Studi Kopling Oksidatif Katekin Teh Oolong dengan Bantuan Katalis Fe-MMT dan Uji Aktivitas Antioksidan Septriayu Norma Yusnita, Widayanti Wibowo, Antonius Herry Cahyana Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Kampus UI Depok 16424 E-mail:
[email protected]
Abstrak Daun teh hijau dikeringkan selama beberapa hari dan diekstrak dengan menggunakan dua jenis pelarut yaitu etanol – air 1:1 (v/v) dan etil asetat – air 1:1 (v/v) untuk memperoleh ekstrak teh oolong. Ekstrak ini digunakan untuk melihat reaksi kopling oksidatif dengan katalis Fe-MMT. MMT diperoleh dari mineral bentonit, berasal dari daerah Jambi, dengan pemisahan fraksi yang mengandung montmoilonit paling tinggi. MMT ini diubah ke Na-MMT dan setelah itu ke Fe-MMT dengan mengimpregnasi masing-masing menggunakan larutan NaCl dan larutan FeCl3. Katalis Fe-MMT dikarakterisasi dengan metode FTIR dan XRD, untuk melihat struktur MMT. Metode SSA digunakan untuk melihat kandungan dari Na+ dan Fe3+ pada preparasi katalis. Ekstrak teh oolong pertama-tama difraksinansi dengan menggunakan silika gel dalam tabung reaksi untuk memperoleh isolat yang mengandung senyawa catechin. Reaksi kopling oksidatif dari catechin dipanaskan pada suhu 115°C selama 24 jam, untuk mengidentifikasi senyawa hasil produk menggunakan metode KLT dan LC-MS. Hasil analisa menunjukkan pembentukan senyawa kopling dari catechin menghasilkan 2 senyawa yaitu EGCG trimer pada m/z 1370 dan theadibenzotropolene pada m/z 974. Aktivitas penangkapan radikal dari produk kopling oksidatif, ditentukan dengan menggunakan radikal bebas 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH), menunjukkan % inhibisi produk lebih tinggi dibandingkan senyawa isolat. Kata kunci: reaksi kopling oksidatif, catechin, DPPH, bentonit, antioksidan
Abstract Green tea leaves were dried for several days and were extracted with two kinds of solvents, namely ethanol – water 1:1 (v/v) and ethyl acetate – water 1:1 (v/v) to obtain the oolong tea extracts. These extracts were used to study the oxidative coupling reactions over Fe-Montmorilonite (Fe-MMT) catalyst. The MMT was obtained from mineral bentonite, origin area Jambi, by separating the fraction which had the highest montmorilonite content. This MMT was first transformed into Na-MMT and after that into Fe-MMT by impregnating with NaCl solutions and FeCl3 solutions respectively. The Fe-MMT catalyst was characterized by FTIR and XRD methods, to confirm the MMT structure. The AAS method was carried out to determine the content of Na+ and Fe3+ in the catalyst preparation. The oolong tea extracts were first fractionated using silica gel in a glass column to obtain isolate with the catechin content. The oxidative coupling reactions of catechins were conducted at 115°C for 24h, to investigate the formation of the coupling products, which were identified using TLC and LC-MS methods. The analysis results showed the formation of a coupling compound of catechins results two compounds that is EGCG trimer with the m/z value of 1370 and theadibenzotropolene with the m/z value of 974. The radical scavenging activity of the oxidative coupling product, determined by the use of a free radical 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazil (DPPH), showed the value of product inhibition percent more high than isolate compounds. Keyword : oxidative coupling reaction, catechin, DPPH, bentonite, antioxidant
Studi kopling..., Septriayu Norma Yusnita, FMIPA UI, 2013
1. PENDAHULUAN Berdasarkan jenis pengolahannya dari daun teh (Camellia Sinensis), teh dibagi menjadi tiga yaitu Teh Hijau, Teh Oolong dan Teh Hitam. Teh Hijau merupakan teh yang belum mengalami fermentasi, Teh Oolong merupakan teh yang sebagian telah mngalami fermentasi dan teh hitam merupakan teh yang mengalami fermentasi secara total [1]. Teh Tolong dan Teh Hitam mengalami oksidasi melalui enzim PPO (Polyphenol Oksidase) [2]. Teh menjadi popular di Indonesia karena memiliki 36% senyawa polifenol yang bersifat sebagai antioksidan dan antikanker. Pada Teh Hijau terdapat senyawa catechin, epicatechin gallate, epigallocatechin gallate, pada Teh Oolong terdapat theaflavin, theaflavin-3-gallate. Sedangkan pada Teh Hitam terdapat thearubigin [3]. Senyawa aktif ini berfungsi sebagai "radical scavanger". Penelitian ini bertujuan melihat hasil produk kopling dengan menggunakan katalis FeMMT. Apakah cara kerja katalis ini sama dengan cara kerja enzim PPO dalam daun teh. Melihat pula aktivitas antioksidan yaitu persen inhibisi yang dihasilkan apakah lebih besar dari aktivitas antioksidan dari isolat awal yaitu berupa katekin.
