Studi Farmakofor Reseptor COX-2 Sebagai Anti Inflamasi Nursalam Hamzah1, Ahmad Najib2, Nurshalati Thahir1, Ika Misqawati1 1
Jurusan Farmasi Fakultas Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Alauddin Makassar Fakultas Farmasi Universitas Muslim Indonesia Makassar
2
ABSTRACT Cyclooxygenase (COX) receptor is a dual-function receptor that bound to the membrane which acts to catalyze two important stages in the formation of prostanoide, namely cyclooxigenation and peroxidation. Cyclooxigenation stage is the stage in which COX cyclization process and the addition of two molecules of oxygen to arachidonic acid to form prostaglandin G2 (PGG2). While the stage is the stage of the reduction of the peroxidation of PGG2 endoperoxide become unstable compound called prostaglandine H2 (PGH2). The purpose of this study is to determine the features that are important pharmacophore on anti-inflammatory activity of compounds on COX-2 receptor. Modeling and determination pharmacophore features created using the program MOE application version 2009 Virtual screening of chemical compounds to look for natural ingredients in accordance with pharmacophore features that have been made. Molecular docking to study ligand-receptor interactions, performed using MOE. Keywords: COX-2 receptor, inflammation, pharmacophore feature, virtual screening, docking molekuler.
PENDAHULUAN Inflamasi adalah proses kompleks
bersifat progresif
dapat
menimbulkan
penyakit-penyakit
tertentu
yang
tidak
yang terjadi melalui beberapa mekanisme
diinginkan, seperti demam, periodonitis,
yang menyebabkan perubahan di dalam
atherosklerosis,
aliran
dan bahkan kanker. Hal-hal yang tidak
darah
lokal
dan
pelepasan
rheumatoid
beberapa mediator inflamasi. Mediator-
diinginkan
mediator
keluarnya enzim-enzim fagositosis dari
inflamasi
terjadinya permeabilitas leukosit
ini
menyebabkan
vasodilatasi,
peningkatan
vaskuler,
menuju
dan
tempat
migrasi terjadinya
inflamasi (Martel- Pelletier dkk., 2003). Inflamasi merupakan upaya untuk
sel-sel
tersebut
arthritis,
fagosit
,
terjadi
seperti
karena
phagocyte
oxydase, inducible nitric oxyde synthase, dan
lysosomal
protease,
yang
memproduksi senyawa-senyawa radikal bebas dan superoksida
yang
dapat
menghilangkan pemicu terjadinya luka
menyebabkan luka pada jaringan sekitar
(misalnya infeksi) dan untuk mengawali
(Abbas & Lichtman, 2004).
terjadinya
proses
penyembuhan
Meskipun
demikian,
inflamasi
JF FIK UINAM Vol.2 No.3 2015
luka. yang
Terdapat
lima
tanda
utama
(cardinal signs) yang umumnya muncul
99
saat terjadinya inflamasi, yaitu nyeri
menghambat PG pada lokasi inflamasi,
(dolor),
kemerahan
tetapi PG juga berperan penting dalam
(rubor), bengkak (tumor), dan hilangnya
bagian lain dari tubuh. Komplikasi yang
fungsi (functio laesa). Terjadinya panas
paling
dan
penggunaan
NSAID
melibatkan
saluran
panas
(calor),
kemerahan
meningkatnya
disebabkan
aliran
darah,
oleh
bengkak
sering
dikaitkan
disebabkan oleh akumulasi cairan, nyeri
(gastrointestinal).
disebabkan
pencernaan,
oleh pelepasan berbagai
dengan
adalah
pencernaan
Perdarahan
ulserasi
yang
dan
perforasi
senyawa yang merangsang syaraf nyeri,
merupakan
dan hilangnya fungsi dipengaruhi oleh
morbiditas dan mortalitas pada pasien
bermacam-
yang dirawat dengan obat-obatan ini
macam
sebab
(Chandrasoma & Taylor,2005). Obat
signifikan
(NPS, 2010: 2).
