Modifikasi Struktur Senyawa Asam p-metoksi Sinamat Melalui Proses Nitrasi Serta Uji Aktivitas Sebagai Anti Inflamasi

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

Modifikasi Struktur Senyawa Asam p-Metoksi Sinamat Melalui Proses Nitrasi Serta Uji Aktivitas Sebagai Anti Inflamasi

SKRIPSI

MUHAMAD SYAHID ALI NIM: 1111102000115

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN PROGRAM STUDI FARMASI JAKARTA JUNI 2015

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

Modifikasi Struktur Senyawa Asam p-Metoksi Sinamat Melalui Proses Nitrasi Serta Uji Aktivitas Sebagai Anti Inflamasi

SKRIPSI Diajukan Sebagai Salah Satu Syarat Untuk Mendapat Gelar Sarjana Farmasi

MUHAMAD SYAHID ALI NIM: 1111102000115

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN PROGRAM STUDI FARMASI JAKARTA JUNI 2015

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS

Skripsi ini adalah hasil karya saya sendiri dan semua sumber baik yang dikutip maupun dirujuk telah saya nyatakan dengan benar.

Nama

: Muhamad Syahid Ali

Nim

: 1111102000115

Tanda Tangan : Tanggal

: 15 juni 2015

iii

ABSTRAK Nama : Muhamad Syahid Ali Nim : 1111102000115 Program Studi : Strata-1 Farmasi Judul : Modifikasi Struktur Senyawa Asam p-Metoksi Sinamat Melalui Proses Nitrasi Serta Uji Aktivitas Sebagai Anti Inflamasi. Etil p-metoksisinamat merupakan senyawa utama yang terdapat dalam rimpang kencur. Tujuan dari penelitian ini adalah memodifikasi struktur asam pmetoksisinamat (APMS) yang dihidrolisis dari etil p-metoksinamat (EPMS) dan menilai terhadap aktivitas antiinflamasi. Modifikasi senyawa Etil pmetoksisinamat dilakukan melalui reaksi hidrolisis menggunakan NaOH sebagai katalis, etanol sebagai pelarut yang selanjutnya menghasilkan senyawa asam pmetoksisinamat. Senyawa asam p-metoksisinamat selanjutnya direaksikan melalui reaksi nitrasi dengan menggunakan HNO3 sebagai reagen dan menggunakan metode cold microwave menghasilkan senyawa asam p-metoksisinamat yang mengandung gugus nitro. Hasil modifikasi diidentifikasi menggunakan GCMS, IR, 1H-NMR, 13C-NMR dan HSQC. Uji aktivitas antiinflamasi dilakukan dengan menggunakan metode antidenaturasi Bovine Serum Albumin (BSA). Senyawa Asam p-metoksisinamat dapat menginhibisi denaturasi protein pada konsentrasi 10 ppm ( 0,115%) dan pada konsentrasi 100 ppm (0,325%) serta tidak mampu menginhibisi pada konsentrasi 0,1 ppm ( -0, 54) dan 1 ppm (-0,34). Senyawa hasil modifikasi Asam p-motoksisinamat menginhibisi denaturasi protein pada konsentrasi 0,1 ppm (36,71%), 1 ppm (29,65%) dan 10 ppm ( 15,32 %), akan tetapi pada konsentrasi 100 ppm (-7,93) tidak dapat menginhibisi denaturasi protein. Hasil ini menunjukan bahwa terjadi peningkatan aktivitas antiinflamasi pada senyawa nitrasi APMS dibandingkan pada senyawa APMS. Kata kunci : Etil p-metoksisinamat, hidrolisis, Asam p-metoksisinamat, nitrasi, antiinflamasi, Bovine Serum Albumin.

vi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

ABSTRACT

Name Study Program Title

: Muhamad Syahid Ali : Bachelor of Pharmacy : Structure Modification of p-Metoxycinnamate Acid Through Nitration Process and Deternination of Antiinflammatory Activity

Kencur contains a large amount of ethyl p-methoxycinnamate compound. The aims of this study were to modified the ethyl p-methoxycinnamate into pmethoxycinnamate acid through hydrolysis reaction and determined the antiinflammatory activity. Ethyl p-methoxycinnamate was modified into pmethoxycinnamate through hydrolysis reaction using NaOH as a catalyst,and ethanol as a solvent. Then, p-methoxycinnamate was modified into pmethoxycinnamate acid nitro derivative through nitration process using cold microwave method and HNO3 as a reagent. The resuls were identified using GCMS, IR, 1H-NMR. 13C-NMR, and HSQC. The determination of antiinflammatory activity was performed using Bovine Serum Albumin (BSA). pMethoxycinnamate acid 10 ppm (0.115%) and 100 ppm (0.325%) inhibits the protein denaturation, while the 0.1 ppm (-0,54) and 1 ppm (-0,34) showed no inhibition. And the p-methoxycinnamate nitro derivative 0.1 ppm (36.71%), 1 ppm (29.65%), and 10 ppm (15.32%) inhibits the protein denaturation, while the 100 ppm (-7,93) showed no inhibition. This results showed that anti-inflammatory activity of p-methoxycinnamate acid nitro derivative was increased compared to p-methoxycinnamate acid. Keywords

:Ethyl p-methoxycinnamate, hydrolysis, p-methoxycinnamate acid, nitration, anti-inflammation, Bovine Serum Albumin

vii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

KATA PENGANTAR Alhamdulillah , puji dan syukur kehadirat allah SWT yang telah melimpahkan rahmat dan karunia-Nya, serta shalawat dan salam selalu tercurah kepada junjungan kita Nabi Muhamad SAW karena dengan segala rahmat dan karunia-Nya penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penulisan skripsi dengan judul “Modifikasi Struktur Senyawa Asam p-metoksisinamat Melalui Proses Nitrasi Serta Uji Aktivitas Sebagai Antiinflamasi”. Skripsi ini disusun untuk memenuhi tugas akhir sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada Fakultas Kedokteran dan Kesehatan Program Studi Farmasi UIN Syarif Hidayatullah, Jakarta. Pada kesempatan ini perkenankanlah penulis menyampaikan ucapan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada : 1. Kedua orang tua ayah Yayan Taryana dan ibu Lia Nurhaliah tercinta yang telah memberikan kasih sayangnya, doa, semangat, dukungan moril maupun materi, tiada yang bisa aku balas atas semua pemberiannya, hanya ucapan terimakasih ini yang bisa aku sampaikan. Kepada keduan kaka tercinta A Edi & A Dede, kepada adik-adik tersayang Fanji, Piki, dan adik kesayanganku Gangan & Gingin yang selalu menyemangatiku dalam menuntun ilmu. 2. Ibu Ismiarni Komala, M.Sc.,Ph.D.,Apt sebagai pembimbing I dan bapak Supandi, M.Si.,Apt sebagai pembimbing II yang telah memberikan ilmu, nasihat, waktu, tenaga, dan pikirannya selama penelitian dan penulisan skripsi. 3. Bapak Dr.H. Arif Sumantri, SKM.,M.Kes selaku Dekan Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta. 4. Bapak Yardi.,Ph.D., Apt, selaku Kepala Program Studi Farmasi dan Ibu Nelly Suryani., Ph.D., Apt selaku sekertaris Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta. 5. Ibu Dr. Hj. Delina Hasan, M. Kes., Apt selaku pembimbing akademik yang telah memberikan arahan selama masa perkuliahan

viii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

6. Bapak dan Ibu dosen staf pengajar yang telah memberikan ilmu pengetahuan yang banyak dalam menempuh pendidikan di Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta. 7. Teman-teman seperjuangan “KENCUR” : Reza, Indri, Nova, Aziz, Sutar, Indah, Mida, BTR, & Adyt yang telah saling membantu menyelesaikan permasalah baik saat penelitian maupun saat penulisan skripsi dan tidak lupa kepada ka Ipho dan Ka Fikri yang telah membimbing penelitian ini. 8. Nicky yang banyak membantu dalam penelitian dan belajar. 9. Teman-teman yang suka membantu dalam belajar : Fio (gembul), Rhesa (Uni), Rianisa (achi), Reza (Abang), puspita dll yang selalu membantu belajar dari awal kuliah sampai perkuliahan berakhir dan kepada ayu DG, wina, henny, Icho yang telah membantu dalam berbagai hal sehingga saya bisa menyelesaikan kuliah di farmasi UIN Jakarta. 10. Teman-teman satu kontrakan dan teman bermain : Wahidin mamet, Rijal, Mozer, Andis, Akas, Haidar dll. 11. Teman-teman Farmasi 2011 dan spesial untuk kelas C yang telah memberikan memori yang indah selama perkuliahan di pinggiran ibukota Jakarta ini. Tanpa kalian perjalanan mencari ilmu ini tidak akan berwarna. 12. Para staf dan karyawan program studi farmasi, staf laboran, ka Eris, ka Tiwi, ka Lisna, Ka liken, Mb Rani, dan pak Rahmadi yang banyak membantu selama penelitian berlangsung. Penulis menyadari bahwa penyusunan skripsi ini masih belum sempurna. Oleh karena itu kritik dan saran yang bersifat membangun sangat penulis harapkan guna tercapainya kesempurnaan skripsi ini. Akhirnya, dengan segala kerendahan hati, penulis berharap semoga hasil penelitian ini dapat bermanfaat baik bagi kalangan akademis, khususnya bagi mahasiswa Farmasi, Masyarakat pada umumnya dan bagi dunia ilmu pengetahuan. Ciputat,

Juni 2015

Penulis

ix UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI TUGAS AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Sebagai sivitas akademika Universitas Islam Negeri ( UIN ) Syarif Hidayatullah Jakarta, saya yang bertandatangan dibawah ini :

Nama

: Muhamad Syahid Ali

Nim

: 1111102000115

Program Studi

: Strata-1 Farmasi

Fakultas

: Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

Jenis Karya

: Skripsi

Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya menyetujui skripsi/ karya ilmiah saya, dengan judul :

MODIFIKASI STRUKTUR SENYAWA ASAM P-METOKSISINAMAT MELALUI PROSES NITRASI SERTA UJI AKTIVITAS SEBAGAI ANTIINFLAMASI

Untuk dipublikasikan atau ditampilkan di internet atau media lain yaitu Digital Library Perpustakaan Universitas Islam Negeri ( UIN ) Syarif Hidayatullah Jakarta untuk kepentingan akademik sebatas sesuai dengan Undang-Undang Hak Cipta.

