1
1. ŐSSEJTEK
Őssejtek & Regeneratív Medicina A molekuláris medicina címszó alatt olyan molekuláris biológiai megközelítésekről lesz/volt szó, melyek eredményeit már alkalmazzák az orvosi diagnosztikában és a terápiában, vagy óriási reményeket fűznek a közeljövőben való alkalmazásukhoz. Az idetartozó témákat különböző előadások keretében tárgyaljuk.
ŐSSEJTEK Dia 1 Regeneráció A tengeri csillag a lábát, egyes gyíkok pedig az elvesztett farkukat képesek 1 újraképezni. Az ember az elvesztett testrészeit nem képes regenerálni, de bizonyos szövetei (például hám, vér) folyamatosan megújítják magukat az élet során. Az orvostudomány már régóta keresi azt a technikát, melynek segítségével bármilyen szöveti sérülés pótolható lenne. Az őssejt technológia erre a problémára ígér megoldást. Dia 2 Mi az őssejt? Az őssejt olyan sejt, amely képes megújítani magát: egy őssejt osztódása során vagy két őssejt, vagy egy őssejt és egy elkötelezettebb sejt (progenitor sejt vagy differenciált sejt) keletkezik. A differenciálódott sejtek csak magukkal megegyező specializált sejteket képesek produkálni (például hámsejtek), vagy nem képesek osztódni (például idegsejtek). A progenitor sejtek egy közbenső helyet foglal el: a differenciált sejtek közvetlenül ezekből a progenitor sejtekből alakulnak ki. Dia 3 A sejtek típusai elkötelezettségük szerint A sejteket osztályozhatjuk aszerint, hogy milyen képességük (potenciájuk) van más típusú sejtekké átalakulni. (1) A totipotens sejtek potenciája a legnagyobb, s ebből következően, az elkötelezettségük a legkisebb. Ezekből a sejtekből bármilyen más típusú sejt is kialakulhat. Totipotens sejtek például az emberi zigóta és a 2, a 4 és a 8 sejtes humán embrió. (2) A pluripotens sejtek potenciája némileg kisebb fokú. Ilyen sejtek alkotják például hólyagcsíra (blasztociszta, blasztula) úgynevezett belső sejttömegét. Ezek a sejtek képesek bármilyen sejtté átalakulni, kivéve trofoblaszt sejtekké, melyek az embrió táplálásáért felelős szövetekké alakulnak (melyek a placenta magzati-eredetű részének kialakulásában vesznek részt). Az úgynevezett embrionális őssejteket (embryonic stem cells: ESC, vagy ES sejtek) rendszerint a belső sejttömeg sejtjeiből állítják elő. Mivel az ES sejtek nem totipotensek, egy egyedet csak úgy tudunk előállítani belőlük, ha a hólyagcsíra belső sejttömegébe ültetjük őket. Megjegyzés: a beültetett ES sejtekkel nem cserélhetjük le belső sejttömeg összes sejtjét, annak csupán egy bizonyos hányadát alkothatják, ezért genetikailag mozaikos egyedek jönnek létre. (3) A multipotens sejtek potenciája tovább szűkül. A felnőtt őssejtek beszűkültebb potenciával rendelkeznek, csak bizonyos típusú sejtekké képesek alakulni, például a hematopoetikus őssejtek sejtek csak vérsejtekké. Pontosabban, a hematopoetikus őssejtek először multipotens progenitor (elő-) sejtekké alakulnak (mieloid és a limfoid progenitor sejtek), melyek potenciája a felnőtt őssejtekétől is szűkebb). A felnőtt őssejtek és a progenitor sejtek között az a különbség, hogy az őssejtek hosszabb ideig tárolódhatnak, míg a progenitor sejtek kialakulásuk után rövidesen rátérnek a differenciálódás útjára. (4) Az unipotens sejtek csak magukkal megegyező sejtekké alakulhatnak, például egy hámsejt csak hámsejté. Az unipotens sejtek osztódásainak száma genetikai program által meghatározott, s ezt a programot in vitro sejttenyészetben is követik, azaz, a tenyésztőedényben ugyanannyiszor osztódnak, mint a testben, majd megáll a szaporodásuk (kivéve a hallhatatlanná tett sejtvonalakat). A statikus sejtpopulációt olyan sejtek alkotják, amelyek mitotikus aktivitása nagyon alacsony (G0 stádiumban van a sejtek zöme), rendszerint sérülések hatására