non-steroid
Pemilihan obat saat ini diharapkan
(AINS) adalah obat yang digunakan
obat dengan selektivitas yang tinggi
untuk meredakan nyeri dan inflamasi.
terhadap reseptor tertentu agar diperoleh
AINS terdiri dari kelompok AINS
efek
selektif
anti-inflamasi
penyebab
saluran
yang
menghambat (COX-1
bekerja
enzim
dan
menurunkan
non-
terapi
yang
maksimal,
oleh
dengan
karena itu, penting untuk dilakukan suatu
siklooksigenase
pengembangan obat. Salah satu metode
COX-2)
produksi
sehingga
prostaglandin,
pengembangan paling
baik
obat
saat
dan
ini
populer
yang adalah
sedangkan kelompok AINS lain (selektif
berdasarkan pendekatan komputasi (in
COX-2
silico).
inhibitor)
bekerja
dengan
Metode
komputasi
menghambat enzim COX-2. Produk obat
dikembangkan
kelompok AINS yang disetujui beredar di
untuk
Indonesia
farmakologi dan pengujian.
antara
indometacin,
lain
etodolac,
ibuprofen,
adalah
telah
dan banyak digunakan
pengembangan
hipotesis
diklofenak,
Rancangan obat adalah usaha
piroxicam,
untuk mengembangkan obat yang telah
naproxen,
meloxicam, celecoxib, etoricoxib.
ada,
yang
sudah
diketahui
struktur
Aspirin dan obat anti-inflamasi
molekul dan aktivitas biologisnya, atas
nonsteroid (NSAID) adalah salah satu
dasar penalaran yang sistematik dan
kelas obat-obatan yang paling banyak
rasional,
digunakan. NSAID diyakini bertindak
coba- coba seminimal mungkin.
melalui
penghambatan
prostaglandin
(PG)
penghambatan enzim
dengan
mengurangi
faktor
sintesis dengan
METODE PENELITIAN
siklooksigenase
Konsep farmakofor pertama kali
(COX). Kebanyakan NSAID tidak hanya
diperkenalkan pada tahun 1909 oleh
JF FIK UINAM Vol.2 No.3 2015
100
Ehrlich yang mendefinisikan farmakofor
disejajarkan (superpose) sehingga rantai
sebagai
yang
memiliki struktur yang sama yang akan
membawa (phoros) fitur penting yang
bergerak bersama-sama sebagai satu
bertanggungjawab
unit. Dengan cara ini kompleks protein-
kerangka
molekul
terhadap
aktivitas
biologis obat (Yang, 2010:1). Farmakofor
ligan dapat disejajarkan. File kemudian
menurut
IUPAC
disimpan sebagai database. Dilakukan
adalah faktor sterik dan elektronik yang
analisis PLIF dengan urutan perintah
diperlukan untuk memastikan terjadinya
DBV | Compute | PLIF | Generate
interaksi
(Hamzah, 2013)
molekuler
secara
optimal
dengan struktur target biologis spesifik
Penentuan Fitur Farmakofor
sebagai penginduksi atau penghambat
Penentuan
respon biologis (Mannhold dkk, 2006).
diawali
Alat dan data penelitian
(superpose)
Perangkat yang digunakan pada
dengan
diunduh
dilakukannya
berupa
dengan
adalah
pentium
kesamaan
spesifikasi:
set
notebook
Processor
tipe
farmakofor mensejajarkan
seluruh
dari
penelitian ini adalah perangkat keras satu
fitur
protein
situs
RCSB.