Dibuat di

: Jakarta

Pada tanggal : april 2015 Yang menyatakan

Muhamad Syahid Ali

x UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR ISI HALAMAN JUDUL ........................................................................................... ii HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS .............................................. iii HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ............................................... iv HALAMAN PENGESAHAN ............................................................................. v ABSTRAK ........................................................................................................... vi KATA PENGANTAR .......................................................................................viii HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI........................ x DAFTAR ISI ........................................................................................................ xi DAFTAR GAMBAR .........................................................................................xiii DAFTAR TABEL .............................................................................................xiv DAFTAR LAMPIRAN .....................................................................................xv DAFTAR SINGKATAN ................................................................................... xvi BAB 1 PENDAHULUAN ................................................................................... 1 1.1 Latar Belakang ................................................................................... 1 1.2 Rumusan Masalah.............................................................................. 2 1.3 Tujuan Penelitian ............................................................................... 3 1.4 Hipotesa ............................................................................................. 3 1.5 Manfaat Penelitian ............................................................................. 3 BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA .......................................................................... 4 2.1 Etil p-metoksisinamat ........................................................................ 4 2.2 Asam Nitrat........................................................................................ 5 2.3 Hidrolisis ........................................................................................... 5 2.4 Nitrasi ................................................................................................ 7 2.5 Kromatografi ..................................................................................... 9 2.5.1 Kromatografi Lapis Tipis ............................................... 10 2.5.2 Kromatografi Kolom ...................................................... 11 2.5.3 kromatografi gas............................................................. 12 2.6 Spektroskopi ..................................................................................... 13 2.6.1 Spektroskopi UV-Visible ................................................ 13 2.6.2 Spektroskopi Infra Merah .............................................. 13 2.6.3 Spektrofotometri Resonansi Magnetik ........................... 14 2.7 Uji inVitro Antiinflamasi dengan Bovine Serum Albumin ................ 15 BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN ............................................................ 16 3.1 Lokasi dan Waktu .............................................................................. 16 3.2 Alat dan Bahan .................................................................................. 16 Alat ..................................................................................................... 16 Bahan .................................................................................................. 16 3.3 Prosedur Penelitiaan ........................................................................... 16 3.3.1 Hidrolisis Etil p-metoksisinamat .......................................... 16 3.3.2 Nitrasi Asam p-metoksisinamat ........................................... 17 3.3.3 Identifikasi ........................................................................... 17 3.3.4 Pembuatan Reagen untuk Uji Antiinflamasi ........................ 18 3.3.5 Uji Invitro Antiinflamasi ...................................................... 19 (a) Pembuatan Larutan Uji ........................................................... 19

xi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

(b) Pembuatan Larutan Kontrol Positif......................................... 19 (c) Pembuatan Larutan Kontrol Negatif ....................................... 19 BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN ......................................................... 20 4.1 Modifikasi Senyawa Etil p-metoksi Sinamat dengan reaksi Hidrolisis ............................................................................................ 20 4.2 Modifikasi Senyawa Asam p-metoksi Sinamat Dengan Reaksi Nitrasi .................................................................................................. 21 4.3 Identifikasi Senyawa Hasil Modifikasi .............................................. 23 4.3.1 Senyawa Hasil Hidrolisis Etil p-metoksisinamat.................24 4.3.2 Senyawa Hasil Nitrasi Asam p-metoksisinamat..................25 4.4 Pengujian Aktivitas Antiinflamasi dan Hubungan Struktur Aktivitas Senyawa Hasil Modofikasi................................................32 BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN ............................................................... 36 5.1 Kesimpulan......................................................................................... 36 5.2 Saran .................................................................................................. 36 DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................... 37

xii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR GAMBAR 1. Gambar jalur sikimat dalam biosintesa fenilpropaoid untuk menganalisa etil p-metoksisinamat .................................... 4 2. Gambar mekanisme reaksi hidrolisis pada ester.......................... 6 3. Gambar mekanisme reaksi hidrolisis ester dengan katalis basa 7 4. Gambar prinsip subtitusi elektrofilik pada aromatis .................. 8 5. Gambar Mekanisme nitrasi aromatik ........................................... 9 6. Gambar KLT senyawa hasil Hidrolisis ......................................... 20 7. Gambar Reaksi Hidrolisis............................................................... 21 8. Gambar KLT Optimasi Reaksi Nitrasi ......................................... 22 9. Gambar Reaksi Nitrasi Hasil Hidrolisis ........................................ 22 10. Gambar Hasil KLT senyawa dengan eluen heksan:etil (3:2) ..... 23 11. Gambar Serbuk APMS ................................................................... 24 12. Gambar Fragmentasi Senyawa Hasil Hidrolisis EPMS .............. 25 13. Gambar Struktur Senyawa Asam p-metoksisinamat .................. 25 14. Gambar Senyawa Hasil Nitrasi Nitrasi 4-Metoksi-2-Nitro-betaNitrostirena ........................................................................................ 25 15. Gambar Spektrum IR ..................................................................... 26 16. Gambar Spektrum GCMS Senyawa 4-Metoksi-2-Nitro-betaNitrostirena ........................................................................................ 27 17. Gambar Fragmentasi Massa Senyawa Hasil Nitrasi APMS ....... 28 18. Gambar Asam p-metoksisinamat & senyawa hasil modifikasi nitras ................................................................................................. 28 19. Gambar H-NMR Senyawa Hasil Nitras ........................................ 28 20. Gambar C-NMR Senyawa Hasil Nitrasi ....................................... 30 21. Gambar HSQC Senyawa Hasil Nitrasi .......................................... 31 22. Gambar Diagram Aktivitas Antiinflamasi .................................... 34 23. Gambar Senyawa Modifikasi ......................................................... 35

xiii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR TABEL 1. Tabel enafsiran IR ........................................................................... 26 2. Tabel Data Pergeseran Kimia (ὁ ) Spektrum 1H NMR Senyawa 4Metoksi-2-Nitro-beta-Nitrostirena ( CDCl3, 500 MHz) ............... 2 3. Tabel C-NMR senyawa 4-Metoksi-2-Nitro-beta-Nitrostirena .... 32 4. Hasil Uji Antiinflamasi Senyawa Kontrol dan Senyawa Hasil Modifikasi .................................................................................................. 33

xiv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1: Kerangka Penelitian ..................................................................... 40 Lampiran 2: Skema Identifikasi Senyawa Hasil Modifikasi .......................... 41 Lampiran 3: Identifikasi Senyawa Etil p-metoksisinamat .............................. 42 Lampiran 4: Spektrum IR Etil p-metoksisinamat ........................................... 43 Lampiran 5: Spektrum GC-MS Etil p-metoksisinamat .................................. 44 Lampiran 6: Spektrum 1H-NMR Etil p-metoksisinamat ............................... 46 Lampiran 7: Spektrum GC-MS Senyawa Asam p-metoksisinamat .............. 49 Lampiran 8: Spektrum IR Senyawa Reaksi Nitrasi ........................................ 50 Lampiran 9: Spektrum GC-MS senyawa Reaksi Nitrasi ................................ 51 Lampiran 10: Spektrum NMR Senyawa Hasil Reaksi Nitrasi ....................... 52 Lampiran 11: Perhitungan Reaksi .................................................................... 63 Lampiran 12: Hasil Perhitungan Uji Antiinflamasi ........................................ 65 Lampiran 13: Kurva Uji Antiiflamasi .............................................................. 66 Lampiran 14 : Gambar Senyawa ...................................................................... 67 Lampiran 15: Gambar Analisis Senyawa ......................................................... 68

xv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR SINGKATAN AINS Anti Inflamasi Non Steroid COX Siklooksigenase g gram IR Infra Red KLT Kromatografi Lapis Tipis NMR Nuclear Magnetic Resonance UV Ultra Violet EPMS Etil p-Metoksisinamat APMS Asam p-Metoksisinamat

xvi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB 1 PENDAHULUAN

1.1

Latar Belakang Indonesia dikenal sebagai negara dengan sumber daya hayati kedua terbesar

didunia yang tersebar dari Sabang hingga Merauke. Di Indonesia terdapat lebih kurang 30.000 jenis tumbuh-tumbuhan, lebih kurang 7.500 jenis diantaranya termasuk tanaman berkhasiat obat lebih dari 1.800 jenis tanaman telah diidentifikasi dari beberapa formasi hutan, namun hingga saat ini pemanfaatannya belum optimal. Jumlah tanaman obat yang dimanfaatkan oleh masyarakat baru sekitar 1.000 hingga 1.200 jenis, dan yang digunakan secara rutin dalam industri obat tradisional baru sekitar 300 jenis (BPOM, 2014). Salah satu tanaman tradisional yang dimanfaatkan untuk obat-obatan adalah Kencur (Kaempferia galanga L.). Kencur diketahui mengandung minyak atsiri dan merupakan salah satu tanaman Suku Zingiberaceae. Secara empirik rimpang kencur sering digunakan sebagai obat tradisional, salah satunya sebagai anti inflamasi (Hasanah et al, JMS 2011). Kandungan metabolit sekunder dalam ekstrak kencur diantaranya ialah asam propionat (4,7%), pentadekan (2,08%), asam tridekanoat (1,81%), 1,21-decosadiene (1,47%), beta sitosterol (9,88%), dan komponen terbesarnya adalah etil p-metoksisinamat (80,05%) (Umar et al, 2012). Dalam studi in vitro, etil p-metoksisinamat secara non-selektif menghambat aktivitas COX-1 dan COX-2, dengan masing-masing nilai IC50 1,12 μM dan 0,83 μM. Hasil ini memvalidasi aktivitas antiinflamasi kencur yang dihasilkan oleh penghambatan COX-1 dan COX-2 (Umar et al, 2012). Dari berbagai penelitian, epidemiologi, dan studi klinis menunjukkan bahwa AINS mempunyai prospek yang menjanjikan sebagai agen antikanker (Kashfi, 2002). Etil p-metoksisinamat terdapat pada kencur (Kaempferia galangal Linn) dalam jumlah yang besar. Etil p-metoksisinamat dapat diisolasi dan dimurnikan dengan mudah (Barus, 2009) Modifikasi etil p-metoksisinamat yang telah dilakukan adalah amidasi dengan dietanolamin (Bangun, 2011), amidasi dengan etanolamin (Barus, 2009), adisi brom dengan pelarut karbontetraklorida dan reduksi dengan logam natrium dan etanol kering (Surbakti, 2008), modifikasi dengan pereaksi pemecah eter

1

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

2

(Nurhayati, 2010) tanpa dilakukan uji aktivitas senyawa, modifikasi dengan proses hidrolisis (Mufidah, 2014). Senyawa asam p-metoksisinamat (APMS) merupakan senyawa turunan dari etil p-metoksisinamat yang direaksikan melalui proses hidrolisis. Menurut hasil penelitian sebelumnya asam p-metoksisinamat yang dihasilkan dari proses hidrolisis etil p-metoksisinamat tidak memiliki aktivitas antiinflamasi (Mufidah, 2014). Salah satu kelemahan dari senyawa antiinflamasi non steroid adalah kurang selektif karena menghambat COX-1 dan COX-2 dengan efek samping yang sering terjadi adalah induksi tukak peptik (Nazeruddin G. M. et al, 2010) yang sering disertai dengan anemia sekunder akibat perdarahan saluran cerna (Farmakologi, 2007). Dalam rangka mengeksplorasi hubungan struktur aktivitas senyawa asam p-metoksisinamat, maka akan dilakukan penelitian tentang pengaruh penambahan atau pengurangan gugus tertentu pada struktur aromatis yakni dengan melakukan substitusi gugus NO2, dengan adanya substitusi NO2 pada APMS diharapkan dapat meningkatkan aktivitas antiinflamasi dan alasan di balik pengembangan kelas obat ini adalah bahwa gugus NO2 dapat mempertahankan aliran darah mukosa lambung dan mencegah leukosit pada endotel vaskular sirkulasi splanknikus (salah satu peristiwa paling awal setelah pemberian AINS) sehingga dapat melawan efek merugikan dari COX-1 dan cedera mukosa tidak terjadi (Halen et al, 2009). Uji antiinflamasi dilakukan secara in vitro menggunakan Bovine Serum Albumin (BSA) dengan melihat efek denaturasi pada BSA. Pengujian ini dipilih karena mempunyai banyak keuntungan yaitu mudah dalam pengerjaan, membutuhkan sampel yang sedikit, cepat, dan merupakan uji pendahuluan dalam pengujian antiinflamasi

1.2

Rumusan Masalah

a. Apakah gugus fungsi pada senyawa asam p-metoksisinamat yang dihidrolisis dari etil p-metoksisinamat dapat ditransformasi melalui reaksi nitrasi? b. Bagaimana hubungan struktur senyawa hasil nitrasi gugus fungsi asam pmetoksisinamat terhadap aktivitas antiinflamasi?

1


3

1.3

Tujuan Penelitian

a. Melakukan modifikasi struktur senyawa asam p-metoksisinamat yang dihidrolisis dari etil p-metoksisinamat b. menilai analisa hubungan struktur aktivitas antiinflamasi senyawa yang dihasilkan proses nitrasi asam p-metoksisinamat.

1.4

Hipotesa

a. Mendapatkan senyawa turunan asam p-metoksisinamat yang mengandung gugus nitro yang diharapkan dapat memberikan informasi baru mengenai hubungan struktur aktivitas senyawa etil p-metoksisinamat sebagai agen antiinflamasi. b. Memberikan informasi untuk proses modifikasi struktur dan uji aktivitas dari senyawa asam p-metoksisinamat lebih lanjut, khususnya yang melalui proses nitrasi.

