STŘEDOŠKOLSKÁ ODBORNÁ ČINNOST

STŘEDOŠKOLSKÁ ODBORNÁ ČINNOST Obor SOČ: 4. Biologie

Vliv oxidativního stresu na telomerickou aktivitu u Drosophila melanogaster

Tereza Cettlová

Kraj: Jihočeský kraj

České Budějovice 2016

Věda pro veřejnost / cesta k udržitelnému rozvoji

STŘEDOŠKOLSKÁ ODBORNÁ ČINNOST Obor SOČ: 4. Biologie

Vliv oxidativního stresu na telomerickou aktivitu u Drosophila melanogaster

Effect of oxidative stress on the telomeric activity by Drosophila melanogaster

Autor: Tereza Cettlová Škola: Česko-anglické gymnázium, s.r.o. v Českých Budějovicích Kraj: Jihočeský kraj Konzultant: RNDr. Radmila Čapková Frydrychová,Ph.D.,

České Budějovice 2015


Prohlášení Prohlašuji, že jsem svou práci SOČ vypracovala samostatně a použila jsem pouze podklady (literaturu, projekty, SW atd.) uvedené v seznamu vloženém v práci SOČ. Prohlašuji, že tištěná verze a elektronická verze soutěžní práce SOČ jsou shodné. Nemám závažný důvod proti zpřístupňování této práce v souladu se zákonem č. 121/2000 Sb., o právu autorském, o právech souvisejících s právem autorským a o změně některých zákonů (autorský zákon) v platném znění.

V Českých Budějovicích dne

2016

…………………………… Tereza Cettlová

Poděkování Velice ráda bych zde poděkovala své konzultantce Radmile Čapkové Frydrychové, za přijetí do laboratoře, za všechen čas, který strávila prací se mnou, za ochotu a trpělivost. Dále bych ráda poděkovala Tomáši Krůčkovi, za pomoc při mých prvních krocích v laboratoři, za vysvětlení fungování laboratorních přístrojů a příjemnou spolupráci. Moje poděkování patří také Michale Korandové, za všechnu pomoc, čas a rady, které mi věnovala, i když jsem nepracovala pod jejím vedením. Bez Vás všech bych nic z toho nedokázala a neměla bych žádnou zkušenost s prací v laboratoři, děkuji.


Anotace Tato práce se zabývá vlivem oxidativního stresu na délku telomer. Oxidativní stres je způsoben nerovnováhou mezi

antioxidanty a volnými

radikály.

Předpokládáme, že nízké dávky oxidativního stresu mohou aktivovat ochranné mechanizmy a mít tak pozitivní vliv na délku telomer a tím vylepšit odolnost organismu proti stresovým podmínkám. Pro indukci oxidativního stresu byly využity látky kofein a taurin v návaznosti na výzkum vlivu kofeinu a taurinu na pohybovou a denní aktivitu (Fang Ju lin, 2010).

Klíčová slova: Drosophila melanogaster; telomery; oxidativní stres; kofein; taurin

Annotation This study deals with the influence of oxidative stress on the length of telomer. Oxidative stress is caused by the imbalance between antioxidants and free radicals. We assume that the low-doses of oxidative stress may activate defense mechanism and so have a positive effect on the length of telomeres and thus improve the resistance of the organism against stress conditions. For the induction oxidative stress have been used substances caffeine and taurine in relation on the research of effect of caffeine and taurine on the locomtor activity and durinal activity (Fang Ju lin, 2010).

Key words: Drosophila melanogaster; telomers; oxidative stress; caffeine; taurin

Obsah 1.

Úvod ..................................................................................................................... 1 1.1.

Oxidativní stres.............................................................................................. 1

1.1.2. Volné radikály ............................................................................................ 1 1.1.3. ..................................................................................................................... 4 1.2.

Telomery ....................................................................................................... 5

1.2.1 1.3.

Vliv oxidativního stresu na délku telomer .................................................... 7

1.3.1. 1.4.

. Telomery u Drosophila melanogaster ................................................. 5

Antioxidativní obrana............................................................................. 7

Hormeze ........................................................................................................ 9

2.

Cíle ..................................................................................................................... 10

3.

Materiál a metody .............................................................................................. 11 3.1.

4.

Výsledky ............................................................................................................ 14 4.1.

5.

Modelový organismus D. melanogaster...................................................... 11

Transkripční aktivita.................................................................................... 14

Diskuse ............................................................................................................... 19 5.1.

Transkripční aktivita .................................................................................... 19

6.

Závěr .................................................................................................................. 21

7.

Použitá literatura ................................................................................................ 22 7.1.

Internetové zdroje ........................................................................................ 25

1. Úvod 1.1.

Oxidativní stres

Oxidativní stres je způsoben nerovnováhou mezi reaktivní formou kyslíku (ROS) nebo dusíku (RNS) a schopností biologického systému snadno detoxikovat reaktivní produkty (https://en.wikipedia.org/wiki/Oxidative_stress). Oxidativní stres se projeví, když se zvýší hladina ROS a sníží hladina antioxidantů, které zachycují volné kyslíkové radikály a tím snižují riziko oxidativního stresu (Turrens, 2003; https://cs.wikipedia.org/wiki/Oxidační_stres). Za normálních podmínek je rovnováha mezi tvorbou ROS a antioxidačních mechanismů. Při nerovnováze dochází vyšší produkcí volných radikálů k toxickým účinkům, ty způsobují poškození buňky včetně proteinů i DNA, a k fyziologickým změnám mechanismu.

