Stanovení stechiometrického poměru komplexu chelátor-železo. Jobovou metodou

Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmakologie a toxikologie

Stanovení stechiometrického poměru komplexu chelátor-železo Jobovou metodou Rigorózní práce

Vypracovala: Mgr. Zuzana Staňová Školitel: PharmDr. Přemysl Mladěnka, Ph.D. Hradec Králové 2012

Prohlašuji, že jsem tuto práci vypracovala samostatně a veškeré použité prameny byly v práci řádně citovány. Tuto práci jsem nepoužila k získání jiného nebo stejného titulu.

Na tomto místě bych chtěla poděkovat svému školiteli PharmDr. Přemyslu Mladěnkovi, Ph.D., za všestrannou pomoc, ochotu, za poskytnuté rady, materiály a čas, který mi věnoval. Zároveň děkuji i Mgr. Tomáši Filipskému za pomoc při měření a sestavování výsledků, ochotu poradit a pomoci. V neposlední řadě děkuji své rodině která mě neustále podporuje a umožňuje mi se vzdělávat, za jejich obětavost a pochopení.

Abstrakt Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmakologie a toxikologie Kandidát: Mgr. Zuzana Staňová Konzultant: PharmDr. Přemysl Mladěnka, Ph.D. Název rigorózní práce:

Stanovení stechiometrického poměru chelátor-železo Jobovou

metodou

Železo je důležitým biogenním prvkem ovlivňujícím mnoho biochemických reakcí v organismu. Jeho nedostatek i nadbytek způsobuje patofyziologické změny v organismu. Nadbytek železa je nejčastěji důsledek podávání častých krevních transfuzí při terapii hematologických onemocnění. Dále může nastat při poruchách metabolismu železa (chronické intoxikace). Nebezpečným stavem, zejména u dětí, je akutní intoxikace po požití nadměrného množství železa. Pro odstranění přebytečného železa z organismu se používají chelátory železa. Jde o heterogenní skupinu látek schopných vázat železo. Standartním lékem této skupiny je parenterálně podávaný deferoxamin. V současné době jsou používány i perorální chelátory (deferipron, deferasirox). Další indikace těchto látek jsou dnes předmětem výzkumu, kdy se zkoumá možný přínos při terapii nádorů a akutního infarktu myokardu. V patogenezi obou těchto stavů hrají významnou roli i změny pH. V této práci byl zjišťován spektrofotometricky stechiometrický poměr komplexů vybraných chelátorů (deferoxamin, deferipron, deferasirox, H2QPyQ /2,6-bis[4(1-fenyl-3-methylpyrazol-5on)karbonyl]pyridin/) s dvojmocným a trojmocným železem při různých patofyziologicky významných pH (4,5; 5,5; 6,8 a 7,5) pomocí standardní Jobovy metodiky. Z testovaných látek deferoxamin tvořil s železnatými i železitými ionty při všech testovaných pH komplex s pravděpodobnou stechiomerií 1:1, i když v některých případech použitá metoda poukázala spíše na komplex s nepravděpodobnou stechiometrií 3:4(0,75:1). Další testovanou látkou

byla sloučenina H2QPyQ. Tato látka s železnatými ionty komplexy netvoří nebo k nim má nižší afinitu. S železitými ionty při pH 4,5 se komplex vytvářel, ale použitá metodika neumožnila zjistit přesnou stechiometrii s výjimkou pH 5,5, kdy byl zaznamenán komplex v poměru 2:1. Při vyšších pH má opět látka nižší afinitu k železitým iontů. U sloučeniny deferipron byl nalezen komplex s železnatými/železitými ionty v poměru 3:1 kromě pH 4,5, kde v případě železnatých iontů nebylo možné určit stechiometrii. Deferasirox tvořil komplexy s železnatými i železitými ionty v poměru 2:1 při pH 5,5; 6,8; a 7,5. U pH 4,5 byl po přidání železnatých iontů nalezen jen nevýznamný posun absorpčního maxima, v případě železitých iontů byl nalezen komplex se stechiometrií 1:1. Závěrem lze uvést, že pH je důležitým faktorem při tvorbě komplexu s železnatými i železitými ionty u testovaných chelátorů.

Abstract in English Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Pharmacology & Toxicology Candidate: Zuzana Staňová, MSc. Consultanat: Přemysl Mladěnka, Ph.D. Title of Thesis: : Determination of the stoichiometric ratio of iron chelators by Job's method Iron is an important biogenic element affecting many biochemical reactions in the body. Its deficiency and excess cause pathophysiological changes in the organism. Excess of iron is very often the result of frequent blood transfusions in the treatment of hematologic diseases. It may also occur in iron metabolism disorders (chronic intoxication). Acute intoxication after ingestion of excessive amounts of iron is life threatening especially in children. Chelators are used to remove excess iron from the body. It is a heterogeneous group of substances capable of binding iron. Standard drug of this group is parenterally administered deferoxamine. Oral chelators (deferiprone, deferasirox) are also currently used. Other indications of these substances are now the subject of research, which investigates their potential benefits in cancer therapy and acute myocardial infarction. The pH changes play an important role in the pathogenesis of both mentioned conditions. In this work, the stoichiometric ratios of complexes of selected chelators (deferoxamine, deferiprone, deferasirox, H2QPyQ /2,6-bis[4(1-phenyl-3-methylpyrazol-5-one)carbonyl]pyridine/) were

determined

spectrophotometrically

with

divalent

and

trivalent

iron

in

various

pathophysiologically relevant pHs (4.5, 5.5,6.8 and 7.5) using the standard Job's method. From the tested compounds, deferoxamine formed with ferrous and ferric ions at all tested pH complexes with stoichiometry 1:1, although in some cases, the method revealed a complex with unexpected 3:4 stoichiometry (0.75:1). Another studied drug was H2QPyQ. This substance did not form complexes with ferrous ions or had low affinity to ferrous ions. Although a complex with ferric ions was formed at pH 4.5, this method did not allow to determine the exact stoichiometry. At pH 5.5

a complex with a ratio 2:1 was formed. At higher pHs the substance had again low affinity to ferric ions. The compound deferiprone formed complexes with ferrous / ferric ions in the ratio 3:1 with exception of pH 4.5 and ferrous ions, where it was not possible to determine the stoichiometry . Deferasirox formed complexes with ferrous and ferric ions in the ratio 2:1 at pH 5.5, 6.8 and 7.5. At pH 4.5, only an insignificant shift in the absorption maxima was found after addition of ferrous ions, a complex with 1:1 stoichiometry was found in the case of ferric ions. In conclusion, the pH is an important factor in the formation of complexes of ferrous or ferric ions with the tested chelators.

Obsah Seznam zkratek

.................................................................................................................................. 3

Úvod

.................................................................................................................................. 4

Teoretická část

.................................................................................................................................. 5

1.Železo

.................................................................................................................................. 6

1.1 Fyziologie železa ................................................................................................................................6 1.1.1 Metabolismus železa ……………………………...………………………………………………6 1.2 Patologie železa ................................................................................................................................12 1.2.1 Akutní intoxikace …………………………………...…………………………………………...12 1.2.2 Chronická intoxikace ………………………………..…………………………………………..14 1.3 Toxicita železa .................................................................................................................................15 2.Chelátory

................................................................................................................................ 18

2.1 Vlastnosti chelátorů železa ...............................................................................................................18 2.2 Vliv pH na chelataci .........................................................................................................................19 2.3 Zkoumané chelátory .........................................................................................................................19 2.3.1 Deferoxamin (DFO) ………………………………………………………………...…………...19 2.3.2 Deferipron (DRP) …………………………………………………………………..…………...20 2.3.3 Deferasirox (DFR) ………………………………………………………………..……………..21 2.3.4 /2,6-bis[4(1-fenyl-3-methylpyrazol-5-one)karbonyl]pyridin/ (H2QPyQ) …………………..…..22 2.4 Chelátory železa – budoucnost .........................................................................................................22 3. Cíl práce

................................................................................................................................ 24

4. Materiál a pomůcky ........................................................................................................................... 25 4.1 Chemikálie použité pro analýzu .......................................................................................................25 4.2 Testované látky ................................................................................................................................25 4.3 Použité pufry .................................................................................................................................25 4.4 Přístrojové vybavení .........................................................................................................................25

1

5.Příprava zásobních roztoků a pracovních roztoků.............................................................................. 26 5.1 Příprava zásobních roztoků ..............................................................................................................26 5.2 Postup kalibrace Fe2+ resp. Fe3+ pro UV-VIS spektrofotometrii (Ferrozinová metoda) (Stookey, 1970)

.................................................................................................................................26

5.3 Postup stanovení železo-chelatační aktivity spektrofotometricky....................................................27 5.3.1 Stanovení absorpčního maxima komplexu ……………..……………………………………….27 5.4 Princip Jobovy metody .....................................................................................................................28 Experimentální část ............................................................................................................................... 29 6. Výsledky:

................................................................................................................................ 30

6.1 Deferoxamin

.................................................................................................................................30

6.1.1 Deferoxamin - železnaté ionty ……………………..……………………………………………30 6.1.2 Deferoxamin - železité ionty ……………..…………….……………………………………….34 6.2 H2QpyQ

.................................................................................................................................39

6.2.1 H2QpyQ - železnaté ionty …………..…………………………………………………………...39 6.2.2 H2QPyQ – železité ionty …………………..…………………………………………………….42 6.3 Deferipron

.................................................................................................................................46

6.3.1 Deferipron železnaté iony …………..…………………………………………………………...46 6.3.2 Deferipron železité ionty ………………………..………………………………………………51 6.4 Deferasirox

.................................................................................................................................55

6.4.1 Deferasirox železnaté ionty ……………..………………………………………………………55 6.4.2 Deferasirox železité ionty ………………..……………………………………………………..59 7.Diskuze

................................................................................................................................ 64

8.Závěr

................................................................................................................................ 66

9.Literatura

................................................................................................................................ 67

2

Seznam zkratek DFO – deferoxamin DFR - defrasirox DMT -1 – Transportér pro dvojmocné kovy, Divalent metal transporter 1 DRP – deferipron EDTA – etylendiamintetraoctová kyselina Fe2TF – železem naložený transferin HAMP – gen pro hepcidin HFE - gen hemochromatózy HPC1 – Heme protein carrier HSV - gen pro hemojuvelin NTBI – volné železo nenavázané na transferin, non-transferin bound iron ROS – reaktivní kyslíkové sloučeniny (reactive oxygen substances) TfR1 – transferinový receptor 1

3

Úvod V této práci byl zkoumán vliv pH na výslednou stechiometrii komplexu chelátor – železo a to jak s železem dvoumocným, tak s železem trojmocným. Byly vybrány tři chelátory používané v klinické praxi a jeden perspektivní chelátor ve fázi výzkumu. Dané hodnoty pH byly vybrány podle dostupných informací o změnách pH při patofyziologických procesech. K určení stechiometrie jsme použili Jobovu metodu. Předchozí vědecké práce zkoumaly stechiometrii komplexů především při neutrálním pH a proto jsme se pokusili zjistit, jaký vliv na stechiometrii komplexu má změna pH.

4

Teoretická část

5

1.