1.5

Manfaat Penelitian

a. Proses nitrasi dapat menghasilkan senyawa turunan yang mengandung NO2. b. Penambahan gugus NO2 pada senyawa asam p-metoksisinamat akan mempengaruhi aktivitas antiinflamasi.

1


4

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA

2.1

Etil p-metoksisinamat Etil p-metoksisinamat adalah salah satu senyawa hasil isolasi rimpang

kencur yang merupakan bahan dasar tabir surya yaitu pelindung kulit dari sengatan sinar matahari. EPMS merupakan senyawa aktif yang ditambahkan pada lotion atau pun pada bedak setelah mengalami sedikit modifikasi yaitu perpanjangan rantai dimana etil dari ester ini diganti oleh oktil, etil heksil ataupun melalui heptil melalui transesterifikasi maupun esterifikasi bertahap (Barus, 2009). Etil p-metoksisinamat termasuk kedalam senyawa ester yang mengandung cincin benzene dan gugus metoksi yang bersifat nonpolar dan juga gugus karbonil yang mengikat etil yang bersifat sedikit polar sehingga dalam ekstrasinya dapat menggunakan pelarut-pelarut yang mempunyai variasi kepolaran yaitu etanol, etil asetat, methanol, air dan heksane (barus, 2009). Etil p-metoksisinamat merupakan senyawa turunan asam sinamat sehingga biosintesinya termasuk pada jalur sikhimat.

Gambar 2.1 Jalur asam sikhimat dalam biosintesa fenilpropanoid untuk menghasilkan etil p-metoksisinamat (Bangun, 2011).

1


5

2.2 Asam Nitrat Sifat Fisika Rumus Kimia

: HNO3

Berat molekul (g/mol)

: 63,012

Bentuk (30ºC, 1 atm)

: cair

Titik didih 1 atm, ºC

: 83,4

Titik leleh, ºC

: -41,59

Densitas (20ºC), g/ml

: 1,502

Kelarutan (dalam 100 bagian) - air dingin

: ∞ (tak terhingga)

- air panas

: ∞ (tak terhingga)

Meledak dalam pelarut etanol Viskositas (25ºC), Cp

: 0,761

Panas peleburan (Hfus),Kj/mol

: 10,48

Panas pembentukan (Hf), (25ºC), Kj/mol: -174,10 Panas penguapan (25ºC), Kj/mol

: 39,04

Energi bebas pembentukan (25ºC), Kj/mol: -80,71

Sifat Kimia Asam nitrat merupakan suatu asam monobasa yang kuat, mudah bereaksi dengan alkali, oksida dan senyawa basa dalam bentuk garam. Asam nitrat merupakan senyawa yang berperan dalam proses nitrasi sebagai nitrating agent. (Yulianto, 2010)

2.3

Hidrolisis Hidrolisis adalah pemecahan ikatan kimia akibat reaksi air, hal ini

berlawanan dengan hidrasi yang merupakan penambahan elemen-elemen air pada ikatan ganda, tetapi tidak terkait dengan fregmentasi molekul. Sejumlah besar gugus fungsi yang ditemukan dalam obat-obatan mudah mengalami hidrolisis saat penyimpanan, tetapi yang paling umum ditemukan yaitu pada ester dan amida. (Donald, 2009)

1


6

Hidrolisis ester dan amida terjadi sebagai hasil serangan nukleofilik pada karbon gugus karbonil dan pemecahan lebih lanjut ikatan tunggal karbon-oksigen atau karbon-nitrogen. Karbon pada gugus karbonil lebih positif daripada yang diperkirakan akibat tingginya elektronegativitas oksigen yang didekatnya. Pembagian electron-elektron ikatan yang tidak seimbang menyebabkan terjadinya polarisasi ikatan sehingga karbon bermuatan positif parsial, sedangkan oksigen bermuatan negatif parsial (Donald , 2009). Reaksi hidrolisis dapat terjadi dengan katalis basa atau asam. Mekanisme reaksi hidrolisis sendiri dikelompokkan berdasarkan tipe reaksi dasar seperti subtitusi nukleofilik, gugus fungsi yang ditransformasikan dengan reaksi substitusi

nukleofilik,

substitusi

asil

nukelofilik,

gugus

fungsi

yang

ditransformasikan dengan reaksi substitusi asil nukleofilik. Hidrolisis untuk turunan asam karboksilat masuk ke dalam kategori terakhir yakni gugus fungsi yang ditransformasikan dengan reaksi subtitusi asil nukleofilik. Mekanisme hidrolisis pada gambar diinisiasi oleh protonasi pada karbonil oksigen. Protonasi menyebabkan keadaan terpolarisasi pada gugus karbonil melepaskan elektron dari karbon sehingga bersifat lebih elektrofilik dan akan menerima penambahan nukleofilik dari air (Larson and Weber, 1994).

Gambar 2.2 Mekanisme Reaksi Hidrolisis pada Ester (Larson and Weber, 1994).

1


7

Hidrolisis ester dengan katalis basa melalui mekanisme penambahan nukleofilik OH (gambar 2.5) secara langsung kepada gugus karbonil. Hidrolisis ester berkatalis basa terjadi karena ion OH merupakan nukleofil yang lebih kuat dibandingkan air (Larson dan Weber, 1994).

Gambar 2.3 Mekanisme Reaksi Hidrolisis Ester dengan Katalis Basa (Larson and Weber, 1994).

2.4

Nitrasi Nitrasi adalah salah satu reaksi organik yang banyak dipelajari baik secara

aromatis maupun alifatik. Nitrasi dapat dilakukan dengan berbagai metode seperti heterolitik (elektrofilik dan nukleofilik) dan nitrasi radikal. Nitrasi aromatik biasanya merupakan elektrofilik dan untuk nitrasi alifatik adalah radikal bebas. Senyawa nitroaromatik biasa digunakan sebagai senyawa intermediet dalam sintesis plastik, insektisida, bahan peledak, dan juga farmasetik. Sedangkan untuk nitroalifatik biasa digunakan sebagai pelarut dan hasil sintesis dalam sintesis organik (Olah, 1982). Nitrobenzen juga secara luas digunakan untuk pembuatan aniline dan senyawa pyroxylin, pemurnian minyak pelumas, dan dalam produsi sabunserta poles sepatu. Karena toksisitasnya, nitrobenzene telah terdaftar sebagai prioritas polutan oleh EPA dan terdaftar dalam senyawa yang diatur dalam Resource Conservation and Recovery Act. Hanya sedikit informasi terkait dengan nasib

1


8

nitrobenzene

dilingkungan

dan

hamper

tidak

diketahui

mekanisme

biodegradasinya (Billy et al, 1991).

Gambar 2.4 Prinsip Subtitusi Elektrofilik pada Aromatis

Reaksi nitrasi berlangsung dengan penggantian satu atau lebih gugus nitro (NO2) menjadi molekul yang reaktif. Gugus nitro akan menyerang karbon membentuk nitro aromatik atau nitro parafin. Jika menyerang nitrogen membentuk nitramin dan bila menyerang oksigen membentuk nitrat ester. Pada proses nitrasi masuknya gugus (-NO2) ke dalam senyawa dapat terjadi dengan menggantikan kedudukan beberapa atom atau gugus yang ada dalam senyawa. Umumnya nitrasi yang banyak dijumpai adalah nitrasi –NO2 menggantikan atom H (Yulianto, 2010). Nitrating agent adalah reaktan elektrofilik, dimana reaksi akan terjadi pada atom karbon dari cincin aromatik yang mempunyai kepadatan elektron terbesar. Gugus NO2 yang masuk dapat membentuk posisi ortho, para, dan meta. Jumlah isomer pada produk tergantung pada subtituen ini. Subtituen meta menyebabkan kepadatan elektron menjadi lebih besar dibandingkan subtituen ortho dan para, sehingga yield produk nitrasi akan didominasi isomer meta (Yulianto, 2010). Mekanisme nitrasi aromatik yang mengikuti prinsip subtitusi elektrofilik dengan berbagai step sehingga menghasilkan suatu senyawa nitro aromatik dijelaskan dalam gambar.

1


9

Gambar 2.5 Mekanisme Nitrasi Aromatik

2.5

Kromatografi Penjelasan tentang kromatografi pertama kali diberikan oleh Michael

Tswett, yang mengumumkan pemberian pemisahan klorofil dan pigmen lainnya dalam suatu seri tanaman. Sekarang kromatografi mencakup berbagai proses yang berdasarkan pada perbedaan distribusi dari penyusunan cuplikan antara dua fase. Kromatografi merupakan suatu cara pemisahan fisik dengan unsur-unsur yang akan dipisahkan terdistribusikan antara dua fasa, satu dari fasa-fasa ini membentuk lapisan stasioner dengan luas permukaan yang besar dan fasa lainnya merupakan cairan yang merembes lewat. Fasa stasioner mungkin suatu zat padat atau suatu cairan dan fasa yang bergerak mungkin suatu cairan atau suatu gas (Underwood, 1981). Pemisahan secara kromatografi dilakukan dengan mempertimbangkan beberapa sifat fisika umum dari molekul. Sifat utama yang terlibat ialah: - Kecenderungan molekul untuk melarut dalam cairan (kelarutan) - Kecenderungan molekul untuk melekat pada permukaan serbuk halus (adsorbs, penjerapan)

1


10

- Kecenderungan molekul untuk menguap atau berubah ke keadaan uap (keatsirian) Pada sistem kromatografi, campuran yang akan dipisahkan ditempatkan dalam keadaan demikian rupa sehingga komponen-komponennya harus menunjukkan dua dari ketiga sifat tersebut. Hal ini melibatkan dua sifat berlainan, misalnya penjerapan dan kelarutan, misalnya kelarutan di dalam dua cairan yang tidak bercampur. Walaupun kromatografi melibatkan proses saling mempengaruhi antara beberapa sifat. Misalnya memasukkan senyawa ke dalam corong pisah yang berisi dua pelarut yang masing-masing mempunyai kelarutan yang terbatas dalam pelarut pasangannya (misalnya eter dan air), Senyawa itu cenderung terdistribusi atau terpartisi di antara kedua cairan itu atau fase bergantung kepada sifat kelarutannya. Partisi yang demikian merupakan persaingan antara kelarutan di dalam cairan. Jikadimasukkan linarut ke dalam labu yang berisi cairan dan serbuk bahan padat (misalnya arang), linarut akan terdistribusi di antara permukaan bahan padat (dalam hal kedua ini, linarut menunjukkan sifat kejerapannya). Pada akhirnya dimasukkan linarut ke dalam labu yang sedikit mengandung cairan yang tidak atsiri, linarut akan menunjukkan sifat kelarutan dan keatsirian. Dalam sistem kromatografi, mungkin saja dapat memperbesar perbedaan itu, walaupun perbedaan itu sangat kecil, dan menjadikannya sebagai dasar pemisahan (Gritter, 1991).