1.1.2. Volné radikály Volný radikál je jakákoli částice schopná samostatné existence, která má jeden

nebo

více

nepárovaných

elektronů

(https://mefanetmotol.cuni.cz/download.php?fid=2139). Při látkové výměně v buňkách, vznikají jako vedlejší produkty reaktivní formy kyslíku a reaktivní formy dusíku (Obr. 1) tzv. volné radikály, které obsahují volný nepárový elektron. Reaktivní kyslíkové radikály vznikají hlavně jako meziprodukty při respiraci, při

oxidaci

vodíku

kyslíkem

na

vodu

za

účasti

cytochromoxidázy

(http://www.wikiskripta.eu/index.php/Antioxida%C4%8Dn%C3%AD_ochrana_lids k%C3%A9ho_t%C4%9Bla). Mezi ROS patří superoxid (O2•), peroxyl (ROO•), hydroxylový radikál (OH•), ale i peroxid vodíku (H2O2) a ozón (O3), které nepatří mezi volné radikály (Berlett & Stadtman, 1997). Kyslíkové radikály můžeme rozdělit na exogenní a endogenní. Exogenní faktory vyvolávající ROS jsou toxické a chemické látky, UV záření, herbicidy, pesticidy, těžké kovy. K endogenním faktorům řadíme řetězec mitochondrii při neúplné redukci kyslíku.

1

Superoxid (O2•) Superoxidy vznikají jako důležitý produkt redoxních reakcí kyslíku, také jako vedlejší produkt při buněčném dýchaní v mitochondriích, při práci enzymů a i ve fagocytujících buňkách jako jsou lymfocyty a v endoplasmatickém retikulu (https://cs.wikipedia.org/wiki/Superoxidy, Johnston & kol., 1975) Superoxidy vznikají reakcí kyslíku s elektronem (O2 + e- O2•). Tyto sloučeniny jsou velice toxické a imunitní systém je využívá k zabití mikroorganismů. Také přispívají k patogenezi

mnoha

chorob,

důkazem

jsou

nemoci

z ozáření

(https://en.wikipedia.org/wiki/Superoxide, http://che1.lf1.cuni.cz/html/ROS_CZE_081209b.pdf ).

Peroxyl (ROO•) Peroxyl je slabší oxidant, který napadá řetězce nenasycených mastných kyselin. Tomuto ději se říká lipoperoxidace. Sám o sobě peroxyl vzniká za přítomnosti kyslíku, kdy se naváže na nepárový elektron. Peroxyl se poté snaží získat chybějící elektron z jiné sloučeniny, tím se vytváří nový volný radikál. (http://www.celostnimedicina.cz/volne-radikaly-aantioxidanty-mudr-vaclav-holecek-csc.htm)

Peroxid vodíku (H2O2) Peroxid vodíku je stabilní, ale sám o sobě málo reaktivní, volně prochází skrz biologické membrány. Nepatří přímo mezi radikály, ale účastní se jejich vzniku. Peroxid vodíku vzniká dismutací superoxidu nebo činností enzymů xynthinoxidázy a monoaminooxidázy. Dále napomáhá vzniku hydroxylového radikálu, který vzniká rozpadem peroxidu vodíku za přítomnosti přechodových kovů Fe2+ nebo Cu+ ve Fentonově reakci (http://che1.lf1.cuni.cz/html/ROS_CZE_081209b.pdf , Fenton, 1894). Fentonova reakce 2Cu+ + 2H2O2 → 2Cu2+ + 2OH˙ + 2OHFe2+ + 2H2O2 → Fe3+ + OH˙ + OH-

2

Hydroxylový radikál (OH•) Hydroxyl je silný a velmi reaktivní. Reaguje se všemi molekulami ve své blízkosti (Kodíček, 2004- online). Hydroxyl vzniká především jednoelektronovou redukcí peroxidu vodíku : H2O2 + e- + H+ → OH• + H2O, ale také ionizačním zářením nebo Fentonovou reakcí peroxidu vodíku (http://www.wikiskripta.eu/index.php/Antioxida%C4%8Dn%C3%AD_ochrana_lids k%C3%A9ho_t%C4%9Bla, Lloyd, 1997).

