Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen Academiejaar 2010 – 2011
Studie van de werking van metamitron in melganzenvoet (Chenopodium album L.)
Jelle PHLYPO Promotor: Dr. ir. B. De Cauwer Tutor: Ir. J. Aper
Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master in de bio-ingenieurswetenschappen: landbouwkunde
i
De auteur en de promotor geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie. The author and the promotor give the permission to use this thesis for consultation and to copy parts of it for personal use. Any other use is subject to the copyright laws, more specifically the source must be extensively quoted when citing results from this thesis. Gent, juni 2011
Dr. ir. B. De Cauwer
Jelle Phlypo
ir. J. Aper
i
WOORD VOORAF Vooreerst wil ik het departement Herbologie van de vakgroep Plantaardige Productie bedanken om te mogen meewerken aan hun onderzoek naar de detectie, verspreiding en bestrijding van gevoelige en resistente melganzenvoetpopulaties. Mijn grootste dank en waardering gaan uit naar mijn begeleider, ir. Jonas Aper, voor de vele dagen en weekends aan nuttige uitleg, richtlijnen, verbeteringen en het bijstaan in het uitvoeren van de proeven. Zonder zijn hulp bij het uitzaaien, water geven en oogsten zou het onmogelijk geweest zijn alle proeven binnen het gunstig seizoen te kunnen uitvoeren. Ik hoop met deze thesis een belangrijke hulp te zijn in doctoraatsonderzoek van Jonas. Daarnaast wil ik het personeel aan de vakgroep Herbologie op de Proefhoeve bedanken voor het bijspringen op drukke momenten. Speciale dank gaat uit naar Dhr. Chris Bekaert voor het klaarmaken van het grondmengsel en het uitvoeren van de bespuitingen. Ik kan met een glimlach terugblikken op een leuke thesistijd op de proefhoeve vol met leuke herinneringen, toffe collega’s en rookpluimen van het landbouwmaterieel. Vervolgens wil ik Dr. ir. Benny De Cauwer en Prof. dr. Robert Bulcke bedanken voor het kritisch nalezen en formuleren van zinvolle opmerkingen om deze thesis tot een goed einde te brengen. Ook Prof. Dr. ir. MC. Van Labeke wil ik bedanken voor het gebruik van haar laboratorium. Daarnaast wil ik Stijn, Delphine, Riek en Joachim bedanken voor het water geven van mijn planten op momenten dat ik er niet kon zijn. Speciale dank gaat uit naar Frederik Peeters voor het opofferen van talloze uren om mij te helpen in het labo. Tot slot wil ik mijn ouders, familie en vrienden bedanken voor de steun in dit thesisjaar.
Staden, juni 2011 Jelle Phlypo
ii
SAMENVATTING Melganzenvoet (Chenopodium album L.) blijkt voor vele landbouwers een lastig te bestrijden onkruid. Vooral in de teelt van suikerbiet zijn er grote problemen door de aanwzigheid van populaties die resistent geworden zijn ten aanzien van metamitron, een herbicide dat toegepast wordt in suikerbiet. Ondanks de resistente melganzenvoetpopulaties blijft metamitron een belangrijke component in het FAR-bestrijdingssysteem in suikerbiet omwille van zijn excellente selectiviteit ten aanzien van suikerbiet. Deze scriptie wil in een eerste plaats het effect nagaan van de omgevingsomstandigheden op en rond het moment van toepassing van metamitron. Hierbij wordt gebruik gemaakt van potproeven om dosis-responscurven op te stellen voor een gevoelige en twee resistente melganzenvoetpopulaties. Er wordt telkens een tolerante suikerbietvariëteit mee ingezaaid ter controle. Suikerbiet mag tenslotte geen significante groeiremming kennen bij toepassing van metamitron. De effecten op de bestrijding van volgende omgevingsomstandigheden wordt onderzocht: lichtintensiteit, temperatuur, luchtvochtigheid, bodemvochtgehalte en tijdstip van behandeling. In tweede instantie wordt er onderzoek verricht naar de werking van verschillende inhibitoren op de detoxificatie van metamitron. Via HPLC-analyse wordt de aanwezigheid van metamitron en de afbraakproducten deamino-metamitron en metamitron-N-glucoside gedetecteerd. Beide resistente populaties zijn gekenmerkt door een puntmutatie Ser264->Gly op het psbA-gen van het D1-proteïne ter hoogte van Fotosysteem II. Deze mutatie zorgt voor een wijziging van de bindingsplaats van metamitron in de plant, waardoor er sprake is van target-site resistentie. Naast deze target-site resistentie zou er ook sprake zijn van verhoogd metabolisme van metamitron. De geteste inhibitoren werken in op specifieke enzymes die instaan voor dit metabolisme. Hiermee worden de enzymes die instaan voor dit metabolisme geïdentificeerd. Tot slot wordt het herbicideneffect van metamitron vergeleken met twee verwante PSII-remmers, metribuzin en terbuthylazin. Dit wordt geanalyseerd via het opstellen van tijdsreeksen die het verloop van het chlorofyl-, carotenoïden- en malondialdehyde-gehalte (een maat voor de peroxidatie van membranen) weergeven voor een gevoelige en twee resistente melganzenvoetpopulaties. Alle geteste omgevingsomstandigheden, uitgezonderd luchtvochtigheid, toonden een niet-significant effect op de bestrijding, maar waren niet eenduidig voor alle geteste populaties. Het toevoegen van de inhibitoren 1-amino-benzotriazool (ABT) zorgde voor een daling van de afbraakproducten in vergelijking met de andere geteste inhibitoren picolinezuur-t-butylamide (PABA) en piperonylbutoxide (PBO). Tot slot bleek terbuthylazin geen invloed te hebben op de efficiëntie van het fotosyntheseapparaat, waar er wel een daling van 20 % werd vastgesteld bij toepassing van metamitron en metribuzin. Resistente populaties reageren op een toepassing van een PSII-remmer door het pigmentgehalte te verhogen. Bij de metamitron-resistente populatie steeg het malondialdehydegehalte tot 5 dagen na toepassing om vervolgens terug te dalen naar het normale niveau. Het toevoegen van een inhibitor in combinatie met de toepassing van metamitron bij de juiste weeren omgevingsomstandigheden kan ervoor zorgen dat de resistente populaties toch op een voldoende wijze bestreden kunnen worden. Dit is belangrijk want een onvoldoende bestrijding is een trigger voor het ontwikkelen en uitbreiden van resistente populaties, in eerste plaats deze met een verhoogd metabolisme. De inhibitoren met een significant beter bestrijdingseffect zullen wel eerst nog een erkenningsprocedure moeten doorlopen vooraleer de landbouwer deze zouden kunnen inzetten.
iii
INHOUDSOPGAVE Lijst met afkortingen ............................................................................................................................... 1 Inleiding ................................................................................................................................................... 2 1
2
3
Resistentie ten aanzien van herbiciden bij onkruiden .................................................................... 5 1.1
Inleiding ................................................................................................................................... 5
1.2
Definities.................................................................................................................................. 5
1.3
Resistentiemechanismen ........................................................................................................ 7
1.3.1
Mechanismen waarbij het doel niet bereikt wordt......................................................... 7
1.3.2
Mechanismen waarbij het doel verandert ...................................................................... 8
1.4
Het probleem resistentie......................................................................................................... 8
1.5
De gevolgen van resistentie .................................................................................................... 9
Melganzenvoet .............................................................................................................................. 10 2.1
Taxonomie ............................................................................................................................. 10
2.2
Biologie .................................................................................................................................. 10
2.3
Verspreiding en concurrentie in gewassen ........................................................................... 11
Metamitron als fotosysteem-II-remmer ....................................................................................... 13 3.1
Metamitron ........................................................................................................................... 13
3.2
PSII-remmers ......................................................................................................................... 14
3.2.1
Werking van de fotosynthese bij C3-planten ................................................................ 14
3.2.2
Bouw PSII ....................................................................................................................... 16
3.2.3
Werking PSII-remmer .................................................................................................... 16
3.3
Metamitron-resistentie bij melganzenvoet .......................................................................... 17
3.3.1
Target site resistentie bij melganzenvoet ..................................................................... 18
3.3.2 Onvolkomen metamitron werking bij metamitron-gevoelige biotypen van melganzenvoet .............................................................................................................................. 19 4
5
Invloed weersfactoren op de werking van herbiciden .................................................................. 20 4.1
Lichtintensiteit ....................................................................................................................... 20
4.2
Temperatuur.......................................................................................................................... 22
4.3
Relatieve vochtigheid ............................................................................................................ 23
4.4
Bodemvochtgehalte .............................................................................................................. 23
4.5
Tijdstip van toediening .......................................................................................................... 23
4.6
Besluit .................................................................................................................................... 24
Inlvoed weersomstandigheden op werking metamitron .............................................................. 26 5.1
Doelstelling ............................................................................................................................ 26 iv
5.2
Materiaal en methoden ........................................................................................................ 26
5.2.1
Algemene proefopzet .................................................................................................... 26
5.2.2
Specifieke proefopzet .................................................................................................... 28
5.2.3
Statistische analyse ....................................................................................................... 31
5.3
Resultaten en discussie ......................................................................................................... 33
5.3.1
Proef A: Invloed lichtintensiteit op de effectiviteit en selectiviteit van metamitron.... 33
5.3.2
Proef B: Invloed temperatuur op de effectiviteit en selectiviteit van metamitron ...... 36
5.3.3
Proef C: Invloed luchtvochtigheid op de effectiviteit en selectiviteit van metamitron 38
5.3.4 Proef D: Invloed bodemvochtgehalte op de effectiviteit en selectiviteit van metamitron ................................................................................................................................... 41 5.3.5 Proef F: Invloed toepassingstijdstip op de effectiviteit en selectiviteit van metamitron ................................................................................................................................... 43 6
Detoxificatie van metamitron in melganzenvoet en suikerbiet .................................................... 46 6.1
Doelstelling ............................................................................................................................ 46
6.2
Materiaal en methoden ........................................................................................................ 46
6.2.1
Proefopzet ..................................................................................................................... 46
6.2.2
HPLC-analyse ................................................................................................................. 47
6.2.3
Verwerking .................................................................................................................... 48
6.3
Resultaten en discussie ......................................................................................................... 48
6.3.1
Resultaten...................................................................................................................... 48
6.3.2
Discussie ........................................................................................................................ 48
7 Verschillen in herbicidenactiviteit tussen PSII-remmers metamitron, metribuzin en terbuthylazin ......................................................................................................................................... 51 7.1
Doelstelling ............................................................................................................................ 51
7.2
Materiaal en methoden ........................................................................................................ 51
7.2.1
Proefopzet ..................................................................................................................... 51
7.2.2
Analyses ......................................................................................................................... 52
7.3
8
Resultaten en discussie ......................................................................................................... 53
7.3.1
Resultaten...................................................................................................................... 53
7.3.2
Discussie ........................................................................................................................ 54
Algemeen Besluit ........................................................................................................................... 58 8.1
Verder onderzoek .................................................................................................................. 59
Literatuur ............................................................................................................................................... 60 Bijlage 1 ................................................................................................................................................. 68
v
LIJST MET AFKORTINGEN ABT ACC ALS ED F0 FAR FDR FM FV Gly LHC MCPA MDA OV PABA PAR PBO PQ PQH2 PSI (P700) PSII (P680) Ra Rm RV S SB SC SD SE Ser WG
1-aminobenzotriazool Acetyl-CoA Carboxylase Acetolactaatsynthase Effectieve dosis Basisfluorescentie Fenmedifam-Activator-Racinaire Frequency Domain Reflectometry Maximale fluorescentie Variabele fluorescentie Glycine Light Harvesting Complex 4-chloor-2-methylfenoxyazijnzuur Malondialdehyde Onderzoeksvraag Picolinezuur-t-butylamide Photosynthetic Active Radiation Piperonylbutoxide Plastochinon Gereduceerd plastochinon Fotosysteem I Fotosysteem II Atrazin-resistente melganzenvoetpopulatie Metamitron-resistente melganzenvoetpopulatie Relatieve vochtigheid Gevoelige melganzenvoetpopulatie Suikerbietpopulatie Suspensieconcentraat Standaarddeviatie Standaardfout Serine Waterdispergeerbare granulen
1
INLEIDING Sinds mensenheugenis probeert de landbouwer zijn gewassen te vrijwaren van allerlei plagen, ziekten en onkruiden. Deze laatste vormen een grote concurrentie voor het gewas door lichtinterceptie en opname van water en nutriënten die voor het gewas bedoeld zijn. De heersende onkruiden hebben zich zodanig gespecialiseerd dat ze vanaf een jong gewasstadium tot de oogst voor enorme hinder en verliezen kunnen zorgen. Vroeger moest men deze onkruiden manueel gaan verwijderen, wat enorm veel tijd in beslag nam. Met het opduiken van talloze herbiciden konden gewassen op een goedkope en snelle manier gevrijwaard worden van onkruiden. De lage prijs van de herbiciden, in vergelijking met arbeidskosten, zorgden voor een excessief en eenzijdig gebruik en al snel leidde dit tot het probleem resistentie. Nauwe teeltrotaties hebben dit deels in de hand gewerkt. In eerste instantie werd dit opgelost door het invoeren van dosisverhogingen, maar dit was allesbehalve duurzaam en gaf onder andere problemen in volggewassen. Daarnaast had men de keuze uit een pallet aan verschillende soorten herbiciden uit verschillende klassen. Wanneer er resistentie ontstond tegen één herbicide, kon men vaak overschakelen naar een volgend herbicide tot er daartegen resistentie ontstond. Men zag helaas niet tijdig in dat het belangrijk was om herbiciden met verschillende werkingswijzen te gaan alterneren. Van geïntegreerde onkruidbestrijding was er nog nauwelijks sprake. Op heden is men zich bewust van de heersende resistentieproblematiek, maar wordt het steeds moeilijker om resistentiemanagement adequaat toe te passen door het wegvallen van talloze middelen bij de herziening van de Europese wetgeving. Algemeen kan resistentie onderverdeeld worden in twee grote groepen. De ene groep wordt targetsite resistentie genoemd door wijziging in de bindingsplaats voor het herbicide. Een tweede groep, non-target-site resistentie, omvat hoofdzakelijk resistentie door verhoogd metabolisme van het herbicide, waardoor het de bindingsplaats in mindere mate zal bereiken. Om resistentieontwikkeling tegen te gaan is optimalisatie van herbicidenwerking noodzakelijk (De Cauwer, 2010). Dit kan gebeuren door de juiste herbicidenkeuze te maken, het herbicide toe te passen in het juiste bladstadium van gewas en onkruid aan de juiste dosering, en rekening te houden met optimale weersomstandigheden rond toepassingstijdstip. Deze scriptie handelt over de werking van metamitron in melganzenvoet. Melganzenvoet (Chenopodium album L.) is een algemeen voorkomend onkruid in zowat alle landbouwgebieden (Holm et al., 1977). Metamitron is een fotosyntheseremmer die een belangrijke rol heeft in de onkruidbestrijdingsschema’s voor suikerbiet. De laatste jaren zijn er echter tal van resistente populaties ontdekt. Hierdoor wordt het voor de suikerbiettelers problematisch om hun gewas onkruidvrij te houden. Een eerste hoofdstuk van deze scriptie behandelt de algemene resistentieproblematiek, waarna een hoofdstuk volgt over het voorkomen, de eigenschappen en het concurrentievermogen van melganzenvoet. Vervolgens wordt ingegaan op de eigenschappen en werking van metamitron waarbij ook toelichting wordt gegeven over resistentie tegen deze actieve stof. Een vierde en laatste hoofdstuk van de literatuurstudie handelt over het effect van de weersomstandigheden rond het moment van behandeling. Vanaf hoofdstuk 5 volgen de resultaten van de uitgevoerde proeven met metamitron op melganzenvoet. In eerste instantie wordt het effect van verschillende weersfactoren rond het moment van behandeling onderzocht. Hierbij worden effecten van lichtintensiteit, temperatuur, luchtvochtigheid en bodemvochtgehalte nagegaan. Dit hoofdstuk wordt afgesloten met een proef omtrent het suikergehalte in de plant en het tijdstip van toepassing. In hoofdstuk 6 worden verschillende inhibitoren getest die de detoxificatie van metamitron kunnen remmen. Hierbij kan worden nagegaan welke enzymen geremd worden en dus verantwoordelijk zijn voor het metabolisme van metamitron. Een laatste hoofdstuk vergelijkt de herbicidenwerking van metamitron en twee verwante PSII-remmers, namelijk metribuzin en terbuthylazin. Hierbij worden tijdsreeksen 2
opgesteld die het verloop van het pigmentgehalte en de mate van peroxidatie van de membranen weergeven. Deze tijdsreeksen worden aangevuld met fluorescentiemetingen die de efficiëntie van het fotosyntheseapparaat weergeven. Deze scriptie wordt afgesloten met een algemeen besluit in zake de gestelde onderzoeksvragen.
3
Deel I: Literatuurstudie
4
1 RESISTENTIE TEN AANZIEN VAN HERBICIDEN BIJ ONKRUIDEN 1.1 INLEIDING Biological flexibility and ecological adaptability have been recognized as laws of nature for long time. The ability of living organism to compensate for or adapt to adverse or changing environment conditions is remarkable. Regardless of how and when various living species began, the survival of the fittest has been and still is going on (Tharayil-Santhakumar, 2003). De groeiende wereldbevolking heeft wetenschappers gedwongen op zoek te gaan naar methoden om de productiviteit van het beperkte wereldlandbouwareaal te vergroten. Het invoeren van pesticiden zorgde ervoor dat de landbouwers een grotere opbrengst kenden op een economisch leefbare manier. De plagen en ziekten werden beter onder controle gehouden en de concurrentiekracht van onkruiden kon sterk onderdrukt of totaal teniet gedaan worden. Maar iedere medaille heeft zijn keerzijde. Al snel kwam er resistentie in de doelorganismen tegen de gebruikte pesticiden. Als eerste melding van herbicidenresistentie geldt de resistentie van een biotype van klein kruiskruid (Senecio vulgaris L.), in boomkwekerijen in de VS, tegenover het triazine simazin (Ryan, 1970). Alvorens de verschillende vormen van resistentie te behandelen worden eerst enkele definities van de verschillende soorten resistentie gegeven.
1.2 DEFINITIES De huidige definities voor resistentie en tolerantie worden het best beschreven door de Weed Science Society of America (WSSA) (Aper, 2008). Tolerantie is het inherent vermogen van een soort om te overleven na een behandeling met een herbicide en zich daarna ook nog te kunnen vermenigvuldigen. Hier komt geen natuurlijke selectie aan te pas (WSSA, 1998). Resistentie is het erfelijke vermogen van een plant om te overleven en zich te vermenigvuldigen na blootstelling aan een herbicidendosis die normaal dodelijk is voor het wild type. Dit kan spontaan voorkomen door mutaties in een populatie of geïnduceerd worden door genetische manipulatie of selectie van varianten geproduceerd door weefselcultuur of mutagenese (WSSA, 1998). Kruisresistentie komt voor wanneer een plant met één enkel resistentiemechanisme resistentie vertoont voor verschillende herbiciden. Kruisresistentie kan veroorzaakt worden door een enkel gen, of door meerdere genen die één resistentiemechanisme beïnvloeden (Hall et al., 1994). Negatieve resistentie houdt in dat planten resistent aan een actieve stof gevoeliger zijn voor een andere actieve stof dan de gevoelige populatie (Gadamski et al., 2000). Meervoudige resistentie ontstaat wanneer meerdere resistentiemechanismen aanwezig zijn in één plant. Deze plant is dus resistent tegen verschillende niet-verwante actieve stoffen (Beckie, 2006). Algemeen wordt aangenomen dat de mutaties die verantwoordelijk zijn voor herbicidenresistentie spontaan ontstaan in een populatie. Herbicidenbehandelingen zullen selecteren voor deze resistente biotypes waardoor hun aandeel in de onkruidpopulatie zal stijgen (Duke et al., 1991). Natuurlijke selectie bestaat al veel langer dan herbiciden. Van nature uit zijn planten onderworpen aan natuurlijke selectie omdat een bepaalde mutatiefrequentie voorkomt die ervoor zorgt dat een plantenpopulatie uit diverse organismen bestaat. De planten met de beste mutaties in de gegeven 5
ecologische omstandigheden zullen makkelijker overleven en hun genen kunnen doorgeven. Deze theorie is niets anders dan ‘the survival of the fittest’. Door veranderende factoren worden telkens die planten geselecteerd die het best aangepast zijn aan de heersende vorm van stress. Bij toepassing van een herbicide worden de planten ook aan een vorm van stress onderworpen (Powles & Yu, 2010). Wordt het herbicide verschillende jaren na elkaar toegepast, dan vergroot de selectiedruk in de populatie. Ieder jaar zullen slechts die planten overleven die de gepaste mutatie hebben. Na enkele jaren selectie bestaat de soort enkel nog uit planten die resistent zijn tegen dit herbicide. Wanneer het herbicide maar één jaar gebruikt wordt zullen via zaadverspreiding opnieuw wild types in het gewas terecht komen. Genen uit een resistente populatie kunnen echter door pollen- en zaadverspreiding ook gevoelige populaties voorzien van resistentiegenen (Powles & Yu, 2010). Aangezien de snelheid van zo’n genenstroom veel hoger is dan de mutatiefrequentie, wordt de tijd nodig om een hoog niveau van resistentie te bereiken sterk gereduceerd (Jasieniuk et al., 1996). Veelal vertoont het resistente biotype een lagere fitness dan het wild type, zodat ze op deze manier verdrongen zal worden wanneer de selectiedruk niet meer aanwezig is (Parks et al., 1996; Tharayil-Santhakumar, 2003). Door Smis (1991) worden drie hypothesen naar voor geschoven voor het ontstaan van triazine-resistentie. Een eerste hypothese stelt dat een natuurlijke populatie individuen bevat, die onder bepaalde groeivoorwaarden resistente nakomelingen kunnen geven. Herhaaldelijk gebruik van een herbicide zou resistentieverschijning introduceren. Een tweede hypothese zegt dat er in een natuurlijke populatie resistente individuen spontaan kunnen optreden. Een laatste hypothese vertrekt van intermediaire vormen van resistentie. Deze kunnen door mutatie ontstaan uit gevoelige moederplanten. Herhaaldelijk gebruik van niet-lethale dosissen zou noodzakelijk zijn voor verdere ontwikkeling tot resistente planten. Powles & Yu (2010) geven in Tabel 1 een overzicht van factoren die evolutie van herbicidenresistentie in onkruidpopulaties kunnen beïnvloeden. Tabel 1: Factoren die herbicidenresistentie beïnvloeden. Herwerkt naar Powles & Yu (2010)
Factor Genetica
Frequentie van resistente genen Aantal resistente genen Dominantie van resistente genen Fitnesskost van resistente genen Onkruidbiologie Kruisbestuiving versus zelfbestuiving Capaciteit van de zaadproductie Overleving van de zaden in de zaadbank Verplaatsingscapaciteit van zaden en/of pollen Herbicide Chemische structuur Bindingsplaats Residuen Operationeel Dosis Toepassingstechniek Agro-ecosysteem (beheersovereenkomsten, gewasrotaties, …)
Invloed op resistentieevolutie + + + -/+ + + +
Een gebrek aan afwisseling tussen de gebruikte herbiciden zal de selectiedruk verhogen evenals het gebruik van herbiciden met een specifieke werkingswijze. De evolutie van resistentie zal dus veel trager verlopen wanneer verbindingen met verschillende werkingswijzen worden afgewisseld en middelen gebruikt worden die meerdere werkingswijzen hebben (Beckie, 2006). De correcte dosis is belangrijk om het gewenste bestrijdingseffect te bekomen. Indien een suboptimale of superoptimale dosis gebruikt wordt, vergroot de kans dat de populatie met resistentiegenen toch overleeft en zo sneller kan uitbreiden. De relatie tussen species en herbicide moet gekend zijn door de gebruiker 6
zodat deze de juiste beslissingen kan nemen in het gebruik van deze herbiciden. Een derde factor zijn de weersomstandigheden voor, tijdens en na toepassing van herbiciden. Deze omstandigheden kunnen verantwoordelijk zijn voor het al of niet slagen van de behandeling bij een bepaalde dosis. Deze weersomstandigheden worden uitgebreid besproken in Sectie 4. Naast het herhaald gebruik van efficiënte herbiciden met een specifieke werkingswijze en het voorkomen van onkruidsoorten in hoge populatiedensiteiten voegt Beckie (2006) nog een derde risicofactor toe die de evolutie van herbiciden-resistente onkruidsoorten in de hand werkt, namelijk onze eenvoudige teeltsystemen waar slechts enkele dominante onkruidsoorten kunnen overleven. Beckie (2006) raamt de kosten om herbiciden-resistentie tegen te gaan of te vertragen ongeveer gelijk aan de kosten om resistente onkruiden te bestrijden. Deze kosten zijn veel hoger dan de heersende bestrijdingsschema’s. Als gevolg zullen de landbouwers niet geneigd zijn om hun heersende bestrijdingsschema’s aan te passen totdat resistentie voorkomt. Men wijdt dit aan de onwetendheid omtrent de economische risico’s verbonden aan deze onkruiden en de primaire belangen van de landbouwer om een zo hoog mogelijke winst te halen (Rotteveel et al., 1997). Landbouwers moeten overtuigd worden om anti-resistentie maatregelen te nemen wanneer de kost klein is ten opzicht van de resistentiekost. Als voorbeeld wordt het gebruik van alternatieve herbiciden aangeraden wanneer target-site resistance kan optreden (Orson, 1999). Beckie (2006) vermeldt enkele technieken om herbiciden-resistente onkruiden tegen te gaan. Indien herbiciden gebruikt worden kan men opteren voor herbiciden met verschillende werkingswijzen in één groeiseizoen of een schema opstellen om verschillende herbiciden te gaan gebruiken over verschillende teelten over verschillende groeiseizoenen. Het gebruik van herbicidenmengsels aan de correcte dosissen (afhankelijk van de omstandigheden) en plaatsspecifieke behandelingen wordt ook aangeprezen. Tot slot kunnen genetisch gewijzigde gewassen ingezet worden (maar dit geldt niet voor Europa anno 2010). Hierbij moet wel opgepast worden dat er in deze velden geen nieuwe resistente biotypen van onkruiden opduiken door het herhaaldelijk gebruik van hetzelfde herbicide.
1.3 RESISTENTIEMECHANISMEN Mechanismen van herbicidenresistentie kunnen gegroepeerd worden in twee groepen: mechanismen waarbij het herbicide het doelwit niet bereikt en mechanismen waarbij het doel verandert van vorm zodat het herbicide geen binding kan vormen met de doelstructuur. Beide groepen worden hieronder kort besproken (Tharayil-Santhakumar, 2003). In Sectie 3.3 worden de mechanismen specifiek voor melganzenvoet en PSII-remmers toegelicht.