2.5.1 Kromatografi Lapis Tipis Kromatografi lapis tipis menandai puncak perkembangan kromatografi adsorpsi yang dicetuskan kali pertama oleh Izamailov dan Shraiber pada tahun 1938. Sebagai fase diam adalah bahan padat yang diletakkan pada plat gelas secara seragam, dengan ketebalan lebih kurang 0,250 mm. Disamping plat gelas juga sudah umum digunakan plat dari logam atau plastik. Teknik kromatografi lapis tipis sangat penting artinya dalam bidang analisis dan kedudukan kromatografi lapis tipis setelah menggeser kedudukan kromatografi kertas. Hanya saja elusi pada KLT pada umumnya dilakukan dengan cara menaik (ascending) satu atau dua dimensi. Sebagai fase diam dipakai cairan

1


11

atau campuran yang dikenal sebagai pelarut pengembang atau pelarut pengembang campur. KLT merupakan metode pemisahan komponen-komponen atas dasar perbedaan adsorpsi partisi oleh fase diam dibawah gerakan pelarut pengembang atau pelarut pengembang campur. Pemilihan pelarut sangat dipengaruhi oleh macam dan polaritas zat-zat kimia yang dipisahkan. (Mulja, 1995) KLT dapat dipakai dengan dua tujuan. Pertama, dipakai selayaknya sebagai metode untuk mencapai hasil kualitatif, kuantitatif, atau preparatif. Kedua, dipakai untuk menjajaki sistem pelarut dan sistem penyangga yang akan dipakai dalam kromatografi kolom atau kromatografi cair kinerja tinggi (Gritter, 1991). Nilai Rf dapat

dihitung

dengan menggunakan

perbandingan sebagaimana

dalam

persamaan :

Nilai maksimum Rf adalah 1 dan ini dicapai ketika solute mempunyai perbandingan distribusi (D) dan faktor retensi (k’) sama dengan 0 yang berisi solute bermigrasi dengan kecepatan yang sama dengan fase gerak. Nilai minimum Rf adalah 0 dan ini teramati jika solut tertahan pada posisi titik awal permukaan fase diam.

2.5.2 Kromatografi Kolom Kromatografi kolom adalah kromatografi yang menggunakan kolom sebagai alat untuk memisahkan komponen-komponen dalam campuran. Alat tersebut berupa pipa gelas yang dilengkapi suatu kran di bagian bawah kolom untuk mengendalikan aliran zat cair. Ukuran kolom tergantung dari banyaknya zat yang akan dipindahkan. Pemisahan tergantung kepada kesetimbangan yang terbentuk pada bidang antar muka di antara butiran-butiran adsorben dan fase bergerak serta kelarutan relatif komponen pada fase bergeraknya (Yazid, E., 2005). Kromatografi cair yang dilakukan dalam kolom besar merupakan metode kromatografi terbaik untuk pemisahan dalam jumlah besar (lebih dari 1 gram). Pada kromatografi kolom, campuran yang akan dipisahkan diletakkan berupa pita pada bagian atas kolom penyerap yang berada dalam tabung kaca, tabung logam, dan tabung plastik. Pelarut atau fasa gerak dibiarkan mengalir melalui kolom

1


12

karena aliran yang disebabkan oleh gaya berat atau didorong dengan tekanan. Pita senyawa linarut bergerak melalui kolom dengan laju yang berbeda, memisah, dan dikumpulkan berupa fraksi ketika keluar dari atas kolom (Gritter, 1991). Dengan menggunakan cara ini, skala isolasi flavonoida dapat ditingkatkan hampir ke skala industri. Pada dasarnya, cara ini meliputi penempatan campuran flavonoida (berupa larutan) diatas kolom yang berisi serbuk penyerap (seperti selulosa, silika, atau poliamida), dilanjutkan dengan elusi beruntun setiap komponen menggunakan pelarut yang cocok. Kolom hanya berupa tabung kaca yang dilengkapi dengan keran pada salah satu ujung. Menempatkan larutan cuplikan pada kolom sedemikian rupa sehingga terbentuk pita yang siap dielusi lebih lanjut (Markham, 1988). Pengisian kolom harus dikerjakan seragam, setelah adsorben dimasukkan dapat diseragamkan kerapatannya dalam kolom dengan menggunakan vibrator. Selain itu dapat juga dikerjakan dengan memasukkan adsorben dalam bentuk larutan dan partikelnya dibiarkan mengendap. Pengisian kolom yang tidak seragam dapat menghasilkan rongga-rongga ditengah-tengah kolom. Pada bagian bawah dan atas dari isian kolom diberi wool untuk menyangga isian. Bila kolom telah diisi bahan isian permukaan cairan tidak boleh dibiarkan turun dibawah permukaan bahan isian bagian atas, karena akan memberikan peluang masuknya gelembung-gelembung udara masuk kedalam kolom (Hosttetman, 1995).

2.5.3 kromatografi Gas Kromatografi gas dan spektrometri massa dapat digunakan untuk memisahkan komponen dengan memberikan waktu retensi dan puncak elusi yang dapat dimasukkan ke dalam spektrofotometer massa untuk memperoleh berat molekul, karakteristik dan informasi fragmentasi (Heinrich, 2004). Teknik ini juga dapat digunakan untuk komponen yang polar (senyawa yang larut dalam air) seperti calistegines dan polihidroksil alkaloid jika dibuat turunannya dengan komponen yang sesuai

(trimetilsilil klorida) untuk meningkatkan volatilitasnya

(Heinrich, 2004). Kromatografi gas saat ini merupakan metode analisis yang penting dalam kimia organik untuk menentukan senyawa tunggal dalam campuran. Spektrometer

1


13

massa sebagai metode deteksi yang memberikan data yang bermakna, yang diperoleh dari penentuan langsung molekul zat atau fragmen (Heinrich, 2004).

2.6

Spektroskopi

2.6.1 Spektroskopi UV-Visible Spektrum serapan kandungan tumbuhan dapat diukur dalam larutan yang sangat

encer

dengan

pembanding

blanko

pelarut

serta

menggunakan

spektrofotometer yang merekam otomatis. Senyawa tanwarna diukur pada jangka 200-400 nm, senyawa berwarna pada jangka 200-700 nm. Prinsip kerja spektrofotometer UV-Vis ialah interaksi sinar ultraviolet atau tampak dengan molekul sampel. Energi cahaya akan mengeksitasi elektron terluar molekul ke orbital lebih tinggi (Harborne, 1987). Pada kondisi ini, elektron tidak stabil dan dapat melepas energi untuk kembali ke tingkat dasar, dengan disertai emisi cahaya. Besarnya penyerapan cahaya sebanding dengan molekul, sesuai dengan hukum lambert-Beer : A= ɛ B C Keterangan: A= serapan ɛ = absortivitas molar B= tebal tempat komponen C= konsentrasi konponen Sumber radiasi pada spektrofotometer UV-Vis berdasarkan panjang gelombang terbagi menjadi 2, yaitu lampu deuterium dan tungstent. Lampu deuterium menghasilkan sinar 160-500 nm. Lampu tungstent digunakan di daerah sinar tampak 350-3500 nm. Sumber radiasi dikatakan ideal jika memancarkan sperktrum radiasi yang kontinyu, intensitasnya tinggi dan stabil pada semua panjang gelombang (Day & Underwood, 1980).

2.6.2 Spektroskopi Infra Merah Spektrofotometri inframerah merupakan suatu metode yang mengamati interaksi molekul dengan radiasi elektromagnetik yang berada pada daerah panjang gelombang 0,75 –1.000 μm atau pada bilangan gelombang 13.000–10

1


14

cm-1. Spektrofotometri inframerah merupakan alat untuk mendeteksi gugus fungsional, mengidentifikasi senyawa dan menganalisis campuran. Banyak pita absorpsi yang terdapat dalam daerah yang di sebut daerah “sidik jari” spektrum (Harborne, 1987). Spektrum inframerah suatu sampel dapat di ketahui letak pita serapan yang dikaitkan dengan adanya suatu gugus fungsional tertentu

(Underwood, 1999).

Spektroskopi inframerah digunakan sebagai analisis kualitatif untuk menentukan gugus fungsi. Gugus fungsi dapat diintepretasi dengan memeriksa puncak absorbsi dari spektrum inframerah. Daerah pada spektrum inframerah diatas 1200 cm-1 menunjukkan pita spektrum atau puncak yang disebabkan oleh getaran ikatan kimia atau gugus fungsi dalam molekul yang telah ditelaah. Daerah dibawah 1200 cm-1 menunjukkan pita yang disebabkan oleh getaran seluruh molekul, dan karena kerumitannya dikenal sebagai daerah sidik jari. Intensitas berbagai pita direkam secara subjektif pada skala sederhana: kuat, menengah atau lemah (Harborne, 1987).

2.6.3 Spektrofotometri Resonansi Magnetik Spektrometri Resonansi Magnetik Inti (Nuclear Magnetic Resonance) NMR merupakan alat yang berguna pada penentuan struktur molekul organik. Teknik ini memberikan informasi mengenai berbagai jenis atom hidrogen dalam molekul. Struktur NMR memberikan informasi mengenai lingkungan kimia atom hidrogen, jumlah atom hidrogen dalam setiap lingkungan dan struktur gugusan yang berdekatan dengan setiap atom hidrogen.(Cresswell and Campbell. 1982) Pergeseran kimia adalah pengukuran medan dalam keadaan bebas. Semua proton–proton dalam satu molekul yang ada dalam lingkungan kimia yang serupa kadang–kadang menunjukkan pergeseran kimia yang sama. Setiap senyawa memberikan penaikan menjadi puncak absorpsi tunggal dalam spektrum NMR. (Silverstein. 1981). Dalam spektroskopi NMR, suatu contoh senyawa ditaruh di antara kutubkutub sebuah magnet yang cukup kuat untuk mensearahkan sebagian dari inti-inti yang mempunyai momen magnet. Contoh itu kemudian disinari dengan radiasi

1


15

elektromagnet, biasanya dalam jangkau frekuensi radio 107-108 Hz. Sebuah inti yang berpusing yang disearahkan dengan medan magnet itu dapat dibalikkan arahnya dengan cara menyerap sebuah proton yang energinya tepat sesuai. Inti yang berlainan atau inti yang serupa tetapi terikat pada lingkungan yang berlainan, menyerap foton pada panjang gelombang yang berlainan. Pola frekuensi radio yang diserap merupakan spektrum NMR dari senyawa itu. (Cresswell and Campbell.1982). Di dalam medan magnet, perputaran elektron–elektron valensi dari proton menghasilkan medan magnet yang melawan medan magnet yang digunakan. Hingga setiap proton dalam molekul dilindungi dari medan magnet yang digunakan mengenai dan bahwa besarnya perlindungan ini tergantung pada kerapatan elektron yang mengelilinginya.Makin besar kerapatan elektron yang mengelilingi inti, maka makin besar pula medan yang dihasilkan yang melawan medan magnet yang digunakan. Akibat secara keseluruhan/ proton merasakan adanya pengurangan medan yang mengenainya. Karena inti merasakan medan magnet yang dirasakan lebih kecil, maka ia akan mengalami presesi pada frekuensi yang lebih rendah. Setiap proton dalam molekul mempunyai lingkungan kimia yang sedikit berbeda yang akan mengakibatkan dalam frekuensi yang sedikit berbeda. ( Sastrohamidjojo. 1991 ).

2.7

Uji inVitro Antiinflamasi dengan Bovine Serum Albumin Uji invitro antiinflamasi menggunakan Bovine Serum Albumin (BSA).

Ketika BSA dipanaskan, akan mengalami denaturasi dan mengekspresikan antigen yang berhubungan dengan tipe III reaksi hipersensitivitas dan yang berhubungan dengan penyakit seperti penyakit serum, glomerulonefritis, rheumatoid arthritis dan lupus eritematosus sistemik. Dengan demikian uji yang diterapkan untuk penemuan obat yang dapat menstabilkan protein dari proses denaturasi. Beberapa obat antiinflamasi nonsteroid seperti indometasin, ibufenak, diklofenak natrium, asam salisilat, dan asam flufenamat mencegah denaturasi protein BSA pada pH patologis (6,2-6,5) (Ramalingam, 2010).

1


16

BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN 3.1

Lokasi dan Waktu Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Farmakognosi dan Fitokimia,

Laboratorium Penelitian I, Laboratorium Penelitian II, Laboratorium Kimia Obat Program Studi Farmasi, Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan. Penelitian dimulai pada bulan Februari sampai April 2015.

