STRUKTUR GEN DAN FUNGSINYA. Dr. Jumsu Trisno; Jur. HPT Faperta Unand

STRUKTUR GEN DAN FUNGSINYA Dr. Jumsu Trisno; Jur. HPT Faperta Unand

Gradien perkembangan bioteknologi (Doyle dan Presley, 1996 dimodifikasi Gunadi 2003) Peningkatan biaya Bioteknologi moderen Genomik Rekayasa genetika hewan Rekayasa genetika tanaman Rekayasa genetika mikroba DNA Rekombinan Produksi antibodi monoklonal Transfer embrio pada hewan Kultur jaringan Pengendalian hayati Pupuk hayati Biodekomposer Fermentasi mikroba Bioteknologi tradisional Peningkatan efisiensi Dr. Jumsu Trisno; Jur. HPT Faperta Unand

Tabel 1.1. Perkembangan bioteknologi tanaman sejak abad ke 20 (Chawla, 2002, dimodifikasi) No.

Tahun

Invensi

Inventor

1.

1902

Percobaan pertama kultur jaringan

Haberlandt

2.

1904

Percobaan kultur embrio tanaman kubis-kubisan (Cruciferae)

Hannig

3.

1922

a. Perkecambahan asimbiotik benih anggrek secara in vitro b. Kultur ujung akar secara in vitro

Knudson Robbins

4.

1925

Penggunaan teknik kultur embrio dalam persilangan interspesifik tanaman Linum

Laibach

5.

1934

a. Kultur in vitro jaringan kambium beberapa jenis pohon dan perdu, meskipun gagal dalam pembelahan sel yang berkelanjutan b. Keberhasilan kultur akar tomat

Gautheret

White

6.

1939

Keberhasilan penumbuhan kultur kalus

Gautheret, Nobecourt, and White

7.

1940

Kultur in vitro jaringan kambium Ulmus untuk mempelajari pembetukan pucuk tambahan

Gautheret

No.

Tahun

Invensi

Inventor

8.

1941

a. Penggunaan air kelapa pertama kali yang mengandung faktor pembelahan sel pada Datura b. Kultur in vitro jaringan crown gall

van Overbeek Braun

9.

1944

Pembentukan akar tambahan tanaman tembakau secara in vitro

Skoog

10.

1946

Pembentukan tanaman Lupinus dan Tropaeolum melalui kultur ujung akar

Ball

11.

1950

Regenerasi organ dari jaringan kalus Sequoia sempervirens

Ball

12.

1952

a. Penggunaan kultur meristem untuk memperoleh tanaman dahlia bebas virus b. Aplikasi pertama cangkokan mikro (micrografting)

Morel dan Martin

13.

1953

Produksi kalus haploid tanaman gymnospermae Ginkgo biloba dari serbuk sari (polen)

Tulecke

14.

1954

Tanaman pertama dari sel tunggal

Muir et al

No.

Tahun

Invensi

Inventor

15.

1955

Penemuan kinetin sebagai hormon pembelahan sel

Miller et al.

16.

1957

Penemuan pengatur pembentukan organ melalui prubahan perbandingan auksin : sitokinin

Skoog dan Miller

17,

1958

Regenerasi embrio somatik nucellus dari ovul Citrus secara in vitro

Maneshwari dan Rangas-wamy

18.

1959

a. Regenerasi embrio dari gumpalan kalus dan suspensi sel wortel (Daucus carota) b. Publikasi pertama buku panduan mengenai kultur jaringan tanaman

Reinert, Steward

19.

1960

a. Keberhasilan pertama fertilisasi Ppapaver rhoeas dalam test tube b. Penggunaan metoda mikrokultur untuk menumbuhkan sel tunggal dalam tetesan bergantung (hanging drops) dalam medium yang terkondisi c. Perombakan dinding sel secara enzimatik untuk memperoleh protoplas dalam jumlah banyak d. Filtrasi suspensi sel dan isolasi sel tunggal melalui cawan tuang (plating)

Kanta Jones et al. Cocking Bergmann

20.

1962

Pengembangan medium nutrisi Murashige dan Skoog

Murashige dan Skoog

21.

1968

Meslson dan Yuan

Meslson dan Yuan

22.

1970

a. Seleksi mutan biokimia secara in vitro melalui penggunaan kutur jaringan yang menghasilkan keragaman b. Keberhasilan pertama fusi protoplas c. Penemuan pertama endonuklease restriksi dari Haemophillus influenzae Rd., kemudian dimurnikan dan dinamakan HindII

Carlson Power et al. Smith

23.

1971

a. Penyiapan peta restriksi pertama menggunakan enzim HindII untuk memotong DNA sirkular dari SV 40 menjadi 11 fragmen yang spesifik b. Regenerasi tanaman pertama dari protoplas

Nathans Takebe et al.

24.

25.

1972

1973

a. Laporan pertama mengenai hibridisasi interspesifik melalui fusi protoplas dalam 2 spesies Nicotiana b. Molekul DNA rekombinan pertama pertama menggunakan enzim restriksi c. Penggabungan 2 fragmen restriksi tanpa mempertimbangkan asalnya yang dihasilkan melalui aksi DNA ligase d. Pengembangan prosedur enzim yang cocok dapat ditambahkan untuk mengisi kesenjangan dalam beberapa DNA untai tunggal dan penggunaan DNA ligase untuk menggabungkan 2 fragmen sehingga menghasilkan DNA rekombinan e. Penemuan enzim reverse transkriptase (bolak balik): penentuan virus hewan penyebab kanker, alur informasi genetik dalam bentuk bolak balik (reverse)

Carlson

a. Penggunaan teknik Lobban dan Kaiser untuk pengembangan plasmid hibrid – insersi fragnen molekul DNA EcoRl ke dalam DNA plasmid sirkular dari bakteri menggunakan enzim DNA ligase. Gen dari penyu Afrika diselipkan ke dalam DNA plasmid bakteri b. Sitokinin ditemukan mampu memecah dormansi menggunakan eksplan capitulum dari Gerbera

Herbert Boyer dan Stanley Cohen

Berg et al. Mertz dan Davis Lobban dan Kaiser

Temin

Pierik et al.

