Současná glykobiologie, chemie a biochemie sacharidů v českých zemích

Česká společnost chemická - Odborná skupina organické, farmaceutické a bioorganické chemie Československá mikrobiologická společnost

Současná glykobiologie, chemie a biochemie sacharidů v českých zemích Souhrny přednášek a posterů

Mikrobiologický ústav AV ČR, Praha 22. březen 2001 ISBN 80-86238-11-3

8.00 - 9.00 9.00 - 9.15

Registrace, vyvěšení posterů Zahájení Program přednášek:

Předsedající: Jitka Moravcová (VŠCHT Praha) 9.15 - 10.00 Jiménez-Barbero J.: Applications of NMR to the study of the interactions between carbohydrates and analogues with lectins and enzymes 10.00 - 10.30 Biely P., Mastihubová M., Côté G. T., Greene R. V.: Spôsob účinku mikrobiálnych acetylxylan esteráz 10.30 - 10.45 CMS–Chemicals: Carbohydrates commercialisation for pharmaceuticals 10.45 - 12.00 Posterová sekce, přestávka, občerstvení Předsedající: Vladimír Křen (MBÚ AV ČR Praha) 12.00 - 12.25 Trnka T., Ježek J., Vepřek P.: Syntéza glykopeptidů a glykopeptidových dendrimerů s Tn antigenem 12.25 - 12.55 Říhová B., Jelínková M., Strohalm J., Hovorka O., Kovář M., Šťastný M., Plocová D., Ulbrich K.: Makromolekulární chemoterapeutika směrovaná lektiny 12.55 - 13.45 Oběd Předsedající: Tomáš Trnka (PřF UK Praha) 13.45 - 14.10 Bezouška K.: Sacharidové receptory zabíječských buněk: co vidíme v lidském genomu? 14.10 - 14.25 Sklenář J., Pavlíček J., Horváth O., Fišerová A., Pospíšil M., Batoni G., Campa M., Bezouška K.: Sacharidové, proteinové a peptidové mykobakteriální ligandy lidských lektinových receptorů CD69 a hNKR-P1. 14.25 - 14.40 Hušáková L., Křen V., Kuzma M., Herkomerová E., Bezouška K.: Enzymatic synthesis of N-acetylmannosamine containing oligosaccharides and their immunoactivity 14.40 - 14.55 Plíhal O., Sklenář J., Matoušek P. Weignerová L., Huňková Z., Křen V., Bezouška K.: Isolace, charakterizace, a molekulární klonování β-hexosaminidasy z Aspergillus oryzae CCM1066, sekretovaného glykoproteinu s typickými rysy rodiny glykosylhydrolas 20

14.55 - 15.10 Žídková J., Přibyla L., Chmelík J.: Stanovení sacharidů v ovocných nápojích pomocí kapilární elektroforézy a MALDI-TOF hmotnostní spektrometrie 15.10 - 16.00 Posterová sekce, přestávka, občerstvení Předsedající: Peter Biely (CHÚ SAV Bratislava) 16.00 - 16.25 Wimmer Z.: Chemical and anzymic synthesis and transformation of β-Dglucopyranosides of C(α)-substituted cyclanols 16.25 - 16.40 Červenková R., Řiháková Z., Filip V., Šmidrkal J., Čížková M.: Antimikrobiální účinky esterů sacharosy s mastnými kyselinami 16.40 - 16.55 Rudolfová J., Čurda L., Tovarová I.: Využití kryoskopie pro sledování průběhu hydrolýzy laktosy 16.55 - 17.10 Jindřich

J.:

β-cyklodextrinu 17.10 - 17.15 Závěr

Syntéza

regioselektivně

mono-substituovaných

derivátů

Posterová sekce 1.

Bezouška K., Křen V., Vannucci L., Fišerová A., Pospíšil M., Roy R., Lindhorst T. K.: Sacharidové glykodendrimery jako účinné ligandy aktivujícího lymfocytárního receptoru NKR-P1A a látky zajímavé v nádorových imunoterapiích

2.

Buchalová K., Kefurt K.: Stabilita acetalových a ketalových chránících skupin v derivátech sacharidů v přítomnosti Lewisových kyselin

3.

Dobrovolný P., Raich I.: Optimalizace syntézy -difluorcytidinu) pro farmaceutický průmysl

4.

Fialová P., Hušáková L., Huňková Z., Kuzma M., Weignerová L., Křen V.: Substrate specifity of fungal β-N-acetylhexosaminidases

5.

Karasová P., Malá Š., Králová B., Russell N. J.: Klonování genu kódujícího jeden z izoenzymů β-galaktosidasy z psychrotrofního kmene Arthrobacter sp. C2-2

6.

Karban J., Hilgard S.: Infračervená spektroskopie epimonoderivátů 1,6-anhydro-β-Dhexopyranos

7.

Kráľová K., Capek K.: Štruktúra a biologická aktivita oligosacharidov v predlžovacom raste rastlinných buniek

8.

Kniežo L., Štěpánek P., Šimák O.: Studium syntézy (1→3)-C-disacharidů

9.

Krist P., Sadalpure K., Patel A., Bezouška K., Křen V., Lindhorst K. T.: Preparation of thiourea-bridged glycodendrimers with biological activity

10.

Labíková T., Raich I.: Příprava, prostorové uspořádání a stereochemi nukleofilního štěpení epoxidů a episulfidů methylerythrofuranosidů

11.

Moravcová J., Fenclová L., Dvořáková H., Tkadlecová M., Rollin P.: Inverse konfigurace na dusíku: 1H NMR studie methyl-3,5-dideoxy-β-D-pentofuranosidu s anelovaným pyrazolidinovým kruhem

12.

Moravcová J., Kočalka P., Dvořáková H., Kubelka V.: Vedlejší produkty při reakci 1,2-Oisopropyliden-α-D-ribofuranosy s trifenylfosfinem a diethylazodikarboxylátem

13.

Moravcová

14.

Mylerová V., Ovesná M., Páca J., Martínková L., Křen V.: Deacetylace Nacetylhexosaminů bakteriálními deacetylasami

15.

Pavlíček J., Sopko B., Plíhal O., Staňková B., Novák P., Bezouška K.: Výzkum strukturních a vazebných vlastností sacharid vázající domény lymfocytárního antigenu CD69

16.

Pišvejcová A., Hušáková L., Bezouška K., Křen V.: Occurence of N-acetylmannosamine and its role in biological recognition phenomena

17.

