Stanovení obsahu polyfenolů a celkové antioxidační kapacity v potravinách rostlinného původu
Z. Zloch, J. Čelakovský, A. Aujezdská Ústav hygieny Lékařské fakulty UK, Plzeň
Závěrečná zpráva o plnění výzkumného projektu podpořeného finančně Nadačním fondem Institutu Danone (v r. 2004)
Plzeň, listopad 2004
Obsah:
1. Úvod s. 1
2. Metody studia antioxidační aktivity potravin s. 3
3. Metody zpracování vzorků potravin a stanovení obsahu některých antioxydantů a celkové antioxidační aktivity s. 5
4. Řešení výzkumného úkolu – stanovení antioxidantů a celkové antioxidační aktivity potravin s. 8
5. Výsledky s. 12
6. Diskuse s. 31
7. Závěr s. 33
8. Literatura s. 34
9. Summary s. 35
1. Úvod Zdravotní význam potravin rostlinného původu je mnohostranný a převážně pozitivní. Opakovaně a jednoznačně jsou v epidemiologických studiích a v metaanalýzách jejich výsledků ověřovány statisticky významné asociace mezi velikostí příjmu těchto potravin a incidencí chronických chorob hromadného výskytu (zejména srdečně-cévních, nádorových, diabetu, obezity aj., 1), které svědčí o zdravotně protektivním účinku těchto potravin. Proto jsou v našich doporučeních, týkajících se spotřeby jednotlivých potravních druhů, ale také v Návodech pro předcházení civilizačním nemocem tyto komodity s důrazem uváděny jako stěžejní faktory prevence (2). Avšak v České republice je tradičně jejich spotřeba, hlavně ovoce, zeleniny, luštěnin a okopanin, relativně nízká. Mezi kvalitativní znaky potravin rostlinného původu, které determinují jejich pozitivní vztah ke zdravotnímu stavu populace, patří: zpravidla nízká energetická hodnota, většinou nízký obsah tuků a vysoký obsah monoenových a vícenenasycených mastných kyselin, výhodný obsahový podíl sodíku a draslíku, event. též hořčíku a vápníku, velký obsah různých forem vlákniny, nepřítomnost cholesterolu a obsah rostlinných sterolů, obsah vitaminů rozpustných ve vodě i v tucích, výskyt esenciálních stopových prvků a obsah chemoprotektivních látek s rozmanitými zdravotně ochrannými účinky na lidský organismus včetně antioxidační aktivity. Antioxidantům v potravě se v přítomné době věnuje velká pozornost, a to z hlediska jejich biologické účinnosti i z hlediska jejich výskytu v různých druzích potravin. Je tomu tak proto, že se považují za faktory eliminace nebo redukce oxidačních agens, látkových i enzymatických. Efektem této aktivity je ochrana struktur a funkcí mnohých biomolekul (polynenasycené mastné kyseliny v biomembránách, aminokyseliny v proteinech, sacharidy, různé typy nukleových kyselin aj.), udržování fysiologické rovnováhy mezi iniciátory oxidací (volné radikály, reaktivní formy kyslíku, dusíku aj.) a systémem antioxidační ochrany organismu a stimulace tvorby a aktivity endogenních antioxidantů (odborná literatura na téma rizik oxidačního poškození organismu a antioxidační ochrany je nesmírně bohatá a stále se rozšiřuje, např. 3 - 5). Úloha esenciálních a neesenciálních antioxidantů v ochraně zdraví a v prevenci vzniku a rozvoje nemocí je značně složitá, její mechanismus není dosud v uspokojující míře vysvětlený a zůstává zčásti hypotetický. Avšak výsledky velkého počtu experimentálních a klinických studií a epidemiologických šetření ukazují, že pravidelný a dostatečně velký příjem širokého spektra antioxidantů, esenciálních i neesenciálních (často nad doporučenou denní dávku) přímo koreluje s větší odolností organismu před chronickými chorobami hromadného výskytu, nebo jejich vznik a vývoj zpomalují. Potraviny jsou nositeli nejen „klasických“ antioxidantů esenciální povahy (vitaminy C a E, karotenoidy, folát, selen a některé přechodné prvky), ale také několika tisíc druhů přírodních látek, které v modelových systémech a po aplikaci živým objektům vykazují srovnatelné, v mnoha případech dokonce intenzívnější antioxidační účinky. Tyto látky se mohou vyskytovat ve fysiologickém prostředí ve své redukované i oxidované formě a v závislosti na svém redukčním potenciálu a oxidoredukčních parametrech prostředí se mohou tyto formy - v interakci s jinými látkami - vzájemně přeměňovat. Oxidačně-redukční interakce mezi biomolekulami (lidskému organismu vlastními) nebo exogenními