26.

1978

Hibridisasi somatik dari tomat dan kentang menghasilkan pomato

Melchers et al.

27.

1979

Pengembangan prosedur kokultivasi untuk transformasi protoplas tanaman dengan Agrobacterium

Marton et al

28.

1980

a. Pengembangan teknik restriction fragment length polymorphism (RFLP) b. Studi mengenai struktur T-DNA melalui pengklonan complete EcoRl digest dari DNA crown gall pada tembakau dalam vektor-fag, sehingga memungkinkan isolasi dan kajian rinci T-DNA border sequences

Eli Lily and Co Zambryski et al.

29.

1981

Introduksi istilah variasi somaklonal

Larkin dan Scowcroft

30.

1982

Inkorporasi dari naked DNA oleh protoplas menghasilkan transformasi dengan isolated DNA

Krens et al.

31

1983

Polymerase chain Reaction (PCR) merupakan ide dari suatu proses amplifikasi DNA kimia

Kary Mullis

32.

1864

a.Transformasi tembakau dengan Agrobacterium, pengembangan tanaman transgenik b. Pengembangan teknik sidik jari genetik (finger printing) untuk mengidentifikasi individu melalui analisis polymorphism pada tingkat sekuens DNA

De Block et al., Horsch et al. Jeffreys

33.

1986

Pengembangan tanaman tembakau dan tomat transgenik cDNA dari gen mantel protein dari TMV

Powell-Abel et al

34.

1987

a. Pengembangan metoda pemindahan gen biolistik untuk transformasi tanaman b. Isolasi gen Bt dari bakteri Bacillus thuringiensis

Sanford et al., Klein et al. Barton et al

35.

1990

Pengembangan teknik random amplified polymorphic DNA (RAPD)

Welsh and McClelland

36

1991

Pengembangan sistim microarray DNA Fodor menggunakan cahaya langsung sistim sintesis kimia

37.

1995

a. Pelaporan oleh Institut for Genome Research mengenai gugus (sequence) DNA dari Haemophilus influenzae b. Pengembangan sidik jari (fingerprinting) DNA melalui teknik amplified length polymorphism (AFLP)

Fleischmann et al.

Vos et al.

38.

1997

Penggugusan (Sequencing) genom E. coli

Blattner et al

39

1998

Penggugusan (Sequencing) genom organisme multiseluler (Caenorhabditis elegans)

Sequencing Consortium C. elegans

Dr. Jumsu Trisno; Jur. HPT Faperta Unand

Dasar-Dasar Bioteknologi Untuk Pemuliaan Tanaman

Potensi Bioteknologi dalam Bidang Pertanian 1. Memberikan efisiensi produksi yang lebih tinggi

2.

Pengurangan pencemaran lingkungan

3.

Diperolehnya tanaman yang lebih adaptif pada kondisi lingkungan marjinal

4.

Peningkatan kualitas produk pertanian

5.

Menjadikan tanaman sebagai pengganti sumber energi dan bahan baku alternatif

6. Memperoleh tanaman tahan hama dan penyakit tumbuhan 7. Mendapatkan dan meningkatkan kemampuan biopestisida 8. Mendapatkan pupuk-pupuk hayati


Keuntungan potensial bioteknologi pertanian

Menurut Jones (2003) • mengurangi penggunaan pupuk dan pestisida sintetik, • toleran terhadap cekaman lingkungan, • pemanfaatan lahan marjinal, • identifikasi dan eliminasi penyakit di dalam makanan ternak, • kualitas makanan dan gizi yang lebih baik dan • perbaikan defisiensi mikronutrien Dr. Jumsu Trisno; Jur. HPT Faperta Unand

Peningkatan kualitas tanaman melalui bioteknologi Menurut Huttner (2003 dimodifikasi) • kualitas pangan, • resistensi terhadap hama atau penyakit, • toleransi terhadap cekaman lingkungan (kekeringan, kemasaman tanah, kadar Al-dd) • dan pengelolaan budidaya (gulma, naungan) Dr. Jumsu Trisno; Jur. HPT Faperta Unand

GEN Unit molekul DNA atau RNA dengan panjang minimum tertentu yang membawa informasi mengenai urutan asam amino yang lengkap suatu protein.





STRUKTUR HALUS MATERI GENETIK

Panjang rata-rata sebuah gen ~ 1,2 kb < 1 kb = 1000 bp > 32 kb = 10.000 bp

Prokaryot: tidak mengandung intron Eukaryot : Mengandung Intron

Dr. Jamsari, Prog. Studi Dr. Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA Jumsu Trisno; Jur. HPT Faperta Unand




DNA

RNA

transkripsi replikasi replikasi

PROTEIN translasi

Struktur lengkap Gen: 1. Promotor: pengatur proses ekspresi genetik 2. Struktural (coding rgion): bagian yang membawa kode genetik

3. Terminator: penghentian transkripsi



2. Struktur Halus Materi Genetik Gen A 5‘ 3‘

Exon E

Intron Exon Intron

Exon

P Titik stop

Titik start

5‘ 3‘

Sekuens DNA

Transkripsi m-RNA sementara

Pemisahan intron

Nukleus

m-RNA matang

Translasi

Protein

Sitoplasma

Dr. Jamsari, Prog. Studi Tanaman Jurusan BDP-FPUA Dr.Pemuliaan Jumsu Trisno; Jur. HPT Faperta Unand



Identifikasi Penyakit Virus (Berdasarkan Karakter Molekuler)





