Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav Technologie potravin
Stanovení mastných kyselin v materiálech živočišného původu Diplomová práce
Vedoucí práce: Ing. Tomáš Gregor, Ph.D.
Vypracoval: Bc. Hana Procházková
Brno 2013
PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma STANOVENÍ MASTNÝCH KYSELIN V MATERIÁLECH ŽIVOČIŠNÉHO PŮVODU vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. dne
……………………………………
podpis diplomanta ………………………..
Touto cestou bych ráda poděkovala panu Ing. Tomáši Gregorovi, Ph.D. za odborné vedení a cenné rady při psaní diplomové práce a především svojí rodině a příteli za podporu při studiu.
ABSTRAKT Diplomová práce se zabývá možností využití Potemníka moučného (Tenebrio molitor) jako funkční potraviny. Cílem práce je změření profilu mastných kyselin v jednotlivých vzorcích a určení nejvhodnějšího krmiva ve vztahu k jednotlivým esenciálním mastným kyselinám a především zlepšení poměru ω-6 a ω-3 kyselin, konkrétně kyseliny linolové a kyseliny linolenové v těle larev potemníka. Jednotlivé vzorky byly krmeny vždy 2 a 4 týdny krmivy, které byly vybrány na základě jejich obsahu tuku a podílu mastných kyselin. Po té byl ze vzorků larev vyextrahován tuk a pomocí GC-FID změřeno množství mastných kyselin. Práce potvrdila možnost ovlivnění obsahu tuku a skladbu mastných kyselin správně zvolenou krmnou dávkou. Jako nejvhodnější krmivo se jeví řepka olejka (Brassica napus). A to nejen z hlediska spektra mastných kyselin a poměru kyseliny linolové a linolenové, ale i z důvodu nekolísání poměru těchto dvou kyselin v závislosti na délce krmení. klíčová slova: Potemník moučný (Tenebrio molitor), mastné kyseliny, plynová chromatografie, kyselina linolová, kyselina linolenová
ABSTRACT This work deals with the potential of using mealworm Tenbrio molitor as a functional food. The issue of this work is measuring of fatty acids in concrete samples and choosing the optimal food in relationship to individual essential fatty acids and a priori to improve the proportion of ω-6 and ω-3 acids, namely linoleic and linolenic acids in the body of Tenebrio molitor. The samples were feeding for 2 or 4 weeks with feed, which were chosen on the basic of their fat amount and fatty acids amount. After this procedure the fat was extracted from the Tenbrio samples and fatty acids were measured with GC-FID. The result of this work verifies possibility of influence of fat and fatty acids on correct feeding. It seems that the best feed is oilseed rape (Brassica napus) from at least these reasons: structure of fatty acids, ratio between linoleic and linolenic acids and stability of proportion of these two acids in addiction on the length of feeding. Key words: mealworm (Tenebrio molitor), fatty acids, gas chromatography, linoleic acid, linolenic acid
OBSAH 1 ÚVOD ............................................................................................................................ 8 2 LITERÁRNÍ PŘEHLED ............................................................................................. 10 2.1 Lipidy .................................................................................................................... 10 2.1.1 Mastné kyseliny ............................................................................................. 11 2.1.2 Metabolismus a absorpce mastných kyselin .................................................. 14 2.1.3 Mastné kyseliny ve výživě člověka ............................................................... 15 2.2 Zdroje mastných kyselin ....................................................................................... 18 2.2.1 Řepka olejná .................................................................................................. 18 2.2.2 Hořčice bílá .................................................................................................... 19 2.2.3 Semínka hroznového vína .............................................................................. 19 2.2.4 Konopné semínko .......................................................................................... 19 2.2.5 Amarant ......................................................................................................... 19 2.2.6 Šalvěj španělská ............................................................................................. 20 2.2.7 Mák olejný ..................................................................................................... 20 2.2.8 Len olejný ...................................................................................................... 20 2.3 Maso...................................................................................................................... 21 2.3.1 Odběr a příprava vzorků při vyšetření masa .................................................. 22 2.3.2 Smyslové posuzování kvality masa ............................................................... 23 2.3.3 Hodnocení čerstvosti masa ............................................................................ 23 2.3.4 Zkouška varem a pečením ............................................................................. 24 2.3.5 Stanovení množství masové šťávy odkapáváním .......................................... 24 2.3.6 Důkaz a stanovení celkového množství bílkovin .......................................... 24 2.3.7 Stanovení hemoglobinu a myoglobinu .......................................................... 24 2.3.8 Důkaz a stanovení aminokyselin ................................................................... 24 2.3.9 Důkaz a stanovení obsahu tuku ..................................................................... 25 2.3.10 Stanovení čísla kyselosti, čísla zmýdelnění a jodového čísla tuků .............. 25
2.4 Alternativní zdroje výživy .................................................................................... 25 2.4.1 Potemník moučný (Tenebrio molitor) ........................................................... 27 2.5 Plynová chromatografie ........................................................................................ 27 2.5.1 Historie........................................................................................................... 28 2.5.2 Princip plynové chromatografie..................................................................... 29 2.5.3 Analýza FAMEs ............................................................................................ 31 2.5.4 Kvalitativní a kvantitativní vyhodnocení chromatografu .............................. 35 3 CÍLE DIPLOMOVÉ PRÁCE ...................................................................................... 38 4 MATERIÁL A METODIKA....................................................................................... 39 4.1 Příprava vzorku ..................................................................................................... 39 4.1.1 Lyofilizace ..................................................................................................... 39 4.1.2 Extrakce ......................................................................................................... 40 4.1.3 Rotační vakuová odparka............................................................................... 41 4.1.4 Derivatizace mastných kyselin ...................................................................... 41 4.2 Nastavení chromatografu ...................................................................................... 42 4.2.1 Parametry chromatografu .............................................................................. 42 4.2.2 Teplotní program ........................................................................................... 42 4.3 Vyhodnocení ......................................................................................................... 42 5 VÝSLEDKY A DISKUSE .......................................................................................... 43 5.1 Výsledky ............................................................................................................... 43 5.1.1 Statistika......................................................................................................... 60 5.2 Diskuze ................................................................................................................. 62 6 ZÁVĚR ........................................................................................................................ 66 POUŽITÁ LITERATURA ............................................................................................. 68 SEZNAM OBRÁZKŮ .................................................................................................... 72 SEZNAM TABULEK .................................................................................................... 74 SEZNAM ZKRATEK .................................................................................................... 75 PŘÍLOHA
1 ÚVOD Mezi lidmi panuje řada nepravd a polopravd týkající se tuků ve výživě člověka. Nejprve se začalo s tvrzeními, že jsou obecně tuky špatné a jejich obsah by se měl v potravě člověka snižovat. Tuky ale mají nezbytnou úlohu v těle člověka, jsou důležité, protože slouží jako zdroj a rezerva energie, tvoří součásti biologických membrán, jsou součástí nervové tkáně, mají ochranou a izolační funkci, pomáhají využívat vitaminy rozpustné v tucích a cholesterol slouží jako prekurzor steroidních hormonů. Ve zdravé vyvážené stravě by však tuky neměly tvořit více, než 30 % celkového přijmu kalorií. Vzhledem k nezbytnosti tuků pro lidské tělo se začala objevovat tvrzení o škodlivosti živočišných tuků obecně a prospěšnosti pro zdraví u tuků rostlinných. Tato myšlenka však není stále úplně pravdivá. Ano, živočišné tuky obsahují velké množství škodlivých nasycených mastných kyselin, ale zároveň obsahují i látky, které se v jiných komoditách nevyskytují. Např. pouze máslo obsahuje konjugovanou kyselinu linolenovou. Také nemůžeme prohlásit, že rostlinné tuky jsou jednoznačně zdraví prospěšné, protože např. kokosový olej nebo olej z palmových jader obsahuje velké množství nasycených mastných kyselin. Obecně ale rostlinné tuky obsahují větší množství mono- a polynenasycených mastných kyselin, které jim propůjčují charakteristické vlastnosti, ale záleží na konkrétní mastné kyselině, jestli bude nebo nebude zdraví prospěšná. Typickým příkladem jsou n-6 kyselina linolová a n-3 kyselina α-linolenová, které obě podléhají v těle metabolickým pochodům skládající se z elongace a V prvním
desaturace, kdy konečnými produkty těchto reakcí jsou eikosanoidy.
případě
však
působí
tyto
látky
prozánětlivě
a
zvyšují
riziko
kardiovaskulárních chorob, ve druhém případě působí přesně opačně. Tato skutečnost bývá často ve výživových doporučeních opomíjena a stále se můžeme setkat s názorem, že stačí v dietě obecně nahradit živočišné tuky rostlinnými, které obsahují nenasycené mastné kyseliny. Pozornost by ale především měla být upřena na poměr n-6 a n-3 mastných kyselin, který by měl být ideálně 1:1, ale vzhledem k výživovým zvyklostem v našich zeměpisných šířkách se doporučuju alespoň 5:1 ve prospěch n-3 mastných kyselin, konkrétně kyseliny α-linolenové. Typickým příkladem je nesmyslné bazírování na používání slunečnicového oleje, i když pro tělo je z hlediska skladby mastných kyselin mnohem příznivější olej řepkový. Jak již bylo zmíněno výše, strava běžného středoevropana je nevyvážená z hlediska správného poměru n-3 a n-6 mastných kyselin. K vyvážení tohoto poměru může přispět 8
zařazení správných nenasycených
mastných kyselin do jídelníčku a vyřazení tuků
škodlivých, nebo přímo příjem surovin živočišného původu, u kterých již byl skladbou krmiva ovlivněn a nastaven správný poměr mastných kyselin. Tato možnost se již využívá např. při produkci vajec se zvýšeným obsahem DHA, produkci kaprů s vysokým obsahem n-3 mastných kyselin apod. Následující práce vychází z předpokladu, že je možné ovlivnit skladbu mastných kyselin u živočichů správně zvolenou dietou. Jako živočich byla zvolena larva Potemníka moučného (Tenebrio molitor) pro jeho cenovou i momentální dostupnost, snadnost a rychlost chovu, a především také z toho důvodu, že se hmyz jako alternativní zdroj výživy, dostává stále víc do popředí a získává si více příznivců. Jednotlivé vzorky larev byly krmeny různými komoditami s rozdílnou skladbou mastných kyselin.
9
2 LITERÁRNÍ PŘEHLED 2.1 Lipidy Christie (1989) definuje lipidy jako mastné kyseliny a jejich deriváty a látky, které se vztahují k biosyntéze nebo funkci těchto sloučenin. Lipidy tvoří nejednotnou skupinu sloučenin, jejichž hlavním kritériem je hydrofobnost, nikoliv jejich chemické vlastnosti. Obecně se definují jako přírodní sloučeniny, které obsahují esterově vázané mastné kyseliny s více než 3 atomy uhlíku v řetězci. Z chemického hlediska rozeznáváme tři hlavní skupiny: - homolipidy – sloučeniny mastných kyselin a alkoholů - heterolipidy – sloučeniny, které kromě mastných kyselin a alkoholů obsahují i další kovalentně vázané sloučeniny (kyselina fosforečná, D-galaktosa, aj.) - komplexní lipidy – obsahují jak homolipidy, tak i heterolipidy, ale kromě kovalentních vazeb se při tvorbě molekul uplatňují různé fyzikální vazby, např. vodíkové můstky nebo hydrofobní interakce. V potravinářské praxi se místo termínu lipidy používá označení tuky, oleje, mastné kyseliny, vosky, aj. (Velíšek, 2009). Chemicky jsou živočišné tuky a rostlinné oleje triacylderiváty glycerolu. Jinými slovy jde o estery glycerolu se třemi karboxylovými kyselinami s dlouhým uhlíkatým řetězcem. Hydrolýzou tuků a olejů vodným NaOH dostaneme tedy glycerol a tři mastné kyseliny (McMurry, 2007). Tuk v těle slouží jako zdroj energie, buď přímo, nebo potencionálně, ve formě energie uložené v tukových zásobách. Slouží také jako tepelný izolátor v podkoží a v okolí některých vnitřních orgánů. Nepolární lipidy vytvářejí elektrickou izolaci, což umožňuje rychlejší šíření depolarizačních vln podél myelinových pochev nervů. Obecně nervová tkáň obsahuje velké množství tuku. Lipoproteiny, sloučeniny bílkovin a tuků, jsou součástí buněčných a mitochondriálních membrán a umožňují transport lipidů krví (Murray, 2002), dále slouží jako prekurzory pro mnoho různých molekul a podílí se na transportu vitamínů rozpustných v tucích A, D, E a K (Chow, 2000; O´Keefe, 2000).
10
2.1.1 Mastné kyseliny Mastné kyseliny jsou karboxylové kyseliny s alifatickým uhlovodíkovým řetězcem, nejčastěji se sudým počtem uhlíků. Na jednom triacylglycerolu mohou být navázány tři různé mastné kyseliny (McMurry, 2007). V živočišných tkáních se nejčastěji vyskytují mastné kyseliny s délkou řetězce 14-22 uhlíků, ale příležitostně může být rozsah 2-36 uhlíků nebo i více (Christie, 1989). Z hlediska fyziologie výživy je důležité dělení mastných kyselin: - nasycené mastné kyseliny (neobsahují žádnou dvojnou vazbu; SFA – saturated fatty acid) - mononenasycené mastné kyseliny (nenasycené mastné kyseliny s jednou dvojnou vazbou; MUFA – monounsaturated fatty acid) - polynenasycené mastné kyseliny (nenasycené mastné kyseliny s několika dvojnými vazbami; PUFA – polyunsaturated fatty acid) - mastné kyseliny s trojnými vazbami a s různými substituenty (Komprda, 2003; Velíšek, 2009). Pro označování mastných kyselin se používá schematických značek ve formátu C N:M, kde N je počet atomů uhlíku, M je počet dvojných vazeb. Poloha dvojných vazeb se vyjadřuje pomocí symbolu ∆a,b,c,d, jednotlivá písmena označují polohu dvojných vazeb (Velíšek, 1999). Stěžejní význam z hlediska výživy má dělení nenasycených mastných kyselin do řad n-3, n-6 a n-9, kdy číslovka označuje pořadí dvojné vazby od methylového konce molekuly. Označení all-cis popisuje prostorové uspořádání molekuly (Komprda, 2003). V tucích přírodního původu bylo identifikováno více než 100 rozdílných mastných kyselin, nejvíce je rozšířeno 40 z nich. Nejběžněji vyskytující se nasycené mastné kyseliny jsou kyselina palmitová (C16) a kyselina stearová (C18), z nenasycených jsou to kyseliny olejová a linolová (obě C18); (McMurry, 2007). 2.1.1.1 Nasycené mastné kyseliny Nasycené mastné kyseliny, někdy také z angličtiny saturované, neobsahují žádnou dvojnou vazbu, mají většinou 3-38 uhlíků, ale existují i vyšší mastné kyseliny. Bývají lineární, s nerozvětveným řetězcem, nejčastěji o sudém počtu atomů uhlíku. Významné nasycené mastné kyseliny se sudým počtem uhlíků, jsou uvedeny v tab. 1 (Velíšek, 2009).