oxidanty na jedné straně a těmito látkami na straně druhé mohou mít různý charakter, obvykle vzájemné výměny elektronů, vodíkových atomů nebo atomů resp. molekul kyslíku. Je dlouhou dobu známo, že analogické oxidačně-redukční reakce probíhají také v potravinách (žluknutí tuků a jeho blokování antioxidanty, enzymatické hnědnutí rostlinného materiálu) a také při jejich technologickém zpracování a skladování, ale rovněž v trávicím ústrojí savců. Potravní antioxidanty se aktivně projevují již v trávicí trubici, ale především po svém vstřebání (a po resorpci produktů svého trávení a štěpící činnosti bakteriemi tlustého střeva), a to v krevním oběhu i v cílových tkáních, zde v extra- i intracelulárním prostředí. Protože přírodní látky se po vstřebání často strukturně pozměňují po způsobu xenobiotik (biotransformacemi I. a II. typu), je studium jejich antioxidační aktivity nesnadné a metodicky není dosud plně zvládnuté (6). Z hlediska těchto poznatků je už po dobu několika let pozornost zaměřena na určení jednotlivých druhů přírodních látek a na separátní hodnocení jejich chemických vlastností a biologických účinků. Tato práce je velmi úporná, pomalá, nákladná a málo perspektivní, neboť počet dosud identifikovaných přírodních látek v rostlinném materiálu je vysoký (přes 6 tisíc) a většina z nich se vyskytuje v mnoha strukturně odlišných formách, často v závislosti na druhu a odrůdě rostliny, na vegetačních podmínkách jejich pěstování, na způsobu jejich zpracování apod. Podle nynějšího stavu poznání lze přírodní látky potravinářsky významných rostlin mající významnou oxidačně-redukční aktivitu roztřídit do několika skupin: Jednoduché fenoly a fenolové kyseliny (odvozené od hydroxyskořicové kyseliny) jednoduché a kondenzované nebo polymerisované polyfenoly stilbeny terpeny thioly a dithioly ad. (Také touto problematikou se dlouhodoběji a systematicky zabývá obsáhlá odborná literatura časopisecká i knižní, existují databáze dosud identifikovaných přírodních látek různého typu a jejich chemických a biologických vlastností, 7).
2. Metody studia a standardizace antioxidační aktivity přírodních látek a potravin
V oblasti chemické analýzy a biologického hodnocení potravin byly v posledním desetiletí vypracovány početné metody, které umožňují stanovit tzv. celkovou antioxidační aktivitu vzorku (dále se bude často používat zkratka TAC tj. total antioxidant capacity). Jsou principiálně značně navzájem odlišné a postupně se vyvíjejí jejich modifikace. Jejich základním smyslem je charakterizovat v podmínkách blízkých fysiologickému prostředí jejich antioxidační popříp. redukční účinnost jako souhrnnou vlastnost potraviny. Celková antioxidační účinnost je analogicky a dnes už rutinně stanovována v klinicko-chemických laboratořích (ve vzorcích lidské krevní plazmy) a také v jiných typech biologického materiálu. Po řadu let se k tomuto účelu používá např. standardní radikálové metody s využitím setu fy Randox, Sev. Irsko. V následujícím stručném přehledu uvádíme - převážně jen jmenovitě - metody nejvýznamnější a dnes nejužívanější, jejich chemická charakterizace je předmětem našeho nedávného sdělení (12). Poněkud podrobnější popis principu a způsobu provedení uvedeme v kapitole o metodice naší výzkumné práce.
Metoda TEAC - (Trolox equivalent antioxidant capacity) využívá činidel, která iniciační akcí jiné látky přecházejí ve svou radikálovou formu, která je barevná a relativně stabilní. V přítomnosti antioxidačně aktivních složek extrahovaných ze vzorku potraviny se redukuje, a tím odbarvuje. Rychlost a míra odbarvení jsou úměrné antioxidační aktivitě vzorku. Aby vyjádření této kvality vzorku bylo standardní, stanovuje se shodným postupem TEAC v přítomnosti pouhého askorbátu, Troloxu, gallátu, epikatechinu nebo jiných klasických antioxidantů. Nejčastěji používaným prekursorem radikálu je tzv. ABTS, tj. 2,2´-azinobis.(3ethylbenzothiazolin)-6-sulfonát, iniciátorem, který ji přeměňuje na modrozelený radikál ABTS+, je látka AAHP, tj. 2,2´-azobis(2-amidinopropan)dihydrochlorid, ale také peroxid vodíku, ferrokyanid, persíran nebo peroxidasa z křenu ve směsi s peroxidem vodíku aj.