1.3.1 MECHANISMEN WAARBIJ HET DOEL NIET BEREIKT WORDT Veranderingen in opname van het herbicide: in resistente biotypen wordt het herbicide minder makkelijk opgenomen door onder andere veranderingen in de dikte of kwaliteit van de waslaag, de chemische samenstelling en structuur van de cuticula en de bevochtigbaarheid van de epicuticulaire laag (Baker, 1980; Kirkwood, 1999). Het voorkomen van kleinere bladeren bij resistente biotypen kan de opname van (blad)herbiciden in mindere mate ook negatief beïnvloeden (Tharayil-Santhakumar, 2003). Veranderingen in het transport van het herbicide: door morfologische aanpassingen wordt het apoplastisch (tussen de celwanden, xyleem) en/of symplastisch (celmembraan, floëem) transport van het herbicide gereduceerd (Tharayil-Santhakumar, 2003). Herverdeling van het herbicide: het opgenomen herbicide wordt over de hele plant verdeeld. Hierbij wordt de concentratie verdund en kunnen lipofiele herbiciden geïmmobiliseerd worden in olielichaampjes. Mechanismen als sequestratie en compartimentalisatie kunnen er ook voor zorgen dat het herbicide zijn werking niet kan uitvoeren. Het voorkomen van 7
deze mechanismen is afhankelijk van de chemische eigenschappen van het herbicide (Price, 1983; Kreuz et al., 1996). Metabolisme: het herbicide wordt gedetoxificeerd vooraleer het doel in de plant bereikt wordt. De snelheid van detoxificatie is snel zodat de plant niet gedood wordt. Biochemische detoxificatie kan toegeschreven worden aan vier groepen van enzymen: oxidasen, reductasen, hydrolasen en conjugasen. De meest voorkomende enzymen om herbiciden te metaboliseren zijn glutathion-S-transferasen, cytochroom P450 mono-oxygenasen en aryl acyl amidasen (Preston & Mallory-Smith, 2001).
1.3.2 MECHANISMEN WAARBIJ HET DOEL VERANDERT Target-site resistance: de bindingsplaats voor het herbicide verandert van vorm waardoor het herbicide een verlaagde affiniteit heeft en zijn werking moeilijker kan uitvoeren. Dit berust veelal op een verschil in het DNA, dat voor die bindingsplaats codeert: bv. door een mutatie van één nucleotide waardoor er substitutie gebeurt tussen twee aminozuren. Hierdoor verandert de structuur van de bindingsplaats dat dikwijls een enzym of eiwit is, zodat de binding met het herbicide niet of geringer kan plaatsvinden. Er kan onderscheid gemaakt worden tussen sterische hindering en een gewijzigde bindingsplaats. Veelal zorgt deze structuurverandering ook voor een verminderde fitness. Dit is vooral gekend bij fotosynthese-remmers. Zo zal een resistent biotype voor PSII-remmers met een mutatie in het D1-proteïne een verlaagde fotosynthesecapaciteit bevatten omdat de natuurlijke elektronendragers door de veranderde vorm ook moeilijker kunnen gaan binden (Radosevich & Holt, 1982). Nochtans blijkt een geringer concurrentievermogen bij C. album niet samen te gaan met een lagere fotosynthesesnelheid (Smis, 1991). Overexpressie van de bindingsplaats: hierdoor treedt een verdunningseffect op van het herbicide, m.a.w. zijn er meer bindingsplaatsen dan herbicidemoleculen. De toegepaste dosis zal niet in staat zijn om het volledige systeem plat te leggen en de niet geblokkeerde enzymen zullen de normale taken verder kunnen uitvoeren (Tharayil-Santhakumar, 2003). Het is dus belangrijk het onderscheid te maken tussen resistentie gekenmerkt door een verandering in de genen, veelal een nucleotide verandering met een aminozuursubstitutie als gevolg, of resistentie gekenmerkt door een verhoogd metabolisme, belemmering van het herbicide, sequestratie en compartimentalisatie. Bij deze laatste groep is er geen verandering in de werkingsplaats van het herbicide, maar wordt deze plaats in veel geringere mate bereikt door het middel. Dit wordt beïnvloed door meerdere genen.
1.4 HET PROBLEEM RESISTENTIE Vanaf 1970 begon resistentie ten aanzien van triazines voor te komen. Als oorzaak van deze resistentie werd het intensieve gebruik naar voor geschoven. Samen met de lange werkingsduur van deze actieve stoffen zorgde dit voor een zeer hoge selectiedruk naar resistente biotypes. Dit verklaart ook de enorme boost in het aantal resistente biotypes tot aan 2010 weergegeven in Figuur 1. Recenter wordt resistentie tegen ALS– en ACCase-remmers steeds vaker waargenomen. ALS- en ACCase-remmers hebben een enkelvoudige werkingswijze waardoor snel resistentie kan ontstaan (De Cauwer, 2010).
8
Figuur 1: Aantal resistente biotypes per chemische familie van herbiciden (Heap, 2010).
1.5 DE GEVOLGEN VAN RESISTENTIE Wanneer de onkruiden in het gewas niet meer bestreden kunnen worden, zijn de gevolgen voor de teler enorm. Door de concurrentiekracht van de onkruiden zal de opbrengst van het gewas sterk gereduceerd worden en wanneer de onkruiden tot zaadvorming kunnen komen zullen de volgende gewassen telkens meer problemen ondervinden. Dit hangt af van het aantal beschikbare herbiciden in desbetreffende teelten. Vele gewassen zullen niet meer op een grootschalige manier geteeld kunnen worden met chemische onkruidbestrijding als hulpmiddel. Er zal voor vele gewassen wel een toevlucht zijn naar andere manieren voor onkruidbestrijding maar voor sommige gewassen zal dit niet mogelijk zijn. Andere manieren van onkruidbestrijding zijn schoffelen, branden, stomen, elektrocutie, manueel wieden, … De opbrengstderving hangt af van de voorkomende onkruiden in het gewas. In het kader van deze thesis zorgen dicotyle onkruiden in suikerbiet voor de grootste opbrengstverliezen. Twee ongedefinieerde onkruidplanten in de rij per biet zorgden voor een verlies van 11 procent aan oogstgewicht (Zimdahl & Fertig, 1967). Dawson (1965) toonde zelfs verliezen van 94 procent wanneer melganzenvoet ongestoord kon groeien in suikerbiet.
9
2 MELGANZENVOET 2.1 TAXONOMIE Rijk Klasse
Plantae Spermatopsida (Zaadplanten) Geavanceerde tweezaadlobbigen Orde Caryophyllales Familie Amaranthaceae Genus Chenopodium Soort Chenopodium album L. Figuur 2: Kiemplant + generatief stadium melganzenvoet (Heap, 2010).
Melganzenvoet (Figuur 2) behoorde oorspronkelijk tot de Chenopodiaceae (ganzenvoetfamilie) die recent bij de Amaranthaceae gevoegd werd (Van der Meijden, 2005). Binnen deze familie zijn nog tal van andere belangrijke landbouwonkruiden terug te vinden zoals kleine majer (Amaranthus blitum L.), papegaaienkruid (Amaranthus retroflexus L.) en meldes (Atriplex spp.). Landbouwgewassen zoals biet (Beta vulgaris subsp. vulgaris) en spinazie (Spinacia oleracea L.) behoren ook tot de Amaranthaceae (Van der Meijden, 2005). De correcte Nederlandse naam is melganzenvoet. Landbouwers kennen vaak deze naam niet en gebruiken het plaatselijke dialect zoals het West-Vlaamse ‘dauwkool’, ‘ennevette’, enz. In het Verenigd Koninkrijk spreekt men van ‘goosefoot’ of ‘fat hen’ terwijl in de VS ‘common lambsquarters’ de algemene term vormt. Soms wordt verkeerdelijk de term ‘pigweed’ toegeschreven aan melganzenvoet, terwijl met deze naam meestal papegaaienkruid bedoeld wordt (Holm et al., 1977).
2.2 BIOLOGIE Chenopodium album is een opstaande grijsgroene plant die tot drie meter hoog kan worden in een meegroeiend gewas (Figuur 3). De stam vertakt in oplopende takjes, waarbij dikwijls paarse plekken voorkomen rond de vertakking en op de bladeren. De bladeren zijn onregelmatig van vorm. Slechts oudere bladeren kunnen een ganzenvoetvorm vertonen (Holm et al., 1977). De bladeren zijn ofwel geheel gaafrandig en langwerpig tot lancetvormig, sterk bochtig getand of spiesvormig maar dan met een middenlob zonder evenwijdige zijden (Van der Meijden, 2005). Melganzenvoet is een therofyt waarbij op het einde van het gunstige seizoen sterke zaden gevormd worden die de winter kunnen overleven. De plant sterft af voor het ingaan van de ongunstige periode. Deze zaden worden gevormd in tweeslachtige groene bloempjes die in de oksels of op het uiteinde van de takken in kluwens voorkomen. De bloemen zijn klein en hebben vijf bloemdekbladeren (Van der Meijden, 2005). Ze bevatten vijf meeldraden en twee tot drie stijlen. De vruchten zijn nootjes, waarbij de zaden omhuld zijn door het pericarp. De zaden zijn veelal zwart en glinsterend maar ook bruine zaden komen voor. De zaden zijn ongeveer 2 mm groot en hebben een sterk variabel duizendkorrelgewicht. Williams (1963) vermeldt een gewicht van 1.33±0.37 g, Aliotta et al. (2005) spreken van een duizendkorrelgewicht van 0.38±0.02 g terwijl De Roo (2011) 0.75±0.005 g, 0.77±0.004 g, 0.88±0.001 g en 1.44±0.007 g vermeldt voor respectievelijk een Britse, twee Belgische en een Zweedse populatie. Williams (1963) vermeldt dat één plant tot 3500 zaden kan produceren, terwijl andere bronnen zoals Holm et al.(1977) spreken van tienduizenden. 10
Figuur 3: Typische morfologie van C. album (Ciba-Geigy, 1973).
De zaden van C. album kennen een dormantieperiode waarna er twee kiemingspieken voorkomen op het einde van april en in augustus. Bruine zaden blijken een lagere of ontbrekende dormantie te bezitten (Williams, 1963; Bouwmeester & Karssen, 1993). Het is belangrijk te vermelden dat de vereisten om dormantie te doorbreken niet overal gelijk zijn en afhankelijk zijn van de klimaatsomstandigheden. Een plant kan zowel bruine als zwarte zaden produceren waarbij de bruine direct kunnen gaan kiemen. Daarnaast zullen er meer zaden geproduceerd worden bij een langere fotoperiode met een hoger percentage dormante zaden. Om de kieming te bevorderen zou een hoger nitraatgehalte in de bodem een belangrijke factor zijn naast licht (Holm et al., 1977; Bouwmeester & Karssen, 1993). Toevoeging van nitraat tijdens de zaadvorming zorgde voor een stijging van het nitraatgehalte in de zaden en een daling van de dormantie (Fawcett & Slife, 1978). In onderzoek kan de kieming bevorderd worden door de zaden te schuren op schuurpapier zodat de harde zaadhuid gekwetst wordt. Een andere methode is het weken van de zaden in een kaliumnitraatoplossing gedurende minimaal 12 uur (Aper, 2008). De totale ontwikkelingsduur van de plant bedraagt ongeveer 4 maand afhankelijk van de klimaatsomstandigheden (Williams, 1963).
2.3 VERSPREIDING EN CONCURRENTIE IN GEWASSEN De zaden van C. album worden slechts over beperkte afstand door de wind verspreid. Als gevolg daarvan komt C. album op een perceel eerst pleksgewijs voor. Deze spots bestaan uit enorm veel planten, die met hun enorme zaadproductie ervoor zullen zorgen dat het veld vlug volledig ingenomen is. Verspreiding gebeurt hoofdzakelijk via de mens, transport van granen, dieren en via dierlijke mest. Na passage door het verteringsstelsel van varkens overleeft ongeveer 50 procent van de zaden (Holm et al., 1977). Zaden van C. album komen veel voor in maïssilage. Door de slechte bestrijding van resistente biotypes worden ze meegeoogst. Elema et al. (1990) vonden dat er slechts drie procent van de zaden overleefden na een inkuiling van 4 weken in het midden van de kuil. Werden ze echter bewaard op 5 cm diepte in de kuil, dan overleefde 45 procent van de zaden. Enkel fluweelblad (Abutilon theophrasti Medik.) doet nog beter met waarden van 80 procent over de volledige kuil. Na acht weken in een gerstsilage overleefden drie procent van de zaden (Blackshaw & Rode, 1991). Overleving na passage door het verteringsstelsel van runderen werd geraamd op 52 procent (Blackshaw & Rode, 1991). Elema et al. (1990) constateerden lagere waarden voor algemene 11
overleving van onkruidzaden. De waarden variëren van gemiddeld 23.1 procent voor zeven verschillende onkruidzaden tot 6 procent voor hanenpoot (Echinochloa spp. P. Beauv.). Tot slot moeten de zaden die overleefden ook nog een periode in de mestkelder doorbrengen. Experimenten door Elema et al. (1990) gaven een overleving na acht weken van 67 procent bij 4°C en 16 procent bij 17°C. De goede overleving ten opzichte van andere meegeoogste onkruidzaden zoals hanenpoot en zwarte nachtschade (Solanum nigrum subsp. nigrum) wordt toegeschreven aan de harde schaal rond het zaad. De totale levensduur van zaden in de bodem kan oplopen tot 40 jaar (Holm et al., 1977). Chenopodium album is een kosmopolitisch onkruid en behoort volgens Coquillat (1951) tot de vijf meest verspreide onkruiden in de wereld. Het komt voor in de meest extreme klimaatsomstandigheden, van de rand van de woestijn tot op 3650m hoogte. In Europa komt C. album overal voor, wat ook geldt voor geheel België (Hoste, 2006). In de Nederlandse biologische landbouw is C. album het tweede meest gevreesde onkruid na vogelmuur (Stellaria media L.) (Scheepens et al., 2004). Chenopodium album heeft een grote plasticiteit om zich aan te passen aan de heersende omstandigheden en kan droogte goed overleven. Het koloniseert snel open en verstoorde plaatsen (Williams, 1963). Na bewerking van de grond kan deze soort zich snel ontwikkelen tot een dominante soort door een goede overleving van het zaadbankmateriaal. Wordt dit perceel dan voor een tijd niet meer bewerkt dan zal de melganzenvoetpopulatie sterk afnemen (Hoste, 2006). Landbouwkundig gezien groeit C. album best op goed bewerkte klei- en leembodems, minder op kalkrijke gronden. Het nitraatgehalte van de bodems heeft enerzijds een positieve invloed op de kieming. Anderzijds zorgt een hoog nitraatgehalte voor een dominantere groei ten opzichte van het gewas. Hierbij blijkt vooral ammoniumstikstof een groter effect te hebben dan nitraten (Williams, 1963). Voor de groei lijken kalium en boor essentiële nutriënten te zijn (Pawlika, 1957). Naast licht en water is C. album een sterke concurrent voor stikstof, kalium, calcium en magnesium in maïs (Vengris, 1955). Door zijn grote plasticiteit zal het onkruid meegroeien met de maïs om te blijven concurreren voor het invallende licht. Hierdoor kunnen de planten enorme hoogtes bereiken. C. album is gastheer voor virussen zoals het bietenmozaïekvirus, bietenvergelingsvirus en tal van andere virussen in frequent geteelde gewassen (Holm et al., 1977). Het wordt daarom ook gebruikt als indicatorplant om de aanwezigheid van virussen te testen (Williams, 1963). Chenopodium album is in West-Europa vooral gekend als onkruid, maar in andere delen van de wereld worden de bladeren geconsumeerd (Aliotta et al., 2005). De bladeren blijken een grote hoeveelheid tryptofaan en cysteïne te bezitten waardoor ze een goede aanvulling vormen in het maïsdieet van vele, vooral tropische volksstammen (Holm et al., 1977). Chenopodium album is een kosmopolitisch onkruid en samen met het feit dat het een nitrofiel onkruid is, komt het in vele rijk bemeste gewassen voor. In België is het een algemeen onkruid in groentengewassen en akkerbouwgewassen. De meeste problemen komen voor in suikerbiet, aardappelen en maïs, omdat de bestrijding daar soms te wensen overlaat. Ook in de Nederlandse biologische landbouw komen veel problemen voor (Scheepens et al., 2004). Naast chemische bestrijding is er de mogelijkheid om melganzenvoet op een fysische of mechanische manier te gaan verwijderen zoals werd vermeld in Sectie 1.5. De in België in (suiker)bieten erkende herbiciden werkzaam tegen éénjarige tweezaadlobbigen zijn: clomazon, chloridazon, desmedifam, ethofumesaat, fenmedifam, metamitron, lenacil en quinmerac (Fytoweb, 2010).
12
3 METAMITRON ALS FOTOSYSTEEM-II-REMMER 3.1 METAMITRON Metamitron (C10H10N4O) behoort tot de chemische familie van de triazinonen. De moleculaire structuur is weergegeven in Figuur 4.
Figuur 4: IUPAC: 4-amino-3-methyl-6-fenyl-1,2,4-triazin5(4H)-on (Alanwood, 2010a).
Naast metamitron bestaat deze chemische familie van herbiciden nog uit ametridion, amibuzin, ethiozin, hexazinon, isomethionzin en metribuzin (Alanwood, 2010b). Enkel metamitron en metribuzin zijn nog toegelaten in België (Fytoweb, 2010). Triazinonen remmen de fotosynthese door blokkering van de elektronenstroom in fotosysteem II (PSII). Door specifieke bindingsplaatsen, op het D1-eiwit behoren ze samen met de triazines tot de C1-subgroep van het HRAC. Door het voorkomen van andere families in de C1-groep kan binnen dezelfde plantensoort kruisresistentie voorkomen. Voor Chenopodium album is dit ondermeer het geval voor het triazine atrazin, waarvan het gebruik in de EU inmiddels verboden is volgens de richtlijn 91/414/EEG. Metamitron wordt in België vooral gebruikt als vóór- en na-opkomst herbicide in suikerbiet. Het FARsysteem (een lage dosissysteem) is de regel. Dit systeem is gebaseerd op een vóór-opkomst behandeling met een bodemherbicide aan lage dosis. Daarna kunnen twee tot drie behandelingen met het FAR-mengsel toegepast worden na-opkomst aan lage dosis met hulpstof. Deze hulpstof is veelal een plantaardige olie, paraffineolie of een uitvloeier. De eerste behandeling moet gebeuren in een jong onkruidstadium (kiemlobben). De tweede behandeling volgt een week later om de nieuw opgekomen onkruiden en de onvoldoende bestreden onkruiden te doden. Het FAR-mengsel bestaat uit drie verschillende componenten (De Cauwer, 2010): F: “Fenmedifam” (of fenmedifam + desmedifam); actieve stof aanwezig in Betanal. A: “Activator”; ethofumesaat en/of tri-allaat en/of triflusulfuron-methyl. De activator zorgt ervoor dat F niet uitkristalliseert op het blad of in de tank en zorgt zo voor een gegarandeerde opname. Daarnaast heeft het nog een onkruidbestrijdingseffect. R: “Racinaire”; bodemherbicide dat de contactwerking van de componenten F en A verbetert plus een nawerking heeft. Mogelijke actieve stoffen zijn metamitron, chloridazon, dimethenamide-P, S-metolachloor en quinmerac. De toegepaste dosissen worden aangepast aan het onkruidstadium. Het bodemherbicide naopkomst wordt gekozen in functie van de (aanwezige of te verwachten) onkruidsoorten (Demeyere et al., 2008; De Cauwer, 2010; POVLT, 2010). 13
In België zijn, anno 2010, 26 handelsproducten op de markt die metamitron bevatten als hoofdbestanddeel. Deze formuleringen behoren allemaal tot de waterdispergeerbare granulaten (WG) met 70 % metamitron of de suspensieconcentraten (SC) met een metamitronconcentratie van 700 g/l. De meest populaire is hierbij GOLTIX 700 SC. Daarnaast zijn nog 2 FAR-mengsels op de markt met de handelsnamen BETANAL QUATTRO en FEMO (POVLT, 2010; Fytoweb, 2010). Metamitron wordt bij vooropkomst-behandelingen ingezet wanneer onkruiden zoals echte kamille, melganzenvoet of zwarte nachtschade verwacht worden. Na-opkomst wordt metamitron aanbevolen tegen kamille, gewone duivenkervel, varkensgras, akkerviooltje, melganzenvoet, uitstaande melde, hondspeterselie, zwarte nachtschade, kleefkruid en papegaaienkruid (Demeyere et al., 2008). Daarnaast is metamitron enkel nog erkend in de teelt van aardbeien waar het mag toegepast worden 1 tot 2 weken na planten en tijdens de rustperiode (einde november tot half februari) (POVLT, 2010). In tegenstelling tot de meeste PSII-remmers die een goede opname en werking via het blad vertonen, heeft metamitron een goede opname via de wortels en een mindere efficiënte opname via het blad (WSSA, 2002; Thiel et al., 2010). Metamitron heeft algemeen gezien een slechtere werking dan andere triazinonen en triazines maar is toch noodzakelijk om melganzenvoet in suikerbiet te bestrijden (Aper, 2011). Suikerbiet is in staat om metamitron te deamineren tot het nagenoeg onschadelijke 4,5-dihydro-3-methyl-6-fenyl-1,2,4-triazin-5-on (Schmidt & Fedtke, 1977). Toch werd een verlaging van de opbrengst aangetoond bij behandeling met metamitron (Steen & Al-Windi, 1984). Metamitron wordt in melganzenvoet sneller gedegradeerd na absorptie door de wortels. Verder onderzoek moet ook nog uitwijzen of klimatologische omstandigheden daar een invloed op hebben. Metamitron wordt ofwel gedeamineerd tot deamino-metamitron, maar in sterkere mate vindt N-glucosylatie plaats tot metamitron-N-glucoside. Beide worden weergegeven in Figuur 5 (Aper et al., 2010a).
Figuur 5: Metabolisme van metamitron in melganzenvoet tot metamitron-N-glucoside en deaminometamitron (Aper et al., 2010a).
3.2 PSII-REMMERS Om de werking van PSII remmers goed te begrijpen wordt hier eerst beknopt de werking van de fotosynthese bij C3-planten toegelicht. Dit zal ook de resistentievorming door target-site resistance duidelijker maken.
3.2.1 WERKING VAN DE FOTOSYNTHESE BIJ C3-PLANTEN 14
De fotosynthese bestaat uit twee types van reacties: de lichtreacties en de donkerreacties. Bij de lichtreacties wordt stralingsenergie omgezet in chemische energie onder de vorm van ATP en NADPH. Deze energie wordt bij de donkerreacties gebruikt voor CO2-inbouw dat finaal leidt tot de vorming van suikers en tal van andere producten essentieel voor de groei en het onderhoud van de plant. Beide reacties gaan door in de chloroplasten van groene plantendelen. De lichtreacties vinden plaats in het thylakoïdmembraan dat een scheiding vormt tussen enerzijds het stroma en anderzijds het centraal gelegen thylakoïdkanaal. De elektronenstroom die hierbij voorkomt volgt het bekende Zschema. Deze elektronenstroom wordt weergegeven in figuur 6. Feofytine is niet weergegeven op de figuur maar bevindt zich in het PSII reactiecentrum weergegeven in figuur 7. De light-harvesting complexen (LHC’s), die zich bij beide reactiecentra bevinden, zorgen ervoor dat de geabsorbeerde energie tot bij fotosysteem I en II komt (PSI en PSII). Wanneer uit PSII, gekenmerkt door een chlorofyl-a-molecule met absorptie bij 680nm, een elektron doorgegeven wordt aan feofytine wordt dit elektron vervangen door een elektron afkomstig uit de fotolyse van water. Mangaan-eiwitten treden hier op als katalysator. Er komen 4 elektronen vrij bij het splitsen van één watermolecule. Vervolgens worden deze elektronen doorgegeven aan chinon en daaropvolgend aan plastochinon (PQ) (Steppe, 2010). PQ kan slechts zijn plaats verlaten wanneer het 2 elektronen heeft ontvangen samen met 2 waterstofatomen (Bowyer et al., 1991). Slechts één elektron van PQH2 wordt afgegeven aan plastocyanine (PC) ter hoogte van het cytochroom b6f-complex. Het andere elektron wordt gebruikt om een plastochinon uit de pool te reduceren tot plastosemichinon. Via een tweede PQH2 zal het plastosemichinon verder gereduceerd worden tot een PQH2 mits het opnemen van 2 protonen uit het stroma. Finaal is er dus één molecule PQH2 gerecupereerd, zijn er 2 elektronen doorgegeven aan 2 moleculen PC en zijn er 4 protonen getransporteerd. De protonen worden vrijgesteld in het kanaal (zie Figuur 6) (Reheul, 2010). Hierbij ontstaat een H+-gradiënt tussen het kanaal en het stroma. Ook de waterstofatomen vrijgekomen bij de splitsing van water in het thylakoïdkanaal dragen mee aan deze gradiënt. Via de koppelingsfactor zal deze gradiënt instaan voor ATP-productie. PSI wordt gekenmerkt door een chlorofylmolecule die absorptie vertoont bij 700nm in plaats van de gebruikelijke 680nm. Vandaar de dikwijls voorkomende benaming P700. Via P700 gaat het verder naar ferrodoxine (Fd) dat uiteindelijk de aanleiding geeft tot de vorming van NADPH. De elektronen weg uit PSI worden terug aangevuld door deze uit PSII. Om de elektronen te verwijderen is ook lichtenergie nodig dat wordt gecapteerd via LHCI. De fotofosforylatie kan bestaan uit twee
Figuur 6: Elektronenstroom in de chloroplast. De light-harvesting complexen zijn niet weergegeven in de figuur (Lodish et al., 2008).
15
verschillende wegen. Enerzijds is er de niet cyclische fosforylatie zoals hierboven beschreven met ATP- en NADPH-vorming (Steppe, 2010). Anderzijds is er de cyclische fosforylatie waarbij fotosysteem II niet meer deelneemt aan de elektronenstroom. Dit komt voor wanneer de excitatie van beide systemen ongelijk is en er teveel energie bij PSII terecht komt. LHCII wordt dan gefosforyleerd en kan diffunderen naar PSI. Zo wordt alle energie afgeleid naar PSI, zal er enkel ATP productie en dus geen koolstofinbouw zijn (Lodish et al., 2008). De vorming van energie is bekend onder de chemi-osmotische theorie van Mitchell (Steppe, 2010). Het gevormde ATP en NADPH wordt in de donkerreacties gebruikt om CO2 in te bouwen in ondermeer suikers. Deze reacties gaan bij C3-planten door in het stroma van de chloroplasten. CO2 wordt via het enzym Rubisco gebonden aan ribulosebifosfaat. Samen met Mg2+ als cofactor en water worden 2 moleculen 3-fosfoglycerinezuur gevormd (3-PGA). Omdat deze molecule 3 koolstofatomen bevat, wordt gesproken van C3-planten. Deze 3-PGA-moleculen worden verder in de Calvin-cyclus verwerkt (Steppe, 2010).
3.2.2 BOUW PSII Fotosysteem II bestaat hoofdzakelijk uit 2 proteïnen, D1 en D2 die elkaar overlappen, en een mobiele elektronendrager plastochinon (Figuur 7). Deze bestaat uit de chinonen QA en QB waarbij QA gebonden is aan D2, QB aan D1 (Aper, 2008). QA zal een elektron ontvangen van feofytine en gereduceerd worden tot QA-. Uit de plastochinonpool wordt een QB aangetrokken en de lading wordt overgedragen waarbij het complex QAQB- ontstaat. QB kan slechts loskomen van D1 wanneer het twee elektronen heeft ontvangen. Wanneer dit gebeurd is, wordt het complex QAQB2- gebonden aan 2H+-atomen. Hierbij zal QBH2 loskomen en een elektron doorgeven aan het cytochroomcomplex b6f (Reheul, 2010). De H+-atomen worden aan de andere kant van het thylakoïdmembraan vrijgegeven in het thylakoïdkanaal (Bowyer et al., 1991).