kezdenek csak osztódni. Ilyenek például a kötőszövet rostképző sejtjei (fibroblaszt és oszteoblaszt sejtek), valamint a különféle hámsejtek. A megújuló sejtpopulációt olyan sejtek alkotják, amelyek mitotikus aktivitása magas (például a bélcsatorna lumenét alkotó hám, illetve a többrétegű hámok alsó rétege). (5) A nem-osztódó sejtek felhagytak a szaporodással (idegsejt, izomsejt, szívizomsejt, fehérvérsejt). Dia 4, 5 Őssejtek a testünkben Az embrionális fejlődés során három sejtréteg alakul ki: a külső ektoderma sejtjei a bőrt és az idegrendszert hozzák létre; a középső sejtrétegből (mezoderma) képződik a csontrendszer, az izmok, és a vérképző rendszer; a belső (endoderma) sejtréteg pedig a gasztro-
ALAPKÖVETELMÉNY 26. Előadás
Boldogkői Zsolt ©
2
1. ŐSSEJTEK
intesztinális (gyomor, bél) rendszert és a tüdőket alakítja ki. A három dermális rétegben lévő őssejtek "multipotensek", ami azt jelenti, hogy az adott dermális határokon belül képesek bármilyen sejtté alakulni. Multipotens sejtek (felnőtt őssejtek, progenitor sejtek) találhatóak az agyban, a szemben (cornea, retina), a vérben, a csontvelőben, a májban, az izomban, a bőrben, stb. Minden sejttípusnak vannak őssejtjei. Ilyeneket találtak még például fogbél, pankreász (hasnyálmirigy), gasztro-intesztinális rendszer. Az embrionális fejlődés során az ősivarsejtek nagyon korán elválnak a testi sejtektől. Bár az ősivarsejtekből alakulnak ki az ivarsejtek, amelyek összeolvadva a totipotens zigótát képezik, a gaméták nem totipotensek, mivel csak haploid genetikai információt tartalmaznak. Dia 6-8 Felnőtt őssejtek jellemzője, hogy csak bizonyos típusú sejtekké képesek differenciálódni, például egy idegi őssejt bármilyen típusú neuronná (idegsejt) vagy glia sejtté képes átalakulni, de izomsejt nem lehet belőle. A csontvelő mellett, manapság, a köldökzsinór vér a legnépszerűbb felnőtt őssejt forrás. Külön sejtbankok alakultak a köldökzsinórvér tárolására (folyékony nitrogénben) a különböző országokban, közte hazánkban is. A köldökzsinór vérből származó őssejtek fontosak lehetnek a gyermek valamelyik beteg testvérének vagy akár magának a donornak az élete későbbi szakaszában 2 való betegsége esetén. A köldökzsinór vér jóval magasabb arányban tartalmaz felnőtt őssejteket, mint a felnőtt ember vére, s az őssejt kromoszómáinak telomere sem annyira rövidült, mint egy későbbi életszakaszban. A lefagyasztott köldökzsinórvér jó eséllyel használható transzplantációra akár évtizedekkel a születés után is. A köldökzsinórvér-őssejteket emberben elsősorban a csontvelőelégtelenségben szenvedők kezelésére használják, mivel a köldökzsinórvér-őssejtek könnyen alakulnak át csontvelői sejtekké. Alkalmazásuk előnyösebb a korábban szokásos, más emberből származó csontvelővel végzett transzplantációknál, mert hatékonyabb és nem okoz kilökődést. A felnőtt őssejtek nem csak a testben, hanem megfelelő körülményeket biztosítva (különböző faktorokat hozzáadva) in vitro (itt Petri csészében) is specializált sejtekké differenciáltathatóak. Dia 9 Embrionális őssejtek (ES sejtek) Az első embrionális őssejteket egymástól függetlenül Martin Evans és Gail Martin állították elő egér hólyagcsíra belső sejttömegből. Mégis, az őssejt technológiát kizárólag Martin Evans nevével kapcsolja össze a tudományos világ. Martin Evans kapta két társával együtt megosztva 2007-ben a Nobel Díjat (Orvosi vagy élettani), amelyet a knock-out egerek előállításáért adtak, s ebben Evans szerepe az egér őssejt technológia kidolgozása volt. Az első emberi őssejteket James Thompson állította elő 1998-ban, s ezzel elindult az emberi történelem egyik legnagyobb, tudomány által provokált, társadalmi vitája, amely arról szól, hogy