Metoda FRAP - (Ferric reduction ability of plasma) nebo FOX (Ferrous oxidation assay) je založena na redukci železitých komplexů jako je TPTZ (2,4,6- tripyridyl-S-triazin), ferrikyanid aj. které jsou téměř bezbarvé a po redukci a event. reakci s dalším činidlem vyváří barevné produkty, jakým může být např. berlínská modř.
Metoda ORAC - (Oxygen radical absorbance kapacity) spočívá ve vytvoření peroxylového radikálu fykoeritrinu, a to jeho oxidací činidlem ABAP (2,2´- azobis-2-methyl- propionamidin). Radikál se určuje kvantitativně fluorimetricky a hodnotí se rychlost úbytku signálu po přidání testovaného vzorku.
Lipidově peroxidační metody - provádějí se v pufrovaných modelových systémech obsahujících nenasycené mastné kyseliny a testovaný vzorek. Často se přidává homogenát živočišné tkáně, např. jater nebo mozku, a lipidová peroxidace se v ní iniciuje tetrachlormetanem nebo peroxidem. Je možné použít separovaných mikrosomů a iniciace lipoperoxidačních alterací směsí NADPH a železnaté soli nebo jinými systémy. S těmito typy testů jsme na našem pracovišti získali značné zkušenosti, a to v aplikacích na intoxikaci pokusných zvířat různými xenobiotiky a na kompenzace těchto nepříznivých změn esenciálními antioxidanty.
Metody založené na detekci oxidačního poškození organismu - jsou nákladné a časově náročné, neboť se u pokusných zvířat vyvolává experimentální oxidační stres a současně nebo následně se v různých dávkách podává testovaný vzorek potraviny. Kritérii oxidačního poškození jsou např. 8-hydroxy-2´-deoxyguanosin v moči, karbonylované proteiny v krvi, tzv. TBARS (thiobarbituric acid reactive substances) v krvi, hydroperoxidy a konjugované dieny v krvi, F2-isoprostany a etan + pentan ve vydechovaném vzduchu.
Novější speciální metody - Briggs-Rauscherova metoda využívající peroxylový radikál malonátu, jehož tvorba v umělém systému je moderována aplikovaným vzorkem. Kvantitativní hodnocení radikálu je oscilometrické, metoda je výjimečně citlivá. Jiná metoda spočívá ve vytvoření superoxidového anionu a jeho zhášení vzorkem, koncentrace tohoto radikálu se měří pomocí specifického biosenzoru. Osvědčují se rovněž metody neuvěřitelně jednoduché, např. směs měďnaté soli a činidla na sůl
měďnou (bathocuproin), určuje se množství redukované formy vytvořené potravními antioxidanty.
Stanovení specifických antioxidantů ve vzorcích potravin - Velmi pravidelně se paralelně s určením TAC analyticky v témže vzorku zjišťuje obsah vitaminu C a E, celkový obsah karotenoidů nebo jednotlivě beta-karoten, lykopen aj. a celkový obsah fenolických látek, event. též separátně obsah flavonoidů. Celkové fenoly se zcela pravidelně určují kolorimetricky s použitím tzv. Folin-Ciocalteauova činidla (metoda je doporučena i v Meth.Enzymol.). V ambicioznějších a náročnějších studiích se do těchto analýz zařazují chromatografické separace, často na principu HPLC. Samostatným metodickým problémem stanovení TAC potravin je zpracování vzorku (především vlastní extrakce účinných látek, zahušťování popř. předčištění extraktů, jejich spolehlivé uchovávání) a použití standardů, pomocí nichž se TAC vzorků vyjadřuje. Úpravu vzorků před analýzou stručně pojednáme v kapitole o použitých pracovních postupech, o standardech byla zmínka v předchozích odstavcích. Souhrnně lze stanovení TAC potravin hodnotit jako snahu standardními postupy určit fysiologicky interpretovatelnou antioxidační účinnost vzorku, a to způsobem, který by byl metodicky, materiálově a instrumentálně dostupný a použitelný k početným sériovým analýzám. Jeho výsledky by měly korespondovat s biologicky se manifestující hodnotou téhož vzorku.
3. Metody zpracování vzorků potravin a stanovení obsahu některých antioxidantů a celkové antioxidační aktivity použité v této studii.
Cílem této studie bylo stanovit u vybrané skupiny potravin rostlinného původu obsah vitaminu C, celkový obsah fenolických sloučenin, celkový obsah flavonoidů a celkovou antioxidační kapacitu (TAC).