Železo

1.1 Fyziologie železa Železo je nepostradatelným biogenním prvkem. Je obsaženo v hemoglobinu v krvi, v myoglobinu ve svalech, je součástí stovek enzymů v každé buňce a podílí se tak na mnoha esenciálních procesech (www stránky Ústavu patologické fyziologie 1. LF UK)V těle dospělého člověka je obsaženo 3,5-4g železa. (Lincová at al, 2002) Většinu tohoto množství obsahují erytrocyty v hemoglobinu (70%), dále je vázáno v zásobní formě ve ferritinu v buňkách (24%), myoglobinu (4%) a enzymech obsahující železo 2%. (www stránky Ústavu patologické fyziologie 1. LF UK) Můžeme je rozdělit na železo funkční, které se účastní fyziologických reakcí, a železo transportní a zásobní, které je vázáno na bílkoviny. (Ganong, 2005) Železo se v organismu vyskytuje ve dvou oxidačních stavech: ve ferro (Fe2+) a ferri (Fe3+) formě. Ferro-forma je charakteristická pro funkční železo (váže reverzibilně kyslík), skladovací a transportní proteiny vážou železo ve formě trojmocné. Organismus se tím pravděpodobně chrání proti možné účasti železnatých iontů jako katalyzátoru při tvorbě reaktivních forem kyslíku. Železité ionty jsou pevně vázané na proteiny a tudíž nemohou plnit tuto katalytickou roli. (www stránky Ústavu patologické fyziologie 1. LF UK)

1.1.1

Metabolismus železa Metabolismus železa v organismu představuje uzavřený systém, v němž je většina železa

reutilizována. Ztráty jsou doplňovány ze zevních zdrojů.(Trojan, 2003) V našich podmínkách je hlavním zdrojem železa hem, který je obsažený především v mase a může představovat až 2/3 příjmu železa. Nehemové železo je sice v potravě obsaženo ve větší koncentraci než hemové, ale jeho biodostupnost je nižší. Většinou jde o železo trojmocné, které musí být před absorpcí redukováno na železo dvojmocné. Vstřebávání železa je regulovaný proces, který probíhá v závislosti na množství železa v těle. Hlavním místem pro vstřebávání železa je duodenum (Viz Obr. 1) (www stránky Ústavu patologické fyziologie 1. LF UK).V žaludku se resorbují jen stopy železa, ale žaludeční šťáva

6

usnadňuje redukci železitých iontů na železnaté které se pak následně v dalších oddílech střeva lépe vstřebávají. Podobný efekt mají i reduktanty přijaté potravou jako je kyselina askorbová. (Ganong, 2005) Za fyziologických okolností se u dospělého jedince vstřebává asi 1/10 železa přijatého v potravě. To představuje asi 1-2 mg, což je množství, které nahrazuje ztráty železa. Při zvýšené potřebě železa, např. po předchozím krvácení, se tento podíl může zvýšit. Naopak nadbytek železa a některé stavy způsobují, že se množství vstřebaného železa sníží. (www stránky Ústavu patologické fyziologie 1. LF UK) U dospělých lidí jsou ztráty železa z organismu poměrně malé. Neexistuje žádný specifický mechanismus eliminace, ale jedná se o ztráty deskvamací buňek zejména mukózních buněk gastointestinálního traktu a epiteliálních buněk kůže, močového a pohlavního ústrojí. Muži ztrácejí přibložně 0,6 mg/den, u žen ztráty kolísají a v průměru jsou asi dvojnásobné v důsledku dalšího úbytku železa při menstruačním krvácení. (Ganong, 2005)

Obr. 1 Osud železa v organismu, převzato z publikace Andrews, 1999

7

1.1.1.1 Absorbce železa Železo nacházející se v Fe3+ formě musí být redukováno na Fe2+ formu, tento děj může být kromě zmíněných potravních reduktantů, uskutečněn i enzymem ferrireduktázou (Obr.2). Poté jsou železnaté ionty transportovány přes střevní epitel transportérem pro dvojmocné kovy (divalent metal transporter 1, DMT-1) který transportuje také ostatní dvojmocné kovy jako zinek, měď a kobalt. Absorpce nehemového železa může být snížena tetracykliny, inhibitory protonové pumpy, antacidy, fytáty, kalciem aj. Také infekce Helicobacter pylori může vést k anemii z nedostatku železa a to dokonce i při absenci krvácení. Tato anemie pak neodpovídá na terapii železem ale může být léčena eradikací infekce Helicobacter pylori. (Aisen et al, 2001)

Obr. 2 Hlavní metabolické dráhy absorpce železa v enterocytech u savců Převzato z Aisen et al., 2001 . 1:Ferrireduktáza; 2: transportér dvojmocného kovu 1 (Divalent metal transporter 1,.DMT1); 3: Heme protein carrier 1 (HPC1); 4: Hemoxygenáza; 5: Hem exporter; 6: Ferroportin (Ireg-1); 7:Hefestin; 8: Transferrin receptor-1 (TfR1).

Hemové železo je absorbováno dovnitř enterocytu pomocí membránového proteinu heme carrier protein 1 nacházejícího se v proximální části střeva. Největší množství hemového železa je uvolněno z hemu hemoxygenázou v podobě Fe2+. Není úplně jisté, zda nějaká část hemu nepřechází do buňky neporušená, a může pak být vyloučena enterocyty působením hem exporteru. Jakmile je železo uvnitř buňky střevního epitelu, buď zůstane v buňce pro její použití nebo je exportováno přes

8

basolateralní membránu z enterocytů do oběhu. Železo exportované přes plazmatickou membránu prostřednictvím membránového transportéru ferroportinu 1 je pak oxidováno pomocí proteinu obsahujícího několik atomů mědi nazvaného hephaestin

předtím, než je navázáno v plazmě na

transferin. (Aisen et al, 2001)

1.1.1.2 Transport železa Hlavním transportním proteinem železa u obratlovců je plazmatická bílkovina transferin. (Trojan, 2003) Všechny transferiny obratlovců jsou jednořetězcové glykoproteiny o 80 kDa, obsahující dvě strukturně podobná, ale funkčně odlišná vazebná místa pro atomy železa. Za normálních okolností je všechno nehemové železo v oběhu vázáno na transferrin, jehož saturace vazebných míst se pohybuje okolo 30 %. Při nadbytku železa v organismu a obsazení všech vazebných míst transferrinu se v organismu objeví volné železo (NTBI – NonTransferrin-Bound Iron), obvykle ve formě Fe3+ vázané na citrát. (Sedláčková et al, 2009) Do krevní plazmy se dostává jak železo resorbované v tenkém střevě tak i odštěpené z hemoglobinu rozpadlých erytrocytů a uvolněné ze zásob organismu. Z plazmy odebírají železo nezralé erytroidní buňky (především bazofilní normoblasty a dřeňové retikulocyty), buňky ukládající železo do zásoby a v malém množství ostatní buňky v těle. Za normálních okolností pochází maximum plazmatického železa z hemoglobinu starých červených krvinek a 85-90% železa, které opouští plazmu, vstupuje do krvetvorné kostní dřeně (viz Obr.1). Po vazbě transferrinu s navázaným železem na cílové receptory dojde k internalizaci tohoto komplexu endocytózou, železo se v buňce z transferinu uvolní a bílkovina apotransferin je vypuzená exocytózou (Obr.3). (Trojan, 2003) Buňka může ovlivňovat vstup železa dle své potřeby. Buňka, která má málo železa a vysokou potřebu, např. prekurzor červené krvinky, má na svém povrchu velké množství transferinových receptorů. Pokud je železa v buňce nadbytek, ukládá se do feritinu a tento stav vede k snížené expresi transferinových receptorů. (www stránky Ústavu patologické fyziologie 1. LF UK)

9

Obr. 3 transferinový cyklus. Převzato z z publikace Andrews, 1999 Železem naložený transferin (Fe2TF) se váže na receptory transferinu (TFR) na povrchu buněk. Komplex receptor – Fe2Tf je poté internalizován. Protonová pumpa snižuje pH v endosomu. Nižší pH vede ke konformační změně proteinů, které vyústí k uvolnění železa z transferinu. Železité ionty jsou redukovány na železnaté a ty jsou transportovány DMT1 přes membránu endosomu do cytoplasmy. Transferin (ApoTf) a transferinový receptor jsou recyklovány do plasmy respektive na povrch buňky, kde mohou být použit pro další cykly navázání a příjmu železa. V erytroidních buňkách se nejvíce železa přesune do mitochondrií, kde je začleněno do protoporfyrinu za tvorby hemu. V ostatních buňkách je železo uloženo ve feritinu, příp v hemosiderinu. (Andrews, 1999)

1.1.1.3 Uskladnění železa Zásobní železo je uloženo v makrofázích sleziny, v játrech a v kostní dřeni. Stav zásob železa v lidském organismu je podstatně větší u mužů než u žen (v reprodukčním věku). Bez zásob železa by nemohl lidský organismus zvýšit erytropoezu. (Trojan, 2003) Uvnitř buňky, může být železo uloženo ve dvou formách: v cytosolu jako feritin a po rozpadu feritinu v lyzozomech jako hemosiderin. (Munoz et al, 2009) Ferritin je 24-podjednotek obsahující protein s vnitřním jádrem, kde je železo uloženo jako železité ionty. Do dutiny lze uložit až 4500 atomů železa, ale ta většinou pojme asi 2000 atomů. Apoferritin je heterogenní asi 441 kDa velký protein složený z proměnného počtu 21 kDa těžkých (H) nebo 19 kDa lehkých (L) podjednotek. Ionty železa přechází prostřednictvím jednoho z 6 pórů vnitřní

10

dutiny apo-ferritinu a jsou oxidovány na železitý ion ferroxidázovou aktivitou H-podjednotky. Uvnitř struktury feritinu se železo stává součástí rostoucího krystalu ferrihydritu (FeOOH) x (40). Pokud je železo potřeba, dá se snadno z feritinu uvolnit. Malé množství feritinu se běžně vyskytuje v krvi a je obvykle úměrné množství celkového množství železa v organismu.(Mladěnka et al, 2005) Druhou sloučeninou ukládající železo v buňce je hemosiderin. Hemosiderin je heterogenní a spíše nerozpustná částice, které obsahuje kromě železa i bílkoviny, sacharidy a lipidy. Je považován za degradovanou formu feritinu a je lokalizován v siderosomech, lyzozomech obsahující železo. (Mladěnka et al, 2005)

1.1.1.4 Regulace metabolismu železa Regulace vstupu a využití železa na úrovni buňky je založena na stabilitě mRNA, která ovlivňuje následnou translaci a syntézu příslušných proteinů. Na úrovni organismu je hlavním regulátorem metabolismu železa hepcidin.( www stránky Ústavu patologické fyziologie 1. LF UK) Hepcidin je 25-aminokyselinový peptid tvořený hepatocyty. (Peslova et al, 2009) Funkcí hepcidinu je regulace transportu železa přes membránu. Navázání hepcidinu na ferroportin vede k internalizaci ferroportinu a poté k jeho degradaci v lysosomu. Pomocí ferroportinu je umožňen eflux železa z hepatocytů, enterocytů a makrofágů a proto jeho internalizace po vazbě na hepcidin vede ke snížení uvolňování železa do plazmy. Toto se projeví jako snížení vstřebávání železa ve střevě a rychlé snížení sérového železo. (Kohgo et al, 2008) Díky tomu je železo méně dostupné při invazi mikroorganismů a pro nádorové buňky. (Vyvoral et al, 2005) Při dlouhodobém působení hepcidinu dochází k absolutnímu nedostatku železa v organismu v důsledku útlumu jeho resorpce v duodenu. Naopak nedostatek či chybění hepcidinu má za následek trvale zvýšenou resorpci železa a jeho následný nadbytek a komplikace s tím spojené. (www stránky Ústavu patologické fyziologie 1. LF UK)

11

1.2 Patologie železa Tělo nemá aktivní mechanismus k vylučování

železa a tudíž regulace absorpce železa

přijatého potravou v duodenu hraje rozhodující roli v homeostáze železa v těle. Toto je nesmírně důležité, jelikož železo je nezbytné pro buněčný metabolismus a aerobní respiraci, zatímco přetížení buňky železem vede k toxicitě a buněčné smrti prostřednictvím volných radikálů a peroxidaci lipidů, tudíž homeostáza železa vyžaduje přísnou regulaci. (Munoz et al, 2009)

