. Nanočástice jim podával alimentární cestou v koncentraci 125 mg/kg suché stravy při pokojové teplotě. Nejvíce těchto částic zkonzumovaly larvy, jakožto nejvíce se krmící stadium ve vývoji Drosophily. Pro vyhodnocení aktivity tyrosinasy vytvořil lyzát z 88 mg Drosophil. Z tohoto lyzátu udržovaného při teplotě 37 °C vytvořil roztok, u kterého pak měřil změnu absorbance při vlnové délce 505 nm každých 15 sekund po dobu 5 minut. Při pozorování výsledků zjistil, že všichni jedinci, kteří byli vystaveni působení AgNPs, ztratili melaninový pigment. Jelikož syntéza melaninu je závislá na aktivitě 33

tyrosinasy bylo vidět na první pohled, že byla její aktivita narušena. Jak je vidět na obr. 16 její aktivita klesla při použití koncentrace 50 mg/l téměř o polovinu. Při pozorování životaschopnosti nebyly rozdíly v mediánové délce života kontroly a vzorku. Ale velký rozdíl byl pozorován při schopnosti reprodukce. Drosophily ovlivněné AgNPs dokázaly naklást jen minimum vajíček při srovnání s kontrolními jedinci (Armstrong et al., 2013).

Obr. 16: Srovnání aktivity tyrosinasy v kontrolním vzorku se vzorkem ovlivněným AgNPs (Armstrong et al., 2013). Cong ve své práci použil jako modelový organismus Nereis diversicolor. Tyto dospělce s obvyklou velikostí 5 – 7 cm sesbíral v průběhu zimy 2009 (0 – 4 °C) a jara 2010 (4 – 6 °C) v Rosklide Fjord, Dánsko. Po přenesení do laboratoře je umístil do sedimentu, který sesbíral na stejném místě. Tento materiál byl lyofilizován při -50 °C přes noc, promyt a přefiltrován, aby se odstranily nežádoucí organismy. V laboratoři sesbírané jedince aklimatizoval na teplotu 15 °C a v průběhu experimentu je krmil potravou bez přidaných umělých prvků. Používal zde AgNPs, které byly menší než 100 nm a stabilizované byly v PVP. Tyto nanočástice byly obsaženy v substrátu v různých koncentracích 1 – 50 µg/g sedimentu. Na vzorcích, které byly vystaveny působení těchto částic, pak prováděl comet assay, kde studoval poškození DNA. Tuto metodu použil na coelomocyty. Jako druhý faktor sledoval bioakumulaci AgNPs ve tkáních. To studoval pomocí GFAAS (Graphite Furnace Atomic Absorption Spectrometry) spektrofotometrie.

34

Po 10 dnech inkubace našel v sedimentu 3 mrtvé jedince. Nebyla zde žádná spojitost s koncentrací použitých AgNPs. Pomocí GFAAS spektrofotometru odhalil, že s rostoucí koncentrací nanočástic, které byl jedinec vystaven, roste množství těchto částic uložených v tělních tkáních jedince. Při zkoumání poškození DNA byl objeven stejný trend, kde při nejvyšší koncentraci (50 µg/g) došlo k největšímu poškození (obr. 17). Došel tedy k podobným výsledkům jako další studie zaměřené na toto téma. Na otázku, jak k tomuto poškození dochází, však nedokázal jednoznačně odpovědět. Naznačil zde mechanismy, kdy jsou za poškození odpovědné samotné AgNPs, ale také navrhl, že poškození mohou způsobit ionty z těchto nanočástic uvolněné (Cong et al., 2011).

Obr. 17: Výsledek metody comet assay, kde vidíme kontrolní vzorek (A) s nepoškozenou DNA pak vzorky vystaveny zvyšující se koncentraci AgNPs (B – F), kde se zvyšuje úroveň poškození DNA a pozitivní kontrolu (G), kde inicioval poškození DNA pomocí UV světla (Cong et al., 2011). Srovnání jednotlivých experimentů je velice těžké, protože každý autor použil různé modelové organismy a metody. Někdy dokonce došli autoři používající stejný experimentální design k rozdílným výsledkům. Tyto rozdíly mohou vznikat kvůli použití AgNPs vyrobených různou metodou, ale pro tuto hypotézu zatím nejsou zpracované experimenty, aby ji potvrdily nebo vyvrátily. Z výsledků je ale i přes tento handicap vidět, že se u všech modelových organismů projevila nějaká poškození (např. nekrózy tkání, ztráta pigmentu či zhoršená schopnost reprodukce) nebo alespoň bioakumulace v různém stupni. Bohužel všechny pokusy jsou dělané pouze krátkodobě, kdy čas trvání pokusu a tedy i vystavení živočicha působení AgNPs je nejčastěji kolem 1 měsíce. V literatuře nejsou

35

zpracovány experimenty, které by prováděly dlouhodobou studii dopadu těchto nanočástic na organismus. Stále tak chybí k poznání celkového dopadu na půdní bezobratlé živočichy.