Raich I., Kaminský J., Ludiková J., Heissigerová H.: Detailní prostorové uspořádání methyltetrofuranosidů a jejich derivátů s tříčlenným kruhem pomocí experimentálních a výpočetních metod

J., Nedvědová A., Drašar L.: methansulfonylesterů α-D-pentofuranos

Nová

gemcitabinu

fluorační

(2´-deoxy-2´,2´-

činidla:

fluorace

18.

Rauvolfová J., Macková M., Sedmera P., Bezouška K., Křen V.: Chemoenzymatic modulations of aminosugars-new bioactive molecules

19.

Rohlenová A., Ledvina M., Křen V., Bezouška K.: Syntéza nové skupiny potenciálních oligosacharidových mimetik přirozených ligandů aktivačního receptoru NK buněk

20.

Sejbal J., Vondrášek J., Velek J., Vepřek P., Trnka T., Ježek J.: Computational and NMR study of multiple antigenic glycopeptides with Tn antigens

21.

Simerská P., Hušáková L., Huňková Z., Kuzma M., Nicotra S., Riva S., Křen V.: αGalactosidases – their natural and non-natural substrates and their use for transglycosylation reactions

22.

Sklenář J., Plíhal O., Vannucci L., Lindhorst T. K., Bezouška K.: Determination of glycoclusters in the complex matrixes by HPAEC-PAD

23.

Sopko B., Pavlíček J., Sklenář J., Bezouška K.: Molekulární model sacharidové vazebné domény proteinu NKR-P1

24.

Spiwok V., Strnad H., Karasová P., Malá Š., Králová B.: β-Galaktosidasa antarktické bakterie Arthrobacter sp. C2-2: předběžné studium pomocí modelování založeného na homologii

25.

Synytsya A., Král V., Synytsya A., Čopíková J., Volka K.: Interaction of anionic polysaccharides with oligopyrrole macrocycles

26.

Synytsya A., Čopíková J., Brus J.: 13C CP/MAS NMR spectroscopy in structural analysis of pectins

27.

Trtek T., Černý M., Trnka T., Buděšínský M.: Synthesis of a new 3,10,12-trioxa-6-azatricyclo[7.2.1.02,7]dodecane skeleton

28.

Vannucci L., Pospíšil M., Fišerová A., Kuldová M., Krausová K., Bezouška K., Křen V., Sadalapure K., Lindhorst T. K.: Immunotherapy of experimental tumors by multivalent neoglycoconjugates

29.

Veselý J., Jindřich J., Trnka T., Ledvina M.: Synthesis of orthogonally protected 2-amino-2deoxy-D-hexopyranoses

30.

Zyka D., Pavelová R., Ledvina M., Ježek J., Šaman D.: Nová efektivní synthesa normuramylových analogů muramylových glykopeptidů

APPLICATIONS OF NMR TO THE STUDY OF THE INTERACTIONS BETWEEN CARBOHYDRATES AND ANALOGUES WITH LECTINS AND ENZYMES Jesús Jiménez-Barbero Instituto de Química Orgánica General, C.S.I.C. Juan de la Cierva 3, 28006 Madrid, Spain Email: [email protected] Carbohydrate-protein interactions are involved in a range of biological mechanisms. It is obvious that a detailed knowledge of the structure and dynamics of carbohydrates both free and bound to proteins is indeed relevant. In this context, different examples of the application of NMR as a tool to study protein-carbohydrate interactions in solution will be presented. In particular, it will be demonstrated that the same saccharide analogue (C-lactose) can be recognised by three different proteins (ricin-B, galectin-1, beta galactosidase from E. coli) in three distinct conformations. As a second example, the study by NMR of the specific interaction of hevein domains with GlcNAc oligomers will be described. It will be shown that recognition of chitin by hevein domains is a dynamic process, not restricted to the binding of the non-reducing end of the polymer, as previously thought, thus allowing high affinity binding to a number of protein molecules, depending on polymer chain length, and that therefore, the biological process is multivalent.

SACHARIDOVÉ RECEPTORY ZABÍJEČSKÝCH BUNĚK: CO VIDÍME V LIDSKÉM GENOMU? Karel Bezouška1,2 1

Katedra biochemie PřFUK, Hlavova 8, 12840 Praha 2, 2Laboratoř přirozené buněčné imunity,

MBÚ AV ČR, Vídeňská 1083, 14220 Praha 4, e-mail: [email protected]. Nedávné publikování předběžné verze lidského genomu (Nature, 15. února 2001, Science, 16. února 2001) nám též poskytuje celkovou orientaci v množství genů a proteinových modulů pro jednotlivé rodiny lidských molekul ve srovnání s jinými eukaryotickými organismy, sekvenace jejichž genomů již byla dokončena (kvasinka S. cerevisiae , červ C.elegans, muška D.melanogaster a rostlina A.thaliana). Při celkovém pohledu na lidský genom a proteom je zřejmé, že u člověka došlo k nebývalému nárustu počtu genů zejména v případě komunikačních molekul, a dále obranných molekul imunitního systému. Velmi zajímavý je z tohoto hlediska pohled na rodiny receptorů zabíječských buněk, které představují evolučně starou populaci efektorových buněk imunitního systemu. I přes ohromnou expanzi imunoglobulinové superrodiny u člověka je rodina receptorů zabíječských buněk reprezentována pouze 16 imunoglobulinovými moduly. Na druhé straně patří ze 76 modulů přítomných v lidské lektinové rodině Ctypu (jejíž četné zástupce ovšem na druhé straně nacházíme již u bezobratlých - červa a mušky) nejméně 40 do rodiny zabíječských receptorů. Ukazuje se tedy, že zastoupení lektinových receptorů převažuje nad imunoglobuliny. Dále je patrné, že jsme zatím znali a začali strukturně charakterizovat pouze malou frakci lektinových molekul exprimovaných u zabíječských buněk. Kromě tradičně studovaných molekul jako je NKR-P1, CD69, CD94 a NKG2D byla na lidském chromosomu 12 identifikována celá řada dalších molekul, které zde pravděpodobně vznikly mechanismem genové duplikace a diverzifikace. V této souvislosti je možné uvést alespoň molekuly KLRG1 (MAFA), LLT1, KLRF1, AICL, OLR1, DEC lectin 1, DEC lectin 2, NKG2F, NKG2E, NKG2A a LY49. Na úrovni sekvenční homologie (prohledávání lidského genomu prohlížečem BLAST) mají všechny tyto molekuly více než 40 % identit podél aminokyselinové sekvence, jejich trojrozměrné struktury a biologické a vazebné aktivity zůstávají zcela neznámé. Na druhé straně je však kvantitativní úroveň jejich exprese, a analýza vazebných aktivit nezbytná pro pochopení funkce zabíječských lymfocytů. V naší laboratoři se nyní pokoušíme o získání příslušných cDNA klonů, aby mohla být zahájena exprese a zkoumání těchto velmi zajímavých proteinů. Podporováno výzkumným záměrem MŠMT 113100001, granty GAČR 303/99/1382, 524/00/1275 203/01/1018, a nadací Volkswagen Stiftung