3.2

Alat dan Bahan Alat Spektrofotometer H-NMR(500 MHz, JEOL), Spektrofotometer UV-vis

(HITACHI), GCMS (Agilent Technologies), Spektrofotometer Inframerah Transformasi Fourier, seperangkat alat Kromatografi Lapis Tipis, Seperangkat alat Kromatografi Kolom, timbangan analitik, microwave, Penangas air, rotary evaporator (Eyela), gelas kimia, pipet tetes, pipet ukur, kertas saring, magnetic stirrer (Wiggen Hauser).

Bahan Senyawa etil p-metoksisinamat, HCl 15%, NaOH, HNO3 69%, metanol, aseton, n-Heksan, etil asetat, akuades, es batu, Basa Tris, Bovine Serum Albumin.

3.3

Prosedur Penelitiaan

3.3.1 Hidrolisis Etil p-metoksisinamat Sebanyak 1.500 mg NaOH dilarutkan dalam etanol pro analisia dalam gelas kimia dan dengan kondisi pemanasan pada suhu 60º C dan pengadukan dengan menggunakan magnetic stirer

hingga NaOH larut. Kemudian setelah larut

tambahkan senyawa Etil p-metoksisinamat sebanyak 5.000 mg kedalamnya, suhu dijaga tetap 60º C dan dibiarkan selama 3 jam. Hasil reaksi ditambahkan dengan akuades ±1.000 ml dan akan didapatkan larutan dengan pH 13, tambahkan HCl 15% sehingga akan terbentuk endapan APMS, penambahan HCL 15% dilakukan hingga pH larutan mencapai 4 yaitu ditandai dengan tidak terbentuk lagi endapan apms. Endapan yang didapat disaring dengan menggunakkan kertas saring dan

1


17

keringkan dengan suhu ruang, setelah kering dihitung rendemen senyawa apms yang didapat dengan menggunakan rumus berikut. % rendemen

3.3.2 Nitrasi Asam p-metoksisinamat Sebanyak 3 gram hasil hidrolisis Etil p-metoksisinamat yaitu apms dimasukkan ke dalam erlemeyer dengan dikondisikan dingin pada suhu -15ºC. Lalu dimasukkan 12 ml HNO3, aduk hingga asam p-metoksisinamat larut. Dimasukkan dalam microwave dengan suhu 450ºC selama 2 menit. Hasil yang didapat dicampur dengan akuades sebenyak 30 ml lalu saring dengan kertas saring, setelah itu keringkan dengan suhu ruang (Ajay et al., 2006). Setelah kering hitung rendemen hasil reaksi dengan menggunakan rumus berikut % rendemen

3.3.3 Identifikasi a. Identifikasi Organoleptis Senyawa yang didapat baik senyawa murni etil p-metoksisinamat maupun senyawa hasil modifikasi diidentifikasi warna, bentuk dan juga bau.

b. Identifikasi Senyawa Dengan KLT Dilarutkan sedikit hasil reaksi nitrasi, APMS standar, EPMS standar dalam vial terpisah kira-kira 2 mg dalam etil asetat 1 ml, eluen yang digunakan adalah etil asetat:heksan dengan perbandingan 1:4, ditotolkan senyawa yang akan diuji pada KLT lalu lihat hasilnya menggunakan UV dengan panjang gelombang 254 nm.

c. Identifikasi Senyawa Menggunakan FTIR Sedikit sampel padat (±1-2mg), kemudian ditambahkan bubuk KBr murni (±200mg) dan diaduk hingga rata. Kemudian sampel (pellet KBr yang terbentuk) diambil dan kemudian ditempatkan dalam tempat sampel pada alat spektroskopi inframerah untuk dianalisis (Hidayati, 2012).

1


18

d. Identifikasi Senyawa Menggunakan GCMS Kolom yang digunakan adalah HP-5MS (30 m × 0,25 mm ID × 0,25 µm); suhu awal 70oC selama 2 menit, dinaikkan ke suhu 285oC dengan kecepatan 20oC/menit selama 20 menit. Suhu MSD 285oC. Kecepatan aliran 1,2 mL/menit dengan split 1:100. Parameter scanning dilakukan dari massa paling rendah yakni 35 sampai paling tinggi 550 (Umar et al, 2012). e. Identifikasi Senyawa Menggunakan 1H-NMR dan 13C-NMR Sedikit sampel padat (±10mg), kemudian dilarutkan dalam pelarut kloroform bebas proton (khusus NMR), setelah dilarutkan kemudian dimasukkan ke dalam tabung khusus NMR untuk kemudian dianalisis.

3.3.4 Pembuatan Reagen untuk Uji Antiinflamasi a. Larutan TBS (TrisBuffer Saline)pH 6.3 Sebanyak 1,21 g Trisbase dan 8,7 g NaCl dilarutkan dalam 1000 mL aquades. Didapatkan larutan dengan pH 9,7. Kemudian adjust pH sampai 6,3 menggunakan asam asetat glasial (Mohan, 2003)

b. Penyiapan variat konsentrasi NaDiklofenak Pembuatan larutan induk sebesar 10000 ppm Na diklofenak dengan pelarut metanol, yaitu 50 mg NaDiklofenak dilarutkan dalam 5mL methanol. Kemudian dilakukan pengenceran menjadi 1000, 100, 10 dan 1 ppm.

c. Penyiapan variat konsentrasi APMS dan senyawa hasil modifikasi (sampel). Pembuatan larutan induk sebesar 10000 ppm baik senyawa hasil modifikasi maupun APMS dengan pelarut metanol.yaitu 50 mg sampel APMS dan senyawa hasil modifikasi nitrasi dilarutkan dalam 5 mL methanol. Kemudian dilakukan pengenceran menjadi 1000, 100, 10 dan 1 ppm.

1


19

d. Pembuatan Larutan BSA 0,2 %(w/v) Sebanyak 0.2g BSA dilarutkan dalam TBS 100mL (William set al., 2008).

3.3.5 Uji Invitro Antiinflamasi Pengujian Aktivitas Senyawa Hasil Modifikasi Terhadap Denaturasi BSA : a. Pembuatan Larutan Uji Larutan Uji (5 mL) terdiri dari 50 µL larutan sampel yang kemudian ditambah dengan larutan BSA hingga volume 5 mL sehingga didapatkan variat konsentrasi menjadi larutan 100, 10, 1, dan 0,1ppm

b. Pembuatan Larutan Kontrol Positif Larutan kontrol positif (5 mL) terdiri dari 50 µL larutan natrium diklofenak yang kemudian ditambah dengan larutan BSA hingga volume 5 mL sehingga didapatkan variat konsentrasi menjadi 100, 10, 1, dan 0,1 ppm

c. Pembuatan Larutan Kontrol Negatif Larutan kontrol negatif (5 mL) terdiri dari 50 µL metanol yang kemudian ditambah dengan larutan BSA hingga volume 5 mL. Kemudian diinkubasi pada suhu ruang 27ºC s/d 28ºC selama 30 menit. Lalu setiap larutan diatas dipanaskan selama 5 menit pada suhu 73ºC. Lalu dibiarkan dingin selama 25 menit dan diukur turbiditasnya dengan spektrofotometer diukur pada gelombang 660 nm. Persentase inhibisi dari denaturasi atau presipitasi BSA dikalkulasikan dengan rumus berikut:

1


20

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN Pada penelitian ini dilakukan modifikasi asam p-metoksisinamat hasil hidrolisis dari etil p-metoksisinamat melalui reaksi nitrasi.

4.1

Modifikasi Senyawa Etil p-metoksi Sinamat dengan Reaksi Hidrolisis Reaksi hidrolisis dilakukan dengan mereaksikan EPMS sebanyak 5 gram

(0,024 Mol) dalam etanol dan direaksikan dengan bantuan katalis basa NaOH 1.5 gram (0.0375 mol) dan dipanaskan pada suhu 60oC selama tiga jam sampai terbentuknya serbuk berwarna putih. Setelah reaksi berlangsung, hasil reaksi berupa filtrat lalu ditambahkan akuades yang berguna untuk pencucian filtrat. Kemudian ditambahkan HCl 15% tetes demi tetes sehingga akan terbentuk endapan putih berupa hasil hidrolisis yaitu Asam p-metoksisinamat (APMS) hal ini terjadi karena filtrat sebelum ditambahkan HCl 15% memiliki pH 13 kemudian ditambahkan HCl 15% sampai dengan pH 4, ini bertujuan untuk mengikat ion Na+ sehingga terbentuklah endapan putih berupa hasil hidrolisis ( Mufidah, 2014).

Gambar 4.1 KLT senyawa hasil Hidrolisis

Residu yang didapat dicuci lagi dengan akuades untuk menghilangkan garam yang terbentuk kemudian residu dikeringkan. Residu yang didapat berwarna putih. Rendeman hasil reaksi hidrolisis yang didapatkan sebanyak 4.115 mg %, berikut hasil perhitungan rendemen senyawa apms.

1


21

% rendemen hidrolisis = 82,304%

Mekanisme reaksi hidrolisis diinisiasi oleh protonasi pada karbonil oksigen. Protonasi menyebabkan keadaan terpolarisasi pada gugus karbonil melepaskan electron dari karbon sehingga bersifat lebih elektrofilik dan akan menerima penambahan nukleofilik OH (Larson dan Waber, 1994). Mekanisme reaksi hidrolisis sebagai berikut:

Gambar 4.2 Reaksi Hidrolisis

4.2

Modifikasi Senyawa Asam p-metoksi Sinamat Dengan Reaksi Nitrasi Reaksi nitrasi dilakukan dengan mereaksikan APMS dengan HNO3 dengan

menggunakan metode cold microwave. Keuntungan dari metode cold microwave adalah waktu reaksinya yang cepat dan tidak diperlukannya H2SO4 sebagai katalis. Suhu pada saat pencampuran sampel dengan reagen yang harus dijaga pada suhu 15ºC (bose, et al. 2006). Pada nitrasi ini terjadi reaksi substitusi atom H pada benzen oleh gugus nitro dari reagent HNO3 sebagai nitrating agent. Benzen akan

1


22

menyerang muatan positif atom nitrogen dari elektrofil, yang mana ikatan N=O lepas pada waktu yang sama. Hal ini diikuti dengan lepasnya proton untuk menstabilkan gugus aromatik (Zulfa, 2012). Tujuan reaksi nitrasi adalah menambahkan gugus NO2 pada senyawa asam p-metoksisinamat, sehingga dengan bertambahnya gugus NO2 akan diuji aktivitas antiinflamasinya. Optimasi dilakukan dengan menggunakan 3 keadaan yaitu 300 watt, 450 watt dan 600 watt. Hasil KLT senyawa optimasi terlihat pada gambar 4.3.

Gambar 4.3 KLT Optimasi Reaksi Nitrasi A. 300 Watt, B. 450 Watt, C. APMS

Dari hasil tersebut menunjukan bahwa untuk reaksi dengan menggunakan 450 watt karena spot yang terbentuk lebih tebal sehingga bisa diasumsikan bahwa reaksi dengan 450 watt menghasilkan lebih banyak senyawa hasil reaksi nitro. Untuk 600 watt hasil reaksi tidak didapatkan, hal ini karena untuk reaksi dengan 600 watt didapatkan hasil reaksi yang hangus, sehingga tidak bisa digunakan. Hal ini bisa disebabkan karena reaksi berjalan terlalu panas, sehingga mendapatkan hasil yang hangus.