pensejajaran
untuk
yang Tujuan tersebut
mengetahui
struktur
dari
letak
senyawa-
CoreTM i3-2348M CPU @ 2,30GHz,
senyawa ligan yang memiliki potensi
RAM 4,00 GB, dan harddisk 415 GB
sebagai inhibitor COX-2. Selanjutnya
serta perangkat lunak
seluruh
WindowsTM
sistem
operasi
7 Ultimate, dan MOE
(Molecular OperatingEnvironment). Data dalam penelitian ini berupa struktur-struktur protein dan ligannya yang diunduh dari situs RCSB PDB (Protein Data Bank) Penentuan Sidik Jari Interaksi LiganProtein (Protein-Ligand Interaction
Sidik jari interaksi protein dengan ligan
dibuat
dengan
menggunakan
struktur-struktur protein yang diunduh dari
situs
RCSB
PDB
(Protein
Data Bank). Seluruh struktur kemudian dibuka
pada
merupakan
dihapus
jendela
MOE
JF FIK UINAM Vol.2 No.3 2015
dan
dan
satu
makromolekul
pelarut
yang
kesatuan
dari
protein
sehingga
sebelumnya
yang tampak pada
jendela MOE hanya ligan- ligan yang telah disejajarkan. Langkah menjalankan
selanjutnya
adalah
pharmacophore
query
editor yang bertujuan untuk membuat fitur-fitur
Fingerprint/PLIF)
reseptor
perintah
farmakofor MOE
>>
dengan
urutan
Compute
>>
Pharmacophore >> Query Editor. Skema anotasi farmakofor otomatis membuat query pharmacophore, sehingga pada jendela
MOE
akan
terlihat fitur-fitur
farmakofor yang terdapat pada senyawa ligan. Skema anotasi yang digunakan
101
adalah unified. Titik anotasi yang sesuai
tampak
dengan hasil penelitian interaksi ligan
Search.
reseptor dipilih untuk menjadi
kemudian
farmakofor.
Langkah
perbaikan query untuk
terakhir
yaitu
yang dimaksudkan
memodifikasi
menghasilkan
fitur
query
kecocokan
panel
Senyawa
Pharmacophore yang hit tersebut
disimpan
dalam
database
(*mdb). Docking Molekuler
atau dengan
pada
Preparasi Ligan. Ligan dalam bentuk
struktur
tiga
dimensi
dan
pengaturan query yang lebih ketat.
dioptimasi dengan metode Ab initio
Virtual Screening
menggunakan
Pada tahap virtual screening,
Struktur
program
kemudian
HyperChem.
disimpan
dalam
yang digunakan adalah virtual skrining
format *.mol. File dibuka pada Jendela
berbasis
MOE. Struktur
farmakofor
dimana
fitur
diprotonisasi
untuk
farmakofor yang telah diperoleh pada
menambahkan hidrogen dan muatan
tahap sebelumnya menjadi acuan dalam
parsial, dengan Protonate 3D (urutan
proses ini. Virtual skrining bertujuan
perintah
untuk
asal
Protonate 3D) dengan setting pH 7.4
tanaman yang hit atau memiliki fitur
dan cutoff 10.0. File kemudian disimpan
kimia
dalam database (*.mdb).
menemukan
yang
senyawa
mirip
dengan
fitur
MOE
Preparasi
farmakofor. Senyawa digunakan
asal
diperoleh
tanaman dari
situs
yang
diunduh
zinc
dengan
dari kode
>>
Compute
Reseptor. situs 3TCP
>>
Reseptor
RSCB.PDB dalam
format
database (www.zink-docking.org) yang
*.pdb/ent. Molekul air kemudian dihapus
didownload
dari
Adapun
dalam
bentuk
jumlah
*MOL2.
senyawa
Protein
kemudian
diprotonisasi
dengan
didownload sebanyak 3509 senyawa.
sama
preparasi
Selanjutnya
amino arginin, lisin dan histidin yang
dengan
yang
struktur.
menggunakan
pada
program aplikasi MOE dibuat database
memiliki
senyawa yang telah didownload tersebut.
pada
Setelah
dibuat
dalam
bentuk
langkah
yang
ligan.
Asam
gugus basa akan mengion
pH
7.4
lingkungan
sehingga membentuk
kationik.