a

SACHARIDOVÉ GLYKODENDRIMERY JAKO ÚČINNÉ LIGANDY AKTIVUJÍCÍHO LYMFOCYTÁRNÍHO RECEPTORU NKR-P1A A LÁTKY ZAJÍMAVÉ V NÁDOROVÝCH IMUNOTERAPIÍCH Karel Bezouška1,2, Vladimír Křen3, Luca Vannucci4, Anna Fišerová2, Miloslav Pospíšil2, Rene Roy5 a Thisbe K. Lindhorst6 1

Katedra biochemie PřFUK, Hlavova 8, 12840 Praha 2; 2Laboratoř přirozené buněčné imunity, 3Laboratoř biotransformací MBÚ AV ČR, Vídeňská 1083, 14220 Praha 4; 4Division of General Surgery, Department of Oncology, University of Pisa, Via Paradisa 2, 56124 Pisa, Itálie; 5Department of Chemistry, University of Ottawa, Ottawa, ON, K1N 6N5, Kanada; 6Institute of Organic Chemistry, Christiana Albertina University of Kiel, OttoHahn-Platz 4, D-24098 Kiel, SRN

Biologické aktivity sacharidových dendrimerů polyamidoaminového a polylysinového typu (Fig. 1) [1], [2]) byly zkoumány v systemu receptoru NKR-P1A, aktivujícího membránového proteinu přirozených zabíječských buněk a NK/T-lymfocytů. V našich počátečních pokusech bylo zjištěno, že dimerická rozpustná forma receptoru NKR-P1 exprimovaná v bakteriích E.coli projevuje velmi vysokou aktivitu vůči určitým sacharidovým zbytkům, jako je β-glykosidicky vázaný N-acetyl-D-glukosamin, zatímco nereaguje s jinými sacharidy, jako je α-glykosidicky vázaná D-mannosa [3]. U oligosacharidových ligandů může dojít k zesílení vazby, přesto však zůstává úloha terminálních zbytků dominantní. Bylo prokázáno, že látky typu N-acetyl-D-glukosaminových glykodendrimerů jsou velmi dobrými ligandy pro receptor NKR-P1, takže dokonce dochází ke tvorbě definovaných Fig. 1 precipitátů [4]. Těchto unikátních vlastností PAMAM-based glycodendrimers glykodendrimerů bylo jednak možné využít ke studiu přirozené formy receptoru NKRGlcNAc3 GlcNAc4 P1, jednak slouží jako základ nádorových terapií založených na aktivaci cytotoxických buněk [5,6]. HN

HN

S

S

N H

N

N H

S

HN

S

NH

HN

NH

HN

O

HN S

Podporováno výykumným záměrem MŠMT 113100001, granty GAČR 312/98/K034, 303/99/1382 a 203/01/1018, grantem AAV A702006, a nadací Volkswagen Stiftung (projekt I74679).

N H

H N

N H

N NH

O

O

N

S

N O

S

H N

HN

O

HN

NH

N

O

O

O

NH

N H

N H

HN

HN HN

O

NH

S

N

S

NH

N O

H N

O

H N

O

HN

N

HN S

O

NH

N H

S

[1] Lindhorst TK, Kieburg C 1996 Angew Chem Int Edn Engl 35, 1953. [2] Zanini D, Roy R 1997 Bioconjug Chem 8, 187. [3] Bezouška K et al. 1994 J Biol Chem 269, 16945. [4] Bezouška K et al. 1998 FEBS Lett 426, 243. [5] Bezouška K. et al.1998 Nature (Lond.) 372, 150. [6] Pospíšil M. et al. 2000 Int J Oncol 16, 267.