Gambar 4.4 Reaksi Nitrasi Hasil Hidrolisis

1


23

Karena senyawa masih terdapat beberapa spot maka dilakukan pemisahan dengan menggunakan kolom kromatografi, dimana setelah di lakukan kolom kromatografi didapatkan senyawa murni dengan spot tunggal sebagai berikut

Gambar 4.5. Hasil KLT senyawa dengan eluen heksan:etil (3:2)

Hasil rendemen senyawa nitrasi dari 3000 mg campuran hasil reaksi didapat senyawa murni sebanyak 412 mg dan rendemen dapat dihitung dengan persamaan berikut %rendemen = 13,73%

4.3

Identifikasi Senyawa Hasil Modifikasi Identifikasi senyawa hasil modifikasi dimulai dengan melihat perbandingan

nilai Rf seluruh senyawa yang di KLT menggunakan eluen heksan:etil asetat dengan perbandingan 3:2 (lihat gambar 4.5) Etil p-metoksisinamat

: 0,875

Asam p-metoksisinamat : 0.35 Hasil Nitrasi

: 0.6

Berdasarkan nilai Rf tersebut dapat diketahui tingkat kepolaran senyawa hasil modifikasi. Etil p-metoksisinamat memiliki polaritas paling rendah dimana nilai

Rf

etil

p-metoksisinamat

mencapai

0.875,

sedangkan

Asam

p-

metoksisinamat memiliki polaritas yang paling tinggi terlihat dari nilai Rf yang paling rendah yaitu 0,35. Senyawa hasil modifikasi memiliki nilai Rf diatas

1


24

senyawa Asam p-metoksisinamat yang artinya terjadi penurunan polaritas, hal ini terjadi karena adanya pemasukan gugus NO2 pada cincin benzen senyawa Asam p-metoksisinamat.

4.3.1 Senyawa Hasil Hidrolisis Etil p-metoksisinamat Senyawa hasil hidrolisis etil p-metoksisinamat memiliki karakteristik sebagai berikut: 1. Warna

: Putih

2. Bau

:Tidak berbau

3. Bentuk

: Serbuk

Gambar 4.6. Serbuk APMS

Analisa senyawa hasil hidrolisis ini dilakukan dengan menggunakan GCMS dan membandingkan nilai Rf dan dibandingkan dengan hasil GCMS dan nilai Rf dari Mufidah (2014). Dari interpretasi GCMS pada senyawa hasil hidrolisis menunjukan bahwa senyawa hasil hidrolisis muncul pada waktu retensi 9,649 yang memiliki berat molekul (BM) 178,0 serta fragmentasi massa pada 161; 133; 117; 89; dan 63 (lampiran 7 ). Berikut fragmentasi senyawa hasil hidrolisis etil pmetoksisinamat:

1


25

Gambar 4.7. Fragmentasi Senyawa Hasil Hidrolisis EPMS

Dari data GCMS dan nilai Rf ternyata hasil yang diperoleh sama seperti yang dilakukan Mufidah (2014), sehingga senyawa hasil hidrolisis Etil pmetoksisinamat adalah Asam p-metoksisinamat.

Gambar 4.8. Struktur Senyawa Asam p-metoksisinamat

4.3.2 Senyawa Hasil Nitrasi Asam p-metoksisinamat Senyawa hasil nitrasi asam p-metoksi sinamat memiliki karakteritik sebagai berikut: 1. Warna

: kuning

2. Bau

: bau khas

3. Bentuk

: serbuk

Gambar 4.9. Senyawa Hasil Nitrasi 4-Metoksi-2-Nitro-beta-Nitrostirena

1


26

Elusidasi struktur senyawa hasil modifikasi dilakukan dengan menggunakan IR, GCMS, dan NMR Tabel 4.1. Penafsiran IR Ikatan

Daerah Absorbansi (V,cm-1)

Aromatik posisi para

903,69

NO

1526,72

C-O

1334,80-1316,47

C-Haril

3098, 78

C=C

1614

C-H alifatik

2974,36-2882,74

C-O Aril

1210, 38

105 %T 97.5

90

903.69

82.5

4000 3500 nitrasi apms

3000

1086.93

2000

1750

1010.74

1210.38

2500

1349.26

1614.49

60

1526.72

67.5

2923.25

3098.78

75

1500

1250

1000

750

500 1/cm

Gambar 4.10. Spektrum IR

Penafsiran

spektrum

IR

Senyawa

4-Metoksi-2-Nitro-beta-Nitrostirena

ditunjukan pada table 4.1 yaitu ditemukan pita serapan pada bilangan gelombang v3098,78 cm-1adalah serapan spesifik vibrasi ulur ikatan antar atom C-H pada

1


27

gugus aromatik. Keberadaan aromatik juga ditunjukan dengan adanya C=C pada bilangan gelombang v 1619, 49 cm-1. Aromatik disubsitusi para juga ditunjukan dengan munculnya serapan pada bilangan gelombang v903,69 cm-1. C-H Alifatik ditemukan pada bilangan gelombang 2974,36-2882,74 cm-. dan pada bilangan gelombang 1210, 38 cm-1 terdapat C-O yang berikatan pada aromatik. Serapan vibrasi C-O ditemukan pada pita v1349,26 cm-1. Lalu terdapatnya gugus nitro pada posisi aromatik dapat ditunjukan dengan adanya pita serapan pada bilangan gelombang v 1526,72 cm-1. Elusidasi senyawa 4-Metoksi-2-Nitro-beta-Nitrostirena selanjutnya yaitu menggunakan analisa GCMS. Dari data kromatogram GCMS dari trasi 4-Metoksi2-Nitro-beta-Nitrostirena, muncul kromatogram pada waktu retensi 11,9 dengan

berat molekul (BM) 224 dengan fragmentasi massa pada 224; 177; 147; 102; dan 77. Berikut hasil fragmentasi pada senyawa ini.

Gambar 4.11. Spektrum GC-MS senyawa 4-Metoksi-2-Nitro-beta-Nitrostirena

1


28

Gambar 4.12. Fragmentasi Massa Senyawa 4-Metoksi-2-Nitro-beta-Nitrostirena

Berdasarkan interpretasi GCMS yang dengan BM 224 menunjukan telah masuknya gugus NO2 pada gugus benzene dan karboksilat, sehingga gugus karboksilat hilang dan diganti dengan gugus NO2. Hal ini sesuai dengan aturan nitrogen yang menyatakan bahwa jika jumlah atom nitrogen didalam suatu senyawa ada 1 maka berat molekul senyawa adalah ganjil, sedangkan jika atom nitrogen dalam suatu senyawa adalah dua maka berat molekul adalah genap (pavia et al. 2001)

Gambar 4.13. 1. APMS, 2. 2 nitro-4-metoksi-beta-nitrostirena

Gambar 4.14. H-NMR Senyawa 4-Metoksi-2-Nitro-beta-Nitrostirena

1


29

Tabel 4.2. Data Pergeseran Kimia Spektrum 1H NMR Senyawa 4-Metoksi-2-Nitro-betaNitrostirena ( CDCl3, 500 MHz)

Asam 5nitro pPosisi

metoksisinamat 1

2

3

APMS 1

H NMR

H NMR

7,95 (d, 1H,

7,63 (d, 1H,

J=13,65)

J=16,2)

7,55 (d, 1H,

6,34 (d, 1H,

J=13,65)

J=16,2)

5

6,95 (d, 1H, J=9,1)

6

8

8,05 ( d, 1H, J= 7, 54 (d, 1H, 1,95 )

J=9,1)

7,74 (d, 1H,

7, 54 (d, 1H,

J=2,6)

J=9,1)

7,72 ( d, 1H, J=9,1) 9

11

7,18 (d, 1H,

7,47 (d, 1H,

J=9,1)

J=9,1)

4,04

3,82 (s, 3H)

Interpretasi NMR pada penelitian ini dibandingkan dengan hasil interpretasi NMR pada senyawa Asam p-metoksisinamat pada penelitian Mufidah (2014). Spektrum H1NMR memberikan sinyal pergeseran kimia 4,04 ( 3H ) dan muncul dengan bentuk singlet. Sinyal ini lebih kearah downfield karena berikatan dengan oksigen (-OCH3, metoksi), sedangkan pada H-NMR senyawa APMS pergeseran kimia terjadi pada 3, 82 (3H) dan memiliki bentuk dan sinyal yang sama seperti senyawa Asam 5nitro p-metoksisinamat . Pergeseran kimia 7,95 (1H) berbentuk doublet memiliki hubungan dengan pergeseran kimia 7,55 (1H) berbentuk doublet dengan konstanta kopling 13,65 Hz. Pergeseran kimia tersebut sama dengan HNMR APMS pada pergeseran kimia 6,34 dan 7,63 berbentuk doublet dan dengan konstanta kopling 16,2 Hz. Bentuk tersebut adalah olefin dengan proton

1


30

berkonfigurasi trans. Kemudian pada pergeseran kimia 8,05 ppm (1H), 7,72 (1H), dan 7,18 (1H) adalah proton-proton yang tersubsitusi. Sinyal pada pergeseran kimia 7,72 ppm menunjukan bahwa satu proton terkopling secara metha dengan satu proton pada sinyal 8,05 ppm dengan nilai konstanta kopling 1,95 Hz Hz. Selanjutnya terkopling secara ortho dengan proton pada sinyal 7,18 ppm dan nilai konstanta kopling 9,1 Hz. Hal ini dibandingkan dengan H-NMR APMS pada pergeseran kimia 6,95 ppm dan 7,54 ppm (4H) yang merupakan proton-proton dari benzen dengan dua substitusi yaitu menunjukan bahwa dua proton yang ekivalen terkopling secara ortho dengan dua proton yang ekivalen lainnya (Mufidah, 2014). Perbedaan APMS dengan Asam 5nitro p-metoksisinamat yaitu terletak pada H di posisi 5 yang mana Asam 5nitro p-metoksisinamat tidak terdapat H pada posisi 5 karena sudah disubstitusi oleh NO2 pada posisi 1. .

Gambar 4.15 C-NMR Senyawa 4-Metoksi-2-Nitro-beta-Nitrostirena

1


31

C

Gambar 4.16 HSQC senyawa 4-Metoksi-2-Nitro-beta-Nitrostirena

interpretasi NMR selanjutnya yaitu

13

C-NMR dan HSQC. Spektrum

13

C-NMR

memberikan pergeseran kimia pada 57,13 ppm yaitu C pada posisi 11, hal ini bisa dilihat dari HSQC yang didapat, yaitu didapat korelasi antara H-NMR pada 13

pergeseran kimia 4,04 ppm yakni H pada posisi 11 dengan

C-NMR pergeseran

kimia 57,13 ppm , artinya C dengan pergeseran kimia 57,13 ppm berikatan dengan H pada pergeseran kimia 4,04 ppm. Berikutnya

13

C-NMR memberikan

pergeseran kimia pada 114,57 ppm dan pada HSQC didapat korelasi dengan HNMR pada pergeseran kimia 7,18 ppm yakni H pada posisi 9, artinya C dengan spektrum 114,57 ppm berikatan dengan H pada posisi 9.