Gugus-
gugus
database, selanjutnya masuk pada tahap
asam seperti rantai samping karboksilat
pencarian senyawa asal tanaman yang
asam
hit
terdeprotonisasi menghasilkan gugus
dengan
fitur
perintah MOE
farmakofor >>
(urutan
Compute
>>
aspartat
dan
glutamat
akan
anion COO- yang dapat berinteraksi
Pharmacophore >> Search). Kemudian
dengan
setelah
memastikan telah dilakukan protonasi,
proses
pencarian
selesai,
jumlah senyawa yang hit tersebut akan
JF FIK UINAM Vol.2 No.3 2015
dilakukan
gugus
ammonium.
pengecekan
Untuk
hingga
102
dipastikan tiap atom pada molekul
3Q7D, 3NT1, 3OLU,3MDL, 3HS6, dan
memiliki muatan.
1PXX.
Simulasi Docking. Ligan dan reseptor
yang
telah
Dengan menggunakan 12 struktur
diprotonisasi
kompleks ligan-protein tersebut di atas,
dibuka dalam Jendela MOE. Panel
dapat dibuat sidik jari interaksi ligan-
Simulasi docking dibuka dengan urutan
protein dengan membandingkan cara
perintah MOE
pengikatan
>>
Compute
>>
masing-masing
ligan
Simulations >> Dock. Receptor pada
terhadap residu asam amino di sisi
panel Dock diatur Receptor+Solvent,
pengikatan protein. Metode ini berguna
Site diatur Ligand Atoms. Ligand diatur
untuk meringkas
MDB File (atau Selected
jika
ligan
dan protein menggunakan skema
Ligan terbuka pada Jendela MOE dan
sidik
jari.
di-select). Placement diatur Triangle
hidrogen, interaksi ionik dan kontak
Matcher,
menggunakan
permukaan yang diklasifikasikan sesuai
London dG, dan refinement diatur Force
dengan residu asal, dan dibangun dalam
Field. Posisi docking terbaik dipilih
skema
berdasarkan nilai rmsd (≤ 2) dan nilai
representasi dari database dari protein-
scoring terendah.
ligan kompleks.
rescoring
1
Atoms
interaksi
Interaksi
sidik
jari
antara
seperti
yang
ikatan
merupakan
Penyusunan Query Farmakofor Ligan HASIL DAN PEMBAHASAN
Tujuan
Analisis Interaksi Protein-Ligan
dari
penyusunan
query
farmakofor adalah untuk menjelaskan
Tujuan dari analisis interaksi protein-
struktur 3D fitur senyawa-senyawa anti
ligan ini adalah untuk mengetahui jenis-
inflamasi
jenis dari asam amino yang terdapat
reseptor
pada situs aktif reseptor COX-2 yang
farmakofor, dan
kemudian
fitur struktur dari COX-2 yang penting
akan
berinteraksi
dengan
senyawa- senyawa ligan. Struktur
kompleks
untuk
pengikatan
dengan
dengan
menghasilkan
untuk
menentukan
untuk aktivitas biologis dengan melihat COX
dengan
residu asam amino yang berperan pada
ligan telah banyak diteliti. Terdapat 22
pengikatan.
struktur protein
farmakofor digunakan Pharmacophore
COX
yang
telah
Query
situs RCSB PDB (www.rscb.org), tetapi
Interaction Fingerprint pada program
hanya 12 struktur kompleks COX-2 yang
MOE.
mengikat
Pharmacophore
Query
Protein-Ligand
Interaction
yaitu
dengan
kode
4OTY, 4FM5, 4E1G,3RR3, 3LN0, 3LN1,
pada
JF FIK UINAM Vol.2 No.3 2015
dan
penyusunan
dilaporkan dan dapat didownload dari
ligan
Editor
Untuk
Protein-Ligand
Farmakofor
program
MOE.