1.2.1

Akutní intoxikace Otrava železem se vyskytuje jak u dospělých tak u dětí. Mortalita u dětí je vyšší, úmrtí u

dospělých je srovnatelně méně. (McCrea et al, 1999) Smrtelná p.o. dávka elementárního železa je různá v různých pracech. Pohybuje se od 60 do 300 mg/kg. (Mahoney et al, 1989, McCrea et al, 1999, Spanierman, 2011, Mehta et al, 1997) Protože doplňky stravy s obsahem železa obsahují až 105 mg železa v jedné tabletě, požití několika tablet může způsobit vážnou otravu u malých dětí. Přesný mechanismus akutní otravy železem není známý, ale může být odvozen z oxidativní reaktivity kovu. Ve skutečnosti pozření železa a askorbátu - kombinace vyskytující se v mnoha tabletách doplňujících železo může generovat hydroxylové radikály in vivo. Hydroxylové radikály jsou extrémně reaktivní a způsobí zcela nahodilé poškození biomolekul. (Mahoney et al, 1989) V terapii otravy železem musí být vstřebané železo odstraněno chelatací, protože lidské tělo nemá efektivní způsob vyloučení absorbovaného železa. Současným lékem první volby je deferoxamin. (Mahoney et al, 1989) Při akutním předávkování je překročen normální mechanismus absorpce a železo je rychle absorbováno pasivním procesem. Protože není specifický mechanismus exkrece akumuluje se nadbytek železa v orgánech. Byly pozorovány různé mechanismy toxicity železa, mj. přímé poleptání gastrointestinálního traktu vedoucí k hemorrhagické nekróze. Volné železo prostupuje buněčné membrány a hromadí se kolem mitochondriálních krist a může způsobit přesunutí elektronů z elektronového transportního systému. Přechod na anaerobní metabolismus a zvýšení hladiny kyseliny mléčné vyústí v laktátovou acidózu.V dýchacím systému

12

může železem katalyzované produkce volných radikálů vést k poškození buněčné membrány plicních alveolů peroxidací, která může vyústit až k respiračnímu selhání a acidóze. Ve vaskulárním systému může dojít k masivní post-arteriolární dilataci a zvýšené kapilární permeabilitě. Tím sníží krevní tlak a dále prostřednictvím uvolnění histaminu a serotoninu snižuje srdeční činnost. Volné železo vede také k funkční, reversibilní a na koncentraci závislé poruše koagulace v průběhu prvních hodin intoxikace. (McCrea et al, 1999) Obecně se otrava železem se dá klasifikovat do pěti odlišných fází Fáze 1 (gastrointestinální) : se obvykle objevuje během 6 hodin po expozici. Objevuje se nevolnost a průjem, často doprovázené bolestmi břicha. Při těžké intoxikaci je pozorována též gastroenteritida. Kombinace ztráty tekutiny a krve může mít za následek hypovolemii nebo šok. Významné procento pacientů umírá během této první fáze. Fáze 2 (latentní) se vyznačuje zdánlivým vyřešením GI příznaků. Pacient se symptomaticky zlepšuje. Tato „podvodná“ fáze se obvykle trvá od 6 do 12 hodin po požití a může trvat až 24 hodin. Mezi poruchy v této fázi mohou patřit hypotenze, metabolická acidóza a koagulopatie. U některých pacientů tato fáze chybí. Fáze 3 (metabolická - kardiovaskulární) je charakterizována metabolickou acidózu a příznaky kardiovaskulárního onemocnění. Obvykle nastupuje stupor a kóma. Acidóza může indukovat i selhání jiných orgánů, jako jsou srdce a ledviny. Během této fáze umírá většina pacientů. Tato fáze může začít velmi brzy (6-8 h), v závislosti na závažnosti expozice, a může trvat až 2 dny. Fáze 4 (jaterní). Zvýšené hladiny jaterních enzymů a bilirubinu spojené s koagulopatií, svědčí o poruše funkce jater, která může být doprovázena hypoglykémií. Fáze 5 (zpoždění) se vyznačuje zjizvením trávicího traktu. Postižen je hlavně žaludek a střeva. Tato fáze se objevuje týdny po těžké otravě. (Spanierman, 2011)

13

1.2.2

Chronická intoxikace Chronické přetížení železem se obvykle projevuje jedním ze dvou charakteristických vzorů. V

případech, kdy je erytropoéza normální, ale plazmové železo překročí obsah vazebné kapacity transferinu (např. v případě dědičné hemochromatózy), je železo uloženo v parenchymu buněk jater, srdce a buňkách podskupiny endokrinních tkání. Naopak při přetížení organismu železem výsledkem zvýšeného katabolismu erytrocytů (např. v případě přetížení železem po transuzích), se železo hromadí nejprve v retikuloendoteliálních makrofázích a teprve později v intersticiálních buňkách. Přetížení parenchymu železem je zvláště nebezpečné, protože to vede k poškození tkání a fibróze. (Andrews, 1999)

1.2.2.1 Hereditární hemochromatóza Klasická hereditární hemochromatóza je genetické onemocnění, keré bylo poprvé popsáno v roce 1865 jako klinická triáda glykosurie, cirhóza a hyperpigmentace kůže. Pozdeji bylo zjištěno, že tyto klinické projevy byly v důsledku depozice železem a prosadil se termín hemochromatóza. (Andrews, 1999) V roce 1970 byl uznán název hemochromatóza pro autozomálně recesivní poruchu spojenou s krátkým ramenem chromozomu 6.V roce 1996, byl identifikován gen hemochromatózy (HFE) . Tzv. HFE související HH je charakterizována zvýšeným vstřebáváním železa, jehož množství je nepřiměřené k zásobám železa v organismu, a vede k ukládání železa v parenchymu orgánů jako jsou játra a slinivka. (Swinkels et al, 2006) Pacienti s hereditární hemochromatózou absorbují asi tři až pět mg železa ze stravy denně ve srovnání s normální populací, kde je toto množství jen kolem jednoho mg. Tento relativně malý rozdíl může vést k akumulaci 20 - 40 g železa v dospělosti ve srovnání s běžnou hodnotu asi čtyř gramů. Klinické projevy spojené s nadbytkem železa se obvykle objeví mezi 40 a 60 rokem. Plné vyjádření onemocnění u žen se vyskytuje méně často a v pozdějším věku než u mužů, protože ženy přirozeně ztrácí železo menstruací a porodem. (Kang, 2001) V pozdějších fázích onemocnění mohou projevy zahrnovat artropatie, diabetes mellitus, hypogonadismus a jiné endokrinopatie, jaterní cirhózu, kardiomyopatie, pigmentace kůže, a u cirhotických pacientů, zvýšenou náchylnost k rakovině jater.

14

Včasná diagnostika a léčebné flebotomie mohou zabránit vzniku poškození tkáně, snížení nemocnosti a úmrtnosti a zajištění dlouhodobé přežití podobně jako v běžné populaci. (Swinkels et al, 2006) V současné době je známo 5 hlavních forem HH, každá způsobená sekvencí změn v jiném genu. Jsou to typ HFE1 - klasická hemochromatóza, způsobená mutací v genu HFE, typ HFE2A, HFE2B - juvenilní hemochromatóza,způsobená mutací v genech pro hemojuvelin (HJV) a hepcidin (HAMP) , typ HFE3 - mutace v genu TfR2 pro transferrinový receptor 2, typ HFE4 - mutace v genu SLC10A1 pro ferroportin1 a typ HFE5 – způsobený mutací v genu H-ferritin. (Swinkels et al, 2006)

1.2.2.2 Sekundární přetížení železem Existuje řada klinických situací spojených se sekundárním přetížením železem. Většinou se jedná o situace, kdy je zvýšená erytropoéza a tu pak doprovází i zvýšené vstřebávání železa. Taková situace je pozorována u některých forem hemolytické anémie, např. thalassemia major a sideroblastická anémie, které jsou spojeny s abnormalitami hemoglobinu a v důsledku toho s neefektivní erythropoézou. Léčba se provádí opakovanými krevními transfuzmi a to pak vede k rychlému hromadění železa, protože každá jednotka krve obsahuje 200 - 250 mg železa. Tento nadbytek železa se pak projeví jako klinický syndrom známý jako transfuzní sideróza. (Andrews, 1999) Rovněž je pozorována akumulace železa při poruše syntézy hemu. Například, pozdní kožní porfyrie vyplývá z nedostatku uroporphyrinogen dekarboxylázy, enzymu vyžadovaného při synteze hemu. Tento stav, charakterizovaný citlivostí na světlo, je spojen s mírně zvýšenou hladinou železa. Kromě toho jsou jaterní cirhóza a alkoholismus často spojeny s přetížení železem. (Kang, 2001)

1.3 Toxicita železa Účinnost Fe (II) jako donora elektronů a Fe (III) jako akceptora elektronů s vhodným redoxním potenciálem kompatibilním s buněčným prostředím je základním předpokladem pro mnoho biochemických reakcí. Nicméně, právě tato vlastnost je rozhodující pro toxicitu železa. Je to proto, že

15

v aerobních podmínkách, může železo snadno katalyzovat generování toxických voných radikálů. Toxicita železa je z velké části založena na Fentonově, respektive Haber-Weissově reakci, kde katalytické množství železa je dostatečné k tvorbě hydroxylových radikálů (•OH) ze superoxidu (•O2−) peroxidu vodíku (H2O2). (Papanikolaou et al, 2005) Fe3+ + •O2− → Fe2+ + O2 Fe2+ + H2O2 → Fe3+ + OH− + •OH (Fentonova reakce) Tyto dvě reakce se souhrnně označují jako Haber-Weissova reakce •O2- + H2O2 → •OH + OH- + O2 Tyto radikály patří mezi tzv. reaktivní kyslíkové sloučeniny (Reactive oxygen substances, ROS). Důležité je, že ROS se v organismu přirozeně vyskytují jako vedlejším produkty aerobního metabolismu v mitochondriích. ROS mohou být také generovány během enzymatických reakcí i v jiných subcelulárních prostorech, jako v peroxisomech, endoplazmatickém retikulu, nebo cytoplasmě. ROS jsou důležitým nástrojem pro antimikrobiální obranu organismu. Jsou vytvářeny NADPH oxidázovým komlexem při infekci a tento komplex generuje vysoké hladiny superoxidu, který je enzymaticky a spontánně přeměněn na peroxid vodíku. Tyto reakční produkty vedou k nárustu více účinných oxidantů jako je peroxynitrit (ONOO-) a chlornan (ClO-), které zesilují baktericidní a cytotoxickou kapacitu fagocytických buněk a představují hlavní toxické produkty vytvářené in vivo. První z nich je generován spontánní reakcí superoxidu s NO, zatímco druhý je syntetizován z peroxidu vodíku a chloridu v reakci katalyzované myeloperoxidázou. V tomto prostředí, redoxně aktivní železo katalyzuje vytváření nejen hydroxylových radikálů, ale i jiných biologicky reaktivních sloučenin, jako peroxidových ( ROOS•), alkoxylových (ROS•), thiolových (RS•) a nebo thiol-peroxidových (RSOOS•) radikálů. Volné radikály jsou vysoce reaktivní a mohou podporovat oxidaci proteinů, peroxidaci membránových lipidů a modifikaci nukleových kyselin.(Papanikolaou et al, 2005) Generování radikálů Fe2+ + ROOH → Fe3+ + OH− + RO• Fe3+ + ROOH → Fe2+ + H+ +ROO• RSH + OH• → RS• + H2O

16

RSH + ROO• → RS• + ROOH RS• + O2 → + ROO•

Produkce volných radikálů pak může vést k závažnému poškození organismu, proto se organismus snaží této reakci zabránit, např. rozkladem peroxidu vodíku pomoci katalázy a glutathionperoxidázy nebo oxidaci Fe2+ na Fe3+ ceruloplasminem a jeho inaktivaci vazbou na specifické proteiny – transferrin, ferritin nebo laktoferrin. (Sedláčková et al, 2009)

17

2.