13

C-NMR selanjutnya

memberikan pergeseran kimia pada 134,71 ppm dan didapat korelasi dengan HNMR pada pergeseran kimia 7,72 ppm yaitu pada H posisi 8, sehingga dapat diartikan bahwa terjadinya ikatan antara C dengan H pada posisi 8. Lalu

13

C-

NMR memberikan pergeseran kimia pada 136,48 ppm dan membentuk korelasi dengan H-NMR pada pergeseran kimia 7,95 yaitu H pada posisi 2, artinya terjadi ikatan C & H pada posisi 2. Berikutnya 13C-NMR memberikan sinyal pergeseran kimia pada 126,36 ppm dan membentuk korelasi dengan H pada posisi 6 yakni

1


32

pada pergeseran kimia 8,05 ppm. Sinyal karbon

13

C-NMR memberikan

pergeseran kimia pada 137,45 ppm dan membentuk korelasi dengan H-NMR pada pergeseran kimia 7,55 ppm, yaitu H pada posisi 3, sehingga dapat diartikan bahwa terjadi ikatan antara C & H diposisi 3. Sinyal karbon lainnya yaitu pada pergeseran kimia 155,53 ppm merupakan karbon tersier (C3) yang dapat berikatan dengan atom oksigen dari metoksi. Sinyal karbon terakhir yaitu pada pergeseran kimia 122,68 yaitu karbon kuartener (4C). Tabel 4.3 C-NMR senyawa 4-Metoksi-2-Nitro-beta-Nitrostirena 13

C-NMR senyawa hasil nitrasi

4.4

Posisi

Pergeseran kimia

11

57,13 ppm

9

114,57 ppm

6

126,68 ppm

8

134,71 ppm

2

136,48 ppm

3

137,45 ppm

7

155,53 ppm

4

122,68 ppm

Pengujian Aktivitas Antiinflamasi dan Hubungan Struktur Aktivitas Senyawa Hasil Modofikasi Pada penelitian ini, uji aktivitas antiinflamasi invitro dengan prinsip

penghambatan denaturasi protein dimana denaturasi terjadi karena adanya perlakuan pemberian panas (William et al, 2008), pengujian ini dipilih sebagai skrining awal uji antiinflamasi pada senyawa hasil modifikasi, metode ini juga dipilih karena adanya masalah yang terjadi berkaitan tentang penggunaan hewan pada penelitian farmakologi seperti kode etik. Selain itu obat-obat anti inflamasi konvensional NSAID seperti fenil butazon dan indometasin tidak bertindak hanya dengan menghambat produksi prostaglandin dengan menghalangi enzim COX, tetapi juga dengan pencegahan denaturasi protein, dengan demikian uji antidenaturasi protein adalah metode yang mudah untuk memeriksi aktivitas antiinflamasi (Ullah et al, 2014)

1


33

Uji aktivitas antiinflamasi dilakukan pada dua senyawa yang didapatkan yaitu Asam p-metoksisinamat dan senyawa hasil reaksi nitrasi dan Na Diklofenak sebagai kontrol positif. Pada uji inhibisi denaturasi BSA dengan rentang konsentrasi uji 50-0,035 ppm dapat memberikan % inhibisi >20% maka dianggap memiliki aktivitasi sebagai antiinflamasi (William et al,.2008). Tabel 4.4. Hasil Uji Antiinflamasi Senyawa Kontrol dan Senyawa Hasil Modifikasi

1

Sampel

Konsentrasi

% Inhibisi

Na

0.1 ppm

1,59

diklofenak

1 ppm

4,56

10 ppm

26,75

100 ppm

98,85

0.1 ppm

30,9

1 ppm

36,46

10 ppm

46,76

100 ppm

54,93

0.1 ppm

-0.54

1 ppm

-0.34

10 ppm

0.11

100 ppm

0.32

4-metoksi-

0.1 ppm

36.71

2-nitro-

1 ppm

29.65

beta-

10 ppm

15.32

nitrostirena

100 ppm

-7.93

EPMS 2

3

4

APMS

1


34

120 100 Na diklofenak

80

EPMS

60 40

APMS

20

4-metoksi-2-nitrobeta-nitrostirena

0 0.1 ppm

1 ppm

10 ppm

100 ppm

-20

Gambar 4.17. diagram aktivitas antiinflamasi

Natrium diklofenak aktif dalam memberikan aktivitas antiinflamasi dimulai dari konsentrasi 10 ppm dengan persen inhibisi 26,75 %dan pada konsentrasi 100 ppm dapat menghambat denaturasi protein sebesar 98,85%. Senyawa EPMS aktif sebagai antiinflamasi dimulai dari konsentrasi 0,1 ppm sampai dengan konsentrasi 100 ppm, terlihat dari hasil yang didapat yaitu pada konsentrasi 0,1 ppm memberikan persen inhibisi sebesar 30,9 %, 1 ppm 36,46%, 10 ppm 46,76 % dan 100 ppm sebesar 54,93. Artinya semakin tinggi konsentrasi, maka semakin tinggi aktvitas sebagai antiinflamasi. Senyawa Asam pmetoksisinamat yang merupakan hasil dari hidrolisis sebelumnya telah diteliti efek aktivitas antiinflamasi oleh mufidah (2014), bahwa senyawa Asam pmetoksisinamat tidak mempunyai aktivitas sebagai antiinflamasi. Pada pengujian kali ini juga mendapatkan hasil yang sama dimana senyawa Asam pmetoksisinamat sama sekali tidak memiliki aktivitas sebagai antiinflamasi, terlihat dari persen inhibisi yang dihasilkan baik pada konsentrasi terendah sampai konsentrasi tertinggi menghasilkan persen inhibisi negative dan <20%. Senyawa 4-Metoksi-2-Nitro-beta-Nitrostirena dengan konsentrasi 0,1 ppm, 1 ppm, dan 10 ppm mengalami peningkatan aktivitas antiinflamasi dibandingkan dengan senyawa APMS pada konsentrasi 0,1 ppm, 1 ppm dan 10 ppm, sedangkan pada konsentrasi 100 ppm tidak menghasilkan peningkatan aktivitas sebagai antiinflamasi, hal ini terlihat dari persen inhibisi yang dihasilkan

1


35

dimana persen inihibisi senyawa ini yaitu pada konsentrasi 0.1 ppm sebesar 36.71%, 1 ppm sebesar 29,65%, 10 ppm sebesar 15,32% dan pada konsentrasi 100 ppm -7,93%. Artinya penambahan gugus NO2 pada senyawa Asam pmetoksisinamat memberikan efek peningkatan efek antiinflamasi. Dari data tersebut terlihat semakin kecil konsentrasi maka semakin besar aktivitas antiinflamasi, hal yang sama juga terjadi pada penelitian uji antiinflamasi senyawa hasil isolasi Butea monosperma (Ningappa et al, 2012) dan ektrak Annona cherimola mempunyai aktivitas antiinflamasi pada konsentrasi yang rendah, sedangkan semakin tinggi konsentrasi, semakin rendah aktivitas antiinflamasi (Verma et al, 2011).

1

2

Gambar 4.18. 1. Asam p-metoksisinamat, 2. 4-Metoksi-2-Nitro-betaNitrostirena Untuk senyawa hasil modifikasi melalui reaksi nitrasi, dapat dianalisa bahwa penambahan gugus NO2 pada gugus aromatik senyawa Asam pmetoksisinamat dapat meningkatkan aktivitas antiinflamasi, hal ini disebabkan karena terjadinya penurunan polaritas senyawa asam p-metoksisinamat oleh gugus NO2.

1


36

BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN

5.1

Kesimpulan

1. Transformasi gugus fungsi pada etil p-metoksisinamat berhasil dilakukan melalui proses hidrolisis menjadi asam p-metoksisinamat, lalu dinitrasi menghasilkan senyawa 4-Metoksi-2-Nitro-beta-Nitrostirena 2. Hubungan struktur aktivitas hasil modifikasi asam p-metoksisinamat terhadap antiinflamasi menunjukan bahwa penambahan gugus NO2 dapat meningkatkan aktivitas antiinflamasi pada konsentrasi 0,1 ppm, 1 ppm, 10 ppm.

5.2

Saran

1. Perlu dilakukan optimasi lebih lanjut tentang reaksi dan pereaksi, kondisi reaksi dan waktu reaksi sehingga dapat diperoleh rendemen senyawa yang lebih baik. 2. Perlu dilakukan uji invivo pada senyawa hasil modifikasi untuk penelitian lebih lanjut. 3. Perlu dilakukan pengujian uji antiinflamasi pada konsentrasi yang lebih kecil.

1


37

DAFTAR PUSTAKA Aliya nur hasanah.et al. 2011. Analisis Kandungan Minyak Atsiri dan Uji Aktivitas Antiinflamasi Ekstrak Rimpang Kencur (Kaempferia galanga L.). Jurnal matematika & sains, Vol.16 Nomor 3, Hal 147-152. Bangun,

Robijanto. 2011. Semi Sintesis N,N-Bis(2-Hidroksietil)-3-(4Metoksifenil) Akrilamida Dari Etil P-Metoksisinamat Hasil Isolasi Rimpang Kencur (Kaempferia Galanga, L) Melalui Amidasi Dengan Dietanolamin. Medan: Universitas Sumetra Utara.

Barus, Rosbina. 2009. Amidasi Etil p-Metoksisinamat yang Diisolasi dari Kencur (Kaempferia Galanga, Linn). Medan: Sekolah Pasca Sarjana Universitas Sumatera Utara. Billy E. Haigler and Jim C Spain. 1991. Biotransformation of Nitrobenzene by Bacterial Containing toluene Degradative Pathways. Bose, K ajay et al. 2006. Cold Microwave Chemistry: Synthesis Using Pre-Cooled Rearents. BPOM RI. 2014. Kebun Tanaman Obat Badan POM RI. Chandra et all india, 2012. Evaluation of in vitro anti-inflammatory activity of coffee against the denaturation of protein Cairns, Donald. Intisari Kimia Farmasi. 2004. EGC. jakarta Cresswell ,C. J.,Runquist dan Campbell. 1982. Analisis Spektrum Senyawa Organik. . Edisi kedua. Bandung: Penerbit ITB. Day,R. A., dan Underwood, A. L., 1999, Analisis Kimia Kuantitatif (Penerjemah Aloysius Hadyana Pudjaatmaka,), Penerbit Erlangga, Jakarta, hal: 491. Ernawati Teni et al. 2012. Synthesis of a Cnadidate Anti-Cancer Inhibitor Compound:N,N-Diethylcinnamide. Intrnational Confrence and Alternative Medicine In Health Care: Surakarta Farmakologi dan Terapi UI. 2007. Departemen Farmakologi dan Terapeutik Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. Jakarta Halen, Parmeshwari K et al. 2009. Prodrug Designing of NSAIDs. Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 9, 124-139.

1


38

Harborne, J.B. 1987. Metode Fitokimia: penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan. Penerjemah: Kosasih P., Soediro Iwang. Bandung: Penerbit ITB. Heinrich, M. Barnes, J. Gibbons, S. Williansom, M, E. Fundamental Of Pharmacognosy and Phytotherapy. Philadelpia: Penerbit Elsevier. Hidayati, Nur et al. 2012. Isolasi Dan Identifikasi Senyawa Antifungal Akar Acacia Mangium Dan Aktivitasnya Terhadap Ganoderma Lucidum. Sekolah Pasca Sarjana : Universitas Gadjah Mada. Hostettman, K. 1995. Cara Kromatografi Preparatif “Penggunaan pada Isolasi Senyawa Alam”.. Penerbit ITB. Bandung Schiefer Isaac T et al. 2012. Inhibition of amyloidogonesis by non-steroidal anti – inflamatmatory drugs and their hybrid nitrates. Griter,. 1991. Pengantar Kromatografi. ITB. Bandung Khoirunni’mah, zulfa. 2012. Modifikasi Senyawa Metil Sinamat melalui Proses Nitrasi Serta Uji Toksisitas BSLT (Brine Shrimp lethality Test) Terhadap HasilSenyawa Modifikasi Khosrow kashfi et al. 2002. Nitric Oxide-Donating Nonsteroidal AntiInflammatory Drugs Inhibit the Growth of Various Cultured Human Cancer Cells: Evidence of a Tissue Type-Independent Effect Larson, Richard A.; Eric J. Weber. 1994. Reaction Mechanisms In Environmental Organic Chemistry. Lewis Publisher : United States of America. Markham, K. R. 1988. Cara Mengidentifikasi Flavonoida. Terjemahan Kosasi. Padmawinata.: ITB Press. Bandung Mohan, Chandra. 2003. Calbiochem; Buffer. CALBIOCHEM® and Oncegene Research Products. Mufidah, syarfatul. 2014. Modifikasi struktur senyawa etil P-metoksisinamat Yang Diisolasi dari Kencur (Kaemferia galangal Linn) melalui transformasi gugus fungsi serta Uji Aktivitsa Sebagai Antiinflamasi Mulja, M,. 1995. Analisis Instrumental. ITB. Bandung. Nazeruddin, G. M. dan S. B. Suryawanshi. 2010. Sythesis of Novel Mutual Prodrugs by Coupling of Ibuprofen (NSAID) with Sulfa Drugs. J. Chem. Pharm. Res., 2010, 2(4):508-512. Ningappa Praveen Tatti et al. 2012. Evaluation of in-vitro anti-denaturation activity of isolated compound of butea monosperma bark.