digunakan Editor
dan
Fingerprint Farmakofor
103
hipotetik
yang dihasilkan juga akan
menjelaskan pengikatan ligan situs
dalam
pengikatan atau katalitik dari
reseptor. Salah satu tahapan yang sangat penting
dalam
penyusunan
query
farmakofor ligan ini adalah pada proses pensejajaran struktur 12 protein yang telah diunduh dari situs RCSB. Seluruh protein
tersebut
harus
benar-benar
sejajar, karena akan sulit untuk membuat fitur
farmakofor
dari
ligan
ketika
Gambar IV.3. Struktur protein sejajar dengan style ribbon dalam bentuk line
strukturnya tidak sejajar dengan baik. Adapun
dalam
proses
pensejajaran
tersebut, protein dibuka pada jendela MOE
satu persatu dan disejajarkan
setiap penambahan protein. Hal tersebut dilakukan
agar
pensejajaran
struktur
protein dapat berjalan maksimal dan menghasilkan dengan
baik.
struktur
yang
sejajar
Selanjutnya
untuk
memastikan struktur protein telah sejajar dengan baik, maka pada bagian ribbon diubah style menjadi line sehingga akan tampak
seperti benang-benang yang
tersusun rapi.
Sebelum membuat
masuk
fitur
pada
farmakofor
tahap ligan,
seluruh reseptor dan pelarut dihilangkan sehingga struktur
yang
bertumpuk
ligannya
saja.
hanya
Selanjutnya
pembuatan fitur farmakofor ligan dapat dilakukan
dengan
menjalankan
Pharmacophore Query Editor. Titik-titik anotasi
ligan
kemudian
akan
muncul secara otomatis. Adapun titik anotasi ligan yang dipilih terdapat tiga titik yang kemudian dibuat menjadi tiga fitur farmakofor. Ketiga fitur farmakofor tersebut masing-masing sebagai gugus anion dan akseptor proton (F1:Ani&Acc dan F2:Ani&Acc) dan gugus aromatik (F3:Aro). Tiga titik anotasi ligan tersebut dipilih
karena
banyaknya
titik
anotasi ligan yang bertumpuk pada titik tersebut.
Di
berdasarkan Gambar IV.2. Struktur protein yang telah disejajarkan (superpose)
JF FIK UINAM Vol.2 No.3 2015
samping
itu,
interaksi ligan yang
diperoleh pada tahap analisis interaksi ligan-protein, dapat dilihat interaksi ligan
104
dengan protein terjadi di titik anotasi
sisi aktif dari target seperti enzim atau
ligan
reseptor.
pada
fitur
F1:Ani&Acc
dan
F2:Ani&Acc.
Kemudian interaksi senyawa-
senyawa yang telah diikatkan kemudian diurutkan
berdasarkan
hasil
analisis
secara komputasi komponen sterik dan elektrostatiknya. Dewasa
ini
telah
banyak
ditemukan senyawa anti inflamasi dari bahan alam. Tetapi, belum diketahui senyawa-senyawa menghambat Gambar IV.4. Fitur farmakofor ligan
uraian di
yang
COX-2. atas,
penelitian
senyawa
Berdasarkan
maka
yang
memodelkan
selektif
dilakukan
secara
interaksi
yang
khusus beberapa
diketahui diketahui
memiliki aktivitas anti inflamasi melalui penghambatan COX-2. Pada
penelitian
ini
dilakukan
proses virtual skrining terhadap 3509 senyawa
kimia
bahan
alam
yang
diunduh dari situs zinc database. Dari proses tersebut senyawa dengan Gambar IV.5. Jarak antar fitur-fitur dalam farmakofor query
diperoleh
13
kimia bahan alam yang hits fitur
farmakofor
ligan
yang
memiliki interaksi dengan reseptor COX2. Docking Molekuler
Virtual Screening
Sebelum
dilakukan
docking,
Proses virtual skrining digunakan
molekul target harus dipreparasi terlebih
untuk membantu menemukan senyawa
dahulu. Molekul yang telah didownload
senyawa
dari
berpotensi
yang
kemungkinan
sebagai
obat,
besar dengan
pada
situs RCSB jendela
PDB ditampilkan
MOE.