Ozon (O3) Ozon je nestabilní molekula tvořená ze 3 atomů kyslíku, proto snadno reaguje s jiným prvky (dusík, chlor, brom nebo vodík). Ozon může být odbouráván z atmosféry katalýzou. Radikály mohou reagovat s molekulou ozonu a odštěpit z ní atom kyslíku, dále mohou reagovat s dalším volným atomem kyslíku, přičemž vzniká molekula kyslíku a opět volný radikál, který může v novém cyklu odbourávat další molekuly ozonu (http://www.sci.muni.cz/~dobro/ozon_1.htm). Reaktivní dusíkaté radikály (RNS) tvoří radikály oxid dusnatý (NO•), oxid dusičitý (NO2•), ale také ne-radikály nitrosonium (NO+), nitrixyl (NO-), peroxynitrit (ONOO-), alkylperoxynitrit (ROONO). Oxid dusnatý (NO•) Oxid dusnatý je plynný radikál, který vzniká syntházovou reakcí. NO• reaguje se superoxidem a vytvoří toxický peroxynitrit, který dále reaguje s vodíkem, a konečným

produktem

je

(http://che1.lf1.cuni.cz/html/ROS_CZE_081209b.pdf ). NO· + O2 ·– → OONO– peroxynitrit OONO– + H+ → HOONO → OH· + NO2 ·

3

hydroxylový

radikál

Obr.1: Reakce ROS a RNS (http://www.nature.com/nrmicro/journal/v2/n10/fig_tab/nrmicro1004_F2.html)

1.1.3. Vliv oxidativního stresu na organismus Oxidativní stres postihuje každého z nás. Má vliv na stárnutí organismu a na mnoho vážných nemocí, např. cukrovka, kardiovaskulární onemocnění, atd. (https://en.wikipedia.org/wiki/Oxidative_stress; http://www.stefajir.cz/?q=oxidacnistres) Dále ovlivňuje na vznik neurodegenerativní onemocnění jako Parkinsonova choroba, Alzheimerova choroba, atd. ( Uttara & kol., 2009). Tato onemocnění zapříčiňuje zvýšená hladina ROS, které se navzájem ovlivňují s buněčnými molekulami v organismech. Poškozené molekuly se postupně akumulují a zapříčiňují stárnutí a nakonec i buněčnou smrt (Bandypadhyary & kol., 1994; Tower, 996).

4

1.2.

Telomery

Telomery jsou specifické nukleoproteinové struktury na koncích lineárních chromozómů. Telomery mají zajišťovat stabilitu a celistvost chromozómů, odlišovat přirozené konce od konců vzniklých dvouřetězcovitými zlomy, tím zabraňovat chromozomálním fúzím (Chan & Blackburn, 2002; Denchi, 2009). Telomery mají také kompenzovat ztráty koncové DNA, ke kterým dochází z důvodů neschopnosti enzymu DNA polymerázy dokončit replikaci (Watson, 1972). Každým dělením dochází ke zkracování koncových repetic na 5’konci dceřiného řetězce, a tím i ke zkracování telomer. Pokud je telomera zkrácena na minimální délku, ztrácí buňka schopnost dělení (Hayflick & Moorhead, 1961). Kompenzování ztráty telomer je zajištěno telomerázou, enzymem, který se váže k chromozómovým koncům a přidává krátké sekvence DNA (Blackburn, 1991). Nefungující telomeráza je příčinou procesů stárnutí a rakoviny (Zhu & kol., 2011).

1.2.1. Telomery u Drosophila melanogaster Telomery u většiny organismů jsou tvořeny sérií krátkých opakujících se sekvencí jako je například (TTAGGG)n u člověka nebo u rostlin (TTTAGGG)n a většina hmyzu má (TTAGG)n (Mcknight, 2004; Maeshima & kol., 2001). Výjimku tvoří například zástupci z rodu Drosophila, jejichž telomery jsou tvořeny kopiemi třech non LTR (nonlong- terminal- repeat- retrotransposable elements) retroelementů HeT-A, TAHRE a TART, které prodlužují telomery namísto telomerázy. Tyto elementy jsou v telomeře zastoupeny v různém počtu a sledu. Tato oblast je souhrnně označována HTT. K této oblasti přiléhá speciální proteinový komplex nazývaný telomerická čepička (Mason & kol., 2008). Telomerická čepička je multiproteinová struktura, která zajišťuje stabilitu a celistvost chromozómu. Mimo jiné slouží pro rozpoznání přirozených chromozomálních konců od chromozomálních zlomů. Jestliže, se formace telomerické čepičky poruší, dojde k chromozomálním fúzím následovaným chromozomálními zlomy, ztrátou genetického materiálu, které můžou vést až k apoptóze (Linger & Price 2010). Telomerická čepička drozofily je tvořena proteinovým komplexem terminu, který se liší komponenty od telomirecké čepičky u 5

člověka, ta je tvořena komplexem shelterinu a dalšími proteiny (Capkova Frydrychova & Mason, 2013). Avšak telomerická čepička je také tvořena dalšími proteiny, z nichž některé mají drozofily a lidé společné. Například se jedná o DDR proteiny, které opravují dvouřetězcové zlomy. Dále jsou to proteiny ATM a ART (Cenci & kol., 2005).

6

1.3.