Chelátory

2.1 Vlastnosti chelátorů železa Chelátory jsou molekuly, které váží různě pevnou vazbou ionty kovů. Některé chelátory jsou jednoduché molekuly, které se snadno syntetizují (např. ethylendiamintetraoctová kyselina, EDTA), jiné jsou složité bílkoviny produkované živými organismy (např., transferin). (Sharma et al, 2010) Železo má koordinační číslo šest a centrální atom železa je schopen koordinovat šest jednovazných ligandů a vytvářet osmistěnný chelát. Ligandy které můžou koordinovat více než jeden donorový atom se nazývají dvojvazné, trojvazné případně šestivazné a jsou více stabilní než jednovazné. (Tam et al, 2003) Všech šest koordinační míst musí být pevně vázáno, aby ionty železa ztratily schopnost katalyzovat redoxní reakce. Vaznost ligandů přímo souvisí s molekulovou hmotností: šestivazné chelátory mají vyšší molekulovou hmotnost ve srovnání s troj- a dvojvaznými molekulami. Nicméně, prostup přes biologických membrány a tím i absorpce z gastrointestinálního traktu a buněčná penetrace se neřídí jen molekulární hmotností, ale také lipofilitou a nábojem molekuly.(Cohen et al, 2004) Chelátory železa by měly snížit množství železa ve tkáních a tím zabránit nadměrné akumulaci železa v orgánech a neutralizovat potenciálně toxické volné železo.(Cohen et al, 2004) Důležitou charakteristikou chelátoru je jeho afinita a selektivita k iotům železa. Tím se snižuje schopnost chelátoru vyvázat další důležité ionty kovů, jako např. měďnaté a zinečnaté ionty. Afinita chelátoru k železu a stabilita komplexu ligand-kov, se vyjádřuje jako hodnota pFe3+, což je záporný dekadický logaritmus koncentrace volných Fe3+ (měřeno v roztoku ligandu o koncentraci 10 µM a Fe3+ o koncentraci 1 µM při pH 7,4). Čím je tato hodnota vyšší, tím je vyšší stabilita komplexu ligandkov.(Cohen et al, 2004) Při snaze nalézt účinné chelátory železa musíme přihlédnou ke třem hlavním podmínkám: cestě podání železa, chelatační účinnost dané látky a toxicitě látky. V ideálním případě by lék měl být perorálně účinný, úsporný a vysoce specifický, bez vedlejších účinků. (Kalinowski et al, 2005) Další

18

významnou vlastností chelátoru je, že by měl odstranit pouze přebytečné železo a neovlivňovat homeostázu železa (absorpce, distribuce, utilizace), neinterferovat s enzymy na železu závislými a neodstraňovat důležité ionty kovů (zinek, vápník apod.). (Cohen et al, 2004) Neméně důležité je, aby molekula chelátoru nebyla v organismu rychle metabolizována na nefunkční metabolit bez schopnosti vázat železo. Podaná dávka chelátoru by se pak musela úměrně zvýšit, čímž by se také zvýšilo riziko toxicity. Chelátor musí být přítomen v extracelulární tekutině v určité dostatečné koncentraci (10-25 µM) a musí mít dostatečně dlouhý eliminační poločas. (Hider, 2002)

2.2 Vliv pH na chelataci Schopnost chelátorů vázat železo nezávisí pouze na jeho struktuře, ale může být ovlivněna různými fyzikálně-chemickými podmínkami např. koncentrací vodíkových iontů v okolním prostředí. Hodnota pH také může ovlivnit nejen schopnost chelátoru vázat železo ale také stabilitu komplexu chelátor-železo. (Hrabalíková, 2010) Fyziologicky se nízké pH vyskytuje v lumen lysozomů (pH 4,6 - 5). (Papanikolaou et al, 2005) S nižším pH se může setkat u řady patofyziologických stavů. Vysoké koncentrace vodíkových iontů se nacházejí např. u zánětu (pH pod 5.4), akutní ischémie myokardu (pH pod 5.7) nebo u maligních tumorů. (Steen et al, 2010) Existuje hypotéza, že acidita spolu s hypoxií mohou být jednou z příčin progrese nádoru z benigního na maligní. Bylo prokázáno, že acidita má roli v odolnosti vůči chemoterapii, a také v proliferaci a šíření metastáz. (De Milito et al, 2005) Obecně byly chelatační účinky zkoumány ve většině studií zejména za neutrálního nebo slabě kyselého pH. (Liu et al, 2002)

2.3 Zkoumané chelátory 2.3.1

Deferoxamin (DFO) Deferoxamin (viz Obr. 4 Deferoxamin) je standardní chelátor železa od roku 1970. Jedná se o

šestivazný chelátor, který váže železo pevně a komplex železo-DFO se vylučuje do moči i stolice. (Ellis et al, 2006) Vzniklý chelát má náboj, takže těžko přechází přes membrány buněk. Po orálním podání se špatně absorbuje a jeho plazmatický poločas je krátký (okolo 12 minut) (Brittenham, 1992),

19

z tohoto důvodu vyžaduje časté aplikace. Je možné jej podávát ve formě podkožní infuze přes noc 5 7 nocí / týden. Parenterální podání a každodenní nepříjemnosti při používání infuzní pumpy snižují optimální complience. (Ellis et al, 2006) Deferoxamin účinně udržuje normální nebo téměř normální zásoby železa a intenzivní terapie může zvrátit srdeční onemocnění. Nízká complience s prodlouženým subkutánním podání je hlavním důvodem pro neefektivní léčbu a také je třeba zvážit sluchovou, oční a neurologickou toxicitu. (Ambrosio et al, 1987) Nicméně jeho podávání znamená dramatický pokrok v přežití pacientů s thalassemií. Hydroxyethylškrob

deferoxamin je

vysokomolekulární chelátor, který byl získán na základě vazby polymeru hydroxyethylškrobu a deferoxaminu. Tato molekula má stejnou afinitu k železu jako deferoxamin, ale jeho biologický poločas je 10-30 krát delší. Deferoxamin depot (ICL749B) je nová sůl získaná modifikací deferoxaminu, která má pomalé uvolňování. (Ellis et al, 2006) Komplex deferoxamin – železo je metabolicky neaktivní a tím předchází vzniku ROS. V důsledku toho je deferoxamin schopen snížit oxidační stres v buňkách přetížených železem, zmírnit symptomy onemocnění související s přetížením organismu železem. (Kalinowski et al, 2005)

Obr. 4 Deferoxamin

2.3.2

Deferipron (DRP) Deferipron (viz Obr. 5) je perorální chelátor, který byl poprvé použit u lidí v roce 1987. Deferipron je

dvouvazný chelátor (3 molekuly chelátoru váží jen atom železa). Výhodou této sloučeniny je to, že chelát železo (III)- deferipron nenese žádný náboj, a proto může proniknout snadno membránami, což umožňuje odstranění potenciálně toxického železa z tkání. (Ellis et al, 2006)

20

Deferipron má střední plazmatický poločas 47 - 134 min, a proto musí být podáván třikrát denně perorálně. Hlavní cestou vylučování je moč. Dlouhodobý bezpečnostní profil deferipronu není ještě jasně stanoven. Může účinně odstranit kardiální železo, a může být použit v kombinaci s deferoxaminem. K hlavním nežádoucím účinkům patří agranulocytóza, muskuloskeletální a kloubní bolesti, žaludeční intolerance, a deplece zinku. Riziko agranulocytózy vyžaduje každý týden kompletní krevní diferenciální rozpočet a sérové ALT by měly být měřeny měsíčně po dobu 3 až 6 měsíců a pak každých 6 měsíců.(Ambrosio et al, 1987)

Obr. 5 Deferipron s vyznačenými skupinami (hydroxy- a ketoskupinou), které se podílejí na chelataci železa.

2.3.3

Deferasirox (DFR) Deferasirox (viz Obr. 6 Deferasirox) patří do nové skupiny perorálních trojvazných chelátorů.

S poločasem od 8 do 16 hodin a dávkováním jednou denně umožňuje po celou dobu chelatovat nontransferin navázané volné plazmatické železo. Komplex deferasirox-železo se vylučuje stolicí.(Ellis et al, 2006) Je obvykle dobře snášen, nejčastějšími nežádoucími účinky jsou gastrointestinální poruchy a vyrážka. Několik studií fáze II a rozhodující studie fáze III prokázaly, že účinnost deferasiroxu je u pacientů závislých na transfuzi deferoxaminu podobná. Nedávno uveřjněné roční výsledky z velké prospektivní multicentrické studie EPIC tyto výsledky podporují. V této studii bylo po dobu 1 roku zjištěno, že deferasirox odstraňuje železo z myokardu u pacientů s -thalassemií a myokardiální hemosiderózou. Ejekční frakce levé komory zůstala stabilní po celou dobu studie. Pravidelné hodnocení zátěže železem je nezbytné pro dosažení optimální dávky.(Ambrosio et al, 1987)

21

Obr. 6 Deferasirox s vyznačenými skupinami podílejícími se na chelataci.

2.3.4

/2,6-bis[4(1-fenyl-3-methylpyrazol-5-one)karbonyl]pyridin/ (H2QPyQ) Sloučenina H2QPyQ /2,6-bis[4(1-fenyl-3-methylpyrazol-5-on)karbonyl]pyridin/ (viz Obr. 7

H2QPyQ) patří do skupiny acypyrazolonů, které jsou známými chelátory kovů. H2QPyQ zvyšuje svoje železo-chelatační vlastnosti při klesajícím pH. Zatímco železo-chelatační vlastnosti dříve testovaných látek jsou obecně silnější v neutrální pH, jejich železo- chelatační schopnost klesá s pH. H2QPyQ proto může představovat nový typ selektivního chelátoru železa, který má jen malou železo chelatační aktivitu za fyziologických podmínek a jeho afinita se aktivuje při poklesu pH. Teoreticky může být velmi užitečný v léčbě akutní infarkt myokardu, kdy je železo uvolněno a pH poklesne.(Filipský et al, 2011)

Obr. 7 H2QPyQ

2.4 Chelátory železa – budoucnost Ze skutečnosti, že nádorové buňky vyžadují vysokou hladinu železa k zajištění jejich proliferace vyplývá, že tyto chelátory železa mohou být použity v zájmu klinického výzkumu jako potenciální protinádorové látky. Chelátory železa mohou pomoci předejít rozvoji jaterního karcinomu

22

a případně i omezit šíření nádorových buňek. (Gaboriau et al, 2010) Je rovněž studován vliv železa na stabilitu aterosklerotických plátů. (Liu et al, 2002) Je studován také vliv chelátorů železa na reperfuzi myokardu po ischemii. Výzkumy ukazují, že obnova vysoce energetického fosfátového metabolismu myokardu a kontraktility levé komory po ischemii může bý výrazně zvýšena podáním deferoxaminu během prvních minut reperfuze. To ukazuje na to, že železo hraje klíčovou roli v patogenezi reperfuzního poškození. (Ambrosio et al, 1987)

23

3.

Cíl práce Cílem této práce je stanovení stechiometrického poměru komplexů vybraných chelátorů

s dvojmocným a trojmocným železem při různých patofyziologicky významných pH pomocí standardní Jobovy metodiky.

24

4.

Materiál a pomůcky

4.1 Chemikálie použité pro analýzu Ferrozin

[

disodná

sůl

kyseliny

4,4-(3-(2-pyridinyl)-1,2,4-triazin-5,6-

diyl)bisbenzensulfonové], hexahydrát chloridu železitého (FeCl3.6H2O), tartarát železitý, heptahydrát síranu železnatého (FeSO4.7H2O), hydroxylamin chlorid (HA), HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1piperazinethanesulfonová kyselina), HEPES sodná sůl, kyselina octová a octan sodný byly zakoupeny od Sigma-Aldrich (Německo) a methanol od JT Baker (USA).

4.2 Testované látky Deferasirox byl izolován z tablet Exjade® (Novartis) na Katedře anorganické a organické chemie FaF UK, deferoxamin byl zakoupen od firmy Novartis (Švýcarsko), Deferipron byl poskytnut darem firmou ApoPharma Inc, Apotex, Toronto (Kanada), 2,6-bis[4(1-fenyl-3-methylpyrazol-5on)karbonyl]pyridin /H2QpyQ/ byl syntetizován na univerzitě Camerino (Itálie).

