Ke Daftar Isi
-
PJ'iWdlIv
portonwan
dan Prosontasl
DmIah FWlDslnnal TBknls Non PWJBJIU,19 DosombBr
2008
ISSN :1410·6381
PRE PARAS I 99mTc-HUMAN IMMUNOGLOBULIN G YANG AKAN DIGUNAKAN SEBAGAI PREP ARA T PENA TAH INFEKSI/INFLAMASI Laksmi A, Widyastuti W, Sri Setyawati, Maskur, Agus A, Gina M. PRR - BAT AN
ABSTRAK PREP ARASI99mTc - HUMAN IMMUNOGLOBULIN G YG AKAN DIGUNAKAN SEBAGAI PREP ARA T PENA TAH INFEKSI/INFLAMASI , Telah dilakukan preparasi 99mTc_Human Immunoglobulin G (99mTc_hIgG) yg akan digunakan sebagai penatah infeksi/inflamasi. Preparasi 99mTc_hIgGini dilakukan dengan melalui beberapa tahapan yaitu: Reduksi hIgG menggunakan merkaptoetanol dg perbandingan molar hIgG terhadap merkaptoetanol 1:2000, pemurnian melalui kolom PD-I0, hasil pemurnian diukur serapannya dengan spektrometer UV pada panjang gelombang 280 nm dan pelabelan hIgG dengan Tc 99m , yang mana pada pelabelan ini ditambahkan kit MDP sebagai sumber Sn(lI) dan coligand serta larutan perteknetat Tc-99m dari generator Mo-99/Tc-99m. Hasil penandaan dianalisis dengan kromatografi lapis tipis/kromatografi kertas untuk mengetahui kemumian radiokimianya. Untuk mengetahui stabilitas sediaan di dalam tubuh dilakukan uji stabilitas dalam serum manusia selama 1,2 dan 3jam .Hasil analisis dengan kromatografi lapis tipis/kromatografi kertas diperoleh kemurnian radiokimia 99mTc_hIgGlebih besar 95%. Hasil pengujian kestabilan dalam serum manusa menunjukkan kemurnian radiokimia masih stabil sampai 3 jam dan dari pengamatan didapatkan hasil reduksi hIgG masih cukup stabil sampai 3 bulan ABSTRACT PREP ARA TION OF 99mTc HUMAN IMMUNOGLOBULIN G AS INFECTION/INFLAMMATION IMAGING AGENT. /Prep~ation of 99mTc -Human Immunoglobulin G(99mTq_hIgG) and its analysis have been carried out.This preparation needs several steps, first reducing hIgG using mercaptoetanol with molar ratio 2000:1, purification using PD-I0 column ( sephadex G-25,Pharmacia), and the reduced hIgG was labeled with 99mTcand MDP as transchelator. The radiochemical purity of 99mTc_hIgG was analysed using TLC/paper chromatography. The stability in the body was carried out by using fresh human serum after 1 ,2 and 3 hours incubation. the raqiochemical purity of 99mTc_hIgG analysed with TLC/paper chromatography was higher than 95 %. The stability of labeled hIgG in fresh human serum was stable after 1 ,2, 3 hours incubation and the reduced hIgG was stable until 3 months
84
--PM.