elpusztíthatunk-e egy ekkora méretű emberkét: „.” (a pont a mondat végén). Dia10 Az emberi ES sejtek forrásai Emberi embrionális őssejtek két fő forrásból nyerhetők: in vitro megtermékenyítésből, vagy felnőtt testi sejtek sejtmagjának enukleált (eltávolított sejtmagvú) petesejtbe való beültetéséből. (1) A mesterséges megtermékenyítés in vitro megtermékenyítési formájánál (a másik a spermiumok befecskendezése a méhűrbe, vagy a petevezetékbe) az ezzel foglalkozó klinikákon a megtermékenyített petesejtek fölöslegben maradnak, hiszen, nem ültethetnek be sok ilyet a leendő anya testébe. A maradék sejteket, bizonyos idejű tárolást követően, rendszerint kidobják. Nagy a társadalmi tiltakozás a mesterséges megtermékenyítés során kapott sejtek kutatás és gyógyítás céljára történő felhasználása ellen. A fejlett országok egy részében ez a protokoll tilos. A megtermékenyített petesejtet in vitro („lombikban”) differenciáltatják, amíg az eléri a hólyagcsíra stádiumot (5 nap). A hólyagcsíra úgynevezett belső sejttömegét (ezekből alakul ki normálisan az embrió) izolálják és in vitro tenyésztik. A kinyert sejtekből pluripotens embrionális őssejt tenyészeteket készítenek, melyeket kutatási célokra lehet használni. Az így nyert embrionális őssejtek jellemzője, hogy a genotípusuk egyedi, azaz nem egyezik meg egyetlen élő emberével sem. (2) Ezzel szemben, a sejtmag átültetéssel kapott őssejtek genotípusa tökéletesen megegyezik a donor genetikai állományával (ez a klónozás egyik formája). Az így nyert embrionális őssejtek jelentősége abban van, hogy a donorba visszaültetve, nem lép fel szöveti inkompatibilitás (nem-egyezőség), az immunrendszer elfogadja azt. Másrészről, a személyre szabott orvostudományában fontos lehet, hogy kísérleteket lehet elvégezni tenyésztett sejteken, például bizonyos gyógyszerekre való reakciót illetően. A nehézség ennél a megközelítésnél egyrészt technológiai, másrészt, az, hogy önkéntes petesejt donort kell találni hozzá, harmadrészt a jogi környezet, ami nem mindig megengedő, sőt. Klónozott humán embrionális őssejtek előállítását a dél-koreai Hwang Wu Szuk (ugyanaz a kutató, aki Snoopy-t, a klónozott kutyát előállította) jelentette be 2004-ben. Kiderült azonban, hogy, amellett, hogy női alkalmazottait kényszerítette a petesejtadásra, a jegyzőkönyveket meghamisította, s nem volt igaz a bejelentés (de Snoopy igaznak bizonyult). Később egy angol kutató sikeresen elvégezte ezt a kísérletet.
ALAPKÖVETELMÉNY 26. Előadás
Boldogkői Zsolt ©
3
1. ŐSSEJTEK
Megjegyzés: 2010-ben Robert Edwards Nobel díjat kapott az in vitro megtermékenyítés kidolgozásáért (nincs köze az ES sejtekhez!). Dia11, 12 ES sejtek előállítása belső sejttömeg sejtjeiből A hólyagcsíra belső sejttömegéből nyert ES sejteket in vitro tenyésztjük fibroblaszt tápláló sejteken. Attól függően, hogy milyen differenciálódást serkentő faktorokat adunk a tápfolyadékba, különféle specializált sejteket kapunk. Az őssejtek differenciálódása történhet a testen kívül (in vitro differenciálódás), vagy a testen belül (in vivo differenciálódás), attól függően, hogy Petri csészében, különféle faktorok hozzáadásával, differenciáltatjuk az őssejteket, vagy közvetlenül a test megfelelő helyére oltjuk azokat. Az ES sejtek in vivo differenciálódása során gyakran teratomákat (speciális tumor sejtek) képeznek; ez a veszély elhanyagolható felnőtt őssejtek, illetve differenciált sejtek beültetése esetén. Dia13 ES sejtek előállítása embrionális csíravonal őssejtekből ES sejteket előállíthatunk még ősivarsejtekből is. Az ilyen sejtek felnőttekből való kinyerése nehézkes, embrióból viszont viszonylag egyszerű az izolálásuk. Humán forrásként abortált embriókat szokás használni.