4.3 Použité pufry Všechny použité pufry byly vodné roztoky o koncentraci 15mM. Pufry 4,5 a 5,5 byly acetátové a pufry 6,8 a 7,5 HEPES-pufry.

4.4 Přístrojové vybavení Analytické váhy KERN ALT 220-4NM (Kern, Německo), spektrofotometr HELIOS GAMMA (thermospectronic, Německo), nastavitelné automatické pipety s různým rozsahem – Mikropipeta Biohit Proline mechanická 20 - 200µl, Mikropipeta Biohit Proline mechanická 10 100µl, Mikropipeta Biohit mLINE 500 - 5000µl, Mikropipeta BRAND Transferpipette S 100 1000µl. Dále byl využíván počítačový program VISIONlite Scan (version 2.2. ThermoScientific, Německo).

25

5.

Příprava zásobních roztoků a pracovních roztoků

5.1 Příprava zásobních roztoků Vodné zásobní roztoky železnatých (FeSO4.7H2O) a železitých (FeCl3.6H2O nebo vinan železitý) kationů byly připravovány denně čerstvé v koncentraci 5mM a denně byly kalibrovány. Rozpouštědlem pro zkoušené chelátory železa byl methanol, zásobní roztoky měly koncentraci 5mM.

5.2 Postup kalibrace Fe2+ resp. Fe3+ pro UV-VIS spektrofotometrii (Ferrozinová metoda) (Stookey, 1970) Připravené roztoky chemikálií se napipetovaly do mikrozkumavek podle Tabulka 1 v tomto pořadí: 1. 10 mM hydroxylamin 2. Superčistá voda 3. 5 mM roztok Fe2+ resp Fe3+ soli 4. 5 mM ferrozin Tabulka 1 . Postup pro kalibraci iontů železa objem výsledná

objem

5mM

objem 5mM

koncentrace železa

roztoku Fe soli

roztoku

Objem H2O

10mM roztoku HA ferrozinu

M

μl

Μl

Μl

Μl

100

30

500

500

470

70

21

500

500

479

40

12

500

500

488

26

Absorbance směsi se měřila absorbance při vlnové délce 562 nm oproti destilované vodě. Zaznamenané hodnoty byly vyneseny do grafu, kde rozmezí hodnot konstanty k pro Fe2+ 0.023 - 0.028 dm3.mol-1 resp konstanty k pro vinan železitý 0.018 - 0.022 a FeCl3 0.024 - 0.028

5.3 Postup

stanovení

železo-chelatační

aktivity

spektrofotometricky 5.3.1

Stanovení absorpčního maxima komplexu Komplex s železnatými ionty – při pH 4,5; 5,5 a 6,8 byl měřen vzhledem ke slepému vzorku

obsahujícímu 1000 µl pufru a 500 µl methanolu. Při pH 7.5 byl použit jako pufr 5mM roztok hydroxylaminu v pufru pH 7.5, aby bylo zabráněno oxidaci železnatých iontů na železité. Slepý vzorek byl analogický ostatním pH s výjimkou použití zmíněného modifikovaného pufru. Komplex s železitými ionty – při pH 4.5 a 5.5 bylo měřeno s chloridem železitým vzhledem ke slepému vzorku skládajícímu se z 1000 µl pufru a 500 µl methanolu. Při pH 6.8 a 7.5 bylo měřeno s vinanem železitým a slepé vzorky byly připraveny v čase potřeby z 500 µl metanolu, 150 µl roztoku Fe3+ o koncentraci 5 mM a 850 µl pufru. Do mikrozkumavky byly roztoky pipetovány v daném pořadí: 1. požadované množství methanolu 2. žádané množství roztoku zkoušeného chelátoru 3. žádané množství pufru 4. požadované množství roztoku Fe2+ nebo Fe3+ Obsah mikrozkumavky byl míchán přesně po dobu 3 minut a poté bylo okamžitě změřeno spektrum od 220 do 600 nm.

27

5.4 Princip Jobovy metody Jobova metoda nazývaná také metoda kontinuálních variací je jednoduchý a efektivní přístup k určení stechiometrie chemické reakce. (Job, 1928) Jobova metoda, jak je běžně praktikována, je prováděna v uzavřeném režimu mísením aliquotních množství dvou zásobních roztoků kovu a ligandu (někdy následované ředěním na stanovený objem). Tyto roztoky jsou připraveny tak, aby celková analytická koncentrace kovů (C M) a ligandu (CL) byla udržována konstantní, zatímco poměr ligand : kovu se mění od vzorku ke vzorku, tj.: CM + CL = konst. (Rovnice 1) Absorbance je pak zobrazena v závislosti na molárním poměru ligandu nebo kovu ve směsi. (Zachary et al, 1986) Absorbance je úměrná množství produktu a její maximální hodnota tedy odpovídá hledanému stechiometrickému poměru (Job, 1928)

28

Experimentální část

29

6.

Výsledky:

6.1 Deferoxamin Deferoxamin neabsorbuje v rozmezí vlnových délek od 300 do 500 nm, naopak v této oblasti se nachází absorpční maximum jeho komplexu s železnatými nebo železitými ionty, které bylo při všech testovaných pH při vlnové délce 430 nm.

6.1.1

Deferoxamin - železnaté ionty Při všech patofyziologicky významných pH zahrnutých do analýzy byl zjištěn komplex

deferoxaminu a železnatých iontů s pravděpodobnou stechiometrií 1:1. Na Obr. 8-15 jsou znázorněna absorpční spektra komplexu deferoxamin – Fe2+ při daných pH včetně grafické analýzy stechiometrických komplexů.

Obr. 8 Absorbance komplexu deferoxamin-Fe2+ při pH 4,5 při měnícím se koncentračním poměru železa a deferoxaminu. Konstantní souhrnná koncentrace obou složek byla 0,5 mM. Z měření jednoznačně vyplývá, že nejvyšší absorbance a tedy nejvíce produktu se vytvořilo při poměru

30

deferoxaminu a železnatých iontů 1:1 (zelená křivka). Pro porovnání je zobrazena i absorbance čistého deferoxaminu v koncentraci 50µM (růžová křívka). Shrnutí tohoto měření je v Obr. 9.

Obr. 9 Výsledné zobrazení Jobovy metody pro komplex deferoxamin – železnaté ionty při pH 4.5. Absorbance byla odečtena při vlnové délce 430 nm z naměřených spekter (Obr. 8)

Obr. 10 Absorbance komplexu deferoxamin-Fe2+ při pH 5,5 při měnícím se koncentračním poměru železa a deferoxaminu. Konstantní souhrnná koncentrace obou složek byla 0,5 mM. Z měření jednoznačně vyplývá, že nejvyšší absorbance a tedy nejvíce produktu se vytvořilo při poměru

31

deferoxaminu a železnatých iontů 1:1 (růžová křivka). Pro porovnání je zobrazena i absorbance čistého deferoxaminu 20µM. (oranžová křivka). Shrnutí tohoto měření je v Obr. 11.

Obr. 11 Výsledné zobrazení Jobovy metody pro komplex deferoxamin – železnaté ionty při pH 5.5. Absorbance byla odečtena při vlnové délce 430 nm z naměřených spekter (Obr. 10)

Obr. 12 Absorbance komplexu deferoxamin-Fe2+ při pH 6,8 při měnícím se koncentračním poměru železa a deferoxaminu. Konstantní souhrnná koncentrace obou složek byla 0,5 mM. Z měření jednoznačně vyplývá, že nejvyšší absorbance a tedy nejvíce produktu se vytvořilo při poměru

32

deferoxaminu a železnatých iontů 1:1 (okrová křivka). Pro porovnání je zobrazena i absorbance čistého deferoxaminu 50µM (světle modrá křívka). Shrnutí tohoto měření je v Obr. 13.

Obr. 13 Výsledné zobrazení Jobovy metody pro komplex deferoxamin – železnaté ionty při pH 6,8. Absorbance byla odečtena při vlnové délce 430 nm z naměřených spekter (Obr. 12). Z grafu je vidět, že se tvoří komplex se stechiometrií 1:1.

Obr. 14 Absorbance komplexu deferoxamin-Fe2+ při pH 7,5 při měnícím se koncentračním poměru železa a deferoxaminu. Konstantní souhrnná koncentrace obou složek byla 0,5 mM. Z měření jednoznačně vyplývá, že nejvyšší absorbance a tedy nejvíce produktu se vytvořilo při poměru

33

deferoxaminu a železnatých iontů 1:1 (růžová křivka). Pro porovnání je zobrazena i absorbance čistého deferoxaminu o koncentraci 20µM. (černá křívka). Shrnutí tohoto měření je v Obr. 15.

Obr. 15 Výsledné zobrazení Jobovy metody pro komplex deferoxamin – železnaté ionty při pH 7.5. Absorbance byla odečtena při vlnové délce 430 nm z naměřených spekter (Obr. 14). Graf jasně ukazuje, že se tvoří komplex se stechiometrií 1:1.

6.1.2

Deferoxamin - železité ionty Při zjišťování stechiometrie komplexu s železitými ionty ukázala Jobova metoda paradoxně

při většině testovaných pH na nepravděpodobnou stechiometrii komplexu deferoxamin:železité ionty 3:4 (poměr deferoxaminu k železu 0,75:1) viz Obr. 17, Obr. 21 a Obr. 23, pouze při pH 5.5 byl jednoznačně prokázán poměr 1:1 (Obr. 19). Změřená absorpční spektra jsou na Obr. 16, Obr. 18, Obr.20 a Obr. 22

34

Obr. 16 Absorbance komplexu deferoxamin-Fe3+ při pH 4,5 při měnícím se koncentračním poměru železa a deferoxaminu. Konstantní souhrnná koncentrace obou složek byla 0,5 mM. Z měření jednoznačně vyplývá, že nejvyšší absorbance a tedy nejvíce produktu se vytvořilo při poměru deferoxaminu a železitých iontů 0,75:1 (okrová křivka). Pro porovnání je zobrazena i absorbance čistého deferoxaminu o koncentraci 50 µM. (růžová křívka). Shrnutí tohoto měření je v Obr. 17.

Obr. 17 Výsledné zobrazení Jobovy metody pro komplex deferoxamin – železité ionty při pH 4,5. Absorbance byla odečtena při vlnové délce 430 nm z naměřených spekter (Obr. 16). Podle grafu se vyváří komplex se stechiometrií 0,75:1.

35

Obr. 18 Absorbance komplexu deferoxamin-Fe3+ při pH 5,5 při měnícím se koncentračním poměru železa a deferoxaminu. Konstantní souhrná koncentrace obou složek byla 0,5 mM. Z měření jednoznačně vyplývá, že nejvyšší absorbance a tedy nejvíce produktu se vytvořilo při poměru deferoxaminu a železitých iontů 1:1 (růžová křivka). Pro porovnání je zobrazena i absorbance čistého deferoxaminu o koncentraci 20 µM. (černá křívka). Shrnutí tohoto měření je v Obr. 19.

Obr. 19 Výsledné zobrazení Jobovy metody pro komplex deferoxamin – železité ionty při pH 5.5. Absorbance byla odečtena při vlnové délce 430 nm z naměřených spekter (Obr. 18). Z grafu je praděpodobné, že se vytváří komplex se stechiometrií 1:1.

36

Obr. 20 Absorbance komplexu deferoxamin-Fe3+ při pH 6,8 při měnícím se koncentračním poměru železa a deferoxaminu. Konstantní souhrnná koncentrace obou složek byla 0,5 mM. Z měření jednoznačně vyplývá, že nejvyšší absorbance a tedy nejvíce produktu se vytvořilo při poměru deferoxaminu a železitých iontů 0,75:1 (růžová křivka) a 1:1 (světle modrá křivka). Pro porovnání je zobrazena i absorbance čistého deferoxaminu o koncentraci 50 µM. (zelená křívka). Shrnutí tohoto měření je v Obr. 21.