Vliv oxidativního stresu na délku telomer

Délka telomer je považována za biomarker stárnutí a jako předpovídatel délky života; krátké telomery jsou spojeny s vývojem onemocnění (Slijepčević, 2007; Zhu & kol., 2011). Délka telomer je udržována koordinací mezi mechanismem údržby telomer a faktory, které telomery zkracují. Předpokládá se, že délka lidských telomer je ovlivněna různými endogenními a exogenními faktory, jako je emocionální nebo fyzický stres, strava, životní styl, zdravotní podmínky (Zhu & kol., 2011). (Obr2.) Hlavním faktorem zkracování telomer je oxidativní stres. Jeho vliv na délku telomer je dokonce větší než ztráta telomer při replikaci. Endogenní oxidativní stres souvisí s některými buněčnými procesy, jako je mitochondriální OXPHOS systém, nebo zánět, jehož úroveň je ovlivňována endogenními i exogenními faktory (Cui & kol., 2012).

In vitro

mitochondriální dysfunkce indukovaní reaktivního kyslíku (ROS) nebo hyperoxie vedou k urychlenému zkrácení telomer. Úroveň vlivu oxidativního stresu je ovlivněna antioxidativní obranou buněk (Missirlis, Phillips, Jäckle, 2001).

Obr.2:

Systém,

mezi

telomerama,

stárnutím,

oxidativním

stresem

a

mitochondriemi, regulovaný exogenními faktory (R. Čapková Frydrychová).

1.3.1.

Antioxidativní obrana

Antioxidanty by měly reagovat s biologicky odpovídajícími oxidanty a radikály, produkt odvozený z této reakce by měl být méně nebezpečný než odstraněný radikál. Aby antioxidanty mohly reagovat, musí být přítomny v dostatečné míře.

7

Antioxidativní obranné mechanismy jsou tři. Primární antioxidanty tvoři tzv. nonenzymatický obranný mechanismus. Primární antioxidanty inhibitují tvorbu ROS cheletací kovových iontů, redukcí hydroperoxidů a peroxidu vodíku a zhašením superoxidu a singletovaného kyslíku. Složky, které zabraňují tvorbě antioxidantů, jsou albumin, myoglobin, ferritin, transferrin, adt. Funkcí sekundárních antioxidantů je vychytávat již vytvořené ROS a tím potlačovat nebo přerušovat řetězové reakce iniciace a propagace. Tyto antioxidanty jsou součástí enzymatického obranného mechanismu, tvoří je přirozený antioxidant superoxid dismutáza (SOD), glutation peroxiáza, katalasa, meteloenzymy, glutathion, bilirubin. Superoxid dismutáza zháší superoxidový radikál a přeměňuje ho na peroxid vodíku. Terciární antioxidanty opravují, obnovují a odstraňují oxidačně poškozené lipidy, proteiny a DNA. Významnou úlohu zde sehrávají různé enzymy, jakými jsou lipázy, proteázy a opravné

enzymy

DNA

(www.nutriacademy.cz/lifestyle/doc/antioxidanty.docx,

http://is.muni.cz/el/1431/podzim2010/Bi9901/um/04_Antioxidanty.pdf).

8

1.4.

Hormeze

Termín hormeze říká, že nízké dávky chemických či biologických látek, které mají negativní vliv na zdraví, jsou prospěšné, (Calabrese, & kol., 1999). Benefiční účinky zvyšují plodnost a odolnost vůči stresu. Spouštějí tzv. obranné mechanismy a chrání proti dávkám stejného či jiného stresového faktoru. Princip hormeze může být viděn v mnoha kontextech. Klasický příklad, nízké dávky insekticidu mohou vyvolat chemickou odolnost zvýšením xenobiotik detoxikací (Calabrese, & kol., 1999). Z molekulárního hlediska (dávka- odezva) hormeze odpovídá indukci adaptivních a obranných reakčních stresorů, prostřednictvím změny genové exprese. Například teplotní stres (heat-shock) aktivuje expresi heat-shock proteinů (charaproteinů), které pomáhají odolávat stresu. To vede k ochraně proti teplem indukovanému molekulárního poškození, jako je částečná denaturace bílkovin (Keyon, 2005). Pod termínem hormeze se skrývá celá řada mechanismů, které jsou málo prozkoumány. Zmiňována je například adaptace, schopnost všech živých organismů reagovat na nepříznivé podmínky a bránit se jim. Při jakékoliv zátěži dochází k poškození, kterému se organismus snaží bránit tzv. odpovědí na stres. Při určité nízké míře zátěže je poškození minimální, a zároveň již dochází ke spuštění odpovědi na stres, která zvyšuje odolnost organismu a opravuje poškozené molekulární komponenty. Navíc indukce odpovědi na stres krátkou mírnou zátěží obvykle chrání organismus po delší dobu a i před mnoha dalšími druhy zátěže. Organismus procházející pravidelnou mírnou zátěží tak může být v lepším stavu než organismus izolovaný od jakékoliv zátěže (Mattson, 2008).

9

2. Cíle Tato seminární práce je součástí širšího výzkumu oxidativního stresu a jeho vlivu na telomerickou homeostázi u hmyzu. Hlavním cílem této práce bylo zjistit, jestli oxidativní stres vyvolaný kofeinem a taurinem má vliv na délku telomer a transkripční aktivitu u D. melanogaster. Předpokládali jsme, že nízké dávky kofeinu a taurinu budou mít positivní efekt na délku telomer, podle principu hormeze.