11
Tab. 1 Hlavní nasycené mastné kyseliny vyskytující se v lipidech (Velíšek, 2009) Mastná kyselina ethanová butanová hexanová oktanová dekanová dodekanová tetradekanová hexadekanová oktadekanová eikosanová dokosanová tetrakosonová hexakosonová oktakosanová triakontanová dotriakontanová tetratriakontanová
Počet atomů uhlíků 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34
Triviální název octová máselná kapronová kaprylová kaprinová laurová kristová palmitová stearová arachová behenová lignocerová cerotová montanová melissová lakcerová gheddová
Kyselina octová se nevyskytuje často v souvislosti s mastnými kyselinami o vyšší molekulové hmotnosti. Mastné kyseliny o délce řetězce 4-12 uhlíků se vyskytují hlavně v mléčném tuku, mastné kyseliny se středně dlouhým řetězcem se vyskytují v olejích ze semen, jako např. kokosový olej. Palmitová kyselina je jednou z nejrozšířenějších mastných kyselin v přírodě, nachází se v lipidech všech organismů. Stearová kyselina je také poměrně častá (Christie, 1989). 2.1.1.2 Nenasycené mastné kyseliny s jednou dvojnou vazbou Jednotlivé nenasycené mastné kyseliny, obsahující jednu dvojnou vazbu, se mezi sebou liší především polohou dvojné vazby a prostorovým uspořádáním. Pro označování se častěji používají triviální názvy. Přehled významných monoenových mastných kyselin je uveden v tab. 2 (Velíšek, 2009). Tab. 2 Hlavní nenasycené mastné kyseliny s jednou dvojnou vazbou (Velíšek, 2009) Mastná kyselina decenová decenová dodecenová dodecenová tetradecenová tetradecenová tetradecenová hexadecenová hexadecenová oktadecenová
Počet atomů uhlíku 10 10 12 12 14 14 14 16 16 18
Poloha dvojné vazby 4 9 4 9 4 5 9 9 9 6
12
Isomer cis cis cis cis cis cis cis cis trans cis
Triviální název obtusilová kaprolejová linderová laurolejová tsugová fyseterová myristolejová palmitolejová palmitelaidová petroselinová
oktadecenová oktadecenová oktadecenová oktadecenová oktadecenová eikosanová eikosanová dokosenová dokosenová dokosenová dokosenová tetrakosenová hexakosenová triakontenová
18 18 18 18 18 20 20 22 22 22 22 24 26 30
6 9 9 11 11 9 11 11 11 13 13 15 17 21
trans cis trans cis trans cis cis cis trans cis trans cis cis cis
petroselaidová olejová elaidová asklepová (cis-vakcenová) trans-vakcenová gadolejová gondoová cetolejová cetelaidová eruková brassidová nervonová (selacholejová) ximenová limekvová
V rostlinných a živočišných tkáních se nejčastěji vyskytuje kyselina olejová, a to jako součást strukturních i depotních tuků. Např. tvoří 30-40 % z celkového obsahu tuku zvířat, 20-80 % semenných olejů v obchodech. Olivový olej obsahuje až 78 % olejové kyseliny (Christie, 1989). 2.1.1.3 Nenasycené mastné kyseliny se dvěma a více dvojnými vazbami Nenasycené mastné kyseliny se dvěma a více dvojnými vazbami se liší počtem vazeb, jejich polohou v řetězci a především prostorovým uspořádáním molekuly. Významné polyenové mastné kyseliny uvádí tab. 3. Tab. 3 Hlavní nenasycené mastné kyseliny se dvěma a více dvojnými vazbami (Velíšek, 2009) Počet atomů uhlíku
Poloha dvojných vazeb
Izomer
16 18 18 18 20 22
9, 12 9, 12 9, 12 12, 15 11, 14 13, 16
cis, cis cis, cis trans, trans cis, cis cis, cis cis, cis
16 18 18
6, 10, 14 6, 9, 12 8, 10, 12
oktadekatrienová
18
8, 10, 12
oktadekatrienová
18
9, 11, 13
oktadekatrienová
18
9, 11, 13
all-cis all-cis trans, trans, cis trans, trans, trans cis, trans, trans trans, trans, trans
oktadekatrienová
18
9, 11, 13
Mastná kyselina dienové hexadekadienová oktadekadienová oktadekadienová oktadekadienová eikosadienová dokosadienová trienové hexadekatrienová oktadekatrienová oktadekatrienová
cis, trans, cis
13
Triviální název
linolová linolelaidová
hiragonová γ-linolenová α-kalendová β-kalendová α-eleostearová β-eleostearová puniková (trichosanová)
oktadekatrienová eikosatrienová eikosatrienová tetraenové
18 20 20
9, 12, 15 5, 8, 11 8, 11, 14
all-cis all-cis all-cis
α-linolenová Meadsova dihomo-γ-linolenová
oktadekatetraenová
18
6, 9, 12, 15
all-cis
stearidonová (moroktová)
oktadekatetraenová
18
9, 11, 13, 15
oktadekatetraenová eikosatetraenová dokosatetraenová pentaenová eikosapentaenová eikosapentaenová dokosapentaenová dokosapentaenová hexaenové dokosahexaenová tetrakosahexaenová
18 20 22
α-parinarová
9, 11, 13, 15 5, 8, 11, 14 7, 10, 13, 16
cis, trans, trans, cis all-trans all-cis all-cis
20 20 22 22
4, 8,12, 15, 19 5, 8, 11, 14, 17 4, 7, 10, 13, 16 7, 10, 13, 16, 19
all-cis all-cis all-cis all-cis
klupanodonová timnodonová (EPA)
22 24
4, 7, 10, 13, 16, 19 6, 9, 12, 15, 18, 21
all-cis all-cis
cervonová (DHA) nisinová
β-parinorová arachidonová adresová
klupadonová (DPA)
Linolová kyselina je nejrozšířenější polynenasycená mastná kyselina, nachází se ve většině živočišných a rostlinných tkání. Pro živočichy je esenciální, slouží jako prekurzor n-6 mastných kyselin. Další esenciální kyselinou je kyselina α-linolenová, která je důležitá pro metabolismus n-3 mastných kyselin (Christie, 1989). Arachidonová kyselina je důležitá pro proliferaci epidermis, reprodukci a produkci. Nedostatek způsobuje poruchy mozku a nervů a to již v prenatálním období (Suchý, 2008). 2.1.2 Metabolismus a absorpce mastných kyselin V potravě člověk přijímá převážně neutrální lipidy (triacylglyceroly), fosfolipidy, cholesterol a estery cholesterolu. Slinné žlázy a žaludek kojenců produkují lipázy. U dospělých jedinců tato schopnost v omezené míře zůstává zachována, především ve formě žaludeční lipázy, která štěpí triacylglyceroly na glycerol a mastné kyseliny. O hlavním trávení tuků ale mluvíme až v okamžiku, kdy trávenina dorazí do duodena, kde tuky stimulují sekreci žluči. V procesu zvaném emulgace tuků dochází pomocí solí žlučových kyselin ke tvorbě micel. Jedná se o drobné kapénky tuků obalené na povrchu solemi žlučových kyselin na základě jejich lipofilních nebo hydrofilních vlastností. Při tomto procesu ještě nedochází k hydrolýze triacylglycerolů, ale emulgace tuků hydrolýzu usnadňuje, protože vzniká více menších tukových kapének o větším povrchu. K samotné hydrolýze tuků, kterou můžeme vidět na obr. 1, dochází až působením pankreatické lipázy, která štěpí první a třetí esterovou vazbu mezi mastnými kyselinami
14
a glycerolem (Fox, 1996). Monoacylglyceridy jsou na glycerol a mastné kyseliny štěpeny střevní lipázou (Komprda, 2003).
Obr. 1 Hydrolýza triacylglycerolu působením pankreatické lipázy Volné mastné kyseliny se středním a krátkým řetězcem jsou do jater vstřebávány přímo přes vena portae. Mastné kyseliny s dlouhým řetězcem a složky, které nebyly rozloženy úplně, jsou vstřebávány ve formě micel, přes střevní epitel. V enterocytech se k micelám přiřazují další složky, jako fosfolipidy, estery cholesterolu a bílkoviny, vznikají tak chylomikra, která se absorbují přes lymfatické cévy a krev do jater. 2.1.3 Mastné kyseliny ve výživě člověka Prodlužováním délky života se začaly více vyskytovat nemoci spojené se stárnutím, jako jsou především kardiovaskulární onemocnění. To do popředí dostalo zájem o množství a druh tuku a obsah cholesterolu ve spojitosti se zdravím (Lawrence, 2010). Především v 60. a 70. letech minulého století se poukazovalo na riziko konzumace másla a sádla pro obsah cholesterolu a výhody konzumace rostlinných olejů, jako prevence vzniku srdečních onemocnění (Strunecká a Patočka, 2011). V důsledku toho se nejprve hlasitě odsoudily nasycené tuky, které zvyšují frakce LDL. Na druhé straně, polynenasycené mastné kyseliny snižující frakce LDL a zvyšující frakce HDL jsou považovány za prospěšné. Toto rozdělení není úplně přesné. Pokud se zaměříme na artritidy a záněty, platí všeobecná shoda, že rostlinné omega-6-polynenasycené mastné 15
kyseliny jejich množství zvyšují, naopak prospěšné jsou omega-3-MK, především rybího původu (Lawrence, 2010). Nasycené a mononenasycené mastné kyseliny se vyskytují především v živočišných tucích, jako jsou maso a mléčné výrobky. Bell et al. (1997;) a McKenzie (2001) uvádějí, že je možné ovlivnit profil mastných kyselin u živočichů změnou diety. Obohacení zvířecí diety omega-3 mastnými kyselinami má za následek zvýšení množství omega-3 mastných kyselin v lipidech, oproti kontrolní skupině zvířat, která byla krmena klasickou dietou. Kromě mastných kyselin, které člověk přijímá spolu s potravou, je schopen si nasycené i nenasycené mastné kyseliny syntetizovat z acetylkoenzymu A postupným prodlužováním
řetězce
o
dvouuhlíkaté
zbytky.
Nedovede
však
syntetizovat
polynenasycené mastné kyseliny řady n-3 a n-6, které z toho důvodu nazýváme esenciální mastné kyseliny, a musí je a jejich prekurzory přijímat v potravě. Důležité esenciální kyseliny jsou především linolová a α-linolenová, které se v lidském organismu prodlužují o 2-4 uhlíky (tzv. elongace) a vytvoří se další dvojné vazby (tzv. desaturace), viz obr. 2 (Komprda, 2003; Velíšek 2009). n-6 kyselina
n-3 kyselina
linolová (C 18:2 ∆9,12)
α-linolenová (C 18:3 ∆9,12,15) ↓ ∆6 – desaturasa
γ-linolenová (C 18:3 ∆6,9,12)
oktadekatetraenová (C 18:4 ∆6,9,12,15) ↓ elongasa
eikosatrienová (C 20:3 ∆8,11,14)
eikosatetraenová (C 20:4 ∆8,11,14,17) ↓ ∆5 - desaturasa eikosapentaenová (EPA) (C 20:5 ∆5,8,11,14,17)
arachidonová (C 20:4 ∆5,8,11,14) ↓ elongasa adrenová (C 22:4 ∆7,10,13,16)
dokosapentaenová (C 22:5 ∆7,10,13,16,19) ↓ ∆4 – desaturasa
dokosapentaenová (C 22:5 ∆4,7,10,13,16)
dokosahexaenová (DHA) (C 22:6 ∆4,7,10,13,16,19)
Obr. 2 Schéma metabolismu esenciálních mastných kyselin (Velíšek, 2009) 16
Fyziologicky nejvýznamnějším metabolity jsou kyselina arachidonová, kyselina eikosapentaenová a kyselina dokosahexaenová. Důležitými metabolity n-3 a n-6 řad jsou biologicky aktivní látky, tzv. eikosanoidy, které mají důležité fyziologické funkce. Jedná se o prostaglandiny, leukotrieny, prostacykliny, tromboxany a lipoxiny, tyto látky se uplatňují při regulaci krevního tlaku, regulují srážení krve jako agregační a antiagregační látky trombocytů, regulují funkci leukocytů, cykly spánku a bdění aj. Z řady n-6 vznikají eikosanoidy řady 2, které působí prozánětlivě, vasokonstrikčně a způsobují agregaci trombocytů, na druhé straně metabolity řady n-3 tvoří eikosanoidy řady 3, které působí protizánětlivě, vasodilatačně a proti shlukování trombocytů, čímž snižují riziku kardiovaskulárních onemocnění, autoimunních onemocnění a rakoviny. U mastných kyselin je důležité, jak ovlivňují hladinu sérového cholesterolu. Kyselina laurová, myristová a palmitová hladinu sérového cholesterolu zvyšují, kyselina stearová působí neutrálně a mononenasycené a polynenasycené mastné kyseliny hladinu sérového cholesterolu snižují (Komprda, 2003; Velíšek, 2009). Poměr mezi omega-6 a omega-3 nenasyceními mastnými kyselinami v stravě západního typu je 10-30:1, což je mnoha odborníky na výživu hodnoceno jako nedostatečný příjem, který je odpovědný za zdravotní poruchy (Chapkin, 2000; McKenzie, 2001). V rámci EU se doporučuje následující příjem (vyjádřený % celkového denního příjmu energie): - celkový tuk ≤ 30 % - SFA + transnenasycené MK ≤ 10 % - MUFA 15 % - PUFA 7 % - poměr n-6 : n-3 5 (hodnota by se ale měla co nejvíce přiblížit 1) - vitamin E ≥ 0,6 mg/g PUFA - cholesterol ≤ 300 mg - kyselina linolová 7-10 g - kyselina α-linolenová 1 g - kyselina eikosapentaenová + dokosahexaenová 350-400 mg - poměr PUFA : SFA > 0,7 (Komprda, 2009). Příjem EPA+DHA by měl činit denně 1,25 g, což odpovídá 0,5 % celkového denního příjmu energie (Komprda, 2009). 17
Úměrně se zájmem o zdravý životní styl se zvedla i spotřeba potravinových doplňků. V souvislosti s tím řada členských zemí EU vyjádřila obavu ohledně nadměrné konzumace n-3 LCPUFA. EFSA proto provedl posouzení zdravotních tvrzení a dospěl ke zjištění, že k dosažení žádoucích zdravotních účinků (udržení krevního tlaku a hladiny triglyceridů) stačí denní příjem EPA a DHA 2-4 g, z toho už 250 mg denně je dostatečné pro udržení zdraví kardiovaskulárního systému. Dále doplňkový příjem EPA a DHA až do výše 5 g denně nezvyšuje riziko krvácení a poruchy regulace hladiny glukózy nebo poruchy imunitního systému. Průměrné spotřeby se však pohybují u dospělých jedinců mezi 400-500 mg n-3 LCPUFA z potravin denně, u dětí do 320 mg denně. Při konzumaci doplňků stravy mohou dospělí zkonzumovat až 2700 mg a děti 1700 mg denně (EFSA Journal, 2012).
2.2 Zdroje mastných kyselin Výborným zdrojem esenciálních mastných kyselin jsou ryby a dále některé rostlinné oleje, které se získávají převážně z olejnin. Olejniny jsou rostliny, které v semenech, plodech či jiných částech obsahují tuk v takovém množství, že je výhodné jeho získávání. V diplomové práci byly kromě vybraných olejnin použity i méně známá rostlinná semena a suroviny z nich, u kterých se předpokládalo, že by mohly příznivě ovlivnit složení mastných kyselin v tuku Potemníka moučného. 2.2.1 Řepka olejná Řepka olejná je nejpěstovanější olejnina v ČR i v EU. Bezerukové odrůdy se využívají na výrobu jedlého oleje. Semena řepky jsou tmavá, obsahují asi 35-44 % tuku, 22 % bílkovin, 8 % vody, 12 % vlákniny a ligninu. Zastoupení jednotlivých MK je uvedeno v tabulce 4. Řepkový olej je pro lidské zdraví příznivější, protože poměr n-6 a n-3 MK je 2:1. Tab. 4 Průměrné zastoupení MK v řepkovém oleji (Suchý, 2008) kyselina pentadekanová palmitová stearová olejová linolová α-linolenová arachidonová
% 0 4,26 1,81 63,49 16,96 6,26 0
18
2.2.2 Hořčice bílá Semena hořčice bílé se v potravinářství využívají především k výrobě hořčice, na výrobu oleje se příliš nehodí, protože má olejnatost pod 30 % (Mikšík, 2007). Množství mastných kyselin je vyjádřeno v tabulce 5. Tab. 5 Průměrné zastoupení MK v hořčičném semeni (Suchý, 2008) kyselina pentadekanová palmitová stearová olejová linolová α-linolenová arachidonová
% 4,1 20,3 11,7 12,1 -
2.2.3 Semínka hroznového vína Semínka hroznového vína se využívají hlavně pro vysoký obsah antioxidačních látek. Semínka z tmavých hroznů obsahují navíc flavonoidy, které se uplatňují v prevenci rakoviny a kardiovaskulárních onemocnění. Pro diplomovou práci byla použitá mouka vyrobená ze semínek vinné révy. 2.2.4 Konopné semínko V posledních letech se do podvědomí lidí dostává konopí a výrobky z něj. Především konopné semínko, které lze konzumovat přímo – loupané nebo např. naklíčené přidávat do salátů nebo konzumovat za studena lisovaný olej. Průměrné složení konopného semínka je 25-28 % oleje, 30-35 % sacharidů a 20-24 % bílkovin. Z toho olej obsahuje 57 % kyseliny linolové a 19 % kyseliny α-linolenové (http://www.konopnyshop.cz/proc-konopi/konopne-semeno.html). V práci byla využita konopná zelená hmota a mouka z konopného semene. 2.2.5 Amarant Amarant řadíme mezi pseudocereálie a je využíván především k přímé konzumaci jako součást potravinářských výrobků, kdy se zpracovává mletím, pražením, pufováním, extruzí, bobtnáním, vařením, vločkováním, naklíčením nebo enzymovým opracováním. Je vhodný pro bezlepkovou dietu. Amarantové zrno má vysoký obsah dusíkatých látek, asi 18 %, dále bílkoviny amarantu jsou biologicky velmi hodnotné, z důvodu většího množství lysinu a sirných aminokyselin. Hrubá vláknina tvoří 2,2 %, bezdusíkaté látky 57 %, z toho především škrob. Tuku obsahuje amarantové zrno asi 619
9
%,
převážně
nenasycené
mastné
kyseliny
(http://vfu-
www.vfu.cz/vegetabilie/plodiny/czech/laskavec.htm). V diplomové práci se využilo amarantové zrno a amarantová zelená hmota. 2.2.6 Šalvěj španělská Šalvěj španělská, jejíž semínka jsou známa také pod označením Chia, je stále populárnější vzhledem k připisovaným účinkům na zdraví. Semínka Chia jsou významným zdrojem omega-3 masných kyselin, které tvoří 60 % celkového tuku (http://www.chia-seminka.cz/co-chia-obsahuji/). Tab. 6 Složení semen Chia živiny bílkoviny sacharidy tuky z toho omega-3 mastné kyseliny vláknina sodík
% 21,2 37,5 31,4 20,36 33,7 0
2.2.7 Mák olejný Semena maku obsahují 40-55 % oleje. Množství oleje v makových semenech ovlivňují především klimatické podmínky, ale průměrně se za studena dá vylisovat asi 32 % oleje. V potravinářství je makový olej využívaný pro svoji jedinečnou chuť a vůni (Suchý, 2008). Obsah mastných kyselin v makovém oleji je uveden v tabulce 7. Tab. 7 Průměrné zastoupení MK v maku olejném (Suchý, 2008) kyselina pentadekanová palmitová stearová olejová linolová α-linolenová arachidonová
% 0 8,45 2,03 12,97 72,26 0,93 0
2.2.8 Len olejný V ČR se pěstuje převážně len olejný, z něhož se pro výživu lidí využívají celá semena nebo mouka z pokrutin jako doplněk do výrobků za účelem zvýšení nutriční hodnoty a stolní olej. Semena obsahují 30-36 % tuku s vysokým podílem kyseliny linolenové, 20-23 % dusíkatých látek, 6-10 % hrubé vlákniny, 7-10 % bezdusíkatých 20
látek a 2-3 % minerálních látek. Kromě toho semena obsahují velké množství slizovitých látek, které působí příznivě na trávicí trakt. Vzhledem k vysokému podílu kyseliny α-linolenové je len dobrým zdrojem n-3 MK ve výživě (Suchý, 2008). Zastoupení MK v olejném lnu uvádí tabulka 8. Tab. 8 Průměrné zastoupení MK ve lnu olejném (Suchý, 2008) kyselina pentadekanová palmitová stearová olejová linolová α-linolenová arachidonová
% 0 6,62 3,11 13,42 43,59 21,95 0,08
Všemi výše uvedenými komoditami byly krmeny jednotlivé vzorky larev Potemníka moučného. Tyto vzorky byly pak dále zpracovávány jako jiné materiály živočišného původu, na kterých se provádí analýzy, jako např. na mase.