5.2. Vliv na vodní bezobratlé Jelikož velké množství odpadních vod, které mohou obsahovat i stříbrné nanočástice často končí v přirozených vodních tocích, je zde velmi vysoké riziko, že budou působit toxicky na organismy, které zde žijí (Canesi et al., 2012). Tyto možné úniky do přírody a její následná kontaminace vedly dokonce k zapsání stříbra do listiny znečišťujících látek americké EPA (Environmental Protection Agency). Jelikož se nanočástice ve vodním prostředí lépe přenášejí a vytváří zde homogenní substanci, jsou nebezpečnější než v půdním prostředí. Navíc podvodní život je obecně více citlivý na znečištění. Pokud přihlédneme k faktu, že se za rok vyrobí přibližně 500 t AgNPs, může zde jít o vážný problém. Studie zaměřené na vodní prostředí stále probíhají, ale chybí pokusy osvětlující dlouhodobé působení těchto částic. Ve vodním prostředí dochází k silnějšímu vlivu vystavení nanočásticím, protože jsou rozpuštěny v okolním prostředí, ale také přijímány alimentární cestou. Navíc ve vodě dochází k relativně rychlému odmytí stabilizačního prostředku, což má za následek aglomeraci částic a jejich usazování na dně. Tyto sedimentační vrstvy na sebe mohou vázat jednobuněčné organismy a ničit je. Experimenty jsou prováděné na relativně velkém množství životních forem, ale vzhledem k rozmanitosti mořského života, kde končí většina znečišťujících látek, je snaha obsáhnout zástupce všech tříd velice problematická. Navíc se stále velice slabými vědomostmi, kde všude vlastně mohou AgNPs působit, je těžké naplánovat správný design experimentů (Fabrega et al., 2011; Canesi et al., 2012; Matranga and Corsi, 2012) Bianchini ve své práci používá hned několik modelových bezobratlých organismů. Konktrétně krevety druhu Penaeus duorarum, ostnokožce (mořský ježek) Diadema antillarum a mořského plže Aplysia californica. Všichni tito živočichové byli aklimatizováni ve 100 l trvale provzdušňované a denně měněné vody získávané ze zálivu Biscayne Bay, která byla udržována při teplotě 20 ºC. Takto aklimatizovaní živočichové byli vystaveni působení stříbra z prostředí v koncentraci 1 µgAg/l a 10 µgAg/l po dobu 48 hodin. Po této expozici byli živočichové naočkování radioaktivně značenou látkou PEG (polyetylen glykol). Hodinu po naočkování měřili permeabilitu celého těla pro PEG, přičemž jako 100 % schopnost permeability vzali střední hodnoty výsledků z kontrolní skupiny. Také měřil aktivitu ATPasy a přenos Na+ a K+ iontů v jednotlivých tkáních živočichů.

36

Jak se ukázalo, tak expozice neměla prakticky žádný vliv na permeabilitu těla u mořského plže a ostnokožce, u něhož byla permeabilita dokonce i lehce zvýšena. Naopak těžký dopad měla na krevety, kdy se při dávce 10 µgAg/l snížila permeabilita až o 60 %. Schopnost přenosu Na+ a K+ iontů a aktivita ATPasy výrazně poklesla ve všech sledovaných tkáních (žábra, hepatopankreas, gonády, vajíčka), pouze ve svalovině ostnokožce byl pozorován nárust této aktivity. Tento vliv je pro mořské živočichy nebezpečný, protože způsobuje selhání ionoregulace a tím schopnosti vylučovat soli získané z mořské vody. Toto selhání může končit i smrtí živočicha (Bianchini et al., 2005). Gomes se ve své práci snaží zjistit, zda AgNPs působí genotoxicky u Mytilus galloprovincialis. Tyto mušle sesbíral na jihu Portugalska. Nechal je v laboratoři 7 dní aklimatizovat a následně je umístil do 25 l vody, která obsahovala 10 µg/l stříbrných nanočástic. Tento roztok byl každých 12 hodin obnovován kvůli agregaci AgNPs. Mušle byly vystaveny působení AgNPs po dobu 15 dní. Ke stanovení poškození DNA pomocí comet assay byly sbírány vzorky hemolymfy po 0, 3, 7 a 15 dnech. Po vyhodnocení se ukázalo, že je DNA opravdu poškozována. Toto poškození bylo sledováno hlavně na koncových částech DNA. Rozsah poškození rostl s dobou, po kterou byly mušle působení AgNPs vystaveny. Ve výsledcích se toto poškození projevilo vznikem tzv. ocasu komety (obr. 18) (Gomes et al., 2013).