P8rtml11JandaD Prosentasl
ISSN :1410 - 6381
Umlah FIIDIIsionalToknls Non PIlll8lltl.18 Daswnbor 2006
PENDAHULUAN Radiofarmaka telah menunjukkan manfaat yang nyata dan spesifik dalam pelayanan kesehatan, terutama untuk keperluan diagnosis dan terapi, antara lain penyakit kanker,
infeksi
/ inflamasi dan lain lain. Akhir akhir ini penelitian/pengembangan irrt1amasi berkembang
mengenai radiofarmaka penyidik infeksi dan
dengan pesat, misalnya
monoklonal
antibodi bertanda,
fragmen
antibodi, peptida kemotaktik dan antibiotik bertanda [ 1 ]. Inflamasi jaringan
dengan atau tanpa infeksi merupakan
gangguan yang bersifat
heterogen dan dapat melibatkan berbagai organ dalam tubuh dengan manifestasi klinik yg bervariasi. Inflamasi adalah suatu respon yang terjadi pada jaringan yang terluka untuk membawa molekul dan sel dari sistem imun ke tempat terjadinya kerusakan, sedangkan infeksi adalah inflamasi umumnya diagnosis
yang disertai dengan kontaminasi
mikro-organisme
infeksi tidak sulit terutama apabila sudah terbentuk
[2]. Pada
abses, namun
demikian pada keadaan tertentu diagnosis menjadi sulit seperti pada penderita dengan keluhan, gejala klinik dan dari pemeriksaan fisik ditemukan gambaran yang tidak khas. Pada keadaan demikian modalitas pencitraan untuk deteksi dan penentuan lokasi inflamasi/infeksi menjadi suatu hal yang penting dalam klinik, karena dapat memberikan informasi yang penting dalam pengelolaan
penyakit
sekaligus
dapat memberikan
konfirmasi
eradikasi
infeksi setelah
pemberian antibiotik [3]. Pada saat ini beberapa modalitas diagnostik dapat digunakan
untuk deteksi dan
lokalisasi infeksi. Teknik diagnostik tersebut dapat dikelompokkan menjadi dua kelompok , yaitu kelompok yg didasarkan pada perubahan anatomis dan fisiologis. Kelompok yang didasarkan pada perubahan anatomis misalnya pencitraan menggunakan sinar-x konvensional, USG, CT dan MRI, sedangkan kelompok yang didasarkan pada perubahan fisiologis adalah p{mcitraan radionuklida
menggunakan akan
teknik
diperoleh
kedokteran
informasi
berupa
nuklir.
Pada
perubahan
pencitraan yang
terjadi
menggunakan dalam
proses
patofisiologi dan patobiokimia pada penderita. Kelebihan pencitraan dengan teknik kedokteran nuklir dibandingkan dengan pencitraan anatomis adalah, tidak dipengaruhi oleh perubahan anatomi dan secara rutin dapat dilakukan pada seluruh tubuh tanpa memberikan paparan radiasi tambahan [3].
85
-
PCUS_
PortBD\JJ311 dan ProsontaslllmIah
FWloslonal
Toknls
ISSN ;1410·5381
Non POIIODtl.18 DOS8m/Jor 2008
Penandaan monoklonal antibodi dengan IIlIn diperkenalkan oleh Locker dkk. [4]dan Rusckowski dkk. [5], tetapi secara umum prosedur penandaan dengan IllIn cukup mmit. P,;:ncitraan dengan III In lamban sampai 24 jam serta menghasilkan kualitas pencitran yang sub-optimal[6].
Adanya kelemahan penggunaan
menggunakan
99mTc yang mempakan
kamera gamma. Dibandingan dengan
11
IlIIn telah merangsang
peneliti untuk
radionuklida ideal untuk pencitraan menggunakan IIn, 99mTcmemberikan beberapa keuntungan seperti
paparan radiasi yang diterima penderita relatif lebih rendah, kualitas pencitraan lebih baik dengan pencitraan lebih pendek, serta diagnostik dapat ditegakkan lebih cepat dalam beberapa jam dengan akurasi cukup tinggi dibandingkan [7]. Dalam penelitian
ini dilaporkan
dengan I11 In yang memerlukan waktu 24 jam
hasil preparasi 99mTc_hIgG beserta uji kemumian
radiokimia uji kestabilan dalam semm manusia yg akan digunakan sebagai preparat penatah infeksi/inflamasi.
Diharapkan
penelitian
ini dapat menyumbangkan
tambahan
informasi
(Merck), MDP ( fluka) , kolom
PD-IO (
dalam pengembangan Radiofarmaka penatah infeksi/inflamasi.
BAHAN DAN TATA KERJA Bahan dan Peralatan Bahan yg digunakan ialah SnCh.2H20 st::phadex G-25 Pharmacia),
Merkaptoetanol
( Sigma), hIgG (Sandoz),
air demin, air
bidestilasi steril ( IPHA), larutan HCI 0,01 N,larutan PBS O,OIM pH 7,4,gas nitrogen dan lain lain. Alat yang digunakan
ialah peralatan gelas standar, tabung mikro, Syringe dan pipet
eppendorf berbagai ukuran, timbangan , Ph meter, HPLC ( Shimadzu ) dengan kolom SE, Spektrometer UV, peralatan kromatografi kertas/lapis tipis dan lain-lain.