Figuur 7: Bouw fotosysteem II (PSII) (Devine et al., 1993).
3.2.3 WERKING PSII-REMMER Een PSII-remmer zal de plaats van QB innemen door binding op het D1-proteïne. Dit proteïne heeft hierbij een grotere affiniteit voor de herbicidemolecule dan voor het chinon. De PSII-remmer zal de bindingsplaats niet meer verlaten en zodus de elektronenstroom blokkeren. Hierdoor zal het reactiecentrum geëxciteerd blijven waardoor triplet chlorofyl gevormd wordt (Aper, 2008). Dit triplet 16
chlorofyl zal aanleiding geven tot de vorming van reactief zuurstof. Het reactief zuurstof gevormd in het reactiecentrum zal de start zijn van destructieve reacties waarbij eerst chlorofylbegeleidende eiwitten beschadigd worden. Dit zal ervoor zorgen dat chlorofyl loskomt van de beschermende carotenoïden, waarbij nog meer triplet chlorofyl gevormd zal worden. Dit zal uiteindelijk leiden tot het verdwijnen van chlorofyl en de dood van de plant. Bemerk hierbij wel dat licht noodzakelijk is in de werking van een PSII-remmer (Rutherford & Krieger-Liszkay, 2001). Het verloop na een behandeling met een PSII-remmer kan weergegeven worden in tijdsreeksen. Hierbij kan de concentratie malondialdehyde een maat zijn voor de peroxidatie van membranen. Het verloop van zo’n tijdsreeks is weergegeven in Figuur 8 (Devine et al., 1993).
Figuur 8: Tijdsreeks voor komkommerbladeren na behandeling met de PSII-remmer monuron. 1: CO2-fixatie; 3: totaal chlorofylgehalte; 5: malondialdehyde (Devine et al., 1993).
3.3 METAMITRON-RESISTENTIE BIJ MELGANZENVOET Melganzenvoet staat anno 2010 op de 4de plaats van soorten met het grootste aantal herbicidenresistente biotypes (Heap, 2010). Enkel Lolium rigidum Gaudin., Avena fatua L. en Amaranthus retroflexus L. gaan melganzenvoet vooraf. Globaal zijn er 348 biotypes resistent tegen herbiciden waarvan er 68 resistent zijn t.o.v. fotosysteem II remmers (groep C1). Wanneer de groepen C2 en C3 meegeteld worden zijn dit er 92. Tabel 2 geeft een overzicht weer van gemelde en bevestigde resistente biotypes van melganzenvoet (Heap, 2010). Bemerk dat er geen sprake is van resistentie ten opzichte van metamitron. Nochtans zijn er resistente populaties van melganzenvoet uitgebreid getest en besproken in de literatuur door Mechant & Bulcke (2006), Mechant et al. (2008), De Marez et al. (2008), Thiel et al. (2010), Powles & Yu (2010).
17
Tabel 2: Overzicht van de gemelde en bevestigde resistente biotypes van melganzenvoet (Heap, 2010)
HRAC-groep C1 (PSII-inhibitor)
C2 (PSII-inhibitor) B2 (ALSinhibitoren) O (Synthetische auxines)
Actieve stof Atrazin
Metribuzin Simazin Cyanazin Lenacil Prometon Terbutylazin Terbutryn Linuron Trifensulfuronmethyl Imazamox Dicamba
Landen van resistentie België, Canada, Tsjechië, Frankrijk, Italië, Nieuw-Zeeland, Polen, Portugal, Slovenië, Spanje, Zwitserland, Nederland, VS Bulgarije, Griekenland, Noorwegen, VS Tsjechië, Verenigd Koninkrijk,VS Tsjechië, VS Tsjechië Tsjechië Tsjechië Tsjechië Noorwegen Canada, VS VS Nieuw-Zeeland
3.3.1 TARGET SITE RESISTENTIE BIJ MELGANZENVOET Bij niet-gemuteerde biotypes van melganzenvoet bevat het D1-proteïne op plaats 264 een serine (Ser264). Plastochinon kan via waterstofbinding gebonden worden aan de hydroxylgroep van serine. Daarbij is het ook nog gebonden aan een fenylalanine op plaats 255 (Phe255). Indien PSII-remmers zoals metamitron en atrazin worden toegepast gaan deze op dezelfde manier binden aan het D1proteïne. Dit wordt afgebeeld op Figuur 9 (Powles & Yu, 2010). Een gekende puntmutatie in het psbA-gen (dat codeert voor het D1-proteïne) veroorzaakt de substitutie van Ser264 door Gly (De Marez et al., 2008). Als gevolg kan metamitron geen binding meer aangaan met plaats 264 zodat het zich niet aan het D1-proteïne kan hechten. Het kan dus de elektronenstroom niet verhinderen. Hetzelfde geldt voor atrazin die op een geringere manier kan gaan binden. Plastoquinon zal wel nog kunnen binden aan het proteïne maar de efficiëntie van het fotosynthese-apparaat zal gereduceerd worden. Hierdoor hebben resistente biotypen vaak een verminderde fitness. Veelal spreekt men dan van een fitnesskost door resistentie. Algemeen wordt gesteld dat resistentie ten aanzien van atrazin kruisresistentie heeft veroorzaakt tegen triazinonen zoals metamitron en metribuzin (Aper et al., 2010b). Men gaat ervan uit dat decennialang gebruik van atrazin onder hoge frequentie en dosering in onder andere maïs de gepaste puntmutatie heeft geselecteerd om een toepassing van atrazin te kunnen overleven (Thiel et al., 2010). Door Mechant et al. (2008) werd in een Zweedse populatie de mutatie alanine251 (Ala251) door valine teruggevonden. Deze populatie toonde een afwijkend resistentieprofiel: het biotype was resistent tegen metamitron, maar gevoelig ten aanzien van atrazin. Recent vermeldden Petersen & Varrelmann (2010) nog een derde puntmutatie in C. album. Zij vonden een mutatie van leucine218 (Leu218) door valine waarbij het biotype resistentie vertoont tegen metamitron en metribuzin, maar wel nog gevoelig is voor terbuthylazin. Gezien het intensieve gebruik van triazines zijn er nog een drietal andere mutaties aangetroffen, namelijk de substitutie van serine264 (Ser264) door threonine in Portulaca oleracea L. (Masabni & Zandstra, 1999), valine129 (Val129) door isoleucine in Poa annua L. (Mengistu et al., 2000) en asparagine266 (Asp266) door threonine in Senecio vulgaris L. (Park & Mallory-Smith, 2006). Oettmeier (1999) toont een overzicht van de in 1999 gekende mutaties in fotosysteem II in onkruiden en bacterieculturen.
18
Figuur 9: Binding aan het D1 proteïne voor plastochinon (links) en atrazin (rechts) (Powles & Yu, 2010).
Onder normale omstandigheden bindt QB via een carbonylgroep op serine264 (Ser264), terwijl metamitron, zoals alle andere triazinonen, dit doet via een waterstofbrug met hun amidegroep. De binding is dieper gelegen in het D1-proteïne t.o.v. triazines. Door mutaties van bv. Ser264 door alanine, of specifiek voor melganzenvoet de mutatie alanine251 (Ala251) door valine kan de binding van de PSII-remmer sterk bemoeilijkt worden of zelfs verhinderd worden door de structuurverandering van het D1-eiwit. Dit fenomeen wordt target-site resistance genoemd (Tietjen et al., 1993). Volgens Thiel et al. (2010) kunnen ook gevoelige planten reeds een aantal cellen bevatten met een gemuteerd psbA-gen. De mutatie was niet detecteerbaar na een gewone PCR-reactie, maar na een geneste PCR-reactie van psbA-genfragmenten werd de Ser264 → Gly mutatie teruggevonden in twee gevoelige populaties, waarbij één populatie afkomstig was van een veld van een organisch landbouwbedrijf, waar metamitron nog nooit toegepast werd. Een vergelijking van piekintensiteiten wees uit dat de proportie van het aantal gemuteerde chloroplasten weliswaar zeer laag lag.
3.3.2 ONVOLKOMEN METAMITRON WERKING BIJ METAMITRON-GEVOELIGE BIOTYPEN VAN MELGANZENVOET Wanneer metamitron-gevoelige melganzenvoet behandeld wordt met metamitron in een aanbevolen dosis blijkt het afsterven soms te wensen over te laten. Het belang van de weersomstandigheden vóór, tijdens en na het behandelen kunnen dit verklaren. Daarom wordt in Sectie 4 dieper ingegaan op de invloed van weersfactoren op de werking van PSII-remmers.
Mechant et al. (2008) geven aan dat resistentie tegen metamitron ook verward kan worden met (verhoogd) metabolisme van metamitron in melganzenvoet. De planten zouden metamitron kunnen afbreken vooraleer het D1-proteïne van PSII bereikt wordt. Dit werd besproken in Sectie 3.
19
4 INVLOED WEERSFACTOREN OP DE WERKING VAN HERBICIDEN Op de verpakking van herbiciden staat een voorgeschreven dosis die ook onder minder gunstige omstandigheden toch de gewenste doding kan leveren. Hieruit blijkt dat deze dosis in vele gevallen te hoog is. Een lagere dosis van het herbicide zal de meeste doelonkruiden doden onder optimale condities. Onder minder gunstige condities zal een hogere dosis vereist zijn. Zijn de omstandigheden ongunstig dan kan de hoogste dosis leiden tot onvoldoende doding (Medd et al., 2001; Kudsk, 2001). In Denemarken werd door Kudsk (1989) een groeimodel ingevoerd waarbij naast de te behandelen onkruiden en het groeistadium ook rekening moest gehouden worden met de heersende weersomstandigheden om een factor-afhankelijke dosis te gaan gebruiken. Deze dosis zal dus lager zijn dat de aanbevolen dosis door de producenten van herbiciden. Verschillende weersfactoren kunnen een invloed hebben op de werking van herbiciden. Factoren zoals temperatuur, lichtintensiteit, relatieve vochtigheid, bodemvochtgehalte, CO2-gehalte en regenval zorgen zowel voor een rechtstreekse als onrechtstreekse beïnvloeding van de fytotoxiciteit zowel vóór, tijdens en na de behandeling. Onrechtstreeks kan er invloed zijn op de samenstelling en dikte van de cuticula en de waslaag, die op hun beurt de opname van het herbicide kunnen beïnvloeden. Opname blijkt de belangrijkste stap te vormen in de werking van herbiciden (Riethmuller-Haage et al., 2007). Door Lundkvist (1997a) worden de weersfactoren op de dag van toepassing als prioritair beschouwd naar opname en activiteit van het herbicide. Na de behandeling zijn deze invloeden geringer maar niet onbestaande. Andere factoren zoals het toepassingstijdstip, suikergehalte van de te bestrijden planten, plantendensiteit en bladstand kunnen de werking ook versterken of verminderen. Veelal zijn deze laatste factoren het gevolg van de heersende weersomstandigheden vóór het toepassingstijdstip. Algemeen kan gesteld worden dat omstandigheden die de groei bevorderen een positieve werking hebben op de fytotoxiciteit van bladherbiciden (Hammerton, 1967; Lundkvist, 1997a; Lundkvist, 1997b; De Ruiter & Meinen, 1999; Peterson et al., 2001). Voor bodemherbiciden is dit minstens even belangrijk omdat een goede groei samengaat met een grote vraag aan vochtopname. Een goede groei zorgt er dus voor dat er veel bodemvocht opgenomen wordt met daarin het opgeloste bodemherbicide. Factoren die de transpiratie van planten bevorderen, zorgen ook voor een verhoogde opname van bodemvocht. De werking van bodemherbiciden wordt nog door andere zaken beïnvloed zoals absorptie aan bodemcolloïden en plaatsing van het herbicide in de bodem (Kudsk, 2001; De Cauwer, 2011). Condities vóór, tijdens en na toediening van herbiciden kunnen dus een sterke invloed uitoefenen op de herbicidenwerking. De combinatie onkruid x herbicide zal specifiek beïnvloed worden. Er kan dus geen algemene trend naar voor geschoven worden welke weersomstandigheden alle herbiciden positief beïnvloeden (Riethmuller-Haage et al., 2007).
4.1 LICHTINTENSITEIT Een verhoogde lichtintensiteit zal een positief effect hebben op de fotosynthesecapaciteit en dus op de groei van planten. Samen met een hoge relatieve vochtigheid zorgt dit voor ideale groeiomstandigheden. Planten die goed groeien zullen herbiciden makkelijker opnemen en transporteren (Legg, 1983). Uit onderzoek van Riethmuller-Haage et al. (2007) bij Persicaria maculosa Gray. bleek dat een gereduceerde lichtintensiteit zorgt voor een verhoging van de LAR (Leaf Area Ratio). De totale bladhoeveelheid was groter maar zonder significant effect op de 20
herbicidewerking. Uit hetzelfde onderzoek bleek wel dat de opname negatief gecorreleerd was met de ED50-waarde waarbij het belang van een goede opname benadrukt wordt. Hammerton (1967) wijst op de verschillen tussen plantensoorten op de invloed van lichtintensiteit. Wel kan algemeen gesteld worden dat bij verduistering eerst de LWR (Leaf Weight Ratio) zal afnemen. Wordt er verder verduisterd dan zal ook de SLA (Specific Leaf Area) dalen. Meritt (1984) vermeldde een verlaging van de fytotoxiciteit van ioxynil bij reductie van de lichtintensiteit vanaf de behandeling. De werking van terbutryn op tarwe verminderde naarmate de lichtintensiteit laag bleef na behandeling (Figuerola & Furtick, 1972). Onderzoek van Lundkvist (1997b) met groeistoffen toonde aan dat een hoge stralingsintensiteit voor de behandeling een daling van de ED80 veroorzaakte en dus voor een betere werking zorgde. Tijdens en de tweede dag na behandeling werd echter de ED80-dosis verhoogd. Het effect van lichtintensiteit is moeilijk los te koppelen van andere factoren. Dit geldt voor alle factoren (Lundkvist, 1997b). Het is moeilijk om in een groeikamer één parameter te laten variëren terwijl de andere constant blijven. In veldomstandigheden is dit uitgesloten. Wanneer bijvoorbeeld de temperatuur stijgt zal automatisch de relatieve vochtigheid gaan dalen (Skuterud et al., 1998). In een groeikamer zal de lichtintensiteit lager zijn dan in open lucht of in serres. Dit kan ook effecten hebben op andere klimatologische parameters (Petersen & Hurle, 2001). Een hoge lichtintensiteit zal zorgen voor een stijging van de temperatuur. Dit kan een positief effect hebben op de groeisnelheid maar ook een negatief effect door het sneller voorkomen van droogtestress. De effecten van temperatuur worden verder besproken (Sectie 4.2). Gerber et al. (1983) vermeldden dat verhoogde stralingsintensiteit de herbiciden sneller kan degraderen. Een hogere lichtintensiteit versnelde de chlorofylafbraak door metribuzin (Pallett & Dodge, 1980). PSII-remmers zullen bij een hogere lichtintensiteit zorgen voor een hogere productie aan zuurstofradicalen en de daarop volgende oxidatieve stress (Aper, 2011). Schaduwplanten hebben minder bescherming nodig tegen UV-straling. Als gevolg zal de waslaag en de cuticula dunner zijn en zal deze minder cutine bevatten. Dit zou in theorie de opname van herbiciden moeten beïnvloeden (Hammerton, 1967; Price, 1983). Ook Lundkvist (1997a) vermeldde dat er een dikkere waslaag voorkomt bij planten opgekweekt bij hoge stralingsintensiteit en hoge temperatuur. Herbiciden kunnen vastgehouden worden door celcomponenten waarbij de actieve concentratie verlaagd wordt. Dit hangt af van de chemische eigenschappen van het herbicide (hydrofiel of hydrofoob) en van het voorkomen van de celcomponenten zoals celwanden, eiwitten, tannines,… . Wanneer er gedurende lange termijn veel licht is, stijgt de concentratie aan tannines, hetgeen de actieve herbicidenconcentratie kan verlagen (Price, 1983). De condities voor de behandeling beïnvloeden de eigenschappen van het bladoppervlak wat de efficiëntie van herbicidenopname reguleert. Baker (1980) stelde dat planten een dikkere en meer was bevattende cuticula zullen aanmaken wanneer de relatieve vochtigheid daalt, de lichtintensiteit stijgt of de temperatuur zeer hoge of lage waarden bereikt. Ook de dikte en samenstelling variëren met het vochtgehalte van de bodem. Grond op 40% van de beschikbare watercapaciteit zal planten leveren met drie maal meer wasafzetting op de bladeren van erwten, bieten en aardbeien. Er werden ook verschillen opgemeten tussen de abaxiale en adaxiale zijde van het blad en de ouderdom van de bladeren. Abaxiaal gebeurde de penetratie van de actieve stof sneller. Hetzelfde werd besloten voor jonge bladeren. Baker (1980) wees dit toe aan verschillen in dikte en samenstelling van de cuticula. Nochtans hebben volgens Baker (1980) jongere bladeren een dikkere waslaag dan mature bladeren waarbij deze tevens het grootst is op de abaxiale zijde. Hieruit volgt dat niet alleen de dikte van de cuticula en epicuticulaire waslaag belangrijk is, maar ook zijn samenstelling. Ook de formulering kan een belangrijke rol spelen in de opname van de actieve stof (De Cauwer, 2011). Naast de cuticula worden ook nog effecten van de stomata vermeld en effecten van herbiciden op de stomata (Davies et al., 1983; Cobb et al., 1983). Huidmondjes komen zowel aan de bovenzijde (tot 25%) als onderzijde van het blad voor bij C. 21
album (Harr et al., 1991). Gevoelige populaties vertonen een grotere stomatale densiteit aan de onderzijde van het blad dan resistente populaties van C. album (Smis, 1991).
4.2 TEMPERATUUR Temperatuur kan op plantniveau sterk verschillen tegenover de omgevingstemperatuur. Instraling op een blad kan de temperatuur in de grenslaag en de temperatuur in de buitenste weefsellagen enkele graden doen stijgen ten opzichte van de omgevingstemperatuur. Het temperatuursverloop vóór het toedieningstijdstip zal enerzijds effect hebben op de morfologie van de plant en anderzijds op de groeisnelheid van de plant. Een lage temperatuur voor de behandeling kan een vermindering in gevoeligheid ten aanzien van herbiciden teweeg brengen door de geringere aanwezigheid van doelenzymen en doeleiwitten (Hammerton, 1967). Een verhoging van de temperatuur na de behandeling zorgt bij verschillende soorten voor een snellere dood en een lagere ED50 bij toepassing met 2,4-D (Hammerton, 1967). Een te hoge stijging zal echter nadelig zijn. De spuitvloeistof zal te snel opdrogen waarbij binnendringen in het blad niet kan gebeuren. Te hoge temperaturen doen de stomata sluiten wat bij sommige herbiciden de werking kan verstoren (Hammerton, 1967). De temperatuur kan naast de planteigenschappen ook de eigenschappen van het herbicide veranderen (Figuerola & Furtick, 1972). Een temperatuursverandering kan ook de eigenschappen van het herbicide veranderen. Zo zorgt een temperatuursstijging voor een betere werking van het ioxynil ester ten opzichte van het zout (Meritt, 1984). Een verhoogde temperatuur tijdens en na de behandeling kan zorgen voor een verhoogde transpiratie. Mits voldoende plantbeschikbaar bodemvocht aanwezig is, zal de plant meer water gaan opnemen en zal de groei bevorderd worden. De stijging van de bodemtemperatuur kan het uitdrogen van het bodemoppervlak veroorzaken. Indien de watertoevoer niet voldoende is zal het bodemherbicide, dat zich meestal in de toplaag bevindt, niet meer in oplossing zijn en niet meer door de plant kunnen worden opgenomen. Door de verhoogde transpiratie zal een betere translocatie van het herbicide gebeuren in de plant en/of wordt er meer bodemherbicide uit de bodemoplossing opgenomen (Figuerola & Furtick, 1972; Mulder & Nalewaja, 1978). Hierbij kan de concentratie van vooral bladherbiciden in het blad te sterk verdund worden bij een sterke xyleemstroom (Petersen & Hurle, 2001). Door transport zal de concentratiegradiënt tussen binnen- en buitenzijde van het blad behouden blijven en zal er finaal meer actieve stof van het bladherbicide worden opgenomen. Als nadeel kan een verhoogd metabolisme bij een hogere temperatuur aangehaald worden (Lundkvist, 1997a). De combinatie met andere factoren kan niet veralgemeend worden. Een hoge temperatuur samen met lage instraling bij de behandeling verlaagde de ED80-dosis van MCPA, maar verhoogde de ED80-dosis van tribenuron-methyl (Lundkvist, 1997b). Atrazin ingezet tegen gerst vertoonde een efficiëntiestijging met 26% tussen 10°C en 17°C (Mulder & Nalewaja, 1978). Gelijkaardige effecten werden gevonden door Bowen (1967) en Penner (1971). De toxiciteit van simazin ten opzichte van maïs vergrootte bij stijgende temperatuur (Burnside & Behrens, 1961). De toxiciteit van atrazin in maïs daalde bij stijgende temperatuur door verhoogde detoxificatie en beter penetratie (Thomson et al., 1970). Een verhoging van de temperatuur beïnvloedt de viscositeit van de cuticula en begunstigt de penetratie (Price, 1983). Price (1983) toont dat de temperatuur op drie verschillende manieren invloed heeft op de diffusie, weergegeven als de Stokes-Einstein diffusie coëfficiënt: D=kB*T/(6πrn) Met kB: Boltzman constante; r: straal van een druppel; n: viscositeit van de cuticula. De temperatuur beïnvloedt rechtstreeks D, maar ook n is temperatuursafhankelijk. Daarnaast bepaalt de temperatuur ook de dikte en structuur van de druppel via zijn invloed op het luchtvochtigheidsdeficiet. Hoe kleiner de druppel, hoe meer er verdampt eer de druppel het blad bereikt. 22
4.3 RELATIEVE VOCHTIGHEID Hogere relatieve vochtigheden zijn gunstig voor de bladopname, translocatie en werking van herbiciden (Hammerton, 1967; Gerber et al., 1983; Nalewaja & Woznica, 1985; Lundkvist, 1997a; Lundkvist, 1997b; Skuterud et al., 1998; Medd et al., 2001; Petersen & Hurle, 2001; RiethmullerHaage et al., 2007). Metamitron blijkt een verhoogde activiteit te bezitten indien het toegepast wordt bij een hoge relatieve vochtigheid (May, 1983). Extreem hoge relatieve vochtigheid kan echter de translocatie beperken. Bij een aanhoudende hoge relatieve vochtigheid vóór de behandeling zal de cuticula beter doordringbaar zijn. Planten opgekweekt bij lage relatieve vochtigheid hebben een dikkere cuticula en meer was, wat de interceptie, retentie en penetratie reduceert (Lundkvist, 1997a). Tijdens en na de behandeling zal een hoge relatieve vochtigheid ervoor zorgen dat de gespoten actieve stof minder snel opdroogt en verder kan opgenomen worden doorheen de cuticula. Hoge relatieve vochtigheid zal er ook voor zorgen dat de stomata open zijn wat de werking van herbiciden kan begunstigen (Hammerton, 1967). Dauw ’s morgens zorgt ervoor dat het product terug wat oplost en zo verder zijn werking kan uitvoeren. Geringe regenval kent hetzelfde effect, maar hevige regenval na behandeling spoelt het middel van de bladeren. Regenval voor de behandeling zorgt ervoor dat de bladeren goed nat zijn, waardoor het middel zich beter zal verspreiden. Een vochtige cuticula en epicuticulaire waslaag verbeterden het indringen van hydrofiele herbiciden zoals metamitron en bentazon bij planten met een sterk hydrofobe cuticula zoals C. album L. (Cobb et al., 1983). Hevige regenval en wind kunnen echter de cuticula en epicuticulaire waslaag beschadigen waardoor penetratie van het herbicide makkelijker verloopt (Hammerton, 1967).
4.4 BODEMVOCHTGEHALTE Onder droogtestress zullen planten een dikkere cuticula ontwikkelen (Hammerton, 1967). Worden bodemherbiciden toegepast, dan zal een goed bodemvochtgehalte vereist zijn zodat de actieve stof in oplossing blijft en opgenomen kan worden. Dit geldt enkel voor herbiciden die geen werking hebben via de gasfase. Droogtestress na behandeling leverde niet het gewenste resultaat (Nalewaja & Woznica, 1985; Boydston, 1990; Dickson et al., 1990). Het bodemvochtgehalte nabij het oppervlak is belangrijk, want alleen daar zal het middel kunnen opgenomen worden door de ondergrondse plantendelen. Hebben de te bestrijden onkruiden een diepgaand wortelstelsel net als de penwortel van C. album, dan is er enige neerslag nodig om het bodemherbicide op de juiste plaats te krijgen (Maganti et al., 2005). Geraakt het middel te diep door overvloedige regen dan zal de behandeling minder resultaat leveren (Gerber et al., 1983). Ook voor bladherbiciden is het bodemvochtgehalte belangrijk. Een vochtige bodem zal ervoor zorgen dat ook het gewas wat vochtiger blijft tegenover een gewas op een droge bodem. Dit zorgt voor een hogere relatieve vochtigheid in het microklimaat van het gewas (Hammerton, 1967). Heerst er droogtestress, dan zal er geen watertransport en translocatie van het herbicide plaatsvinden in de plant.
4.5 TIJDSTIP VAN TOEDIENING De effecten van het tijdstip van toediening zijn afhankelijk van de combinatie species x herbicide. Collings et al. (2003) onderzochten de behandeling van Alopecurus myosuroides L. in wintertarwe. Behandeling met clodinafop was minder effectief in de namiddag dan bij een ochtendbespuiting. Resultaten voor isoproturon waren niet significant. Doran & Andersen (1976) concludeerden dat de toediening van bentazon in sojabonen het best gebeurde rond de middag. Zij besloten ook dat dit slechts een kleine invloed heeft op het resultaat, maar de combinatie met andere factoren zoals lichtintensiteit en vochtigheid kunnen voor significante verschillen zorgen. Erwten behandeld met MCPA werden best bestreden tussen 12 en 16u. Men concludeerde hoe meer suikers er aanwezig waren des te gevoeliger de erwten waren (Hammerton, 1967; Doran & Andersen, 1976). Skuterud et al. (1998) vermelden dat een ochtend- en middagbespuiting globaal gezien beter zijn dan een avondbespuiting. De kans op hevige regen- en windvlagen is geringer op deze tijdstippen. Wanneer men in droge perioden moet gaan behandelen wordt een ochtendbespuiting aangeraden om van de 23
gunstige effecten van dauw te kunnen profiteren. Een avondbespuiting met groeistoffen resulteerde in een afname in bestrijdingseffectiviteit van C. album. In tegenstelling met de erwten behandeld met MCPA zorgde toevoeging van sucrose (in mindere mate glucose) voor verminderde gevoeligheid ten aanzien van atrazin bij Arabidopsis zaailingen. Wanneer enkel sucrose wordt toegediend (80mM) is er een lagere aanwezigheid van psbA mRNA en D1 proteïnen ten opzichte van de controle. Als verklaring wordt vermeld dat accumulatie van oplosbare suikers zorgt voor een negatieve feedback op de fotosynthese (Sulmon et al., 2004; Couée et al., 2006). Wordt daarbij ook atrazin toegediend dan is het gehalte aan psbA mRNA en D1 proteïnen hoger dan de controle. De toegediende suikers hebben geen invloed op de koolstofbalans, met andere woorden ze worden niet gebruikt als vervangingsbrandstof door de fotosyntheseinhibitie (Sulmon et al., 2004). Ook Rutherford & Krieger-Liszkay (2001) stellen dat cel- en plantsterfte na PSII-bindende herbiciden niet het gevolg is van ‘verhongering’. Couée et al. (2006) stelde wel dat glucose gebruikt kan worden als energiebron in detoxificatiemechanismen. Herhaalde lage dosissen metamitron geven hetzelfde of een beter resultaat dan één volle behandeling in suikerbiet. Het effect van het weer op herhaalde lage dosissen is kleiner, de kans om telkens de onkruiden te bestrijden in een correct groeistadium is groter en er heerst een cumulatief effect op de overlevers (May, 1983). Hierbij is de kans wel groter op selectiedruk naar verhoogd metabolisme.