I. Identifikasi dan karakterisasi patogen : VIRUS 1. Isolasi DNA 

1

2

3

4

5

6

1

2

3

4

5

6

B

A

2. Amplifikasi PCR M

1

2

3

4

5

6

7

8

9 10

M

11

1600 bp

1500 bp 1000 bp 500 bp 250 bp


1

2

3

4

5

6

560 bp

Primer yang digunakan adalah: 1). PAL1v 1978 (5’-GCATCTGCAGGCCCACATYGTCTTYCCNGT-3’) dan PAR1c 715 (5’-GATTTCTGCAGTTDATRTTYTCRTCCATCCA-3’) yang dirancang untuk mengamplifikasi gen yang menyandikan protein untuk replikasi, common region dan protein selubung. 2). PAV494 [5’-GCC(C/T)AT(G/A)TA(T/C)AG(A/G) AAGCC(A/C)AG-3’] dan PAC1048 [GG(A/G)TT(A/G/T)GA(G/A)GCATG (T/A/C)GTACATG-3’] yang didesain untuk mengamplifikasi target gen coat protein (CP) dari kelompok geminivirus (Wyatt dan Brown, 1996). Dr. Jumsu Trisno; Jur. HPT Faperta Unand


Sekuensing >PYK 1 GAATTATATATGTATGGGATGGACGAAAGATCAACTGCGGAGATCAGCGG CTTCCTTCACATTTTCACTAGCCCATTGTCGTAGTTCCTCTGGAACTTGG TCAAACGACGACGACGGATATGGTGAAGCAAATGTATCTACAGGTTTAGC AAATATTTTATCGAAATTAACACTTAAATTGTGGTACTGTAGAACGTAGT CTTTTGGAGCAAGCTCTTTAATCAATTGAAGAGCATCGGACTTACTTCCA CAATTTAGGGCCTGCGCGTAAACATCGTTTACGGCGTGCTGACCACCTCG TGCAGATCGGCCATCTATCTGAAATTCTCCCCATTCGGTGGTATCACCGT CTTTGTCCATGTACGCCTTGACATCGGAACTTGATTTAGCTCCCTGAATG TTCGGATGGAAATGTGCTGACCTGGTTGGGGATACCAGGTCGAAGAATCT GTTGTTCGTGCAGACGTATTTCCCTTCGAATTGTATGAGCACATGGAGAT GAGGGCTCCCATCTTCGTGAAGTTCTCTACAGATCTTGACAAACAGCTTG TTGACAGGAGTGATGAGGGATTTTAATTGTTCGAGGGCCTCTTCTTTGGT TAGAGAACAATGTGGGGTATGTTAAGAAATAGTTTTTGCTCTGTAACTTA AAACGACGTGGGGGGAGGCATTTGGAGTGTCGTTTTGTATTGGAGACAAT CACTTCTATCCCTATGTATTGGAGACAGGAGACAATATATATAACTCCTA TATGGGCCTTACTACTTATTGGGCCTATCCCCGGGGTAAAGCGGCACTCG TATAATATTACCGAGTGCCGCGAAAAATTTTTGAGAAGGGGGGCCCAGAA ACCAAAACTTTGGACTGACCAATCCCGTTGGCATCTCCAAAGCTTAAANT TATGGGGGCGCCCAATTAAAAAGAAAAGGGGACCACCCCTCCCCCT Dr. Jumsu Trisno; Jur. HPT Faperta Unand

Karakterisasi

A

A T A

A–T

T

A

1: PYK1, Ag2-1, Ag2-4, PYLCIV

T

T A C

T A T

A T T

G–C C–G T–A C–G A–T C–G G–C G–C C–G 5’-G – C-3’

A T C G–C C–G T–A C–G A–T C–G G–C G–C C–G 5’-G – C-3’

1

2

T

Common Region

A

2: So2-1; 3: So3-5

A T A

A

T

A

T

T A C

T

A T A

A

T

A

T

T A C

T

G–C C–G T–A C–G A–T C–G G–C G–C C–G G–C 5’-C – G-3’

G–C C–G T–A C–G C–G G–C G–C 5’-C – G-3’

4

3

8: PSBT1 ; 9: Ag 1-4

A

A T A

A

T

A

T

T A C

T

G–C C–G T–A C–G A–T C–G G–C G–C 5’-G – C-3’

6

A T A

A–T A A T

T A C T T A

C G–C C–G T–A C–G A–T C–G G–C G–C 5’-G – C-3’

7

T

A

A T

T C–G C–G C–G C–G T–A G–C T–A T–A C–G T–A T–A 5’-G – C-3’

8

A T A

A

T

A

T

T A C

T

G–C C–G T–A C–G A–T C–G G–C G–C C–G G–C 5’-G – C-3’

9

Gambar 6: Hairpin loop region Geminivirus Isolat Sumatera Barat Dr. Jumsu Trisno; Jur. HPT Faperta Unand

A

A–T A

T

T A T C G–C C–G T–A C–G C–G C–G G–C G–C 5’-C – G-3’

5

4: TD1-3; 5: TD2-1

6: PSS1-1; 7:PSS2-3

A T A

A T A

A

A–T A A

T T T A

A A

T

C G–C C–G T–A C–G A–T C–G G–C G–C 5’-G – C-3’

(a)

A T A

A T

T

T A T

C G–C C–G T–A T–A A–T C–G C–G G–C G–C C–G 5’-G – C-3’

(b)

PSS

A

T

T A C

G–C C–G T–A C–G A–T C–G G–C G–C C–G G–C 5’-G – C-3’

(a)

T

A

T A

T

T- A

T

T A C


A T A

T

A

A

T

A T A

T A C

T

A T A

A

T

T

T A C

T

(b)

(a)

T- A

A

T A

T

T A C

T


(b) AG Dr. Jumsu Trisno; Jur. HPT Faperta Unand

T


TD

A

A

T A C

T

G–C C–G T–A C–G A–T C–G G–C G–C C–G G–C 5’-C – G-3’

(a)

T

A


PYK

(b)

Tabel 3. Perbandingan iteron gen C1 dari 11 isolat geminivirus Sumatera Barat dengan PepYLCIDV dan ToLCIDV Isolat

Iteron (5’ – 3’)

Posisi*

PepYLCIDV1)