TAC byla stanovena paralelně čtyřmi rozdílnými chemickými metodami (jedna z nich - DPPH- se považuje spíše na orientační). Aplikované metody byly vybrány jako relativně nejvhodnější ze širší skupiny metodických postupů, jež byly testovány. Při tomto výběru se přihlíželo k praktické zvládnutelnosti metod, k jejich materiálové, instrumentální a časové náročnosti, ke spolehlivosti jejich výsledků a k jejich aktuálnosti z hlediska využívání na zahraničních pracovištích. (Nutno podotknout, že zkoušení a výběr metod narážel na různé nesnáze a překážky, mj. na výskyt věcných chyb v metodických návodech, a to i v renomovaných odborných časopisech.)
Výběr a zpracování vzorků potravin
V plzeňských prodejnách (výjimečně na vlastních zahrádkách) bylo vybráno a zakoupeno několik desítek druhů čerstvého ovoce a zeleniny, čtyři druhy červeného a dva druhy bílého révového vína a dva druhy fermentovaného sypaného čaje. Podle možností se zaznamenala odrůda a země původu potraviny. Vzorky byly zpravidla zpracovány v den jejich nákupu, v případě potřeby byly uchovávány po minimální dobu v chladničce. Ovoce a zelenina byly mechanicky a v proudu vody očištěny (nerez náčiním) a pak extrahovány mixováním v moderním výkonném mixéru po dobu několika vteřin a při maximálních otáčkách nože. Bylo používáno extrakční směsi metanol - voda 1 : 1 a poměru 20 g potraviny a 80 ml. extrakční směsi. Hrubé homogenáty byly zfiltrovány přes papírový filtr nebo byly odstředěny (3 min., 4 000 ot.) a supernatant případně ještě zfiltrován. Získaný extrakt byl ihned titiltrován na obsah vitaminu C a pak uložen v chladničce v uzavřené nádobě na dobu 1 max. 3 dnů. Byl zároveň použit ke stanovení celkových fenolů a flavonoidů a alikvotní podíl byl vakuově zahuštěn na méně než 1/3 původního objemu. Tento koncentrát byl v Eppendorfových zkumavkách uložen v mrazničce (cca -20 °C) a v průběhu několika dnů až týdnů použit k laboratornímu stanovení TAC. Vzorky vín byly použity k analýzám bez předchozích úprav, čaje byly přelity vroucí destilovanou vodou, dekantovány a použity k analýzám bez zahušťování.
Úprava potravinových vzorků před laboratorním stanovením jejich celkové antioxidační kapacity.
Přikládáme kopie autentických manuálů používaných při těchto pracovních postupech.
Čaje : 1 g suchého čaje + 100 ml vroucí vody, přelít, nechat 10 ml stát, při tom 2 – 3 krát zamíchat, pak slít a
bez další úpravy zamrazit
Révová vína : bez úpravy zmrazit
Ovoce : očistit, evt. Oloupat (banány, citrusy apod.) Odvážit 20 g ovocné hmoty předem nakrájené na malé kousky, v mixéru přelít 80 ml extrakční směsi obsahující 40 ml metanolu a 40 ml vody, Mixovat při velkých obrátkách max. 10 vteř., Suspenzi zfiltrovat přes papírový filtr nebo odstředit při plných otáčkách a supernatant zfiltrovat přes papír (popříp. přes skleněnou fritu a při podtlaku).
Filtrát: 30 ml odpařit vakuově na přibl. 5 ml, doba odpařování by neměla překročit 1 hod. Odparek kvantitativně převést, tzn. S výplachem prázdné baňky do 10 ml odměrky, doplnit vodou po značku a promíchat. Tento zahuštěný extrakt rozlít do Eppendorfek a zamrazit.
Zelenina listová, kořenová, cibule apod. : 20 g nakrájené zeleniny v mixéru zalít 80 ml 50 % směsi etanolu a vody, max. 10 vteř. mixovat, zfiltrovat nebo odstředit (podobně jako ovoce). Supernatant vakuově zahustit podobně jako u ovoce, odparek doplnit na objem 10 ml , promíchat a v Eppendorfkách zamrazit. ! U každého vzorku zapsat do protokolu datum zpracování, druh potraviny a místo nákupu, navážku vzorku, objem extrakční směsi, podíl odebraný k zahuštění, a to i standardním provádění těchto operací !
Chemické analýzy vzorků potravin
Obsah vitaminu C byl stanoven ve většině čerstvých extraktů, a to klasickou Tillmansovou titrací s 2,6-dichlorfenolindofenolem (0.001 M). U barevných vzorků se bod ekvivalence indikoval s pomocí potenciometru. Jako standardu se použilo kyseliny L-askorbové p.a. kvality firmy Merck. Výsledky se vyjadřovaly v mg KA na 100 g původního vzorku.