Obr. 21 Výsledné zobrazení Jobovy metody pro komplex deferoxamin – železité ionty při pH 6,8. Absorbance byla odečtena při vlnové délce 430 nm. K vyhodnocení bylo provedeno více měření, jedno meření je zobrazeno v Obr. 20). Graf ukazuje na komplex se stechiometrií 0,75:1.

37

Obr. 22. Absorbance komplexu deferoxamin-Fe3+ při pH 7,5 při měnícím se koncentračním poměru železa a deferoxaminu. Konstantní souhrnná koncentrace obou složek byla 0,5 mM. Z měření jednoznačně vyplývá, že nejvyšší absorbance a tedy nejvíce produktu se vytvořilo při poměru deferoxaminu a železitých iontů 0,75:1 (zelená křivka). Pro porovnání je zobrazena i absorbance čistého deferoxaminu o koncentraci 20 µM. (světle hnědá křívka). Shrnutí tohoto měření je v Obr. 23.

Obr. 23 Výsledné zobrazení Jobovy metody pro komplex deferoxamin – železité ionty při pH 7.5. Absorbance byla odečtena při vlnové délce 430 nm z naměřených spekter (Obr. 22). Podle grafu se tvoří komplex se stechiometrií 0,75:1.

38

6.2 H2QpyQ H2QPyQ absorbuje v měřené oblasti při pH 4,5 a 5,5 při 237 nm a při pH 6,8 a7,5 při 234nm.

6.2.1

H2QpyQ - železnaté ionty Při hledání absorpčních maxim komplexů této látky s železnatými ionty nebyl nalezen

významný a jednoznačný posun spektra čisté sloučeniny u žádného z testovaných pH (4,5, 5,5 a 7,5) – Obr. 25 až Obr.28. Při pH 6.8 byl sice nalezen posun spekter, ale tento posun (Obr.26) už nebyl pozorován při měření Jobovou metodou (Obr.27). H2QpyQ má při tomto pH určitou afinitu k železu, ale komplex se tvořil pouze při vysoké koncentraci železnatých iontů a nebylo tedy možné stanovit stechiometrický poměr.

Obr. 24 Absorpční křivky H2QpyQ a jeho směsi s železnatými ionty při pH 4,5. Zelená a růžová křivka odpovídá čisté látce v koncentracích 60 µM a 40 µM. Modrá a červená křivka odpovídá Fe2+ a H2QPyQ v koncentracích 250µM a 25 µM resp. 41,7 µM ( poměr 1:10, resp. 1:6). Z porovnání daných spekter není patrný vznik dalšího absorpční maxima v případě směsi s železnatými ionty. Je pravděpodobné, že nevzniká komplex nebo vzniká jen v omezeném množství.

39

Obr. 25 Absorpční křivky H2QPyQ a jeho směsi s železnatými ionty při pH 5,5. Červená křivka odpovídá H2QPyQ a Fe2+ v koncentracích 41,7 µM a 250 µM ( poměr 1:6), růžová a modrá křivka odpovídá čisté látce v koncentracích 40 µM a 20 µM, respektive. Z porovnání daných spekter není patrný vznik dalšího absorpční maxima v případě směsi s železnatými ionty. Podobně jako v případě pH 4.5 nebyl komplex s železnatými ionty touto metodou prokázán.

Obr. 26 Absorpční křivky H2QPyQ a jeho směsi s železnatými ionty při pH 6,8. Červená a tmavě modrá křivka odpovídá čisté látce v koncentraci 60 µM a 40 µM, , růžová a světle modrá křivka odpovídá Fe2+ aH2QPyQ v koncentracích 250 µM 41,7 µM a resp. 33,3 µM ( poměr 1:6 a 1:7,5). Z

40

porovnání daných spekter je patrný posun absorpčních maxim v případě směsi s železnatými ionty. Vzhledem k výsledku bylo provedeno také měření Jobovou metodou(Obr.27 )

Obr. 27 Absorpční spektra směsi H2QPyQ – Fe2+ při pH 6,8 při měnícím se koncentračním poměru železa a testované látky. Konstantní souhrnná koncentrace obou složek byla 0,5 mM. Při tomto měření ale nebyly nalezeny píky odpovídající absorbanci komplexu (tj. při 250 a 290 nm). Naopak píky odpovídaly čisté sloučenině, což je zřetelné i z oranžové křivky (čistá látka H2QPyQ o koncentraci 40 M).

Obr. 28 Absorpční křivky H2QPyQ a jeho směsi s železnatými ionty při pH 7,5. Růžová křivka odpovídá čisté látce o koncentraci 20 µM a zelená křivka odpovídá koncentraci 40 µM.

41

Červená křivka představuje H2QPyQ a Fe2+ v koncentracích 250 µM a 41,7 µM ( poměr 1:6). Z porovnání daných spekter není patrný vznik dalšího absorpční maxima v případě směsi s železnatými ionty. Podobně jako v případě pH 4.5 nebyl komplex s železnatými ionty touto metodou prokázán.

6.2.2

H2QPyQ – železité ionty Bylo zjištěno, že H2QPyQ tvoří komplex s železitými ionty pouze při pH 4,5 a pH 5,5, kdy

byl po přídavku železitých iontů zaznamenám posun absorpčního maxima z 237 nm na 308 nm při pH 4,5 resp. na 287 při pH 5,5 (Obr. 29 a Obr. 32). Pravděpodobnou stechiometrii komplexu se ale Jobovou metodou nepodařilo při pH 4.5 přesně určit (Obr.31), při pH 5,5 se tvoří komplex 2:1 (Obr.34). Při pH 6,8 došlo k mírnému posunu absorpčního spektra, pravděpodobně má látka při tomto pH nižší afinitu k železitým iontům než při kyselejších pH (Obr.35). Při pH 7.5 se pravděpodobně komplex netvoří, k žádnému posunu absorpčních spekter totiž v tomto případě nedošlo. (Obr. 36)

Obr. 29 Absorpční křivky samotného H2QPyQ a jeho směsi s železitými ionty při pH 4,5. Červená a tmavě modrá křivka odpovídá čisté látce v koncentracích 60 µM a 40 µM. Růžová představuje H2QpyQ a Fe3+ v koncentracích 83.3 µM a 500 µM (poměr 1:6) a světle modrá křivka

42

H2QpyQ a Fe3+ v koncentracích 50 µM a 500 µM (poměr 1:10). Z porovnání daných spekter je patrný vznik dalšího absorpční maxima v případě směsi s železitými ionty.

Obr. 30 Absorbance komplexu H2QPyQ – Fe3+ při pH 4,5 při měnícím se koncentračním poměru železa a H2QPyQ. Konstantní souhrná koncentrace obou složek byla 0,04 mM. Shrnutí tohoto měření je v Obr. 31.

Obr. 31 Výsledné zobrazení Jobovy metody pro komplex H2QPyQ – železité ionty při pH 4.5. Absorbance byla odečtena při vlnové délce 308 nm z naměřených spekter (Obr. 30). Přesnou stechiometrii nelze přesně z naměřených dat určit.

43

Obr. 32 Absorpční křivky samotného H2QPyQ a jeho směsi s železitými ionty při pH 5,5. Červená a zelená křivka odpovídá čisté látce v koncentracích 60 µM a 20 µM. Růžová představuje

H2QPyQ a Fe3+ v koncentracích 41,7 µM a 250 µM (poměr 1:6) a světle modrá křivka H2QPyQ a Fe3+ v koncentracích 25 µM a 250 µM (poměr 1:10). Z porovnání daných spekter je patrný vznik dalšího absorpční maxima v případě směsi s železitými ionty.

Obr. 33 Absorbance komplexu H2QPyQ – Fe3+ při pH 5,5 při měnícím se koncentračním poměru železa a deferoxaminu. Konstantní souhrná koncentrace obou složek byla 0,04 mM. Shrnutí tohoto měření je v Obr. 34.

44

Obr. 34 Výsledné zobrazení Jobovy metody pro komplex H2QPyQ – železité ionty při pH 5,5. Absorbance byla odečtena při vlnové délce 287 nm z naměřených spekter (Obr. 33). Pravděpodobná stechiometrie komplexu je tedy 2:1, pyrazolon:železité ionty.

Obr. 35. Absorpční křivky H2QPyQ a jeho směsi s železitými ionty při pH 6,8. Zelená křivka odpovídá čisté látce o koncentraci 20 µM a červená křivka odpovídá koncentraci 40 µM. Růžová křivka představuje H2QPyQ a Fe3+ v koncentracích 41,7 µM a 250 µM (poměr 1:6) a světle modrá H2QPyQ a Fe3+ v koncentracích 25 µM a 250 µM (poměr 1:10). Z porovnání daných spekter je patrný určitý posun spektra čisté látky z 235 nm na 250 nm. Látka má asi určitou afinitu k železitým iontům i při tomto pH.

45

Obr. 36 Absorpční křivky H2QPyQ a jeho směsi s železitými ionty při pH 7,5. Zelená křivka odpovídá čisté látce o koncentraci 20 µM a červená křivka odpovídá koncentraci 60 µM. Růžová křivka představuje H2QPyQ a Fe3+ v koncentracích 41,7 µM a 250 µM (poměr 1:6) a světle modrá H2QPyQ a Fe3+ v koncentracích 25 µM a 250 µM (poměr 1:10). Spektra čisté látky a její směsi s železitými ionty jsou prakticky identické, při tomto pH se tedy komplex s vysokou pravděpodobností netvoří nebo jen v malém množství.

6.3 Deferipron Samotný deferipron vykázal v měřené oblasti dvě absorpční maxima 223nm a 280 nm. Při všech pH byl zřetelný posun absorpčního maxima po přidání iontů železa.

6.3.1

Deferipron železnaté iony Při všech patofyziologicky významných pH zahrnutých do analýzy byl zjištěn komplex

deferipronu a železnatých iontů s pravděpodobnou stechiometrií 3:1. Výjimkou je pH 4.5 u železnatých iontů, kdy tato metoda selhala. Byl sice zjištěn jednoznačný posun spektra samotného deferipronu (Obr.37) ale nebylo tedy možné přesně určit stechiometrický poměr pravděpodobně z důvodu nízké afinity látky k železnatých iontům při tomto pH (Obr.38 a 39). Obr. 40-45 jsou

46

detailním zobrazením spekter změřených principem Jobovy metodiky a analýzou stechiometrického poměru při pH 4.5-7.5.

Obr. 37. Absorpční křivky deferipronu a železnatých iontů při pH 4.5 Červená a modrá křivka odpovídá čistému deferipronu v koncentracích 20 µM a 40 µM, růžová křivka představuje deferipron a Fe2+v poměru 15:1, šedá křivka poměr 6:1 a hnědá křivka poměr 7,5:1. Z porovnání daných spekter není patrný výrazný posun absorpční maxima v případě směsi s železnatými ionty. Komplex s železnatými ionty nebyl touto metodou prokázán.

Obr. 38 Absorbance komplexu deferipron-Fe2+ při pH 4,5 při měnícím se koncentračním poměru železa a deferipronu. Konstantní souhrnná koncentrace obou složek byla 0,5 mM. Pro porovnání je zobrazena i absorpční křivka čistého deferipronu (černá) o koncentraci 60µM.

47

Obr. 39 Výsledné zobrazení Jobovy metody pro komplex deferipron – železnaté ionty při pH 4,5. Absorbance byla odečtena při vlnové délce 285 nm z naměřených spekter (Obr. 38). Ze získaného spektra nelze s jistotou určit přesnou stechiometrii komplexu.

Obr. 40 Absorbance komplexu deferipron-Fe2+ při pH 5,5 při měnícím se koncentračním poměru železa a deferipronu. Konstantní souhrnná koncentrace obou složek byla 0,5 mM. Pro porovnání je zobrazena i absorpční křivka čistého deferipronu (světle modrá) o koncentraci 50µM.

48

Obr. 41 Výsledné zobrazení Jobovy metody pro komplex deferipron – železnaté ionty při pH 5,5. Absorbance byla odečtena při vlnové délce 289 nm z naměřených spekter (Obr. 40). Jobovou metodou byla zjištěna stechiometrie komplexu 3:1.