2.3 Maso Mezinárodní organizace pro standardizaci (ISO) definuje maso jako jedlou část těla zvířat, v užším slova smyslu tím rozumíme skeletní svaly zvířat s příslušnou tukovou tkání. Maso obsahuje téměř všechny esenciální složky výživy. Dnešní doba je ve znamení zvýšené spotřeby masa a sníženou spotřebou cereálií, to může být způsobeno nejen vysokým obsahem bílkovin a jiných výživových látek, ale také jeho strukturou a chuťovými vlastnostmi, jejichž variabilita je dána mimo jiné různými kulinárními úpravami. Obsah tuků v mase je nežádoucí pro jeho vysokou energetickou hodnotu, cholesterol a obsah nasycených mastných kyselin, při současném nízkém obsahu esenciálních mastných kyselin (Dvořák, 1987). Český statistický úřad uvádí průměrné spotřeby jednotlivých potravin na osobu a rok v ČR pro rok 2010, kdy se průměrná spotřeba masa na kosti pohybovala na 79,1 kg (to představuje 10,3 % z celkové spotřeby potravin). Z tohoto množství tvoří 41,6 kg vepřové maso, 24,5 kg drůbeží maso, 9,4 kg hovězí maso, 2,2 kg králičí maso, 0,1 kg telecí maso, 0,4 kg skopové, kozí a koňské maso a 0,9 kg zvěřiny. Spotřeba ryb byla 5,6 kg/os/rok. Spotřeby jednotlivých druhů mas pro předchozí roky jsou uvedeny v tabulce 9 (http://www.apic-ak.cz/data_ak/12/k/Stat/Potraviny2010analyzaSpotr.pdf).
21
Tab. 9 Spotřeba masa v hodnotě na kosti (http://www.apic-ak.cz/data_ak/12/k/Stat/Potraviny2010analyzaSpotr.pdf)
1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010
maso na kosti celkem 86,5 84,2 81,1 82,1 85,3 81,5 82,1 83,0 79,4 77,8 79,8 80,6 80,5 81,4 80,6 81,5 80,4 78,8 79,1
vepřové maso 48,8 48,1 46,7 46,2 49,2 45,8 45,7 44,7 40,9 40,9 40,9 41,5 41,1 41,5 40,7 42,0 41,3 40,9 41,6
hovězí maso 20,4 19,8 18,4 18,5 18,2 16,1 14,3 13,8 12,3 10,2 11,2 11,5 10,3 9,9 10,4 10,8 10,1 9,4 9,4
telecí maso 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,2 0,2 0,2 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
z toho skopové, kozí, koňské maso 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,2 0,4 0,4 0,3 0,3 0,4 0,4
drůbeží maso 12,5 11,7 11,6 13,0 13,6 15,3 17,9 20,5 22,3 22,9 23,9 23,8 25,3 26,1 25,9 24,9 25,0 24,8 24,5
zvěřina 0,5 0,5 0,4 0,4 0,3 0,3 0,3 0,4 0,4 0,3 0,4 0,4 0,6 0,6 0,5 0,8 1,1 0,9 0,9
králičí maso 3,6 3,5 3,5 3,4 3,4 3,4 3,3 3,1 3,0 3,0 3,0 3,0 2,9 2,8 2,6 2,6 2,5 2,3 2,2
Pokud hodnotíme kvalitu a zdravotní nezávadnost masa, je nutné přihlížet na některé základní charakteristiky. 2.3.1 Odběr a příprava vzorků při vyšetření masa Při vyšetření masa se pracuje s některými pojmy, které Hálková a kol (2001) definuje následovně: Plán vzorkování - předpis, který vymezuje konkrétní situaci místo, čas, způsob odběru vzorků, jejich úpravu, označování a skladování vzhledem k minimalizaci nákladů a přijatelné vzorkovací chybě. Úprava vzorku – převedení vzorku do stavu, který využijeme v souladu s plánem vzorkování (dělení, míchání apod.). Vzorek – určité množství materiálu, odebrané ve vzorkovacím celku, může být: - analytický – vzorek upravený z laboratorního vzorku, z něhož se odebírají zkušební vzorky (např. jednotlivé navážky) - dílčí – jednorázově odebraný vzorek z určité části vzorkovaného celku (např. jedno spotřebitelské balení) - hrubý – směs dílčích a jednotlivých vzorků ze vzorkovaného celku - jednotkový – souhrn dílčích vzorků ze vzorkované jednotky 22
- konečný – tak veliký vzorek, podle plánu vzorkování, aby stačil na požadované analýzy s potřebnou rezervou - laboratorní – vzorek připravený z konečného vzorku pro vlastní laboratorní zkoušky - reprezentativní – vzorek, který si zachovává stejnou proměnlivost sledovaných znaků, jako měl vzorkovaný celek - rozhodčí – reprezentativní část konečného vzorku, která je určena pro arbitrážní rozbory, musí být zapečetěná a opatřena předpisy přejímacích orgánů - složený – směs nebo souhrn dílčích vzorků odebraných poměrným způsobem Vzorkování – odborné odebírání a úprava vzorku. Může být dynamické, spojité nebo statické. Vzorkovnice – nádoba, ve které se odebraný vzorek uchovává. Po převozu vzorku do laboratoře se vzorek zpracovává podle potřeby metody. Vzorky určené k senzorickému hodnocení se zásadně nekonzervují. Vzorky, které jsou určené
k laboratornímu
chemickému
vyšetření,
můžeme
konzervovat,
volba
konzervačního prostředku závisí na chemické analýze. Vzorky se v laboratoři skladují v podmínkách, které zajistí, aby ve vzorku neprobíhaly žádné, popř. minimální změny, které by mohly ovlivnit stanovované hodnoty. Odběr vzorků je zastřešen nařízením evropského parlamentu a rady (ES) č. 854/2004 ze dne 29. dubna 2004, kterým se stanoví zvláštní pravidla pro organizaci úředních kontrol produktů živočišného původu určených k lidské spotřebě, příloha I, oddíl I, kapitola II, F) Laboratorní testy. 2.3.2 Smyslové posuzování kvality masa Při smyslovém posuzovaní kvality masa se čerstvé, chlazené a nakládané maso hodnotí na čistém laboratorním stole při laboratorní teplotě. Bodově se hodnotí povrchový vzhled, kvalita a jakost opracování, vůně, vzhled na řezu a konzistence masa (Straka, 2006). 2.3.3 Hodnocení čerstvosti masa Čerstvost masa můžeme ověřit mikrobiologickým vyšetřením, ale metoda je dražší, než jednoduché chemické metody, kterými se ověřuje přítomnost různých rozkladných produktů. Tyto chemické metody jsou následující – důkaz přítomnosti amoniaku Nesslerovým činidlem, přítomnost různých těkavých aminů isonitrilovou zkouškou, přítomnost plynného sirovodíku reakcí s octanem olovnatým. Rozkladné produkty 23
bílkovin se srážejí síranem měďnatým. Také aktivita enzymu peroxidázy je ve srovnání s čerstvým masem nulová (Straka, 2006). 2.3.4 Zkouška varem a pečením Pokud se při smyslovém hodnocení masa objeví pachové odchylky, které jsou diskutabilní, provede se zkouška varem či pečením, kdy se v těchto případech stane zápach intenzivnější a jednoznačnější (Straka, 2006). 2.3.5 Stanovení množství masové šťávy odkapáváním Vaznost masa, je schopnost masa vázat přirozeně obsaženou vodu. Při hodnocení se stanovuje množství masové šťávy, které se z masa samovolně uvolní za podmínek metody (Straka, 2006). 2.3.6 Důkaz a stanovení celkového množství bílkovin Jako důkaz stanovení bílkovin v mase se využívá Biuretova reakce, reakce s kyselinou
pikrovou,
ninhydrinová
reakce
(reakce
volných
aminoskupin
s ninhydrinem), xantoproteinová reakce, Millova reakce, Adamkiewiczova reakce, Pettenkoferova reakce, či reakce využívající důkaz –SH skupin v bílkovinách. Dále se dají využít i reakce srážecí, kdy se bílkoviny sráží se solemi těžkých kovů, s koncentrovanými minerálními kyselinami, s organickými kyselinami, či s etanolem nebo srážení bílkovin varem. Bílkoviny se stanovují spektrofotometricky dle FolinCiocalteua, biuretovou reakcí nebo oranží G (Straka, 2006). 2.3.7 Stanovení hemoglobinu a myoglobinu Při tomto stanovení se využívá gelové chromatografie, dříve se využívalo stanovení za využití toxického kyanidu draselného, ale od metody se upustilo z důvodu toxicity (Straka, 2006). 2.3.8 Důkaz a stanovení aminokyselin Aminokyseliny můžeme stanovit např. Ninhydrinovou reakci, Sakaguchiho reakcí, Xanthoproteinovou reakcí, Paulyho reakcí, Formolovou titrací, Manometrickou van Slykeovou
metodou,
či
spektrofotometricky
pomocí
kyseliny
2,4,6-
trinitrobenzensulfonovou. Celkový dusík se stanovuje metodou dle Klejdahla (Straka, 2006).
24
2.3.9 Důkaz a stanovení obsahu tuku K zahřátému vzorku se přiloží papír, pokud se vytvoří mastná skvrna, je to důkaz přítomnosti tuků. Vzorek se také dá zahřát nad 200 °C, při rozkladu tuků vzniká ostře štiplavě páchnoucí akrolein. Při analýze masa a masných výrobků často stačí stanovit celkové množství tuků, pokud chceme stanovit i složení lipidové fáze, zvolí se šetrnější extrakční postupy a extrakt se frakcionuje různými chromatografickými metodami. Většinou stačí použití klasického Soxhleta a rozpouštědla, jako je hexan, petrolether, diethylether nebo chloroform. Rozpouštědlo se po té odstraňuje při teplotách do 60 °C za sníženého tlaku, aby nedošlo k rozložení extraktu. Pokud materiál obsahuje větší množství vody, je vhodnější použít polárnější rozpouštědlo, jako je např. chloroform a metanol nebo etanol a diethylether. Využití Soxhletovy metody je vhodné tam, kde v lipidech převažují triacylglyceroly. Soxhletova metoda je tedy vhodná pro analýzu tukové tkáně, která obsahuje větší množství lipidů s nízkým obsahem vody. Vzorek se naváží do extrakční patrony, která se vloží do extraktoru, ke kterému se připojí baňka se zábrusem, předem zvážená a vysušená. Napojí se na zpětný vodní chladič. Do extraktoru se nalije rozpouštědlo. Výsledek závisí na použitém rozpouštědle, proto je nutné tuto skutečnost vždy uvádět. Extrahuje se asi 4-6 hodin. Po extrakci se z baňky rozpouštědlo oddestiluje na elektrické vodní lázni a dosuší v elektrické sušárně. Po té se baňka zváží. Množství tuků se ve výsledku vztáhne na hmotnost nebo sušinu vzorku (Straka, 2006). 2.3.10 Stanovení čísla kyselosti, čísla zmýdelnění a jodového čísla tuků Tuková čísla jsou měřítkem množství různých funkčních skupin. Dnes tato čísla ztratila na významu, protože instrumentální chromatografické metody poskytují přesnější informace o složení a vlastnostech analyzovaného tukového materiálu. Význam má stále stanovení čísla kyselosti, které je kritériem kvality surovin při výrobě jedlých tuků a ukazatelem případných změn při technologických postupech (Straka, 2006). V mase se dále stanovuje obsah glykogenu, vlákniny, vody, sušiny a popela, obsah dusitanů a chloridů.
2.4 Alternativní zdroje výživy Úměrně s rostoucími obavami ze stále hladového a přibývajícího lidstva se objevují myšlenky na alternativní zdroje potravy. Hokrová (2012) odkazuje na švédské vědce, 25
kteří poukazují na to, že světové zásoby vody nejsou dostačující, aby se jedlo maso v takovém množství jako doposud. Za posledních 60 let se spotřeba masa ve světě zpětinásobila. Na produkci kilogramu hovězího masa se spotřebuje 15 tisíc litrů vody, na kilogram vepřového masa téměř 6 tisíc litrů vody. Při stávajícím trendu by v roce 2050 neměl být dostatek vody pro produkci dostatečného množství potravin pro odhadovaných téměř 9 miliard lidí. Jednou z možných alternativ je zařazení hmyzu do jídelníčku člověka. U této komodity je navíc možné ovlivnit nutriční složení vhodnou skladbou krmiva. Jak uvádí Bell a kol. (1997) a McKenzie (2001), je možné ovlivnit profil mastných kyselin u živočichů změnou diety. Obohacení zvířecí diety omega-3 mastnými kyselinami má za následek zvýšení množství omega-3 mastných kyselin v lipidech, oproti kontrolní skupině zvířat, která byla krmena klasickou dietou. Z tohoto předpokladu vychází i Zajíc a kol. (2011) v práci, zabývající se produkcí sladkovodních ryb s vysokým obsahem omega-3 mastných kyselin. Sladkovodní ryby jsou schopné vytvářet v těle HUFA, díky enzymům jako jsou desaturáza a elongáza. Nejvýznamnější z těchto kyselin, jak už bylo uvedeno výše, jsou kyselina eikosapentaenová a dokosahexaenová. Léčebné účinky masa kapra se zvýšeným obsahem omega-3 MK potvrdila studie Adámkové a kol. (2011). Ovlivnit složení mastných kyselin výživou je komplikované u přežvýkavců, kde hrají negativní roli mikroorganismy v předžaludcích. Jednodušší je situace v chovu monogastrických zvířat, kdy lze dodáním mastných kyselin docílit jejich vyšší obsah v mase. Sladkovodní ryby mají navíc schopnost syntézy HUFA. Pokud se rybám v potravě dodávají C18 prekurzory HUFA, dokážou ryby fyziologicky vytvořit kyseliny více nenasycené a s delším uhlíkatým řetězcem. Tuto schopnost postrádají ryby mořské, která HUFA přijímají v potravě a ze sladkovodních ryb ryby dravé. Při experimentu Zajíce a kol. (2011) byly použity oleje lněný, konopný, řepkový, sojový, olivový, palmový, kukuřičný, bavlníkový a slunečnicový. Cílem práce Zajíce a kol. (2011) bylo zvýšit zájem o konzumaci domácích sladkovodních ryb a zároveň zvýšit konzumaci omega-3 mastných kyselin. Další možnou komoditou, která by se dala zařadit do jídelníčku člověka, poté, co u ní dojde k ovlivnění skladby mastných kyselin vhodnou složkou krmení, je hmyz. Konzumace hmyzu jak alternativního zdroje živin není žádnou novinkou. Původně hmyz do jídelníčku člověka patřil, ale časem byl nahrazen jinou stravou, která byla pro smysly lahodnější. Stále ale brouci slouží jako potrava v Asii, Africe, Jižní a Severní 26
Americe. Výjimku tvoří Evropa. V rozvojových zemích často hmyz tvoří jedinou dostupnou hodnotnou složku potravy. Obsahuje totiž vysoce kvalitní bílkoviny, srovnatelné s bílkovinami drůbeže či ryb, množství esenciálních aminokyselin, lehce stravitelný tuk, omega-3 a omega-6 mastné kyseliny, vitaminy A, D, E, C a řady B a minerály, především Ca, Zn a Mg (Cesterová, 2007, Borkovcová a kol., 2009). Dnes se za jedlé považují asi tři tisíce druhů hmyzu. Chuť hmyzu ovlivňují feromony na povrhu těla, prostředí, ve kterém daný jedinec žije a čím se živí, např. larvy Potemníka moučného živícího se moukou chutnají po chlebu. Omytím feromonů ztrácí hmyz chuť a při vaření přejímá chuť přísad (Borkovcová, 2009). Pro diplomovou práci byl vybrán Potemník moučný. 2.4.1 Potemník moučný (Tenebrio molitor) Potemník moučný, označovaný také jako „moučný červ“ patří mezi brouky (Coleoptera). Dospělec má asi 2 cm a larvy jsou dlouhé až 3 cm. Jsou to brouci sušších, teplých stanovišť. Živí se rostlinnými a živočišnými zbytky. Chov potemníka je nenáročný a doporučuje se dodržovat teplotu kolem 20 °C, při níž vývojový cyklus trvá asi 6 měsíců. Při vyšší teplotě se cyklus zkracuje, ale také se zvýší zápach červů. Používají se skleněné nebo plastové nádoby, dobře větrané, se substrátem asi 4 cm pod okraj, aby larvy neunikly. Jako chovný substrát se používají ovesné vločky, kukuřičné šustí, strouhanka, otruby, bramborový škrob, sušené mléko apod. Jako zdroj vody slouží larvám ovoce a zelenina (http://www.jaknahmyz.cz/moucni_cervi). Jak prokázala Borkovcová (2012), larvy Potemníka moučného mohou být důležitým zdrojem vysoce ceněných nutričních látek a zároveň velice adaptabilní druh, u kterého lze složení nutrietů velmi snadno ovlivnit druhem krmné dávky. Obecně tvoří larvy potemníka sušina 291 g/1000 g, hrubé proteiny 470 g/1000 g, tuk 374 g/1000 g, chitin 18,86 g 1000 g, popeloviny 38,94 g/1000 g a brutto energie 26,74 MJ/kg.
2.5 Plynová chromatografie Plynová chromatografie je součástí chromatografických metod, které umožňují separaci složitých směsí a získávání jednotlivých složek směsi ve velmi čistém až homogenním stavu. Těmito metodami můžeme získat kvalitativní i kvantitativní informace o jednotlivých složkách vzorku (Králová a kol., 2001). Jančářová a Jančář (2003) rozdělují chromatografické metody následovně:
27
1) podle povahy fází: a) plynová chromatografie - rovnováha se ustavuje mezi mobilní plynnou fází a stacionární pevnou fází (GSC – gas-solid-chromatography) - rovnováha se ustavuje mezi mobilní plynou fází a stacionární kapalnou fází (GLC – gas-liquid-chromatography) b) kapalinová chromatografie - rovnováha se ustavuje mezi mobilní kapalnou fází a stacionární pevnou fází (LSC – liquid-solid chromatography) - rovnováha se ustavuje mezi mobilní kapalnou fází a stacionární kapalnou fází (LLC – liquid-liquid chromatography) 2) podle uspořádání fází: a) kolonová (sloupcová) chromatografie - stacionární fáze je umístněna v koloně b) plošná chromatografie - tenkovrstvá chromatografie (TLC – thin-layer chromatography) – tenká vrstva sorbentu je nanesena na inertní podložce (Al fólie, sklo) - papírová chromatografie (PC- paper chromatography) 3) podle děje, který probíhá: a) adsorpční chromatografie b) rozdělovací chromatografie c) iontově výměnná chromatografie d) gelová chromatografie Pro stanovení mastných kyselin se nejvíce osvědčila plynová chromatografie. 2.5.1 Historie Počáteční fáze vývoje plynové chromatografie byly v rukou analytiků lipidů, protože metoda usnadňuje oddělení lipidů, především mastných kyselin. To je jeden z hlavních důvodů růstu znalostí o těchto přírodních produktech za posledních 30 let. V současné době je možné převést mg vzorku lipidů derivatizací a jednotlivé methylestery mastných kyselin oddělit pomocí plynové chromatografie a kvantitativní výsledek získat za méně než hodinu. V počátcích, ve čtyřicátých až začátkem padesátých let 20. století, se ale začínalo na vzorku o velikosti 20-200 gramů 28
methylesterů, především z oleje semen. Vzorek byl podroben předběžné frakcionaci nízkoteplotní krystalizací, destilací vodní parou, pak byly jednotlivé frakce podrobeny frakční destilaci za vakua. Po dalších chemických reakcích, výpočtech a o několik týdnů později se získal přibližný výsledek (Christie, 1989). 2.5.2 Princip plynové chromatografie Plynová chromatografie je analytická a separační metoda využívaná k analýze těkavých látek. Výhodou této metody je jednoduché a rychlé provedení, účinná separace látek a malé množství vzorku. V praxi se nejčastěji setkáváme s plynovými chromatografy s kapilárními kolonami.