GGAGACA

-86 s/d -80, -93 s/d-87, -122 s/d-116

ToLCIDV1)

GGAGACA

-134 s/d -128, -196 s/d -190

TLCJAV1)

GGGTCTCAA

-102 s/d -94, -137 s/d -129

Isolat musim tanam 2007 PYK1

GGAGACA

-82 s/d -76, -89 s/d-83, -118 s/d-112

So2-1

GGAGACA

-89 s/d -83, -97 s/d-91, -125 s/d-119

So3-5

GGAGACA

-84 s/d -78, -91 s/d-85, -119 s/d-113

TD1-3

GGAGACA

-87 s/d -81, -94 s/d-88, -123 s/d-117

TD2-1

GGAGACA

-83 s/d -77, -90 s/d-84, -117 s/d-111

PSS1-1

GGAGACA

-88 s/d -82, -95 s/d-89, -122 s/d-116

PSS2-3

GGAGACA

-85 s/d -79, -93 s/d-87, -121 s/d-115

PBST2-3

GGAGACA

-125 s/d -119

Ag1-4

GGAGACA

-90 s/d -84, -97 s/d-91, -125 s/d-119

Ag2-1, Ag2-4

GGAGACA

-89 s/d -83, -96 s/d-90, -124 s/d-118

Isolat musim tanam 2008 PSS1-1(08)

GGCGTC

-99 s/d -94, -106 s/d -101, -133 s/d -128

TD1-2(08)

GGAGACA

-85 s/d -80, -92 s/d -86, -119 s/d -114

Ag1-3(08)

GGAGACA

-85 s/d -80, -92 s/d -86, -119 s/d -114

PYK1-1(08)

Dr. Jumsu Trisno;-88 Jur. Faperta GGAGACA s/dHPT -82, -95 s/d 89, -125 s/d -119

Unand

Sequence Characterization of Begomoviruses PBST2-3 AG2-4 PYK1 TD2-1 PSS2-3 TD1-3 PSS1-1 AG2-1 AG1-4 SO3-5 SO2-1 PYLCVI-Co

GGTATTGGGAGACAATCCCTTCTTGTCCCCCATATAATTGGGGACAAGAAGACCACGATT -GTAT-AGGAGACAATCCTTCTAT---CCCCATATA--TGGGAGACAGGAGACAA----T -GTAT-TGGAGACAATCACTTCTA--TCCCTATGTA-TTGGAGAC-AGGAGACAA-----GTAT-TGGAGACA-TCCTTCTAT---CCCCATATATTGG-AGACAGG-AGACA-----T -GTAT-TGGAGACAATCCTTCTAT---CCCCATATATTGG-AGACAGGGAGACAA----T -GTAT-TGGAGACAATCCTTCTAT---CCCCATATATTGGGAGACAGG-AGACAA----T -GTAT-TGGAGACA-TCCTTCTAT---CCC-ATATATTGGGAGACAGG-AGACAA----T -GTAT-TGGAGACAATCCTTCTAT---CCCCATATATTGG-AGACAGG-AGACAA----T -GTAT-TGGAGACAATCCTTCTAT---CCCCATATATTGG-AGACAGG-AGACAA----T -GTAT-TGGAGACAATCCTTCTAT---CCCCATATATTGG-AGACAGG-AGACA-----T -GTAT-TGGAGACAATCCTTCTAT---CCCCATATATTGG-AGACAGGGAGACAA----T -GTAT-TGGAGACAATCACTTCTA--TCCCTATGTATTGG-AGACAGG-AGACAA----T **** ******* ** * *** ** ** * * **** iteron iteron iteron


767 743 735 730 655 732 739 731 730 736 735 2673

PBST2-3 AG2-4 PYK1 TD2-1 PSS2-3 TD1-3 PSS1-1 AG2-1 AG1-4 SO3-5 SO2-1 PYLCVI-Co

ATTCATTCAGG-TTCTTTAAGAGGGCGTTCTAGGGAAATTTTGGTCCACCCTCTGAAAGG ATATACATAAG-TTCTATAA--GGGCTTTCTAGGTAATTTT--GTAC-CCCCCTGGAATG -TATATATAAC-TCCTATATG-GGCCTTACTACTTA---TTGGGCCTATCCCC-----GG ATATACTTAAG-TTCTATAA--GGGC-TTCTAGGTAATTTT---TAC-CCCCTTGAATGA ATATACATAAG-TTCTATAA--GGGC-TTCTAGGTAATTTT--GTAC-ACCCTTGAATGA ATATACATAAG-TTCTATAA--GGGC-TTCTAGGTAATTTT--GTAC-ACCCTTGAATGA ATATACATAAG-TTCTATAA--GGGC-TTCTAGGTAATTTT--GTACCCCCCTTGAATGA ATATACATAAG-TTCTATAAA-GGGC-TTCTAGGTAATTTTT-GTACACCCCTTGAATGA ATATACCTAAGGTTCTATAA--GGGC-TTCTAGGTTATTTTT-GTAC-CCCCTTGAATGA ATATACTTAGN-TTCTATAA--GGGC-TTCTAGGTAATTTT--GTAC-NCCCTTGAATGA ATATACATAGG-TTCTATAAA-GGGC-TTCTAGGTAATTTT--GTAC-ACCCTTGAATGA ATATAGATAAG-TTCTATAA--GGGC-TTCTAGGTAATTTT--GTAC-ACCCTTGAATGA * * * * ** ** ** * * *** ** **