Obr. 42 Absorbance komplexu deferipron-Fe2+ při pH 6,8 při měnícím se koncentračním poměru železa a deferipronu. Konstantní souhrnná koncentrace obou složek byla 0,5 mM. Pro porovnání je zobrazena i absorpční křivka čistého deferipronu (červená) o koncentraci 50 µM.

49

Obr. 43 Výsledné zobrazení Jobovy metody pro komplex deferipron – železnaté ionty při pH 6,8. Absorbance byla odečtena při vlnové délce 291,5 nm z naměřených spekter (Obr. 42). Je zde zřetelné, že od poměru 3:1 už absorbance dále nestoupá a výsledný komplex má tedy stejnou stechiometrii.

Obr. 44 Absorbance komplexu deferipron-Fe2+ při pH 7,5 při měnícím se koncentračním poměru železa a deferipronu. Konstantní souhrnná koncentrace obou složek byla 0,5 mM. Pro porovnání je zobrazena i absorpční křivka čistého deferipronu (růžová) o koncentraci 60 µM.

50

Obr. 45 Výsledné zobrazení Jobovy metody pro komplex deferipron – železnaté ionty při pH 7,5. Absorbance byla odečtena při vlnové délce 290 nm z naměřených spekter (Obr. 44). Jako u pH 6,8 absorbance prudce stoupá až do poměru 3:1 a pak už dále nestoupá. Výsledný poměr je tedy 3:1.

6.3.2

Deferipron železité ionty Při všech patofyziologicky významných pH zahrnutých do analýzy byl zjištěn komplex

deferipronu železitých iontů s pravděpodobnou stechiometrií 3:1 Obr 47 – 52 jsou detailním zobrazením spekter měřených Jobovou metodikou a následné analýzy výsledného poměru.

Obr. 46 Absorbance komplexu deferipron-Fe3+ při pH 4,5 při měnícím se koncentračním poměru železa a deferipronu. Konstantní souhrnná koncentrace obou složek byla 0,5 mM. Pro porovnání je zobrazena i absorpční křivka čistého deferipronu (růžová) o koncentraci 60 µM.

51

Obr. 47 Výsledné zobrazení Jobovy metody pro komplex Deferipron – železité ionty při pH 4,5. Absorbance byla odečtena při vlnové délce 288 nm z naměřených spekter (Obr. 46). Od poměru 3:1 již křivka miminálně stoupá – opět tento graf ukazuje na stechiometrii 3:1.

Obr. 48 Absorbance komplexu deferipron-Fe3+ při pH 5,5 při měnícím se koncentračním poměru železa a deferipronu. Konstantní souhrnná koncentrace obou složek byla 0,5 mM. Pro porovnání je zobrazena i absorpční křivka čistého deferipronu (růžová) o koncentraci 60 µM.

52

Obr. 49 Výsledné zobrazení Jobovy metody pro komplex deferipron – železité ionty při pH 5,5. Absorbance byla odečtena při vlnové délce 285 nm z naměřených spekter (Obr. 48). Při poměru 3:1 je zřetelný přechod křivek, výsledný poměr je 3:1.

Obr. 50 Absorbance komplexu deferipron-Fe3+ při pH 6,8 při měnícím se koncentračním poměru železa a deferipronu. Konstantní souhrná koncentrace obou složek byla 0,5 mM. Pro porovnání je zobrazena i absorpční křivka čistého deferipronu (červená) o koncentraci 60 µM.

53

Obr. 51 Výsledné zobrazení Jobovy metody pro komplex deferipron – železité ionty při pH 6,8. Absorbance byla odečtena při vlnové délce 292 nm z naměřených spekter (Obr. 50). Jak je z grafu zřejmé absorbance prudce stoupá až do poměru 3:1 a už dále nesoupá. Výsledný poměr je tedy 3:1.

Obr. 52 Absorbance komplexu deferipron-Fe3+ při pH 7,5 při měnícím se koncentračním poměru železa a deferipronu. Konstantní souhrná koncentrace obou složek byla

0,5 mM. Pro

porovnání je zobrazena i absorpční křivka čistého deferipronu (červená) o koncentraci 60 µM.

54

Obr. 53 Výsledné zobrazení Jobovy metody pro komplex Deferipron – železité ionty při pH 7,5. Absorbance byla odečtena při vlnové délce 291,5 nm z naměřených spekter (Obr. 52). Absorbance stoupá až k poměru 3:1 a pak se stoupání zastaví. Výsledný poměr je tedy 3:1.

6.4 Deferasirox Deferasrox absorbuje v měřené oblasti při 246 nm. Při měření absorpčních maxim komplexů s železnatými nebo železitými ionty byl znatelný posun absorpčního maxima, pouze při měření komplexu s železnatými ionty při pH 4,5 byl posun velmi malý.

6.4.1

Deferasirox železnaté ionty Při všech patofyziologicky významných pH zahrnutých do analýzy byl zjištěn komplex

deferasiroxu a železnatých iontů s pravděpodobnou stechiometrií 2:1 (Obr.55 - Obr. 60). Kromě komplexu deferasiroxu s železnatými ionty při pH 4,5 kde nebyl významný posun absorpčního maxima (Obr. 54).

55

Obr. 54 Absorpční křivky deferasiroxu a jeho směsi s železnatými ionty při pH 4,5. Žlutá respektive růžová křivka znázorňují čistý deferasirox v koncentracích 20 µM a 60 µM. Zelená a červená křivka znázorňují komplex deferasiroxu a Fe2+ v koncentracích 50 µM a 500 µM (poměr 1:10) resp. 83,3 µM a 500 µM (poměr 1:6). Z grafu není zřetelný posun absorpčních maxim testované látky po přidání deferasiroxu.

Obr. 55 Absorbance komplexu deferasirox-Fe2+ při pH 5,5 při měnícím se koncentračním poměru železa a deferasiroxu. Konstantní souhrnná koncentrace obou složek byla 40 µM. Pro porovnání je zobrazena i absorpční spektrum čistého deferasiroxu (světle modrá křivka) v koncentraci 40 µM.

56

Obr. 56 Výsledné zobrazení Jobovy metody pro komplex deferasirox – železnaté ionty při pH 5,5. Absorbance byla odečtena při vlnové délce 309,5 nm z naměřených spekter (Obr. 55). Z grafu vyplývá komplex se stechiometrií 2:1.

Obr. 57 Absorbance komplexu deferasirox-Fe2+ při pH 6,8 při měnícím se koncentračním poměru železa a deferasiroxu. Konstantní souhrnná koncentrace obou složek byla 0,02 mM. Pro porovnání je zobrazena i absorpční spektrum čistého deferasiroxu (světle modrá křivka) v koncentraci 30 µM.

57

Obr. 58 Výsledné zobrazení Jobovy metody pro komplex deferasirox – železnaté ionty při pH 6,8. Absorbance byla odečtena při vlnové délce 306,5 nm z naměřených spekter (Obr. 57). Z grafu je jasně vidět, že se tvoří komplex se stechiometrií 2:1.

Obr. 59 Absorbance komplexu deferasirox-Fe2+ při pH 7,5 při měnícím se koncentračním poměru železa a deferasiroxu. Konstantní souhrnná koncentrace obou složek byla 40 µM mM. Pro porovnání je zobrazena i absorpční spektrum čistého deferasiroxu (růžová křivka) v koncentraci 40 µM.

58

Obr. 60 Výsledné zobrazení Jobovy metody pro komplex deferasirox – železnaté ionty při pH 7,5. Absorbance byla odečtena při vlnové délce 306,5 nm z naměřených spekter (Obr. 59). Dle grafu je jasně vidět, že se tvoří komplex 2:1.

6.4.2

Deferasirox železité ionty Při pH 4.5 byl nalezen stechiometrický poměr komplex deferasirox - železité ionty 1:1.(Obr.

62) při vyšších pH zahrnutých do analýzy byla zjištěna pravděpodobná stechiometrie 2:1 ( Obr. 64, Obr. 66, Obr. 68). Naměřená spektra komplexu deferasirox-železité ionty jsou pro jednotlivá pH zobrazena na Obr. 61, Obr. 63, Obr. 65 a Obr. 67.

Obr. 61 Absorbance komplexu deferasirox-Fe3+ při pH 4,5 při měnícím se koncentračním poměru železa a deferasiroxu. Konstantní souhrnná koncentrace obou složek byla 40 µM. Pro porovnání je zobrazena i absorpční spektrum čistého deferasiroxu (šedá křivka) v koncentraci 30 µM.

59

Obr. 62 Výsledné zobrazení Jobovy metody pro komplex deferasirox – železité ionty při pH 4,5. Absorbance byla odečtena při vlnové délce 311 nm z naměřených spekter (Obr. 61). Z grafu vyplývá komplex s pravděpodobnou stechiometrií 1:1.

Obr. 63 Absorbance komplexu deferasirox-Fe3+ při pH 5,5 při měnícím se koncentračním poměru železa a deferasiroxu. Konstantní souhrnná koncentrace obou složek byla 40 µM. Pro porovnání je zobrazena i absorpční spektrum čistého deferasiroxu (hnědá křivka) v koncentraci 30 µM.

60

Obr. 64 Výsledné zobrazení Jobovy metody pro komplex deferasirox – železité ionty při pH 5,5. Absorbance byla odečtena při vlnové délce 306,5 nm z naměřených spekter (Obr. 63). Z grafu vyplývá, že největší absorbanci pravděpodobně má komplex 2:1.

Obr. 65 Absorbance komplexu deferasirox-Fe3+ při pH 6,8 při měnícím se koncentračním poměru železa a deferasiroxu. Konstantní souhrnná koncentrace obou složek byla 40 µM. Pro porovnání je zobrazena i absorpční spektrum čistého deferasiroxu (černá křivka) v koncentraci 30 µM.

61

Obr. 66 Výsledné zobrazení Jobovy metody pro komplex deferasirox – železité ionty při pH 6,8. Absorbance byla odečtena při vlnové délce 309 nm z naměřených spekter (Obr. 65). Z grafu vyplývá, že se tvoří komplex se stechiometrií 2:1.

Obr. 67 Absorbance komplexu deferasirox-Fe3+ při pH 7,5 při měnícím se koncentračním poměru železa a deferasiroxu. Konstantní souhrnná koncentrace obou složek byla 40 µM. Pro porovnání je zobrazena i absorpční spektrum čistého deferasiroxu (hnědá křivka) v koncentraci 30 µM.

62

Obr. 68 Výsledné zobrazení Jobovy metody pro komplex deferasirox – železité ionty při pH 7,5. Absorbance byla odečtena při vlnové délce 309 nm z naměřených spekter (Obr. 67). Po proložení křivek body na grafu vyplývá, že se tvoří komplex se stechiometrií 2:1.

63

7.

Diskuze Na schopnost chelátorů vázat železo může mít vliv řada faktorů. Jedním z nich je vliv pH

prostředí. Při různých patologických stavech se v organismu může změnit pH prostředí a tím může být ovlivněna i chelatace železa. Takové změny pH nastávají např. při zánětu, akutní ischemii myokardu (Steen et al, 2010) nebo u maligních tumorů, kde změna pH může hrát roli při rezistenci na chemoterapii. (De Milito et al, 2005) Standartní chelátor deferoxamin tvořil komplexy v poměru 1:1 s železitými ionty u všech zkoumaných pH což odpovídá i nalezeným poměrům v literatuře. (Kalinowski et al, 2005) S železnatými ionty byl tento poměr nalezen jen při pH 5,5. U ostatních pH však Jobova metoda nalezla nepravděpodobný poměr 3:4. Tento nález se nedá s jistotou vysvětlit. Stechiometrický poměr komplexu chelátor – železo byl stanoven v této práci pomocí standardní Jobovy metody neboli metody kontinuálních variací. Tato metoda vychází z předpokladu, že pokud připravíme několik vzorků, kde bude součet koncentrací dvou látek tvořících komplex konstantní ale jejich vzájemný poměr se bude měnit, pak maximální množství komplexu se vyskytuje právě při jejich stechiometrickém poměru (Job, 1928). Vzhledem k nestabilitě železa byl každý den připraven čerstvý roztok železa a zkalibrován pomocí specifického indikátoru železnatých iontů ferrozinu. Koncentrace železitých iontů byla stanovena nepřímo po jejich redukci na železnaté ionty prostřednictvím redukčního činidla hydroxylaminu a následném stanovení ferrozinem. (Stookey, 1970) S ohledem na nízkou rozpustnost většiny železitých solí byl použit vinan železitý, který se v naších experimentech při pH 6.8 a 7.5 i díky vyšší rozpustnosti osvědčil. Je možné, že mohl tyto experimenty ovlivnit. Není to ale pravděpodobné: 1) kromě těchto pH byl tento poměr nalezen i při pH 4.5, kdy byl použit chlorid železitý a při tomto pH jsou železité ionty dobře rozpustné 2) při použité stejné soli byly nalezeny ve shodě s literaturou stechiometické poměry pro deferasirox a deferipron (viz dále). Na druhé straně je možné, že při stanovování vyšších stechiometrických poměrů (2:1 a 3:1) je vliv použité železité soli nižší.