Tata kerja Reduksi dan pemurnian hIgG. Sebanyak 500 !1llarutan hIgG yg mengandung
50 mg/ml hIgG direduksi dengan cara
direaksikan dengan merkaptoetanol dengan perbandingan molar 1:2000 dan diinkubasi selama
86
Pr1ls1!11JJJPBl'twnuan iii--~-
dan Prosontasillmlah
FWlDSlonaJ Toknls Non PonoIIU,18
Dosombor
2008
ISSN :1410 • 6381
30 menit dalam suhu kamar, hasil reduksi dilewatkan pada kolom PD-I0 yang telah diaktifkan , kemudian dielusi dengan larutan PBS O,OIM pH 7,4 yang telah dijenuhkan dengan gas ni.trogen, eluat ditampung tiap Iml yang
masing
masing fraksi diukur serapannya dengan
spektrometer UV pada panjang gelombang 280 nm, fraksi yang mengandung hIgG dihitung kadarnya dari persamaan regresi yang diperoleh dari kurva kalibrasi standar hIgG.
P,mandaan
99mTc_
hIgG
Ke dalam kit MDP (PRR)
ditambahkan larutan NaCI fisiologis ( salin ) hingga
volume akhir 5 ml kemudian divortex, kemudian tambahkan sebanyak 3-10 III ke dalam tabung mikro yang mengandung (10-50) III 5490 ppm larutan hIgG yang telah direduksi ,kemudian tambahkan
sebanyak (2-3) mCi larutan 99mTc dari generator
Mo99!fc-99m,
diinkubasi dalam suhu kamar selama 30 menit
AJilalisa Fraksi hIgG yang telah direduksi diidentifikasi dg HPLC menggunakan kolom 'size exlusion'(SE) gelombang
BIORAD dengan eluen larutan PBS pH 7 dan detektor UV pada panjang 280 nm yang prinsip pemisahannya berdasarkan perbedaan berat molekul untuk
spesi yang berat molekulnya lebih besar akan terelusi lebih awal, hasilnya dibandingkan dengan hIgG yang belum direduksi, kemurnian radiokimia diuji dengan kromatografi kertas dengan eluen aseton untuk menentukan %99mTcbebas dan kromatografi lapis tipis dengan eluen buffer sitrat 0,15 M pH 5,5 untuk menentukan % 99mTc02 , dg demikian kemurnian radiokimia 99mTc- hIgG dapat dihitung. Untuk mengetahui stabilitas sediaan di dalam tubuh dilakukan uji stabilitas dalam serum manusia dengan cara mereaksikan sediaan yang telah ditandai dengan 99mTcdengan serum manusia dan PBS , diinkubasi selama 1, 2, 3 jam dan hasilnya dianalisis kromatografi kertas / kromatografi lapis tipis
87
pros_
iiii- --
PW'tanwan
dan Prosontasillmlah
ISSN :14ID - 6381
FW\lJsJonaI ToknIs NDn PonoDtI, 18 Dosombor 2006
HASIL DAN PEMBAHASAN. HasH pengujian dengan HPLC untuk hIgG standar menunjukkan puncak tunggal pada menit ke 9,017
ditunjukkan pada Gambar 1 dan untuk
hIgG hasH reduksi menunjukkan
puncak pada menit ke 16,763 dan 20.417 yang ditunjukkan
pada Gambar 2, hal ini
menunjukkan bahwa telah terjadi fragmentasi molekul pada hIgG hasil reduksi atau ikatan disulfida pada antibodi terse but telah tereduksi.