Dia14 ES sejtek előállítása testi sejtekből sejtmag transzferrel Az ES sejtek előállításának további lehetősége az a fentebb említett folyamat, melynek során magjától eltávolított petesejtbe egy felnőtt testi sejt magját ültetjük (magtranszferrel vagy fúzióval). Ez a protokoll a klónozás tipikus esete, hiszen a donor sejttel megegyező genotípusú ES sejteket állítunk elő. Az így kapott sejteket stimuláljuk, hogy blasztocisztává differenciálódjanak, majd a belső sejttömeg izolálásával és szaporításával, ES sejteket állítunk elő. A kutatók abban bíznak, hogy ez a technika lehetővé teszi az adott páciens betegségének tanulmányozását, hiszen a saját sejtjeit vizsgálják in vitro körülmények között. A jövőben a kutatók „személyre-szabott” őssejteket állíthatnak elő ezzel a technikával. Ezek az őssejtek beültetve a donor személy testébe, nem fognak kilökődést eredményezni, lévén ugyanolyan genetikai tartalmúak. Dia15 ES sejtek előállítása csíravonal sejtekből sejtmag transzferrel (klónozás) Az ősivarsejtekből származó sejtmagoknak nem kell olyan mértékben újraprogramozódniuk, mint egy testi sejtnek, mivel azok eleve nem annyira elkötelezettek. Az ilyen sejtek izolálása azonban jóval nehezebb, mint például a hámsejteké.
A REGENERATÍV MEDICINA az orvostudomány azon ága, amely a károsodott szövetek újra kialakításával foglalkozik. Korábban (és jelenleg is) sikereket értek el különféle szerv transzplantációkkal, például csontvelő, csont, cornea (szaruhártya), szív, máj, tüdő, pankreász (hasnyálmirigy), Langerhans szigetek, bőr, stb. A probléma az ilyen megközelítéseknél a szöveti inkompatibilitás szokott lenni. Jelenleg az őssejt alapú megközelítések a legbiztatóbbak, s a továbbiakban kizárólag erre a témára fókuszálunk. Dia16, 17 ES sejtek a gyógyászatban A gyógyászatban alkalmazott ES sejtek a már említett két fő forrásból származhatnak: (1) az in vitro megtermékenyítéssel vagy (2) sejtmag átültetéssel kapott blasztulából. Mindkét esetben az ES sejteket in vitro szaporítják, majd a megfelelő sejttípusra történő differenciálódásra késztetik, ezt követően pedig beültetik a beteg testébe. Dia18 Felnőtt sejtek a gyógyászatban – hematopoetikus (vérképző) őssejtek A gyógyászatban már régóta alkalmazzák a hematopoetikus őssejteket a vérrákban (például leukémiában) szenvedő betegek gyógyítására. Első lépésként az őssejteket izolálják egy donor személy csontvelőjéből, majd in vitro tenyésztik őket (sejt sokszorozás a cél). Ezt követően beültetik az őssejteket a beteg csontvelőjébe (transzplantáció). Az ilyen típusú beavatkozást sejtcserés terápiának nevezik. SATÍROZOTT TERÜLET – Extra követelmény Dia19 A hematopoetikus őssejtek differenciálódása A csontvelőben két fontos őssejt típus található a hematopoetikus (vérképző) és a sztrómális (mezenchimális) őssejtek. A hematopoetikus őssejt multipotens őssejt, melynek potenciája fokozatosan csökken. Első lépésben a hosszú életű multipotens őssejtből rövid életű multipotens őssejt képződik, majd a limfociták és a többi vérsejt útja válik el egymástól: a limfoid progenitor sejtekből csak limfociták, dentritikus és természetes ölősejtek; a mieloid progenitor sejtekből pedig a granulociták, a monociták, a vérlemezkék és a vörösvértestek alakulnak ki. Az a feltételezés, hogy a szervezet összes szövet típusa ugyanilyen hierarchia szerint szerveződik.