Obr. 18: Srovnání výsledků comet assay kdy vlevo je vidět vzorek získaný z kontrolní skupiny a vpravo vzorek vystavený působení AgNPs u něhož vznikl jednoznačně viditelný ocas značící poškození DNA (Gomes et al., 2013). 37

Griffitt ve své práci používá nanoprášek o velikost částic 20 – 30 nm. Snaží se zjistit LC50 pro Daphnia pulex a Daphnia rerio. Oba druhy byly vystaveny nanočásticím stříbra po dobu 48 hodin a střídalo se osvětlení 14 hodin světla/10 hodin tmy. V průběhu experimentu nebyli pokusní jedinci krmeni. Používal 5 jedinců pro každou koncentraci, kterou testoval. Ve výsledku mu vyšlo, že LC50 pro D. pulex bylo 0,04 mg/l a pro D. rerio 7,2 mg/l. Z výsledků je tedy vidět velice rozdílná vnímavost jednotlivých druhů. Kvůli provázanosti ekosystému mohou být nebezpečné dávky mnohem menší než 1 mg/l, protože už tak malé dávky dokáží ohrozit některé druhy, což může vést k řetězové reakci. Po skončení experimentu ještě testoval vodu, v níž pokus probíhal, aby zjistil, jak velké množství AgNPs zůstalo v roztoku rozpuštěno. Po provedení měření zjistil, že ve vodě zbylo méně než 10 % rozpuštěného nanostříbra. Z toho plyne, že zbytek musel být absorbován živočichy (Griffitt et al., 2008). Asghari používal ve svém pokusu stříbrný nanoprášek, ze kterého si vytvořil zásobní roztok o koncentraci 400 mg/l. Střední velikost nanočástic obsažených v tomto roztoku byla 20 nm. Jako modelový organismus si vybral Zástupce Daphnia magna. Experiment provedl podle návodu číslo 202 poskytnutému od OECD. Pokus probíhal 48 hodin a médium, v němž byli jedinci vystaveni působení nanostříbra, bylo po 24 hodinách vyměněno. Byla zde konstantní teplota 20 ± 2 ºC a 16 hodin světla/8 hodin tmy. Během experimentu nebyli jedinci krmeni a po jeho skončení zkoumal mortalitu a imobilizaci živočichů. Při experimentu došlo k poměrně malé mortalitě a to přibližně 5 %. Ze svého experimentu Asghari vypočítal EC50 pro AgNPs 0,187 mg/l. Také hledal, jaká koncentrace způsobí 100 % mortalitu a došel k výsledku 0,275 mg/l. Imobilizace a nějaký druh abnormálního plavání se projevil u 26,3 – 31 % zkoumaných jedinců. Tyto abnormality se neprojevovaly v závislosti na zvyšování koncentrace AgNPs v prostředí. Vyskytovaly se hlavně BOT (mainly at the bottom) a SUR (mainly at the surface) abnormality. Po provedení experimentu byli někteří jedinci zkoumáni pomocí světelného mikroskopu. Pomocí toho zjistil, že se nanočástice ukládaly v organismu a projevily se jako tmavší místa. Zvlášť tmavě se ukázal celý trávicí systém (obr. 19). Část nanočástic stříbra se ale uložila i na vnější straně organismu a to hlavně na anténách. Ve své práci také okrajově zkoumal vliv stříbrných iontů a zjistil, že působí toxičtěji už při mnohem nižších koncentracích než tomu je v případě AgNPs (Asghari et al., 2012).

38

Obr. 19: Tmavé skvrny a tmavé zbarvení trávicího systému způsobené ukládání AgNPs ve tkáních (Asghari et al., 2012). Buffet si vybral jako modelový organismus mlže Scrobicularia plana, kterého vystavoval působení nanočástic o velikosti 40 – 45 nm. Mlže sesbíral na západním pobřeží Francie a v laboratoři je nechal po dobu 48 hodin aklimatizovat. K expozici AgNPs docházelo z vodního prostředí, kdy použil roztok o koncentraci 10 µg/l, který měnil každý den. Pokus trval 14 dní a probíhal při 20 ºC a v temném prostředí. Mlži během těchto 14 dní nedostávali potravu. Jako druhou metodu zvolil expozici nanostříbrem skrz potravu. K tomuto účelu používal řasy, které pěstoval v odděleném mediu. Na tyto řasy následně nanesl gel, který sloužil jako transportní prostředek pro AgNPs. Nanočástice, které byly na gelu navázány se tak dostaly až do trávicího systému mlžů. Experiment také probíhal po dobu 14 dnů a řasy byly přidávány do nádrže s mlži každý den. Po skončení experimentů zkoumal úroveň akumulace stříbra ve tkáních. Zjistil, že se nanočástice stříbra ukládaly ve všech tkáních mlžů. Při vystavení nanostříbru v prostředí získal hodnoty akumulace 753 ± 467 ng/g. Ale při vystavení nanočásticím z potravy prakticky k žádné akumulaci nedošlo. Sledoval také změny chování jednotlivých živočichů. Ale v této oblasti nezaznamenal statisticky významné rozdíly v porovnání s kontrolou. Sledoval i některé biochemické vlastnosti, ale ani tady nepozoroval významné odchylky od kontroly. Došel tedy k závěru, že nedošlo k podstatnému ovlivnění viability mlžů (Buffet et al., 2013). 39