10

3. Materiál a metody 3.1. Modelový organismus D. melanogaster K pokusu jsem použila dospělců druhé generace divokého kmene D. melanogaster OregonR. Byli uchováváni při 25° C na kukuřičném šrotu a melasovém médiu (163 g kukuřičného šrotu, 16 g agaru, 33 g sušených kvasnic, 200 ml melasy, 2,6 l vody) a desinfekčním roztoku (12g kyseliny benzoové, 240 ml denaturovaného etylalkoholu, 2,5g kyseliny sorbové). Kmeny byly dodány z chovného centra v Bloomingtonu.

3.2. Stresory Pro indukci stresu, byl použit kofein a taurin o koncentracích 16x10-1mM16x10-10mM. Kofein a taurin byly rozmíchány s destilovanou vodou a podány octomilkám do instantního media (Carolina biologiacal supply company). Poté byly octomilky uloženy a nechány při pokojové teplotě do vylíhnutí nové generace.

3.3. Příprava vzorků Na přípravu jednotlivých vzorků bylo použito 10 jedinců (pět samců a pět samic), vždy připravovány v duplikátech. Vzorky byly poté zamraženy tekutým dusíkem a uchovány při -80°C.

3.4. Izolace nukleonových kyselin Izolace RNA byla prováděna pomocí kitu NukleoSpin RNA (MachereyNagel). Při izolaci jsem postupovala podle pokynů výrobce. Koncentrace nukleových kyselin byla stanovena spektrofotometricky pomocí nanodropu.

11

3.5. Syntéza cDNA Pro syntézu cDNA byla využita reverzní transkriptáza SMARTTM MMLV Reverse Transcriptase Protocol (Clontech), přičemž bylo použito 1 µg celkové RNA, 1 μl oligo(dT), 2 µl 100nM DTT, 4 µl 5 First-strand Buffer, 2,5 µl H2O a 0,5 µl reverzní transkriptázy SMART. Prvně se inkubuje voda s olifgo(dT) na 3 minuty při 72 °C. Poté byla provedena inkubace při 42 °C na 60 minut a ukončení reakce proběhlo při 70 °C na 15 minut.

3.6. Kvantifikace pomocí Real time PCR Polymerázová řetězová reakce zrychluje množení vybraného úseku DNA (Obr.3), který je ohraničen primery (oligonukleotidy). Byly využity primery k telomerickému elementu HeT-A a ke genu pro superoxid dismutázu (SOD) (Tab.1). Princip

PCR

je

podobný

jako

při

syntéze

DNA

v buňce

(http://labguide.cz/metody/pcr/).

Obr:3 Množení molekul DNA (http://labguide.cz/metody/pcr/ )

Reakce byly prováděny v 20μl objemu, a to vždy v duplikátech. Na vnitřní kontrolu byl využit gen RpL 32, což je ribozomální protein, u kterého se nemění transkripční aktivita a lze tedy použít jako interní kontrola koncentrace přepsané cDNA v reakci. Průběh reakcí proběhl 30x za sebou v opakovaném sledu. Nejdříve se denaturuje dvouřetězcová molekula DNA při teplotě 95°C po dobu 30 sekund. Vznikají, tak dvě jednořetězcová vlákna DNA, na která v dalším kroku nasedají primery. Při tomto kroku se teplota snížila na 58°C na dobu 30 sekund. Poslední krok je syntéza DNA, která probíhala při 72°C po dobu 20 sekund. 12

Tab.1: Sekvece použitých primerů Gen

HeT-A

SOD

Název Primeru

Sekvence Primerů

Velikost

Teplota

Produktu

Nasedání

(bp)

Primeru (°C)

HeT-A (forward)

150

58

5´– ATTGTCTTCTCCTCCGTCCACC – 3´

HeT-A (reverse)

150

58

5´– TTCTCTATGCTATTGTCGCTGTGC – 3´

SOD (forward)

175

58

5´–TCGAAATGGTGGTTAAAGCTG-3

SOD (reverse)

175

58

5´–AACTCGTGCACGTGGAATCC- 3´

13

4. Výsledky Pro tento výzkum jsem využívala chronické působení kofeinu a taurinu, podávané v nízkých koncentracích (16 × 10-1 - 16 × 10-10 mM) do instantního media pro D. melanogaster. Mouchy na tomto mediu prožily jeden vývojový cyklus, poté byla celá jedna generace testovaná na transkripční aktivitu.

4.1. Transkripční aktivita Používala jsem D. melanogaster kmene Oregon R., chované na instantním médiu, a jako kontrola byly použité mouchy D1 na kukuřično-melasovém médiu a D2 na instantním médiu. Transkripční aktivita elementu HeT-A a genu pro superoxid dismutáza (SOD) byla měřena pomocí kvantitativní Real-time PCR. Test byl prováděn u samců s primery k telomerickému elementu HeT-A a genu pro SOD.

Ze získaných výsledků (Obr.4) je patrné, že působením kofeinu o

koncentracích 16 × 10-2- 16 × 10-6 mM dochází ke snižování transkripční hladiny elementu HeT-A, až na koncentraci 16× 10-5 mM, u které je patrná zvýšená transkripční aktivita. Při vyhodnocení transkripční hladiny SOD (Obr.5) nebyly vzhledem

ke

kontrole

nalezeny

významné

rozdíly,

kromě

koncentrace

16 × 103mM, u níž byl pozorován téměř dvojnásobný nárůst.