O

NH

NH

NH

NH

S

S

HN

NH

GlcNAc8 Man8

O

NH NH

H N

H N

N H

N

S

NH

O

OH

S

HN

NHAc

=

H N

S

S

H N

N H

NH

O

N H

O

HN NH

S

O

NH

O

H N

H N

NH O

NH

O

O

NH

H N

S

S

HN

S

N H

O

O

S

GlcNAc4plys

O

O

NH N H

N H

H N S

N H

NH

NH O

O

NH

H N

O

O

GlcNAc8plys

O

H N O

O

O

H N

O

NH

N H

H N

N H

O

NH

O

S

O

O

O

H N

O N H

O NH

H N

N H

O

O

O

NH

H N

N H O

O

OH OH O

O

O

CO 2H

S

O

O

O

O

H N

O H N

H N

S

O

or HO HO

Polylysine-based glycodendrimers O

O

HO HO

HN

NH

O

O HN

O S

O

NH

O

CO 2H

Spôsob účinku mikrobiálnych acetylxylan esteráz Peter Biely1, Mária Mastihubová1, Gregory L. Côté2, Richard V. Greene2; 1 Chemický ústav SAV, 84238 Bratislava, Slovensko; 2USDA, ARS, Peoria, IL, USA Enzýmová hydrolýza najhojnejšej rastlinnej hemicelulózy, xylanu, je viac ako desaťročie v popredí záujmu základného i aplikovaného výskumu. Mikrobiálne xylanázy sa vyžívajú v papierenskom a potravinárskom priemysle, a v krmovinárstve. Enzýmová hydrolýza xylanov ulahčuje extrakciu lignínu v procese bielenia buničiny, čo vedie k znižovaniu množstva ekologicky závadných odpadov. V potravinárstve a krmovinárstve má priaznivé účinky znižovanie viskozity obilninových arabinoxylanov. V tvrdých drevinách a v jednoročných rastlinách sa nachádzajú 4-O-metyl-D-glukurono-D-xylany parciálne acetylované v polohách 2 alebo 3. Je zaujímavé, že súčasťou xylanolytických systémov sú enzýmy nazvané acetylxylan esterázy [1]. Ich funkciou je odstraňovať acetylové skupiny z jednotiek D-xylózy a tak vytvárať na hlavnom reťazci polysacharidu nové miesta pre produktívne viazanie depolymerizujúcich hydroláz. Tieto enzýmy sa práve afinitou k polymérnemu substrátu a regioselektivitou deacetylácie sacharidov líšia od početných acetylesteráz a lipáz, ktoré nachádzajú aplikácie v chémii sacharidov. Jednou z unikátných acetylxylan esteráz je enzým produkovaný kmeňom Streptomyces lividans. Vykazuje výnimočne vysokú afinitu voči polymérnemu substrátu, je však schopný katalyzovať aj deacetyláciu per-O-acetylovaných metyl β-glykozidov, Deacetylácia modelových látok prebieha výlučne v polohe 2 a 3, odpovedá teda funkcii enzýmu pri degradácii polymérneho substrátu. Na diacetátoch metyl β-D-xylopyranozidu ako modelových substrátoch sa zistilo, že AcXE zo S. lividans katalyzuje o niekoľko rádov rýchlejšie deacetyláciu polohy 2 alebo 3, ak je OH-skupina vo vedľajšej polohe, teda v polohe 3 alebo 2, súčasne neacetylovaná. Enzým sa chová tak, akoby deacetylácia polohy 2 alebo 3 prebiehala cez spoločný orto-esterový intermediát, v ktorom je acetylová skupina viazaná súčasne na OH-skupiny v polohe 2 a 3 (Schéma 1) [2].

Na podporu uvedeného mechanizmu deacetylácie polôh 2 a 3 sme syntetizovali analógy acetylovaného metyl β-D-xylopyranozidu, u ktorých je tvorba orto-esterového intermediátu vylúčená: metyl 2-deoxy-3,4-di-O-Ac-, 3-deoxy-2,4-di-O-Ac- a 3-deoxy-3-fluor-2,4-di-O-Ac-βD-xylopyranozid. Náhrada OH-skupiny v polohách 2 alebo 3 vodíkom alebo fluórom viedla k spomaleniu reakcie enzýmom katalyzovanej deacetylácie o niekoľko rádov, čo podporilo hypotézu, že deacetylácia polohy 2 alebo 3 ak je OH-skupina na vedľajšom uhlíku voľná acetylxylan esterázou S. lividans sa uskutočňuje cez spoločný intermediát. Je zaujímavé, že intermediáty podobného charakteru sa uvažujú v reakciách aminoacyltransferáz [3]. [1] Biely P., Puls J., Schneider H. (1985) FEBS Letters 186, 80-84. [2] Biely P., Cote G.L., Kremnický L., Greene R.V., Dupont C. (1996) FEBS Letters 396, 257260. [3] Chládek S., Sprinzl M. (1985) Angew. Chem.Int. Ed. Engl. 24, 371-391.

STABILITA

ACETALOVÝCH

A

KETALOVÝCH

CHRÁNÍCÍCH

SKUPIN

V DERIVÁTECH SACHARIDŮ V PŘÍTOMNOSTI LEWISOVÝCH KYSELIN

Kateřina Buchalová, Karel Kefurt VŠCHT, Ústav chemie přírodních látek, Technická 5, Praha 6, 166 28 e-mail: [email protected] Bylo zjištěno, že v etherových roztocích (2-propylether, 1,2-dimethoxyethan) látek I-IV dochází v přítomnosti katalytického množství BF3⋅Et2O k částečné intermolekulární migraci chránících skupin. Vedle derivátů V-VIII s maximálním počtem chránících skupin vznikají i volné aldosy resp. alditoly. ROCH2 RO O

ROCH2

O OR

RO

OH O

O

O

RO RO

RO

CH3

O O

O O

CH3

O

I,IV

II,VI I,II V,VI

R H C(CH3)2

III,VII

IV,VIII III,IV VII,VIII

R H CHCH3

U látky I byla kromě výše uvedené migrace pozorována hlubší změna spočívající v destrukci ketalové chránící skupiny a spontánním spojování nechráněných molekul D-xylofuranosy

do oligomerních řetězců s počtem jednotek 2-15.

Práce je součástí řešení výzkumného záměru MŠMT č. 223300006

ANTIMIKROBIÁLNÍ ÚČINKY ESTERŮ SACHAROSY S MASTNÝMI KYSELINAMI Červenková Radka, Řiháková Zdeňka, Filip Vladimír, Šmidrkal Jan, Čížková Marcela Vysoká škola chemicko-technologická, Ústav technologie mléka a tuků, Technická 3, 166 28 Praha 6, tel. 02/24353274, fax. 02/24353285 e-mail: [email protected] Je známo, že estery mastných kyselin s glycerolem mají antimikrobiální účinky. Tyto látky se hojně používají jako emulgátory v tukovém a kosmetickém průmyslu. Estery mastných kyselin s glycerolem jsou lépe rozpustné v tukové fázi. Životním prostředím mikroorganismů v emulzních systémech je však vodná fáze. V rámci zvýšení hydrofility, a tedy i rozpustnosti antimikrobiální látky ve vodné fázi, byl glycerol v testovaných látkách nahrazen sacharosou a u těchto derivátů byla stanovena antifungální aktivita. Inhibiční vlastnosti esterů sacharosy s vyššími nasycenými mastnými kyselinami (dekanová, undekanová, dodekanová a tetradekanová) byly testovány na kmen Aspergillus sp. DMF 0501. Metodou IFR želatinových kazet bylo zjištěno, že 6-O-undekanoylsacharosa inhibuje germinaci spor při koncentracích vyšší než 0,7 mg/ml a 6-O-tetradekanoylsacharosa při koncentracích

vyšších

než

1,0

mg/ml,

ostatní

estery

(6-O-dekanoylsacharosa

a

6-O-dodekanoylsacharosa) v rozsahu testovaných koncentrací germinaci spor neinhibují. Všechny testované látky inhibovaly rychlost růstu kolonie plísně. Se vzrůstajícím počtem uhlíkových atomů v molekule rychlost růstu kolonie plísně klesala. U testovaných látek byla změřena povrchová napětí kroužkovou metodou a stanovena kritická micelární koncentrace. Získané výsledky naznačují, že existuje souvislost mezi strukturou molekuly antifungální látky a jejím účinkem na růst plísně.