Agar
tidak
membutuhkan waktu yang relatif singkat.
mengganggu proses docking nantinya,
Jika target telah diketahui, algoritma
molekul-molekul
docking
dihilangkan sehingga dipastikan yang
dapat
digunakan
untuk
menempatkan kandidat obat ke dalam
JF FIK UINAM Vol.2 No.3 2015
air
berinteraksi adalah molekul
sebaiknya
uji
dan
105
molekul
target. Selanjutnya dilakukan
protonasi untuk menambahkan muatan atom
dan
hidrogen
pada
(S), makin rendah nilai S maka interaksi antara keduanya makin kuat.
molekul.
Struktur protein yang digunakan adalah struktur
4OTY.
adalah
tahap
Tahap
selanjutnya
docking
senyawa-
senyawa uji terhadap COX-2. Pada proses
docking
digunakan
senyawa
perangkat
uji
lunak
ini MOE
versi 2009.
Gambar
Proses simulasi docking senyawasenyawa
uji
diawali
mengidentifikasi pengikatan
Posisi
Ligan
Asli
Protein 4OTY
dengan
kantung
dari
IV.7.
atau
enzim
sisi
tersebut.
Selanjutnya dengan fasilitas simulation dock,
senyawa-senyawa
uji
sebagai
ligan di-docking-kan pada reseptor, serta diarahkan pada sisi pengikatan yang sebelumnya telah diidentifikasi. Proses docking menggunakan ligan fleksibel dan reseptor scoring
rigid
menggunakan
London
metode docking
dG. dilakukan
metode
Gambar IV.9. Posisi Ligan Asli Protein
Validasi
3HS6
dengan
redocking native ligan pada binding site.
KESIMPULAN
Didapatkan nilai rmsd (root mean square
Berdasarkan
hasil
penelitian
deviation) lebih kecil dari 2 yang berarti
yang
metode tersebut memiliki validitas yang
bahwa:
tinggi, artinya posisi ligan copy mirip
1. Asam amino yang penting dalam
dilakukan
dapat
disimpulkan
dengan posisi ligan asli. Tabel IV.1
interaksi
menunjukkan
asal
beberapa senyawa anti inflamasi yaitu
tanaman yang diperoleh dari situs ZINC
Arg 120, Ser 530, Tyr 355, dan
Database dapat mengikat Arg 120, Tyr
Tyr
355, Tyr 385, Ser 530, Arg 513. Interaksi
385. Adapun query farmakofor yang
yang terjadi antara senyawa-senyawa
berperan
asal
reseptor memiliki fitur dua gugus
bahwa
tanaman
senyawa
dengan
reseptor
reseptor
dalam
COX-2
interaksi
dengan
ligan-
ditunjukkan dengan nilai docking score
JF FIK UINAM Vol.2 No.3 2015
106
anion dan akseptor proton, dan gugus aromatik. 2. Senyawa-senyawa potensi
sebagai
berdasarkan
yang
memiliki
inhibitor
COX-2
hasil
dari
virtual
screening terdapat 13 senyawa.
KEPUSTAKAAN
Hamzah, Nursalam. Studi Hubungan Kuantitatif Strukturaktivitas, Fitur Farmakofor Molekuler
Dan Senyawa
Pirazolo-[3,4-D]-Pirimidin Inhibitor
Mer
Tirosin
Institut
Teknologi
Docking Turunan Sebagai Kinase. Bandung,
Bandung. 2013.
Mannhold,
R.,
H.
Kubinyi,
G.
Folkers,2006, Pharmacophore and Pharmacophore Searches, Wiley – VCH, Weinheim, 3
National Prescribing Service (NPS). 2010. COX-2-Selective NSAIDs : New Wonder Drugs?
Yang, S.-Y., 2010, Pharmacophore Modelling and Applications in Drug Discovery: Challenges and Recent Advances, Drug Discovery Today, 15, 444-450.
JF FIK UINAM Vol.2 No.3 2015
107