Hladina transkriptů vzhledem k RpL 32

Hladina transkriptů elementu HeT-A 10-2 mM

0,003

10-3 mM

0,0025

10-4 mM

0,002

10-5 mM 0,0015 10-6 mM 0,001 0 mM D 1 0,0005 0 mM D 2 0

Obr.4: Vliv kofeinu na hladinu transkripční aktivity u elementu HeT-A

14


Hladina transkriptů SOD 10-2 mM

0,25

10-3 mM

0,2

10-4 mM 0,15

10-5 mM 10-6 mM

0,1

0 mM D 1

0,05

0 mM D 2 0

Obr.5: Vliv kofeinu na hladinu transkripční aktivity u SOD

Vzhledem k tomu, že se mi nepodařilo prokázat jednoznačný trend, co se týče vlivu použitých koncentrací kofeinu na sledované markery, rozhodla jsem se k otestování dalších koncentrací, a to 16 × 10-6- 16 × 10-10 mM (Obr.6). Ovšem použití ani těchto koncentrací neprokázalo jednoznačný vliv na transkripci.


Hladina transkriptů elementu HeT-A 0,003 0,0025

10-6 mM

0,002

10-7 mM

0,0015

10-8 mM 10-9 mM

0,001 10-10 mM 0,0005

0 mM D 1

0


15

Znovu testované nízké koncentrace 16 × 10-7 mM a 16 × 10-10 mM u kofeinu na elementu HeT-A (Obr.7). V předchozím pokusu se tyto koncentrace jevily nadějně, proto jsem je ještě jednou otestovala. Obě tyto koncentrace mají vliv na vyšší transkripční aktivitu elementu HeT-A než kontrolní dieta D1. Tyto koncentrace se zdají mít positivní vliv na organismu, na prodlužování telomer.


Hladina transkriptů elementu HeT-A 0,0014 0,0012 0,001 10-7 mM 0,0008

10-10 mM

0,0006

0 mM D 1

0,0004 0,0002 0


Stejné koncentrace použité u kofeinu, byly využity také při testování taurinu. Totožné koncentrace byly využity také při testování samců na vliv taurinu. Při porovnání s kontrolou došlo k významnému poklesu transkripční aktivity jak u HeTA (Obr.8) tak u SOD (Obr.9). při koncentraci 16 × 10-3 mM.

16


Hladina transkriptů elementu HeT-A 10-1 mM

0,003

10-2 mM

0,0025

10-3 mM 0,002 10-4 mM 0,0015

10-5 mM

0,001

10-6 mM

0,0005

0 mM D 1 0 mM D 2

0

Obr.8: Vliv taurinu na hladinu transkripční aktivity u elementu HeT- A


Hladina transkriptů SOD 0,18

10-1 mM

0,16

10-2 mM

0,14

10-3 mM

0,12 0,1

10-4 mM

0,08

10-5 mM

0,06

10-6 mM

0,04 0 mM D 1

0,02

0 mM D 2

0 Obr.9: Vliv taurinu na hladinu transkripční aktivity u elementu SOD

Jelikož se nepodařilo prokázat jednoznačný vliv taurinu na sledované markery, rozhodla jsem se otestovat další koncentrace, a to

16 × 10-6- 16 × 10-10 mM

(Obr.10). Bohužel ani použití těchto koncentrací neprokázalo jednoznačný vliv na transkripci.

17


Hladina transkriptů elementu HeT-A 0,003 0,0025

10-6 mM 10-7 mM

0,002

10-8 mM 0,0015

10-9 mM 10-10 mM

0,001

0 mM D 1 0,0005 0

Obr.10: Vliv taurinu na hladinu transkripční aktivity u elementu HeT-A Díky hodně variabilní kontrole nešlo jednoznačně určit, zda nějaká koncentrace taurinu má vliv na transkripční aktivitu Nízké koncentrace 16 × 10-7 mM a 16 × 10-8 mM taurinu mají vyšší hladinu transkripční aktivity elementu HeT-A než kontrolní dieta D1 (Obr.11).


Hladina transkriptů elementu HeT-A 0,0016 0,0014 0,0012 0,001

10-7 mM

0,0008

10-8 mM 0 mM D 1

0,0006 0,0004 0,0002 0

Obr.11:

Vliv

taurinu

na

hladinu

transkripční

18

aktivity

u

elementu

HeT-A

5. Diskuse Tato seminární práce se zabývá vlivem oxidativního stresu, vyvolaného kofeinem a taurinem, na délku telomer a transkripční aktivitu u D. melanogaster.