Stanovení obsahu vitaminu C v potravinách rostlinného původu
Princip metody Kyselina askorbová je oxidována roztokem 2,6-dichlorfenolindofenolu, který tím přechází na bezbarvou leukobázi. Jeho nadbytek vytváří v kyselém prostředí červené zbarvení.
Činidla
1. M roztok DFIF - přibl. 50 mg 2,6-dichlorfenolindofenolu nasypat do 250 ml vroucí vody a ještě horký roztok přefiltrovat přes papír do tmavé láhve. Uchovávat v chladničce, každý týden stanovit jeho faktor Faktorování činidla: Odvážit přesně 100 mg kys. askorbové, vsypat ji do 100 ml odměrky a rozpustit v přibl. 25 ml Vody, přidat přibl. 10 ml 5 % TCA a doplnit vodou po značku, dobře promíchat. Tento roztok je stabilní max. 3 hod. při pokoj. teplotě. Naplnit 5 – 10 ml byretu roztokem činidla Odpipetovat do malé Erlenm.baňky 1 ml zásob. roztoku KA, zředit napůl 5 % roztokem TCA a vodou a titrovat činidlem do vzniku výrazného červeného zbarvení přetrvávajícího Minim 10 vteř. Opakovat ještě dvakrát, odečíst spotřebuDFIF-činidla ( a ). Faktor DFIF č.: je-li „a“ = počtu ml DFIF spotřebovaných při titraci KA, pak faktor f = 1000/a a odpovídá počtu umg KA vytitrovaných 1 militrem DFIF činidla. Každý týden korigovat!
Analýza rostlinného materiálu 5 g analyzovaného vzorkukrátce rozmixovat s 25 ml 2 % TCA, u velmi měkkých potravin postačí vymačkat šťávu, směs zfiltrovat nebo krátce odstředit. 1ml filtrátu (je-li spotřeba činidla malá, pak 5 ml filtrátu i více) odpipetovat do baňky a titrovat DFIF činidlem do vzniku trvalejšího červeného zbarvení, tuto titraci provést 3krát (často se napoprvé přetitruje a tuto titraci je nutné pokládat jen za orientační).
Výpočet koncentrace vitaminu C ve vzorku: Je-li n = navážka vzorku v g, b = objem extraktu vzorku odebraný k titraci v ml, a = spotřeba DFIF činidla při titraci v ml f = faktor činidla, pak
mg vit. C ve 100 g vzorku = 3 . a . f / n . b
You are reading a preview. Would you like to access the full-text?
Access full-text
Lze učinit předběžný závěr, že nápadně často vstupuje do významných korelací s jinou metodou postup FRAP. Předpokládáme, že všechny shromážděné výsledky budeme – v souvislosti s jejich zpracováváním k publikační realizaci- znovu a důkladněji statisticky přehodnocovat a že všechny dodatečně zjištěné skutečnosti zveřejníme. Nezávisle na charakteru vzájemných korelací je nutné zdůraznit, že nejpříznivější výsledky TAC se vyskytovaly společně s vyšším obsahem vitaminu C (většina citrusů) i polyfenolů (hrozny – ovoce i nápoje, čaj) a u žlutozelené zeleniny (pravděpodobně účinkem karotenoidů). Naopak malé hodnoty TAC byly stanoveny u cukety, okurky, melounu, švestky aj. V tab. 6 uvádíme některé srovnatelné hodnoty TAC zjištěné a publikované zahraničními autory. Výběr takových dat je, i přes značnou rozsáhlost odborné literatury zabývající se touto problematikou, velmi obtížný, neboť v zahraničí se běžně používá mnoha různých modifikací základních metod a také zpracování vzorků před analýzou se mnohdy provádí speciálními způsoby. Laboratorní stanovení celkové antioxidační kapacity potravin má své opodstatnění jako jedna z možností poznávání a ověřování jedné důležité stránky biologické aktivity přírodních látek, které jsou v nich obsaženy. Jedná se o nepřímou metodu, jejíž výsledky nepostihují skutečný antioxidační potenciál potravin in vivo, tj. po jejich požití, ale jsou mu pouze úměrné. Protože je tato biologická vlastnost potravin významným faktorem podmiňujícím jejich příznivý vliv na zdraví, je zájem o standardní metody stanovení TAC, které by poskytovaly validní, navzájem srovnatelné a reprodukovatelné výsledky, oprávněný. Možnosti praktického využití výsledků systematického hodnocení TAC potravin rostlinného původu jsou několikeré, např.: mohou být používány jako alternativní kritérium biologické hodnoty potravin, mohou být používány jako srovnávací znak potravin v závislosti na různých podmínkách jejich získávání a úchovy (odrůdy, technologie, způsob skladování, klimatické a agrotechnické podmínky apod.), jsou podnětem pro přehodnocení účelnosti suplementací farmaceutickými antioxidanty namísto preference ovoce, zeleniny aj. potravin rostlinného původu, nabízejí v úvahu možnost přípravy koncentrovaných extraktů některých potravin (nikoli separace přírodních látek) a jejich aplikace při výrobě potravních doplňků nebo funkčních potravin, jejich prokázaný výskyt a biologický efekt v potravinách může stimulovat a usměrňovat pěstitelskou a šlechtitelskou činnost, mohou se stát jedním z kritérií tržního oceňování potravin. Naše výsledky naznačují, že koncepce TAC jako nového kritéria biologické hodnoty potravin příznivé pro zdraví je reálná. Aby se dosáhlo jejího dalšího rozvoje a předpokládaného efektu, je žádoucí zdokonalovat metodické postupy při určování TAC a podrobovat laboratornímu testování široký sortiment ovoce, zeleniny, luštěnin, obilovin, potravinářských surovin i finálních výrobků, a to opakovaně po dobu několika let.