2. METODE PENELITIAN Pada penelitian ini, sampel yang digunakan adalah bentonit yang berasal dari Jambi dan daun teh hijau yang berasal dari PTPN VIII Puncak, Cisarua, Bogor. Bentonit difraksinasi dan disintesis terlebih dahulu kemudian dikarakterisasi menggunakan FT-IR, XRD dan AAS. Hasil isolat senyawa katakein dan hasil produk kopling di uji dengan KLT dan LCMS Bahan-bahan yang digunakan adalah NaCl, FeCl3, metanol, etanol, etil asetat, silika gel, n-heksan, dan akuabides. Prosedur kerja penelitian secara lengkap adalah sebagai berikut: 2.1 Preparasi Katalis Fe-MMT 50 gram bentonit dilarutkan dalam 1 liter akubides (1 : 20), distrirer 30 menit, ambil endapan, dikeringkan pada suhu 105°C dan didapat MMT. MMT dilarutkan dalam NaCl 1M, distrirer, dikeringkan pada suhu 60°C dan didapat padatan Na-MMT. Kemudian Na-MMT dilarutkan dalam FeCl3 0,3, distirer, dikeringkan pada suhu ruang. Dilakukan pencucian ion Cl- dengan menggunakan akuabides. Kemudian MMT, Na-MMT dan FeMMT dikarakterisasi menggunakan AAS Shimadzu aa 6300, XRD dan IR Prestige-21 Shimadzu. 2.2
Daun teh hijau dikeringkan selama beberapa hari dalam keadaan tertutup tanpa terkena cahaya matahari dan diekstrak dengan metode maserasi [4] menggunakan pelarut etanol : air dan etil asetat : air. Hasil ekstrak dipekatkan dengan rotary evaporator dan diisolasi menggunakan kromatografi kolom dengan menggunakan fasa gerak berupa metanol dan fasa diam berupa silika gel. Isolat yang didapat ditimbang massanya dan diuji menggunakan KLT dan LC-MS. 2.3
Reaksi kopling oksidatif dengan katalis FeMMT
Hasil isolat direaksikan dengan Fe-MMT dan metanol 30%. Digunakan pada pemanasan sistem tertutup dengan suhu 115°C selama 24 jam. Dilakukan penyaringan dan diekstraksi dengan corong pisah, diuapkan untuk menghilangkan metanol, ditambahkan NaCl jenuh 20 ml, etil asetat 25 ml dan akuabides 20 mL. Fasa organik yang didapat kemudian diupkan dan ditimbang massa produk. Hasil produk diuji dengan KLT dan LCMS. 2.4.
Uji aktivitas antioksidan
Uji ini menggunakan metode DPPH [5], isolat dan produk yang diuji aktivitasnya dipersiapkan dengan beberapa konsentrasi yaitu 100 ; 75 ; 50 ppm. Setelah itu dipersiapkan larutan 0,1 mM DPPH (1,1-diphenyl-2-picryldidrazol) dalam metanol Untuk uji antioksidan sampel, 2 mL sampel ditambahkan 1 mL larutan DPPH. Untuk kontrol terdiri dari 2 mL metanol dan 1 mL DPPH. Masing-masing campuran tersebut diaduk setelah ditambahkan DPPH kemudian dimasukkan ke dalam kuvet dan dibiarkan selama 30 menit pada temperatur ruang dalam keadaan gelap. Setelah itu, diukur absorbannya dengan UV pada panjang gelombang 515 nm. Pengukuran ini dilakukan sebanyak dua kali. Untuk menghitung efek scavenging menggunakan persamaan berikut % efek scavenging =
(
)
x 100 %
3. HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil XRD dari fraksinasi bentonit ditunjukkan pada gambar berikut :
Isolasi senyawa katekin
Studi kopling..., Septriayu Norma Yusnita, FMIPA UI, 2013
6000
F1
5000
F2 F3