5.1. Transkripční aktivita Vycházela jsem z předpokladu, že pokud chemické, biologické či fyzikální látky ovlivňují organismus dlouhodobě, v nízkých dávkách, může to u daného jedince vyvolat stimulační, až benefiční účinky, označované jako efekt hormeze (Calabrese & Baldwin, 2002). V tomto výzkumu bylo studováno, jaký vliv budou mít nízké dávky kofeinu a taurinu na transkripční aktivitu telomerického elementu HeT-A u D. melanogaster. Dřívější pokusy byly prováděny s insekticidem parakvatem jako stresorem. Snažili jsme se zjistit, jestli kofein a taurin v nízkých koncentracích mají stejné účinky jako parakvat. V porovnání parakvatu s kofeinem a taurinem, měl tento

insekticid

v koncentracích

16

×

10-5

mM,

16

×

10-6

mM,

16 × 10-7 mM a 16 × 10-8 mM statisticky průkazný nárůst telomerické aktivity u D. melanogaster (Szakosova 2015). Pozitivní účinky začínaly u kofeinu s taurinem až u koncentrací 16 × 10-7 mM a 16 × 10-10 mM, ale nejsou to statisticky prokazatelné výsledky. Abychom mohli jednoznačně říci, že jsou výsledky statisticky průkazné, bude potřeba pokusy ještě zopakovat a případně koncentrace obou použitých stresorů ještě snížit. Navazovali jsme na výzkum, kde zkoumali vliv kofeinu a taurinu na spánek a fyzickou aktivitu u Drosophily melanogaster (Fang Ju Lin, & kol., 2010). Fang Ju Lin se nechal inspirovat energetickými nápoji, kde je kofein a taurin obsažen, které mají za úkol člověka udržet bdělého a v plné aktivitě. Tento výzkum prokázal, že kofein při nízkých dávkách má pozitivní účinky na fyzickou aktivitu a omezuje spánek. Zato taurin měl úplně opačné účinky, zvýšil potřebu spánku až o 50 %. Bylo zjištěno, že 1,5 % taurinu podávaného po dobu 5 dní do media D. melanogaster, má reverzibilní účinky na pohybovou aktivitu a také mění cirkadiánní rytmy, která řídí denní aktivity. V návaznosti na tento výzkum jsme podávali D. melanogaster nízké koncentrace kofeinu a taurinu a zjišťovali, jestli se tím zvýší transkripční aktivita elementu 19

HeT-A, a tím dojde k prodloužení telomer. V našich experimentech jsme použili vyšší koncentrace než při výzkumu na pohybovou aktivitu, které neměly žádný vliv nebo zkracovaly telomerickou délku. Ve výzkumu na pohybovou a denní aktivitu používali vysoké koncentrace kofeinu a taurinu, které měly průkazně špatný vliv na denní režim u D.melanogatser. Je prokázané, že tyto látky ve vysokých koncentracích mají negativní efekt na organismus. K prokázání jejich positivního vlivu, by bylo zapotřebí provést další pokusy s koncentracemi nižšími než 16 × 10-10 mM.

20

6. Závěr V této seminární práci jsem se zabývala vlivem stresu, indukovaného kofeinem a taurinem, na telomerickou aktivitu. Při mých experimentech byla testována série koncentrací obou látek, a to od 16 x 10-1 – 16 x 10-10 mM. Nicméně, ani u jedné z testovaných koncentrací těchto látek nebyl zjištěn statisticky prokazatelný nárůst telomerické transkripční aktivity či změna v délce telomer. Lze se proto domnívat, že obě látky na telomerickou homeostázi nemají vliv, či případně koncentrace látek nebyla optimálně zvolena, proto je do budoucna potřeba pokusy ještě zopakovat a případně

koncentrace

obou

stresorů

21

ještě

více

snížit.

7. Použitá literatura Archer, M.A., J.P. Phelan, K.A. Beckman, M.R. Rose (2003) „ Breakdown in correlations during laboratory evolution. II. Selection on stress resistance in Drosophila populations. Evolution 57:536-543. Bandyopadhyay U., Das D., Banerjee R.K. (1999) "Reactive oxygen species: oxidative damage and pathogenesis." Current Science 77.5: 658-666. Berlett B.S., Stadtman E.R. (1997)"Protein oxidation in aging, disease, and oxidative stress." Journal of Biological Chemistry 272.33: 20313-20316. Blackburn E.H. (1991). Structure and function of telomeres. Nature, 350(6319), 569573. Calabrese, E.J., Baldwin, L.A., and Holland, C.D. (1999). Risk Anal. 19, 261–281. Calabrese E.J. & Baldwin L.A. (2002). Defining hormesis. Human & Experimental Toxicology, 21(2), 91-97. Capkova Frydrychova R., Mason J.M. (2013) Telomeres: Their structure and maintenance. David Stuart (ed.) The Mechanisms of DNA Replication. Intech, Open Access Publisher, Rijeka, Croatia, pp. 423-443. Cenci G., Ciapponi L., Gatti M. (2005) The mechanism of telomere protection: a comparison between Drosophila and humans. Chromosoma 114: 135–145. Cui H., Kong Y., Zhang H.: Oxidative stress, mitochondrial dysfunction, and aging. J Signal Transduct 2012, 2012:646354.