826 797 784 782 708 785 793 787 785 789 789 2726

TATA Box PBST2-3 AG2-4 PYK1 TD2-1 PSS2-3 TD1-3 PSS1-1 AG2-1 AG1-4 SO3-5 SO2-1 PYLCVI-Co

AAGAAAGGGGGGCACTTCGTAATAATAATAGCCCGAGGGGCCCCGCAAAATTTTTTAGGA ATTAAAGCGGCAC---TCGTA-TAATATTA--CCGAGTGCCGCCGAAAAATTTT----GG GGTAAAGCGGCAC---TCGTA-TAATATTA--CCGAGTG-CCGCGAAAAATTTTT---GA TAAA--GCGGCCC---TCGTA-TAA-ATTA--CCGAGGG-CC-CGAAAATTTTGA---AA TTAA--AGGGCAC---TCGTA-TAA-ATTA--CCGAGTG-CC-CNAAAATTTTGA---GT TTAAC-GCGGCAC---TCGTA-TAATATTA--CCGAGTG-CCGCGAAAAATTTTA---GA TAAAA-GGGGCAC---TCGTA-TAATATTA--CCGAGTG-CC-CGAAAATTTTTT---GA TTAAA-GCGGCAC---TCGTA-TAATATTA--CCGAGTG-CCGCGAAAATTTTTG---GA TTAAAGGCGGCAC---TCGTA-TAATATTA--CCGAGTG-CCGCCNAAAATTTTG---GA TNAA--GCGGCCT----CGTA-TAATATTA--CCGAGG--CCGCGAAAATTTT------TTAAA-GCGGCAC---TCGTTATAATATTA--CCGAGTG-CCGCGAAAATTTTT----GA TTAAA-GCGGCAC---TCGTA-TAATATT------------------------------* ** *** *** * *

Nanonucleotide Dr. Jumsu Trisno; Jur. HPT Faperta Unand

886 847 834 828 754 834 841 836 835 831 838 2750

Phylogeny Analysis of Begomovirus : “Common Region”

Langkah kerja: 1. Data sekuen yang didapatkan dianalisis 2. BANDINGKAN DENGAN DATA GENE BANK: BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST), : DIDAPAT HUBUNGAN HOMOLOGI DNA 3. Analis kekerabatan : ClustalW (www.ebi.ac.uk), Phylip (www.biowec.pasteur.fr/seqanal/phylogeny/philip-uk.htm),








Phylogeny Analysis of Begomovirus : “Common Region”

Group 1

Group 2 Group 3

Gambar 5. Filogenetik kekerabatan 11 isolat gemenivirus Sumatera Barat terhadap strainstrain dari daerah dan negara lain yang ada pada GeneBank. Dr. Jumsu Trisno; Jur. HPT Faperta Unand

AYLCV-To PYLCVI-To PYLCVI-Ca

Java Begomoviruses

PYLCVI-Ag TYLCV-Lbg PBST2-3(07) SO2-1(07) SO3-2(07) AG2-4(07) AG2-1(07)

West Sumatra, Isolates 2007

AG1-4(07) TD1-3(07) PYK1(07) PSS1-1(07) TD1-2(08) AG1-3(08)

West Sumatra, Isolates 2008

SO1-3(08) TD2-1(07) PSS2-3(07) PSS1-8(08)

West Sumatra, Isolates 2007 West Sumatra, Isolates 2008

Figure 1. Phylogeny of Begomovirus isolates from West Sumatera compare to Begomovirus isolates from Java (from GeneBank data). Number at cladogram branch showed bootstrap value in 100 Dr. Jumsu Trisno; Jur. HPT Faperta replication. Unand

PSS2-3(07) TD2-1(07) PYK1(07) AG2-1(07) AG1-4(07) SO3-5(07) TD1-3(07) TD1-2(08) AG1-3(08) SO1-3(08) PSS1-1(07) AG2-4(07) SO2-1(07) PBST2-3(07) AYLCV-To PYLCVI-To1 PYLCVI-To2 PYLCVI-Co TLCPaksV TYLCVetA TYLCVVit AYLTaiV AYLCVIsh AYVV TLCVJava TLCVMal AYVChiV PLCYuV TYLCVThaiA TYLCVThai TLCPhiV PYLCMaliV TYLCV TYLCV TYLCMaliV PYLCV-Bgr PYLCVI-Ag PYLCV-Co TYLCV-Lbg TYLCV-LbgA

PSS1-8(08)

West Sumatra, Indonesia Begomoviruses

Java, Indonesia Begomoviruses

Asian Begomoviruses

Java, Indonesia Begomoviruses

Painan-West Sumatra, Indonesia Begomoviruses

Figure 2. Phylogeny of Begomovirus isolates from West Sumatera compare to Begomovirus isolates from Indonesia and Asia (from GeneBank data). Number at cladogram branch showed bootstrap value Dr. Jumsu Trisno; Jur. HPT Faperta in 100 replication. Unand


