STUDI EKSPRESI GEN PENYANDI AGAMOUS DAN LEAFY TANAMAN KELAPA SAWIT (Elaeis guineensis Jacq.) NORMAL DAN ABNORMAL HASIL KULTUR JARINGAN
IMRON RIYADI
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2008
ii
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul Studi Ekspresi Gen Penyandi AGAMOUS dan LEAFY Tanaman Kelapa Sawit (Elaeis guineensis Jacq.) Normal dan Abnormal Hasil Kultur Jaringan adalah benar-benar hasil karya sendiri dengan arahan dari Komisi Pembimbing dan belum pernah digunakan untuk memperoleh gelar sejenis di perguruan tinggi manapun.
Semua sumber data dan
informasi yang digunakan telah dinyatakan secara jelas dan dapat diperiksa keberadaan dan kebenarannya.
Bogor, Agustus 2008
Imron Riyadi NRP. P055050061
iii
ABSTRACT IMRON RIYADI. Study on the Expression of Genes Encoding AGAMOUS and LEAFY in Normal and Abnormal Oil Palm (Elaeis guineensis Jacq.) Derived from Tissue Culture. Under the direction of GUSTAAF ADOLF WATTIMENA and ASMINI BUDIANI. Tissue culture of oil palm has been established, but its commercialization has been hampered by reproductive organ abnormality. The development of flowers and fruits is influenced by expression of genes controlling organ identity. The function AGAMOUS (AG) gene is to induce organ identity, whereas the function LEAFY (LFY) gene is to induce AG expression. A research was conducted to study AG and LFY transcript accumulation (expression) in several developmental reproductive organs of normal and abnormal oil palm derived from tissue culture. Total RNA was isolated from flowers and fruits of normal and abnormal oil palm trees derived from tissue culture. Synthesis of first strand cDNA was carried out using total RNA. Amplification of AG and LFY gene fragment were conducted by means of RT-PCR technique using specific primers. The RT-PCR product was isolated, cloned, sequenced and analysed to confirm its homology to the target gene. Accumulation of AG and LFY transcript was analysed by quantitative program of UN-SCAN-IT GelTM connected to gel doc. The results revealed that RT-PCR product of AG is highly homologous with AG gene sequence of oil palm from the GenBank. Reproductive organ of normal and abnormal oil palm accumulated AG, but LFY could not be detected. There was difference of quantity on AG transcript accumulation between normal and abnormal oil palm. The biggest difference was detected between normal and abnormal fruits. AG fragments of normal oil palm has maximum identity of 100% with that of oil palm AG sequence from the GenBank, whereas AG fragments of abnormal oil palm has maximum identity of 99%. Difference in one nucleotide was detected between AG DNA sequence of normal and abnormal oil palm. Keywords: oil palm, abnormality, tissue culture, AG, LFY, transcript accumulation, RTPCR
iv
RINGKASAN IMRON RIYADI. Studi Ekspresi Gen Penyandi AGAMOUS dan LEAFY Tanaman Kelapa Sawit (Elaeis guineensis Jacq.) Normal dan Abnormal Hasil Kultur Jaringan. Dibimbing oleh GUSTAAF ADOLF WATTIMENA dan ASMINI BUDIANI. Teknologi kultur jaringan tanaman kelapa sawit telah berhasil dikembangkan sejak beberapa dekade. Namun, munculnya abnormalitas pada organ reproduktif menghambat komersialisasinya. Keberhasilan deteksi dan identifikasi gen kunci pada organ reproduktif berpotensi membuka jalan untuk perakitan marka abnormalitas pada tanaman kelapa sawit asal kultur jaringan. Gen LEAFY (LFY) dan Gen AGAMOUS (AG) merupakan gen penting dalam proses pembungaan tanaman yang berpengaruh dalam pembentukan dan perkembangan organ reproduktif. Gen LFY berperan untuk menginduksi ekspresi gen AG di samping gen AP3 dan PI. Sedangkan gen AG berperan dalam pembentukan dan perkembangan stamen dan karpel. Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari ekspresi gen AG dan LFY pada kelapa sawit normal dan abnormal hasil kultur jaringan sebagai bagian dari upaya untuk merakit teknologi deteksi abnormalitas kelapa sawit asal kultur jaringan. RNA total organ reproduktif kelapa sawit normal dan abnormal diisolasi dari bunga dan buah asal kultur jaringan. RNA total selanjutnya digunakan untuk sintesis cDNA utas pertama. Amplifikasi fragmen gen LFY dan AG dilakukan dengan pendekatan RT-PCR menggunakan primer spesifik. Fragmen gen AG berhasil diamplifikasi, namun fragmen gen LFY tidak berhasil, sehingga analisis akumulasi transkrip hanya dilakukan pada mRNA AG yang dianalisis secara visual dan kuantitatif dengan program UN-SCAN-IT GelTM versi 6.1 yang dihubungkan dengan gel doc. Fragmen gen AG hasil RT-PCR diklon menggunakan vektor pGEM-T Easy ke dalam sel E. coli DH5α kompeten. Plasmid rekombinan diisolasi untuk sekuensing DNA fragmen terklon. Sekuen DNA kemudian dianalisis homologinya dengan gen AG. Hasil penelitian menunjukkan bahwa fragmen produk RT-PCR AG mempunyai homologi yang tinggi dengan gen AG kelapa sawit yang terdapat pada database GenBank, menunjukkan bahwa fragmen produk RT-PCR AG adalah benar merupakan fragmen gen AGAMOUS. Ekspresi AG terdeteksi pada pada bunga dan buah kelapa sawit normal dan abnormal. Akumulasi transkrip mRNA AG pada kelapa sawit abnormal lebih tinggi dari pada kelapa sawit normal. Perbedaan akumulasi terbesar adalah antara buah normal dengan buah abnormal. Fragmen AG dari kelapa sawit normal mempunyai nilai maximum identity 100%, sedangkan fragmen AG dari kelapa sawit abnormal mempunyai nilai maximum identity sedikit lebih rendah, yaitu 99%. Dideteksi adanya satu basa yang berbeda antara sekuen DNA AG dari kelapa sawit normal dengan yang abnormal. Kata kunci: kelapa sawit, abnormalitas, kultur jaringan, LFY, AG, akumulasi transkrip, RT-PCR.
v
© Hak cipta milik Institut Pertanian Bogor, tahun 2008 Hak Cipta dilindungi Undang-undang Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumber. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin Institut Pertanian Bogor.
vi
STUDI EKSPRESI GEN PENYANDI AGAMOUS DAN LEAFY TANAMAN KELAPA SAWIT (Elaeis guineensis Jacq.) NORMAL DAN ABNORMAL HASIL KULTUR JARINGAN
IMRON RIYADI
Tesis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Bioteknologi
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2008
vii
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr. Ir. Agus Purwito, M.Agr
viii
Judul Penelitian Nama NRP
: Studi Ekspresi Gen Penyandi AGAMOUS dan LEAFY Tanaman Kelapa Sawit (Elaeis guineensis Jacq.) Normal dan Abnormal Hasil Kultur Jaringan. : Imron Riyadi : P055050061
Disetujui Komisi Pembimbing
Prof. Dr. Ir. G. A. Wattimena, M.Sc Ketua
Dr. Asmini Budiani, M.Si Anggota Diketahui
Ketua Program Studi Bioteknologi
Dr. Ir. Muhammad Jusuf, DEA
Tanggal ujian: 26 Agustus 2008
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof. Dr. Ir. Khairil Anwar Notodiputro, M.S.