4.6 BESLUIT Het blijkt dus dat er geen éénduidige verbanden bestaan tussen de weersomstandigheden en de herbicideneffectiviteit. Alles hangt af van een combinatie van heersende factoren en de relatie tussen species en herbicide. Men kan er wel in slagen om met deze vaststellingen toch te streven naar lagere dosissen en betere bestrijding van onkruiden indien men de weersomstandigheden opvolgt. Men kan echter het weer niet maken en onkruiden moeten op tijd bestreden worden. Figuur 10 illustreert dat er een enorme variabiliteit bestaat tussen behandelingen. In deze figuur zijn vijf herhalingen van éénzelfde experiment gegeven met resulterende dosis-responscurves. Men wijdt de verschillen aan variaties in opname, translocatie en metabolisme (Aper et al., 2010a).
Figuur 10: Variabiliteit bij herhaling experiment (Aper et al., 2010a). De 5 verschillende curves zijn herhalingen van hetzelfde potexperiment.
24
Deel II: Eigen onderzoek
25
5 INLVOED WEERSOMSTANDIGHEDEN OP WERKING METAMITRON 5.1 DOELSTELLING Het doel van dit onderzoek is het nagaan van de invloed van omgevingsomstandigheden op de herbicidenwerking van metamitron bij een gevoelige en twee resistente populaties van melganzenvoet en de invloed op de selectiviteit voor een tolerante suikerbietvariëteit. Volgende onderzoeksvragen worden naar voor geschoven: - Is er een effect van lichtintensiteit rond het tijdstip van behandeling op de herbicidenwerking van metamitron? (OV1) - Is er een effect van temperatuur rond het tijdstip van behandeling op de herbicidenwerking van metamitron? (OV2) - Is er een effect van relatieve luchtvochtigheid rond het tijdstip van behandeling op de herbicidenwerking van metamitron? (OV3) - Is er een effect van het bodemvochtgehalte rond het tijdstip van behandeling op de herbicidenwerking van metamitron? (OV4) - Is er een verschil tussen ochtend- en avondbehandeling (toepassingstijdstip) op de herbicidenwerking van metamitron? (OV5) - Is er een effect van de geteste omgevingsomstandigheden op de selectiviteit van metamitron in suikerbiet? (OV6) De reactie van activiteit van metamitron op verschillende omgevingsomstandigheden wordt bepaald met behulp van bioassay-potproeven: planten worden opgekweekt in potjes en nadien behandeld met een concentratiereeks van metamitron. Hieruit kan de dosis-responscurve en een schatting van de ED50 en ED90 afgeleid worden. Dit zijn de dosissen die zorgen voor een reductie in plantrespons (b.v. droog gewicht) ten opzichte van de onbehandelde controle van respectievelijk 50 en 90%.
5.2 MATERIAAL EN METHODEN 5.2.1 ALGEMENE PROEFOPZET Er werd gewerkt met drie verschillende populaties melganzenvoet en één populatie suikerbiet weergegeven in Tabel 3. Uit voorgaande experimenten met deze populaties werden reeds ED50waarden en resistentie-indexen berekend (Aper, 2011). Deze zijn ook terug te vinden in Tabel 3. De populatie Herbiseed is afkomstig van de firma Herbiseed (Twyford, Verenigd Koninkrijk) en wordt internationaal gebruikt als gevoelige referentie. De onkruiden werden opgekweekt op velden die een tijdje braak hadden gelegen. Kortessem is afkomstig uit een suikerbietenveld in de gemeente Kortessem (Limburg, België) en geselecteerd met metamitron door zaad te kweken uit de planten die een behandeling met 6 mg metamitron per kg bodem overleefd hadden in potproeven. Deze populatie wordt gebruikt als metamitron-resistente referentie. Melle II is afkomstig uit een proefveld in Melle (Oost-Vlaanderen, België) waar 22 jaar lang atrazin in maïs werd toegepast. Deze populatie wordt gebruikt als atrazin-resistente referentie. De atrazinresistente referentie wordt mee ingesloten omdat zowel Kortessem als Melle de Ser264→Gly mutatie bezitten (Tabel 3), maar ze een verschillende achtergrond hebben. Uit eerdere experimenten is gebleken dat Kortessem resistenter reageert ten aanzien van metamitron dan Melle en dit verschil zou te wijten kunnen zijn aan een verhoogd metabolisme van metamitron (Tabel 3; Aper, 2011). Suikerbiet wordt bij de experimenten ingesloten als tolerante referentie ten aanzien van metamitron. Deze tolerantie is volledig te wijten aan een zeer snel metabolisme van metamitron. In deze experimenten werd de variëteit “Coyote” gebruikt (SESVanderHave NV, Tienen, België). 26
Tabel 3: Overzicht van de gebruikte populaties (Aper, 2011)
Code
Info
Herkomst
S Rm
Gevoelig Metamitronresistent Atrazinresistent Suikerbiet
Ra SB
Ser264->Gly mutatie
ED50 (g/ha) (standaardfout)
Resistentie-index (standaardfout)
Herbiseed Kortessem
X
129 (24) 380 (33)
2.95 (0.60)
Melle II
X
226 (25)
1.75 (0.39)
Coyote
-
>>10000
>>100
De melganzenvoetzaden werden handmatig geschuurd met schuurpapier ter bevordering van de kieming (Aper, 2008). Het aantal zaden nodig per pot werd machinaal geteld (Contador, Pfeuffer GmbH, Kitzingen, Duitsland). De potjes werden gevuld met het grondmengsel en de zaden werden 3 à 4 mm diep gezaaid. De zaden van suikerbiet werden 2 cm diep gezaaid. Het aantal zaden per pot wordt specifiek per proef vermeld. De populaties werden uitgezaaid in plastic potjes (7 cm x 7 cm x 7 cm) met een 1:1 mengsel van potgrond en gezeefde en gestoomde zandleemgrond afkomstig van de proefhoeve te Melle. Kenmerken van de zandleemgrond zijn weergegeven in Tabel 4. De potjes voor de proeven voor lichtintensiteit, bodemvochtgehalte en tijdstip van bespuiting werden in een goed verluchte plastic serre geplaatst als een gerandomiseerde blokkenproef en optimaal geïrrigeerd volgens de behoeften. De potjes voor de proeven voor temperatuur en lichtintensiteit werden geplaatst in een groeikamer. Tabel 4: Eigenschappen van de gebruikte zandleemgrond
Bodemeigenschappen pHKCl 5.78 % OM 2.04 Fracties 0-2 µm 9.1 % 2-20 µm 13.6 % 20-50 µm 36 % >50 µm 41.3 % De behandelingen werden uitgevoerd in het 2- tot 4-bladstadium gebruikmakend van een gedragen spuitboom met een breedte van 2 m. De gebruikte spuitdoppen waren van het type Teejet XR 11002 en werden gebruikt bij een werkdruk van 1.8 bar. Er werd gewerkt met een spuitvolume van 300 l/ha. Het handelsproduct GOLTIX 700 SC (700 g/l metamitron; Makhteshim-Agan Holland BV) werd gebruikt. Aan de spuitoplossing werd het adjuvant TIPO (842 g/l veresterde koolzaadolie; Comptoir Commercial des Lubrifiants) toegevoegd aan de aanbevolen dosis van 1 l/ha. De potjes met planten werden bespoten met een meetkundige concentratiereeks van metamitron (zie behandeling 1 t.e.m. 7, Tabel 5). Bij behandeling 8 werden de planten 2 uur vóór de toepassing van 700 g/ha metamitron behandeld met de inhibitor piperonylbutoxide (PBO, Fluka analytical, Sigma Aldrich Ltd., Israel) aan 1000 g/ha. Deze inhibitor wordt hoofdzakelijk via het blad opgenomen (Aper, 2011) en remt de werking van de cytochroom P450 mono-oxygenasen, die verondersteld worden ten dele verantwoordelijk te zijn voor de deaminatie van metamitron (Bode et al., 2006). Op deze manier kan het metabolisme van metamitron deels stil gelegd worden en nagegaan worden in hoeverre dit een rol speelt bij de reactie ten aanzien van metamitron. Ongeveer twee weken na behandeling werden de planten geoogst, waarbij het aantal overlevende planten en de verse biomassa per pot werd bepaald. Na 16 uur in een droogstoof op 75 °C werd het droog gewicht per pot bepaald.
27
Tabel 5: In na-opkomst toegepaste dosissen metamitron, TIPO en inhibitor PBO
Behandeling Dosis metamitron (g/ha) Dosis TIPO (l/ha) Dosis PBO (g/ha) 1 0 1 0 2 175 1 0 3 350 1 0 4 700 1 0 5 1400 1 0 6 2800 1 0 7 5600 1 0 8 700 1 1000
5.2.2 SPECIFIEKE PROEFOPZET 5.2.2.1 Proef A: Invloed lichtintensiteit op de effectiviteit en selectiviteit van metamitron De proef werd uitgevoerd in de plastic serre op de Proefhoeve te Melle (België). De klimatologische omstandigheden in de serre zijn weergegeven in Tabel 6. Drie dagen voor behandeling werden schermdoeken (65% PE-HD, groen, AVEVE) geplaatst in de serre, zowel aan bovenzijde als aan de zijkanten van de serre (Figuur 11). Op deze wijze werden drie verschillende lichtintensiteiten gecreëerd: “lage lichtintensiteit” (bekomen na installatie van twee schermdoeken, zonder tussenluchtlaag), “middelmatige lichtintensiteit” (bekomen na installatie van één schermdoek) en “hoge lichtintensiteit” (geen schermdoek). Watergift naar behoefte gebeurde via een sprinklerirrigatiesysteem (3.58 mm dag-1). Het plaatsen van de schermdoeken zal niet alleen de lichtintensiteit beïnvloeden, maar zal ook een effect hebben op andere klimatologische parameters. Eventuele effecten van deze beschaduwing op effectiviteit van metamitron kunnen bijgevolg niet louter toegeschreven worden aan veranderingen in lichtintensiteit. Met een PAR-sensor (Skye) werd de lichtintensiteit gemeten. Er heerste een reductie van 20 % door de plastic afdekking van de serre. Het ophangen in het dak van de serre (hoogte 2 meter aan de zijkanten) van 1 net zorgde voor een PARreductie van ongeveer 54%, terwijl het ophangen van 2 netten zorgde voor een reductie van 82.5 %. Vier dagen na behandeling werden de schermdoeken terug verwijderd. Er werd geopteerd om de beschaduwing slechts voor een korte periode net voor en net na de behandeling te laten doorgaan om de onderlinge verschillen in planthabitus te reduceren en het belang van andere factoren (verandering in samenstelling en dikte van de cuticula, vorming van schaduwbladeren, …) te beperken. Overzicht van de proefgegevens zijn terug te vinden in Tabel 6. Tabel 6: Overzicht proefgegevens proef A lichtintensiteit A*** Inzaai Zaden per pot voor populatie S; Rm; Ra Zaden per pot voor suikerbiet (2 cm diep) Aantal parallellen Aantal planten per pot (melganzenvoet; suikerbiet) Plaatsing schermdoeken Behandeling (1 t.e.m. 8) na-opkomst Verwijdering schermdoeken Oogsten Klimaatgegevens serre in periode: Gemiddelde temperatuur (Dag/Nacht) Gemiddelde relatieve vochtigheid (Dag/Nacht) Klimaatgegevens serre 2 netten in periode Gemiddelde temperatuur (Dag/Nacht)
23/08/2010 40; 70; 70 5 , 4* ** 4; 1 03/09/2010 06/09/2010 10/09/2010 20/09/2010 03/09/2010-20/09/2010* 18.75 °C/12.75 °C 70.44 %/91.45 % 03/09/2010-10/09/2010 20.47 °C/12.01 °C
*5de parallel bij behandeling 1 en 4 voor het nemen van bladstalen **6de parallel bij behandeling 1, 4 en 8 voor fluorescentiemeting ***Opkweek gebeurde in de grote glazen serre te Melle (subirrigatie), verplaatsing naar plastic serre op 03/09/2010
28
Figuur 11: Plaatsing van schermdoeken in de serre te Melle (Belgïe).
5.2.2.2 Proef B: Invloed temperatuur op de effectiviteit en selectiviteit van metamitron De potjes werden geplaatst in petrischalen in de groeikast (Figuur 12). Watergift gebeurde naar behoefte door middel van subirrigatie. Ongeveer een 5-tal dagen vóór behandeling werd de temperatuur op het gewenste niveau ingesteld. In de groeikamer heerste een dagregime van 16 uur. Een overzicht van de drie uitgevoerde proeven is weergegeven in Tabel 7. Tabel 7: Overzicht proefgegevens proef B voor de drie temperatuursproeven. B1: lage temperatuur; B2: middelmatige temperatuur; B3: hoge temperatuur
B1 Inzaai Zaden per pot voor populatie S; Rm; Ra Zaden per pot voor suikerbiet (2 cm diep) Aantal parallellen Temperatuur opkweek Aantal planten per pot (melganzenvoet; suikerbiet) Behandeling (1 t.e.m. 8) na-opkomst Oogsten Klimaatgegevens rond tijdstip behandeling: Gemiddelde temperatuur (Dag/Nacht) Gemiddelde relatieve vochtigheid (Dag/Nacht) Gemiddelde instraling
B2
B3
03/08/2010 07/09/2010 06/10/2010 40; 70; 70 40; 70; 70 50; 70; 70 5 5 6 3 + 4de voor behandeling 1 en 4 16°C/10°C * 24°C/16°C 22°C/16°C 4; 1 4; 1 4; 2 24/08/2010 23/09/2010 21/10/2010 07/09/2010 06/10/2010 04/11/2010 16 °C/10 °C 24 °C/16 °C 26 °C/18 °C 42 %/54 %. 69 %/92 % 72 %/94 % -2 -1 64.47 µmol m s
*Tussen 10/08 en 19/08 verhoogd naar 24°C/16°C wegens slechte kieming.
Figuur 12: Plaatsing potjes in de groeikast.
29
5.2.2.3 Proef C: Invloed luchtvochtigheid op de effectiviteit en selectiviteit van metamitron De potjes werden geplaatst in petrischalen in de groeikast (Figuur 12). Watergift gebeurde door middel van subirrigatie. Een drietal dagen vóór na-opkomst behandeling werd de luchtvochtigheid op het gewenste niveau ingesteld. Om een hoge luchtvochtigheid te bereiken werden dweilen opgehangen in de groeikamer. Deze dweilen werden continu vochtig gehouden door ze onderaan in contact te houden met vrijstaand water. Een lage vochtigheid werd bekomen door droogkorrels (Wegvocht, Gamma) in de ventilatiestroom van de groeikamer te plaatsen. In de groeikamer heerste een dagregime van 16 uur. Tabel 8 geeft een overzicht van de twee uitgevoerde proeven. Tabel 8: Overzicht proefgegevens proef C voor de twee luchtvochtigheidsproeven. C1: hoge luchtvochtigheid; C2: lage luchtvochtigheid
C1 Inzaai Zaden per pot voor populatie S; Rm; Ra Zaden per pot voor suikerbiet (2 cm diep) Aantal parallellen Temperatuur opkweek Aantal planten per pot (melganzenvoet; suikerbiet) Plaatsing luchtvochtigheidsregeling Behandeling (1 t.e.m. 8) na-opkomst Verwijderen luchtvochtigheidsregeling Oogsten Klimaatgegevens rond tijdstip behandeling: Gemiddelde temperatuur (Dag/Nacht) Gemiddelde relatieve vochtigheid (Dag/Nacht) Gemiddelde instraling
C2
04/11/2010 03/01/2011 50; 70; 70 50; 70; 70 6 6 3 + 4de voor behandeling 1 en 4 22°C/18°C 22°C/18°C 4; 3 4; 3 16/11/2010 17/01/2011 19/11/2010 19/01/2011 22/11/2010 21/01/2011 03/12/2010 03/02/2011 24°C/16 °C 23 °C/16 °C 83 %/96 %. 63 %/89 % -2 -1 64.47 µmol m s
5.2.2.4 Proef D: Invloed bodemvochtgehalte op de effectiviteit en selectiviteit van metamitron De potjes werden geplaatst in petrischalen in de plastic serre. Watergift gebeurde via subirrigatie naar behoefte. Een drietal dagen vóór behandeling werd de irrigatie van de potjes voor laag bodemvochtgehalte stopgezet. De andere potjes werden verder op veldcapaciteit gehouden. Een viertal dagen na behandeling werden alle potjes terug geïrrigeerd naar behoefte. Het bodemvochtgehalte werd gemeten via een FDR-sensor (HH2 Moisture Meter, Delta-T Devices Ltd). Een overzicht van de proefgegevens is weergegeven in Tabel 9. Tabel 9: Overzicht proefgegevens proef D bodemvochtgehalte D Inzaai Zaden per pot voor populatie S; Rm; Ra Zaden per pot voor suikerbiet (2 cm diep) Aantal parallellen Aantal planten per pot (melganzenvoet; suikerbiet) Stopzetting watergift laag bodemvochtgehalte Behandeling (1 t.e.m. 8) na-opkomst Hervatting gelijke watergift Oogsten Klimaatgegevens serre in periode: Gemiddelde temperatuur (Dag/Nacht) Gemiddelde relatieve vochtigheid (Dag/Nacht) Bodemvochtgehalte rond tijdstip behandeling (Droog/Nat)
30/08/2010 50; 70; 70 6 , 4* ** 4; 1 08/09/2010 15/09/2010 20/09/2010 29/09/2010 10/09-29/09/2010*** 21.4 °C/11.95 °C 61.15 %/91.76% 10.9 (±1.88) vol%/23.9 (±3.86) vol%
*5de parallel bij behandeling 1 en 4 voor het nemen van bladstalen **6de parallel bij behandeling 1, 4 en 8 voor fluorescentiemeting ***Opkweek in bakken in de glazen serre te Melle. Verplaatsing naar petrischalen in plastic serre op 10/09/2010.
30
5.2.2.5 Proef F: Invloed toepassingstijdstip op de effectiviteit en selectiviteit van metamitron De potjes werden opgekweekt in de grote glazen serre en de watergift gebeurde via subirrigatie. Pas na na-opkomst toepassing van metamitron werden de potjes verplaatst naar de plastic serre waar bovengronds geïrrigeerd werd. De proef werd verdeeld in vier onderdelen. Er werd een ochtend- en avondtoepassing uitgevoerd. Beide onderdelen werden nogmaals gesplitst waarbij de helft van de potjes een sucroseoplossing (80mM) bovengronds toegediend kregen gedurende twee dagen voor toepassing. Zo werd een hoog suikergehalte in de plant nagebootst op het moment van behandeling met metamitron. De proefgegevens (proef F) zijn weergegeven in Tabel 10. Tabel 10: Gegevens proef toepassingstijdstip (proef F) F Inzaai Zaden per pot voor populatie S; Rm; Ra Zaden per pot voor suikerbiet (2 cm diep) Aantal parallellen Aantal planten per pot (melganzenvoet; suikerbiet) Toediening sucroseoplossing bovengronds (20 ml/pot) Behandeling (1 t.e.m. 5 +8) na-opkomst Oogsten Klimaatgegevens serre in periode: Gemiddelde temperatuur (Dag/Nacht) Gemiddelde relatieve vochtigheid (Dag/Nacht)
03/09/2010 50; 60; 50 6 3* 4; 1 18/09/2010 20/09/2010 (ochtendtoepassing: 6.00-8.00; avondtoepassing: 18.00-20.00) 04/10/2010 20/09-04/10/2010 17.84 °C/12.77 °C 77.67 %/94.30 %
*4de parallel bij behandeling 1,4 en 8 voor het nemen van bladstalen
5.2.3 STATISTISCHE ANALYSE Voor de verwerking van de resultaten werd gebruik gemaakt van dosis-responscurven en de daaruit berekende ED50-waarden. De statistische verwerking en het opstellen van de curven gebeurde via het programma R (versie 12.2.1) (R Development Core Team, 2011) met de packages drc (Knezevic et al., 2007) en Rcmdr. Het fitten van dosis-responscurven werd beschreven in het artikel van Ritz & Streibig (2007). De dataset werd gesplitst in een dataset met de data voor de drie melganzenvoetpopulatie en een dataset met de data voor suikerbiet. De data van de behandeling met inhibitor werd apart geanalyseerd. De data werd verdeeld in groepen die een combinatie vormden van populatie en onderdeel van de proef. Algemeen werd gestart met een Levene-test om de homogeniteit van de varianties te onderzoeken. Vervolgens werd een ANOVA uitgevoerd om het effect van de component herhaling te achterhalen. Er werd steeds gestart met het fitten van een 4-parametermodel van het bovengronds droog gewicht per pot Y (g/pot) in functie van de dosis x (g/ha). Y = c + (d-c)/(1 + exp[b*(logx-loge)]) (Seefeldt et al., 1995) Met c en d respectievelijk de onder- en bovengrens, b de helling en e de ED50-waarde. Een voorbeeld van een dosis-responscurve wordt weergegeven in Figuur 13.
31
Figuur 13: Dosis-responscurve met d=100,c=4, b=2 en e= 1x (Seefeldt et al., 1995).
Bij ieder model werd via een lack-of-fit test nagegaan of het gefitte model een betere beschrijving van de data gaf t.o.v. de gewone ANOVA. Het 4-parametermodel kan nadien nog verder gereduceerd worden naar een 3-parametermodel. Dit model stelt dat alle c-parameters nul zijn, m.a.w. de ondergrens wordt gelijk gesteld aan nul. Tot slot werd onderzocht of het gereduceerde 3parametermodel gebruikt kon worden: wanneer alle curven in het te analyseren experiment een schatting voor een bepaalde parameter hebben die vrij dicht bij elkaar ligt, kan er nog verder gereduceerd worden door voor alle curven een gemeenschappelijke schatting te maken van die parameter (Ritz & Streibig, 2007). Om twee modellen onderling te vergelijken werd gebruikt gemaakt van een F- test (Seefeldt et al., 1995). Indien er geen significante verschillen zijn, kan het meest gereduceerde model gebruikt worden. F= ((SSeII-SSeI)/(DFeII-DFeI))/(SSeI/DFeI)(Seefeldt et al., 1995) waarbij SSe = error sum of squares is voor model I en II en DFe= degrees of freedom. Indien niet voldaan werd aan homogeniteit van varianties werd voor het gekozen model een boxcoxtransformatie toegepast. Finaal werd geopteerd voor het model dat voldoet aan de statistische vereisten en mooie curven plot. Knezevic et al. (2007) stellen voor om de analyse uit te voeren op het droog gewicht per pot. Voor het plotten werd het relatieve droog gewicht per pot ten opzichte van de controle gebruikt. Het probleem met relatieve data is het feit dat de parameterschattingen niet meer onafhankelijk zijn van elkaar door de herschaling. Veelal zijn de parameters b en e min of meer gelijk, maar zijn er grotere verschillen in de standaardfouten. Voor het fitten van de curves moet eveneens voldaan zijn aan de voorwaarden voor homoscedasticiteit en mag er geen effect zijn van herhaling. De vergelijking tussen de berekende ED50-waarden werd uitgevoerd via het programma R dat steunde op de selectiviteitsindices. Hierbij wordt de verhouding tussen twee ED50-waarden berekend en onderzocht of deze verhouding significant verschillend is van 1. Voor de verwerking van de data met inhibitor werd het droog gewicht per pot voor de behandeling met 700 g/ha metamitron vergeleken met het droog gewicht per pot voor de behandeling met 700 g/ha metamitron + 1000 g/ha PBO.
32
5.3 RESULTATEN EN DISCUSSIE 5.3.1 PROEF A: INVLOED LICHTINTENSITEIT OP DE EFFECTIVITEIT EN SELECTIVITEIT VAN METAMITRON
5.3.1.1 Invloed van lichtintensiteit op de effectiviteit van metamitron Na doorlopen van de procedure beschreven in 5.2.3 voor de drie melganzenvoetpopulaties apart werd het 3-parametermodel gekozen. Er was voldaan aan de homogeniteit van varianties (p>0.06) en er was geen effect van herhaling (p>0.17). De resultaten zijn weergegeven in Tabel 11. Figuur 14 geeft de drie verschillende dosis-responscurven weer voor de gevoelige populatie (S). Tabel 11: Parameters (±SE) van het 3-parametermodel voor het droog gewicht per pot voor de drie populaties melganzenvoet afzonderlijk samen met de ED90-waarden en de berekende resistentie-indexen Populatie*
Lichtintensiteit
b-parameter
d-parameter -2 [x10 ]
ED50 [g/ha]
Resistentieindex
S
Laag Middelmatig Hoog Laag Middelmatig Hoog Laag Middelmatig Hoog
1.69 (6.09) 1.99 (2.02) 1.35 (0.86) 1.46 (0.49) 1.36 (0.26) 1.64 (0.20) 1.18 (0.65) 1.56 (0.45) 1.27 (0.24)
17.20 (1.55) 29.31 (1.38) 35.34 (1.38) 8.97 (0.69) 14.89 (0.69) 18.81 (0.90) 3.51 (0.47) 6.90 (0.47) 9.21 (0.47)
32 (209) 65 (71) 45 (46) 160 (42) 174 (27) 289 (29) 172 (90) 159 (35) 199 (33)
5.00 2.68 6.42 5.34 2.45 4.42
Rm
Ra
ED90 [g/ha]
117 196 229 722 874 1100 1099 652 1127
(241) (47) (57) (280) (216) (164) (891) (209) (314)
*S: gevoelige populatie; Rm: metamitron-resistente populatie; Ra: atrazin-resistente populatie
Figuur 14: Dosis-responscurven voor de gevoelige populatie (S) bij een na-opkomstbehandeling met metamitron bij drie verschillende lichtintensiteiten: hoog, middelmatig en laag (controle =1).