Obr. 3 Zjednodušené schéma plynového chromatografu Obvykle se plynová chromatografie dělí na chromatografii v systému plyn – pevná látka (GSC) a na chromatografii plyn – kapalina (GLC). U GSC probíhá rozdělení analytu mezi stacionální a mobilní fází na základě adsorpce, naopak GLC je typ rozdělovací chromatografie, kdy se látka rozpustí v obou fázích. Plynový chromatogram se skládá z následujících částí: Zdroj nosného plynu, kterým bývá tlaková láhev obsahující inertní plyn, nejčastěji se využívá H, He, Ar nebo N2, který slouží jako mobilní fáze. Při výběru nosného plynu se uvažuje o viskozitě, čistotě, reaktivitě, toxicitě, typu používaného detektoru a ceně plynu. Nejčastěji používaný vodík má tu nevýhodu, že je hořlavý a explozivní, popř. je schopen hydrogenovat některé látky, které stanovujeme. K pohybu nosného plynu se využívají regulátory tlaku a průtoku, které zajišťují konstantní průtok plynu kolonou a detektorem, tlak plynu se nastavuje automaticky podle viskozity plynu, vnitřního 29
průměru kolony a délky kolony, tak, abych průtok zůstal konstantní. Za zdrojem bývá umístěno čistící zařízení, které zachycuje vlhkost a nečistoty (Klouda, 2003; Literák, 2009). Regulační systém umožňuje nastavit stálý nebo programově se měnící průtok mobilní fáze (Klouda, 2003). Dávkovač slouží k zavedení vzorku s cílem odpaření vzorku v co nejrychlejším čase. Kapalný vzorek se dávkuje injekčně přes pryžové septum, plynné vzorky se zavádí přes plynotěsné injekční stříkačky nebo obtokové dávkovací kohouty (Klouda, 2003). Stále častěji se při zavádění vzorků využívají autosamplery, které poskytují lepší reprodukovatelnost a časovou optimalizaci. Nanášený vzorek vstupuje do GC přes injektor, kdy se nástřik provádí pomocí speciální injekční stříkačky přes septum, které dělí vnitřní injektor od vnějšího prostoru (Literák, 2009). Vzorek můžeme nastříknout přímo do kolony (on columm), pomocí děliče toku (split injection) nebo bez děliče toku (splitless injection). Kolona, v níž je umístěna stacionární fáze. V GC se využívají náplňové a kapilární kolony. Kolony obsahují sorbent nebo nosič se zakotvenou mikroskopickou vrstvou kapaliny, popř. polymeru na inertní pevné podpoře uvnitř skla nebo kovové trubky. Kolona je umístěna v peci, kde je udržována konstantní teplota. Náplňové kolony jsou trubice o průměru 2-3 mm a délce 1-3 m, naplněné sorbenty nebo nosiči pokrytými kapalnou fází. Vyrábí se z oceli nebo skla a mají vyšší kapacitu než kapilární kolony. Kapilární kolony mají průměr 0,1-0,6 mm a délku 15-60 m. Vyrábí se z taveného křemene (Klouda, 2003; Literák, 2009). Detektor slouží k detekci látek. Mezi nejčastěji používané detektory v GC patří plamenově ionizační detektor (FID) a tepelně vodivostní detektor (TCD). TCD detektory jsou univerzální, ale FID detektory jsou citlivější pro stanovení uhlovodiků, kdy je odezva úměrná počtu atomu uhlíků v molekule (Literák, 2009). TCD detektor – obsahuje odporové vlákno zahřívané konstantním elektrickým proudem, které se průtokem plynu ochlazuje a tím se mění jeho elektrický odpor. Průchod látky detektorem se projeví změnou tepelné kapacity protékajícího plynu a vodivosti odporového vlákna. V praxi se zapojují dva detektory, kdy jedním protéká čistý nosný plyn a druhým plyn, který vychází z kolony (Komprda, 2003). FID detektor – plyn vycházející z kolony je přiváděn do kyslíkovo-vodíkového plamene, kde dochází k ionizaci a tím ke vzniku nabitých částic, tím dochází 30
k elektrickému toku mezi elektrodami, na které je vloženo stabilizované jednosměrné napětí (elektrody tvoří tryska hořáku a drátek nad plamenem); (Komprda, 2003).
Obr. 4 Plamenově ionizační detektor (http://web.natur.cuni.cz/~pcoufal/images/obr91.gif) V poslední době se využívá zapojení GC k hmotnostnímu spektrometru, který působí jako detektor a umožňuje postupně identifikovat jednotlivé látky, na základě hmotnostního spektra. Tuto metodu nazýváme GC-MS. Stanovované látky je nutné převést na plynné analyty o dostatečném tlaku syté páry, teplotní stálosti a relativní molekulové hmotnosti menší než 1000. Proto se GC využívá k separaci plynů, nedisociovatelných kapalin, pevných organických molekul a mnoha organokovových látek. Nedají se pomocí ní stanovit makromolekuly, organické a anorganické soli (Klouda, 2003). 2.5.3 Analýza FAMEs Obecný analytický postup při zpracování vzorku se skládá z odběru vzorku, úpravy vzorku (koncentrace, transport), zpracování vzorku (rozklad, rozpouštění, ředění, separace, zkoncentrování), měření a následné zpracování analytického signálu, jako je vyhodnocení dat a interpretace výsledků. Národní referenční laboratoř ÚKZÚZ (2011) definovala jednotný pracovní postup pro stanovení obsahu mastných kyselin v olejích a tucích metodou GC s využitím kapilárních kolon, tento postup vychází z normy ČSN CEN ISO/TS 17764-1 a 2. metoda je určena především pro kvalitativní a kvantitativní stanovení methylesterů MK ve vzorcích živočišných a rostlinných tuků a olejů a směsí MK pro krmiva, ale jde využít i pro materiály živočišného původu, jako je maso. Metoda se nedá použít pro 31
polymerizované tuky. Kapalné vzorky, pokud nejsou čiré, se zfiltrují. Pevné vzorky se extrahují vhodným rozpouštědlem, nejčastěji využitím Soxhletovy aparatury, po extrakci se odpaří na vakuové odparce a dosuší v sušárně. Ze vzorků živočišného původu se před vlastní extrakcí odstraní voda lyofilizací. Methylestery MK se dají z extraktu připravit třemi způsoby: 1) obecná metoda s bortriflouridem 2) trimethylsulfonium hydroxidová (TMSH) metoda 3) trans-esterifikační metoda (ÚKZÚZ, 2011). Celý proces analýzy esterů mastných kyselin se skládá z esterifikace lipidů, nástřiku, vlastní separace, identifikace a kvantifikace. Esterifikace lipidů se provádí několika činidly, založenými na kysele nebo zásaditě katalyzované reakci. Nejkritičtějším krokem při analýze FAMEs plynovou chromatografií je nástřik vzorku. Klasická split technika nástřiku, která je široce rozšířená, má potenciální nevýhodu v rozlišení vzorku na základě bodu varu. Na druhé straně, studená technika nástřiku vzorku, jako on-column nebo programovaná technika vypařování (PTV), nepředstavuje tento problém a měla by být proto upřednostňována (Eder, 1995). Na separaci se využívají komerčně dostupné kapilární kolony z křemenného skla. Velmi polární stacionární fáze dobře separují všechny estery mastných kyselin, ale mají relativně nízkou tepelnou stabilitu a ve výsledku dlouhé retenční časy. Nepolární fáze mají výbornou tepelnou stabilitu, ale nižší selektivitu. Pro většinu analýz se využívají stacionární fáze se střední polaritou, které kombinují výhody, jako vyšší unášecí schopnost s relativně vysokou tepelnou stabilitou (Eder, 1995). Jednotlivé methylestery mastných kyseliny jsou identifikovány porovnáním retenčních časů s čistými standardy, vlastní množství esterů mastných kyselin určuje plocha píku, absolutní koncentrace mastných kyselin se zjistí přidáním vnitřního standardu (Eder, 1995). 2.5.3.1 Příprava methylesterů mastných kyselin Aby mohly být v lipidech vázané mastné kyseliny analyzovány plynovou chromatografií, musí být nejprve odděleny a převedeny na deriváty s nízkým bodem varu, jako jsou alkoholické estery. K tomu se využívá přímé transesterifikace lipidů, kdy hydrolýza a esterifikace probíhá v jednom kroku. Problémy spojené s přípravou esterů, mohou být následující: (1) nekompletní převedení lipidů na methylestery 32
mastných kyselin; (2) změny ve složení původní mastné kyseliny způsobené transesterifikací; (3) tvorba sloučenin, které mohou být špatně identifikovány jako mastné kyseliny nebo mohou překrývat píky FAMEs při GC analýze; (4) kontaminace nebo jiné poškození vyplývající ze zbytkových stop esterifikačního činidla; (5) nekompletní extrakce FAMEs po transesterifikaci; (6) ztráty vysoce těkavých FAMEs s krátkým řetězcem (Eder, 1995). Většina biologických vzorků, včetně potravin, obsahuje převážně mastné kyseliny s dlouhým řetězcem. Odpovídající FAMEs jsou velmi nepolární, a proto mohou být získány alkany, jako jsou n-pentan, n-hexan nebo isooktan. Extrakce FAMEs by měla být provedena dvakrát, abychom získali kompletní množství, a zároveň musí být dostatečný poměr mezi objemem extrakčního rozpouštědla a transesterifikovaným reagentem (Eder, 1995). Kysele katalyzovaná transesterifikace Běžně používané látky při kysele katalyzované transesterifikaci jsou kyselina mravenčí, chlorovodíková, sírová a fluorid boritý v methanolu. Všechny tyto látky jsou vhodné pro transesterifikaci lipidů a metylaci volných mastných kyselin. Nicméně, ani kysele katalyzovaná ani fluoridem boritým katalyzovaná reakce neprobíhá při pokojové teplotě, pro obě reakce je třeba teplo. Mezi zmíněnými reagenty je fluorid boritý v metanolu nejčastěji využívaný pro transesterifikaci všech typů lipidů (Eder, 1995). Zásaditě katalyzovaná transesterifikace Při zásaditě katalyzované transesterifikaci se využívají látky jako methanolát sodný a methanolát draselný. Na rozdíl od všech kysele katalyzovaných reakcí probíhá transesterifikace methanolátem sodným při pokojové teplotě, proto je nízké riziko rozkladu PUFA (Eder, 1995). 2.5.3.2 Nástřik FAMEs Jak již bylo zmíněno výše, samotný nástřik vzorku je v plynové chromatografii nejkritičtějším bodem s ohledem na dosažení vysoké přesnosti a správnosti. Nástřik pomocí děliče toku (Split injection) Nejčastěji se při vstřikovaní FAMEs využívá nástřik pomocí děliče toku, kdy je vzorek zaveden před septum do horké vstřikovací komory. Část koncentrovaného vzorku se spolu s nosným plynem oddělí, tak se do kolony dostane jenom přesně definovaný zlomek. Rozdělení nosného plynu má tu výhodu, že vzorky o vysoké 33
koncentrace FAMEs mohou být nastřikovány bez ohledu na riziko z přetížení stacionární fáze. Naopak hlavní nevýhodou této techniky je diskriminace mezi sloučeninami s vysokým a nízkým bodem varu ve vzorku. Přirozeně se vyskytující mastné kyseliny mají uhlíkatý řetězec o délce 4-24 uhlíkatých atomů a s tím spojený různý bod varu. V důsledku toho není často možno dosáhnout správnosti a přesnosti výsledku (Eder, 1995; Klouda, 2003). Nástřik bez děliče toku (Splitless injection) Metoda se využívá pro velké objemy, např. pro stopovou analýzu. Vzorek se dávkuje do odpařovací trubice, kde se nechává asi 1 minutu odpařovat, po té se septum opláchne (Klouda, 2003). Nástřik vzorku za studena Problémy spojené s nanášením vzorku metodou pomocí děliče toku mohou být odstraněny nástřikem vzorku za studena, jako např. nástřik do kolony (on-column) nebo PTV (teplotně programovaný nástřik); (Eder, 1995). Nástřik do kolony (on-column) Tato technika je základní metodou u náplňových kolon. Vzorek je bez předehřátí a smíchání s nosným plynem přímo nanášen do studené části kolony. Vzorek musí být rychle nastříknut a vytváří kapalný film na stěně kolony. Protože nedochází k žádnému rozdělení vzorku a k žádnému odpaření vzorku v horkém injektoru, můžeme zcela zabránit diskriminaci vzorku a zároveň je zde nízké riziko degradace analytu během nástřiku. Proto mohou být vzorky s širokým rozsahem rozděleny s vyšší přesností. Technika
on-column
je
nejspolehlivější
způsob
zavedení
vzorku
z hlediska
kvantifikace. To platí i pro FAMEs s různou délkou řetězce. (Eder, 1995; Klouda, 2003). PTV (teplotně programovaný nástřik) Při PTV nástřiku dochází k odstranění rozpouštědla v nástřikovém prostoru, programování teploty nástřiku. Vzorek je zaveden do chladné odpařovací komory s otevřeným děličem toku, rozpouštědlo a těkavé látky jsou unášeny nosným plynem do splitové linie. Po odebrání injekční jehly a po odpaření rozpouštědla se odpařovací komora velmi rychle zahřeje na 250-350 °C, aby se odpařily látky i s vyšší teplotou varu. Hlavní výhodou této techniky je, že nedochází k odpařování vzorku uvnitř vstřikovací jehly a nedochází k degradaci termostabilních sloučenin. PTV má 34
následující výhody oproti technice on-column. Za prvé, může být použita ve třech různých režimech: studený nástřik pomocí děliče toku, studený nástřik bez děliče toku a nástřik s eliminací rozpouštědla. Za druhé, pro nástřik PTV nejsou potřeba speciální stříkačky. Za třetí, skleněná vložka jde vyměnit a vyčistit od netěkavých složek. Studený nástřik pomocí děliče toku má tu výhodu, že vzorky s vysokou koncentrací FAMEs mohou být aplikovány bez rizika překročení kapacity kapilární kolony. Bylo také prokázáno, že PTV nástřik pomocí děliče toku poskytuje přesnější výsledky analýzy pro FAMEs s více než 10 atomy uhlíku. Analýza FAMEs s méně než 10 atomy uhlíku není tak přesná jako pro FAMEs s dlouhým řetězcem (Eder, 1995). 2.5.3.3 Separace methyl esterů mastných kyselin Existují komerčně vyráběné kapilární kolony určené přímo pro separaci FAMEs o různých délkách řetězce, které jsou pro separaci methyl esterů mastných kyselin velmi vhodné. 2.5.4 Kvalitativní a kvantitativní vyhodnocení chromatografu Doba, po kterou separovaný vzorek zůstává v koloně, závisí na interakci se stacionární fází. Tuto dobu nazýváme retenční (eluční) čas vzorku – tR a je pro danou složku
za
daných
experimentálních
podmínek
charakteristický.
Vzniká
tak
chromatogram, který tvoří eluční křivky – píky. Signál z detektoru se zaznamenává v závislosti na čase nebo na proteklém objemu nosného plynu. Množství složky, tedy její kvantitativní zastoupení, odpovídá ploše píku. Mobilní fázi označujeme jako eluent, složku jako eluát. Každou sloučeninu charakterizuje tedy retenční čas – tR a retenční objem VR. Retenční čas je doba od nástřiku vzorku po maximum píku. Retenční objem můžeme dále rozdělit na mrtvý retenční čas (tM) – doba, kterou složka zůstává v mobilní fázi a redukovaný retenční čas t´R – doba, kterou složka zůstává ve stacionární fázi. Retenční objem je celkový objem mobilní fáze, který proteče od nástřiku vzorku po maximum píku (Jančářová a Jančář, 2003; Klouda, 2003). Kolonu charakterizuje její účinnost separovat složky směsi. Čím je kolona účinnější, tím větší má počet teoretických pater n. Teoretické patro je myšlená část kolony, ve které se ustanoví rovnováha mezi stacionární a mobilní fází. Tuto délku nazýváme výškový ekvivalent teoretického patra H. Pro kolonu o délce L se výškový ekvivalent teoretického patra stanoví H = L/n. Počet teoretických pater n můžeme určit z chromatogramu z šířky píku v základně Y nebo z šířky píku v polovině jeho výšky Y1/2 a retenčního času tR: 35
(Klouda, 2003). 2.5.4.1 Kvalitativní analýza Umístění maxima píku v chromatogramu, identifikuje konkrétní látku. Toho umístnění nejčastěji charakterizují retenční čas a retenční objem. Jestliže zjistíme, že stanovovaná látka a standard mají odlišné retenční chování, znamená to, že jde o různé chemické látky (Klouda, 2003). 2.5.4.2 Kvantitativní analýza Plocha a výška píku roste s množstvím složky ve vzorku. Moderní přístroje počítají plochu píku integrací. Metoda vnitřní normalizace – sečtou se jednotlivé plochy všech píků, které tvoří 100 % a plochy jednolitých píků pak tvoří procentuální části. Látkový zlomek složky i v procentech vypočítáme podle následujícího vzorce:
Při analáze stačí jeden nástřik, u kterého nemusíme znát objem (Klouda, 2003). Metoda absolutní kalibrace – při této metodě nastřikujeme známý objem vzorku a standardu za stejných podmínek a srovnáváme odpovídající plochy nebo výšky píků. Při metodě přímého srovnávání nastříkneme známý objem Vi látky i, jejíž koncentraci chceme stanovit a určíme plochu Ai. Za stejných podmínek pracujeme se standardem s. Při metodě kalibrační křivky nastříkneme několik vzorků standardu o různém objemu stanovované složky a sestrojíme kalibrační křivku závislosti plochy (výšky) píku na koncentraci. Z tohoto grafu odečítáme koncentraci složky ve vzorku (Klouda, 2003). Metoda vnitřní standardizace – ke vzorku se přidá známé množství standardu. Zároveň musí jít o látku, které není obsažena ve vzorku, a která vytváří samostatná pík v blízkosti píku stanovované složky (Klouda, 2003). Metoda standardního přídavku – při této metodě se nejprve dávkuje samostatný vzorek a poté vzorek, ke kterému se přidá známé množství standardu, který je stejný jako stanovovaná látka. Zvětšení plochy píku je přímo úměrné přidanému množství 36
standardu. Pro výpočet musí být známy objemy nástřiků a objemy míšeného vzorku a standardního přídavku (Klouda, 2003).
