Stanovení základních lymfocytárních populací - Příprava k akreditaci – IVD metoda Mgr. Marcela Vlková, Ph.D; Mgr. Olga Tichá, Ph.D. Ústav klinické alergologie a imunologie, FNUSA, Brno RNDr. Veronika Kanderová, Ph.D. CLIP, 2. LF UK a FN Motol, Praha
Základní lymfocytární subpopulace – relativní počty (%)
CD3+ CD3+4+ CD3+8+ CD16+56+ CD19+ CYTO-STAT tetraCHROME (Beckam Coulter, Inc.; IVD & CE): anti-CD45FITC/CD4RD1/CD8ECD/CD3PC5 anti-CD45FITC/CD56RD1/CD19ECD/CD3PC5 + anti-CD16PE Kombitest (Exbio) CD3 FITC / CD4 PE‐Cy7 / CD8 APC‐Cy7 / CD16+CD56 PE / CD19 APC / CD45 PerCP‐Cy5.5
fyziologické meze nastaveny dle: Comans-Bitter et.al; Immunophenotyping of blood lymphocytes in childhood. Reference values for lymphocyte subpopulations. Journal of Pediatrics.1997
Kontrola kvality vyšetření na průtokovém cytometru v naší laboratoři
IKK v průtokové cytometrii Řešení jako u všech ostatních metod určených k akreditaci: 1) nutnost měření kontrol pro stanovení reprodukovatelnosti 2) nutnost měření kontrol pro stanovení opakovatelnosti Pravidla by měla být stejná, jako u každého jiného analyzátoru!!!! Denní x týdenní měření kontrolního vzorku
Denní měření kontrolního vzorku Respektovat SOP !!! Správný pipetovací proces Správné monoklonální protilátky Správné lyzační činidlo Správné nastavení cytometru Správné nastavení protokolu Vlastní měření Správné vyhodnocení dat
Denní x týdenní měření kontrolního vzorku
Denní měření před započetím práce
Měření Flow Check, Spherotech, … CST, Rainbow Beads
Měření kontrolního vzorku
Příslušný laborant je povinen porovnat výsledky naměřených kontrol s výsledky, které poskytl výrobce.
Pokud výsledky splňují příslušné kontrolní limity, laborant pokračuje v práci měřením pacientských vzorků.
Pokud jsou výsledky mimo uvedené limity, pokračuje laborant podle připravených opatření.
Opatření 1. Kontrola případného „ucpání“ cytometru řešení – důkladné promytí cytometru 2. Kontrola správného nastavení cytometru kontrolní kuličky – při chybě volat servis 3. Kontrola reagencií (protilátky, lyzační činidlo, zpracovávaného ref. vzorku) 4. Kontrola postanalytické fáze správného nastavení protokolů / gatů u příslušného parametru 5. Opětovné změření kontroly
Protokol o měření kontrolního vzorku musí obsahovat: Název kontrolního materiálu Šarži kontrolního materiálu / Abs Expirace Rozmezí, ve kterém se mají pohybovat výsledné hodnoty Kdo měřil Kdy měřil Výsledek
parafovaný záznam ve formuláři pro IKK
Hodnocení IKK (verifikace)
Měsíční hodnocení: ◦ ◦ ◦ ◦
průměrná hodnota směrodatná odchylka variační koeficient sestrojení grafu – sledování splnění Westgardových pravidel ◦ protokol ◦ pouze jedna šarže 2x ročně hodnotíme opakovatelnost CD‐Chex 2x ročně reprodukovatelnost IMMUNO‐TROL
Levey – Jennings Graf
Westgardova pravidla
k minimalizaci zbytečných opakování měření
rozpoznání náhodné systematické chyby
systematická
náhodná 13s
41s
10x 12s
www.westgard.com
R4s
22s
7T
Hodnocení EKK
hodnocení výsledků v EHK manažerem kvality
případný neúspěch – stanovení opatření (v příští zprávě hodnocení úspěchu opatření)
hodnocení výsledků EHK v čase (letech) – vývoj absolutních a relativních chyb, úspěšnost v EHK
Plány EHK Zprávy z EHK
Srovnání dvou přístrojů
Porovnání měření na dvou cytometrech
korelace získaných výsledků?
– tudy statistická cesta nevede!
NAVIOS %CD3+4+
% CD3+4+ 70 65 60 55
y = 0,9838x R2 = 0,9724
50 45 40 35 30 30
40
50 FC500 %CD3+4+
60
70
Passing-Bablokova regrese Hodnotí se, zda je sklon (směrnice) proložené přímky významně odlišný od jedničky, která odpovídá úhlu 45° a dále, zda je intercept (hodnota ve které proložená přímka protíná osu y) významně odlišný od nuly.
Bland-Altmanův rozdílový graf Graf lze jednoduše vyhodnotit. Pokud je nula na ose y uvnitř intervalu +2SD a - 2SD lze konstatovat, že mezi metodami A a B není významný rozdíl.
Poděkování: Mgr. Jan Stuchlý