7. Závěr
Analýzy cca 40 vzorků čerstvého ovoce, zeleniny, révových vín a čaje, jejichž výsledky a komentáře k nim tvoří obsah této zprávy, potvrzují reálnost sériového stanovení TAC, uskutečněného paralelně v několika metodických variantách, a to i při skromnějším instrumentálním vybavení laboratoře. Za nejzávažnější zjištění vyplývající z výsledků této práce považujeme: značné rozdíly mezi hodnotami získanými různými metodami u téhož vzorku, statisticky významné korelace mezi hodnotami TAC zjištěnými s použitím dvou různých metod a mezi hodnotami TAC a koncentracemi vitaminu C resp. polyfenolů, pozoruhodné přednosti metod založených na využití preparátů z živočišných tkání (mozkový homogenát, v úvahu přicházejí také buněčné organely).
Charakteristické výsledky analýz, prováděných v rámci tohoto projektu, tj. nejpříznivější hodnoty TAC v citrusech, hroznech, červených vínech, čajích a ve žlutozelené zelenině, odpovídají zkušenostem a hodnotám publikovaným v nedávné době v zahraničí. V České republice by tento perspektivní a z hlediska ochrany veřejného zdraví smysluplný trend hodnocení biologické hodnoty potravin neměl setrvávat na pokraji zájmu odborné veřejnosti.
8. Literatura
1. Mandelker,L., Wynn, S.: Cellular effects of common nutraceuticals and natural food substances. Vet.Clin.Small Anim. 34, 2004, p. 339-353. 2. Handique, J.G., Barnach, J.B.: Polyphenolic compounds: an overview. React.Funct.Polym. 52, 2002, p. 163-188. 3. Goldman, I.L.: Recognition of fruit and vegetables as healthful: Vitamins and phytonutrients. HortTechnol. 13 (č.2), 2003, p. 252-25 4. Kromhout, D.: Protective nutrients and up-to-date dietary recommendation. Eur.Heart J., Suppl. 3(D), 2001, p. D33-D36. 5. Bravo, L.: Polyphenols: Chemistry, dietary sources, metabolism, and nutritional significance. Nutr.Rev. 56 (č.11), 1998, p. 317-333. 6. Saint-Cricq de Gaulejac, N., Vivas, N., de Freitas, V., Bourgeois, G.: The influence of various phenolic compounds on scavenging aktivity assessed by an enzymatic Metod. J.Sci.Food Agr. 79, 1999, p. 1081-1090.