Prakash používal larvy hmyzu Chironomus riparius získané z Korea Institute of Toxicology (Daejeon, Korea). Tyto larvy vystavil působení nanočástic stříbra v koncentraci 0,5, 1, 2 a 4 mg/l v nádobě po dobu 24 hodin. Takto simuloval akutní vystavení nanočásticím stříbra. Pro zkoumání dlouhodobého působení použil koncentrace 0,2, 0,5 a 1 mg/l a pokus probíhal po dobu 25 dní. U těchto jedinců také zkoumal poškození DNA pomocí comet assay. Jelikož za dobu experimentu larvy dospěly, byly výsledky získávány z adultních jedinců. Pokoušel se zjistit mortalitu, jenže při akutní expozici žádný jedinec neuhynul a stejně tak ani při chronické. Během dlouhodobého působení však zjistil, že klesl počet jedinců, kteří se zakulili o 64 % při koncentraci 1 mg/l. Navíc dospělosti dosáhlo pokaždé více samičích jedinců než samčích. Nanostříbro také ovlivnilo reprodukční schopnost, protože zaznamenal pokles počtu vajíček oproti kontrole. Při použití comet assay zjistil, že došlo k poškození DNA (obr. 20). Při sledování předem vybraných genových sekvencí objevil různou aktivaci jednotlivých genů. Došlo i k úplné inaktivaci některých genů nebo naopak aktivaci ve skupině vystavené účinkům nanostříbra. K těmto odlišnostem nedocházelo jen v jaderné DNA, ale projevily se i v mitochondriální DNA (Nair et al., 2011).

Obr. 20: Výsledky comet assay kdy vidíme zdravou DNA (A) a DNA poškozenou působením nanočástic stříbra (B) (Nair et al., 2011). Každý autor používá různé modelové organismy vodních bezobratlých živočichů. Od těch nejjednodušších až po mnohem složitější a AgNPs mají také na jednotlivé živočichy rozdílné účinky. Někdy zde figurují i organismy, u kterých probíhá ve vodním prostředí jen larvální vývoj. Ale pokud jsou larvy ovlivněné, přenáší se tyto vedlejší efekty i na dospělé živočichy, kteří už nemusí být následně tomuto působení vystaveni. Převládá snaha autorů o věrné napodobení přirozených podmínek, kde nejčastěji dochází k expozici z prostředí. Proto ve svých pokusech zkoumají právě tento způsob, ale 40

existují i studie, které se zaměřují na alimentární cestu příjmu AgNPs do organismu. Jsou zde patrné rozdíly mezi těmito metodami a to někdy i velmi výrazné. Nejvíce je zkoumána akumulace nanočástic stříbra uvnitř organismů a jejich působení na DNA. Také se zkoumají vlivy na reprodukční schopnosti jako u suchozemských bezobratlých. Naneštěstí studie nejčastěji ukazují negativní působení nanočástic stříbra na živočichy, ale existují zde nějaké výjimky. Někteří autoři potvrdili akumulaci nanočástic uvnitř živočichů, ale následně nezjistili negativní působení tohoto jevu na samotný organismus. Pro potvrzení toho zjištění je však stále třeba udělat řadu výzkumů, ale to je potřeba i pro získání dalších důkazů a vědomostí o negativním působení. Stejně jako u suchozemských bezobratlých se zde opakuje problém s krátkodobými experimenty a velkou rozmanitostí vodních bezobratlých živočichů, jakož i s nanočásticemi vyrobenými různými postupy. Je tedy nutno posílit snahu o sjednocení experimentů, jako se snaží např. OECD.

6. Závěr Nanočástice stříbra se používají stále častěji, a to nejen v biologii nebo medicíně, ale také např. ve stavebnictví (antibakteriální fasády domů). Rozšiřují se do předmětů každodenní potřeby jako např. textilie, deodoranty, detergenty atd. Podle amerického úřadu pro kontrolu nanočástic stříbra je na trhu už více jak 1000 produktů, které je obsahují. V České republice nejsou preparáty s obsahem stříbra schváleny pro lékařské použití. Nanočástice stříbra se však dají pořídit v prodejnách zdravé výživy a po konzultaci s lékařem je může člověk používat a například firma Hartmann nabízí Atrauman® Ag, což je krycí tyl s obsahem stříbra. Více výrobků s obsahem nanostříbra lze nalézt na stránkách http://www.nanostribro.cz/, a to kosmetiku, textil nebo prací prášky. Tato práce shrnuje postupy používané k syntéze nanočástic stříbra. Popisuje různé možnosti použití metod top-down. To jsou méně rozšířené postupy, ale mají výhodu rychlé výroby přesných a čistých nanočástic. Jejich nevýhoda je cena, kdy jsou potřeba nákladná zařízení (laser, vakuová komora…). Následná produkce je však již velice jednoduchá a efektivní. Dále popisuje metody bottom-up, které jsou levnější a mnohem více rozšířené. Bohužel se při nich pracuje s nebezpečnými chemikáliemi, ke kterým je potřeba přistupovat velmi opatrně. Takto vniklé AgNPs jsou levnější, ale nejsou tak přesné kvůli nutnosti odmýt rezidua nebezpečných látek z jejich povrchu, aby mohly být použité v biologických a lékařských postupech. Proto se nejčastěji používají metody Green synthesis, které jsou 41