33
5.3.1.2 Invloed van lichtintensiteit op de selectiviteit van metamitron in suikerbiet Homogeniteit van de varianties werd niet verworpen op het 1% significantieniveau. Na doorlopen van de standaardprocedure werd als eindresultaat het gereduceerd 3-parametermodel gekozen. Voor de lage lichtintensiteit kon geen dosisresponscurve gefit worden. Resultaten voor middelmatige en hoge lichtintensiteit zijn terug te vinden in Tabel 12. Figuur 15 geeft een overzicht weer van het gemiddeld droog gewicht per pot na toepassing van 0, 700 en 5600 g/ha metamitron na-opkomst. Tabel 12: Parameters (±SE) van het 3-parametermodel voor het droog gewicht per pot voor de suikerbietpopulatie -2
Lichtintensiteit
b-parameter
d-parameter [x10 ]
ED50 [g/ha]
SB
Middelmatig Hoog
0.71 (0.34) 0.29 (0.32)
18.16 (2.68) 18.16 (2.68)
629 (3997) 2180 (928)
Droog gewicht per pot (g)
Populatie
0.35 0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00
Hoge lichtintensiteit Middelmatige lichtintensiteit Lage lichtintensiteit 0
700
5600
Dosis metamitron (g/ha)
Figuur 15: Droog gewicht per pot (g) in functie van de dosis metamitron (g/ha) naopkomst voor de suikerbietpopulatie bij drie verschillende lichtintensiteiten (gemiddelde + SD).
5.3.1.3 Invloed inhibitor op de effectiviteit en selectiviteit van metamitron
Droog gewicht (% van gemiddelde controle)
De resultaten voor de drie verschillende melganzenvoetpopulaties en de suikerbietpopulatie zijn weergegeven in Figuur 16. 140 120 100 80
700 g/ha metamitron 700 g/ha metamitron + 1000 g/ha PBO
60 40 20 0
Figuur 16: Droog gewicht per pot relatief t.o.v. controle bij behandeling met en zonder inhibitor (PBO: 1000 g/ha) voor de drie verschillende lichtintensiteiten rond tijdstip van behandeling (gemiddelde + SD).
34
5.3.1.4 Discussie Uit Tabel 11 blijken de ED90-waarden hoger (niet-significant; p>0.05) te zijn voor onbeschaduwde planten binnen éénzelfde populatie. Voor de metamitron-resistente populatie (Rm) is er een betere bestrijding bij een halvering van de lichtintensiteit (ED50Hoog/ED50Middelmatig=1.66; p=0.04). Dit spreekt de bevindingen uit Sectie 4.1 tegen waar een hogere lichtintensiteit zorgt voor een hogere groeisnelheid en dus een beter opname van het herbicide. Hieruit worden dus lagere ED90-waarden verwacht voor onbeschaduwde planten. Want een hoge lichtintensiteit zorgt voor een overmaat aan invallende lichtenergie en bijgevolg een hogere productie van radicale zuurstofmoleculen en triplet chlorofyl, waardoor een sterkere herbicidenwerking verwacht wordt. Baker (1980) stelde echter dat een hoge lichtintensiteit resulteert in een dikkere cuticula en waslaag en dus gereduceerde opname van het herbicide. Metamitron wordt echter hoofdzakelijk opgenomen vanuit de bodemoplossing (WSSA, 2002). De bodemwerking van metamitron is belangrijk in deze proef omdat gewerkt werd met bovengrondse irrigatie, waardoor een goede heroplossing en herverdeling van metamitron kon plaatsvinden. Daarbij is de beschaduwing slechts een drietal dagen voor behandeling geplaatst. Dit kan niet het uitgesproken effect op de cuticula hebben als een volledige opkweek bij lage lichtintensiteit zoals in het onderzoek van Baker (1980). Niet enkel de lichtintensiteit verandert bij beschaduwing, maar dit heeft ook een effect op de heersende temperatuur en relatieve luchtvochtigheid. Uit de metingen bleek het effect op temperatuur gering door de aanwezigheid van windbreekgaas onderaan de serre zodat de wind voor een gelijke temperatuursverdeling over de serre kon zorgen. De RV werd opgemeten door een falende datalogger en is bijgevolg niet bruikbaar. Mogelijk zijn de verschillen in RV echter gering wegens diezelfde windspeling. Een verschil in RV op moment van behandeling kan de (geringe) bladopname beïnvloeden (zie Sectie 5.3.2), maar dit is in dit geval uit te sluiten omdat alle planten na behandeling een tweetal uur op een gemeenschappelijke plaats hebben doorgebracht vooraleer ze terug in de serre werden geplaatst. De kans bestaat echter wel dat een verschil in RV de mate van heroplossen op het blad kan beïnvloeden. In deze proef zijn lichtintensiteit en RV niet onafhankelijk waardoor de gevonden resultaten niet eenduidig toegeschreven kunnen worden aan de factor lichtintensiteit. Uit de berekende ED90-waarden kan wel duidelijk afgeleid worden dat beide resistente populaties Rm en Ra niet volledig te bestrijden zijn bij de aanbevolen dosis van 700 g/ha. De gevoelige populatie valt onder om het even welke lichtintensiteit perfect te bestrijden. Uit Tabel 12 en Figuur 15 blijkt dat de lichtintensiteit geen invloed heeft op de selectiviteit van een na-opkomst toepassing van 700 g/ha metamitron in suikerbiet. Bij zowel midddelmatige als hoge lichtintensiteit is een daling van het droog gewicht terug te zien. Aangezien de standaardfout hoog is voor de ED50 (SE=3997) voor een toepassing bij middelmatige lichtintensiteit kunnen we vaststellen dat de aanbevolen dosis van 700 g/ha metamitron bij de geteste lichtintensiteiten niet schadelijk is voor de geteste suikerbietvariëteit en in het slechtste geval voor een kleine remming kan zorgen. Een voorbehandeling met de inhibitor piperonylbutoxide (PBO) zorgt voor een daling van het droog gewicht. Deze daling is echter niet significant op het 5% significantieniveau. Door het ontbreken van verschillende datapunten wordt er hier niet verder op ingegaan. Dit zal gebeuren in hieropvolgende proefbesprekingen waar gelijkaardige resultaten voor het toevoegen van de inhibitor werden teruggevonden los van de geteste omgevingsomstandigheden.
35
5.3.2 PROEF B: INVLOED TEMPERATUUR OP DE EFFECTIVITEIT EN SELECTIVITEIT VAN METAMITRON
5.3.2.1 Invloed van temperatuur op de effectiviteit van metamitron Na het doorlopen van de werkingswijze beschreven in Sectie 5.2.3 bleek alles erop te wijzen dat de toepassing met concentratie 1400 g/ha metamitron een lager bestrijdingseffect had dan de toepassing met 700 g/ha metamitron waaruit afgeleid werd dat de behandeling niet correct was uitgevoerd. Dit bleek enkel het geval te zijn bij proef B1 (lage temperatuur). Bijgevolg werd de data van de toepassing met 1400 g/ha metamitron bij lage temperatuur uit de dataset geschrapt. Er werd voldaan aan de homogeniteit van varianties (p=0.14) en er was geen effect van herhaling (p=0.36). Tabel 13 geeft de parameters weer van het gereduceerd 3-parametermodel (reductie op bparameter) voor het droog gewicht per pot. Een vergelijking van de dosis-responscurven voor de gevoelige populatie bij de drie verschillende behandelingstemperaturen is weergegeven in Figuur 17. Tabel 13: Parameters (±SE) van het gereduceerd 3-parametermodel voor het droog gewicht per pot voor de drie populaties melganzenvoet samen met de ED90-waarden en de berekende resistentie-indexen -2
Populatie*
Temperatuur
b-parameter
d-parameter [x10 ]
ED50 [g/ha]
Resistentie-index
ED90 [g/ha]
S
Laag Midden Hoog Laag Midden Hoog Laag Midden Hoog
0.93 (0.11) 0.93 (0.11) 0.93 (0.11) 0.93 (0.11) 0.93 (0.11) 0.93 (0.11) 0.93 (0.11) 0.93 (0.11) 0.93 (0.11)
8.52 (0.77) 15.59 (0.77) 11.58 (0.95) 7.39 (0.79) 13.66 (0.77) 8.06 (0.77) 6.26 (0.78) 7.87 (0.76) 4.58 (0.75)
156 (51) 78 (19) 40 (17) 500 (207) 152 (31) 195 (62) 242 (104) 175 (57) 375 (203)
3.21 1.95 4.88 1.55 2.24 9.38
1656 (795) 825 (404) 428 (1010) 5313 (2517) 1619 (408) 2069 (736) 2574 (1164) 1862 (574) 3987 (2144)
Rm
Ra
*S: gevoelige populatie; Rm: metamitron-resistente populatie; Ra: atrazin-resistente populatie
Figuur 17: Dosis-responscurven voor de gevoelige populatie (S) voor een naopkomst behandeling met metamitron bij drie verschillende temperatuursregimes. Hoog: 26/18°C; Midden: 24/16°C; Laag: 16/10°C (controle=1).
36
5.3.2.2 Invloed van temperatuur op de selectiviteit van metamitron in suikerbiet Zowel met als zonder de data voor 1400 g/ha bij lage temperatuur konden geen dosis-responscurven via het programma R gefit worden. Via ANOVA werd geen effect teruggevonden van de factor dosis (p=0.19). Metamitron blijkt dus onder gecontroleerde omstandigheden in de groeikast geen effect te hebben op een suikerbietpopulatie onder verschillende temperatuursregimes. 5.3.2.3 Invloed inhibitor op de effectiviteit en selectiviteit van metamitron
Droog gewicht (% van gemiddelde controle)
Voor de drie onderdelen van de proef werd afzonderlijk het gemiddeld relatieve droge potgewicht ten opzichte van de controle berekend voor zowel de behandeling met 700 g/ha metamitron als deze met 700 g/ha metamitron + inhibitor. Resultaten zijn in onderstaande figuur (Figuur 18) vermeld. 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0
700 g/ha metamitron 700 g/ha metamitron + 1000 g/ha PBO
Figuur 18: Droog gewicht per pot relatief t.o.v. controle bij behandeling met en zonder inhibitor (PBO: 1000 g/ha) voor de drie verschillende temperaturen rond tijdstip van behandeling (gemiddelde + SD).
5.3.2.4 Discussie Stijgende temperaturen werken groeibevorderend indien er geen andere beperkende factoren zijn (zie Sectie 4.2). Een betere groei samen met verhoogde transpiratie door hoge temperaturen zorgen voor een grotere opname van bodemvocht en het daarin opgeloste metamitron. Finaal zou dus een betere werking vastgesteld moeten worden bij stijgende temperaturen. Deze trend is duidelijk te zien bij de ED50-waarden van de gevoelige populatie. Bij de metamitron-resistente populatie (Rm) is de bestrijding eveneens veel beter bij middelmatige en hoge temperaturen dan bij lage temperatuur. De atrazin-resistente populatie (Ra) wordt echter slechtst bestreden bij hoge temperaturen. Dit kan te wijten zijn aan een verhoogd metabolisme van metamitron bij stijgende temperaturen. Dit spreekt echter Tabel 3 tegen waar bij de Rm-populatie een hogere ED50 verwacht wordt door hogere metabolisme in vergelijking met de Ra-populatie. Indien de ED90-waarden in rekening worden genomen zien we zeer grote waarden bij lage temperaturen. Dit is deels te wijten aan het weglaten van de dosis met 1400 g/ha metamitron in de verwerking. Bij zowel Rm als Ra is de bestrijding minder effectief bij hoge temperaturen in vergelijking met de middelmatige temperaturen, wat kan wijzen op verhoogd metabolisme bij stijgende temperatuur (Tabel 13). Er is een significante verschil binnen de Rm-populatie tussen behandeling bij lage en middelmatige temperatuur (ED50Midden/ED50Laag=0.3; p<0.001). Voor de Ra-populatie is er een significant verschil tussen behandeling bij middelmatige en hoge temperatuur (ED50Midden/ED50Hoog=0.47; p<0.001). Er zijn geen significante verschillen binnen de gevoelige populatie (S).
37
Zoals Lundkvist (1997b) vermeldde is het onmogelijk om één klimatologische factor bij proeven constant te houden. Wanneer bijvoorbeeld de temperatuur stijgt zal automatisch de relatieve vochtigheid (RV) gaan dalen (Skuterud et al, 1998). Wordt er echter in gesloten ruimten gewerkt, zoals groeikamers, zal een verhoging van de temperatuur ook zorgen voor een stijgende RV door een hogere transpiratie. Dit wordt geïllustreerd in Tabel 7. De reactie van de gevoelige populatie (S) op een stijgende temperatuur kan deels te maken hebben met een stijging in relatieve vochtigheid, waarbij meer metamitron wordt opgenomen via het blad (zie Sectie 4.3). Een stijgende RV zorgt er tevens voor dat het middel langer in oplossing blijft op het blad wat de totale opname kan bevorderen. Omdat er gewerkt werd met subirrigatie kan de bladopname niet verwaarloosd worden. Een temperatuursregime van 24/16°C (dag/nacht) stimuleert de opname en werking van metamitron in beide resistente populaties (Rm en Ra). Een stijgende temperatuur kan enerzijds zorgen voor een betere doordringbaarheid van de cuticula en de epicuticulaire waxen (Price, 1983), maar kan anderzijds ook zorgen voor een versneld metabolisme. Dit laatste kan de oorzaak zijn van de hogere ED90-waarden bij het hoge temperatuursniveau. Met de aanbevolen dosis van 700 g/ha metamitron kunnen beide resistente populaties duidelijk niet bestreden worden. Voor de gevoelige populatie liggen deze ED90-waarden voor middelmatige en hoge temperaturen rond de aanbevolen dosis. Uit het feit dat er geen effect van dosis is vastgesteld blijkt metamitron onder alle temperatuursregimes volkomen veilig te zijn voor suikerbiet. Het effect van het toevoegen van piperonylbutoxide (PBO) voor de toepassing met metamitron is niet significant volgens TukeyHSD (p>0.05) binnen de populaties. Er is echter wel een trend zichtbaar dat de inhibitor zorgt voor een daling in de droge biomassa ten opzichte van een onbehandelde controle en dus zorgt voor een betere bestrijding. Enkel bij de gevoelige populatie bij hoge temperaturen is dit niet het geval. Wellicht is de gevoelige populatie dermate gevoelig dat PBO geen bijkomend effect heeft op de bestrijding bij de geteste metamitron-doseringen. De daling in droog potgewicht blijkt het sterkst te zijn voor de metamitron-resistente populatie (Rm). Voor suikerbiet, die ook gevoelig is voor PBO, is de daling in droog potgewicht gering. De met PBO èn metamitron behandelde potjes geven gemiddeld gezien nog 75% van het controlegewicht. Nochtans is de gewasselectiviteit van metamitron-toepassingen bij suikerbiet bepaald door snel metabolisme van metamitron. Suikerbiet is in staat om metamitron te deamineren tot het nagenoeg onschadelijke 4,5dihydro-3-methyl-6-fenyl-1,2,4-triazin-5-on (Schmidt & Fedtke, 1977). De invloed van de inhibitor op P450 mono-oxygenasen is bij suikerbiet dus van geringere invloed bij de metabolisatie van metamitron, nochtans blijken deze enzymen een belangrijke rol te spelen in de deaminatie van metamitron (Bode et al., 2006). Uit de proef met inhibitoren (Sectie 6) wordt hierop verder ingegaan.
5.3.3 PROEF C: INVLOED LUCHTVOCHTIGHEID OP DE EFFECTIVITEIT EN SELECTIVITEIT VAN METAMITRON
5.3.3.1 Invloed van luchtvochtigheid op de effectiviteit van metamitron Na het doorlopen van de werkingswijze beschreven in Sectie 5.2.3 bleek voldaan te zijn aan de voorwaarden voor homoscedasticiteit (p=0.24) en was er geen effect van herhaling (p=0.13). Tabel 14 geeft de parameters weer voor het gereduceerd 3-parametermodel (b-parameter) voor het droog gewicht per pot. Ter illustratie worden de dosis-responscurven voor de gevoelige melganzenvoetpopulaties gegeven voor behandeling bij lage en hoge luchtvochtigheid in Figuur 19. Voor beide resistente populaties zijn de verschillen tussen de curves voor behandeling bij lage en hoge luchtvochtigheid gelijkend als bij de gevoelige populatie.
38
Tabel 14: Parameters (±SE) van het gereduceerd 3-parametermodel voor het droog gewicht per pot voor de drie populaties melganzenvoet samen met de ED90-waarden en de berekende resistentie-indexen -2
Populatie*
Luchtvochtigheid
b-parameter
d-parameter [x10 ]
ED50 [g/ha]
Resistentieindex
ED90 [g/ha]
S
Laag Hoog Laag Hoog Laag Hoog
0.88 (0.11) 0.88 (0.11) 0.88 (0.11) 0.88 (0.11) 0.88 (0.11) 0.88 (0.11)
7.11 (0.65) 7.03 (0.64) 9.06 (0.54) 7.79 (0.53) 4.02 (0.54) 3.46 (0.51)
100 (34) 108 (34) 195 (43) 177 (44) 289 (135) 345 (166)
1.95 1.64 2.89 3.19
1211 (957) 1316 (645) 2375 (528) 2153 (1142) 3510 (1658) 4166 (2000)
Rm Ra
*S: gevoelige populatie; Rm: metamitron-resistente populatie; Ra: atrazin-resistente populatie
Figuur 19: Dosis-responscurven voor de gevoelige populatie (S) voor een naopkomst behandeling met metamitron bij hoge en lage luchtvochtigheid (controle=1).
5.3.3.2 Invloed van luchtvochtigheid op de selectiviteit van metamitron in suikerbiet Via een Levene-test werd homogeniteit van de varianties bekomen (p=0.53). Er konden geen dosisresponscurven via het programma R gefit worden. Via ANOVA werd geen effect teruggevonden van de factor dosis (p=0.67). Metamitron blijkt dus onder gecontroleerde omstandigheden in de groeikast geen effect te hebben op een suikerbietpopulatie onder verschillende luchtvochtigheidsregimes. 5.3.3.3 Invloed inhibitor op de effectiviteit en selectiviteit van metamitron Voor beide onderdelen van de proef werd afzonderlijk het gemiddeld relatieve droge potgewicht ten opzichte van de controle berekend voor zowel de behandeling met 700 g/ha metamitron als deze met 700 g/ha metamitron + inhibitor. Resultaten zijn in onderstaande Figuur 20 vermeld.
39
Droog gewicht (% van gemiddelde controle)
200 180 160 140
700 g/ha metamitron 700 g/ha metamitron + 1000 g/ha PBO
120 100 80 60 40 20 0
Figuur 20: Droog gewicht per pot relatief t.o.v. controle bij behandeling met en zonder inhibitor (PBO: 1000 g/ha) voor de twee verschillende luchtvochtigheidsregimes rond tijdstip van behandeling (gemiddelde + SD).
5.3.3.4 Discussie Een hoge relatieve vochtigheid is positief voor de groei van planten indien er geen gebrek is aan andere factoren. Stomata zullen optimaal hun werk kunnen uitvoeren zonder teveel water te verliezen. Uit Sectie 4.3 volgt dat hogere luchtvochtigheden gunstig zijn voor bladopname, translocatie en finaal de werking van herbiciden (Hammerton, 1967; Gerber et al., 1983; Nalewaja & Woznica, 1985; Lundkvist, 1997a; Lundkvist, 1997b; Skuterud et al., 1998; Medd et al., 2001; Petersen & Hurle, 2001; Riethmuller-Haage et al., 2007). Zeer hoge luchtvochtigheden zullen de translocatie via het xyleem eerder afremmen. Metamitron blijkt een verhoogde activiteit te bezitten indien het toegepast wordt bij een hoge relatieve vochtigheid (May, 1983). In het geval van metamitron, dat voornamelijk via de bodem wordt opgenomen (WSSA, 2002), zal luchtvochtigheid vooral een rol gaan spelen naar de transpiratie-mogelijkheden van de plant en de hiermee gekoppelde opname van bodemvocht waarin metamitron is opgelost. Een zeer hoge luchtvochtigheid is echter gekenmerkt door een lagere zuigspanning van de lucht en dus een lagere transpiratie van de planten. Dit zou kunnen resulteren in een slechtere bestrijding. Langdurige lage luchtvochtigheden kunnen fysiologische aanpassingen veroorzaken, namelijk het voorkomen van dikkere cuticula en meer wasafzettingen. Daarnaast zullen lage luchtvochtigheden de regulatie van openen en sluiten van de stomata beïnvloeden (De Cauwer, 2011). Beide zullen leiden tot een lagere transpiratie en dus een lagere opname van bodemvocht. In deze proefopzet is er geen sprake van luchtvochtigheidsextremen. De verschillen in ED50 tussen hoge en lage relatieve luchtvochtigheid (RV) bij de drie populaties is zeer gering en niet significant. Dit kan veroorzaakt zijn door het toepassen van het adjuvant TIPO die de effecten van luchtvochtigheid kan compenseren door een goede verdeling van het product op de bladeren en een bevordering van de penetratie. Doordat met subirrigatie gewerkt werd zal het herbiciden vooral in de toplaag van de bodem aanwezig blijven. Hierdoor zal het aandeel van bladopname in totale opname gaan toenemen. De inwerking van het adjuvant TIPO kan dus de effecten van luchtvochtigheid verminderen. Daarnaast is de lage luchtvochtigheid niet echt laag te noemen. Het verschil tussen de ED50- en ED90-waarden blijkt zeer hoog te zijn. Dit kan te maken 40
hebben met de keuze van het model. Als we de standaardfouten in rekening brengen zal enkel de gevoelige populatie voldoende bestreden worden bij de aanbevolen dosis van 700 g/ha. Uit het ontbreken van een dosiseffect blijkt metamitron onder beide geteste luchtvochtigheden volkomen veilig te zijn voor suikerbiet. Het toepassen van de inhibitor PBO twee uur voor toepassing van metamitron geeft geen signifcante daling van het relatief droog potgewicht ten opzichte van diezelfde metamitron-toepassing zonder inhibitor. Wel is een trend te zien dat toepassing van een inhibitor kan zorgen voor een betere bestrijding. Voor de suikerbietpopulatie is er in vergelijking met proef B (Sectie 5.3.2.3) zelfs een stijging van het relatief potgewicht. Dit stemt overeen met de bevindingen van Proef B dat metamitron in suikerbiet weinig of niet gemetaboliseerd wordt door inwerking van monooxygenasen, maar wel hoofdzakelijk via deaminatie (Schmidt & Fedtke, 1977). In de proef met inhibitoren (Sectie 6) wordt hier verder op ingegaan.
5.3.4 PROEF D: INVLOED BODEMVOCHTGEHALTE OP DE EFFECTIVITEIT EN SELECTIVITEIT VAN METAMITRON
5.3.4.1 Invloed van bodemvochtgehalte op de effectiviteit van metamitron Uit de Levene-test bleek niet voldaan te zijn aan de voorwaarden van homoscedasticiteit (p=0.001). Na het doorlopen van de werkingswijze beschreven in 5.2.3 gaf het 4-parametermodel na boxcoxtransformatie de beste fit (lambda=1). De resultaten zijn weergeven in Tabel 15. Figuur 21 geeft voor de gevoelige populatie de dosis-responscurven weer bij hoog en laag bodemvochtgehalte. Tabel 15: Parameters (±SE) van het 4-parametermodel voor het droog gewicht per pot voor de drie populaties melganzenvoet samen met de ED90-waarden en de berekende resistentie-indexen. De c-parameter was niet significant verschillend van 0 en bijgevolg niet weergegeven in deze tabel (p>0.98) Populatie*
Bodemvocht
b-parameter
S
Laag Hoog Laag Hoog Laag Hoog
1.05 (0.46) 1.49 (0.57) 0.97 (0.38) 1.42 (0.44) 1.03 (0.53) 1.27 (0.75)
Rm Ra
-2
d-parameter [x10 ]
ED50 [g/ha]
Resistentie-index
20.99 (1.34) 152 (44) 34.63 (1.34) 133 (22) 15.22 (1.27) 269 (110) 21.13 (1.18) 360 (72) 12.60 (1.27) 299 (145) 17.28 (1.25) 226 (59)
1.77 2.71 1.97 1.70
ED90 [g/ha]
1224 585 2622 1694 2520 1268
(1185) (279) (2743) (1001) (3293) (1436)
*S: gevoelige populatie; Rm: metamitron-resistente populatie; Ra: atrazin-resistente populatie
Figuur 21: Dosis-responscurven voor de gevoelige populatie (S) voor na-opkomst behandeling met metamitron bij hoog (Nat) en laag (Droog) bodemvochtgehalte (controle=1).
41
5.3.4.2 Invloed van bodemvochtgehalte op de selectiviteit van metamitron in suikerbiet Er werd homogeniteit van de varianties bekomen op het 1% significantieniveau (p=0.01). Via ANOVA werd geen effect teruggevonden van de factor dosis (p=0.93). Metamitron blijkt dus zowel onder goede bodemvochtcondities als droogtestress geen bestrijdingseffect uit te oefenen op suikerbiet. 5.3.4.3 Invloed inhibitor op de effectiviteit en selectiviteit van metamitron
Droog gewicht (% van gemiddelde controle)
Voor beide experimenten werd afzonderlijk het gemiddeld relatieve droog potgewicht ten opzichte van de controle berekend voor zowel de behandeling met 700 g/ha metamitron als deze met 700 g/ha metamitron + inhibitor. Resultaten zijn in onderstaande Figuur 22 vermeld. 160 140
700 g/ha metamitron
120
700 g/ha metamitron + 1000 g/ha PBO
100 80 60 40 20 0 S-Laag
S-Hoog Rm-Laag Rm-Hoog Ra-Laag Ra-Hoog SB-Laag SB-Hoog
Figuur 22: Droog gewicht per pot relatief t.o.v. controle bij behandeling met en zonder inhibitor (PBO: 1000 g/ha) voor de twee verschillende bodemvochtgehaltes rond tijdstip van behandeling (gemiddelde + SD).