~1,,--,'don 'irn_ (MNT) II
10
311
in
Gambar 1. Kromatogram HPLC hIgG standar kolom SE250 BIORAD, eluen buffer phospat pH 7 , detektor UV dengan panjang gelombang 280 nm
10
1$
Gambar 2. Kromatogram HPLC hIgG hasil reduksi kolom SE250 BIORAD, eluen buffer phospat pH 7 , detektor UV dg panjang gelombang 280 nm
88
-
ProsldllJJ pcrtumuan dan Prosontaslllrnlah
FWloslonai Tokllls Non PonuDtl.18 Dosamllor 2DD8
ISSN :1410 . 6381
Hasil pengujian kemurnian radiokimia dengan kromatografi kertas untuk 99mTe_hIgG dapat dilihat pada Tabel 1 . Dad Tabel 1 dapat dilihat untuk nomer pereobaan 1 sid 3 k{:murnian radiokimia di atas 95% hal ini menunjukkan
bahwa· baik hasil reduksi hIGg
,metoda analisis maupun metoda penandaan dan komposisi sediaan yang digunakan eukup bagus.untuk selanjutnya dipilih formula pereobaan 3 , karena dengan kandungan hIgG yg lebih keeil kemurnian radiokimianya tidak jauh berbeda hal ini bisa lebih menghemat jumlah hIgG yang dipakai.
Tabel 1. Hasil Analisis Kemurnian Radiokimia dg TLC _
.•..
25 5 98,8 MDP 103 50 10 2,21 2,47 2,47 97,8 No.98,9 mCi) lar 5490 ppm I/I/IDTc ( lar Aktivitas %hIgG I/l/nlTc_hIgG (J!I)
Hasil uji stabilitas sediaan dalam serum manusia dan dalam PBS dapat dilihat
pada
Gambar 3 , dad Gambar 3 ini dapat dilihat bahwa baik dalam serum manusia ataupun dalam PHS setelah diinkubasi dalam 1 jam, 2 jam maupun 3 jam kemurnian radiokimia sediaan
relatif konstan
I
rata2 diatas 95% , hal ini menunjukkan bahwa sediaan Te-99m hIgG yang
dihasilkan eukup stabil dalam dalam tubuh manusia , diharapkan sediaan ini bisa digunakan untuk kepentingan
diagnosis infeksi maupun inflamasi.
89
prosldlJJJ
pertwnuan
_
dan PrDSontasl
11m/aft FWluslonaJ Jokola
Non PonoJJtJ.18 DDSombor 2006
n
ISSN :1410 • 6381
98 97 % Tc-99m 96 hlgG 95 94 9
dim PBS
&Idim serum
Gambar 3. Uji stabilitas 99mTc_hIgG dalam serum manusia dan dalam PBS
Pengamatan stabilitas hasil reduksi dapat dilihat pada Gambar 4, pengamatan stabilitas hasil reduksi ini sangatlah penting
, karena hal ini menyangkut masa kadaluwarsa dari hasil
reduksi , sehingga bisa memperkirakan berapa banyak hIgG yang ingin di reduksi dan kapan kira-kira reduksi ulang harus kita lakukan lagi sesuai dengan ~~butuhan atau pesanan, pengujian stabilitas hasil reduksi dilakukan
dengan cara melakukan penandaan sediaan
dengan Tc-99m dan di lakukan analisis kemurnian radiokimia dengan kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis, dari Gambar 4 dapat dilihat bahwa dari sampai rentang waktu 3bulan (01/05/06
sid 03/08/06)
hasil kemurnian radiokimia99mTc-hIgG ternyata masih cukup tinggi
yaitu masih di atas 92% hal ini menunjukkan bahwa hasil reduksi hIgG masih cukup stabil sampai rentang waktu 3 bulan.