založené na stejném principu jako metody bottom-up, ale pracují s mnohem bezpečnějšími látkami pro organismy i prostředí. Nevyžadují skladování nebezpečných látek a využívají se pro syntézu AgNPs i úplně obyčejné rostliny, houby nebo bakterie. Jsou to tedy levné, nenáročné, ekologicky nezávadné a elegantní metody. Proto se ve výrobě nanočástic prosazují nejvíce z již zmiňovaných postupů. Okrajově se práce zabývá i problematikou antibakteriálních účinků nanočástic stříbra. Popisuje multifaktoriální působení AgNPs na bakteriální buňku a mikrobicidní schopnosti i při relativně nízkých koncentracích. Faktem však je, že se stále zkoumají přesné mechanismy tohoto účinku a panuje nejednotnost názorů ve vědecké obci. Ani negativní působení na člověka není uspokojivě osvětleno. Velice dobře je známá nemoc argyrie, která postihuje jedince vystavené nadměrnému používání AgNPs, ale také je zde nezanedbatelný baktericidní účinek na prospěšnou střevní mikroflóru. Na molekulární úrovni se také objevují nežádoucí vlastnosti AgNPs, ale stejně jako u antimikrobiálních vlastností nejsou zcela známy a spolehlivě vysvětleny všechny tyto vedlejší účinky. Druhá část práce se zabývá hlavně vlivem AgNPs na bezobratlé organismy. Ti jsou vzhledem ke své druhové rozmanitosti a rozšíření ve všech ekosystémech dobrou cílovou skupinou. Jejich rozdělení je těžké, a proto byl zvolen nepřesný způsob rozdělení na vodní a suchozemské bezobratlé. Pro účel shrnout dosavadní poznatky k tomuto tématu je však tento způsob dostatečný. Nejtěžší je srovnání samotných metod autorů, protože každý používá jinak vyrobené nanočástice a ty mohou mít odlišné účinky. Suchozemští bezobratlí mají výhodu v tom, že se stříbro tímto prostředím nešíří tak dobře. Proto jsou znečištěné jen určité oblasti, kterým se mohou bezobratlí vyhnout. Pokud už však byli vystaveni působení účinkům AgNPs, tak se u nich projevily většinou negativní dopady. Často se zjistilo, že stříbro nemá až tak špatné účinky na současnou populaci, ale silně negativně ovlivňuje rozmnožování. Ve smyslu pozitivních účinků se dají prezentovat povětšinou jen práce, kde k žádnému působení nanočástic stříbra nedošlo. Existují zde však rozdíly mezi jednotlivými autory, i když používají stejné metody. U vodních bezobratlých probíhá výzkumů více, protože ve vodním prostředí se nanostříbro snáze šíří a je více kontaminováno vzhledem k tomu, že velké množství odpadních vod stále končí v řekách a mořích. Těžko se srovnávají jednotlivé práce, ať už kvůli použitým AgNPs, tak kvůli rozmanitosti druhů. Na každý jednotlivý druh má totiž stříbro odlišné účinky. Bohužel opět se ukazují spíše negativní dopady na organismy, a to častěji, protože jsou nanostříbru neustále vystaveni v prostředí. Prováděné výzkumy jsou

42

většinou jen krátkodobé a chybí tak studie dopadu, při dlouhodobé expozici nanočásticím stříbra to platí jak pro vodní tak suchozemské bezobratlé. Obecně se tedy dá shrnout, že vlastnosti nanočástic jsou závislé na metodě jejich výroby a vznikají tak nanočástice, které mohou mít stejnou velikost ale rozdílné vlastnosti. Mají dobré antibakteriální schopnosti, i když se stále neví, jak přesně působí. Ale bohužel mají převážně špatný vliv na bezobratlé organismy, které s ním přicházejí do styku.

43

7. Seznam zkratek AgNPs

nanočástice stříbra

BOT

mainly at the bottom abnormalita plavání

DCFH-DA

2, 7 dichlórfluorescein diacetát

EC50

efektivní koncentrace

EPA

Environmental Protection Agency

GFAAS

Graphite Furnace Atomic Absorption Spectrometry

LC50

letální koncentrace

LB medium

lysogeny broth medium

MIC

minimální inhibiční koncentrace

Nd:YAG laser

neodym:yttrium aluminium granát laser

NGM

růstové medium pro nematoda

OA

kyselina olejová

OECD

organizace pro hospodářskou spolupráci a rozvoj

OP50

kmen bakterie E. Coli

PEG

polyetylen glykol

PVA

poly(vinyl-alkohol)

PVP

poly(vinyl-pyrrolidon)

ROS

reaktivní kyslíkové metabolity

SEM

skenovací elektronová mikroskopie

SH09

kmen Corynebacterium

SOD

super oxid dismutasa

SUR

mainly at the surface abnormalita plavání

TEM

transmisní elektronová mikroskopie

UV

ultrafialové světlo

UV-Vis

ultrafialovo-viditelná spektrofotometrie

WHO

světová zdravotnická organizace

XPS

rentgenová fotoelektronová spektroskopie

44

8. Seznam literatury ALONSO, J. C., R. DIAMANT, P. CASTILLO, M. C. ACOSTA–GARCÍA, N. BATINA, and E. HARO-PONIATOWSKI. 2009. Thin films of silver nanoparticles deposited in vacuum by pulsed laser ablation using a YAG:Nd laser. Applied Surface Science. 255:4933-4937.