4000 F4 3000 2000 1000 0 0
10
20
30
40
50
60
Dengan menggunakan persamaan diatas maka didapatkan konsentrasi logam Fe pada montmorilonit awal sebesar 543.970 ppm dan pada Fe-MMT sebesar 6254.595 ppm. Hal ini menjelaskan dengan bertambahnya konsentrasi membuktikan bahwa logam Fe berhasil menggantikan kation Na+ yang berada dalam interlayer bentonit. Hasil FTIR untuk MMT, Na-MMT dan FeMMT ditunjukkan pada gambar :
Gambar 1. Hasil XRD F1-F4 bentonit
Absorbansi
1.5 1 y = 0.7575x + 0.1352 R² = 0.9975
0 0
0.5 1 1.5 Konsentrasi (ppm)
2
Gambar 2. Kurva standar logam Na Dengan menggunakan persamaan diatas maka didapatkan konsentrasi logam Na pada montmorilonit awal sebesar 3,0330 ppm dan pada Na-MMT sebesar 199,6237 ppm. Hal ini menjelaskan dengan bertambahnya konsentrasi membuktikan bahwa logam Na berhasil menggantikan kation-kation yang ada dalam interlayer bentonit. Untuk kurva standar logam Fe sebagai berikut : Kurva Standar Logam Fe
Absorbansi
0.8 0.6 0.4
y = 0,068x + 0,0104 R² = 0,9993
0.2 0.0 0.0
5.0
10.0
60 40 MMT Na-MMT Fe-MMT
20 0 4000
3000
2000
1000
bilangan gelombang (cm-1)
Gambar 4. Hasil FTIR MMT, Na-MMT dan FeMMT
Kurva standar logam Na
0.5
80 % Transmitan
Gambar diatas menunjukkan puncak khas smektit sesuai literatur pada 2θ berkisar empat sampai enam [6]. Terlihat bahwa F1 yang memiliki puncak smektit yang tertinggi pada 2θ sebesar 5.6057 dengan nilai d (bacal spacing) sebesar 15.75. Hasil SSA (Spektroskopi Serapan Atom) pada impregnasi logam Na dan Fe pada montmorilonit menunjukkan bertambahnya konsentrasi kedua logam tersebut. Kurva standar logam Na ditunjukkan pada gambar berikut :
100
15.0
Konsentrasi (ppm)
Gambar diatas menunjukkan adanya gugus fungsi khas montmorilonit [6]. Pada bilangan gelombang (v) 3620,1 menunjukkan adanya vibrasi ulur dari gugus OH (gugus hidroksil yang terikat pada Al dilapisan oktahedral Al-Al-OH / Mg-OH-Al). Bilangan gelombang 3436,9 menunjukkan adanya vibrasi ulur gugus OH yang terhidrasi molekul air yang teradsorbsi. Adanya pita serapan pada bilangan gelombang 1636,4 cm-1 menunjukkan adanya vibrasi tekuk dari H-O-H (air yang teradsorbsi didalam bentonit). Pita serapan pada bilangan gelombang 1035,7 sampai 794,6 menunjukkan adanya vibrasi ulur asimetris dari Si-O. Adanya gugus Si-O diidentifikasi dengan munculnya pita serapan yang tajam dan intensitas yang tinggi pada bilangan gelombang 1035,7 .Tingginya intensitas pada puncak serapan menunjukkan tingginya kandungan montmorilonit daripada bentonit cukup tinggi. Vibrasi tekuk gugus hidroksil dari Al-Al-OH muncul pada pita serapan 914,2 , sedangkan vibrasi tekuk dari Si-O-Al / Si-O-Si ditunjukkan pada bilangan gelombang 530 dan 468,7 . Katekin pada teh oolong telah mengalami oksidasi melalui enzim PPO menjadi theaflavin dan thearubigin. Pada penelitian ini digunakan pelarut etanol : air untuk direaksikan dengan katalis FeMMT. Hal ini disebabkan karena pada pelarut etil asetat : air setelah dikarakterisasi dengan LC-MS tidak menunjukkan m/z senyawa theaflavin.