ALAPKÖVETELMÉNY 26. Előadás
Boldogkői Zsolt ©
3
4
1. ŐSSEJTEK
Dia20 A hematopoetikus őssejtek használata a gyógyászatban Hematopoetikus őssejtek a következő forrásból nyerhetők: (1) csontvelő, (2) köldökzsinór vér, (3) placenta vér és (4) felnőtt vér. Csontvelőből nyert felnőtt őssejteket már az 1950-es évektől alkalmaznak különféle betegségek gyógyítására: leukémia, sarlósejtes vérszegénység, immunhiányos betegségek, csontvelősérülések, néhány anyagcsere rendellenesség. A csontvelő átültetés (transzplantáció) messze a legsikeresebb őssejteken alapuló terápia. A kezelés azonban fájdalmas mind a donor, mind a recipiens számára, s csak akkor sikeres, ha genetikai hasonlóság áll fenn közöttük. Az utóbbi években dogozták ki köldökzsinórés placentavérből való őssejtek kinyerésének technológiáját. Ez a technika a donor vagy rokonai számára a későbbi évek során genetikailag azonos, illetve hasonló őssejteket produkál. A felnőtt vér a legegyszerűbben hozzáférhető, de sajnos kevés őssejtet tartalmaz. Megjegyzés: a vérképző őssejtek alkalmazása illetően azért nincs társadalmi vita, valószínűleg azért mert a közvélemény nem tudja, hogy ezek ugyanolyan őssejtek, mint amik ellen tiltakoznak. Dia21 Őssejtek a gyógyászatban – Sztrómális őssejtek A csont (és porc) regeneráció esetében a sztrómális őssejteket ex vivo tenyésztik, majd a sejteket egy 3 dimenziós szerkezetű kerámiához 4 tapasztják (maguktól tapadnak a szilárd felszínhez), végül, beültetik a sérült csontszövetbe ahol a sejtek 3D-ben kitöltik a teret. Dia22 Szívizom terápia A szív progenitor sejtek esetében az utóbbi években több sikeres klinikai alkalmazásról számoltak be. A szív progenitor sejteket a hólyagcsíra belső sejttömegéből nyert ES sejtekből állítják elő a megfelelő differenciálódási faktorok hozzáadásával. Ezt követően két lehetőség van: (1) vagy közvetlenül a szív sérült részébe ültetik, s azok differenciálódnak [simaizom sejtekké (vérerek falában), szívizommá, illetve endotél sejtekké (vérerekben)]; (2) vagy in vitro végezzük el a sejtek differenciáltatását, s csak ezt követően ültetjük be a specializált sejteket a szívbe. Az in vitro differenciálódásnál lehetőség van az esetleges genetikai hibák kijavítására génbevitellel (ez a gén terápia). Pluripotens őssejtek magzati és felnőtt sejtekből is nyerhetők. Dia23 Bőr őssejtek A bőr pótlására különféle sérülések vagy plasztikai műtétek esetén van szükség. (1) A hagyományos kezelés a nem-sérült bőrfelületből való bőrátültetést jelenti. Ezen a területen a siker titka az, hogy őssejtek találhatók közvetlenül az epidermisz alatt, s ezek pótolják a hiányzó szövetet. Ha azonban nincs elegendő ép bőr, a páciens meghalhat. (2) 20 év óta működik egy alternatív technológia, nevezetesen, a bőr őssejtek tenyésztése, majd bőrbe való beültetése. (3) Nemrégen fedeztek fel új típusú őssejteket a mélyebb bőrrétegekben és a szőrhagymákban, ezek alkalmazhatóságát jelenleg tesztelik. Dia24 Idegi őssejtek (neural stem cells, NCS) – neurogenezis a felnőtt agyban A patkány agyban nemrégiben fedeztek fel két olyan agyterületet (hippocampus dentate gyrus és az anteriolaterális kamra subventrikuláris zónája; SVZ), amelyekben felnőtt korban is képződnek új idegsejtek. Az SVZ őssejtek a szaglógumó felé vándorolnak, ahol idegsejtekké differenciálódnak. Feltételezik, hogy az embernél is találhatók őssejtek ezeken az agyterületeken. Tehát, az a közhiedelem, hogy az ember 35 éves kora után csak veszíti az idegsejtjeit, de azok nem pótlódnak, nem biztos, hogy igaz, hiszen az őssejtekből új neuronok képződhetnek. Bár, ezek az őssejtek inkább csak sérüléskor aktiválódnak. Sérülések esetén azonban elsősorban a glia sejtek pótolják az elpusztult idegsejteket, ezek azonban nem tudják átvenni ezek funkcióit. Dia25 Parkinson kór – Az agy substantia nigra nevű területe alapvető szerepet játszik a mozgás koordinációban. Az ebben a magban lévő neuronok egyik típusának az a szerepe, hogy a