37
3 CÍLE DIPLOMOVÉ PRÁCE Cílem diplomové práce bylo stanovit mastné kyseliny v materiálech živočišného původu pomocí plynové chromatografie. Jako vhodný materiál byl zvolen Potemník moučný (Tenebrio molitor), přesněji jeho larvální stádium. Jednotlivé cíle: 1) ověřit hypotézu, zda jde krmnou dávkou ovlivnit obsah tuku a podíl mastných kyselin živočichů, konkrétně tedy larev potemníka. Z tohoto důvodu bylo zvoleno několik rozdílných krmiv s různým obsahem tuku a skladbou mastných kyselin. U těchto krmiv také proměřit zastoupení jednotlivých mastných kyselin. 2) ověřit, jak se změní složení mastných kyselin v rámci jednotlivých krmiv v závislosti na délce krmení. Z tohoto důvodu stanovit vhodné intervaly krmení. V každém z krmných intervalů ponechat jeden slepý vzorek pouze o jablku jako zdroji vody. 3) ověřit možnost zlepšení poměru kyseliny linolové a kyseliny linolenové v těle larev potemníka a určení z tohoto hlediska nejvhodnějšího krmiva.
38
4 MATERIÁL A METODIKA 4.1 Příprava vzorku Jak již bylo zmíněno výše, jako živočišný vzorek byla vybrána larva Potemníka moučného, Tenebrio molitor. Všechny larvy byly zakoupeny ve společnosti Aqua life s.r.o. na Táborské 192 v Brně. Jako krmivo byly použity rozemletá semena šalvěje, amarantu, konopí, lnu, hořčice, maku a řepky a dále mouka získaná ze zrníček z hroznového vína a mouka z konopí a granule ze zelených částí amarantu. Jeden vzorek larev byl vždy ponechán bez krmiva a porovnán jako slepý vzorek. Část krmiva byla zakoupena ve společnosti Oseva Brno, Spálená 1, zbylou část krmiva darovala firma Amr Amaranth a.s., Blansko. Pro vlastní pokus bylo krmivo namleto na mlýnku na kávu, viz příloha foto 1. První skupinky larev byly krmeny 4 týdny. Vždy 50 ml larev bylo umístněno do misek s víčky s otvory a s krmivem. Krmivo bylo larvám podáváno ad libitum. Každé skupince bylo krmivo doplňováno podle potřeby. V miskách byl uložen i kousek jablka, které poskytovalo larvám potřebnou vodu. Slepý vzorek byl ponechán pouze s jablkem. Vzorky larev byly umístněny v tmavé místnosti při pokojové teplotě. První skupinka larev byla označena názvy červi 1-11. Druhá skupinka larev byla krmena 2 týdny. V tomto případě byl postup identický, jenom bylo použito 25 ml larev, protože vzhledem ke kratší době krmení hrozila menší pravděpodobnost úmrtí či kanibalismu mezi larvami. Druhá skupinka larev byla označena červi 22-32. Fotografie jednotlivých krmiv s larvami jsou umístěny v příloze, foto 2-8. Po skončení stanovené doby krmení byly jednotlivé larvy ze zbytků krmiva ručně vybrány do označených igelitových sáčků a umístněny alespoň na 2 hodiny do mrazáku, kde došlo k jejich usmrcení. Zmrazené larvy potemníka se po té umístnily do lyofilizátoru. 4.1.1 Lyofilizace Vakuové vymrazování neboli lyofilizace je šetrný způsob, jak ze vzorků odstranit vodu. Využívá se nejen při sušení biologických materiálů, ale metoda se dá využít i např. při záchraně archiválií, jakými jsou staré knihy nebo dokumenty. Princip metody je založen na sublimaci zmrzlé vody při nízkém tlaku a teplotě. Výhodou je právě to, že nedochází k přímému přechodu vody z kapalného do plynného skupenství, čímž by 39
mohla být řada sušených materiálů poškozena. Samotná lyofilizace se skládá ze tří fází, první je zmrazení, po té následuje sušení a posledním krokem je dosušování. Zmražený vzorek se umístní do vakuové komory, kde dochází k sublimaci ledu, tedy zachytávání uvolněné vodní páry z ledu na ledovém kondenzátoru, který má velmi nízkou teplotu a označujeme jej jako „čerpadlo vodních par“. Toto čerpadlo odčerpává vzduch z vakuové komory nebo připojeného prostoru. Ze vzorku je tak odstraněna veškerá volná (chemicky nevázaná voda) a za vysokého tlaku může dojít i k odstranění krystalické vody. Tuto poslední část nazýváme dosušování. Tímto postupem jsme schopni snížit obsah vody ve vzorcích na 1 až 4 %, ale ostatní látky zůstanou ve vzorku zachovány. Vzorek larev byl zvážen a vložen v hliníkových miskách do lyofilizačního přístroje ALPHA 1-2 LO plus (Christ, LABIKOM), ve kterém byl nastaven program na 26 hod. Tento program 21 hodin vzorky vysušoval při teplotě – 40 °C a následně dosušoval 5 hodin při teplotě – 50 °C, vždy za podtlaku 35 mPa. Po vyjmutí z lyofilizátoru byly vzorky zváženy a použity na extrakci tuků. Současně se vzorky larev (červi 1-11 a červi 22-32), byly na extrakci použity i jednotlivá krmiva, a to za účelem stanovení celkového množství tuku a skladby jednotlivých mastných kyselin v krmivech. Vzorky krmiv jsou označeny jako krmení 12-21 a krmení 33-36. 4.1.2 Extrakce Extrakce probíhá v Soxhletově extraktoru. Princip této metody spočívá v tom, že se v baňce zahřívá organické rozpouštědlo, jehož výpary postupují až do zpětného chladiče, ve kterém dochází k jejich kondenzaci a rozpouštědlo tak stéká do střední části, do extrakčního prostoru, kde je umístěna papírová patrona se vzorkem. Jakmile dojde k naplnění prostoru extrahovadlem, přeteče roztok do baňky, kde se rozpouštědlo znovu zahřívá a odpařuje. Zlyofilizovaný a zvážený vzorek larev nebo zvážený vzorek krmiva se umístní do extrakční papírové patrony, která se vloží do střední části extraktoru, na spodní část se nasadí čistá, suchá a zvážená 250 ml baňka se zábrusem a do aparatury se nalije petrolether. Používá se 1,5 násobné množství rozpouštědla, než je objem střední extrakční části aparatury. Spodní baňka je umístěna ve vařiči VL-32 AVALIER, který zahřívá vodní lázeň. Extrakční aparatura musí být zapojena pod zpětným chladičem. Extrakce probíhá 3,5 až 4 hodiny při teplotě 65 °C. Zapojení Soxhletova extraktoru je viditelné v příloze, viz foto 9. Po skončení extrakce se sejme baňka, obsahující 40
vyextrahovaný tuk a přebytečné rozpouštědlo, které se odpaří na rotační vakuové odparce. Rozpouštědlo, které zůstane ve střední části extraktoru, se vylije do připravené nádoby na odpad. Extrakční patrona se vzorkem se z extraktoru vyjme a vyhodí. 4.1.3 Rotační vakuová odparka K odpaření přebytečného rozpouštědla byla použita rotační vakuová odparka HB3 Basic (KIKA Labortechnik). Vodní lázeň byla zahřátá na 60 °C a odpařování probíhalo za sníženého tlaku tak, aby nedocházelo k probublávání rozpouštědla s tukem. Po odpaření veškerého rozpouštědla, kdy na dně baňky zůstal pouze tuk, byla baňka s tukem zvážena. Ze zjištěných hodnot byl vypočítán celkový obsah tuku ve vzorcích. Tuk byl následně použit na derivatizaci. 4.1.4 Derivatizace mastných kyselin Aby bylo možné ve vzorcích tuků stanovit jednotlivé mastné kyseliny pomocí plynové chromatografie, musí se nejprve málo těkavé mastné kyseliny převést na těkavé estery mastných kyselin. Při kysele katalyzované transesterifikaci se pro všechny typy lipidů nejčastěji využívá flourid boritý v metanolu, pro reakci je potřeba teplo. Na zásaditě katalyzovanou transesterifikaci se běžně využívá methanolát sodný, reakce probíhá už při pokojové teplotě (Eder, 1995). Při měření pro tuto diplomovou práci jsem vycházela z metodiky Rozíkové (2010). Do čisté a suché 250 ml baňky s rovným dnem jsem navážila 0,05 g <0,04-0,06 g> čistého vzorku tuku, ke kterému jsem přidala 3 ml pentadekanové kyseliny (5 g∙l-1) od výrobce SIGMA-ALDRICH spol. s r.o., o čistotě GC a 3 ml methanolátu sodného (11,5 g∙l-1 Na v CH3OH), Na pocházel od výrobce Lach-ner s.r.o., o čistotě P.A,, tím se vytváří alkalické prostředí a vznikají soli mastných kyselin a alkoholické estery mastných kyselin. Směs jsem vložila pod zpětný chladič a zahřívala na 60 °C 5 minut. Po 5 minutách jsem přes zpětný chladič přidala 3 ml 14 % flouridu boritého v CH3OH, který pocházel od společnosti SIGMA-ALDRICH spol. s r.o., o čistotě GC a nechala směs zahřívat při 60 °C dalších 5 minut. Tímto postupem se esterifikuje v kyselém prostředí zbývající neesterifikovaná organická část. Po té jsem baňku se směsí sundala ze zpětného chladiče, přidala 3 ml isooktanu (M=114,23 g/mol), od společnosti Lachner s.r.o., o čistotě P.A. a 5 ml nasyceného roztoku NaCl, od společnosti Lach.ner s.r.o., o čistotě P.A. a směs 15 vteřin protřepávala. Vysolováním dochází ke spojení glycerinu s NaCl a vzniká sůl, která se vysráží. Sražená část se oddělí od zbylé organické části, vyvstane na povrchu směsi jako čirá vrstva. Tuto vrchní vrstvu jsem převedla do 41
zkumavky s Na2SO4, která se umístnila na autosampler plynového chromatografu, který následně nastřikoval 1 μl vzorku na vlastní analýzu. Na2SO4 pocházel od výrobce Lachner s.r.o. a měl čistotu P.A.
4.2 Nastavení chromatografu Vlastní měření proběhlo na plynovém chromatografu FISONS GC 8000 series, který je vybavený plamenově ionizačním detektorem (FID) a kapilární kolonou Capital Analytical RH-1 ms + (30 m x 0,25 mm x 0,25 μm), jež má teplotní limity od 60 do 360 °C. Kolona je vyrobená ze 100% dimethylpolysiloxanu a je vhodné ji využívat k analýze pesticidů, aminů, fenolů, FAME, MTBE, PCB, halogenidů a hydrocarbonů. 4.2.1 Parametry chromatografu Vlastní nastavení plynového chromatografu vychází z měření Rozíkové (2010). Split poměr top/bottom byl nastaven na 1:2, což ovlivňuje poměr odfouknutí rozpouštědla. Range vytváří rozsah píku na délku, s přidáváním hodnot klesá jeho výška a zvyšuje se rozsah. Jako nosný plyn byl použit dusík o průtoku 0,9 ml/min. Poměr vodíku a vzduchu zůstal 1:3, tedy 50 kPa:150 kPa. 4.2.2 Teplotní program Pro vlastní měření byl využit teplotní program, který začínal na 140 °C po dobu 5 minut, následně se teplota zvýšila teplotním gradientem 5 °C/min až na 240 °C, a které byla ponechána 5 minut. Teplotním gradientem 10 °C/min se teplota zvýšila až na 280 °C, kde byla ponechána 1 minutu. Teplota injektoru byla 260 °C a detektoru 260 °C.
4.3 Vyhodnocení Vlastní vyhodnocení probíhalo na počítači, pomocí softwaru Clarity. Výsledky získané z programu Clarity byly dále také statisticky vyhodnoceny programem STATISTICA.
42
5 VÝSLEDKY A DISKUSE 5.1 Výsledky Jednotlivé vzorky byly rozděleny do dvou skupin. Červi 1-11 byli krmeni 4 týdny, červi 22-32 byli krmeni 2 týdny. Vlastní jednotlivá krmení jsou označena jako krmení 12-21, přičemž krmení 33-36 jsou znovu změřený len, mák, šalvěj a amarant s tím rozdílem, že před vlastní extrakcí byla semena rozdrcena, aby se lépe vyextrahoval tuk. Veškeré navážky a zjištěná měření jsou uvedena v tabulce 1 v příloze. U každého vzorku byl měřením zjištěn celkový obsah tuku. Nejvíce tuku obsahovala řepka 43,64 %, mák 36,86 % hořčice 30,76 %, len 24,47 %, šalvěj 23,56 %, dále pak mouka z konopí 14,93 %, zelené konopí 11,59 %, mouka ze semen z hroznového vína 9,91 %, amarant zrno 5,03 % a amarant zelená hmota 3,38 %. Rozdíly v obsahu tuku u lnu, máku, šalvěje a zrna amarantu jsou způsobeny rozdrcením semen před extrakcí pomocí kuchyňského mlýnku na mák. Ostatní pokrutiny byly pomlety na elektrickém mlýnku, u těchto čtyř nebylo použití elektrického mlýnku vzhledem k velikosti semen možné. Pro vlastní krmení červů byla všechna krmiva rozdrcena nebo pomleta. Tab. 10 Obsah tuku jednotlivých krmiv v g a % z celkové hmotnosti vzorku název vzorku červi 1 červi 2 červi 3 červi 4 červi 5 červi 6 červi 7 červi 8 červi 9 červi 10 červi 11 krmení 12 krmení 13 krmení 14 krmení 15 krmení 16 krmení 17 krmení 18 krmení 19 krmení 20 krmení 21 červi 22 červi 23
použité krmení obsah tuku /g/ obsah tuku /%/ AMARANT ZELENÝ 0,4165 16,70 KONOPÍ ZELENÉ 1,2474 37,24 ŠALVĚJ 0,8488 55,27 LEN 1,8539 35,07 AMARANT ZRNO 0,1520 8,23 HOŘČICE 0,1318 9,89 MÁK 2,5603 39,81 SLEPÝ VZOREK 4 TÝDNY 0,4007 13,44 VÍNO MOUKA 0,3351 5,67 ŘEPKA 1,9520 24,34 KONOPÍ MOUKA 1,1818 18,38 ŘEPKA 2,5842 43,64 HOŘČICE 1,6618 30,76 MOUKA VÍNO 0,5781 9,91 KONOPÍ MOUKA 0,8332 14,93 MÁK 0,5731 9,58 LEN 0,4276 7,94 AMARANT ZELENÝ 0,1851 3,38 AMARANT ZRNO 0,1821 3,48 ŠALVĚJ 0,2559 5,06 KONOPÍ ZELENÉ 0,6907 11,59 AMARANT ZELENÝ 0,4838 15,38 KONOPÍ ZELENÉ 0,2060 3,93
43
červi 24 červi 25 červi 26 červi 27 červi 28 červi 29 červi 30 červi 31 červi 32 krmení 33 krmení 34 krmení 35 krmení 36
ŠALVĚJ LEN AMARANT ZRNO HOŘČICE MÁK SLEPÝ VZOREK 2 TÝDNY VÍNO MOUKA ŘEPKA KONOPÍ MOUKA LEN - DRCENÝ MÁK - DRCENÝ ŠALVĚJ - DRCENÁ AMARANT - DRCENÝ
1,2691 1,3122 0,9321 0,2532 0,2800 0,3300 0,5124 1,3479 2,0353 2,6545 5,5378 2,4234 0,6378
26,88 26,90 22,52 7,98 4,92 8,78 17,89 25,98 34,38 24,47 36,86 23,56 5,03
U všech krmiv byl pomocí GC stanoven obsah a množství jednotlivých mastných kyselin. Chromatogramy mastných kyselin jednotlivých krmiv jsou přiloženy v příloze. Tab. 11 Obsah jednotlivých mastných kyselin v % v použitých krmivech pentadekanová kyselina
krmení 12 krmení 13 krmení 14 krmení 15 krmení 16 krmení 17 krmení 18 krmení 19 krmení 20 krmení 21 krmení 33 krmení 34 krmení 35 krmení 36
palmitová kyselina
linolová kyselina
linolenová kyselina
olejová kyselina
stearová kyselina
arachidonová kyselina
řepka 4,95
4,43
6,72
44,87
36,67
2,36
0,00
10,44
4,90
1,41
37,62
24,80
2,18
18,66
3,42
4,40
14,31
27,24
46,03
4,61
0,00
1,17
13,69
11,38
48,23
20,52
3,82
1,19
10,72
13,11
16,44
31,04
25,83
2,86
0,00
17,61
11,61
25,57
45,21
0,00
0,00
0,00
40,33
7,31
19,17
33,19
0,00
0,00
0,00
21,09
7,28
41,04
30,59
0,00
0,00
0,00
3,78
3,10
14,10
65,79
8,70
4,53
0,00
2,40
2,80
22,70
55,62
14,08
2,40
0,00
3,77
5,39
16,60
59,23
11,63
3,38
0,00
0,57
8,73
10,40
64,73
13,70
1,86
0,00
0,04
8,73
16,50
47,84
24,09
2,80
0,00
0,00
14,65
42,42
42,94
0,00
0,00
0,00
hořčice mouka víno konopí mouka mák len amarant zelený amarant zrno šalvěj konopí zelené
len drcený mák drcený šalvěj drcená amarant drcený
-
44
70 60 50 40
pentadekanová kyselina palmitová kyselina
30
linolová kyselina 20
linolenová kyselina olejová kyselina
10
stearová kyselina arachidonová kyselina amarant - drcený
šalvěj - drcená
mák - drcený
len - drcený
konopí zelené
šalvěj
amarant zrno
amarant zelený
len
mák
konopí mouka
mouka víno
hořčice
řepka
0
krmení krmení krmení krmení krmení krmení krmení krmení krmení krmení krmení krmení krmení krmení 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 33 34 35 36
Obr. 5 Graf vyjadřující obsah mastných kyselin v % v jednotlivých krmivech
45
100,00
80,00
60,00 arachidonová
stearová 40,00
olejová linolenová linolová
20,00
palmitová
pentadekanová KONOPÍ MOUKA
KONOPÍ MOUKA
ŘEPKA
ŘEPKA
VÍNO MOUKA
VÍNO MOUKA
SLEPÝ VZOREK
SLEPÝ VZOREK
MÁK
MÁK
HOŘČICE
HOŘČICE
AMARANT ZRNO
AMARANT ZRNO
LEN
LEN
ŠALVĚJ
ŠALVĚJ
KONOPÍ ZELENÉ
KONOPÍ ZELENÉ
AMARANT ZELENÝ
AMARANT ZELENÝ
0,00
červi červi červi červi červi červi červi červi červi červi červi červi červi červi červi červi červi červi červi červi červi červi 22 1 23 2 24 3 25 4 26 5 27 6 28 7 29 8 30 9 31 10 32 11
Obr. 6 Graf zobrazuje porovnání obsahu mastných kyselin v % u skupin larev Tenebrio molitor
46
Na obrázku 6 je zobrazeno spektrum mastných kyselin u skupin larev Tenebrio molitor, vždy je v grafu nejprve umístěn vzorek, který byl krmen kratší dobu, tedy 2 týdny a následuje vzorek, který se krmil déle, 4 týdny. Obecným předpokladem bylo, že by délka krmení mohla ovlivnit množství jednotlivých mastných kyselin v pozitivním slova smyslu. Z grafu je však patrné, že záleží na konkrétní kyselině a nejen na době krmení. Z výživového hlediska je důležitý obsah kyseliny linolové a kyseliny linolenové. Jak již bylo zmíněno výše, poměr kyseliny linolové a kyseliny linolenové v dietě člověka by měl být 5:1, ideálně 1:1. Jedním z cílů práce tedy bylo zlepšit poměr těchto dvou kyselin skladbou krmné dávky.