5.3.4.4 Discussie Uit Sectie 4.4 volgt dat een vochtige bodem gunstig is voor de werking van bodemherbiciden. Dit is ook terug te vinden in Tabel 15. De verschillen tussen toepassing van metamitron bij hoog en laag bodemvochtgehalte zijn echter niet significant (p>0.05). Specifiek voor metamitron, dat in opgeloste vorm voorkomt in het bodemvocht, zou een hoog bodemvochtgehalte bevorderend moeten werken ter bestrijding van melganzenvoet. Tijdens de proef werd echter gewerkt met subirrigatie. Hierbij is het toegepaste metamitron wel aanwezig in het bodemvocht maar is de verticale herverdeling mogelijks gering. Bijgevolg zal de bladwerking van metamitron mogelijk belangrijker zijn dan de bodemwerking. Indien planten vóór herbicidentoepassing langdurig aan droogtestress zijn blootgesteld, zullen ze zich aanpassen aan de heersende omstandigheden via de vorming van een dikkere cuticula en waslaag. Dit alles zal de bladopname reduceren en de planten zullen minder gaan transpireren om zo hun vochtverlies te beperken. De opname van bodemherbiciden zal dus ook in mindere mate doorgaan. Wordt de grond na droogtestress opnieuw bevochtigd dan kan het bodemherbicide alsnog opgenomen worden. Er wordt dus een betere bestrijding verwacht wanneer de grond genoeg vocht bevat waar metamitron in opgelost kan worden en zo opgenomen kan worden door de planten. In deze proef werden de planten (onderdeel “Laag”) een zestal dagen voor behandeling niet meer geïrrigeerd. De planten zullen echter maar na een tweetal dagen met droogtestress te maken krijgen, wat waarschijnlijk niet lang genoeg is om reeds fysiologische verschillen te gaan vertonen met de planten in grond op veldcapaciteit (bodemvochtgehalte “Hoog”). De snelheid van optreden van droogtestress is weersafhankelijk. Wel was er een kleurverschil te zien tussen beide onderdelen. De planten onder droogtestress zagen er bleker uit, wat ook te wijten kon zijn aan gebrekkige stikstofopname. 42
Indien de ED50-waarden bekeken worden, blijken de verschillen tussen de behandeling op vochtige of droge grond beperkt te zijn. De metamitron-resistente populatie (Rm) wordt zelfs slechter bestreden bij een hoog bodemvochtgehalte. Worden de ED90-waarden in rekening gebracht is het effect van bodemvochtgehalte duidelijker en in overeenstemming met de verwachte resultaten. Maar het bodemvochtgehalte kan ook een indirect effect hebben op de bestrijding. Droogtestress heeft een invloed op de dikte van de cuticula en waslaag en dus op de bladopname van metamitron. De periode van droogtestress zal dus bepalen op welke vorm van opname (blad- of bodemopname) het laag bodemvochtgehalte effect heeft. Bij langdurige droogtestress zal de werking van metamitron afhangen van de bladopname. Slechts de bestrijding van de gevoelige populatie bij veldcapaciteit slaagt goed bij de aanbevolen dosis van 700 g/ha metamitron. Alle andere behandelingen geven geen 90% reductie in droog gewicht. Aangezien er geen dosiseffect was van metamitron op suikerbiet zijn er geen selectiviteitsproblemen te verwachten onder droge en natte bodemcondities. Wordt de inhibitor PBO toegepast vóór gebruik van metamitron, dan is er een daling van het relatief droog potgewicht ten opzichte van een enkele behandeling met metamitron. Voor de melganzenvoetpopulaties zorgt de inhibitor PBO voor een betere bestrijding (niet significant, p>0.05) door inwerking op de P450 mono-oxygenasen, die deelnemen in het metabolisme van metamitron. Het is onduidelijk of de werking van PBO beïnvloed wordt door het bodemvochtgehalte.
5.3.5 PROEF F: INVLOED TOEPASSINGSTIJDSTIP OP DE EFFECTIVITEIT EN SELECTIVITEIT VAN METAMITRON
5.3.5.1 Invloed toepassingstijdstip op de effectiviteit van metamitron Uit de Levene-test bleek slechts op het 1% significantieniveau voldaan te zijn aan de voorwaarden van homoscedasticiteit (p=0.01). Er was geen effect van herhaling (p=0.70). Tabel 16 geeft de parameters weer voor het 4-parametermodel voor het droog gewicht per pot na een boxcoxtransformatie (lambda =1). Tabel 16: Parameters (±SE) van het 4-parametermodel voor het droog gewicht per pot voor de drie populaties melganzenvoet samen met de ED90-waarden en de berekende resistentie-indexen. De c-parameter was niet significant verschillend van 0 en bijgevolg niet weergegeven in deze tabel (p>0.33) Populatie
Tijdstip
S
Ochtend Ochtend Avond Avond Ochtend Ochtend Avond Avond Ochtend Ochtend Avond Avond
Rm
Ra
Sucroseoplossing
b-parameter
d-parameter
ED50 [g/ha]
X X X X X X -
0.97 (0.64) 1.40 (0.63) 0.79 (0.54) 1.41 (0.59) 1.89 (0.98) 1.78 (0.60) 0.52 (1.12) 1.44 (0.74) 1.57 (1.14) 1.38 (2.28) 2.05 (2.25) 1.20 (1.07)
0.31 (0.019) 0.51 (0.019) 0.31 (0.019) 0.52 (0.019) 0.18 (0.019) 0.22 (0.020) 0.24 (0.033) 0.18 (0.023) 0.14 (0.019) 0.16 (0.019) 0.10 (0.019) 0.15 (0.019)
55 (40) 81 (27) 69 (43) 97 (23) 233 (64) 321 (83) 160 (650) 283 (128) 196 (86) 145 (66) 251 (152) 199 (129)
Resistentie-index
ED90 [g/ha]
531 (581) 390 (184) - 1163 (2189) 461 (229) 4.24 744 (544) 3.96 1106 (563) 2.32 10917 (141810) 2.92 1302 (1392) 3.56 790 (920) 1.79 718 (1886) 3.64 733 (1041) 2.05 1238 (2479)
*S: gevoelige populatie; Rm: metamitron-resistente populatie; Ra: atrazin-resistente populatie
43
5.3.5.2 Invloed toepassingstijdstip op de selectiviteit van metamitron in suikerbiet Er werd homogeniteit van de varianties bekomen (p=0.20) en er werd geen effect teruggevonden van de factor dosis (p=0.93). Metamitron blijkt op ieder tijdstip van de dag selectief toepasbaar in een suikerbietpopulatie. 5.3.5.3 Invloed inhibitor op de effectiviteit en selectiviteit van metamitron
Droog gewicht (% van gemiddelde controle)
Voor de vier onderdelen van de proef werd afzonderlijk het gemiddeld relatieve droog gewicht per pot ten opzichte van de controle berekend voor zowel de behandeling met 700 g/ha metamitron als deze met 700 g/ha metamitron + inhibitor. Resultaten zijn in onderstaande Figuur 23 vermeld. 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0
700 g/ha metamitron + sucrose 700 g/ha metamitron 700 g/ha metamitron + 1000 g/ha PBO + sucrose 700 g/ha metamitron + 1000 g/ha PBO
Figuur 23: Droog gewicht per pot relatief t.o.v. controle bij behandeling met en zonder inhibitor (PBO: 1000 g/ha) voor ochtend- en avondtoepassingen met of zonder een sucrose-voorbehandeling (gemiddelde + SD).
5.3.5.4 Discussie Als de ED90-waarden uit Tabel 16 geanalyseerd worden, is er voornamelijk een hogere waarde terug te vinden bij toediening van sucrose. Dit zowel bij ochtend- als avondbehandeling. Bij de metamitronresistente populatie (Rm) is er een significant verschil (p<0.05) bij de avondbespuiting met en zonder sucrose (ED50). Wanneer een hoger sucrosegehalte aanwezig is in de plant verloopt de bestrijding dus slechter. Logisch gezien zou de avondtoepassing een slechter bestrijdingseffect moeten hebben, omdat ’s avonds de bladeren hogere gehaltes aan suiker bevatten na een dag fotosynthetiseren. De suikers worden dan ’s nachts verplaatst naar andere plantendelen. Dit komt overeen met Sulmon et al. (2004) en Couée et al. (2006) waar een toediening van 80 mM sucrose een negatief effect had op de bestrijding van Arabidopsis thaliana met atrazin. Zij verklaren dit door het voorkomen van grotere hoeveelheden psbA mRNA en D1-proteïnen. Belangrijk is het feit dat sucrose wordt toegediend, terwijl de plant voornamelijk glucose produceert. Dit zou het uitblijven van een betere avondbestrijding verklaren. Bij deze proef moet opgemerkt worden dat er slechts dosissen gebruikt zijn tot 1400 g/ha metamitron. Het is dus gevaarlijk om deze ED90-waarden te gaan interpreteren omdat de hoogste dosis, vooral voor avondbespuitingen, rond of onder de 90% afname in droog gewicht zit. Zowel bij de gevoelige populatie als bij de atrazin-resistente populatie zien we bij de ED50-waarden een betere bestrijding wanneer voor een ochtendtoepassing wordt gekozen. De verschillen zijn echter niet significant. Voor de metamitron-resistente populatie blijkt dit enkel zo te zijn wanneer de ED90 in rekening wordt gebracht. Door gebrek aan hoge dosissen is het onmogelijk om deze waarden correct te interpreteren. Er is dus meer onderzoek nodig waarbij er zowel hogere dosissen moeten worden toegepast als dosissen tussenin om een correcter verloop van de curven te kunnen fitten. 44
Suikerbiet bleek onder alle geteste omstandigheden op een veilig manier behandeld te kunnen worden met metamitron door het uitblijven van een dosiseffect. Het is duidelijk of de toepassing van de inhibitor (PBO) zorgt voor een vermindering van het potgewicht (niet significant: p>0.05).
45
6 DETOXIFICATIE VAN METAMITRON IN MELGANZENVOET EN SUIKERBIET 6.1 DOELSTELLING Het doel van deze proef is de bepaling van de hoeveelheid metamitron en zijn afbraakproducten deamino-metamitron en metamitron-N-glucoside na behandeling met verschillende inhibitoren via HPLC-analyse op bladstalen. Deze bladstalen zijn afkomstig van een gevoelige en twee metamitronresistente melganzenvoetpopulaties en een tolerante suikerbietvariëteit. Volgende onderzoeksvraag wordt gesteld: Is er een effect van de gebruikte inhibitor op de vorming van metabolisatieproducten van metamitron in gevoelige en resistente melganzenvoetpopulaties en in een suikerbietpopulatie? (OV7)
6.2 MATERIAAL EN METHODEN 6.2.1 PROEFOPZET De gebruikte testpopulaties zijn terug te vinden in Sectie 5.2.1 (Tabel 3). De verschillende melganzenvoetpopulaties werden eerst handmatig geschuurd om de kieming te bevorderen (Aper, 2008) en vervolgens uitgezaaid in plastiek potjes (7 cm x 7 cm x 7 cm) gevuld met vermiculiet, een inert substraat. Vervolgens werden de potjes in een groeikamer geplaatst met gemiddelde dag- en nacht temperatuur van respectievelijk 25 °C en 16 °C en een gemiddelde lichtintensiteit van 62.3 µmol m-2 s-1 gedurende 16 uur. De plantjes werden geïrrigeerd met een Hoagland-voedingsoplossing. Wanneer de planten het 4-bladstadium bereikten, werden ze verspeend in glazen flesjes gevuld met 10 ml voedingsoplossing. De planten werden gefixeerd met watten zodat enkel de wortels in de voedingsoplossing zaten. Om fotolyse van zowel metamitron als de inhibitoren te vermijden werden de flesjes gewikkeld in aluminiumfolie (Figuur 24). De planten werden eerst behandeld met een inhibitor om vervolgens de volgende dag behandeld te worden met metamitron aan een concentratie van 50 µM. Zowel de inhibitoren als metamitron werden opgelost in de Hoaglandvoedingsoplossing. Er werd 10 ml van deze oplossingen toegediend aan de planten. Tabel 17 geeft een overzicht weer van de gebruikte inhibitoren en concentraties. Drie dagen na behandeling werden de planten uit de potjes verwijderd, afgespoeld met gedestilleerd water, afgedept en gewogen ter bepaling van het versgewicht. Vervolgens werden de planten ingevroren bij -18 °C totdat analyse kon plaatsvinden. De proefgegevens zijn weergegeven in Tabel 18. Tabel 17: Gebruikte oplossingen proef inhibitoren
Behandeling 1 2 3 5 6
Actieve stoffen* Controle Metamitron Metamitron + PABA Metamitron + ABT Metamitron + PBO
Concentratie (µM) 50 50 + 5 50 + 30 50 + 30
*PABA: picolinezuur-t-butylamide; ABT: 1-aminobenzotriazool; PBO: piperonylbutoxide
PABA (picolinezuur-t-butylamide) (synthese aan vakgroep Organische Chemie, Faculteit Bioingenieurswetenschappen, Universiteit Gent) is een inhibitor van de deaminatie van metribuzin, eveneens een triazinon (Klamroth et al., 1989).
46
Figuur 24: Proefopzet proef inhibitoren: glazen flesjes gewikkeld in aluminiumfolie en watjes om de planten op hun plaats te houden zodat enkel de wortels in de nutriëntenoplossing zitten.
PBO (piperonylbutoxide) en ABT (1- aminobenzotriazool) (Fluka analytical, Sigma Aldrich Ltd., Israel) remmen de werking van de cytochroom P450 mono-oxygenasen (Preston, 2004), die verondersteld worden ten dele verantwoordelijk te zijn voor de deaminatie van metamitron (Bode et al., 2006). Op deze manier kan het metabolisme van metamitron deels stil gelegd worden en nagegaan in hoeverre dit een rol speelt bij de werking van metamitron. Tabel 18: Overzicht proefgegevens proeven detoxificatie van metamitron in melganzenvoet en suikerbiet
E1 Inzaai Zaden per pot voor populatie S; Rm; Ra Zaden per pot voor suikerbiet (2 cm diep) Aantal potjes per populatie Aantal planten per pot na uitdunning Verspenen Aantal parallellen Behandeling inhibitoren Behandeling metamitron Oogsten en invriezen Analyse: aantal herhalingen per combinatie van populatie x behandeling
09/08/2010 50; 70; 70 5 36 5 31/08/2010 8 voor behandeling 1 en 2, 6 voor behandeling 3,5 en 6 02/09/2010 03/09/2010 06/09/2010 4*
E2 25/08/2010 50; 70; 70 5 36 5 22/09/2010 5 herhalingen 23/09/2010 24/09/2010 27/09/2010 4**
*3 herhalingen voor controle bij populatie Ra **3 herhalingen voor behandeling 3 bij populatie SB
6.2.2 HPLC-ANALYSE De analyses werden uitgevoerd aan de Faculteit Farmaceutische Wetenschappen van de Universiteit Gent. De diepgevroren planten werden vermalen met ± 20 ml vloeibare stikstof in een mortier. Tweemaal 1 ml methanol:water (95:5) werd toegevoegd en het mengsel van solvent en plantenmateriaal werd in een gelabeld epje van 2 ml gegoten. Dit alles vond plaats in een ijsbad. De stalen werden vervolgens 10 min. gecentrifugeerd op 5000 g. Het supernatans werd in een gelabelde proefbuis overgegoten en de pellet werd opnieuw aangelengd met 1 ml van het methanol:water mengsel (95:5) en nadien gevortext. Vervolgens werd het staal terug 10 min. gecentrifugeerd en het supernatans opnieuw afgegoten. Dit procédé werd nochmaals herhaald om finaal tot een supernatans van 4 ml te komen. Dit supernatans werd geëvaporeerd onder een continue stroom van stikstofgas en heropgelost in 200 µl methanol: water (95:5). Na vortexen werd het staal opgezogen met een pipet om via een filter in een verkleind HPLC-vialtje te worden gebracht. Deze stalen werden onderworpen aan een HPLC-analyse, gebaseerd op Bode et al. (2006): de mobiele fase startte met water (+0.025 % mierenzuur) en acetonitril (+0.025 % mierenzuur) met als verhouding 95:5 (v/v). Dit mengsel werd aangehouden gedurende 5 min, waarna het percentage acetonitril lineair steeg van 5 tot 25 % gedurende de volgende 35 min en daarna van 25 naar 100 % gedurende 10 min. Daarna 47
werd 100 % acetonitril aangehouden gedurende 5 min. Tot slot keerde het systeem terug naar zijn initiële condities die gedurende 15 min werden aangehouden. De piekoppervlakte voor metamitron en het afbraakproduct metamitron-N-glucoside werd gemeten bij 306 nm, terwijl de piekoppervlakte voor het afbraakproduct deamino-metamitron gemeten werd bij 288 nm. De gemeten piekoppervlakten werden omgerekend per gram vers gewicht.
6.2.3 VERWERKING De data werd onderverdeeld in verschillende groepen die een combinatie vormden van populatie en behandeling. Er werd besloten de beide experimenten afzonderlijk te behandelen door verschil in grootte-orde van de resultaten en pas in laatste fase de resultaten te vergelijken. Na onderverdeling werd per experiment een Levene-test uitgevoerd voor metamitron en beide afbraakproducten om homogeniteit van de varianties te controleren. Alle componenten in beide experimenten bleken homogene varianties te hebben (p>0.14). Vervolgens werden deelsets aangemaakt voor zowel metamitron, deamino-metamitron en metamitron-N-glucoside die nogmaals onderverdeeld werden per gebruikte inhibitor of populatie. Binnen deze datasetjes werd een Tukey HSD-test uitgevoerd om de resultaten twee aan twee te gaan vergelijken en zo de significante verschillen tussen enerzijds de populaties en anderzijds de inhibitoren aan te tonen.
6.3 RESULTATEN EN DISCUSSIE 6.3.1 RESULTATEN De resultaten zijn weergegeven in Tabel 20. Wat als eerste opvalt is de uiteenlopende resultaten tussen beide experimenten. Algemeen zijn de resultaten uit experiment 2 veel lager in vergelijking met experiment 1. Nochtans is de periode tussen behandeling en staalname gelijk, werden dezelfde producten en voedingsoplossing gebruikt onder gelijkende omstandigheden. Waarschijnlijk waren er verschillen in de opname van metamitron uit de voedingsoplossing maar de oorzaak hiervan is onbekend. Dit kan te wijten geweest zijn aan een verschil in luchttemperatuur en de temperatuur van de voedingsoplossing. Dit kan een invloed gehad hebben op enerzijds de opname van metamitron en anderzijds de vorming van (on)detecteerbare afbraakproducten. Daarnaast kan de oplosbaarheid van metamitron in de voedingsoplossing verschillend zijn geweest door verschil in temperatuur bij het aanmaken van de oplossing.
6.3.2 DISCUSSIE Significante verschillen tussen de verschillende inhibitoren binnen éénzelfde populatie zijn aangeduid in Tabel 20. Als PABA vergeleken wordt met de toepassing zonder inhibitor zijn er meer afbraakproducten aanwezig bij toepassing van PABA voor beide resistente populatie Ra en Rm. Er is echter geen significant verschil. De grootste verschillen zijn terug te vinden tussen de inhibitoren PABA en ABT. Dit is te verklaren door hun verschillende werkingswijze. Bij PABA zijn grotere hoeveelheden afbraakproducten gedetecteerd wat erop wijst dat de werking van deze inhibitor geringer is in vergelijking met ABT bij resistente melganzenvoet. Het metabolisme van metamitron gaat dus in mindere mate door bij resistente melganzenvoet behandeld met ABT. Dit resultaat is ook duidelijk te zien bij vergelijking van een behandeling met ABT en een behandeling zonder inhibitor waar in het laatste geval meer afbraakproducten worden gedetecteerd. PBO remt de afbraak van metamitron in mindere mate in de gevoelige populatie in vergelijking met ABT en PABA. De verhouding tussen deamino-metamitron en metamitron-N-glucoside bij de melganzenvoetpopulaties is significant hoger bij PABA dan bij ABT (Tabel 19). Vooral bij ABT en in mindere mate bij PBO is er vooral een daling van deamino-metamitron in vergelijking met de toepassing van enkel metamitron. ABT en PBO inhiberen dus de enzymen verantwoordelijk voor deaminatie. Uit Bode et al. (2006) blijken vooral de P450 mono-oxygenasen hiervoor verantwoordelijk te zijn. 48
De verhouding tussen deamino-metamitron en metamitron-N-glucoside blijkt voor de drie melganzenvoetpopulaties voor éénzelfde inhibitor niet significant verschillend te zijn (Tabel 19). Daarentegen is de verhouding veel kleiner bij de suikerbietpopulatie. Suikerbieten metaboliseren metamitron dus voornamelijk via N-glucosylatie en slechts zeer gering via deaminatie. Uit onderzoek van Aper (2011) met 14C-gelabeld metamitron bleek na bladopname de deaminatie een belangrijkere rol te spelen. Het hoge glucosegehalte in de wortel van suikerbiet kan een oorzaak zijn van het hoge aandeel aan N-glucosylatie na bodemopname. Dit kan ook de resultaten uit Sectie 5 deels verklaren, waar er gewerkt werd met PBO en zowel blad- als bodemopname van metamitron. Inwerking van PBO kan het metabolisme door mono-oxygenasen inhiberen na bladopname van metamitron. Opmerkelijk is ook dat er quasi geen metamitron aanwezig is in suikerbiet en de afbraakproducten in lagere hoeveelheden aanwezig zijn in verhouding met de melganzenvoetpopulaties. Het is onbekend of dit te wijten is aan geringe opname van metamitron en/of door snel metabolisme van metamitron. Indien dit laatste zou voorkomen is het duidelijk dat ook de afbraakproducten snel gemetaboliseerd worden tot voor dit protocol ondetecteerbare moleculen. Tabel 19: Verhouding deamino-metamitron/metamitron-N-glucoside voor de verschillende populaties bij toepassing van verschillende inhibitoren
PABA ABT PBO
S 0.11 0.15 0.07 0.08
Rm 0.08 0.10 0.05 0.07
Ra 0.13 0.15 0.06 0.08
SB 0.01 0.01 0.01 0.02
Naast de onderlinge vergelijkingen tussen de inhibitoren binnen éénzelfde populatie werden voor dezelfde inhibitor ook vergelijkingen uitgevoerd tussen de populaties. Enkel de significante verschillen (α = 0.05) die in beide experimenten voorkomen worden besproken. Indien geen inhibitor wordt toegepast of er wordt PABA toegepast, dan zijn er significante verschillen tussen suikerbiet en alle melganzenvoetpopulaties voor zowel de hoeveelheid metamitron als deamino-metamitron. Wordt PBO toegepast dan zijn er significant lagere hoeveelheden metamitron aanwezig in suikerbiet in vergelijking met beide resistente melganzenvoetpopulaties. Toepassing van ABT vóór behandeling zorgt voor significant lagere waarden metamitron en deamino-metamitron in suikerbiet in vergelijking met beide resistente populaties. Daarnaast zijn er significant lagere hoeveelheden metamitron in de gevoelige populatie in vergelijking met de twee resistente populaties. Het effect van hogere aanwezigheid van metamitron bij resistente populaties lijkt dus het meest uitgesproken te zijn bij behandeling met de inhibitor ABT, wat te wijten kan zijn aan lagere metabolisatie, eventueel naar ondetecteerbare afbraakproducten.
49
Tabel 20: Overzicht resultaten inhibitorenproef. De resultaten gevolgd door een verschillende letter zijn significant verschillend via Tukey HSD (α = 0.05) binnen éénzelfde populatie, experiment en gedetecteerde stof
Populatie
Inhibitor
S
PABA ABT PBO PABA ABT PBO PABA ABT PBO PABA ABT PBO
Rm
Ra
SB
Gemiddelde piekoppervlakte per gram versgewicht 5 (standaarddeviatie) [x10 ] Experiment 1 Metamitron Deaminometamitron a 176.5 (41.44) 5.7 (0.58) b 127.1 (53.44) 3.8 (0.94) c 102.0 (48.02) 1.2 (0.54) b 131.2 (63.66) 2.7 (1.70) 211.8 (44.39) 4.8 (1.31) 209.7 (68.58) 5.4 (2.11) 257.3 (102.8) 2.8 (1.27) 200.9 (81.70) 4.1 (3.72) ab 207.8 (57.41) 6.1 (2.13) a 289.0 (69.83) 8.8 (2.38) b 259.5 (57.93) 2.0 (0.74) ab 158.0 (88.95) 4.5 (2.65) 1.0 (1.13) 0.2 (0.14) 1.3 (0.70) 0.2 (0.08) 1.4 (0.51) 0.2 (0.09) 1.3 (0.79) 0.2 (0.14)
Metamitron-Nglucoside a 43.8 (4.29) ab 31.7 (12.40) b 16.9 (6.19) ab 39.1 (17.64) 56.2 (22.51) 59.2 (17.54) 40.7 (13.69) 53.2 (25.00) 38.5 (15.62) 50.9 (10.55) 33.8 (9.20) 41.6 (25.47) 25.6 (14.66) 17.9 (4.95) 37.9 (16.11) 24.8 (12.95)
Gemiddelde piekoppervlakte per gram versgewicht 5 (standaarddeviatie) [x10 ] Experiment 2 Metamitron DeaminoMetamitron-Nmetamitron glucoside ab 40.7 (13.73) 0.8 (0.24) 7.4 (3.38) a 76.0 (4.12) 1.6 (0.44) 8.7 (5.43) b 53.1 (22.87) 0.4 (0.33) 7.3 (4.42) ab 62.5 (19.99) 1.0 (0.68) 10.3 (5.26) b ab 45.9 (13.07) 1.1 (0.61) 13.9 (4.27) a a 106.6 (54.24) 2.0 (1.05) 17.7 (7.50) a b 110.2 (9.53) 0.4 (0.05) 13.4 (1.10) ab ab 75.3 (3.51) 1.1 (0.09) 20.1 (2.38) b 53.4 (4.89) 1.3 (0.34) 13.3 (1.77) b 73.3 (8.70) 1.8 (0.52) 13.6 (4.40) a 124.1 (16.79) 1.1 (0.28) 16.1 (2.98) ab 83.5 (46.52) 1.1 (0.51) 17.1 (6.42) b 1.0 (0.57) 0.1 (0.05) 8.3 (4.32) ab 3.0 (3.96) 0.04 (0.01) 13.2 (5.46) a 2.6 (1.62) 0.2 (0.17) 20.5 (6.85) ab 1.3 (2.20) 0.5 (0.86) 16.0 (3.03)
50
7 VERSCHILLEN IN HERBICIDENACTIVITEIT TUSSEN PSIIREMMERS METAMITRON , METRIBUZIN EN TERBUTHYLAZIN 7.1 DOELSTELLING Het doel van deze proef is het effect bestuderen van fotosysteem II-remmers (PSII) op de chlorofylen caroteeninhoud, malondialdehydeconcentratie en fluorescentie van een gevoelige en twee resistente melganzenvoetpopulaties. De activiteit van metamitron wordt vergeleken met het nauw verwante herbicide metribuzin en terbuthylazin. Is er een verschil in herbicidenactiviteit op gevoelige en resistente melganzenvoetpopulaties tussen metamitron, metribuzin en terbuthylazin? (OV8)
7.2 MATERIAAL EN METHODEN De opname en werking van metamitron is in veel gevallen wispelturig en dit zou, naast metabolisme, te wijten kunnen zijn aan een geringe affiniteit van het herbicide met de bindingsplaats in de chloroplasten. Daarnaast zijn de verschillen in opname en werking tussen populaties zonder en met de Ser264 -> Gly mutatie na een behandeling met metamitron kleiner dan bij behandelingen met andere PSII-remmers (Aper, 2011). Deze proef onderzoekt de reactie van het herbicide ter hoogte van de bindingsplaats via fluorescentie en naar de vervolgreacties: de afbraak van de plantpigmenten chlorofyl en carotenoïden en de productie van malondialdehyde (dat een maat is voor de peroxidatie van membranen) (Devine et al., 1993).