OPTIMALIZACE SYNTÉZY GEMCITABINU (2´-DEOXY-2´,2´-DIFLUORCYTIDINU) PRO FARMACEUTICKÝ PRŮMYSL Petr Dobrovolný, Ivan Raich Ústav chemie přírodních látek, Vysoká škola chemicko-technologická v Praze 166 28 Praha 6,Česká republika [email protected], [email protected] Gemcitabin⋅HCl (1) (obch. název Gemzar) je nový syntetický difluorovaný analog cytidinu patřící mezi významné farmaceutické léky s antivirovým a cytostatickým účinkem (schválený Americkým úřadem pro kontrolu potravin a léčiv (FDA)), používaný pro léčbu malobuněčného karcinomu plic, leukémie, rakoviny prsu, slinivky břišní, vaječníků, tlustého střeva, prostaty, močového traktu a měchýře, ledvin, hrdla. Při chemoterapii je užíván v kombinaci s jinými léky: např. cisplatin, docetaxel, carboplatin, ifosfamid, vinorelbin, epirubicin, paclitaxel, oxaliplatin, 5-fluoruracil, cytarabin, fludarabin, doxorubicin, vesnarinon, taxan, etoposid, anthracyklin, amifostin, acetyldinalin. Tato celosvětově významná látka je proléčivem, které se stává v buňce aktivním

po fosforylaci

na

gemcitabindifosfát

(dFdCDP)

a

gemcitabintrifosfát (dFdCTP) v přítomnosti enzymu deoxycytidin kinasy.

Vzniklé

fosforylované

deriváty

inhibují

deoxycytidin-

monofosfát (dCMP) deaminasu, cytidintrifosfát (CTP) synthetasu a ribonukleotid reduktasu. Při inhibici těchto enzymů je narušena metabolická cesta syntézy deoxyribonukleové kyseliny. Práce se zabývá navržením syntézy gemcitabinu a optimalizací jednotlivých syntetických kroků s ohledem na výtěžek, cenu vstupních surovin a možnost provádění reakce ve větším měřítku. Ve všech reakčních stupních byly syntetizované meziprodukty charakterizovány pomocí NMR a IČ, vedlejší produkty a nečistoty pomocí HPLC. Byly navrženy dvě varianty syntézy vycházející z D-ribosy a z cytidinu. Při těchto syntézách byly vyzkoušena i nová a relativně drahá organická činidla, poskytující vysoké výtěžky a umožňující snadnou izolaci produktů – DMP [Dess-Martinův

periodinan]

na

oxidaci

sekundární

[(diethylamino)sulfurtrifluorid] na geminální difluoraci .

hydroxylové

skupiny

a

DAST

INVERSE KONFIGURACE NA DUSÍKU: 1H NMR STUDIE METHYL-3,5DIDEOXY-β-D-PENTOFURANOSIDŮ S ANELOVANÝM PYRAZOLIDINOVÝM KRUHEM JITKA MORAVCOVÁ1, LUCIE FENCLOVÁ1, HANA DVOŘÁKOVÁ2, MARCELA TKADLECOVÁ3, PATRICK ROLLIN4 1

Ústav chemie přírodních látek, 2Centrální laboratoře, 1Ústav analytické chemie, Vysoká škola chemicko-technologická, Technická 5, 166 28 Praha 6; 4ICOA, Université d'Orléans, BP 6759, F-45067 Orléans, Francie Pyrazolidin 1 je snadno dostupný v jednom kroku z 1,2-O-isopropyliden-α-D-

ribofuranosy. Pro synthesu analogů nukleosidů jsme ho převedli na příslušné 1,2-Odiacetyl deriváty. V 1H i

13

C NMR spektrech obou diacetátů jsme pozorovali nejméně

dvě rovnováhy, pro něž jsme spočítali thermodynamické parametry a přisoudili je inverzi na dusíku a brzděné rotaci kolem jednoduché C-N vazby. Abychom posoudili vliv EtOOC

O EtOOC

O

N

různých

COOEt N O

N N

O

COOEt

1

OMe 2

OCOCH3

substituentů v poloze 1 a rovněž tak na obou dusíkových atomech na stereochemii tohoto neobvyklého bicyklického systému, připravili jsme jako modelové sloučeniny anomerní glykosidy 2 a studovali jejich chování pomocí měření

1

H NMR spekter

v rozmezí teplot 288 – 373 K. Z Eyringovy rovnice jsme spočítali aktivační parametry a porovnali s publikovanými údaji i daty nalezenými pro dříve studované diacetáty. Ukazuje se, že pro stereochemii tohoto typu sloučenin je nejdůležitější konfigurace na anomerním uhlíku. V případě β-anomerů pravděpodobně dochází k nevazebné interakci stabilizující trans konfiguraci na obou dusíkových atomech. Studie bude pokračovat sérií látek substituovaných i na obou atomech dusíku. Tato práce byla finančně podporována MŠMT v rámci výzkumného záměru č. 22330006.

SUBSTRATE SPECIFITY OF FUNGAL β-N-ACETYLHEXOSAMINIDASES P. Fialová, L. Hušáková, Z. Huňková, M. Kuzma, L. Weignerová, V. Křen Institute of Microbiology, Laboratory of Biotransformation, Academy of Sciences of the Czech Republic, Vídeňská 1083, 142 20 Prague 4, Czech Republic, e-mail: [email protected] In recent years, oligosaccharides have evoked an increasing interest as key structures in many adhesion and recognition processes in living organisms. In the search for efficient oligosaccharide syntheses enzymatic methods play a crucial role. One of their main advantages, esp. with glycosyltransferases and glycosidases, is based on the possibility of using various unnatural substrates. Thus, the diversity of new potentially useful glycostructures increases significantly. For example, our previous research has shown that some hexosaminidases are able to accept 6-O-acylated glycosyl donors and even to catalyse their transglycosylation giving yield to modified oligosaccharides. In this area we have currently investigated on the influence of N-acyl modification on the activity of hexosaminidases concerning the affinity to the modified structures and possibly the transglycosylation potential. Some scare hints on this topic have also appeared in literature. For this reason, we synthetised p-nitrophenyl 2-(trifluoacetyl)amido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside starting from D-glucosamine hydrochloride. The synthesis route includes several steps via 3,4,6tri-O-acetyl-2-acetamido-2-deoxy-α-D-glucopyranosyl chloride rearranged to 1,3,4,6-tetra-Oacetyl-2-amino-2-deoxy-α-D-glucopyranose hydrochloride, which is selectively trifluoracetylated on the amino group, converted to a bromide and consequently to a pnitrophenyl glycoside, which was finally deprotected giving yield to the desired compound. We performed a wide enzymatic screening comprising our enzymatic library of fungal glycosidases and several animal and plant enzymes for the possible activation and inhibition effects of this substrate. With some enzymes (esp. β-N-acetylhexosaminidase from B. Epidymis and from Jack Beans) this substrate caused a significantly increased affinity to the standard substrate. Furthermore, β-N-acetylhexosaminidase from P. oxalicum 1959 showed a slight affinity to this substrate at an enormous concentration whereas at a concentration comparable to that used with standard substrate the enzyme was inhibited. Our proposed mechanism for this unusual behaviour is that β-N-acetylhexosaminidase from P. oxalicum 1959 willingly accepts this substrate to its activation site but is unable to split its glycosidic bond effectively and therefore exhibits a certain level of inhibition. These results indicate that although the substrate specifity of β-N-acetylhexosaminidases is low enough to accept and even transglycosylate some significantly modified substrates, the replacement of an N-acetyl group by a sterically similar N-trifluoracetyl group is unacceptable. This is quite surprising in view of the fact that for example metabolites of fluoracetic acid can block the citrate cycle efficiently being confused for acetyl derivatives by the enzymes of energetic metabolism. Hušáková, L. et al: Enzymatic glycosylation using 6-O-acylated sugar donors and acceptors: β-Nacetylhexosaminidase-catalysed synthesis of 6-O,N,N`-triacetylchitobiose and 6`-O,N,N`triacetylchitobiose, Carboh. Res., in press Mariam, G. et al: Synthesis of some p-nitrophenyl 2-acylamido-2-deoxy-D-glucosides and their hydrolysis with the β-D-hexosaminidase from Hohenbuehelia serotina