64

Chelátor deferipron s železnatými ionty tvoří komplexy v poměru 3:1 u všech testovaných pH kromě pH 4,5, kde nebylo možné určit stechiometrii. S železitými ionty tvoří deferipron komplex v poměru 3:1 u všech testovaných pH. Tyto výsledky odpovídají i dostupným údajům z literatury (Tam et al, 2003), které prokázaly, že deferipron koordinuje atom železa keto- a fenolovou skupinou(Obr. 5). K obsazení všech šesti koordinačních míst železa jsou tedy potřeba tři molekuly deferipronu. (Gaboriau et al, 2010) Deferasirox tvořil s železnatými ionty komplexy v poměru 2:1 u pH 5,5; 6,8 a 7,5. U pH 4,5 byl jen nevýznamný posun absorpčního maxima. S železitými ionty tvoří při pH 4.5 komplex se stechiometrií 1:1, při ostatních testovaných vyšších pH komplex se stechiometrií 2:1. Tyto výsledky potvrzují, že jde o trojvazný ligand, který tvoří komplexy v poměru 2:1. (SPC Exjade)Na těchto vazbách se podílejí 2 fenolové skupiny a jeden z triazolových dusíků (Obr. 6).(Gaboriau et al, 2010) Vzhledem k tomu, že při nižším pH tvoří komplex 1:1 v případě železitých iontů nebo má jen slabou afinitu k železnatým iontům, je pravděpodobné, že tento chelátor bude při těchto podmínkách neúčinný nebo dokonce jeho komplex 1:1 může být nestabilní a případně se i účastnit redoxních reakcí. Toto bude ale muset být potvzeno dalšími studiemi. Poslední zkoumanou látkou byl chelátor H2QpyQ. Tato látka nebyla ještě důkladně zanalyzována ale první studie ukazují na její zajímavý potenciál chelatovat železo při nižším pH a naopak menší chelatační potenciál při neutrálním pH. (Filipský et al, 2011) To je dobře patrné i z výsledků této studie, kdy se při pH 5.5 tvořil komplex 2:1 s železitými ionty. Při pH 6,8 byl pozorován mírný posun absorpčního maxima, pravděpodobně má sloučenina při tomto pH nížší afinitu k železitým iontům. Při pH 7,5 se komplex netvořil vůbec. Komplex s železitými ionty při pH 5,5 se stechiometickým poměrem 2:1 byl potvzen výsledky práce Filipský a kol., 2011. Na první pohled může být překvapující, že ve zmíněné práci byl pozorován podobný trend i s železnatými ionty. Při stanovení stechiometrie komplexu toto nebylo v této práci pozorováno. Je to pravdpodobně v důsledku faktu, že afinita této látky k železnatým iontům sice také klesá se zvyšujícím se pH, ale i při nízkém pH je relativně nízká.

65

8.

Závěr Byla určována stechiometrie komplexů různých vybraných chelátorů železa s železnatými a

železitými ionty za různých patofyziologicky významných pH podle Jobovy metody. Ve většině případů dokázala určit přesnou stechiometrii. V některých vyjímečných případech byly výsledky nepravděpodobné. Z testovaných látek deferoxamin tvoří s železnatými ionty při všech testovaných pH komplex se stechiomerií 1:1. S železitými ionty pouze při pH 4,5 tvoří komplex v poměru 1:1. U ostatních pH metoda nalezla nepravděpodobný poměr 3:4(0,75:1). Další testovanou látkou byla sloučenina H2QPyQ. Jobova metoda zjistila, že tato látka netvoří komplexy s železnatými ionty nebo má k těmto iontům nižší afinitu. S železitými ionty tvoří při pH 5,5 komplex 2:1. Při pH 4,5 se komplex také vytváří, ale danou metodou se nepodařilo určit přesnou stechiometrii. Při vyšších pH má tato látka k železitým iontům nizkou afinitu. U sloučeniny deferipron Jobova metoda nalezla stechiometrický poměr komplexu s železnatými a železitými ionty 3:1 u všech testovaných pH kromě pH 4,5, kde nebylo možné v případě železnatých iontů určit stechiometrii. Deferasirox tvořil při pH 5.5 až 7.5 komplexy s železnatými nebo železitými ionty vždy v poměru 2:1, při pH 4.5 byl tento poměr v případě železitých iontů 1:1, pro železnaté ionty má tato látka při tomto pH nižší afinitu a nebylo tedy možné určit stechiometrický poměr. Z naměřených výsledků vyplývá, že změny pH mohou ovlivnit chelataci.

66

9.

Literatura Monografie a odborné publikace Aisen, P., Enns, C., Wessling-Resnick, M. Chemistry and biology of eucaryotic iron

metabolism. Int. J. Biochem. Cell Biol., 2001, 33, 10, s. 940–959. Ambrosio G, Zweier JL, Jacobus WE, Weisfeldt ML, Flaherty JT, Improvement of postischemic myocardial function and metabolism induced by administration of deferoxamine at the time of reflow: the role of iron in the pathogenesis of reperfusion injury, Circulation 1987, 76: s.906915 Andrews N. C., Disorders of iron metabolism, The New England Journal of Medicine, 1999, s. 1986-1995 Brittenham G M. Development of iron-chelating agents for clinical use. Blood. 1992; 80(3): s. 569–574. Cohen AR, Galanello R, Pennell DJ, Cunningham MJ and Vichinsky E. Thalassemia. Hematol. 2004, s. 14-34 De Milito A, Fais S. Tumor acidity, chemoresistance and proton pump inhibitors. Future Oncol. 2005;1(6): s. 779-86. Ellis J. Neufeld, Oral chelators deferasirox and deferiprone for transfusional iron overload in thalassemia major: new data, new questions, Blood 2006 107: s. 3436-3441, Filipský T., et al., In vitro characteristics of 1-phenyl-3-methyl-4-acylpyrazol-5-ones iron chelators, Biochemie (2011), s. 1-7 G. Peslova et al. Hepcidin, the hormone of iron metabolism, is bound specifically to -2macroglobulin in blood, Blood, 2009 volume 113, number 24,s. 6225 - 6236 Gaboriau F., et al, Effects of deferasirox and deferiprone on cellular iron load in the human hepatoma cell line HepaRG, Biometals (2010) 23: s.231–245 Ganong W. F., Přehled lékařské fyziologie, 20. vyd., , Galén, 2005. s. 482 – 484 Hider RC. Design of therapeutic chelating agents Biochem Soc Trans. 2002, 30(4), s. 751-4

67

Hrabalíková J., Vliv pH na chelataci železa, diplomová práce, Univerzita Karlova 2010 Job, P. Recherches sur la formation de complexes minéraux en solution, et sur leur stabilité, Annali di Chimica Applicata ,1928, 9, s.113-203 Kalinowski DS, Richardson DR. The evolution of iron chelators for the treatment of iron overload disease and cancer. Pharmacol Rev. 2005, 57(4), s.547-583 Kang J., Chronic iron overload and toxicity: Clinical chemistry perspective, Clinical Laboratory Science; 2001; 14, 3; ProQuest Central, s. 209 Kohgo Y., Ikuta K., Ohraje T., Torimoto Y., Kato J., Body iron metabolism and pathophysiology of iron overload, Int J Hematol (2008) 88: s. 7–15 Lincová D., Farghali H.: Základní a aplikovaná farmakologie, 1. vydání, Galen, 2002, s. 254255 Liu ZD, Hider RC.Design of clinically useful iron(III)-selective chelators. Med Res Rev. 2002;22(1): s. 26-64. Mahoney J.R., Jr., Hallaway P. E., Hedlund Bo E., and Eaton J.W., Acute Iron Poisoning Rescue with Macromolecular Chelators, J. Clin. Invest. The American Society for Clinical Investigation, 1989, 84, s.1362-1366

McCrea S., Bates N., Acute iron overdose: Clinical features and management, Emergency Nurse; 1999; 7, 5; ProQuest Central s. 18 Mehta M., Gharpure V. and Raghavan K., Acute Iron Poisoning, Indian J Pediatr 1997, 64, s. 485-493 Mladěnka P., Hrdina R., Hübl M., Šimůnek T., The fate of iron in the organism and its regulátory pathwazs, Acta Medica (Hradec Králové) 2005;48(3–4):s. 127–135 Muñoz M., Villar I., García-Erce J. A.: An update on iron physiology, World journal of gastroenterology, 2009; 15(37): s.4617-4626 Papanikolaou G., Pantopoulos K.:Iron metabolism and toxicity, Toxicology and Applied Pharmacology 2005, 202, s. 199–211

68

Sedláčková T., Racek J., Metabolismus železa a jeho regulace, Klin. Biochem. Metab., 2009,17 (38), s. 17–23. Sharma R. N. and Pancholi S. S., Oral Iron Chelators: A New Avenue for the Management of Thalassemia Major, Journal of Current Pharmaceutical Research 2010; 01: s. 1-7 Steen KH, Steen AE, Reeh PW. A dominant role of acid pH in inflammatory excitation and sensitization of nociceptors in rat skin, in vitro. J Neurosci. 1995;15(5): s. 3982-9 Stookey, L.L., Ferrozine - a new spectrophotometric reagent for iron, Anal. Chem. 1970, 42, s. 779–781. Swinkels D. W, Janssen M. C.H., Bergmans J., and Marx J. J.M., Hereditary Hemochromatosis: Genetic Complexity and New Diagnostic Approaches, Clinical Chemistry, 2006, 52:6, s. 950–968 Tam TF, Leung-Toung R, Li W, Wang Y, Karimian K, Spino M. Iron Chelator Research: Past, Present, and Future. Curr Med Chem., 2003;10(12), s.983-95 Trojan S., et al. Lékařská fyziologie. 4. vydání. Praha, Grada Publishing, a.s., 2003. s. 132-135 Vyoral D., Petrák J., Hepcidin: a direct link between iron metabolism and immunity., Int J Biochem Cell Biol. 2005;37(9), s.1768-1773 Zachary D. Hill and MacCarthyl P., Novel Approach to Job's Method, An Undergraduate Experiment, Journal of Chemical Education, 1986, s. 162 - 167

Internetové stránky Souhrn informací o přípravku Exjade (SPC), publikované firmou. Novartis West Sussex, United Kingdom: http://www.exjade.com/files/EXJADE_EUSMPC.pdf , cit. 24.3.2012 Spanierman

CS.

Iron

Toxicity in

Emergency

Medicine.

Med

Scape

reference.

http://emedicine.medscape.com/article/815213-overview, cit. 18.11.2011 www stránky Ústavu patologické fyziologie 1. LF UK - Laboratoř biokybernetiky a počítačové

podpory

výuky

Ústavu

patologické

fyziologie

1.

LF

UK:

http://www.physiome.cz/atlas/vnitrniProstredi/04/ , 9.10.2011

69