7.2.1 PROEFOPZET Proef H werd uitgezaaid in bakken. Er werd gewerkt met een gevoelige en twee resistente melganzenvoetpopulaties (Tabel 3). De zaden werden eerst geschuurd om de kieming te stimuleren (Aper, 2008). De verschillende populaties werden in rijen ingezaaid waarbij de drie populaties telkens twee maal per bak werden ingezaaid. In totaal werden drie herhalingen per populatie per behandeling uitgezaaid samen met drie herhalingen ter controle. Deze controle werd enkel behandeld met het adjuvant TIPO. Om de kieming te stimuleren werd indien nodig bovengronds verneveld met een plantenspuit om de grond voldoende vochtig te houden indien de subirrigatie niet volstond. De bakken werden in de serre op de faculteit geplaatst. Voor beide proeven werd gewerkt met een grondmengsel bestaande uit gestoomde zandleemgrond en potgrond (verhouding 1:1). De eigenschappen van de zandleemgrond zijn terug te vinden in Tabel 4. De gevoelige en de Rm-populatie werden behandeld in het 4-bladstadium. De Ra-populatie werd vanwege zijn tragere kiemsnelheid behandeld in het 2-bladstadium. De behandeling werd uitgevoerd met dezelfde spuitboom beschreven in Sectie 5.2.1. Tabel 21 geeft een overzicht weer van de gebruikte actieve stoffen, handelsproducten en dosissen. Als adjuvant werd TIPO (842 g/l veresterde koolzaadolie; Comptoir Commercial des Lubrifiants) gebruikt. De verschillende bakken of trays werden gelabeld en apart behandeld. Er werden metingen uitgevoerd op de dag van behandeling en vervolgens 2, 5, 10, 15 en 20 dagen na behandeling. Een overzicht van de proefgegevens is weergegeven in Tabel 22.
51
Tabel 21: Overzicht van de gebruikte producten en dosissen
Herbicide Controle Metamitron1 Metribuzin2 Terbuthylazin3
Dosis (g/ha) 700 525 750
1
Adjuvant Dosis (l/ha) 1 1 1 1
2
3
GOLTIX SC (700g/l): Makhteshim-Agan Holland BV; PATAPROP WG (70% (w/w)): Hermoo ; TYLLANEX SC (500g/l): Makhteshim-Agan Israël BV Tabel 22: Overzicht proefgegevens proef H
H Inzaai Aantal zaden per rij (S; Rm; Ra) Minimumtemperatuur in serre (dag/nacht) Uitdunning naar 12 planten per rij Behandeling Staalname
25/01/2011 180; 220;180 23 °C/16 °C 13/02/2011 16/02/2011 16-18-21-26/02/2011 en 03-08/03/2011
7.2.2 ANALYSES De uit te voeren analyses zijn gebaseerd op Devine et al. (1993). In deze proef werden de analyses beperkt tot chlorofylinhoud, caroteengehalte en malondialdehydegehalte. De analyses worden verder aangevuld met fluorescentiemetingen. 7.2.2.1 Meting chlorofyl- en carotenoïdeninhoud Het protocol is gebaseerd op Van Labeke (2009). Per populatie en per behandeling werden 12 planten gepoold per 4. Deze werden homogeen vermalen en stalen van 50 mg werden genomen. Per 4 planten werd zowel een staal afgewogen voor het bepalen van de chlorofylinhoud als voor de malondialdehydebepaling (zie 7.2.2.2). Het afgewogen staal werd vermalen met vloeibare stikstof en in een met aluminiumfolie ingewikkeld flesje gebracht waarbij 2.85 ml aceton (80 %) werd bijgevoegd. Dit werd 24 uur bij -18 °C bewaard waarna absorptie bij 470, 647 en 664 nm werd gemeten in een spectrofotometer (Infinite 200 Pro, Tecan Group Ltd). Volgende formules werden gebruikt om het gehalte aan chlorofyl en carotenoïden te berekenen (eenheid: µg ml-1). Chl a = 12.25*A664 – 2.55*A647 Chl b = 20.31*A647 – 4.91*A664 Chl a+b = 17.76*A647 + 7.34*A664 Carotenoïden = (1000*A470 – 1.82*Chl a – 85.02*Chl b)/198 Waarbij A470, A647 en A664 de gemeten absorpties zijn bij de respectievelijke golflengtes. Tot slot werden deze waarden omgerekend naar µg/ g vers gewicht. 7.2.2.2 Malondialdehydebepaling (MDA-bepaling) Malondialdehyde werd bepaald volgens het protocol weergegeven door Hodges et al. (1999). Voor de monstername wordt verwezen naar Sectie 7.2.2.1. Na doorlopen van het protocol worden de absorpties gemeten bij 440, 532 en 600 nm met behulp van een spectrofotometer. 7.2.2.3 Fluorescentiemeting Wanneer chlorofyl-a-moleculen geëxciteerd worden door invallende fotonen (b.v. van zonlicht), zullen deze snel terugkeren naar hun grondtoestand. Hierbij kan de excitatie-energie afgegeven worden via verschillende wegen: 52
1) Resonantie: transfer van excitatie-energie naar een naburige chlorofyl-a-molecule 2) Fotosynthese: transfer naar een elektronenacceptor om de fotosynthese aan te drijven 3) Fluorescentie: er wordt fluorescente straling uitgezonden 4) Fosforescentie: er wordt fosforescente straling uitgezonden (komt eerder zelden voor) 5) Warmte-dissipatie: de energie wordt uitgezonden als warmte. Wanneer de fotosynthese geremd wordt (door b.v. stress, herbicidebehandeling), zal het aandeel van de andere wegen stijgen, omdat de overmaat energie afgegeven moet worden. De fractie die geëxciteerd wordt via fluorescentie is bij normale fotosynthetische activiteit zeer laag, namelijk van 0.6 tot maximaal 5% (Steppe, 2010). Na remming van de fotosynthese zal de fluorescente straling stijgen en een maat geven voor de remming en efficiëntie van de fotosynthese. Een goede beschrijving van chlorofyl-fluorescentiemetingen is terug te vinden in Steppe (2010) of in Aper (2008). Om de fluorescentiemetingen uit te voeren werd gebruik gemaakt van het draagbare toestel Pocket PEA (Hansatech Instruments Ltd). Verschillende parameters worden door het toestel gemeten. Chlorofyl-a-fluorescentie parameters laten toe om populaties in te delen naar gevoeligheid ten aanzien van PSII-remmers. De verhouding FV/FM is volgens Aper (2008) een belangrijke parameter om de inhibitie van de PSII-reactiecentra te meten en dus het herbicideneffect te beoordelen. FV is het verschil tussen het maximale fluorescentieniveau FM en de basisfluorescentie F0. De geteste bladeren (de eerste echte bladeren) werden eerst minimum 20 minuten aan donkeradaptatie onderworpen. Hierdoor waren alle reactiecentra van de PSII-centra ‘open’ en kon de basisfluorescentie (F0) gemeten worden. Vervolgens werd gedurend 1 seconde een saturatiepuls gegeven (3500 µmol m-2 s1 ) zodat alle reactiecentra volledig gereduceerd werden en FM gemeten kon worden. De verhouding FV/FM is een maat is voor de maximaal fotosynthese-efficiëntie van PSII. Onder normale omstandigheden is dit voor alle planten ongeveer gelijk aan 0.83. Een lagere waarde toont aan dat een deel van de reactiecentra van PSII geblokkeerd zijn. Dit komt voor na toepassing van een PSIIremmer of als de planten in een stressomgeving staan (Aper, 2008).
7.3 RESULTATEN EN DISCUSSIE 7.3.1 RESULTATEN 7.3.1.1 Resultaten chlorofyl- en carotenoïdeninhoud De resultaten werden geplot relatief ten opzichte van de controle op dezelfde dag na behandeling. De figuren zijn terug te vinden in Bijlage 1. Voor zowel de chlorofyl- als de carotenoïdeninhoud is in Figuur 30 en Figuur 34 het verloop van de controle weergegeven voor de drie verschillende populaties. Daarnaast is in Figuur 31 t.e.m. 33 en Figuur 35 t.e.m. 37 het verloop per populatie aangeven relatief ten opzichte van de controle voor de drie verschillende herbiciden. Voor zowel chlorofyl- als carotenoïdeninhoud is een stijging te zien van de controles. Beide resistente populaties (Rm en Ra) vertonen eerst een stijging ten opzichte van de controle om 10 dagen na behandelen terug te vallen op de controlewaarden. 7.3.1.2 Resultaten malondialdehydebepaling De resultaten werden op dezelfde manier weergegeven zoals beschreven in sectie 7.3.1.1 in Figuur 38 t.e.m. 41 .De controles verhogen in malondialdehydegehalte tot 10 dagen na behandeling. Voor de gevoelige populatie S is een sterke stijging te zien, terwijl de Ra-populatie een schommelend verloop geeft rond de controlewaarden. Voor de populatie Rm is een stijging te zien tot 5 dagen na behandeling, waarna een terugval zichtbaar is tot de controlewaarden. 53
7.3.1.3 Resultaten fluorescentiemeting De resultaten voor de fluorescentieparameter FV/FM zijn weergegeven in Tabel 23 met de bijhorende significante verschillen binnen éénzelfde populatie (TukeyHSD; α=0.05). Daarnaast werden de resultaten voor de verhouding FV/FM vergeleken tussen de onbehandelde populaties (controle). Hierbij werden significante verschillen (TukeyHSD; α=0.05) gevonden tussen de de drie populaties onderling op de dag van behandeling (p=0.002). Twee dagen na behandeling was de gevoelige populatie (S) nog significant verschillend (p<0.001) van beide resistente populaties (Rm en Ra), terwijl na vijf dagen dit enkel nog voor de Rm populatie geldde (p=0.03).
7.3.2 DISCUSSIE Het chlorofylgehalte stijgt bij het ouder worden van de planten tot gemiddeld 900 µg/g vers gewicht voor de drie verschillende onbehandelde melganzenvoetpopulaties. De gevoelige populatie stijgt sterk in chlorofylinhoud na behandeling met metribuzin. Deze stijging is in strijd met het bestrijdingseffect van metribuzin op een gevoelige populatie. De stijging kan verklaard worden door de manier van staalname. Er werd telkens 50 mg bladmateriaal verzameld. De bestreden planten waren 10 dagen na toepassing al sterk aan het verdrogen. Door het geringe vochtpercentage in deze bladeren is het chlorofylgehalte hoger, wat de abnormale stijging verklaren. Ook na de toepassing van metamitron en terbuthylazin bij de gevoelige populatie zien we een stijging van de chlorofylinhoud. Deze stijging is evenredig met de stijging van de onbehandelde planten, maar is ook te wijten aan het geringere vochtgehalte van de bemonsterde planten. Visueel vergeelden de planten en stierven ze vervolgens af wat ook het gebrek aan resultaten 15 dagen na behandeling verklaart. Om een effectieve daling van het chlorofylgehalte te zien, wat ook geïllustreerd wordt in Figuur 8 zouden er stalen genomen kunnen worden van een vast drogestofgewicht i.p.v. verse biomassa. Beide resistente populaties reageren op een behandeling met de PSII remmer door hun chlorofylconcentratie te verhogen. Deze piek is voor de metamitron-resistente populatie (Rm) gelegen op 5 dagen na behandeling terwijl voor de atrazin-resistente populatie (Ra) de piek gespreid is tussen 2 en 5 dagen na behandeling. Dit stemt overeen met de bevindingen van Ketel (1996) waar een behandeling met metamitron aan 175 en 87.5 g/ha een chlorofylstijging veroorzaakte in een gevoelige melganzenvoetpopulatie. Resistente populaties reageren dus op eenzelfde manier na toepassing van hogere dosissen. Erna komen de chlorofylgehaltes terug overeen met de onbehandelde controles. Voor het carotenoïdengehalte is een gelijkaardige verloop te zien als bij het chlorofylgehalte. Bij alle onbehandelde melganzenvoetpopulaties neemt het carotenoïdengehalte toe met de leeftijd van de plant. De piek voor de met herbicide behandelde Rm-populatie komt voor op 5 dagen na behandeling, voor de Ra-populatie op 2 dagen na behandeling, waarna ook beide populaties gelijke gehaltes aan carotenoïden aannemen als de onbehandelde controle. Zowel voor chlorofyl als voor carotenoïden is er geen duidelijk effect van de gebruikte PSII-remmer. Het chlorofyl- en carotenoïdenverloop van de gevoelige populatie (S) wordt weergegeven in respectievelijk Figuur en 26. Malondialdehyde (MDA) is een maat voor de peroxidatie van de membranen. Een stijging van MDA wijst op een hogere peroxidatie van membranen dat veroorzaakt wordt door radicale zuurstofmoleculen en triplet chlorofylmoleculen (Devine et al., 1993; Aper, 2008). Het vrijstellen van deze moleculen is het gevolg van overgeëxciteerde chlorofylmoleculen die hun energie niet kunnen afgeven in het fotosyntheseproces door blokkering van het elektronentransport na binding van PSIIremmers op het D1-proteïne. Hoe hoger de stijging aan MDA, hoe meer herbicide er gebonden is en hoe sneller de plant zal afsterven. De controles voor alle populaties vertonen een stijging van 150 % tot ongeveer 1.75 x106 nmol/g vers gewicht na 10 dagen. Een verklaring hiervoor is niet gekend, 54
Chlorofylgehalte (t.o.v. controle)
S Metamitron
3.5 S Metribuzin
3
S Terbuthylazin
2.5 2 1.5 1 0.5 0 0
5
10
15
20
Dagen na behandeling Figuur 25: Gemiddeld chlorofylgehalte (±SD) relatief ten opzichte van de gemiddelde controle (=1; op dezelfde dag na behandeling) voor de gevoelige melganzenvoetpopulatie (S) bij behandeling met drie verschillende PSII-remmers.
Carotenoïdengehalte (t.o.v. controle)
4
2.5 S Metamitron S Metribuzin
2
S Terbuthylazin 1.5
1
0.5
0 0
5
10
15
20
Dagen na behandeling Figuur 26: Gemiddeld carotenoïdengehalte (±SD) relatief ten opzichte van de gemiddelde controle (op dezelfde dag na behandeling) voor de gevoelige melganzenvoetpopulatie (S) bij behandeling met drie verschillende PSII-remmers.
maar de stijging zou te wijten kunnen zijn aan een stijging van het instralingsniveau tijdens de proef (overgang winter-lente), die voor een overmaat aan energie op chloroplastniveau zou kunnen zorgen. De S-populatie vertoont de sterkste stijging na toepassing van metribuzin 10 dagen na behandeling. Toepassing van metamitron heeft een stijging na 5 dagen. Dit is ook weergegeven in Figuur 27. Voor de Rm-populatie is er 5 dagen na toepassing van metribuzin en metamitron een piek te zien. Deze piek verdwijnt echter en de MDA-gehaltes stemmen vervolgens terug overeen met de onbehandelde controle. Na toepassing van terbuthylazin is er een geringe piek aanwezig na 2 dagen, waarna ook een terugval plaatsvindt (zie Figuur 28). De stijging in MDA-gehalte is van een kleinere proportie dan bij de gevoelige populatie (S). Deze populatie ondervindt dus geringe schade na toepassing van een PSII-remmer, maar is in staat om te recupereren. Dit is te verklaren door de gewijzigde bindingsplaats op het D1-proteïne. Slechts een fractie van het herbicide zal kunnen binden aan het proteïne en schade veroorzaken, wat een kleine piek van MDA teweeg kan brengen door productie van radicalen. Een verhoogde aanmaak van chlorofyl zoals hoger beschreven kan de getroffen moleculen compenseren. De Ra-populatie vertoont grotere schommelingen rond de controlewaarden na toepassing van metamitron en terbuthylazin. Er kan in deze populatie waarschijnlijk nog minder van de PSII-remmer daadwerkelijk binden op het proteïne wat het uitblijven van een piek in MDA kan verklaren (zie Figuur 29). Na toepassing van metribuzin bij de Rapopulatie zien we wel een soortgelijke terugval als bij de Rm-populatie. De resultaten van de fluorescentieparameter FV/FM uit Tabel 23 tonen zoals verwacht dat de waarde van de parameter constant blijft voor onbehandelde planten. Deze waarde komt voor de gevoelige populatie overeen met de algemeen teruggevonden 0.83 voor alle plantensoorten (Steppe, 2010). Deze waarde is wel significant (α=0.05) hoger bij de gevoelige populatie, en daarbij heeft de Rmpopulatie nog significant hogere parameterwaarden dan de Ra-populatie. Dit is in tegenstelling met Smis (1991) die beweerde dat er geen verschil is in efficiëntie van het fotosyntheseapparaat tussen gevoelige en resistente melganzenvoetpopulaties. De gevoelige populatie bereikt na toepassing van de drie verschillende PSII-remmers snel een zeer kleine waarde (<0.20). De reductie in efficiëntie is het kleinst na toepassing van metamitron.
55
Voor zowel de Rm- als Ra-populatie is er geen significant effect na toepassing van terbuthylazin tegenover de controle. Deze PSII-remmer heeft dus geen invloed op de efficiëntie van het fotosyntheseapparaat van resistente populaties voor de in de proef toegepaste doseringen. Voor zowel metamitron als metribuzin zijn de verschillen niet significant binnen éénzelfde populatie op dezelfde tijdstippen na behandeling. Wel is een sterkere daling te zien na toepassing van metribuzin. De waarde van de parameter schommelt voor resistente populaties tussen de 0.6 à 0.7. Dit wijst erop dat een deel van de reactiecentra toch bezet zijn met metribuzin of metamitron en hun werking niet kunnen uitvoeren. Dit wordt veroorzaakt door target-site resistentie. De betere waarden voor metamitron kunnen wijzen op verhoogd metabolisme van het herbicide waardoor minder metamitron molecules de bindingsplaats kunnen bereiken. In tegenstelling met de MDA-productie blijft de efficiëntieparameter constant op de lagere waarde en is er in het tijdsbestek van de proef (tot 15 dagen na behandeling) nog geen sprake van een zichtbare recuperatie. 2.5
S Metamitron
Rm Metamitron Rm Metribuzin
S Metribuzin
5
MDA-gehalte (t.o.v. controle)
MDA-gehalte (t.o.v. controle)
6
S Terbuthylazin 4
3
2
2 Rm Terbuthylazin
1.5
1
0.5
1 0
0 0
5
10
15
20
Dagen na behandeling
Figuur 27: Gemiddeld MDA-gehalte (±SD) relatief ten opzichte van de gemiddelde controle (op dezelfde dag na behandeling) voor de gevoelige melganzenvoetpopulatie (S) bij behandeling met drie verschillende PSII-remmers.
0
5
10
15
20
25
Dagen na behandeling Figuur 28: Gemiddeld MDA-gehalte (±SD) relatief ten opzichte van de gemiddelde controle (op dezelfde dag na behandeling) voor de metamitronresistente melganzenvoetpopulatie (Rm) bij behandeling met drie verschillende PSII-remmers.
2
MDA-gehalte (t.o.v. controle)
1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6
Ra Metribuzin
0.4
Ra Terbuthylazin
0.2
Ra Metamitron
0 0
5
10
15
20
25
Dagen na behandeling Figuur 29: Gemiddeld MDA-gehalte (±SD) relatief ten opzichte van de gemiddelde controle (op dezelfde dag na behandeling) voor de atrazinresistente melganzenvoetpopulatie (Ra) bij behandeling met drie verschillende PSII-remmers.
56
Tabel 23: Resultaten voor de fluorescentieparameter FV/FM voor de verschillende melganzenvoetpopulaties. De resultaten gevolgd door een verschillende letter zijn significant verschillend via Tukey HSD (α = 0.05) binnen éénzelfde populatie
Populatie S
Rm
Ra
Behandeling Controle Metamitron Metribuzin Terbuthylazin Controle Metamitron Metribuzin Terbuthylazin Controle Metamitron Metribuzin Terbuthylazin
0 0.83 (0.006)a
0.81 (0.005)ab
0.80 (0.008)ab
2 0.84 (0.003)a 0.37 (0.096)b 0.14 (0.061)cd 0.25 (0.091)c 0.82 (0.003)a 0.65 (0.088)bc 0.55 (0.146)c 0.79 (0.025)ab 0.81 (0.011)a 0.65 (0.085)ce 0.56 (0.084)cd 0.81 (0.007)a
Aantal dagen na behandeling 5 10 a 0.84 (0.005) 0.82 (0.020)a c 0.19 (0.067) 0.20 (0.210)c 0.05 (0.009)d 0.07 (0.027)d 0.04 (0.008)d a 0.82 (0.003) 0.83 (0.002)a 0.67 (0.066)ac 0.71 (0.077)ac 0.58 (0.165)c 0.57 (0.251)c a 0.82 (0.004) 0.82 (0.003)a 0.80 (0.055)ab 0.82 (0.002)a 0.58 (0.113)cd 0.66 (0.163)bce 0.44 (0.135)d 0.52 (0.183)de a 0.81 (0.011) 0.81 (0.012)a
15 0.80 (0.062)a
0.82 (0.007)a 0.60 (0.263)c 0.66 (0.173)ac 0.81 (0.007)ab 0.81 (0.005)a 0.69 (0.161)bc 0.60 (0.203)c 0.81 (0.006)a
57
8 ALGEMEEN BESLUIT Is er een effect van lichtintensiteit rond het tijdstip van behandeling op de herbicidenwerking van metamitron? Ja, maar in tegenstelling met de verwachte resultaten dat bij een hogere lichtintensiteit een betere bestrijding zou plaatsvinden, blijkt de werking van metamitron op melganzenvoet slechter te zijn bij stijgende lichtintensiteiten. Zowel gevoelige als resistente melganzenvoetpopulaties reageren op deze manier. De verschillen in werking, weliswaar niet significant, kunnen echter niet louter toegeschreven worden aan de factor lichtintensiteit. Een wijzigende lichtintensiteit zal de groei bevorderen en een invloed uitoefenen op de opname van bodemvocht. Echter in de desbetreffende proef (proef A; Sectie 5.3.1) ging een wijziging in lichtintensiteit ook gepaard met een wijziging in relatieve vochtigheid. Deze relatieve vochtigheid kan dan weer een belangrijke invloed uitoefenen op de bladopname van metamitron hetzij via haar invloed op de toegankelijkheid van de cuticula, hetzij via haar invloed op de duur van in oplossing blijven van metamitron na herbevochtiging van het blad door de toegepaste overhead irrigatie. Is er een effect van temperatuur rond het tijdstip van behandeling op de herbicidenwerking van metamitron? Ja, de gevoelige melganzenvoetpopulatie wordt beter bestreden bij toenemende temperatuur rond het tijdstip van behandeling. Stijgende temperaturen werken immers groeibevorderend indien geen andere factoren beperkend zijn. Een goede groei zorgt voor een grotere opname en translocatie van het herbicide. De resistente populaties worden echter bij hoge temperaturen (dag/nacht: 26/18°C) minder goed bestreden. De oorzaak kan enerzijds te wijten zijn aan een verminderde opname via het blad door veranderende morfologische eigenschappen. Anderzijds kan een verhoogde temperatuur het metabolisme van metamitron stimuleren. Mogelijk wordt het metabolisme bij de gevoelige populatie in veel mindere mate begunstigd door hoge temperatuur dan bij de resistente populaties. Is er een effect van relatieve luchtvochtigheid rond het tijdstip van behandeling op de herbicidenwerking van metamitron? Neen, althans niet binnen het geteste RV-traject (63 versus 83 %) voor zowel gevoelige als resistente melganzenvoetpopulaties. Het toevoegen van een adjuvant zorgt ervoor dat het herbicide toch optimaal wordt opgenomen via het blad en compenseert dus de invloed van geringere relatieve luchtvochtheidsverschillen op de bladmorfologie. Door gebruik van subirrigatie in de desbetreffende proef (proef C; Sectie 5.3.3) was er geen goede verticale herverdeling in de bodem. Bijgevolg was opname via bodem minder belangrijk. Is er een effect van het bodemvochtgehalte rond het tijdstip van behandeling op de herbicidenwerking van metamitron? Ja, maar het effect zal hoogstwaarschijnlijk afhangen van hoelang de planten reeds met droogtestress kampten vóór toepassing van metamitron. Droogtestress zal enerzijds de bladmorfologische kenmerken sterk gaan wijzigen om verdamping tegen te gaan. Dit doen ze door een dikkere cuticula en epicuticulaire waslaag aan te maken, maar ook door de huidmondjes te sluiten. Hierdoor wordt de bladopname van metamitron sterk teruggedrongen. Het bodemvochtgehalte zal ook verantwoordelijk zijn voor het aandeel opgelost metamitron, wat kan opgenomen worden door de plant. De irrigatiewijze (subirrigatie versus overhead irrigatie) zal opnieuw een cruciale rol spelen in de onderlinge verhouding tussen wortel- en bladopname. Voor zowel de gevoelige als resistente populaties was er een betere bestrijding wanneer de grond voldoende bodemvocht bevatte. Is er een verschil tussen ochtend- en avondbehandeling (toepassingstijdstip) op de herbicidenwerking van metamitron? Ja, een ochtendbehandeling zorgt voor betere bestrijding dan een avondbehandeling voor alle melganzenvoetpopulaties. De verschillen zijn echter beperkt. Een mogelijke afbraakpathway van metamitron is N-glucosylatie. Hiervoor is glucose nodig dat ’s avonds voldoende voorhanden is. Dit kan resulteren in een slechtere bestrijding bij een avondtoepassing. 58
Het toevoegen van een sucrose-oplossing aan het irrigatiewater zorgde echter voor een betere bestrijding. Sucrose wordt verondersteld omgezet te worden in de plant naar glucose en fructose en zou dus voor een verhoogde glucosebeschikbaarheid moeten zorgen. Mogelijk liggen andere, meer complexe oorzaken aan de basis van de betere bestrijding mét sucrose-oplossing. Is er een effect van de geteste omgevingsomstandigheden op de selectiviteit van metamitron in suikerbiet? Metamitron bleek onder alle geteste omgevingsomstandigheden geen significante remming te veroorzaken bij suikerbiet. Is er een effect van de gebruikte inhibitor op de vorming van metabolisatieproducten van metamitron in gevoelige en resistente melganzenvoetpopulaties en in een suikerbietpopulatie? Het effect van bodemopname van de verschillende inhibitoren is meest uitgesproken bij resistente populaties van melganzenvoet. De inhibitor 1-aminobenzotriazool (ABT) zorgt voor een sterkere daling van de aanwezigheid van afbraakproducten in vergelijking met picolinezuur-t-butylamide (PABA). Ook de verhouding tussen beide detecteerbare afbraakproducten deamino-metamitron en metamitron-N-glucoside wijzigt. Deze is hoger na gebruik van PABA in vergelijking met ABT en piperonylbutoxide (PBO), die op hetzelfde werkingsprincipe steunen, namelijk inhibitie van de P450mono-oxygenasen, meer dan waarschijnlijk verantwoordelijk voor de deaminatie. PBO daarentegen veroorzaakt een geringere inhibitie van afbraakproducten bij de gevoelige melganzenvoet. Suikerbiet metaboliseert metamitron voornamelijk via N-glucosylatie na bodemopname, te wijten aan hogere glucose-gehalten in de wortel. Wordt PBO bovengronds toegepast is er een niet-significante remming van de droge biomassa, te wijten aan inhibitie van de P450 mono-oxygenasen die in het blad deels verantwoordelijk zijn voor de afbraak van metamitron. Is er een verschil in herbicidenactiviteit op gevoelige en resistente melganzenvoetpopulaties tussen metamitron, metribuzin en terbuthylazin? Ja, er is een verschil tussen het herbicideneffect van de triazinonen (metamitron en metribuzin) in vergelijking met terbuthylazin in de resistente melganzenvoetpopulaties. Bij terbuthylazin is er geen remming van de fotosynthese-efficiëntie , waar bij de triazinonen wel een remming van ±20 procent optreedt. In de metamitron-resistente populatie stijgt het malondialdehyde-gehalte tot 5 dagen na toepassing, om dan terug naar het normale niveau te zakken. Een zelfde trend wordt teruggevonden voor de pigmenten chlorofyl en carotenoïden in beide resistente populaties. De gevoelige populatie wordt door alle geteste herbiciden volledig bestreden. De werking van metamitron verloopt trager in vergelijking met metribuzin en terbuthylazin.