AMIN, M., F. ANWAR, M. R. JANJUA, M. A. IQBAL, and U. RASHID. 2012. Green Synthesis of Silver Nanoparticles through Reduction with Solanum xanthocarpum L. Berry Extract: Characterization, Antimicrobial and Urease Inhibitory Activities against Helicobacter pylori. Int J Mol Sci. 13:9923-41.

ARMSTRONG, N., M. RAMAMOORTHY, D. LYON, K. JONES, and A. DUTTAROY. 2013. Mechanism of Silver Nanoparticles Action on Insect Pigmentation Reveals Intervention of Copper Homeostasis. Plos One. 8:9.

ASGHARI, S., S. A. JOHARI, J. H. LEE, Y. S. KIM, Y. B. JEON, H. J. CHOI, M. C. MOON, and I. J. YU. 2012. Toxicity of various silver nanoparticles compared to silver ions in Daphnia magna. Journal of Nanobiotechnology. 10:11.

BIANCHINI, A., R. C. PLAYLE, C. M. WOOD, and P. J. WALSH. 2005. Mechanism of acute silver toxicity in marine invertebrates. Aquatic Toxicology. 72:67-82.

BONET, F., K. TEKAIA-ELHSISSEN, and K. V. SARATHY. 2000. Study of interaction of ethylene glycol/PVP phase on noble metal powders prepared by polyol process. Bulletin of Materials Science. 23:165-168.

BRITO-SILVA, A., L. GOMEZ, C.

DE

ARAUJO, and A. GALEMBECK. 2010. Laser Ablated

Silver Nanoparticles with Nearly the Same Size in Different Carrier Media. Journal of Nanomaterials.

BUFFET, P.-E., J.-F. PAN, L. POIRIER, C. AMIARD-TRIQUET, J.-C. AMIARD, P. GAUDIN, C. R.-D. FAVERNEY, M. GUIBBOLINI, D. GILLILAND, E. VALSAMI-JONES, and C. MOUNEYRAC. 2013. Biochemical and behavioural responses of the endobenthic bivalve Scrobicularia plana to silver nanoparticles in seawater and microalgal food. Ecotoxicology and Environmental Safety. 89:117-124. 45

CANESI, L., C. CIACCI, R. FABBRI, A. MARCOMINI, G. POJANA, and G. GALLO. 2012. Bivalve molluscs as a unique target group for nanoparticle toxicity. Marine Environmental Research. 76:16-21.

CHAIRUANGKITTI, P., S. LAWANPRASERT, S. ROYTRAKUL, S. AUEVIRIYAVIT, D. PHUMMIRATCH, K. KULTHONG, P. CHANVORACHOTE, and R. MANIRATANACHOTE. 2013. Silver nanoparticles induce toxicity in A549 cells via ROS-dependent and ROS-independent pathways. Toxicology in Vitro. 27:330-338.

CHEN, X., and H. J. SCHLUESENER. 2008. Nanosilver: A nanoproduct in medical application. Toxicology Letters. 176:1-12.

CHEON, J. M., J. H. LEE, Y. SONG, and J. KIM. 2011. Synthesis of Ag nanoparticles using an electrolysis method and application to inkjet printing. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 389:175-179.

CHOU, K. S., and C. Y. REN. 2000. Synthesis of nanosized silver particles by chemical reduction method. Materials Chemistry and Physics. 64:241-246.

CONG, Y., G. T. BANTA, H. SELCK, D. BERHANU, E. VALSAMI-JONES, and V. E. FORBES. 2011. Toxic effects and bioaccumulation of nano-, micron- and ionic-Ag in the polychaete, Nereis diversicolor. Aquatic Toxicology. 105:403-411. ENGELS, S., and A. NOWAK. 1977. Chemické prvky: Historie a současnost. SNTL.

FABREGA, J., S. N. LUOMA, C. R. TYLER, T. S. GALLOWAY, and J. R. LEAD. 2011. Silver nanoparticles: Behaviour and effects in the aquatic environment. Environment International. 37:517-531.

FENG, Q. L., J. WU, G. Q. CHEN, F. Z. CUI, T. N. KIM, and J. O. KIM. 2000. A mechanistic study of the antibacterial effect of silver ions on Escherichia coli and Staphylococcus aureus. Journal of Biomedical Materials Research. 52:662-668.

46

GOMES, T., O. ARAÚJO, R. PEREIRA, A. C. ALMEIDA, A. CRAVO, and M. J. BEBIANNO. 2013. Genotoxicity of copper oxide and silver nanoparticles in the mussel Mytilus galloprovincialis. Marine Environmental Research. 84:51-59. GREENWOOD, N. N., and A. EARNSHAW. 1993. Chemie prvků: Svazek 2. Informatorium.

GRIFFITT, R. J., J. LUO, J. GAO, J. C. BONZONGO, and D. S. BARBER. 2008. Effects of particle composition and species on toxicity of metallic nanomaterials in aquatic organisms. Environmental Toxicology and Chemistry. 27:1972-1978.