Karakterisasi Gen AV1 (Coat Protein): ASAM AMINO .....+.+.+++++*+++++++.++.+++++.+*.++++++++++*+.++++*++.+++. GRRTSDVPRGCEGPCKVQSFEQRHDVTHTGKVLCVSDVTRGNGITHRVGKRFCVKSVYII GRRTSDVPRGCEGPCKVQSFEQRHDVTHTGKVLCVSDVTRGNGITHRVGKRFCVKSVYII GRRSSDVPRGCEGPCKVQSFEQRHDITHTGKALCVSDVTRGSGITHRVGKRFCVKSVYII GRRTSDVPRGCEGPCKVQSFEQRHDITHTGKALCVSDVTRGNGITHRVGKRFCVKSVYII GRRTSDVPRGCEGPCKVQSFEQRHDVTHTGKVLCVSDVTRGNGITHRVGKRFCVKSVYII WRRSSDVPRGCEGPCKVQSFEQRHDITHTGKVLCVSDVTRGNGITHRIGKRFCVKSVYVM WRRSSDVPRGCEGPCKVQSFEQRHDITHTGKVLCVSDVTRGNGITHRIGKRFCVKSVYVM WRRSSDVPRGCEGPCEVQSFEQRHDITHTGKVLCVSDVTRGNGITHRIGKRFCVKSVYVM MYRSPDVPYGCEGPCKVQSFEKKHDVSHTGTLLCVSDVTRGNGITHRVGKRFCIKSIYIL --------AGCEGPCKVQSFEQRHDITHTGKALCVSDVTRGNGITHRVGKRFCVKSVYII AKFGWTKTSSRRTTLTMSCSGWFVTGDLLLRRMASESCSTCMIMNPVQQLSRTIFVIVCR LDGRKHQVEEPHQCHVLVGSPATCYYAVWLRRVVQHVTQYSNYQERSSSCAGVTPFFSYS -------PRGCEGPCKVQSFEQRHDITHTGKALCVSDVTRGNGITHRVGKRFCVKSVYII LDGRKHQVEEPHQCHVLAGSPATCYYAVWLRRVVQHVTQYSNYQERSSSCAGVTPFFSYS AKFGWTKTSSRRTTLTMSCSGWFVTGDLLLRRMASESCSTCMIMNPVQQLSRTIFVIVCR AKFGWTKTSSRRTTLTMSCSGWCVTGDLLLRRMASESCSTCMIMNPVQQLSRTIFVIVCR +++*++++.+.++*++..++*++**++++**+++*++++++++*+++*+++++++.++++ PYLCIV 120) GKVWMDENIKSKNHTNNVMFWLVRDRRPVTTPYGFGELFNMYDNEPSTATIKNDLRDRVQ PYLVIV-2 120) GKVWMDENIKSKNHTNNVMFWLVRDRRPVTTPYGFGELFNMYDNEPSTATIKNDLRDRVQ PYLCIV-3 120) GKVWMDENIKSKNHTNNVMFWLVRDRRPVTTPFGFGELFNMYDNEPSTATIKNDLRDRVQ PYLCIV-to 120) GKVWMDENIKSKNHTNNVMFWLVRDRRPVTTPYCFGELFNMYDNEPSTATIKNDLRDRVQ PYLCIV-4 120) GKVWMDENIKSKNHTNNVMFWLVRDRRPVTTPYGFGELFNMYDNEPSTATIKNDLRDRVQ TYLCKAnV 120) GKIWMDENIKLKNHTNTVMFWLVRDRRPVTTPYGFGELFNMYDNEPSTATIKNDLRDRVQ TYLCKANV1 120) GKIWMDENIKLKNHTNTVMFWLVRDRRPVTTPYGFGELFNMYDNEPSTATVKNDLRDRVQ TYLCVTai 120) GKIWMDENIKLKNHTNTVMFWLVRDRRPVTTPYGFGELFNMYDNEPSTATIKNDLRDRVQ AlYLCV 118) GKIWMDENIKSKNHTNTVMFWLVRDRRPVTTPYGFGEAFNMYDNEPSTATIKNDLRDRLQ PepSO1-3(08) 62) GKVWMDENIKSKNHTNNVMFWLVRDRRPVTTPYGFGELFNMYDNEPSTATIKNDLRDRVQ PepAg1-3(08) 120) CYTVFQLQSLVVSTQARNK--QSRDFLELTTML-F-IIIRKQQNMKITLKMHYCC-----PepPYK1-9(08) 120) HWWSVRKQGTSNREEIFSQLCCLSSGSSKIKSHKCIIVVYGMYSSSQTQNSALQIFSFFL PepPDG-III(08) 64) GKVWMDENIKSKNHTNNVMFWLVRDRRPVTTPYGFGELFNMYDNEPSTATIKNDLRDRVQ PepTD1-2(08) 119) HWWSVRKQGTSNREEIFSQLCCLSSGSSKIKSHKCIIVVYGMYSCLPTPTTIRRSPLFSF PepPDG-I(08) 120) CYTVFQLQSLVVSTQARNK--QSRDFLELTTML-F-IIIRKQQNMKITLKMHYCCIWHVL PepPDG-II(08) 120) CYIVFQLQSLVVSTQARNK--QSRDFLELTTML-F-IIIRKQQNMKITLKMHYCCIWHVH PYLCIV PYLVIV-2 PYLCIV-3 PYLCIV-to PYLCIV-4 TYLCKAnV TYLCKANV1 TYLCVTai AlYLCV PepSO1-3(08) PepAg1-3(08) PepPYK1-9(08) PepPDG-III(08) PepTD1-2(08) PepPDG-I(08) PepPDG-II(08)

60) 60) 60) 60) 60) 60) 60) 60) 58) 10) 60) 60) 11) 59) 60) 60)


Tabel 4.3. Persentase kesamaan runutan nukleotida (NT) dan Asam Amino (AA), serta distance matrices dari gene Coat Protein (CP) isolate Padang (PYLCIV-Padang) dan tujuh isolat Begomovirus dari database GeneBank. Pepper yellow leaf curl Indonesia virus –asal cabai (PYLCIV-Ca: BAF02735.1 ), PYLCIV-asal Ageratum conyzoides (BAF02749.1 ), PYLCIV-asal Tomat (BAF02742.1), Tomato yellow leaf cur virus-Kanchanaburi Thailan isolate 1 (TYLCV-Kan1: NP_995303.1 ), TYLCV-Kan2(AAO15928.1), Alternanthera yellow veinal virus (AlYVV: ACH88349.1), Tomato yellow leaf curl Indonesia Virus-Lembang (TYLCIV-Lbg: AF189018.3) PYLCIV-Padang Begomovirus database GeneBank NT(%)

AA(%)

Distance Matrices (%)

PYLCIV-Ca

95

93

6,78

PYLCIV-Age

94

93

7,10

PYLCIV-To

95

94

6,67

TYLCV-Kan1

74

88

10,68

TYLCV-Kan2

73

87

10,26

AlYVV

77

83

18,10

TYLCIV-Lbg

75

74

24,12


Phylogeny Analysis of Begomovirus : “Gen AV1 (CP)” TYLCIV-Lbg PYLCVI-Ag PYLCVI PepSo1-3 PepPDG-III PYLCIV-2 PYLCIV-3 PYLCIV-To PYLCIV-4 TYLCKanV TYLCKanV-1 TLCVTai

AlYLCV TYLCIV-Lbg PepAg1-3 PepPDG-I PepPDG-II PepPYK1-9 PepTD1-2


Identifikasi & Deteksi Dini Patogen (Bakteri)

Dr. Jumsu Trisno, SP., M.Si Virologis and Bioteknologis Jurusan HPT Faperta Unand E-mail [email protected] HP. 085274050113 Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND

Identifikasi & Karakterisasi Bakteri 

Berdasarkan Gejala dan Tanamannya Morfologi dan Histopatologi Tanaman



Berdasarkan organisme penyebab Morfologi dan Fisiologis Serologi ( ELISA: Antigen-Antibodi) Molekuler (Karakter DNA) Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND

ISOLASI DAN PURIFIKASI DNA

Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND

PENDAHULUAN 

DNA: polimer untai ganda yg tersusun dari dioksiribonukleotida (dari basa purin atau pirimidin, gula pentosa,dan fosfat).