slepý vzorek 45,00 obsah mastné kyseliny %
40,00 pentadekanová
35,00 30,00
palmitová
25,00
linolová
20,00
linolenová
15,00
olejová
10,00
stearová
5,00
arachidonová
0,00 2 týdny
4 týdny
Obr. 7 Graf výchozího obsahu mastných kyselin u jednotlivých slepých vzorků Z obrázku 7 je patrný počáteční obsah jednotlivých mastných kyselin ve slepých vzorcích, které byly použity na 2 a 4 týdenní krmení. U skupinky, která byla dále krmena 2 týdny je poměr kyseliny linolové ku kyselině linolenové přibližně 1:2, v druhém případě u skupinky, která byla použita na 4 týdenní krmení je tento poměr asi 1:4 ve prospěch kyseliny linolenové. Vzorky se liší v počátečním obsahu mastných kyselin. To může být způsobeno jednak tím, že byly koupeny v časovém rozestupu 2 týdnů a jak uvádí Borkovcová (Finke, 2004), chemické složení hmyzu je závislé na mnoha faktorech, např. i na vývojovém stádiu jednotlivého druhu, a za druhé může být tato skutečnost způsobena tím, že ve skupině, která byla držena delší dobu pouze o jablku, jako zdroji vody, mohlo docházet ke kanibalismu.
47
amarant zelený 40,00
obsah mastné kyseliny %
35,00 pentadekanová
30,00
palmitová
25,00
linolová 20,00
linolenová
15,00
olejová
10,00
stearová arachidonová
5,00 0,00 2 týdny
4 týdny
Obr. 8 Graf závislosti změny obsahu jednotlivých mastných kyselin v závislosti na délce krmení zeleným amarantem U zeleného amarantu byl po 2 týdnech větší obsah kyseliny linolenové a to 34,98 %, obsah kyseliny linolové byl 11,93 %. Poměr obou kyselin byl tím pádem téměř 3:1. Po 4 týdnech krmení se obsah kyseliny linolenové snížil na 14,02 % a zároveň se zvýšil obsah kyseliny linolové na 18,42 %. Poměr kyselin se tak téměř vyrovnal.
konopí zelené 45,00 obsah mastné kyseliny %
40,00 35,00
pentadekanová
30,00
palmitová
25,00
linolová
20,00
linolenová
15,00
olejová
10,00
stearová
5,00
arachidonová
0,00 2 týdny
4 týdny
Obr. 9 Graf závislosti změny obsahu jednotlivých mastných kyselin v závislosti na délce krmení zeleným konopím
48
U zeleného konopí se po 2 týdnech krmení ve vzorku vyskytovala pouze kyselina linolová s 30,57 %, po 4 týdnech se již ve vzorku vyskytovaly obě mastné kyseliny a to v poměru téměř 2:1 ve prospěch kyseliny linolové, které bylo ve vzorku 40,87 %. Kyselina linolenová se vyskytovala v množství 28,41 %.
šalvěj
obsah mastné kyseliny %
70,00 60,00
pentadekanová
50,00
palmitová
40,00
linolová
30,00
linolenová olejová
20,00
stearová 10,00
arachidonová
0,00 2 týdny
4 týdny
Obr. 10 Graf závislosti změny obsahu jednotlivých mastných kyselin v závislosti na délce krmení šalvějí španělskou Ve vzorku larev, který byl krmen šalvějí, se po 2 týdenním krmení vyskytovalo 60,04 % kyseliny linolenové a 3,77 % kyseliny linolové. Obě kyseliny se tak vyskytovaly v poměru 16:1 pro kyselinu linolenovou. Při delším, 4 týdenním krmení, se snížil obsah kyseliny linolenové na 42,31 % a zvýšil obsah kyseliny linolové na 25,50 %, poměr obou kyselin se tak snížil na téměř 2:1, ale stále pro kyselinu linolenovou.
49
len
obsah mastné kyseliny %
70,00 60,00
pentadekanová
50,00
palmitová
40,00
linolová
30,00
linolenová olejová
20,00
stearová 10,00
arachidonová
0,00 2 týdny
4 týdny
Obr. 11 Graf závislosti změny obsahu jednotlivých mastných kyselin v závislosti na délce krmení lnem Pokud byl jako krmení použit rozdrcený len, vystoupalo množství kyseliny linolenové po 2 týdenním krmení na 59,08 %, kyseliny linolové vzorek obsahoval 11,73 %, poměr obou kyselin byl tedy 5:1 ve prospěch příznivé kyseliny linolenové. Po 4 týdenním krmení se snížil obsah kyseliny linolenové na 29,57 % a zvýšil se obsah kyseliny linolové na 29,82 %, poměr obou kyselin se tak vyrovnal na 1:1.
amarant zrno 40,00 obsah mastné kyseliny %
35,00 pentadekanová
30,00
palmitová
25,00
linolová
20,00
linolenová
15,00
olejová
10,00
stearová
5,00
arachidonová
0,00 2 týdny
4 týdny
Obr. 12 Graf závislosti změny obsahu jednotlivých mastných kyselin v závislosti na délce krmení zrnem amarantu Při krmení vzorků zrnem amarantu bylo při 2 týdenním krmení množství kyseliny linolenové 38,09 % a množství kyseliny linolové 3,07 %, poměr obou kyselin byl tím 50
pádem téměř 13:1 ve prospěch kyseliny linolenové. Při delším, 4 týdenním krmení se snížil obsah kyseliny linolenové na 15,75 % a obsah kyseliny linolové vzrostl na 11,27 %, poměr obou kyselin se tak téměř vyrovnal.
horčice
obsah mastné kyseliny %
40,00 35,00
pentadekanová
30,00
palmitová
25,00
linolová
20,00
linolenová
15,00
olejová
10,00
stearová
5,00
arachidonová
0,00 2 týdny
4 týdny
Obr. 13 Graf závislosti změny obsahu jednotlivých mastných kyselin v závislosti na délce krmení hořčicí U vzorku krmeného hořčicí byl stanoven obsah kyseliny linolenové na 26,30 %, obsah kyseliny linolové na 10,29 %, poměr obou kyseliny byl tedy 2:1 pro kyselinu linolenovou. Při 4 týdenním krmení se obsah kyseliny linolenové téměř nezměnil, nově změřená hodnota byla 24,86 %, ale zároveň se zvýšil obsah kyseliny linolové na 20,84 %, tím pádem se poměr obou kyselin skoro vyrovnal.
mák obsah mastné kyseliny %
70,00 60,00
pentadekanová
50,00
palmitová
40,00
linolová
30,00
linolenová
20,00
olejová stearová
10,00
arachidonová
0,00 2 týdny
4 týdny
Obr. 14 Graf závislosti změny obsahu jednotlivých mastných kyselin v závislosti na délce krmení makem 51
Pokud byl jako krmivo použit mák, byla naměřena hodnota kyseliny linolenové po 2 týdenním krmení 37,74 % a hodnota kyseliny linolové 62,26 %, poměr obou kyseliny byl tedy 1:2 ve prospěch kyseliny linolové. Po 4 týdenním krmení se rapidně snížil obsah kyseliny linolové na 12,63 % a zároveň se zvýšil obsah kyseliny linolenové. Poměr obou kyselin se tak obrátil a to na téměř 4:1 ve prospěch kyseliny linolenové.
víno mouka 45,00 obsah mastné kyseliny %
40,00 35,00
pentadekanová
30,00
palmitová
25,00
linolová
20,00
linolenová
15,00
olejová
10,00
stearová
5,00
arachidonová
0,00 2 týdny
4 týdny
Obr. 15 Graf závislosti změny obsahu jednotlivých mastných kyselin v závislosti na délce krmení moukou ze zrníček vína U vzorků, které byly krmeny moukou vyrobenou ze zrníček hroznového vína byl změřen obsah kyseliny linolenové 34,88 % a obsah kyseliny linolové 14,53 % po 2 týdenním krmení. Poměr obou kyselin byl tedy 2:1 pro kyselinu linolenovou. Při delším, 4 týdenním krmení se klesl obsah kyseliny linolenové na 25,76 % a obsah kyseliny linolové na 11,75 %. Poměr obsahu obou kyseliny se tedy výrazně nezměnil.
52
řepka 50,00 obsah mastné kyseliny %
45,00 40,00
pentadekanová
35,00
palmitová
30,00
linolová
25,00
linolenová
20,00
olejová
15,00
stearová
10,00
arachidonová
5,00 0,00 2 týdny
4 týdny
Obr. 16 Graf závislosti změny obsahu jednotlivých mastných kyselin v závislosti na délce krmení řepkou Pokud byla jako krmivo použita řepka, byly naměřeny následující hodnoty. Obsah kyseliny linolenové po 2 týdenním krmení byl 45,36 %, obsah kyseliny linolové byl 5,15 %, poměr obou kyselin byl téměř 9:1 ve prospěch kyseliny linolenové. U vzorků, které byly krmeny delší dobu, a to 4 týdny, se obsah těchto dvou kyselin téměř nezměnil, pouze mírně poklesl. Obsah kyseliny linolenové byl 43,02 %, obsah kyseliny linolové 4,52 %. Poměr kyselin se tím pádem zvýšil na téměř 10:1 pro kyselinu linolovou.
konopí mouka 50,00 obsah mastné kyseliny %
45,00 40,00
pentadekanová
35,00
palmitová
30,00
linolová
25,00
linolenová
20,00
olejová
15,00
stearová
10,00
arachidonová
5,00 0,00 2 týdny
4 týdny
Obr. 17 Graf závislosti změny obsahu jednotlivých mastných kyselin v závislosti na délce krmení moukou z konopí 53
Vzorky, které byly krmeny moukou z konopného zrna, obsahovaly 36,61 % kyseliny linolenové a 6,39 % kyseliny linolové po 2 týdenním krmení. Poměr obou kyselin byl téměř 6:1 pro kyselinu linolenovou. Po 4 týdenním krmení se obsah kyseliny linolenové zvýšil na 43,13 % a obsah kyseliny linolové se snížil na 5,62 %.
100,00 90,00 80,00 70,00 60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00 KONOPÍ MOUKA
ŘEPKA
VÍNO MOUKA
MÁK
HOŘČICE
AMARANT ZRNO
LEN
ŠALVĚJ
KONOPÍ ZELENÝ
linolenová AMARANT ZELENÝ
obsah mastné kyseliny v %
Poměr těchto dvou kyselin se tak zvýšil ve prospěch kyseliny linolenové na téměř 8:1.
linolová
2 4 2 4 2 4 2 4 2 4 2 4 2 4 2 4 2 4 2 4
Obr. 18 Poměr kyseliny linolové ku kyselině linolenové Jak se v závislosti na zvoleném typu krmení a době krmení změnil poměr obsahu kyseliny linolové a kyseliny linolenové je zobrazeno na obr. 18, nejprve je v grafu umístěn vzorek, který byl krmen 2 týdny, po té vzorek, který byl stejným krmením krmen 4 týdny.
54
AMARANT ZELENÝ
KONOPÍ ZELENÉ
KONOPÍ ZELENÉ
ŠALVĚJ
ŠALVĚJ
LEN
LEN
AMARANT ZRNO
AMARANT ZRNO
HOŘČICE
HOŘČICE
MÁK
MÁK
SLEPÝ VZOREK
SLEPÝ VZOREK
VÍNO MOUKA
VÍNO MOUKA
ŘEPKA
ŘEPKA
KONOPÍ MOUKA
KONOPÍ MOUKA
45,00 40,00 35,00 30,00 25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 0,00 AMARANT ZELENÝ
obsah mastné kyseliny v %
pentadekanová kyselina
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
Obr. 19 Množství pentadekanové kyseliny u jednotlivých vzorků v závislosti na druhu krmné dávky Pentadekanovou kyselinu z jednotlivých krmení nejvíce obsahoval zelený amarant, a to 40,33 %, dále pak větší obsah, 21,09 %, byl v zrnu amarantu a 17,61 % obsahoval len (obr. 6). Po krmení se nejvíce pentadekanové kyseliny uložilo ve vzorku, který byl krmen zeleným konopím 2 týdny, přesněji 42,74 %, poté vzorek krmený 4 týdny hořčicí 33,01 % a vzorek krmený 4 týdny zrnem amarantu 16 %.
AMARANT ZELENÝ
KONOPÍ ZELENÉ
KONOPÍ ZELENÉ
ŠALVĚJ
ŠALVĚJ
LEN
LEN
AMARANT ZRNO
AMARANT ZRNO
HOŘČICE
HOŘČICE
MÁK
MÁK
SLEPÝ VZOREK
SLEPÝ VZOREK
VÍNO MOUKA
VÍNO MOUKA
ŘEPKA
ŘEPKA
KONOPÍ MOUKA
KONOPÍ MOUKA
30,00 25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 0,00 AMARANT ZELENÝ
obsah mastné kyseliny %
palmitová kyselina
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
Obr. 20 Množství palmitové kyseliny u jednotlivých vzorků v závislosti na druhu krmné dávky 55
Palmitovou kyselinu nejvíce obsahovalo zrno amarantu 14,65 %, dále mouka z konopí 13,69 % a mák 13,11 % (obr. 6). Po krmení byl z hlediska kyseliny palmitové nejvíce ovlivněn vzorek, který byl krmen 2 týdny zeleným konopím, který na konci krmení obsahoval 26,70 % kyseliny palmitové. Dále pak vzorek, který se 2 týdny krmil zrnem amarantu 24,21 % a vzorek, který se 2 týdny krmil moukou z konopí 17,89 % kyseliny palmitové.
AMARANT ZELENÝ
KONOPÍ ZELENÉ
KONOPÍ ZELENÉ
ŠALVĚJ
ŠALVĚJ
LEN
LEN
AMARANT ZRNO
AMARANT ZRNO
HOŘČICE
HOŘČICE
MÁK
MÁK
SLEPÝ VZOREK
SLEPÝ VZOREK
VÍNO MOUKA
VÍNO MOUKA
ŘEPKA
ŘEPKA
KONOPÍ MOUKA
KONOPÍ MOUKA
70,00 60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00 AMARANT ZELENÝ
obsah mastné kyseliny %
linolová kyselina
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
Obr. 21 Množství linolové kyseliny u jednotlivých vzorků v závislosti na druhu krmné dávky Linolová kyselina byla nejvíce obsažena v zrnu amarantu 42,42 %, dále pak ve lnu 25,57 % a v zeleném konopí 22,70 % (obr. 6). Obsah kyseliny linolové ve vzorcích se nejvíce projevil u vzorku, který byl 2 týdny krmen makem, konkrétně se obsah kyseliny linolové zvýšil na 62,26 %. Na dalších dvou místech se, co do obsahu kyseliny linolové, osvědčilo krmení zeleným konopím. U 4 týdenního vzorku byla obsah kyseliny linolové 40,87 %, u 2 týdenního vzorku 30, 57 %. Větší obsah kyseliny linolové obsahoval také vzorek, který byl 4 týdny krmen lnem, v tomto případě byl obsah 29,82 %.