Denchi E.L. (2009) Give me a break: how telomeres suppress the DNA damage response. DNA Repair 8: 1118–1126. Fenton HJH. (1894) "LXXIII. Oxidation of tartaric acid in presence of iron." Journal of the Chemical Society, Transactions 65: 899-910. Hayflick L. & Moorhead P.S. (1961). The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research, 25(3), 585-621.

22

Chan S.W.L. & Blackburn E.H. (2002). New ways not to make ends meet: telomerase, DNA damage proteins and heterochromatin. Oncogene, 21, 553563. Johnston R.B., Keele B.B., Misra H.P., Lehmeyer J.E., Webb L.S., Baehner R.L., RaJagopalan K.V. (1975) "The role of superoxide anion generation in phagocytic bactericidal

activity. Studies

with

normal

and chronic

granulomatous disease leukocytes." Journal of Clinical Investigation 55.6: 1357 - 1372. Kenyon, C. (2005). Cell 120, 449–460. Kodíček M., (2004), projekt č. 618 „Elektronické výkladové slovníky - pilotní projekt BIOCHEMIE“.-Elektronická

verze

1.0

se

vztahuje

k

tištěné

publikaci Biochemické pojmy - výkladový slovník. Korandova M. (2014) Transkripční aktivita telomerického elementu HeT-A u Drosophila melanogaster. Diplomová práce. Přírodovědecká fakulta, Jihočeská univerzita, České Budějovice. Linger B.R., Price C.M. (2010) Conservation of Telomere protein complexes: Shuffling through Evolution. National Institutes of Health Public Access. 44: 434–446. Lloyd R.V., Hanna P.M., Mason R.P. (1997) "The origin of the hydroxyl radical oxygen in the Fenton reaction." Free radical biology and medicine 22.5: 885888. Maeshima K., Janssen S., Laemmli U. K., 2001. Specific targeting of insect and vertebrate telomeres with pyrrole and imidazole polyamides. EMBO Journal, 20, s. 3218–3228. Mason J.M., Capkova Frydrychova R., Biessmann H. (2008) Drosophila telomeres: an exception providing new insights. BioEssays 30: 25–37. Mattson M.P. (2008). Hormesis defined. Ageing Research Reviews, 7(1), 1-7. McKnight T.D. & Shippen DE (2004). Plant telomere biology. The Plant Cell Online, 16(4), 794-803. Missirlis F., Phillips J.P., Jäckle H.: Cooperative action of antioxidant defense systems in Drosophila. Curr Biol 2001, 11:1272–7.

23

Szakosová K. (2013), Vliv oxidativního stresu na antioxidační enzymy u Drosophila melanogaster. Bakalářská práce. Přírodovědecká fakulta, Jihočeská univerzita, České Budějovice. Szakosová K. (2015), Vliv oxidativního stresu na telomerickou délku u Drosoprhila melanogaster. Diplomová práce. Přírodovědecká fakulta, Jihočeská univerzita, České Budějovice. Slijepčević P.: Telomeres and human disease. 2007. Tower J. (1996) "Aging mechanisms in fruit flies." BioEssays 18.10: 799-807. Turrens J. F., 2003. Mitochondrial formation of reactive oxygen species. The Journal of Physiology, 552, s. 335-344. Uttara B., Singh A. J., Zamboni P., Mahajan R. T., 2009. Oxidative stress and neurodegenerative diseases: a review of upstream and downstream antioxidant therapeutic options. Current Neuropharmatology, 7, s. 65-74. Watson J.D. (1972). Origin of concatemeric T7DNA. Nature, 239(94), 197-201. Zhu H., Belcher M., van der Harst P. (2011) Healthy aging and disease: role for telomere biology: Clinical Sciene 120: 427–440.

24

7.1. Internetové zdroje o

http://www.stefajir.cz/?q=oxidacni-stres, cit. 28.12. 2015

o

https://en.wikipedia.org/wiki/Oxidative_stress?oldid=316951349 cit. 28.12. 2015

o

https://cs.wikipedia.org/wiki/Oxida%C4%8Dn%C3%AD_stres cit. 28.12. 2015

o

https://cs.wikipedia.org/wiki/Superoxidy, cit. 12.1. 2016

o

http://www.wikiskripta.eu/index.php/Antioxida%C4%8Dn%C3%AD_oc hrana_lidsk%C3%A9ho_t%C4%9Bla, cit. 12.1. 2016

o

http://147.33.74.135/knihy/uid_es002_v1/hesla/radikal_superoxidovy.html, cit.18.1. 2016

o

https://en.wikipedia.org/wiki/Superoxide, cit. 18.1. 2016

o

https://mefanet-motol.cuni.cz/download.php?fid=2139, cit. 21.1. 2016

o

http://www.sci.muni.cz/~dobro/ozon_1.htm, cit. 21.1. 2016

o

http://che1.lf1.cuni.cz/html/ROS_CZE_081209b.pdf, cit. 21.1. 2016

o

www.nutriacademy.cz/lifestyle/doc/antioxidanty.docx, cit. 25.1. 2016

o

http://is.muni.cz/el/1431/podzim2010/Bi9901/um/04_Antioxidanty.pdf, cit. 26.1. 2016

25

STŘEDOŠKOLSKÁ ODBORNÁ ČINNOST

Recommend Documents