Syntéza regioselektivně mono-substituovaných derivátů β-cyklodextrinu* Jindřich Jindřich Katedra organické chemie, PřF UK, Albertov 2030, 128 40 Praha e-mail: [email protected] Cyklodextriny (CD), cyklické oligomery glukosy, přitahují v posledních letech mnoho pozornosti díky jejich komplexačním schopnostem. Celé číslo Chemical Reviews z července/srpna 1998 věnované těmto sloučeninám dokazuje jejich důležitost. Regioseletivně substituované deriváty cyklodextrinů jsou používány například jako enzymové modely nebo jako selektivní pseudofáze v kapilární R6

elektroforéze. Z tohoto posledního důvodu byly přiraveny 2I-O-, 3I-

O

O- a 6I-O-(3-R-allyl)-β-cyklodextriny (I, II, III), použitím kombinací dvojné

vazby

allylové

skupiny

představují

O R3

O

regioselektivních reakčních podmínek a separačních metod. Díky přítomnosti

O O

syntézu jiných derivátů jako jsou kopolymery, karboxymethyl nebo

R1

karbonylmethylderiváty.

0.5M NaOH, CinBr

β-CD

2M NaOH, AllBr

CD

I

R1,R3,R6=H R2=allyl

II

R1,R2,R6=H R3=cinnamyl

III

R1,R2,R3=H R6=allyl

CD O

COOH

CD O

O

R'NH2

R

CONH2

m

O NHR'

R'CH=PPh3 CD O

R CONH2

O CD

Součást projektů: GAČR 203/00/1564 a MŠMT 113100001

*

CD O

NaIO4, RuCl3

O

n

O R2

tyto

sloučeniny (po chránění peracetylací) velmi užitečné prekursory pro

0.5M NaOH, AllBr

O

R'

O O R1

O R1

6

DETAILNÍ PROSTOROVÉ USPOŘÁDÁNÍ METHYLTETROFURANOSIDŮ A JEJICH DERIVÁTŮ S TŘÍČLENNÝM KRUHEM POMOCÍ EXPERIMENTÁLNÍCH A VÝPOČETNÍCH METOD Ivan Raich, Jakub Kaminský, Júlia Ludiková, Helena Heissigerová Ústav chemie přírodních látek, Vysoká škola chemicko-technologická v Praze 166 28 Praha 6, Česká republika ([email protected], [email protected]) Aplikace klasické Karplusovy rovnice1, používané v konformační analýze sacharidů pro přepočet vicinálních interakčních konstant na dihedrální úhly, je někdy problematické v důsledku velké flexibility studovaných molekul nebo v důsledku silně zdeformované geometrie. Mírného zlepšení lze v případě flexibilních struktur dosáhnout řešením konformační rovnováhy, např. N- a S-konformerů. Nejperspektivnější jsou však modelovací studie, založené na molekulárněmechanických (MM) a ab-initio (QM) metodách. S využitím methyltetrofuranosidů obecného vzorce I (R1 = H, OMe; R2 = OMe, H; R3 = H, OH; R4 = OH, H), jako příkladu nejjednodušších neredukujících furanosových sacharidů, je porovnáno systematické mapování konformačního prostoru s využitím MM a QM metod a molekulární dynamiky. Je diskutována přesnost a další vlastnosti těchto metod. Furanosidy s anelovaným tříčlenným heterocyklickým kruhem obecného vzorce II (X = O, S, NR; R = H, acyl) představují příklad, kde je obtížné použít MM metody v důsledku komplikované parametrizace. V tomto případě jsou ab-initio výpočty ideální metodou a vypočtené ploché obálkové konformace se výborně shodují s dostupnými experimentálními daty.

O R R3 R2 1

OH R4

O

OMe

X X = O, S, NR

(I)

( II )

1. C. A. G. Haasnoot, F. A. A. M. de Leeuw, C. Altona: Tetrahedron 1980, 36, 2783–2792. Práce je součástí řešení výzkumného záměru MŠMT č. 223300006.

Klonování genu kódujícího jeden z izoenzymů β-galaktosidasy z psychrotrofního kmene Arthrobacter sp. C2-2 Petra Karasová, Šárka Malá, Blanka Králová a Nicholas J. Russell * Ústav biochemie a mikrobiologie, VŠCHT, Technická 3, 166 28 Praha 6 tel.: 02/24353028 fax: 02/24355167 *Department of Biological Sciences, Imperial College University of London e-mail: [email protected],