szükségtelen mozgásokat kiiktatják. Parkinson kór esetében, ezek a neuronok degenerálódnak, ezért remeg az érintettek keze. A betegséget már több módszerrel is próbálták gyógyítani, többek között az őssejteken alapuló sejtcserés terápiával, de ezzel a módszerrel még nem értek el sikereket. Génterápiával viszont igen (lásd később). Dia26 Gerincvelő sérülés – Egy másik nagyon fontos probléma a gerincvelő sérülések esetén elpusztult neuronok pótlása. Itt is őssejtekkel és génterápiás megoldásokkal próbálkoznak. Dia27 Y kromoszóma a női agyban? Egyesült Államokban dolgozó magyar kutatók (NIMH, National Institute of Mental Health, Bethesda, USA) egyes halott nők agyában Y kromoszómát tartalmazó idegsejteket mutattak ki. Ezek a nők korábban férfiaktól származó csontvelő transzplantáción estek át. Tehát, úgy tűnik, hogy a csontvelő bizonyos mezenchimális őssejtjei nem csupán multipotens, hanem pluripotens potenciával rendelkeznek. A kísérletet patkányokkal is
ALAPKÖVETELMÉNY 26. Előadás
Boldogkői Zsolt ©
5
1. ŐSSEJTEK
sikeresen megismételték, s az eredmények alapján feltételezik, hogy a csontvelő mezenchimális őssejtjeiből szinte bármilyen sejtféleség kialakulhat. Ez az elképzelés azonban kemény viták középpontjában áll. Ha bebizonyosodik, hogy a csontvelő plaszticitása (potenciája) jóval nagyobb, mint azt korábban hitték, az egy nagyon jelentős eredmény lenne az orvostudomány számára. Nem elegendő azonban kimutatni, hogy a bármilyen (ekto-, endo-, vagy mezodermális) eredetű sejtek kialakulhatnak csontvelői sejtekből, a kérdés az, hogy ennek milyen a gyakorisága. Ha ez a gyakoriság túl alacsony, akkor a jelenség az elméleti érdekesség szintjén marad, kivéve persze, ha ezeket a sejteket könnyen tudjuk izolálni és differenciálódásra késztetni. Dia28, 29 A felnőtt őssejtek a plaszticitása Más megfigyelések és kísérletek alapján is feltételezik, hogy a csontvelő mezenchimális őssejtjei képesek (váz-, és szív-) izommá, neuronokká, valamint glia- és epitél sejtekké alakulni. Mezenchimális őssejtek találhatóak még a csont, porc, zsírszövet és egyéb kötőszöveti elemekben. Az utóbbi időben, nagy reményeket fűznek ezeknek a sejteknek a gyógyászatban való alkalmazásához; azt találták ugyanis, hogy ezek a sejtek pluripotens őssejtekként viselkednek, s ezért felhasználhatók a szövetregenerációban. Vannak azonban, akik megkérdőjelezik mezenchimális 5 őssejtek pluripotens voltát, s azt állítják, hogy ezek a sejtek valójában nem alakultak át más típusú sejtekké, csak összeolvadtak velük. A jövő kutatásai fogják eldönteni, hogy mi a valós helyzet. Dia30-32 Embrionális őssejtek – a sátán maga Az őssejtek legjobban hozzáférhető forrása, az abortált magzat, illetve az in vitro megtermékenyítés során megmaradt zigóták. Ezeket a sejteket azonban a fejlett országok kutatói nem használhatják a társadalmi nyomás, és az ennek engedelmeskedő politika miatt. Az abortuszt ellenzők, illetve az embrió jogaiért síkraszállók úgy vélik, hogy már egy zigóta is oltalmat élvez, hiszen mindene meg van ahhoz, hogy felnőtt ember legyen belőle, ezért embernek tekinthető. George Bush kormányzása idején állami támogatást nem kaptak az őssejt kutatók, akik egyébként is csak azokat az ES sejteket használhatják, amiket korábban (Bush elnöksége előtt) előállítottak. Csakhogy ezek minősége idővel leromlik. Az amerikai kutatók kivándoroltak először a liberálisabb Angliába, majd amikor itt is szigorodtak a szabályok, dél-kelet Ázsiába, ahol kihasználva a hatalmas szellemi tőkét, óriási őssejt kutató központokat építettek. Nyilvánvalóan, nem mindegy, hogy az őssejteket terápiás célra vagy egy egyed létrehozására használják. A kutatási és terápiás célú felhasználás nagy jelentőségű az orvostudomány szempontjából. Barack Obama a beiktatását követő 24 órán belül hatályon kívül helyezte a humán ES sejtek előállításának tilalmát. Dia33 Mire jók az őssejtek? (1) Az alapkutatásban a knock-out állatok előállításához, illetve a