Tanggal Lulus:
ix
PRAKATA Segala puji dan syukur Alhamdulillah penulis panjatkan ke hadlirot Alloh SWT atas segala karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan studi dan penelitian sampai penyusunan tesis ini dengan lancar. Tesis ini ini disusun sebagai salah satu syarat untuk meraih gelar Magister Sains di Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Penelitian ini dilaksanakan sejak bulan April 2007 sampai dengan bulan Mei 2008, dengan judul “Studi Ekspresi Gen Penyandi AGAMOUS dan LEAFY Tanaman Kelapa Sawit (Elaeis guineensis Jacq.) Normal dan Abnormal Hasil Kultur Jaringan”. Penelitian ini merupakan sebagian dari riset yang didanai oleh APBN dengan tema Pengembangan Teknik Produksi Bibit Kelapa Sawit Klonal dengan Abnormalitas Rendah Melalui Kultur Jaringan. Penulis menghaturkan terima kasih setulus hati kepada Prof. Dr. Ir. G.A. Wattimena, M.Sc dan Dr. Asmini Budiani, M.Si selaku komisi pembimbing yang telah berkenan meluangkan waktu, memberikan bimbingan, arahan dan saran kepada penulis dalam melakukan penelitian ini. Ungkapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Dr. Agus Purwito, M.Agr selaku penguji luar atas koreksi dan masukannya demi perbaikan tesis ini. Penulis menghaturkan terima kasih kepada Dr. Ir. Darmono Taniwiryono, M.Sc selaku Kepala Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia (BPBPI) dan Ir. Sumaryono, M.Sc selaku Penanggung Jawab Laboratorium Biak Sel & Mikropropagasi BPBPI yang telah memberikan kesempatan kepada penulis dalam menjalani studi. Penulis juga menghaturkan terima kasih kepada Dr. Djoko Santoso, M.Sc selaku Kepala Urusan Penelitian dan Pengembangan sekaligus Penanggung Jawab Laboratorium Biologi Molekuler dan Rekayasa Genetik (BMRG) BPBPI atas izin dan arahan selama penulis melakukan penelitian. Secara khusus, penulis menghaturkan terima kasih dan hormat yang sangat mendalam kepada Bapak dan Ibu yang senantiasa memberikan dorongan dengan do’a yang tulus selama penulis menjalani studi. Ungkapan terima kasih dan sayang yang tidak terkira penulis sampaikan kepada istri tercinta Woro Sri Harini beserta seluruh anak tersayang Muchammad Amru Al-Chakim, Chusnul Fauzi Az-Zahro dan Muchammad Chanif Al-Muhaimin yang selalu sabar membantu meringankan beban, memberikan dorongan semangat dan do’a yang tulus kepada penulis sehingga penulis tetap tegar dalam menjalani studi sampai penyusunan penelitian ini. Tidak lupa penulis mengucapkan terima kasih kepada seluruh adik saya yang telah memberikan dorongan dan do’a selama studi sampai penelitian. Tidak lupa penulis sampaikan terima kasih kepada seluruh Peneliti BPBPI khususnya di Laboratorium Biak sel & Mikropropagasi dan Laboratorium Biologi Molekuler dan Rekayasa Genetik serta para Staf Penunjang BPBPI. Dalam kesempatan ini penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Staf Teknisi Laboratorium Biak Sel & Mikropropagasi dan Laboratorium Biologi Molekuler dan Rekayasa Genetik khususnya kepada Mbak Niyah dan Mbak Nita atas bantuannya selama penelitian. Terakhir penulis mengucapkan terima kasih kepada Dik Reza dan Febri atas bantuan informasi tentang bioinformatika serta rekan-rekan BTK 2005 & 2006 atas bantuan dan kebersamaanya selama studi dan penelitian. Penulis berharap semoga hasil penelitian dapat bermanfaat di bidang pertanian, khususnya sektor perkebunan yang dapat meningkatkan kesejahteraan bagi para
x
pekebun dan rakyat dalam arti luas. Permohonan maaf penulis sampaikan atas segala kekurangan dalam penulisan laporan ini, serta atas ucapan dan tindakan yang kurang berkenan kepada semua pihak terkait.