56
AMARANT ZELENÝ
KONOPÍ ZELENÉ
KONOPÍ ZELENÉ
ŠALVĚJ
ŠALVĚJ
LEN
LEN
AMARANT ZRNO
AMARANT ZRNO
HOŘČICE
HOŘČICE
MÁK
MÁK
SLEPÝ VZOREK
SLEPÝ VZOREK
VÍNO MOUKA
VÍNO MOUKA
ŘEPKA
ŘEPKA
KONOPÍ MOUKA
KONOPÍ MOUKA
70,00 60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00 AMARANT ZELENÝ
obsah mastné kyseliny %
linolenová kyselina
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
Obr. 22 Množství linolenové kyseliny u jednotlivých vzorků v závislosti na druhu krmné dávky Linolenová kyseliny byla téměř u všech krmení majoritně zastoupenou kyselinou. Nejvíce jí obsahovala šalvěj 65,79 %, dále pak mák 64,73 %, len 59,23 %, zelené konopí 55,62 % a mouka z konopí 48,23 %. Po samotném krmení se množství kyseliny linolenové nejvíce zvýšilo u vzorku, který byl 2 týdny krmen šalvějí, a to na 60,04 %. Vzorek, který byl 2 týdny krmen lnem, obsahoval 59,08 % kyseliny linolené a vzorek, který byl 4 týdny krmen makem obsahoval 45,46 % kyseliny. Oba vzorky, které byly krmeny řepkou, obsahovaly také větší množství kyseliny linolenové. 2 týdenní vzorek obsahoval 45,36 % a 4 týdenní vzorek obsahoval 43,02 % kyseliny linolenové.
57
AMARANT ZELENÝ
KONOPÍ ZELENÉ
KONOPÍ ZELENÉ
ŠALVĚJ
ŠALVĚJ
LEN
LEN
AMARANT ZRNO
AMARANT ZRNO
HOŘČICE
HOŘČICE
MÁK
MÁK
SLEPÝ VZOREK
SLEPÝ VZOREK
VÍNO MOUKA
VÍNO MOUKA
ŘEPKA
ŘEPKA
KONOPÍ MOUKA
KONOPÍ MOUKA
45,00 40,00 35,00 30,00 25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 0,00 AMARANT ZELENÝ
obsah mastné kyseliny %
olejová kyselina
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
Obr. 23 Množství olejové kyseliny u jednotlivých vzorků v závislosti na druhu krmné dávky Olejovou kyseliny nejvíce obsahovalo krmení tvořené moukou ze zrníček z vinných hroznů, přesněji 46,03 %. Dále pak měla větší obsah olejové kyseliny řepka, a to 36,67 %. Větší množství kyseliny olejové obsahoval i mák, 25,83 % (obr. 6). Obecně větší obsah olejové kyseliny obsahoval vzorky, které byly krmeny olejnatějšími krmivy. Nejvíce olejové kyseliny obsahovaly vzorky krmené moukou ze semínek hroznového vína, po 2 týdenním krmení vzorek obsahoval 38,94 %, a po 4 týdenní krmení 38,02 % kyseliny. Vzorky, které byly krmené řepkou, obsahovaly po 4 týdenním krmení 37,91 % a po 2 týdenním krmení 35,83 % kyseliny olejové. Vzorek, který byl 2 týdny krmen hořčicí, obsahoval 36,32 % kyseliny. Větší množství olejové kyseliny obsahovaly i vzorky krmené moukou z konopí. Po 2 týdenním krmení se změnilo množství olejové kyseliny na 36,10 %, po 4 týdenním krmení klesl obsah kyseliny na 30,81 %.
58
AMARANT ZELENÝ
KONOPÍ ZELENÉ
KONOPÍ ZELENÉ
ŠALVĚJ
ŠALVĚJ
LEN
LEN
AMARANT ZRNO
AMARANT ZRNO
HOŘČICE
HOŘČICE
MÁK
MÁK
SLEPÝ VZOREK
SLEPÝ VZOREK
VÍNO MOUKA
VÍNO MOUKA
ŘEPKA
ŘEPKA
KONOPÍ MOUKA
KONOPÍ MOUKA
12,00 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 AMARANT ZELENÝ
obsah mastné kyseliny %
stearová kyselina
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
Obr. 24 Množství stearové kyseliny u jednotlivých vzorků v závislosti na druhu krmné dávky Stearová kyselina byla nejvíce obsažena v mouce vyrobené ze semen hroznového vína 4,61 %, v šalvěji 4,53 %, dále pak v mouce z konopí 3,82 % (obr. 6). Po krmení se stearová kyselina nejvíce nahromadila ve vzorku, který byl 4 týdny krmen moukou z vína, a to 9,82 %. Vzorek, který byl 4 týdny krmen zrnem amarantu obsahoval 5,84 % kyseliny stearové a vzorek, který byl 4 týdny krmen šalvějí, obsahoval 4,95 % stearové kyseliny.
AMARANT ZELENÝ
KONOPÍ ZELENÉ
KONOPÍ ZELENÉ
ŠALVĚJ
ŠALVĚJ
LEN
LEN
AMARANT ZRNO
AMARANT ZRNO
HOŘČICE
HOŘČICE
MÁK
MÁK
SLEPÝ VZOREK
SLEPÝ VZOREK
VÍNO MOUKA
VÍNO MOUKA
ŘEPKA
ŘEPKA
KONOPÍ MOUKA
KONOPÍ MOUKA
6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 AMARANT ZELENÝ
obsah mastné kyseliny %
arachidonová kyselina
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
Obr. 25 Množství arachidonové kyseliny u jednotlivých vzorků v závislosti na druhu krmné dávky Vlastní arachidonová kyselina byla obsažena především v hořčici, která jí obsahovala 18,66 % a dále pak v mouce z konopí 1,19 % (obr. 6). Po pokusu s krmením 59
obsahovaly arachidonovou kyseliny pouze 3 vzorky. Nejvíce jí obsahoval vzorek, který byl 4 týdny krmen moukou ze zrníček hroznového vína, a to 5,68 %, dále pak vzorek, který byl 4 týdnem krmen zrnem amarantu, obsahoval 2,49 % kyseliny a vzorek, který byl 4 týdny krmen moukou z konopí, obsahoval 0,84 % arachidonové kyseliny. 5.1.1 Statistika Statistické výsledky byly zpracovány pomocí programu STATISTICA. Tab. 12 T-test porovnání rozdílu mezi vzorky krmenými 2 a 4 týdny
V tabulce 12 je porovnání souborů larev krmených 2 a 4 týdny pomocí t-testu. Na hladině pravděpodobnosti 95% nebyl shledán celkový rozdíl mezi dobou krmení 2 a 4 týdny. Tab. 13 ANOVA porovnání rozdílu nárůstu jednotlivých mastných kyselin v rámci varianty 2 týdny
Výsledky byly zpracovány metodou analýzy rozptylu a specifikovány Duncanovým testem (program Statistika 10.0, Anova). Jednotlivá čísla odpovídají mastným kyselinám 1 – kyselina pentadekanová, 2 – kyselina palmitová, 3 – kyselina linolová, 4 – kyselina linolenová, 5 – kyselina olejová, 6 – kyselina stearová, 7 – kyselina arachidonová. Kde je hodnota v tabulce zvýrazněna červeně, je průkazný rozdíl na hladině pravděpodobnosti 95 % mezi jednotlivými kyselinami. Varianta krmení 2 týdny nevykazuje tak vysoký nárůst v obsahu mastných kyselin jako varianta 4 týdny.
60
Tab. 14 ANOVA porovnání rozdílu nárůstu jednotlivých mastných kyselin v rámci varianty 4 týdny
Výsledky byly zpracovány metodou analýzy rozptylu a specifikovány Duncanovým testem (program Statistika 10.0, Anova). Jednotlivá čísla odpovídají mastným kyselinám 1 – kyselina pentadekanová, 2 – kyselina palmitová, 3 – kyselina linolová, 4 – kyselina linolenová, 5 – kyselina olejová, 6 – kyselina stearová, 7 – kyselina arachidonová. Kde je hodnota v tabulce zvýrazněna červeně, je průkazný rozdíl, na hladině pravděpodobnosti 95 % mezi jednotlivými kyselinami. Varianta krmení 4 týdny vykazuje průkazně vyšší nárůst obsahu jednotlivých mastných kyselin na hladině 95%.
61
5.2 Diskuze Možnost využití larev Potemníka moučného jako funkční potraviny a ovlivnění jeho nutričního složení vhodnou skladbou krmné dávky vychází z prací doc. Ing. Borkovcové Ph.D. Konkrétně se jedná o články Množství a složení tuků vybraných zástupců hmyzu (Borkovcová, 2011) a Potemník moučný jako funkční potravina (Borkovcová, 2012). V obou pracích se Borkovcová snaží potvrdit hypotézu, že složení a množství tuku lze u hmyzu ovlivnit složením krmné dávky. Jako základní hmyz vybírá mimo jiné Potemníka moučného (Tenebrio molitor), kterého krmí v první práci pouze otrubami, směsí otrub a šalvěje španělské v poměru 1:1 a jenom šalvějí španělskou. Ve druhé práci jako krmivo přidává ještě směs otrub a lnu setého v poměru 1:1. Jednotlivý vzorek tvořilo 100 g hmyzu a 50 g krmiva, které bylo obden doplňováno. Jako zdroj vody hmyzu sloužil kousek jablka. Délka krmení byla 7 dní. Pro porovnání s diplomovou prací uvádím pouze výsledky pokusu v případě Potemníka moučného. Pokud byl Potemník moučný krmen pouze otrubami, obsahoval 9,64 % tuku, při krmení šalvějí a otrubami 1:1 7,45 % tuku, při krmení samotnou šalvějí 10,75 % tuku. Obsah jednotlivých mastných kyselin v základním vzorku larev potemníka je uveden v tabulce 15, spolu s výsledky Borkovcové jsou pro porovnání z jejího článku převzaty i výsledky jiných autorů a pro přehlednost přiloženy i výsledky slepých vzorků změřených v rámci diplomové práce. Tab. 15 Spektrum mastných kyselin v % z celkového tuku mastná kyselina myristová pentadekanová palmitová stearová arachová palmitolejová olejová linolová linolenová arachidonová EPA DHA
Borkovcová, 2011 2,70 20,03 4,43 0,50 0,80 30,60 41,23 0,0 0,0 0,0 0,0
Aguilar-Miranda et al., 2002 1,77 6,76 1,46 0,08 1,51 19,77 8,51 0,11 -
62
Finke, 2001 2,16 17,09 2,91 2,61 39,96 9,13 0,37 -
slepý vzorek 2 4 týdny týdny 13,75 6,53 13,79 18,36 2,77 4,62 30,69 23,18 10,20 6,40 28,80 40,90 0,0 0,0 -
Výsledky jednotlivých autorů se ve většině případů liší jak mezi sebou samými, tak mezi výsledky, které byly naměřeny v rámci diplomové práce. Rozdíly v obsahu mastných kyselin mohou být způsobeny různými podmínkami chovu larev a především krmnou dávkou, ať už co se délky krmení či konkrétního původu krmiva týče. Finke (2001) choval hmyz na různých druzích obilných šrotů, Aguilar-Miranda et al. (2002) dokrmovali hmyz kukuřičným šrotem, tvrdým pečivem a zeleninou, Borkovcová (2011) chovala hmyz na otrubách a pro potřeby diplomové práce byly oba slepé vzorky ponechány pouze o jablku jako zdroji vody. Následující tabulka uvádí spektrum mastných kyselin ovlivněné krmnou dávkou. Borkovcová (2012) používá len a otruby v poměru 1:1 a otruby a šalvěj v poměru 1:1. Pro porovnání jsou v tabulce uvedeny i vzorky, které byly pro potřeby diplomové práce krmeny pouze lnem a šalvějí. Tab. 16 Rozdíly ve spektru mastných kyselin způsobené různou krmnou dávkou v % z celkového tuku mastná kyselina Myristová Palmitová Palmitolejová Stearová Olejová Linolová Linolenová Arachidonová
Borkovcová, 2012 šalvěj otruby + len otruby + šalvěj 2 1:1 1:1 týdny 1,5 1,57 14,33 14,67 14,86 0,60 1,37 2,47 2,90 4,03 24,20 20,80 14,05 33,23 32,97 3,77 22,00 25,53 60,04 0,0
4 týdny 9,64 4,95 15,99 25,50 42,31 0,0
len 2 týdny 9,42 3,71 13,36 11,73 59,08 0,0
4 týdny 8,65 2,08 19,16 29,82 29,57 0,0
Všechny výsledky však potvrzují hypotézu, že by hmyz, konkrétně larvy Potemníka moučného, mohl být využíván jako funkční potravina, u které by navíc šel obsah tuku a složení mastných kyselin ovlivnit speciálně upravenou krmnou dávkou. U všech vzorků došlo nejenom ke změně v obsahu jednotlivých mastných kyselin, ale došlo především ke změně poměru nasycených (SAFA), mononenasycených (MUFA) a polynenasycených (PUFA) mastných kyselin. Borkovcová uvádí tento poměr SAFA:MUFA:PUFA při krmení pouze otrubami 3:3:4, při krmení šalvějí 2:2:6 a při krmení šalvějí a otrubami (1:1) 2:2:6. Protože je poměr mastných kyselin shodný u skupiny, která byla krmena pouze šalvějí, se skupinou, která měla krmnou dávku složenou ze šalvěje a otrub v poměru 1:1, uvádí Borkovcová (2011), že krmivo
63
s vysokým obsahem určité látky má vliv pouze do určité koncentrace této látky a pak už hmyz nereaguje. Tuto myšlenku nemůže tato diplomová práce ani vyvrátit ani potvrdit, jelikož byly všechny vzorky chovány jenom v jednotlivých krmivech a lišila se pouze doba, po kterou byly v krmivu ponechány. V tabulce 17 jsou uvedeny poměry SUFA:MUFA:PUFA u jednotlivých vzorků využitých v rámci diplomové práce. Tab. 17 Poměr SUFA:MUFA:PUFA krmení 2 týdny 4 týdny 1:1:2 1:1:1 Amarant zelený 2:0:1 7:1:17 Konopí zelené 2:1:5 1:1:4 Šalvěj 1:1:6 1:1:3 Len 1:1:2 1:1:1 Amarant zrno 1:1:1 17:1:15 Hořčice 0:0:1 1:1:3 Mák 1:1:1 1:1:2 Slepý vzorek 1:3:4 1:2:2 Víno mouka 1:3:4 1:2:3 Řepka 1:2:2 1:2:3 Konopí mouka
Optimální poměr SAFA:MUFA:PUFA ve výživě člověka by měl být 3:5:2, tomuto poměru se alespoň částečně přiblížily vzorky, které byly 2 týdny krmeny řepkou, moukou z konopí a moukou ze semínek hroznového vína. Ze vzorků, které měřila Borkovcová (2011) se žádný tomuto poměru nepřiblížil. Vzhledem k novým objevům ve výživě člověka není důležitý pouze poměr SAFA:MUFA:PUFA, ale i poměr ω-6 a ω-3 mastných kyselin, který by měl být 5:1, ideálně 1:1. Z výše uvedených výsledků vyplývá, že lze krmnou dávkou ovlivnit i poměr těchto dvou kyselin a to dokonce ve prospěch kyseliny linolenové. Ve většině případů byl po 2 týdenním krmení poměr ω-6 a ω-3 mastných kyselin ve prospěch kyseliny linolenové. U zeleného amarantu 3:1, u šalvěje 16:1, u lnu 5:1, u zrna amarantu 13:1, u hořčice 2:1, u mouky ze semínek hroznového vína 2:1, u řepky 9:1 a u mouky z konopí 6:1. U máku byl poměr kyselin 2:1 ve prospěch kyseliny linolové. U zeleného konopí se po 2 týdnech vyskytovala pouze kyselina linolová. Na první pohled se tak nejlepším krmivem pro zlepšení poměru mastných kyselin ve prospěch kyseliny linolenové jeví zrno amarantu a šalvěj, kde byly rozdíly největší. V obou případech však u vzorků, které byly krmeny 4 týdny, nastal výrazný pokles kyselin. U šalvěje klesl poměr kyselin na 2:1 ve prospěch kyseliny linolenové a u zrna amarantu se poměr obou kyselin téměř vyrovnal. U jediné řepky se poměr obou kyselin 64
s prodlužující se délkou krmení výrazně nezměnil, především neklesl jako u většiny ostatních vzorků, ale naopak se zvýšil na 10:1. Z tohoto důvodu se řepka zdá být nejlepším krmivem, i pro její dostupnost, snadné mletí a možnosti využití například řepkové oleje do krmiv.
65
6 ZÁVĚR Záměr využití larev Potemníka moučného jako funkční potraviny po té, co se u něj obsah nutrietů ovlivní skladbou krmné dávky, vychází z prací doc. Ing. Marie Borkovcové, Ph.D. Tato hypotéza byla zkoumána v rámci diplomové práce a byly provedeny následující zjištění: Vzhledem k výsledkům měření nejen v rámci diplomové práce, ale i s ohledem na výsledky vycházející z odborných publikací u ostatních autorů lze prohlásit, že se potvrdila hypotéza, že obsah tuku u hmyzu, konkrétně u larev Potemníka moučného, je poměrně variabilní, i co se obsahu jednotlivých mastných kyselin týče. Výzkumem bylo potvrzeno, že skladba těchto kyselin a především poměr SUFA:MUFA:PUFA jde ovlivnit vhodnou skladbou krmné dávky. Také se prokázalo, že jde krmením ovlivnit i poměr kyselin linolové a linolenové. Z výsledků je patrné, že některé vzorky měly dokonce podíl kyseliny linolové a linolenové značně větší ve prospěch druhé z nich. To poukazuje na potenciální možnosti využití určitých druhů hmyzu jako funkční potraviny, kdy by se nejprve mohl hmyz cíleně vykrmit vhodnými mastnými kyselinami a následně použít ve výživě člověka jako potrava obsahující vyváženou skladbu esenciálních mastných kyselin. Zároveň se také prokázalo, že délka krmné dávky ovlivňuje podíl jednotlivých mastných kyselin. Tento podíl se s prodlužující se délkou krmení měnil většinou v neprospěch kyseliny linolenové, s výjimkou vzorku řepky, kde zůstal poměr kyseliny linolové a linolenové téměř nezměněn. Také z tohoto důvodu se právě řepka olejka jeví jako nejvhodnější krmivo pro larvy Potemníka moučného, u jejíhož vzorku byl rozdíl v poměrech mastných kyselin výrazný a to 9:1 po 2 týdnech krmení a 10:1 po 4 týdnech krmení pro kyselinu linolenovou. Navíc je tato surovina oproti ostatním relativně levná, dostupná, snadno se mele a dá se z ní používat do krmiv i řepkový olej. Pro lidskou spotřebu se řepkový olej již řadu let používá, ale stále mezi lidmi panuje představa, že je mnohem zdravější olej slunečnicový, i když ten je nevhodný z hlediska poměru kyselin linolové a linolenové. Krmením larev Potemníka moučného řepkou je možné získat funkční potravinu s příznivým složením mastných kyselin, především markantně zlepšit poměr mastných kyselin ve prospěch kyseliny linolenové. Výše uvedené závěry lze použít i v praktickém ovlivnění kvalitního a zdravého stravování. Přidávání takto upravených larev Potemníka moučného do běžné stravy 66
člověka, např. jejich rozemletí a přidávání do mouky při výrobě běžného pečiva, by mohlo vyrovnat celkový poměr ω-6 a ω-3 mastných kyselin a tím ovlivnit výskyt kardiovaskulárních onemocnění. Tato onemocnění by mohla snížit i osvěta v mediálně prezentovaných výsledcích odborných pracích, které by poukázaly na zdravou a vyváženou stravu při využívání řepkového a slunečnicového oleje.