GUNN, A. 2009. Essential Forensic Biology. John Wiley & Sons.

GWO, S., M. H. LIN, C. L. HE, H. Y. CHEN, and T. TERANISHI. 2012. Bottom-Up Assembly of Colloidal Gold and Silver Nanostructures for Designable Plasmonic Structures and Metamaterials. Langmuir. 28:8902-8908.

HECKMANN, L. H., M. B. HOVGAARD, D. S. SUTHERLAND, H. AUTRUP, F. BESENBACHER, and J. J. SCOTT-FORDSMAND. 2011. Limit-test toxicity screening of selected inorganic nanoparticles to the earthworm Eisenia fetida. Ecotoxicology. 20:226-233. HÁJKOVÁ, Z., and P. ŠMEJKAL. 2010. Nanotechnologie pro život, p. 52.

KESARI, A. N., S. KESARI, S. K. SINGH, R. K. GUPTA, and G. WATAL. 2007. Studies on the glycemic and lipidemic effect of Murraya koenigii in experimental animals. Journal of Ethnopharmacology. 112:305-311.

KHANNA, P. K., and V. SUBBARAO. 2003. Nanosized silver powder via reduction of silver nitrate by sodium formaldehydesulfoxylate in acidic pH medium. Materials Letters. 57:22422245.

KHARISSOVA, O. V., H. V. R. DIAS, B. I. KHARISOV, B. O. PÉREZ, and V. M. J. PÉREZ. The greener synthesis of nanoparticles. Trends in Biotechnology. —. 2013. The greener synthesis of nanoparticles. Trends in Biotechnology.

47

KIM, S. W., S. H. NAM, and Y. J. AN. 2012. Interaction of Silver Nanoparticles with Biological Surfaces of Caenorhabditis elegans. Ecotoxicology and Environmental Safety. 77:64-70.

KOTPAL, R. L. 2012. Modern Text Book of Zoology: Invertebrates. Rastogi Publications.

KOZLOFF, E. N. 1990. Invertebrates. Saunders College Pub.

LAL, S. S. 2009. Practical Zoology: Invertebrate. Rastogi Publications.

LAPIED, E., E. MOUDILOU, J. M. EXBRAYAT, D. H. OUGHTON, and E. J. JONER. 2010. Silver nanoparticle exposure causes apoptotic response in the earthworm Lumbricus terrestris (Oligochaeta). Nanomedicine. 5:975-984.

LEE, Y. H., and B. U. LEE. 2006. Inactivation of airborne E-coli and B-subtilis bioaerosols utilizing thermal energy. Journal of Microbiology and Biotechnology. 16:1684-1689.

LIM, D., J. Y. ROH, H. J. EOM, J. Y. CHOI, J. HYUN, and J. CHOI. 2012. Oxidative stressrelated PMK-1 P38 MAPK activation as a mechanism for toxicity of silver nanoparticles to reproduction in the nematode Caenorhabditis elegans. Environmental Toxicology and Chemistry. 31:585-592.

MATRANGA, V., and I. CORSI. 2012. Toxic effects of engineered nanoparticles in the marine environment: Model organisms and molecular approaches. Marine Environmental Research. 76:32-40.

MORONES, J. R., J. L. ELECHIGUERRA, A. CAMACHO, K. HOLT, J. B. KOURI, J. T. RAMIREZ, and M. J. YACAMAN. 2005. The bactericidal effect of silver nanoparticles. Nanotechnology. 16:2346-2353.

NAIR, P. M. G., S. Y. PARK, S.-W. LEE, and J. CHOI. 2011. Differential expression of ribosomal protein gene, gonadotrophin releasing hormone gene and Balbiani ring protein gene in silver nanoparticles exposed Chironomus riparius. Aquatic Toxicology. 101:31-37.

48

NARAYANAN, K. B., and N. SAKTHIVEL. 2010. Biological synthesis of metal nanoparticles by microbes. Advances in Colloid and Interface Science. 156:1-13.

PANACEK, A., L. KVITEK, R. PRUCEK, M. KOLAR, R. VECEROVA, N. PIZUROVA, V. K. SHARMA, T. NEVECNA, and R. ZBORIL. 2006. Silver colloid nanoparticles: Synthesis, characterization, and their antibacterial activity. Journal of Physical Chemistry B. 110:1624816253.

PECHENIK, J. A. 1996. Biology of Invertebrates. Wm. C. Brown Pub.

PELKONEN, K. H. O., H. HEINONEN-TANSKI, and O. O. P. HÄNNINEN. 2003. Accumulation of silver from drinking water into cerebellum and musculus soleus in mice. Toxicology. 186:151-157.

PHILIP, D., C. UNNI, S. A. AROMAL, and V. K. VIDHU. 2011. Murraya Koenigii leaf-assisted rapid green synthesis of silver and gold nanoparticles. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 78:899-904.

PRASAD, T., V. S. R. KAMBALA, and R. NAIDU. 2013. Phyconanotechnology: synthesis of silver nanoparticles using brown marine algae Cystophora moniliformis and their characterisation. Journal of Applied Phycology. 25:177-182.