Gambar 3. Kurva standar logam Fe
Studi kopling..., Septriayu Norma Yusnita, FMIPA UI, 2013
Gambar 6 dan 7 menunjukkan sesuai literatur bahwa pada waktu retensi sebesar 11,074 terdapat senyawa theaflavin pada m/z 564, sedangkan pada waktu retensi sebesar 21,807 terdapat senyawa gallocatechin dimer pada m/z 610 [7] . Senyawa isolat yang didapat akan direaksikan dengan katalis Fe-MMT dan didapat hasil KLT isolat dan hasil produk. Gambar 5. Reaksi oksidasi enzimatis katekin menjadi theaflavin massa isolat katekin yang didapat dengan pelarut etanol : air sebesar 0,0173 gram. Hasil LC-MS sebagai berikut :
Gambar 8. Hasil KLT isolat dan produk Gambar 8 menunjukkan adanya pergeseran jarak migrasi yang mengindikasikan terbentuknya produk. Hasil karakterisasi produk yang terbentuk sebagai berikut :
Gambar 6. Fragmentasi senyawa theaflavin
Gambar 9. Fragmentasi senyawa epigallocatechin gallate trimer
Gambar 7. Fragmentasi senyawa gallocatechin dimer
Studi kopling..., Septriayu Norma Yusnita, FMIPA UI, 2013
Dari hasil penelitian disimpulkan dengan karakterisasi menggunakan instrumentasi LC-MS pada isolat menunjukkan adanya 2 senyawa yaitu berupa theaflavin pada waktu retensi 11,074 dan m/z 564, sedangkan pada waktu retensi sebesar 21,807 terdapat senyawa gallocatechin dimer pada m/z 610. Sedangkan produk menghasilkan 2 senyawa yaitu pada waktu retensi sebesar 1,62 terdapat senyawa epigallocatehchin gallate trimer pada m/z sebesar 1370, pada waktu retensi sebesar 18,996 terdapat senyawa theadibenzotropolene pada m/z sebesar 974. Didapat nilai % inhibisi dari ketiga konsentrasi menunjukkan bahwa produk lebih besar dibandingkan dengan isolat.
DAFTAR PUSTAKA [1]
Dou, Jianpeng. et al. (2007). Identification and Comparison of Phenolic Compounds in the Preparation of Oolong Tea Manufactured by Semifermentation and Drying Processes. J. Agric. Food Chem. 55, 7462-7468.
[2]
Haslam, Edwin. (2003). Thoughts on thearubigins. Phytochemistry. 64, 61-73.
[3]
Kunhert, Nikolai. et al. (2010). Oxidative cascade reactions yielding polyhydroxytheaflavins and theacitrins in the formation of black tea thearubigins: Evidence by tandem LC-MS. Food Funct., 1, 180-199.
[4]
Faramayuda, Fahrauk. et al. (2010). Formulasi Sediaan Losion Antioksidan Ekstrak Air Daun Teh Hijau (Camellia sinensis L.). Majalah Obat Tradisional, 15(3), 105 – 111.
[5]
Zhu, Qin Yan. et al. (2002). Antioxidative Activities of Oolong Tea. J. Agric. Food Chem, 50, 6929-6934.
Gambar 11. Diagram chart aktivitas antioksidan
[6]
Gambar 11 menunjukkan % inhibisi dari isolat dan produk, seiring dengan bertambahnya konsentrasi maka % inhibisi semakin meningkat. Hal ini mengindikasikan bahwa produk memiliki % inhibisi yang lebih tinggi dibandingkan dengan isolat pada setiap masing-masing konsentrasi. Terbukti bahwa terbentuknya kopling menghasilkan senyawa yang memiliki gugus hidroksi yang melimpah sehingga dapat menghambat radikal bebas [9] .
Karna Wijaya, Eko Sugiharto, Mudasir, Iqmal Tahir, Ika Liawati. (2004). Sintesis Komposit Oksida-Besi Montmorillonit dan Uji Stabilitas Strukturnya Terhadap Asam Sulfat. Indonesian Journal of Chemistry, 4 (1), 33 – 42.
[7]
J. Van der Hooft, Justin J. et al. (2012). Structural Annotation and Elucidation of Conjugated Phenolic Compounds in Black, Green, and White Tea Extracts. J. Agric. Food Chem. 60, 8841-8850.
[8]
Ze Lin, Long. et al. (2008). New Phenolic Components and Chromatographic
Gambar 10. Fragmentasi senyawa theadibenzotroplone Didapatkan massa produk sebesar 0,0203 gram. Gambar 9 dan 10 menunjukkan sesuai literatur bahwa pada waktu retensi sebesar 1,62 terdapat senyawa epigallocatehchin gallate trimer pada m/z sebesar 1370, sedangkan pada waktu retensi sebesar 18,996 terdapat senyawa theadibenzotropolene pada m/z sebesar 974 [8]. Hasil uji % inhibisi sampel dan produk sebagai berikut :
% Inhibisi
100 80 60
Isolat
40
Produk
20 0 100 ppm 75 ppm 50 ppm Konsentrasi (ppm)
4. KESIMPULAN
Studi kopling..., Septriayu Norma Yusnita, FMIPA UI, 2013
Profiles of Green and Fermented Teas. J. Agric. Food Chem. 56, 8130-8140. [9]
Sang, Shengmin. et al. (2002). Chemical Studies on Antioxidant Mecahnism of Tea Catechins: Analysis of Radical Reaction Products of Catechin and Epicatechin with 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl. Bioorganic & Medicinal Chemistry 10, 2233-2237.
Studi kopling..., Septriayu Norma Yusnita, FMIPA UI, 2013