Bogor, Agustus 2008 Imron Riyadi
xi
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Boyolali, Jawa Tengah pada tangal 18 Januari 1972 sebagai anak pertama dari pasangan Ayahanda Parto Suwarno dan Ibunda Suparti. Pada tahun 1985 penulis meyelesaikan pendidikan Madrasah Ibtidaiyah Tegalrejo Sawit Boyolali dan melanjutkan ke SMP Negeri 1 Sawit Boyolali selama tiga tahun dan lulus pada tahun 1988. Selanjutnya penulis meneruskan pendidikan ke SMA Negeri 1 Boyolali dan lulus pada tahun 1991. Penulis memperoleh gelar Sarjana Pertanian dari Fakultas Pertanian Jurusan Budidaya, UniversitasTunas Pembangunan Surakarta pada tahun 1997. Sejak tahun 1998 sampai sekarang penulis bekerja sebagai staf peneliti di Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia (BPBPI), Bogor. Pada tahun 2005 penulis memperoleh kesempatan belajar di Program Pascsarjana, Institut Pertanian Bogor.
xii
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL ...................................................................................................
xiii
DAFTAR GAMBAR .............................................................................................
xiv
DAFTAR LAMPIRAN ...........................................................................................
xv
PENDAHULUAN Latar Belakang ........................................................................................... Tujuan Penelitian ....................................................................................... Hipotesis Penelitian ...................................................................................
1 3 3
TINJAUAN PUSTAKA Sejarah Tanaman Kelapa Sawit ................................................................. Botani Tanaman Kelapa Sawit ................................................................... Kultur Jaringan Tanaman Kelapa Sawit .................................................... Abnormalitas Organ Reproduktif Tanaman Kelapa Sawit.......................... Gen-gen Pembungaan Tanaman ......... ....................................................... Bioinformatika ...........................................................................................
5 6 7 8 10 14
BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian .................................................................... Bahan …………………………………………………………………….. Metode …………………………………………………………………… Pengambilan dan Penyimpanan Sumber RNA Total .................................. Isolasi RNA Total ........................................................................................ Perancangan Primer Spesifik AG dan LFY .................................................. Optimasi Kondisi RT-PCR untuk Isolasi Fragmen AG dan LFY ................. Analisis Akumulasi mRNA AG dan LFY dengan RT-PCR ......................... Kloning Fragmen DNA Hasil RT-PCR ....................................................... Sekuensing dan Analisis DNA Fragmen Terklon ........................................
16 16 16 17 18 19 20 20 21 22
HASIL DAN PEMBAHASAN Fenotipe Organ Reproduktif Kelapa Sawit Normal dan Abnormal .............. Isolasi RNA Total ........................................................................................ Perancangan Primer Spesifik AG dan LFY .................................................. Optimasi Kondisi untuk Amplifikasi Fragmen Gen AG dan LFY ................ Analisis Akumulasi mRNA AG dengan RT-PCR ........................................ Analisis Akumulasi mRNA LFY dengan RT-PCR ...................................... Kloning Fragmen DNA Hasil RT-PCR ....................................................... Sekuensing dan Analisis DNA Fragmen Terklon ........................................
23 24 25 28 29 30 31 33
SIMPULAN DAN SARAN ..................................................................................... 39 DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................... 40 LAMPIRAN ............................................................................................................. 45
xiii
DAFTAR TABEL Halaman 1 Konsentrasi dan kemurnian RNA total hasil isolasi dari organ reproduktif kelapa sawit normal dan abnormal ..................................................................... 25 2 Nama primer spesifik beserta susunan nukleotida hasil rancangan ..................
28
3 Hasil kuantifikasi ekspresi AG dengan kontrol internal ACT pada kelapa sawit normal dan abnormal dengan program UN-SCAN-IT gel 6.1 .......................... 30 4 Hasil analisis BlastN sekuen gen AG kelapa sawit normal ...............................
35
5 Hasil analisis BlastN sekuen gen AG kelapa sawit abnormal ...........................
36
xiv
DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Bunga tanaman kelapa sawit .............................................................................