PYATENKO, A., K. SHIMOKAWA, M. YAMAGUCHI, O. NISHIMURA, and M. SUZUKI. 2004. Synthesis of silver nanoparticles by laser ablation in pure water. Applied Physics a-Materials Science & Processing. 79:803-806.

RADZIG, M. A., V. A. NADTOCHENKO, O. A. KOKSHAROVA, J. KIWI, V. A. LIPASOVA, and I. A. KHMEL. 2013. Antibacterial effects of silver nanoparticles on gram-negative bacteria: Influence on the growth and biofilms formation, mechanisms of action. Colloids and Surfaces B-Biointerfaces. 102:300-306.

RAI, M., A. YADAV, and A. GADE. 2009. Silver nanoparticles as a new generation of antimicrobials. Biotechnology Advances. 27:76-83.

49

RAMAMURTHY, C., M. PADMA, I. D. M. SAMADANAM, R. MAREESWARAN, A. SUYAVARAN, M. S. KUMAR, K. PREMKUMAR, and C. THIRUNAVUKKARASU. 2013. The extra cellular synthesis of gold and silver nanoparticles and their free radical scavenging and antibacterial properties. Colloids and Surfaces B-Biointerfaces. 102:808-815.

SHARMA, N. S. 2005. Continuity And Evolution Of Animals. International Scientific Publishing Academy.

SHARMA, V. K., R. A. YNGARD, and Y. LIN. 2009. Silver nanoparticles: Green synthesis and their antimicrobial activities. Advances in Colloid and Interface Science. 145:83-96.

SHOULTS-WILSON, W. A., B. C. REINSCH, O. V. TSYUSKO, P. M. BERTSCH, G. V. LOWRY, and J. M. UNRINE. 2011. Effect of silver nanoparticle surface coating on bioaccumulation and reproductive toxicity in earthworms (Eisenia fetida). Nanotoxicology. 5:432-44.

SONDI, I., D. V. GOIA, and E. MATIJEVIC. 2003. Preparation of highly concentrated stable dispersions of uniform silver nanoparticles. Journal of Colloid and Interface Science. 260:7581.

SONDI, I., and B. SALOPEK-SONDI. 2004. Silver nanoparticles as antimicrobial agent: a case study on E. coli as a model for Gram-negative bacteria. Journal of Colloid and Interface Science. 275:177-182.

TILAKI, R., A. ZAD, and S. MAHDAVI. 2006. Stability, size and optical properties of silver nanoparticles prepared by laser ablation in different carrier media. Applied Physics aMaterials Science & Processing. 84:215-219.

TOLAYMAT, T. M., A. M. EL BADAWY, A. GENAIDY, K. G. SCHECKEL, T. P. LUXTON, and M. SUIDAN. 2010. An evidence-based environmental perspective of manufactured silver nanoparticle in syntheses and applications: A systematic review and critical appraisal of peerreviewed scientific papers. Science of the Total Environment. 408:999-1006.

50

TOURINHO, P. S., C. A. M.

VAN

GESTEL, S. LOFTS, C. SVENDSEN, A. SOARES, and S.

LOUREIRO. 2012. Metal-based nanoparticles in soil: Fate, behavior, and effects on soil invertebrates. Environmental Toxicology and Chemistry. 31:1679-1692.

TSUJI, T., K. IRYO, N. WATANABE, and M. TSUJI. 2002. Preparation of silver nanoparticles by laser ablation in solution: influence of laser wavelength on particle size. Applied Surface Science. 202:80-85. VANĚK, V., and V. DALIBOR. 2007. Staré hutnictví stříbra. Stříbrná Jihlava 2007 - Silberne Stadt Jihlava 2007, Studie k dějinám hornictví a důlních prací, Archeologické výzkumy na Vysočině, Suplementum 1:18.

WANG, H., X. QIAO, J. CHEN, and S. DING. 2005. Preparation of silver nanoparticles by chemical reduction method. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 256:111-115.

WINCHESTER, M. R., R. E. STURGEON, and J. M. COSTA-FERNÁNDEZ. 2010. Chemical characterization of engineered nanoparticles, p. 951-952. In: Analytical & Bioanalytical Chemistry. Vol. 396. Springer Science & Business Media B.V.

ZAKI, S., M. F. ELKADY, S. FARAG, and D. ABD-EL-HALEEM. 2012. Determination of the effective origin source for nanosilver particles produced by Escherichia coli strain S78 and its application as antimicrobial agent. Materials Research Bulletin. 47:4286-4290.

ZHANG, H. R., Q. B. LI, Y. H. LU, D. H. SUN, X. P. LIN, X. DENG, N. HE, and S. Z. ZHENG. 2005. Biosorption and bioreduction of diamine silver complex by Corynebacterium. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 80:285-290. ŠRÁMEK, J. 2011. Nanotechnologie v medicíně, p. 16. MEFANET, Praha, WikiSkripta.

51

9. Seznam URL zdrojů URL 1:

http://www.agh2o.cz/

URL 2:

http://emedicine.medscape.com/article/1069121-overview#showall

URL 3:

http://dermatology.cdlib.org/111/case_reports/argyria/wadhera.html

52