90
-
Pro_
PurtBmuan dan PrllS!lJ!aslllr~IUJIgslonal
ISSN :1410 • 6381
TBknlsNDnPonoIIt118DOS8IIIII8r 2008
uji stabilitas hlgG hasil reduksl 9910/: 98 97 96 kemurnian 95 radiokimia Tc- 94 99m-lgG 93 92 91 90 89 10/5/2006
7/6/2006
28/06/06
19/07/06
waktu pengujian
Gambar 4. Pegamatan stabilitas hasil reduksi hIgG dalam rentang waktu 3 bulan Reduksi dilakukan pada tanggal 01/05/06
KESIMPULAN
DAN SARAN
Dari hasil kromatogram HPLC dan ditunjang dengan hasil penandaan hIgG dg Tc-99m dapat
dikctahui
bahwa
reduksi
hIgG
dengan
menggunakan
merkaptoetanol
dengan
perbandingan moll :2000 dan pemurnian dengan kolom PD-IO (sepadex g-25, Pharmacia) , (:ukup berhasil . Hasil penandaan dapat dilihat dari hasil uji kemumian radiokimia yang mencapai lebih dari 95%, menunjukkan bahwa selain hasil reduksi yg cukup herhasil juga metode penandaan dan metode analisis cukup baik.Dari uji stabilitas sediaan dalam tubuh dapat disimpulkan bahwa sediaan ini cukup stabil dalam tubuh manusia. Dari pengamatan selama kurang lebih 3 bulan dapat disimpulkan hasil reduksi WgG ini masih cukup stabil sampai rentang waktu 3 bulan. Dari semua hasil analisis dan pengamatan tersebut dapat diharapkan sediaan 99mTc_hIgG ini bisa digunakan untuk sediaall infeksi/inflamasi.
Untuk itu perlu
radiofarmaka penatah
dilanjutkan dengan uji biodistribusi dan uji klinis lebih
lanjut serta diharapkan pellelitian illi juga dapat mellyumbangkan tambahan illformasi dalam pengembangan Radiofarmaka penatah infeksi/inflamasi.
91
..
prosIIIIIJJ portmnuan -----
dan PrusontasllimIaII
ISSN :1410 - 5381
FWiDSlonaJToknls Non PonOUtl. 18 Dosombor 2006
DAFT AR PUSTAKA 1. H.J.J.M. RENEN,F.H.M.Corstens,
W.J.G.Oyen, et al.,"New concepts infection! inflamation
imaging ", Q J Nucl Med 2001,45:167-73. 2. ROITT 1M. Essential immunology.
6th
3. A. HUSSEN S KARTAMIHARJA.
edn. Oxfort: Blackwell Scientifik 1989.
Peranan Teknik Kedokteran Nuklir dalam Penentuan
fokus Infeksi. Kumpulan Makalah Pertemuan Ilmiah Dwi tahunan PKBNI-PKNI-BATAN, Jakarta, 2002, 103-111. 4. LOCKER JT,Seybold K, Andres RY, et al. Imaging of inflamantory and infectious lession after injection of
radioiodinated
monoclonal anti granulocyte
antibodies.
Nuc/ Med
Commun. 1986;7:659-670. 5. RUSCKOWSKI M, Fitz B, Hnatowich DJ. Lokalization of infection using strepavidin and biotin;
an
alternatiive
to
nonspesific
polyclonal
immunoglobulin.
J Nuc/ Med.
1992;33: 1810-1815. 6. PALESTRO ,CJ, Weiland FL, Seabold JE et al. Localizing infection with a teclmetium 99m-Iabeled peptide: initial results. Nuc Med Commun 2001; 22(6):695-701. 7. FOGELMAN,
1., Bone scaning in clinical Nuclear Medicine,3d ed, Maisey, Britton and
Coiler Eds, Chapman & Hall Medical, London, 1991:147-150.
T~mya - Jawab : 1. Penanya
: Anna R (PRR - BAT AN)
Pertanyaan Pada proses pelabelan HigG- TC99m diperlukan Coligand kit MDP sebagai sumber Sn (II). Apakah Sn (II) hanya dapat diperoleh dari kit MDP saja? Apakah kit MDP hanya sebagai sumber Sn (II) saja atau ada yang lain? Jawaban
: Laksmi A (PRR - BAT AN)
Sebagai sumber Sn bisa dipakai kit pirostan (phirophospat). Selain sebagai sumber Sn kit MDP dipakai juga sebagai co-ligand/chelator,
yaitu untuk mengurangi
kemungkinan
terhidrolisisnya Tc-99m menjadi TC02 yang berbentuk koloid yang membuat lambatnya reaksi kompleksasinya Tc-99m - AB.
92
Ke Daftar Isi