7. Fahey, J.W., J.W., Clevidence, B.A., Russell, R.M.: Methods for assessing the biological effects of specific plants. Nutr.Rev. 57 (č.9), 1999, p.S34-S40. 8. Bergamini, C.M., Gambetti, S., Dondi, A., Cervellati, C.: Oxygen, reactive oxygen species and tissue damane. Curr.Pharmaceut.Des. 10, 2004, p. 1611-1626. 9. Higdon, J.V., Frei, B.:Tea catechins and polyphenols: health effects, metabolism, and antioxidant functions. Crit.Rev.Food Sci.Nutr. 43 (č.1), 2003, p.89-143. 10. Mandelker, L., Wynn, S.: Cellular effects of various herbs and botanicals. Vet.Clin.Small Anim. 34, 2004, p. 355-368. 11. Goldberg, D.M., Hoffman, B., Yang, J., Soleas, G.J.: Phenolic constituents, furans, and total antioxidant status of distilled spirits. J.Agr.Food Chem. 47, 1999, p. 3978-3985. 12. Zloch, Z., Čelakovský, J., Aujezdská, A.: Posuzování biologické hodnoty potravin na základě jejich antioxidační aktivity. Č.Sl.Hyg. 1(č.3), 2004, p. 82-87. 13. Maclean, D.D., Murr, D.P., Dell,J.R.: A modified total oxyradical scavenging capacity essay for antioxidants in plant tissues. Postharv.Biol.Technol. 29, 2003, p. 183-194. 14. Sánchez-Moreno, C., Plaza, L., de Ancos, B., Cano, M.P.: Quantitative bioactive compounds assessment and their relative contribution to the antioxidant kapacity of commercial juices. J.Sci.Food Agr. 83, 2003, p. 430-439. 15. Dávalo, A., Goméz-Cordovés, C., Bartolomé, B.: Extending applicability of the oxygen radical absorbance capacity (ORAC – fluorescein) essay. J.Agr.Food Chem. 52, 2004, p. 48-54. 16. Burda, S., Oleszek, W.: Antioxidant and antiradical activities of flavonoids. J.Agr.Food Chem. 49, 2001, p. 2774-2779.
17. Ziccarelli, V.E., Basu, T.K.:An in vivo study of the antioxidant potantials of a plant food concentrate. J.Am.Coll.Nutr. 22 (4), 2003, p. 277-282. 18. Höner, K., Cervellati, R.: Bestimmung der antioxidativen Kapazität von Äppeln mit der Briggs-Rauscher-Methode. Ernähr.-Umsch. 50 (č.1), 2003, p. 13-15. 19. Chamkha, M., Cathala, B., Cheynier, V., Douillard, R.: Phenolic composition of Champagnes from Chardonnay and Pinot Noir Vintages. J.Agr.Food Chem. 51, 2003, p. 3179-3184. 20. Packej, L. (ed.): Flavonoids and other polyphenols. Meth.Enzymol. 335, 2000, p. 103-114. 21. Kähkönen, M.P., Heinämäki, J., Ollilainen, V., Heinonen, M.: Berry anthocyanins: Isolation, identification and antioxidant activities. J.Sci.Food Agr. 51, 2003, p. 1403-1411. 22. Hertog, M.G.L., Holman, P.C.M., Katan, M.B.: Kontent of potentially anticarcinogenic flavonoids of 28 vegetables and 9 fruits commonly consumed in The Netherlands. J.Agr.Food Chem. 40 (č.12), 1992, p. 2379-2383. 23. Lugasi, A., Horvási, J.: Antioxidant properties of commercial alcoholic and nonalcoholic beverages. Nahrung/Food 47 (č. 2), 2003, p. 79-86. 24. Chu, Y.F., Sun, J., Wu, X., Lin, R.H.: Antioxidant and antiproliferative activities of common vegetables. J.Agr.Food Chem. 50, 2002, p. 6910-6916.
25. Pellegrini, N., Serafini, M., Colombi, B., et al.: Total antioxidant capacity of plant foods, beverages and oils consumed in Italy by three different in vitro assays. J.Nutr. 133, 2003, p. 2812-2819. 26. Halverson, B.L., Holte, K., Myhrstad, M.C.W., et al.: A systematic screening of total antioxidants in dietary plants. J.Nutr. 132, 2002, p. 461-471. 27. Ou, B.: Analysis of antioxidant activities of common vegetables employing oxygen radical absorbance capacity (ORAC) and ferric reducing antioxidant power (FRAP) assays: A komparative study. J.Agr.Food Chem. A-G, 2002.
9. Summary
Z. Zloch, J. Čelakovský, A. Aujezdská,
Institute of Hygiene, Faculty of Medicine, Charles University, Plzeň
Determination of polyphenols content and total antioxidant kapacity in dietary plants.