Enzymy s vysokou specifickou aktivitou při nízkých teplotách jsou velkým potenciálem pro současné biotechnologie (například pro potravinářský průmysl). Psychrotrofní mikroorganismy mohou být hodnotným zdrojem enzymů, které si zachovávají vyšší procento aktivity při nízkých teplotách než odpovídající enzymy z mesofilních zdrojů. Pro primární screening psychrotrofních mikroorganismů na produkci βgalaktosidasy byly použity jednak isoláty z Antarktidy ze sbírky Imperial College University of London a jednak mikroorganismy z České sbírky mikroorganismů v Brně. U těchto mikroorganismů byla sledována schopnost růstu při 15

o

C, produkce β-

galaktosidasy pomocí syntetického substrátu X-gal (5-brom-4-chlor-3-indolyl-β-Dgalaktopyranosid), teplotní optimum β-galaktosidasy v surovém enzymovém preparátu a jeho schopnost katalysovat přenos galaktosové jednotky na jiný akceptor než vodu. Z testovaných mikroorganismů byly vybrány čtyři kmeny, které splňovaly požadavky kladené na vlastnosti produkovaného enzymu. Z nich byl na základě vyšší specifity β-galaktosidasy k laktose vybrán pro další studia kmen Arthrobacter sp. C2-2 pocházející z Antarktidy získaný z londýnské sbírky. Pomocí nativního barvení byly v tomto kmeni identifikovány dva izoenzymy. Následně byla připravena genomová knihovna v E. coli. Pomocí screeningu s využitím umělého substrátu X-gal byl nalezen gen kódující jeden z izoenzymů odpovědný za βgalaktosidasovou aktivitu. Byla provedena exprese tohoto genu v E.coli. Bylo zjištěno, že tento gen kóduje izoenzym, jehož molekulovou hmotnost podjednotky odpovídá 120 kDa, teplotní optimum 25 oC, při 10 oC si zachovává 42 % aktivity vzhledem k aktivitě při teplotnímu optimu a preferuje substrát laktosu před umělým substrátem o-nitrophenyl-βD-galaktopyranosidem.

Tento gen byl sekvenován.

INFRAČERVENÁ SPEKTROSKOPIE EPIMINODERIVÁTŮ 1,6-ANHYDRO-β-D-HEXOPYRANOS Jindřich KARBANa, Stanislav HILGARDb a

Ústav chemických procesů AVČR, Rozvojová 135, Praha; [email protected]

b

Katedra organické chemie PřF UK, Hlavova 2030, 128 40 Praha 2; [email protected]

Byla

připravena1

serie

1,6-anhydro-4-O-benzyl-2,3-dideoxy-2,3-epimino-β-D-

hexopyranos (1) a 1,6-anhydro-2-O-benzyl-3,4-dideoxy-3,4-epimino-β-D-hexopyranos (2), zahrnující všechny možné konfigurace. Infračervená spektroskopie zředěných roztoků těchto aziridinových derivátů v oblasti valenčních vibrací iminoskupiny umožnila na základě parametrů pásů a znalosti konfigurace měřených látek rozlišit různé způsoby intramolekulární asociace iminoskupiny. Pásy v oblasti vibrace ν(NH) byly přiřazeny vodíkovým vazbám na kyslík O1 pyranosového cyklu, na kyslík O2 dioxolanového cyklu a na kyslík O3 benzyloxyskupiny. Přiřazení pásů je konzistentní s konfiguracemi jednotlivých aziridinoderivátů zjištěnými rentgenovou difrakcí a nepřímo tak potvrzuje jejich strukturu.

O2 O3Bn

O2

O1 H N

1

O1 NH O3Bn

2

1. Karban J.: Disertační práce. Univerzita Karlova, Praha 1998.

VEDLEJŠÍ PRODUKTY PŘI REAKCI 1,2-O-ISOPROPYLIDEN-α-D-RIBOFURANOSY S TRIFENYLFOSFINEM A DIETHYLAZODIKARBOXYLÁTEM Jitka Moravcová1, Petr Kočalka1, Hana Dvořáková2, Vladislav Kubelka2 1

Ústav chemie přírodních látek, 2Centrální laboratoře, Vysoká škola chemicko-technologická, Technická 5, 166 28 Praha 6; e-mail: [email protected]

K aktivaci cukerné hydroxylové skupiny se při nukleofilní substitucích velmi často využívá in situ tvorba transitního oxyfosfoniového kationtu, který ochotně odštěpuje trifenylfosfinoxid (TPO). Při Mitsunobuově reakci1 je tento kation generován pomocí trifenylfosfinu (TPP) a dialkylazodikarboxylátu (DEAD). Substituce je stereoselektivní, regioselektivní a probíhá rychle za mírných experimentálních podmínek, ale bohužel odstraňování vedlejších produktů, zejména TPO, je náročné. Díky komplexnímu mechanismu může být složení produktů ovlivněno i pořadím dávkování jednotlivých reakčních komponent. Nedávno jsme publikovali2, že 1,2-O-isopropyliden-α-D-ribofuranosa poskytne reakcí s TPP a DEAD pyrazolidin 1 a cílem této práce bylo objasnit strukturu dalších vedlejších

produktů

indikovaných

TLC.

Surová

reakční směs byla nejprve v alkalickém prostředí zbavena většiny TPO a hydrazinodikarboxylátu, dále

O EtOOC

O

N N

O 1

byla acetylována a analysována pomocí GLC,

COOEt

GC/MS a LC/MS technikami. Jako hlavní příměs byl

H N COCH3

identifikován hydrazinodikarboxylát 2 a jeho struktura byla

ověřena

pomocí

měření

NOE

H3COC

N

kontaktů.

O

Identifikace neseparovatelných minoritních složek se opírá pouze o hmotnostní spektra.

CH3COO

2

O O

1. Mitsunobu O.: Synthesis, 1 (1981). 2. Moravcová J., Rollin P., Lorin C., Gardon V., Čapková J., Mazáč J.: J. Carbohydr. Chem., 16, 113 - 127 (1997).

Tato práce byla finančně podporována MŠMT v rámci výzkumného záměru č. 22330006.