Basa purin: A,G Basa pirimidin: C,T





DNA merupakan komponen penyusun kromosom ( materi penyimpan informasi genetik) Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND

Komponen DNA Pasangan A-T

G-C


DNA berada dalam sel sehingga untuk mendapatkanya harus merusak dinding dan membran sel


TAHAPAN ISOLASI DAN PURIFIKASI DNA 1. Perusakan dinding dan membran sel 2. Inactivasi Enzim DNA-se 3. Purifikasi DNA dari komponen lain • Ekstraksi/presipitasi • Kromatografi Adsorpsi


Perusakan dinding dan membran sel Tahap 1: Merusak dinding sel: -mekanik (digerus) atau mesin micro smash -enzimatik (bakteri: lisozim), (kapang:kitinase & selulase)

mesin micro smash


Tahap 2: Ekstraksi dengan buffer ekstraksi/lisis Buffer ekstraksi/lisis berfungsi: 1. Merusak membran sel 2. Menginaktivasi enzim DNA-se 3. Menghilangkan kontaminan lain Contoh Buffer ekstraksi/lisis: -Buffer TES ( Tris-HCl pH 8, EDTA 10 mM, NaCl 0,5M , SDS 1%) Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND

Tahap 3: Purifikasi dg Ekstraksi/Presipitasi Tahap 1: Ekstraksi dg pelarut organik Campur sama banyak dg pel. organik

Aqueous

sentrifugasi

e.g. phenol, chloroform, or phenol:chloroform

Fasa air dipisah Interphase Organic

Hasil sentrifugasi dari ekstrak buffer lisis supernatan :mengandung DNA dan kontaminan

Fasa air mengandung DNA, fasa pel. Organik mengandung protein dan lemak, debris sel mengendap


Larutan DNA

Tahap 3: Purifikasi dg Ekstraksi/Presipitasi Tahap 2: Pengendapan DNA After Supernatant

Sentrigugasi

70% EtOH

Wash

Centrifuge

Pellet

+ alkohol dan garam (NaOAc &EDTA) untuk mengendapkan DNA

• Pellet DNA • Cuci dg etanol 70% untuk menghilangkan garam dan kontaminan lain • Keringkan


Larut pelet (H2O, Buffer TE

Tahap 3: Purifikasi dg Kromatografi adsorpsi


Tahapan kromatografi adsorpsi DNA dan kontaminan akan berikatan dengan silika

Silika dicuci untuk menghilangkan kontaminan

Silika dielusi untuk mendapatkan DNA


Penentuan kualitas dan kuantitas DNA


Nucleic Acid Analysis via UV Spectrophotometry DNA Absorption Spectra

DNA mempunyai puncak absorpsi pada panjang gelombang 260nm. Absorban 1,0 pada 260 nm sebanding dg 50 µg DNA/ml Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND

Kemurnian DNA Perbandingan A260/A280 ratio is ~1.8 DNA murni Kurang dari1,8 terkontaminasi


Elektroforesis Untuk Visualisasi DNA Elektroforesis: Perpindahan DNA bermuatan negatif terhadap medium agarosa atau polakrilamid sebagai aksi dari arus listrik Komponen:  Gel agarosa 0.8-1% untuk mencek genom, 1,5-2% untuk fragmen DNA berukuran 200bp, poliakrilamid 40% untuk 1-300 pb  buffer (TAE= Tris-Borat-EDTA;TBE=Tris-AcetatEDTA; TPE=Tris-Fosfat-EDTA)  Loading dye (sukrosa/gliserol dan bromofenol biru)  dan sampel DNA Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND

Elektroforesis Untuk Visualisasi DNA • Aliran listrik untuk elektroforesis 50-100 V dg arah dari – ke + selama sekitar 30 menit.

• DNA akan bermigrasi berdasarkan ukuran, yg paling kecil akan lebih cepat bermigrasi. • Ukuran fragmen DNA ditentukan dg standar yg sudah diketahui ukurannya.


Visualisasi DNA dg etidium bromida yg akan berpendar di bawah sinar UV. EtBr




Isolasi DNA Total (Contoh: Metode Lazo dan Gabriel 1987) 1.

2. 3.

Isolat Bakteri (koloni tunggal) ditumbuhkan dalam medium LB/NB, diinkubasi suhu ruang sambil dishaker 80 rpm selama 24 jam Dipanen, pindahkan ke mikrotupe 2 ml dan disentrifus 10.000 rpm selama 3 menit Pellet diresuspensi dengan 1 ml buffer TE (1M Tris HCl, 0,5 M EDTA pH 8), disentrifus 12.000 rpm, 5 menit Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND

4.

5. 6.

7.

8.

9.

10.