As oxidative damage to various biomolecules, eg lipid peroxidation of PUFA bound in the biomembranes, oxidant alteration of proteins and NO, hydroxylation of purines incorporated in the DNA etc. determines etiopathologically the onset and development of many degenerative processes, antioxidant support and defence against oxidative factors (reactive oxygen species, free radicals, peroxy – derivatives) may play a crucial role in the suppresion and prevention of these health deteriorations. In numerous epidemiological studies it has been recognized that higher consumption of dietary plants (fruits, vegetables, legumines, cereals, red wine) is conversely related to the decreased incidence of atherosclerosis, cancer, diabetes, cataract, neurodegenerative illnesses etc. So called phytochemicals are mentioned to be the main health protective factor contributing to the health promotion. The most expressed mode of biological activity of these compounds seems to be their antioxidant moiety, ie the ability to reduce, scavenge and/or quench in vivo health endangering factors, such as free radicals and reactive metabolic intermediates. Hitherto, above 5,000 chemical individuals have been separated from and identified in dietary plants, eg phenolic acids, simple polyphenolics (eg flavonoids), condensed and polymeric polyphenols (eg tannins), thiols, stilbens etc. They posses antioxidant activities exceeding those being known in a group of essential antioxidants ( vitamin C and E, carotenoids ). At present time, the antioxidative activity of a complex of natural food substances has been systematically examined and recorded. Total antioxidant
capacity (TAC) of plant foods has been the common term reflecting their non – nutritional biological value. Our aim was to assess, implement and apply the laboratory methods to evaluate total antioxidant capacity of various dietary plants, especially fresh fruits and vegetables. Four laboratory procedures were chosen and applied: FRAP – ferric reduction activity of plasma, LPX – the lipid peroxidation delaying in the brain homogenates, DMPD – the quenching of a colored radical form of dimethylphenylendiamine, DPPH – the quenching of a colored form of diphenylpicrylhydrazine. Food samples ( cca 40 sorts including wines and black teas ) were extracted with a mixture of methanol and water, the extract was filtered or centrifuged and concentrated under lowered pressure. Simultaneously, the content of ascorbic acid, total content of polyphenols and flavonoids was separatelly in the food samples estimated. TAS value determined by four different laboratory methods was uniformly expressed as gallic acid equivalents. Very distinct values of TAC were estimated by use of four different laboratory methods, the results of DMPD being the highest and and those of LPX methods being the lowest. Repeatedly, the maximal relative values of TAC were confirmed in grapefruits, grapes, red wines, black teas, and oranges, resp. in onion, cabbage, Brussell sprouts, cauliflowers and tomato. On the contrary, the relatively lowest total antioxidant capacities were found in the lemon, plums, melone, green paprika, zucchetta and potatos. The regression analysis revealed a good correlation between TAC results obtained with help of FRAP and DMPD methods as well as of FRAP and LPX. The relationship between antioxidants content and TAC proved not to be unique, a correlation between vitamin C, resp. polyphenols content in food samples and FRAP and/or DMPD antioxidant values was acknowledged as statistically significant. In conclusion, laboratory testing of TAC in dietary plants can be judged as a tool for non – nutritional biological activity assessment of foods, this estimation is relatively easy and quick to be realized, it may be utilized as a real criterion of food quality being influenced by the agricultural technology, variety choice, climatic conditions, modes of food processing etc.
Seznam prezentací řešené problematiky s uvedením informace o finanční podpoře Nadačním fondem Danone
1. Z.Zloch, J.Čelakovský, A.Aujezdská, Posuzování biologické hodnoty potravin na základě jejich antioxidační aktivity. Česká a slovenská Hygiena 1, č. 3 2004, s. 82-87. 2. Z.Zloch, J.Čelakovský, A.Aujezdská, Total antioxidant capacity of dietary plants and its role in atherosclerosis prevention (přednáška a stať ve sborníku). Sborn. Aterosklerosa 2004, Praha , p.165-167. 3. Z.Zloch, J.Čelakovský, A.Aujezdská, Celková antioxidační kapacita potravin rostlinného původu a její význam v prevenci degenerativních chorob (přednáška a stať ve sborníku, který je v tisku). Životní podmínky a zdraví, Štrbské Pleso, 11.-13.10. 2004. 4. Z.Zloch, Význam antioxidantů v potravě rostlinného původu v ochraně cévního endotelu a možnosti jejich kontroly. Konf. Prevence v kardiologii, leden 2005, Konstantinovy Lázně – přihlášený příspěvek. Připravují se přehledy výsledků a jejich komentáře a interpretace pro dva časopisy (Výživa a potraviny, Česká a slov. Hygiena)
Poděkování Při řešení výzkumného projektu Stanovení obsahu polyfenolů a celkové antioxidační kapacity v potravinách rostlinného původu významným způsobem přispěli k včasnému dokončení projektu v celém proponovaném rozsahu – kromě řešitelů: doc.Ing. Olga Tůmová, CSc., Elektrotechnická fakulta Západočeské univerzity v Plzni, ústav měření , která provedla statistické zhodnocení početných a obsáhlých řad výsledků analýz, paní Milena Feurichová, laborantka, která provedla s velkou zručností , erudicí a samostatností podstatnou část laboratorních prací včetně zpracování vzorků a jejich analýz, paní Helena Nosková, která poskytla cennou pomoc při veškerém počítačovém zpracování metodik, výsledků a závěrečné zprávy.
Všem jmenovaným patří náš srdečný dík.
V Plzni dne 30. listopadu 2004.