67
POUŽITÁ LITERATURA ANALÝZA SPOTŘEBY POTRAVIN V ROCE 2010. [online]. 2012 [cit. 2013-01-29]. Dostupné z: http://www.apic-ak.cz/data_ak/12/k/Stat/Potraviny2010analyzaSpotr.pdf AGUILAR-MIRANDA, Erick D., Mercedes G. LóPEZ, Clara ESCAMILLASANTANA a Ana P. BARBA DE LA ROSA. Characteristics of Maize Flour Tortilla Supplemented with Ground Tenebrio molitor Larvae. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2002, roč. 50, č. 1, s. 192-195. ISSN 0021-8561. DOI: 10.1021/jf010691y. Dostupné z: http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jf010691y BELL, J.G., TOCHER, D. R., FARNDELE, B. M., COX, D. I., McKINNLEY, R. W., & SARGENT, J. R., 1997: The effects of dietary lipids on polyunsaturated fatty acid metabolism in Atlantic salmon undergoing parr-smolt transformation. Lipids, 32, 515BORKOVCOVÁ, Marie a kol., 2009: Kuchyně hmyzem zpestřená. Brno: Lynx. ISBN 978-808-6787-374. BORKOVCOVÁ, M a kol, 2012: Potemník moučný jako funkční potravina. In JŮZL, M. -- NEDOMOVÁ, Š. -- BUBENÍČKOVÁ, A. -- KOZELKOVÁ, M. Sborník příspěvků XXXVIII. Semináře o jakosti potravin a potravinových surovin - Ingrovy dny. 1. vyd. Brno: Audiovizuální centrum MENDELU, s. 34--36. ISBN 978-80-7375-601-7. CESTROVÁ, Dagmar. Zbude na talíři jenom hmyz?. [online]. 2007 [cit. 2012-12-27]. Dostupné
z:
http://www.czech-
press.cz/index.php?option=com_content&view=article&id=3204%3Azbude-na-taliijenom-hmyz&Itemid=4 525 CHAPKIN, R. S., 2000: Reappraisal of essential fatty acids. In C. K. Chow (Ed.), Fatty acid in fous and their healt implications (2nd ed.). New York: Marcel Dekker. CHOW, C. K., 2000: Fatty acid in foods and their health implications, (2nd ed.). New York: Marcel Dekker. CHRISTIE, William W.,1989: Gas chromatography and lipids: a practical guide. Repr. Ayr, Scotland: Oily. ISBN 09-514-1710-X. Dietary lipid Metabolism: Introduction. [online]. [cit. 2012-10-17]. Dostupné z: http://www.nutriology.com/TGbreakdown1.gif 68
DVOŘÁK, Zdeněk, 1987: Nutriční hodnocení masa jatečných zvířat. Vyd. 1. Praha: SNTL, 270 s. EDER, K., 1995: Journal of chromatography B: Biomedical applications: Gas chromatographic analysis of fatty acid methyl esters. vyd. Institute of Nutrition Physiology: Technical University of Munich, s. 113-131. EFSA Journal, 2012: Scientific Opinion on the Tolerable Upper Intake Level of eicosapentaenoic acid (EPA), docosahexaenoic acid (DHA) and docosapentaenoic acid (DPA). [online]. 27 July 2012, 10(7):2815, s. - [cit. 2012-11-23]. DOI: 10.2903/j.efsa.2012.2815.
Dostupné
z:
http://www.efsa.europa.eu/en/efsajournal/doc/2815.pdf FINKE, Mark D. Complete nutrient composition of commercially raised invertebrates used as food for insectivores. Zoo Biology. 2002, roč. 21, č. 3, s. 269-285. ISSN 07333188. DOI: 10.1002/zoo.10031. Dostupné z: http://doi.wiley.com/10.1002/zoo.10031 FOX, Stuart Ira. Human physiology. 5th ed. Dubuque, IA: Wm. C. Brown, c1996, xx, 704 p. ISBN 06-972-0985-7. HÁLKOVÁ, Jana, Marie RUMÍŠKOVÁ a Jana RIEGLOVÁ, 2001: Analýza potravin: laboratorní cvičení. 2. vyd. Újezd u Brna: Ivan Straka, 109 s. ISBN 80-864-9403-9. HOKROVÁ, Marie. Kvůli nedostatku vody ubude masa. [online]. 14.12.2012 [cit. 2013-01-27]. Dostupné z: http://www.rozvojovka.cz/download/docs/107_priloha-hlada-zizen-sveta-lidove-noviny-2012.pdf JANČÁŘOVÁ, Irena a Luděk JANČÁŘ., 2003: Analytická chemie. Vyd. 1. Brno: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita, 195 s. ISBN 978-80-7157-647-12008. KLOUDA, Pavel, 2003: Moderní analytické metody. 2., upr. a dopl. vyd. Ostrava: Pavel Klouda, 132 s. ISBN 80-863-6907-2. KOMPRDA, Tomáš., 2003: Hygiena potravin: cvičení. Vyd. 1. V Brně: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita, 50 s. ISBN 80-715-7709-X. KOMPRDA, Tomáš., 2003: Základy výživy člověka. Vyd. 1. V Brně: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita, 162 s. ISBN 978-807-1576-556.
69
KRÁLOVÁ, Blanka, a kol., 2001: Bioanalytické metody. 3., přeprac. vyd. Praha: Vysoká škola chemicko-technologická, 254 s. ISBN 80-708-0449-1. LITERÁK,
Jaromír.
Plynová
chromatografie.
2009.
Dostupné
z:
http://cheminfo.chemi.muni.cz/chem_sekce/predmety/C7300/GC/uvod.pdf LAWRENCE, Glen D., 2010: The fats of life: essential fatty acids in health and disease. New Brunswick, N.J.: Rutgers University Press, c2010, xvi, 277 p. ISBN 08135-4677-X. McMURRY, John., 2007: Organická chemie. Vyd. 1. VUTIUM: VŠCHT, 1176 s. ISBN 978-80-214-3291-8. McKENZIE, D. J., 2001: Effects of dietary fatty acids on respirátory and cardiovascular fhysiology of fish. Comparative Biochemistry and Physiology, A: Comparative Physiology, 128, 607-621 MIKŠÍK, Vlastimil. Hořčice: pěstitelský rádce. Vyd. 1. Praha: Pro katedru rostlinné výroby, FAPPZ, ČZU v Praze vydalo vydavatelství Kurent, 2007, 23 s. ISBN 978-8087111-01-7. MURRAY, Robert K., 2002: Harperova biochemie. 23. vyd. Jinočany: H H, ix, [3], 872 s. ISBN 80-731-9013-3. O´KNEEFE, S. F., 2002: Nomenclature and classification of lipids, In C. C. Akoh, D. B. Min (Eds), Food lipids: chemistry, nutrition and biotechnology (2en ed.). New York: Marcel Dekker SUCHÝ, Pavel, STRAKOVÁ Eva a HERZIG Ivan. 2008: Kvalita rostlinných olejů a jejich význam z hlediska zdraví zvířat a možnosti ovlivnění nutriční hodnoty potravin živočišného původu [online]. Výzkumný ústav živočišné výroby, Praha, [cit. 2012-1123].
Dostupné
z:
http://www.vuzv.cz/sites/File/vybor/Kvalita%20rostlinn%C3%BDch%20olej%C5%AF %20a%20jejich%20v%C3%BDznam%20z%20hlediska%20zdrav%C3%AD%20zv%C 3%AD%C5%99at%20a%20mo%C5%BEnosti%20ovlivn%C4%9Bn%C3%AD%20nutr i%C4%8Dn%C3%AD%20hodnoty%20potra.pdf
70
STRAKA, Ivan, 2006: Chemické vyšetření masa: (klasické laboratorní metody). Vyd. 1. Tábor: OSSIS, 94 s. ISBN 80-866-5909-7. STRUNECKÁ, Anna a Jiří PATOČKA., 2011: Doba jedová. Vyd. 1. Praha: Triton, 295 s. ISBN 978-80-7387-469-8. VELÍŠEK, Jan., 2009: Chemie potravin. Rozš. a přeprac. 3. vyd. Tábor: OSSIS, xxii, 580 s. ISBN 978-80-86659-17-6. ZAJÍC, Tomáš, 2011: Možnosti produkce sladkovodních ryb s vysokým obsahem omega-3 mastných kyselin. Vodňany: Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích, Fakulta rybářství a ochrany vod, 34 s. Metodik. ISBN 978-80-87437-27-8. Konopné
semínko.
In:
[online].
[cit.
2012-11-23].
Dostupné
z:
http://www.konopnyshop.cz/proc-konopi/konopne-semeno.html Co Chia semínka obsahují. [online]. [cit. 2012-12-26]. Dostupné z: http://www.chiaseminka.cz/co-chia-obsahuji/ LASKAVEC - AMARANT (Amaranthus sp.). In: [online]. [cit. 2012-11-23]. Dostupné z: http://vfu-www.vfu.cz/vegetabilie/plodiny/czech/laskavec.htm ROZÍKOVÁ, Veronika, 2010: Plynová chromatografie esterů mastných kyselin ve vybraných druzích potravin. Brno, Diplomová práce. Mendelova univerzita v Brně. Vedoucí práce Ing. Tomáš Gregor, Ph.D. ÚKZÚZ, Národní referenční laboratoř, 2011: Stanovení obsahu mastných kyselin v olejích a tucích metodou GC: Zpracováno na základě normy ČSN CEN ISO/TS 17764-1 a 2 Krmiva - Stanovení obsahu mastných kyselin: část 1: příprava methylesterů, část 2: metoda plynové chromatografie. Mouční
červi.
[online].
[cit.
http://www.jaknahmyz.cz/moucni_cervi
71
2012-12-28].
Dostupné
z:
SEZNAM OBRÁZKŮ Obr. 1 Hydrolýza triacylglycerolu působením pankreatické lipázy (online).................. 15 Obr. 3 Schéma metabolismu esenciálních mastných kyselin (Velíšek, 2009) ................. 16 Obr. 4 Zjednodušené schéma plynového chromatografu ............................................... 29 Obr. 5 Plamenově ionizační detektor ............................................................................. 31 Obr. 6 Graf vyjadřující obsah mastných kyselin v % v jednotlivých krmivech .............. 45 Obr. 7 Graf zobrazuje porovnání obsahu mastných kyselin u skupin larev Tenebrio molitor ............................................................................................................................. 46 Obr. 8 Graf výchozího obsahu mastných kyselin u jednotlivých slepých vzorků ........... 47 Obr. 9 Graf závislosti změny obsahu jednotlivých mastných kyselin v závislosti na délce krmení zeleným amarantem ............................................................................................ 48 Obr. 10 Graf závislosti změny obsahu jednotlivých mastných kyselin v závislosti na délce krmení zeleným konopím ....................................................................................... 48 Obr. 11 Graf závislosti změny obsahu jednotlivých mastných kyselin v závislosti na délce krmení šalvějí španělskou ...................................................................................... 49 Obr. 12 Graf závislosti změny obsahu jednotlivých mastných kyselin v závislosti na délce krmení lnem ........................................................................................................... 50 Obr. 13 Graf závislosti změny obsahu jednotlivých mastných kyselin v závislosti na délce krmení zrnem amarantu......................................................................................... 50 Obr. 14 Graf závislosti změny obsahu jednotlivých mastných kyselin v závislosti na délce krmení hořčicí........................................................................................................ 51 Obr. 15 Graf závislosti změny obsahu jednotlivých mastných kyselin v závislosti na délce krmení makem........................................................................................................ 51 Obr. 16 Graf závislosti změny obsahu jednotlivých mastných kyselin v závislosti na délce krmení moukou ze zrníček vína ............................................................................. 52 Obr. 17 Graf závislosti změny obsahu jednotlivých mastných kyselin v závislosti na délce krmení řepkou ........................................................................................................ 53 Obr. 18 Graf závislosti změny obsahu jednotlivých mastných kyselin v závislosti na délce krmení moukou z konopí ........................................................................................ 53 Obr. 19 Poměr kyseliny linolové ku kyselině linolenové ................................................ 54 Obr. 20 Množství pentadekanové kyseliny u jednotlivých vzorků v závislosti na druhu krmné dávky .................................................................................................................... 55
72
Obr. 21 Množství palmitové kyseliny u jednotlivých vzorků v závislosti na druhu krmné dávky ............................................................................................................................... 55 Obr. 22 Množství linolové kyseliny u jednotlivých vzorků v závislosti na druhu krmné dávky ............................................................................................................................... 56 Obr. 23 Množství linolenové kyseliny u jednotlivých vzorků v závislosti na druhu krmné dávky ............................................................................................................................... 57 Obr. 24 Množství olejové kyseliny u jednotlivých vzorků v závislosti na druhu krmné dávky ............................................................................................................................... 58 Obr. 25 Množství stearové kyseliny u jednotlivých vzorků v závislosti na druhu krmné dávky ............................................................................................................................... 59 Obr. 26 Množství arachidonové kyseliny u jednotlivých vzorků v závislosti na druhu krmné dávky .................................................................................................................... 59 Obr. 1 Chromatogram řepka ....................................... Chyba! Záložka není definována. Obr. 2 Chromatogram hořčice .................................... Chyba! Záložka není definována. Obr. 3 Chromatogram mouka víno .............................. Chyba! Záložka není definována. Obr. 4 Chromatogram konopí mouka .......................... Chyba! Záložka není definována. Obr. 5 Chromatogram len drcený................................ Chyba! Záložka není definována. Obr. 6 Chromatogram mák drcený .............................. Chyba! Záložka není definována. Obr. 7 Chromatogram šalvěj drcená ........................... Chyba! Záložka není definována. Obr. 8 Chromatogram amarant drcený ....................... Chyba! Záložka není definována. Obr. 9 Chromatogram konopí zelené .......................... Chyba! Záložka není definována. Obr. 10 Chromatogram amarant zelený ...................... Chyba! Záložka není definována.
73
SEZNAM TABULEK Tab. 1 Hlavní nasycené mastné kyseliny vyskytující se v lipidech (Velíšek, 2009) ........ 12 Tab. 2 Hlavní nenasycené mastné kyseliny s jednou dvojnou vazbou (Velíšek, 2009) ... 12 Tab. 3 Hlavní nenasycené mastné kyseliny se dvěma a více dvojnými vazbami (Velíšek, 2009) ............................................................................................................................... 13 Tab. 4 Průměrné zastoupení MK v řepkovém oleji (Suchý, 2008) ................................. 18 Tab. 5 Průměrné zastoupení MK v hořčičném semeni (Suchý, 2008) ............................ 19 Tab. 6 Složení semen Chia .............................................................................................. 20 Tab. 7 Průměrné zastoupení MK v maku olejném (Suchý, 2008) ................................... 20 Tab. 8 Průměrné zastoupení MK ve lnu olejném (Suchý, 2008)..................................... 21 Tab. 9 Spotřeba masa v hodnotě na kosti ....................................................................... 22 Tab. 10 Obsah tuku jednotlivých krmiv v g a % z celkové hmotnosti vzorku ................. 43 Tab. 11 Obsah jednotlivých mastných kyselin v % v použitých krmivech ...................... 44 Tab. 12 T-test porovnání rozdílu mezi vzorky krmenými 2 a 4 týdny ............................. 60 Tab. 13 ANOVA porovnání rozdílu nárůstu jednotlivých mastných kyselin v rámci varianty 2 týdny .............................................................................................................. 60 Tab. 14 ANOVA porovnání rozdílu nárůstu jednotlivých mastných kyselin v rámci varianty 4 týdny .............................................................................................................. 61 Tab. 15 Spektrum mastných kyselin v % z celkového tuku ............................................. 62 Tab. 16 Rozdíly ve spektru mastných kyselin způsobené různou krmnou dávkou v % z celkového tuku .............................................................................................................. 63 Tab. 17 Poměr SUFA:MUFA:PUFA .............................................................................. 64
74
SEZNAM ZKRATEK Al – hliník Ar – argon Ca – vápník ČR – Česká republika DHA – dokohexaenová kyselina EPA – eikosapentaenová kyselina EU – Evropská unie FAME – methylestery mastných kyselin GC-FID – plynový chromatograf s flamenově ionizačním detektorem GLC – gas-liquid-chromatography GSC – gas-solid-chromatography H – vodík HDL – high density lipoprotein He – helium HUFA - highly unsaturated fatty acids CH3OH – metanol ISO - International organization for standardization LDL - low density lipoprotein LLC – liquid-liquid chromatography LSC – liquid-solid chromatography Mg – hořčík MK – mastné kyseliny MS – hmotnostní spektrometr MUFA – monounsaturated fatty acid N2 – dusík Na – sodík Na2SO4 – síran sodný NaCl – chlorid sodný PC- paper chromatography PCB – polychlorované bifenyly PTV - teplotně programovaný nástřik PUFA – polyunsaturated fatty acid SFA – saturated fatty acid TCD – tepelně vodivostní detektor TLC – thin-layer chromatography TMSH - trimethylsulfonium hydroxidová metoda ÚKZÚZ – Ústřední kontrolní zemědělský ústav zkušební Zn – zinek
75