Supernatan dibuang, pellet di resuspensi dg 200 l TE, tambahkan 40 l SDS 10%, dibolak-balik dan inkubasi 65 0C selama 30 Menit dan tambah 20 l Proteinase K (2 mg/ml) Campuran diinkubasi suhu 37 oC selama 3-4 jam Tambahkan 200 l Fenol:klorofor (3:5), dibolak-balik 5 menit, disentrifus 12.000 rpm selama 5 menit Supernatan dipindah ke mikrotupe baru, tambahkan kloroform 200 l, disentrifus 12.000 rpm selama 5 menit Supernatan dipindah ke tupe baru ditambah 1 ml etanol absolut dingin dan 50 l NaOAc 3 M, dibolak-balik,

diinkubasi suhu -20 oC Supernatan dibuang ambil pellet, dan diresuspensi aquades steril DNA disimpan suhu -20 oC sampai digunakan Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND







Amplifikasi gen 16Sr-RNA dengan PCR 16Sr-RNA, urutan DNA yang digunakan untuk identifikasi Bakteri Komposisi reaksi PCR (reaksi total 25 l) 1. DNA template (hasil Isolasi) 1 l (± 200 ng) 2. dNTPs (masing-masing 200 mM) 3. Enzim Taq polimerase 1,5 unit 4. Primer (masing-masing 10 pMol) 5. Ditambahkan aquabides steril sampai vol 25 l Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND

Amplifikasi gen 16Sr-RNA dengan PCR 16Sr-RNA, urutan DNA yang digunakan untuk identifikasi Bakteri Komposisi reaksi PCR (reaksi total 25 l) Dapat menggunakan kit spt Ready -To-Go PCR bead, hanya menambahakn 1. DNA template (hasil Isolasi) 1 l (± 200 ng) 2. Primer (masing-masing 10 pMol) 3. Ditambahkan aquabides steril sampai vol 25 l Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND

Amplifikasi gen 16Sr-RNA dengan PCR Protokol PCR yg digunakan:  Predenaturasi 94 oC, 2 menit  Denaturasi 94 oC, 30 detik  Annealing 55 oC, 30 detik  Elongation 72 oC, 1 menit  Post PCR 72 oC, 5 menit Dengan jumlah siklus 30 – 35 kali Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND

1.500 bp


Bioteknologi Untuk Perlindungan Tanaman

Sekuensing Teknik identifikasi urutan nukleotida-nukleotida dari susunan DNA

Diperkenalkan pada tahun 70-an oleh Maxam dan Gilbert, kemudian disusul oleh Sanger et al (Nobel, 80-an)


Sekuensing 5‘ TGCATTGAATATGACGTTGACTAGCTAACGTTTAACTA 3‘ 3‘ ACGTAACTTATACTGCAACTGATCGATTGCAAATTGAT 5‘ +

TGCATTG

5‘ TGCATTGAATATGACGTTGACTAGCTAACGTTTAACTA 3‘ 3‘ ACGTAACTTATACTGCAACTGATCGATTGCAAATTGAT 5‘ TGCATTG + Polymerase; dA, dC, dG, dT, ddT 3‘ ACGTAACTTATACTGCAACTGATCGATTGCAAATTGAT 5‘ TGCATTGAAT 3‘ ACGTAACTTATACTGCAACTGATCGATTGCAAATTGAT 5‘ TGCATTGAATAT 3‘ ACGTAACTTATACTGCAACTGATCGATTGCAAATTGAT 5‘ TGCATTGAATAAGACGT … dst …

3‘ ACGTAACTTATACTGCAACTGATCGATTGCAAATTGAT 5‘ TGCATTGAATATGACGTTGACTAGCTAACGTTTAACT


Bioteknologi Tanaman

Sekuensing Elektrophoregram hasil pembacaan Megabace yang diolah dengan software DNAstar. DNA template berasal beet gula

Sumber: Jamsari


Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA



Sequensing: di kirim kelembaga-lembaga lain : PT. Charoon Pohpan, Egkman RSCM






Hasil perunutan DNA dianalisis menggunakan program NCBI BLAS (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) untuk melihat kesamaan genetiknya dibandingkan dengan runutan asam nukleat (DNA) yang ada di GeneBank Analisis keragaman berdasarkan runutan DNA daerah 16Sr-RNA menggunakan program ClustalW program versi 1.83 European Bioinformatics Institute (EMBLEBI: www.ebi.ac.uk/serve/clustalW). Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND

Deteksi Cepat Penyakit Bakteri dg PCR menggunakan Primer Spesifik 1.

2. 3. 4.

Rancang primer dari sequen spesifik (spt gen patogenesitas), ini dapat juga dari informasi jurnal Pesan primer spesifik Optimasi kondisi PCR ( kondisi optimum suhu annealing) Setelah dapat kondisi optimal PCR, dpt digunakan untuk deteksi penyakit bakteri Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND

Deteksi dari kultur murni bakteri/DNA Komposisi reaksi PCR (reaksi total 25 l) Dapat menggunakan kit spt Ready -To-Go PCR bead, hanya menambahakn  DNA template (hasil Isolasi) 1 l (± 200 ng)  Primer (masing-masing 10 pMol)  Ditambahkan aquabides steril sampai vol 25 l


Protokol PCR yg digunakan:  Predenaturasi 94 oC, 2 menit  Denaturasi 94 oC, 30 detik  Annealing 55 oC, 30 detik  Elongation 72 oC, 1 menit  Post PCR 72 oC, 5 menit Dengan jumlah siklus 30 – 35 kali



Deteksi in situ (Xag pd Kedelai) Metode Zhao et al (2002)  

  

  

0,5 gram daun kedelai yg bergejala disterilkan dg 0,25% sodium hiperklorit 30 detik Digunting kecil dan dimasukkan ke dlm erlenmeyer 100 ml yg berisi 10 ml Phosfat Buffer Saline (PBS) Sampel digoyang dlm waterbath suhu 30 0C selama 6 jam Supernatan disaring disentrifus selama 10 menit 10.000 rpm Pellert diresuspensi dalam 500 l 0,5 M NaCl disentrifus 10.000 rpm, 5 menit Peller ditambahkan 20 l aquades dipanaskan pada air mendidih 5 menit Ambil 2 l untuk dijadikan DNA template Reaksi PCR dan komposisi sama yang sudah dijelaskan Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND











STRUKTUR GEN DAN FUNGSINYA. Dr. Jumsu Trisno; Jur. HPT Faperta Unand

Recommend Documents