8.1 VERDER ONDERZOEK Vooreerst is het belangrijk om de relatie tussen irrigatiewijze en het relatief belang van blad- en bodemopname bij melganzenvoet te kennen. Daarnaast is de invloed van stressduur op het aanpassingsvermogen van de plant en de resulterende veranderde bladmorfologie belangrijk. Beide aspecten zijn belangrijk om de resultaten van deze scriptie verder te interpreteren. Tijdens alle proeven omtrent de omgevingsomstandigheden werden bladstalen genomen van onbehandelde controleplanten en planten behandeld met 700 g/ha metamitron. Deze stalen konden wegens tijdsgebrek niet geanalyseerd worden op de aanwezigheid van metamitron en beide afbraakproducten deamino-metamitron en metamitron-N-glucoside. Via analyse van deze bladstalen kan de invloed van omgevingsomstandigheden op het metabolisme van metamitron in melganzenvoet bestudeerd worden. Indien de proeven heruitgevoerd zouden worden ter bevestiging van de resultaten zouden kleinere intervallen tussen de dosissen kunnen toegepast worden. Zo kunnen betere curven gefit worden. 59
LITERATUUR ALANWOOD (2010a). Metamitron data sheet. http://www.alanwood.net/pesticides/metamitron.html (laatst geraadpleegd op 01/11/2010). ALANWOOD (2010b). Triazinone herbicides. http://www.alanwood.net/pesticides/class_herbicides.html#triazinone_herbicides (laatst geraadpleegd op 01/11/2010). ALIOTTA, G., CAFIERO, G. & POLLIO, A. (2005). Understanding plant strategies: Broader view for allelopathy scientists. Allelopathy Journal, 16, 63-76. APER, J. (2008). Karakterisatie en detectie van metamitron-resistente melganzenvoet (Chenopodium album L.). Scriptie, Gent, Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen, Universiteit Gent, 119 p. APER, J. (2011). Persoonlijke mededelingen, Gent, Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen, Universiteit Gent. APER, J., DE RIEK, J., MECHANT, E., DE CAUWER, B., BULCKE, R. & REHEUL, D. (2010). The origin of herbicide-resistant Chenopodium album: analysis of genetic variation and population structure. Weed Research, 50, 235-244. APER, J., RUBIN, B., MECHANT, E., BULCKE, R. & REHEUL, D. (2010a). Fate of the triazinone herbicide metamitron in Chenopodium album L. Presentatie ILVO. BAKER, E.A. (1980). Effect of cuticular components on foliar penetration. Pesticide Science, 11, 367370. BECKIE, H.J. (2006). Herbicide-resistant weeds: management tactics and practices. Weed Technology, 20, 793-814. BLACKSHAW, R.E. & RODE, L.M. (1991). Effect of ensiling and rumen digestion by cattle on weed seed viability. Weed Science, 39, 104-108. BODE, M., HAAS, M., FAYMONVILLE, T., THIEDE, B., SCHUPMAN, I. & SCHMIDT, B. (2006). Biotransformation of metamitron by human P450 expressed in transgenic tobacco cell cultures. Journal of Environmental Science and Health, Part B: Pesticides, Food Contaminants, and Agricultural Wastes, 41, 201-222. BOUWMEESTER, H.J. & KARSSEN, C.M. (1993). Seasonal periodicity in germination of seeds of Chenopodium album L. Annals of Botany, 72, 463-473. BOWEN, J.E. (1967). Influence of environmental factors on the efficacy of preemergence diuron applications. Weeds, 15, 317-322.
60
BOWYER, J.R., CAMILLERI, P. & VERMAAS, W.F.J. (1991). Photosystem II and its interaction with herbicides. In: Baker, N.R. & Percival, M.P. (eds). Topics in photosynthesis, volume 10 Herbicides. Elsevier, 27-86. BOYDSTON, R.A. (1990). Soil water content affects the activity of four herbicides on green foxtail (Setaria viridis). Weed Science, 38, 578-582. BURNSIDE, O.C. & BEHRENS, R. (1961). Phytotoxicity of simazine. Weeds, 9, 145-157. COBB, A.H., DUNLEAVY, P.J. & DAVIES, L.G. (1983). Stomatal movement and bentazone action in Chenopodium album L. Aspects of Applied Biology, 4, 187-196. COLLINGS, L.V., BLAIR, A.M., GAY, A.P., DYER C.J. & MACKAY, N. (2003). The effect of weather factors on the performance of herbicides to control Alopecurus myosuroides in winter wheat. Weed Research, 43, 146-153. COQUILLAT, M. (1951). Sur les plantes les plus communes à la surface du globe. Geciteerd uit: Williams, J.T. (1963). Chenopodium album. Journal of Ecology, 51, 711-725. COUÉE, I., SULMON, C., GOUESBET, G. & EL AMRANI, A. (2006). Involvement of soluble sugars in reactive oxygen species balance and responses to oxidative stress in plants. Journal of Experimental Botany, 57, 449-459. DAVIES, W.J., BLACKMAN, P.G. & MANSFIELD, T.A. (1983). Manipulation of stomatal behaviour and plant water status to increase herbicide effect. Aspects of Applied Biology, 4, 197-205. DAWSON, J.H. (1965). Competition between irrigated sugar beets and annual weeds. Weeds, 13, 245-249. DE CAUWER, B. (2010). Herbologie. Cursusnota’s, Gent, Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen, Universiteit Gent. DE CAUWER, B. (2011). Persoonlijke mededelingen, Gent, Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen, Universiteit Gent. DE MAREZ, T., MECHANT, E., HERMANN, O., OLSSON, R. & BULCKE, R. (2008). Monitoring for resistance to metamitron in Chenopodium album. Journal of Plant Diseases and Protection, Special Issue 11, 85-90. DE ROO, S. (2011). Risico van verspreiding van herbicidenresistente zaden van melganzenvoet (Chenopodium album L.) via organische mest. Scriptie, Gent, Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen, Universiteit Gent. DE RUITER, H. & MEINEN, E. (1998). Influence of water stress and surfactant on the efficacy, absorption, and translocation of glyphosate. Weed Science, 46, 289-296. DEMEYERE, A., HOFMANS, E. & MEURRENS, F. (2008). Gewasbescherming bieten. Vlaamse Overheid, Departement landbouw en visserij, Afdeling duurzame landbouwontwikkeling, 24 p.
61
DEVINE, M.D., DUKE, S.O. & FEDTKE, C. (1993). Physiology of Herbicide Action. New Jersey, Prentice Hall, 441 p. DICKSON, R.L., ANDREWS, M., FIELD, R.J. & DICKSON, E.L. (1990). Effect of water stress, nitrogen, and gibberellic acid on fluazifop and glyphosate activity on oats (Avena sativa). Weed Science, 38, 54-61. DORAN, D.L. & ANDERSEN, R.N. (1976). Effectiveness of bentazon applied at various times of the day. Weed Science, 24, 567-570. DUKE , S.O., CHRISTY, A.L., HESS, F.D. & HOLT, Z.S.(1991). Herbicide-resistant crops. Geciteerd uit: Tharayil-Santhakumar, N. (2003). Mechanism of herbicide resistance in weeds. Plant & Soil Sciences. University of Massachusetts, 38 p. ELEMA, A.G., BLOEMHARD, C.M.J. & SCHEEPENS, P.C. (1990). Risk-analysis for the dissemination of weeds by liquid cattle manure. Mededelingen Faculteit Landbouwwetenschappen Rijksuniversiteit Gent, 55, 1203-1208. FAWCETT, R.S. & SLIFE, F.W. (1978). Effects of field applications of nitrate on weed seed germination and dormancy. Weed Science, 26, 594-596. FIGUEROLA, L.F. & FURTICK, W.R. (1972). Effect of climatic conditions on phytotoxicity of terbutryn. Weed Science, 20, 60-63. FYTOWEB (2010). Erkenningen van gewasbeschermingsmiddelen in de suikerbietenteelt en voor de bestrijding van melganzenvoet. http://www.fytoweb.fgov.be/indexNL.asp (laatst geraadpleegd op 05/01/2011). GADAMSKI, G., CIARKA, D., GRESSEL, J. & GAWRONSKI, S.W. (2000). Negative cross-resistance in triazine-resistant biotypes of Echinochloa crus-galli and Conyza canadensis. Weed Science, 48, 176180. CIBA-GEIGY (1973). Weed Tables: a synoptic presentation of the flora accompanying agricultural crops. GERBER, H.R., NYFFELER, A. & GREEN, D.H. (1983). The influence of rainfaal, temperature, humidy and light on soil- and foliage applied herbicides. Aspects of Applied Biology, 4, 1-14. HALL, L.M., HOLTUM, J.A.M. & POWLES, S.B. (1994). Mechanisms responsible for cross resistance and multiple resistance. In: Powles, S.B., Holtum, J.A.M. (eds). Herbicide resistance in plants: biology and biochemistry. Boca Raton, CRC Press, 368 p. HAMMERTON, J.L. (1967). Environmental factors and susceptibility to herbicides. Weeds, 15, 330336. HARR, R., GUGGENHEIM, R., SCHULKE, G. & FALK, R.H. (1991). The leaf surface of major weeds. Sandoz Agro Ltd. HEAP (2010). International survey of herbicide resistant weeds. http://www.weedscience.org/In.asp (laatst geraadpleegd op 18/05/2011).
62
HODGES, M.D., DELONG, J.M., FORNEY, C.F. & PRANGE, R.K. (1999). Improving the thiobarbituric acid-reactive-substances assay for estimating lipid peroxidation in plant tissues containing anthocyanin and other interfering compounds. Planta, 207, 604-611. HOLM, L.G., PUCKNETT, D.L., PANCHO, J.V. & HERBERGER, J. (1977). The World’s Worst Weeds, Distribution and Biology. Honolulu, The University Press of Hawaii, 609 p. HOSTE, I. (2006). Melganzenvoet. In: Atlas van de Flora van Vlaanderen en het Brussels Gewest. Nationale plantentuin van België en Instituut voor bosbouw en wildbeheer, Impressum Meise, 1007 p. JASIENIUK, M., BRÛLÉ-BABEL, A.L. & MORRISON, I.N. (1996). The evolution and genetics of herbicide resistance in weeds. Weed Science, 44, 176-193. KETEL, D.H. (1996). Effect of low doses of metamitron and glyphosate on growth and chlorophyll content of common lambsquarters (Chenopodium album). Weed Science, 44, 1-6. KIRKWOOD, R.C. (1999). Recent developments in our understanding of the plant cuticle as a barrier to the foliar uptake of pesticides. Pesticide Science, 55, 69-77. KNEZEVIC, S.Z., STREIBIG, J.C. & RITZ, C. (2007). Utilizing R software package for dose-response studies: The concept and data analysis. Weed Technology, 21, 840-848. KREUZ, K., TOMMASINI, R. & MARTINOIA, E. (1996). Old enzymes for a new job. Plant Physiology, 111, 349-353. KUDSK, P. (2001). How to investigate the influence of environmental factors on herbicide performance. The Brighton Crop Protection Conference on Weeds 2001, 495-504. LEGG, B.J. (1983). Micrometeorology and the influence of local variations of environment on plant growth and herbicide performance. Aspects of Applied Biology, 4, 15-31. LODISH, H., BERK, A., KAISER, C.A., KRIEGER, M., SCOTT, M.P., BRETSCHER, A., PLOEGH, H. & MATSUDAIRA, P. (2007). Molecular Cell Biology. W.H.Freeman & Co. Ltd, New York, 6th Revised edition, 1296 p. LUNDKVIST, A. (1997a). Influence of weather on the efficacy of dichlorprop-P/MCPA and tribenuronmethyl. Weed Research, 37, 361-371. LUNDKVIST, A. (1997b). Predicting optimal application time for herbicides from estimated growth rate of weeds. Agricultural Systems, 54, 223-242. MAGANTI, M., WEAVER, S. & DOWNS, M. (2005). Responses of spreading orach (Atriplex patula) and common lambsquarters (Chenopodium album) to soil compaction, drought, and waterlogging. Weed Science, 53, 90-96. MASABNI, J.G. & ZANDSTRA, B.H. (1999). Discovery of a common purslane (Portulaca oleracea) biotype resistant to linuron. Weed Technology, 13, 599-605.
63
MAY, M.J. (1983). The variability of single full dose and of repeated low dose treatments. Aspects of Applied Biology, 4, 355-361. MECHANT, E. & BULCKE, R. (2006). Cross-resistance profile of metamitron-resistant Chenopodium album L. biotypes from sugar beet. Journal of Plant Diseases and Protection, Special Issue 20, 147153. MECHANT, E., DE MAREZ, T., HERMANN, O., OLSSON, R. & BULCKE, R. (2008). Target site resistance in Chenopodium album L. Journal of Plant Diseases and Protection, Special Issue 11, 37-40. MEDD, R.W., VAN DE VEN, R.J., PICKERING, D.I. & NORDBLOM, T. (2001). Determination of environment-specific dose-response relationships for clodinafop-propargyl on Avena spp. Weed Research, 41, 351-368. MENGISTU, L.W., MUELLER-WARRANT, G.W., LISTON, A. & BARKER, R.E. (2000). psbA Mutation (valine219 to isoleucine) in Poa annua resistant to metribuzin and diuron. Pest Management Science, 56, 209-217. MERRITT, C.R. (1984). Influence of environmental factors on the activity of ioxynil salt and ester applied to Stellaria media. Weed Research, 24, 173-182. MULDER, C.E.G. & NALEWAJA, J.D. (1978). Temperature effect of phytotoxicity of soil-applied herbicides. Weed Science, 26, 566-570. NALEWAJA, J.D. & WOZNICA, Z. (1985). Environment and chlorsulfuron phytotoxicity. Weed Science, 33, 395-399. OETTMEIER, W. (1999). Herbicide resistance and supersensitivity in photosystem II. Cellular and Molecular Life Sciences, 55, 1255-1277. ORSON, J.H. (1999). The cost of herbicide resistance. http://www.hracglobal.com/Publications/TheCostofHerbicideResistance/tabid/230/Default.aspx (laatst geraadpleegd op 18/05/2011). PALLETT, K.E. & DODGE, A.D. (1980). Studies into the action of some photosynthetic inhibitor herbicides. Journal of Experimental Botany, 31, 1051-1066. PARK, K.W. & MALLORY-SMITH, C.A. (2006). psbA mutation (Asn(266) to Thr) in Senecio vulgaris L. confers resistance to several PSII-inhibiting herbicides. Pest Management Science, 62, 880-885. PARKS, R.J., CURRAN, W.S., ROTH, G.W., HARTWIG, N.L. & CALVIN, D.D. (1996). Herbicide susceptibility and biological fitness of triazine-resistant and susceptible common lambsquarters (Chenopodium album). Weed Science, 44, 517-522. PAWLIKA, A. (1957). Untersuchungen über das Wachstum einiger landwirtschaftlicher Unkraüter in Wasserkulturen unter besonderer Berücksichtigung der Bewirkung. Geciteerd uit: Williams, J.T. (1963). Chenopodium album. Journal of Ecology, 51, 711-725. PENNER, D. (1971). Effect of temperature on phytotoxicity and root uptake of several herbicides. Weed Science, 19, 571-576. 64
PETERSEN, J. & HURLE, K. (2001). Influence of climatic conditions and plant physiology on glufosinate-ammonium efficacy. Weed Research, 41, 31-39. PETERSEN, J. & VARRELMANN, M. (2010). Ein neuer Gänsefuß-Biotyp mit Resistenz gegenüber Metribuzin und Metamitron. Vortragsveranstaltung : 2. Herbizidsymposium Rübe von FCS, Göttingen. PETERSON, D.E., THOMPSON, C.R., SHOUP, D.E. & OLSON, B.L. (2001). Herbicide mode of action. Kansas State University, Agricultural Experiment Station and Cooperative Extension Service, 28 p. POVLT (2010). Vijanden van gewassen en hun beheersing 2010-2011. Heule, Verraes BVBA, 288 p. POWLES, S.B. & YU, Q. (2010). Evolution in action: plants resistant to herbicides. Annual Review of Plant Biology, 61, 317-347. PRESTON, C. (2004). Herbicide resistance in weeds endowed by enhanced detoxification: complications for management. Weed Science, 52, 448-453. PRESTON, C., MALLORY-SMITH, C.A. (2001). Biochemical mechanisms, inheritance, and molecular genetics of herbicide resistance in weeds. In: Powles, S.B., Shaner, D.L. (eds). Herbicide Resistance and World Grains. Boca Raton, CRC Press, 24-49. PRICE, C.E. (1983). The effect of environment on foliage uptake and translocation of herbicides. Aspects of Applied Biology, 4, 157-169. RADOSEVICH, S.R. & HOLT, J.S. (1982). Physiological responses and fitness in susceptible and resistant weed biotypes to triazine herbicides. Geciteerd uit: Tharayil-Santhakumar, N. (2003). Mechanism of herbicide resistance in weeds. Plant & Soil Sciences. University of Massachusetts, 38 p. R DEVELOPMENT CORE TEAM (2011). R: A Language and Environmen for Statistical Computing, Vienna, R Foundation for Statistical Computing, http://www.R-project.org. REHEUL, D. (2010). Fotosynthese. Cursusnota’s Plantkunde 2, Gent, Faculteit Bioingenieurswetenschappen, Universiteit Gent. RIETHMULLER-HAAGE, I., BASTIAANS, L., KEMPENAAR, C., SMUTNY, V. & KROPFF, M.J. (2007). Are pre-spraying growing conditions a major determinant of herbicide efficacy? Weed Research, 47, 415424. RITZ, C. & STREIBIG, J.C. (2007). Statistical assessment of dose-response curves with free software. Collection of examples, 38 p. ROTTEVEEL, T.J.W., DE GOEIJ, J.W.F.M. & VAN GEMERDEN, A.F. (1997). Towards the construction of a resistance risk evaluation scheme. Pesticide Science, 51, 407-411. RUTHERFORD, A.W. & KRIEGER-LISZKAY, A. (2001). Herbicide-induced oxidative stress in photosystem II. Trends in Biochemical Sciences, 26 (11), 648-653. RYAN, G.F. (1970). Resistance of common groundsel to simazine and atrazine. Weed Science, 18, 614616.
65
SCHEEPENS, P., GROENEVELD, R. & RIEMENS, M. (2004). Invoer van onkruiden op een bedrijf. Nota 283, Plant Research International B.V., Wageningen, 22 p. SCHMIDT, R.R. & FEDTKE, C. (1977). Metamitron activity in tolerant and susceptible plants. Pesticide Science, 8, 611-617. SEEFELDT, S.S., JENSEN, J.E. & FUERST E.P. (1995). Log-logistic analysis of herbicide dose-response relationships. Weed Technology, 9, 218-227. SKUTERUD, R., BJUGSTAD, N., TYLDUM, A. & TφRRESEN, K.S. (1998). Effect of herbicides applied at different times of the day. Crop Protection, 17, 41-46. SMIS, K. (1991). Vergelijkende studie van de fotosynthetische assimilatie en de plantontwikkeling bij 1,3,5-triazine-resistente en –gevoelige biotypen van melganzenvoet (Chenopodium album L.). Doctoraat, Gent, Faculteit van de Landbouwwetenschappen, Universiteit Gent, 196 p. STEEN, E. & AL-WINDI, I. (1984). Effects of pre-emergence soil-herbicides (lenacil and metamitron) on sugar-beets (Beta vulgaris L.). Swedish Journal of Agricultural Research, 14, 201-205. STEPPE, K. (2010). Ecofysiologie. Cursusnota’s, Gent, Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen, Universiteit Gent. SULMON, C., GOUESBET, G., COUÉE, I. & EL AMRANI, A. (2004). Sugar-induced tolerance to atrazine in Arabidopsis seedlings: interacting effects of atrazine and soluble sugars on psbA mRNA and D1 protein levels. Plant Science, 167, 913-923. THARAYIL-SANTHAKUMAR, N. (2003). Mechanism of herbicide resistance in weeds. Plant & Soil Sciences. University of Massachusetts, 38 p. THIEL, H., KLUTH, C. & VARRELMANN, M. (2010). A new molecular method for the rapid detection of a metamitron-resistant target site in Chenopodium album. Pest Management Science, 66, 1011-1017. THOMPSON, L., SLIFE, J.F.W. & BUTLER, H.S. (1970). Environmental influence of the tolerance of corn to atrazine. Weed Science, 18, 509-514. TIETJEN, K.G., DRABER, W., GOOSSENS, J., JANSEN, J.R., KLUTH, J.F., SCHINDLER, M. & WROBLOWSKY, H. (1993). Binding of triazines and triazinones in the Qb-binding niche of photosystem II. Zeitschrift für Naturforschung, 48, 205-212. VAN DER MEIJDEN, R. (2005). Heukels’ Flora van Nederland. Groningen/Houten, Wolters-Noordhoff, 685 p. VAN LABEKE, M. (2009). Practicumnota’s bij In vivo sturing van groeiprocessen, Gent, Faculteit Bioingenieurswetenschappen, Universiteit Gent. VENGRIS, J. (1955). Plant nutrient competition between weeds and corn. Agronomics Journal, 47, 213-215. WILLIAMS, J.T. (1963). Chenopodium album. Journal of Ecology, 51, 711-725. WSSA (1998). Resistance and tolerance definitions. Weed Technology, 12, 789. 66
WSSA (2002). Herbicide Handbook, 8th edition, 493 p. ZIMDAHL, R.L. & FERTIG, S.N. (1967). Influence of weed competition in sugar beets. Weeds, 15, 336339.
67
BIJLAGE 1 4 S Metamitron
Chlorofylgehalte (t.o.v. controle)
Chlorofylgehalte (µg / g vers gewicht)
1200 1000 800 600
S
400
Rm
200
Ra
3.5 S Metribuzin
3
S Terbuthylazin
2.5 2 1.5 1 0.5 0
0 0
5
10
15
0
20
Figuur 30: Gemiddeld chlorofylgehalte (µg/g vers gewicht (±SD) voor de controles van drie melganzenvoet populaties. S: gevoelige populatie, Rm: metamitron-resistente populatie, Ra: atrazinresistente populatie.
15
20
Figuur 31: Gemiddeld chlorofylgehalte (±SD) relatief ten opzichte van de gemiddelde controle (op dezelfde dag na behandeling) voor de gevoelige melganzenvoetpopulatie (S) bij behandeling met drie verschillende PSII-remmers.
2.5
Rm Metamitron
1.6
Rm Metribuzin
1.4
Rm Terbuthylazin
1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0
Chlorofylgehalte (t.o.v. controle)
Chlorofylgehalte (t.o.v. controle)
10
Dagen na behandeling
Dagen na behandeling
1.8
5
Ra Metamitron Ra Metribuzin
2 Ra Terbuthylazin 1.5
1
0.5
0 0
5
10
15
20
Dagen na behandeling Figuur 32: Gemiddeld chlorofylgehalte (±SD) relatief ten opzichte van de gemiddelde controle (op dezelfde dag na behandeling) voor de metamitronresistente melganzenvoetpopulatie (Rm) bij behandeling met drie verschillende PSII-remmers.
0
5
10
15
20
Dagen na behandeling Figuur 33: Gemiddeld chlorofylgehalte (±SD) relatief ten opzichte van de gemiddelde controle (op dezelfde dag na behandeling) voor de atrazinresistente melganzenvoetpopulatie (Ra) bij behandeling met drie verschillende PSII-remmers.
68
2.5
S Rm
200
Ra
150
100
50
Carotenoïdengehalte (t.o.v. controle)
Carotenoïdenghealte (µg/g vers gewicht)
250
0
S Metamitron S Metribuzin 2 S Terbuthylazin 1.5
1
0.5
0 0
5
10
15
20
0
Dagen na behandeling Figuur 34: Gemiddeld carotenoïdengehalte (µg/g vers gewicht (±SD) voor de controles van drie melganzenvoet populaties. S: gevoelige populatie, Rm: metamitron-resistente populatie, Ra: atrazinresistente populatie.
10
15
20
Figuur 35: Gemiddeld carotenoïdengehalte (±SD) relatief ten opzichte van de gemiddelde controle (op dezelfde dag na behandeling) voor de gevoelige melganzenvoetpopulatie (S) bij behandeling met drie verschillende PSII-remmers.
2.5
Rm Metamitron
1.4
Rm Metribuzin
1.2
Rm Terbuthylazin
1 0.8 0.6 0.4 0.2 0
Carotenoïdengehalte (t.o.v.controle)
Carotenoïdengehalte (t.o.v. controle)
1.6
5
Dagen na behandeling
Ra Metamitron Ra Metribuzin
2 Ra Terbuthylazin 1.5
1
0.5
0 0
5
10
15
20
Dagen na behandeling Figuur 36: Gemiddeld carotenoïdengehalte (±SD) relatief ten opzichte van de gemiddelde controle (op dezelfde dag na behandeling) voor de metamitronresistente melganzenvoetpopulatie (Rm) bij behandeling met drie verschillende PSII-remmers.
0
5
10
15
20
Dagen na behandeling Figuur 37: Gemiddeld carotenoïdengehalte (±SD) relatief ten opzichte van de gemiddelde controle (op dezelfde dag na behandeling) voor de atrazinresistente melganzenvoetpopulatie (Ra) bij behandeling met drie verschillende PSII-remmers.
69
6
S
Ra
1.5
1
0.5
0
S Metribuzin
5
S Terbuthylazin 4
3
2
1
0 0
5
10
15
Dagen na behandeling
20
Figuur 38: Gemiddeld MDA-gehalte (nmol/g vers gewicht (±SD) voor de controles van drie melganzenvoet populaties. S: gevoelige populatie, Rm: metamitron-resistente populatie, Ra: atrazinresistente populatie.
2.5
0
5
10
15
20
Dagen na behandeling
Figuur 39: Gemiddeld MDA-gehalte (±SD) relatief ten opzichte van de gemiddelde controle (op dezelfde dag na behandeling) voor de gevoelige melganzenvoetpopulatie (S) bij behandeling met drie verschillende PSII-remmers.
2
Rm Metamitron
1.8
2 Rm Terbuthylazin
1.5
1
0.5
0
MDA-gehalte (t.o.v. controle)
Rm Metribuzin
MDA-gehalte (t.o.v. controle)
S Metamitron
Rm 2
MDA-gehalte (t.o.v. controle)
MDA-gehalte (nmol/g vers gewicht) [x106]
2.5
1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6
Ra Metribuzin
0.4
Ra Terbuthylazin
0.2
Ra Metamitron
0 0
5
10
15
20
25
Dagen na behandeling Figuur 40: Gemiddeld MDA-gehalte (±SD) relatief ten opzichte van de gemiddelde controle (op dezelfde dag na behandeling) voor de metamitronresistente melganzenvoetpopulatie (Rm) bij behandeling met drie verschillende PSII-remmers.
0
5
10
15
20
25
Dagen na behandeling Figuur 41: Gemiddeld MDA-gehalte (±SD) relatief ten opzichte van de gemiddelde controle (op dezelfde dag na behandeling) voor de atrazinresistente melganzenvoetpopulatie (Ra) bij behandeling met drie verschillende PSII-remmers.
70