6
2 Model gen ABC untuk proses pembentukan organ bunga ................................. 11 3 Lintasan gen-gen yang berpengaruh dalam proses pembentukan organ bunga.... 13 4 Diagram alir penelitian ....................................................................................... 17 5 Sumber RNA total organ reproduktif tanaman kelapa sawit .............................. 23 6 Hasil isolasi RNA total organ reproduktif tanaman kelapa sawit ....................... 24 7 Sekuen DNA gen AG (AJ581463) dan posisi primer AGF dan primer AGR ..... 26 8 Sekuen DNA gen LFY (gi|60683943) dan posisi primer LFY ............................ 27 9 Hasil RT-PCR AG menggunakan templat RNA dari bunga 2 abnormal dan bunga 2 normal .................................................................................................. 29 10 Fragmen gen AG hasil RT-PCR dengan kontrol internal ACT secara berpasangan dari kelapa sawit normal dan abnormal ......................................... 29 11 Elektroforesis hasil pemurnian fragmen DNA produk RT-PCR bunga 2 normal dan abnormal menggunakan primer AGF/AGR .................................................. 31 12 PCR koloni hasil transforman menggunakan produk RT-PCR AG dari bunga 2 normal dan abnormal ........................................................................................ 32 13 Hasil plasmid rekombinan dan digestinya dengan EcoR1 dari koloni yang teruji positif mengandung fragmen produk RT-PCR AG ............................................. 33 14 Susunan nukleotida hasil sekuensing menggunakan primer M13F dari fragmen gen AG terklon asal kelapa kelapa sawit normal .................................................. 34 15 Susunan nukleotida hasil sekuensing menggunakan primer M13F dari fragmen gen AG terklon asal kelapa sawit abnormal ......................................................... 34 16 Hasil analisis BlastN sekuen gen AG kelapa sawit normal ................................. 35 17 Hasil analisis BlastN sekuen gen AG kelapa sawit abnormal ............................. 36 18 Hasil penjajaran antara sekuen AG kelapa sawit normal dan abnormal ............... 38
xv
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Larutan yang digunakan dalam isolasi RNA total organ reproduktif tanaman kelapa sawit ......................................................................................................... 46 2 Hasil pengukuran RNA total dari semua fase organ reproduktif tanaman kelapa sawit dengan specrofotometer ............................................................................ 47 3 Hasil perancangan primer AG dengan program Primer3 .................................. 48 4 Hasil penjajaran sekuen gen LFY pada beberapa spesies dari database pada GenBank ............................................................................................................ 50 5 Hasil perancangan primer LFY_1 dengan program Primer3 ............................. 55 6 Hasil perancangan primer LFY_2 dengan program Primer3 ............................. 57 7 Hasil perancangan primer LFY_3 dengan program Primer3 ............................. 59 8 Sekuen gen ACT dari database GenBank pada no. Aksesi AF394737 yang digunakan untuk perancangan primer ................................................................. 61 9 Peta situs restriksi vektor ekspresi pGEM-T Easy ............................................. 62 10 Hasil analisis peta restriksi fragmen gen AG kelapa sawit normal ..................... 63 11 Hasil analisis peta restriksi fragmen gen AG kelapa sawit abnormal ................. 66 12 Electropherogram hasil sekuensing fragmen gen AG kelapa sawit normal menggunakan primer M13................................................................................... 68 13 Electropherogram hasil sekuensing fragmen gen AG kelapa sawit abnormal menggunakan primer M13................................................................................... 70 14 Hasil analisis BlastN sekuen gen AG kelapa sawit normal ................................ 72 15 Hasil analisis BlastN sekuen gen AG kelapa sawit abnormal ............................ 75 16 Hasil analisis BlastX sekuen gen AG kelapa sawit normal ................................ 79 17 Hasil analisis BlastX sekuen gen AG kelapa sawit abnormal ............................. 82 18 Hasil penjajaran fragmen gen AG kelapa sawit normal dengan AG yang terdapat dalam database GenBank pada analisis BlastN ................................................. 85 19 Hasil penjajaran fragmen gen AG kelapa sawit abnormal dengan AG yang terdapat dalam database pada analisis BlastN ................................................... 86 20 Susunan nukleotida hasil analisis sekuen komplementer dari sekuen DNA fragmen AG abnormal menggunakan program Reverse Complement dari software BioEdit ................................................................................................ 87