sejtdifferenciálódás folyamatának megértésében nélkülözhetetlen szerepet játszanak az őssejtek. (2) Az orvosi kutatásban és a gyógyításban (a) hatóanyagok tesztelése; (b) beteg páciensek sejtjeinek tesztelése különféle terápiákra; (c) gyógyítás: leukémia, Parkinson- és Alzheimer-kór, idegi sérülések, agyvérzés, szív- és cukorbetegség, stb. Dia34-37 Indukált pluripotens (iPS) őssejtek előállítása testi sejtek újra programozásával Shinya Yamakan japán kutató 2006-ban transzkripciós faktor gének bevitelével differenciált (bőr fibroblaszt) egér sejteket tudott ES-szerű sejtté alakítania. Ezeket a sejteket iPSC-nek (induced Pluripotent Stem Cells; indukált pluripotens őssejt) nevezte el. Az iPS sejtekbe egy genetikailag átalakított (avirulenssé tett) retrovírus vektorral vitt be olyan transzkripciós faktor géneket (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc), amelyek a sejtek elkötelezettségét (epigenetikai programját) visszaállították olyan szintre, mint a pluripotens őssejteké. Ezek a sejtek képesek voltak mindenféle sejttípussá differenciálódni, sőt olyan fertilis (termékeny) egér is előállítható, melynek minden sejtje iPSC-ből képződik. James Thompson (a humán ES sejtek előállítója) 2007-ben elsőként tudott emberi iPS sejteket előállítani transzkripciós faktor gének humán fibroblaszt sejtekbe való bevitelével. SATÍROZOTT TERÜLET – Extra követelmény A négy transzkripciós faktor közül csak az Oct4 nem volt lecserélhető. A másik három gén nem csak más transzkripciós faktor génekkel helyettesíthető, hanem például a Klf4 és a c-Myc gének helyett egy kis molekula, - a hiszton deacetilázt gátló - valproinsav is alkalmas az emberi fibroblaszt sejtek újraprogramozására. Mivel a retrovírus beépül a sejtek genomjába, intenzív kutatás indult másféle génbeviteli rendszerek kifejlesztése érdekében. A sejtek újraprogramozása egy egyszeri folyamat, ezért
ALAPKÖVETELMÉNY 26. Előadás
Boldogkői Zsolt ©
6
1. ŐSSEJTEK
az újraprogramozó faktorok folyamatos jelenléte nem szükséges, sőt, jobb is, ha az indukciót követően már nem fejeződnek ki. Ha a szükséges transzkripciós faktor géneket plazmidok transzfekciójával visszük be a sejtekbe, akkor tranziens (átmeneti) génkifejeződést érünk el, ami beindítja az újraprogramozást, majd az idegen DNS molekulák eltűnnek a sejtből. Beépíthetjük a fenti géneket az úgynevezett Cre-loxP rendszer segítségével is (lásd utolsó előadás). Ilyenkor a beépült gének kivághatóak a Cre enzim hozzáadásával. A Kanadában dolgozó Nagy András ugráló gének segítségével juttatta be a transzkripciós faktor géneket a differenciált sejtek genomjába, ahonnan később ezek a Cre hatására kivágódtak. A transzkripciós faktorok indukált kifejeződését a tetraciklin rendszer alkalmazásával szintén megoldották (lásd utolsó előadás). A fehérjéket közvetlenül is bejuttathatjuk a sejtekbe, ahol azok elvégzik a feladatukat, majd degradálódnak. A legegyszerűbb módszer az újraprogramozásra a kis molekulák használatán alapul. Ha megoldható lenne a kizárólag kis molekulák általi újraprogramozhatóság, az egy újabb áttörést jelentene az őssejt kutatásban. A differenciált sejtek alacsony hatékonysággal (<0.1%) alakulnak át iPS sejtekké, de ez nem probléma, mert szelektíven elszaporítjuk ezeket. Nem értjük azonban, hogy a transzkripciós faktor gének magas transzfekciós hatékonysága ellenére miért ilyen alacsony gyakorisággal keletkeznek az iPS sejtek. A jelenséget két 6 vetélkedő elmélet próbálja magyarázni: (1) Az elit sejt elmélet szerint a sejtek csak egy kis szubpopulációja képes az újraprogramozódásra; (2) A sztochasztikus modell szerint minden sejt képes az újraprogramozódásra, de ez a folyamat kis gyakorisággal, s véletlenszerűen (bármelyik sejtben egyforma eséllyel) megy végbe. A sejtek átprogramozódása a DNS és a hiszton metilációját, illetve a hiszton acetilációját érinti. A nőstények inaktiválódott X kromoszómája is újra aktív lesz. A multipotens sejtek egyszerűbben