1


39

Olah, George A et al. 1982. Recent aspects of nitration : New Preparative Methods and Mechanism studies (A Review). Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 79 4487-4494. Sastrohamidjojo, H. 1996. Sintesis Bahan Alam. Cetakan Pertama. Yongyakarta : Penerbit Liberty Silverstein, R. M. 1984. Penyidikan Spektometrik senyawa Organik. Jakarta : Penerbit Erlangga. Taufikurohmah, T.; Rusmini; Nurhayati. 2008. Pemilihan Pelarut Optimasi Suhu Pada Isolasi Senyawa Etil P-metoksisinamat (EPMS) Dari Rimpang Kencur Sebagai Bahan Tabir Surya Pada Industri Kosmetik. Ullah et al. 2014. Evaluation of antinociceptive, in-vivo & in-vitro antiinflammatory activity of ethanolic extract of Curcuma zedoaria rhizome (Research Article). BMC Complementary and Alternative Medicine. Bangladesh Umar, Muhammad I et al. 2012. Bioactivity-Guided Isolation of Ethyl-pmethoxycinnamate, an Anti-inflammatory Constituent, from Kaempferia galanga L. Extracts. Molecules, 17, 8720-8734. Verma, adarsh. M, Ajay kumar, Kavitha and Anurag. Kb3. 2011. Activities of annona cherimola in-vitro anti denaturation and antioxidant. Williams, LAD et al. 2008. The In Vitro Anti-denaturation Effects Induced by Natural Product and Non-steroidal Compounds in Heat Treated (Immunogenic) Bovine Serum Albumin is Proposed as a Screening Assay for the Detection of Anti-inflammatory compounds, without the Use of Animals, in the Early Stages of The Drug Discovery Process. West Indian Medical Journal 57 (4):327. Yazid, E. 2005. Kimia Fisika untuk Paramedis. Penerbit Andi. Yogyakarta. Yulianto, Yogo Tri. 2010. Prarancangan Pabrik Nitrobenzen dari Benzen dan Asam Campuran dengan Proses Kontinyu Kapasitas 120.000 Ton/Tahun. Teknik Kimia Fakultas Teknik Universitas Muhammadiyah Surakarta.

1


40

Lampiran 1. Kerangka Penelitian Senyawa Etil pmetoksisinamat

Asam p-metoksisinamat Reaksi hidrolisis Reaksi Nitrasi Dengan menggun akan HNO3 Senyawa Hasil Reaksi Nitrasi

Identifikasi

Identifikasi menggunakan kromatografi (KLT dan kolom), GCMS dan spektrofotometri (IR dan NMR).

Uji Invitro Antiinflamasi menggunakan metode denaturasi protein pada Bovine Serum Albumin (BSA). Uji Invitro Antiinflamasi

1


41

Lampiran 2: Skema Identifikasi Senyawa Hasil Modifikasi Senyawa Hasil Modifikasi

Pemisahan Senyawa Hasil Modifikasi Kromatografi

Kromatografi Kolom

Kromatografi Lapis Tipis

Fraksi-Fraksi Senyawa Hasil Modifikasi

Identifikasi Menggunakan Instrumentasi

GCMS

Spektrofotometer IR

H-NMR

Analisa Data

1


42

Lampiran 3. Identifikasi Etil p-metoksisinamat (Mufidah, 2014) Organoleptis Etil p-metoksisinamat Senyawa Etil p-metoksisinamat diisolasi dari rimpang kencur (Kaempferia galanga Linn.) yang diperoleh dari kebun balittro (Balai Penelitian Tanaman Rempah dan Obat) di wilayah Sukabumi, Jawa Barat. Etil p-metoksisinamat berwujud kristal putih kekuningan, memiliki aroma yang khas, mempunyai titik leleh 47-52oC.

1


43

Lampiran 4: Spektrum IR Etil p-metoksisinamat Hasil analisis Spektrofotometri IR menunjukkan penafsiran spektrum IR senyawa isolat kencur (Etil p-metoksisinamat ) dari berbagai bilangan gelombang absorbansi gugus fungsi yang spesifik seperti yang tertera pada gambar dan tabel berikut:

Ikatan

Daerah

Absorbansi

(𝒗,𝒄𝒎−𝟏) C=O

1704,18

C-O

1367,59-1321,3

C-H Aril

3007,15-3045,73

C=C Aril

1629,92-1573,02

C-H Alifatik

2979,18-2842,23

C-O Aril

1252,82-1210,38; 1029,07

Aromatik posisi para

829,43

1


44

Lampiran 5: Spektrum GC-MS Etil p-metoksisinamat Hasil

interpretasi

Gas

Chromatography-Mass

Spectroscopy

(GC-MS)

menunjukkan bahwa senyawa isolat kencur (Etil p-metoksisinamat) muncul pada waktu retensi 9,932 dan memiliki berat molekul 206,0 g/mol dengan fragmentasi massa pada 161; 134; 118; 103; 89; 77; 63; dan 51. Adapun spektrum GC-MS dan fragmentasi yang terjadi pada senyawa isolat kencur (Etil p-metoksisinamat) adalah sebagai berikut

1


45

1


46

Lampiran 6: Spektrum 1H-NMR Etil p-metoksisinamat

1


47

Hasil analisis 1H-NMR menggunakan pelarut CDCl3 menunjukkan nilai pergeseran kimia (δ) sebagai berikut: Posisi

Pergeseran

Kimia

(δ, ppm) (CDCl3) 12

1,33 (t, 3H, Ј=7,15)

11

4,25 (q, 2H, Ј=7,15)

8

6,31 (d, 1H, Ј=15,6)

7

7,65 (d, 1H, Ј=16,25)

5

6,90 (d, 1H, Ј=9,05)

4

7,47 (d, 1H, Ј=8,45)

2

7,47 (d, 1H, Ј=8,45)

1

6,90 (d, 1H, Ј=9,05)

15

3,82 (s, 3H)

Struktur Etil p-metoksisinamat Spektrum 1H-NMR memberikan sinyal pada pergeseran kimia 1,33 ppm (3H) berbentuk triplet dan juga pada 4,25 ppm (2H) berbentuk quartet. Sinyal ini lebih downfield karena berikatan dengan oksigen. Spektrum 1H-NMR juga memberikan sinyal pada pergeseran kimia 3,82 ppm (3H) berbentuk singlet. Sinyal ini lebih downfield karena berikatan dengan Oksigen (-OCH3, metoksi). Pergeseran kimia 6,31 ppm (1H) berbentuk doublet memiliki hubungan dengan puncak pada pergeseran kimia 7,65 ppm (1H) berbentuk doublet, dengan rentang nilai konstanta kopling yang dekat yaitu 15,6 dan 16,26 Hz. Bentuk tersebut adalah olefin dengan proton berkonfigurasi trans. Kemudian pada pergeseran kimia 6,9 ppm-7,4 ppm (4H) merupakan proton-proton dari benzen dengan dua subtitusi.

1


48

Pola sinyal ini menunjukkan bahwa 2 proton yang ekivalen terkopling secara ortho dengan 2 proton yang ekivalen lainnya, yang kemudian menunjukkan bahwa sinyal ini adalah sinhyal H 7/11 dan H 8/10. Dari data-data yang diperoleh tersebut, senyawa hasil isolasi dari kencur (Kaempferia galanga L.) adalah etil p-metoksisinamat.

1


49

Lampiran 7: Spektrum GC-MS Senyawa Asam p-metoksisinamat

1


50

Lampiran 8: Spektrum IR senyawa nitrasi 105

%T

97.5

90

82.5

75

67.5

60

4000 3500 nitrasi apms 3000

3098.78 2923.25

2500 2000 1750 1614.49

1500

1526.72

1349.26

1250

1210.38

1086.93

1000

1010.74

903.69

750 500 1/cm

1


51

Lampiran 9: Spektrum GC-MS Senyawa nitrasi APMS

1


52

Lampiran 10: H-NMR, C-NMR, HSQC senyawa hasil nitrasi


53


54


55

1H-NMR


56


57


58


59


60

HSQC


61


62


63

Lampiran 11: Perhitungan Reaksi a. Perhitungan Bahan untuk Reaksi Hidrolisis 1. Etil p-metoksisinamat -

Terpakai = 5 gram, BM=206,24 gr/mol

-

Mol 

=0,024 mol 2. NaOH -

BM = 40 gr/mol

-

Mol = 1,5 X 0,024 = 0.036 mol

-

Massa (g) =mol X BM = 0,0479 X 40 = 1,44 gram1,5 gram

b. Perhitungan Bahan Reaksi Nitrasi 1. Asam p-metoksisinamat -

Terpakai = 3 gram, BM= 178

-

Mol 

=0,0169 mol 2. Asam Nitrat -

BM = 63,01 g/mol

-

Ƿ

-

Mol

=1,4 g/mL

= 16 X 0,0169 = 0,2704 mol -

Massa (g) =mol X BM


64

= 0,2704 X 63,01 = 17,5612 -

Volume (mL)

= mol = 12,112 mL


65

Lampiran 12: Hasil Perhitungan Uji Antiinflamasi Senyawa hasil nitrasi Kon s 0.1 1 10 100

KN = 1.247 I II III 0.78 0.79 0.78 6 5 3 0.87 0.89 0.86 6 4 1.01 1.08 1.06 6 3 1.34 1.34 1.34 1 7 9

% INHIBISI 36.8 29.7 18.4 4 -7.56

36.17 6 28.28 8 13.1

37.16 5 30.98 9 14.43

-8.04

-8.2

MEA N 36.71 29.65

0.49 5 1.35

MEAN±S D 36.71±0.49 5 29.65±1.35

15.32

2.77

15.32±2.77

-7.93

0.32 9

7.93±0.329

Senyawa 4-metoksi-2-nitro-beta-nitrostirena Kon KN = 2.593 % INHIBISI MEA s N I II III 0.1 2.622 2.59 2.60 0 -0.501 -0.543 3 3 6 1.129 1 2.616 2.58 2.60 0.231 -0.385 -0.347 7 3 0.887 10 2.605 2.58 2.58 0.385 0.424 0.115 3 2 0.462 100 2.587 2.58 2.57 0.424 0.784 0.325 2 3 0.231 Senyawa Na-Diklofenak Konsentrasi 0.1 1 10 100 Senyawa EPMS Kon KN = 1,002 s

0.1

I 0,675

1

0,602

10

0,557

100

0,449

II 0,67 3 0,59 6 0,59 3 0,44 7

KN= 0,20 5 III 0,14 9 0,14 6 0,11 4 0,08 8

% inhibisi 1.59 4.56 26.75 98.85

SD

SD 0.567 0,559 0,5 0,514

MEAN± SD -0.543 ± 0.567 -0.347 ± 0,559 0.115 ± 0,5 0.325 ± 0,514

SD 0.36 2.98 4.43 0.8

% INHIBISI

MEA N

SD

MEAN± SD

32,6

32,8

27,3

30,9

3,119

39,9

40,5

29

6,473

44,4

40,8

44,3

55,2

52,4

57,2

36,46 7 46,76 7 54,93 3

30,9±3,1 19 36,467± 5,473 46,767± 4,852 54,933± 2,411

4,852 2,411


66

Lampiran 13: Kurva Uji Antiiflamasi 120 100 Na diklofenak

80

EPMS

60 40

APMS

20

4-metoksi-2-nitrobeta-nitrostirena

0 0.1 ppm

1 ppm

10 ppm

100 ppm

-20


67

Lampiran 14 : Gambar Senyawa

Etil p-metoksisinamat

Asam p-metoksisinamat

Senyawa hasil nitrasi


68

Lampiran 15: Gambar Analisis Senyawa

Gambar 1: Analisa dengan IR

Gambar 2: Analisa dengan GCMS

Gambar 3: Analisa Dengan HNMR


Modifikasi Struktur Senyawa Asam p-metoksi Sinamat Melalui Proses Nitrasi Serta Uji Aktivitas Sebagai Anti Inflamasi

Recommend Documents