átalakíthatók pluripotens sejtekké, mint a differenciálódott sejtek (a Sox2 transzkripciós faktor nem is szükséges). Az újraprogramozáshoz szükséges transzkripciós faktorokat úgy állapították meg, hogy megvizsgálták milyen gének fejeződnek ki az ES sejtekben. Dia38 Sejt újraprogramozás, génterápia Egy egér modellen mutatjuk be a sejtek újraprogramozásának és génterápiának a kombinálását. Az egér „páciens” sarlóssejtes vérszegénységben szenved. Első lépésként, egy hámsejtet izolálunk az egérből, majd egy retrovírus vektor segítségével olyan transzkripciós faktor géneket viszünk be ezekbe a sejtekbe, amelyek a specializált sejteket átprogramozzák iPS sejtekké. A transzformáns (bevitt géneket tartalmazó) sejteket izoláljuk [a szintén bevitt antibiotikum rezisztencia gének segítségével (antibiotikumot adunk a tápközegbe, s csak a transzformáns sejtek élnek túl)]. Következő lépésként, a mutáns gént kicseréljük a normál génre, úgy, hogy egy egyszerű kémiai transzfekciós módszerrel bevisszük a sejtekbe, s homológ rekombinációval beépül a sejt DNS-ébe. Végül, a transzformáns iPS sejteket differenciáltatjuk, s transzplantáljuk az egér csontvelőjébe. Az eredmény: gyógyult egér. Dia39 Sejt újraprogramozás és génterápia a gyógyászatban Az iPS sejteken alapuló technológiát alkalmazhatjuk a gyógyászatban is. Felnőtt testi sejteket (például bőr fibroblaszt sejteket) iPS sejtekké alakítunk az előzőleg említett retrovírus alapú génbeviteli technikával. Ezeket a sejteket szaporíthatjuk, mivel önmegújuló képességgel rendelkeznek. Ha a páciens nem szenved genetikai betegségben, csupán sérültek a szövetei, akkor az iPS sejteket differenciáltatjuk, majd beültetjük a megfelelő szervbe. Ha a páciens genetikai betegségben szenved, akkor az iPS sejtekben először molekuláris genetikai eszközökkel kijavítjuk a hibát. Ha a problémát egy domináns negatív mutáció okozza, akkor ki kell cserélnünk a hibás gént (homológ rekombinációval). Ha viszont, a mutáció nem domináns (a probléma az elégtelen kifejeződés heterozigóta állapotban), akkor a normális gént bevihetjük a genom más részébe is, úgy, hogy közben a hibás gén is megmarad (illegitim rekombinációval). A mutáció kijavítását követően, differenciáltatjuk a transzformáns sejteket, majd beültetjük a gazda szervezetébe. Az iPS sejteket úgy használhatjuk a donor egyén gyógyítására, hogy nem fog fellépni szöveti inkompatibilitás (nem-egyezés). Az iPS sejteket használhatjuk arra is, hogy farmakológiai (gyógyszerészeti) kísérleteket végezzünk velük, annak megállapítására, hogy a pácienst milyen gyógyszeres kezelésnek vethetjük alá: megállapítható, hogy a sejtek mire érzékenyek, milyen szer hatástalan, s mikre reagálnak pozitívan. Az iPS sejtek alkalmazásának óriási előnye más módszerekhez képest az, hogy könnyen izolálható a páciens szöveteiből, s a beteg sejtek genetikai hibájának kijavítása után a testbe visszajuttatott sejtek nem fognak immunválaszt kiváltani. A génterápiás alkalmazásokat természetesen, meg kell, hogy előzze a terápiás eljárás technikájának a kidolgozása, illetve a diagnózis megállapítása végett, a páciens sejtjeinek vizsgálata. Az iPSC technológia óriási jelentőséggel bír a betegség modellek in vitro vizsgálatában. Különféle monogénes, betegségekre léteznek már sejtvonalak, például ALS (amiotrófiás laterálszklerózis), (szporadikus) Parkinson kór, stb. A kérdés az, hogy a komplex eredetű betegségek tanulmányozására alkalmas lesz-e ez a technika. Az iPSC technika a
ALAPKÖVETELMÉNY 26. Előadás
Boldogkői Zsolt ©
7
1. ŐSSEJTEK
személyre-szabott gyógyásztat nagy reménysége. Az iPS technika korlátainak egyike az, hogy a differenciált sejtek telomere már rövidülésen ment keresztül. Egy másik fontos problémára nemrég derült fény: bizonyos gyakorisággal teratómák képződhetnek e sejtekből. E megközelítés további finomítása elengedhetetlen. Dia40 Az őssejtek összehasonlítása lásd DIA
7
ALAPKÖVETELMÉNY 26. Előadás
Boldogkői Zsolt ©