ŠTRUKTÚRA A BIOLOGICKÁ AKTIVITA OLIGOSACHARIDOV V PREDLŽOVACOM RASTE RASTLINNÝCH BUNIEK Katarína Kráľová a Peter Capek Chemický ústav, Slovenská akadémia vied, Dúbravská cesta 9, 842 38 Bratislava, e-mail: [email protected] Inhibičný účinok galaktoglukomanánových oligosacharidov (GGMO) a ich bočných reťazcov na predlžovací rast segmentov hrachu indukovaný auxínom je známy z predošlých prác (Auxtová et al. 1995, Lišková et al. 1999). Z porovnania pôsobenia galaktomanánových oligosacharidov (GaMO) s GGMO vyplynula ich rozdielna účinnosť prejavujúca sa hlavne v kinetike inhibície rastového procesu. Aj v prípade GaMO, podobne ako u GGMO, sa zistila supraoptimálna (najúčinejšia) koncentrácia uvedených oligosacharidov, ktorá však bola podstatne vyššia (10-7M) ako najúčinnejšia koncentrácia GGMO (10-10M). Stupeň inhibície rastu indukovaný oligosacharínmi je závislý od rastlinného druhu (Auxtová et al. 1995). Porovnateľné rozdiely boli viditeľné však aj medzi kultivarmi toho istého rastlinného druhu. Riešenie úlohy č. 2/1049/21 je podporované Slovenskou grantovou agentúrou VEGA Auxtová O., Lišková, D., Kákoniová, D., Kubačková, M., Karácsonyi, Š., Bilisics, L. (1995), Planta 196:420-424. Lišková, D., Kákoniová, D., Kubačková, M., Sadloňová, K., Capek, P., Bilisics, L., Vojtaššák, J., Slováková, Ľ. (1999), Advances in Regulation of Plant Growth and Development p. 119-130, (eds. M. Strnad, P. Péč, E. Beck), Peres Publishers.

PREPARATION OF THIOUREA-BRIDGED GLYCODENDRIMERS WITH BIOLOGICAL ACTIVITY Krist P.,1, Sadalpure K.,2, Patel A.,2 Bezouška K.1, Křen V.,1 Lindhorst K.T.2 1

Microbiological Institute of the Academy of Sciences of the Czech Republic, Vídeňská 1083,

CZ–142 20 Prague 4, Czech Republic 2

Institute of Organic Chemistry, Christina Albertina University, Otto-Hahn-Platz, D-24098 Kiel,

Germany Specific

interactions

between

carbohydrate

structures

and

proteins

are

of fundamental importance for cell-cell adhesion. Suitable glycomimetics those are able to compete or even perform better than the naturally occurring carbohydrate ligands are needed for the elucidation and manipulation of carbohydrate-protein interaction. For this purpose the clustering of glycosides proved to be advantageous in many cases. GlcNAc - dendrimers already proved to be effective for in vivo treatment of cancer by stimulation of natural immunity (via NK-cells). However, for study of mechanism and

organ

distribution

labeled

dendrimers

were

required.

Therefore,

we have prepared PAMAM - based GlcNAc - dendrimers with a free NH2 group for coupling to a fluorescent label (e.g., via fluorescent isothiocyanate). Man - dendrimers

were

prepared

for

analogous

tracing

studies

anti-adhesion system.

OH R1O

HO HO

OH R2 R1O

HO HO

R2 OH R1O

HO HO

R OH 2 R1O

HO HO

R2

S O

NH

NH

NH

O

NH NH

S NH

Fluorescent label

N NH O

NH2 N O

NH

NH S

NH

NH S

NH

NH NH

N O

O

Man GlcNAc

C1 R1 R2 α OH H β H NHAc

of

the

PŘÍPRAVA, PROSTOROVÉ USPOŘÁDÁNÍ A STEREOCHEMIE NUKLEOFILNÍHO ŠTĚPENÍ EPOXIDŮ A EPISULFIDŮ METHYLERYTHROFURANOSIDŮ Tereza Labíková, Ivan Raich Ústav chemie přírodních látek, Vysoká škola chemicko-technologická v Praze 166 28 Praha 6, Česká republika ([email protected], [email protected]) Byla studována syntéza, detailní prostorové uspořádání a chemické vlastnosti sloučenin obecného vzorce I. Methyl-2,3-anhydro-α- a -β-L-erythrofuranosid (I, X=O) byly připraveny jako výchozí látky pro syntézu methyl-2,3-dideoxy-2,3-epithio-α- a -β-D-erythrofuranosidu (I, X=S) v několika krocích vycházejících z 1,2-O-isopropyliden-β-D-threofuranosy. Tyto epoxidy byly dále podrobeny nukleofilnímu štěpení oxiranového kruhu pomocí thiobenzoanu draselného a jiných nukleofilů. Episulfidy byly připraveny reakcí příslušných vicinálních S-acyltosylátů s methanolátem sodným. Během

nukleofilního

štěpení

epoxidů

byla

sledována

závislost

poměru

2-

a 3-substituovaných produktů na reakčních podmínkách (rozpouštědlo, typ nukleofilu, molární přebytek apod.). Bylo zjištěno, že v případě α-L-epoxidu vznikají oba produkty, zatímco β-Lepoxid poskytuje pouze 3-substituovaný produkt. Všechny připravené sloučeniny byly charakterizovány pomocí NMR a IČ spektroskopie. Přesné prostorové uspořádání derivátů s tříčlennými kruhy bylo studováno pomocí abinitio molekulárně orbitalových výpočtů na úrovni HF/6-31G(d,p) a získané výsledky byly porovnány s experimentálními daty.

O

OMe

X X = O, S (I)

Práce

je

součástí

řešení

výzkumného

záměru

MŠMT

č.

223300006.

IMMUNOTHERAPY

OF

EXPERIMENTAL

TUMORS

BY

MULTIVALENT

NEOGLYCOCONJUGATES. Vannucci L.2, Pospíšil M.1, Fišerová A.1, Kuldová M.1, Krausová K.1, Bezouška K.1, Křen V.1, K. Sadalapure3 Mosca F.2 and Lindhorst T.K.3. 1

Institute of Microbiology, Czech Academy of Sciences, Prague, Czech Republic; 2Dpt.

Oncology, University of Pisa, Pisa, Italy; 3Institute of Organic Chemistry, Christiana-Albertina University, Kiel, Germany

Objectives: to recruit the immune system response(s) against malignant lesions by synthetic multivalent ligands of the lymphocyte C-type lectin receptors. Methods: multivalent poly(amidoamine) dendrimers, functionalised either with GlcNAc or mannose were used as a treatment of AOM-bile induced rat colorectal carcinogenesis model and B16 melanoma in the mouse. Immune cell subpopulations (FACS analysis) and cytotoxicity (51Cr-release assay), were followed. Results: synthetic glycodendrimers tested in vitro showed high affinity for NKR-P1 and CD 69 receptors (binding studies) and enhanced cytotoxicity. In vivo treatments reduced the bowel tumor incidence, involving NKR-P1 positive cells, and prolonged the survival in melanoma bearing mice. Conclusions: experimental data are in good agreement with molecular modelling, leading to receptor-ligand interactions, and suggest the importance of immune responses to nonpeptidic substances, such as carbohydrates.

This work was supported by grants 312/98/KO34 of GACR, A 7020006 of the GAAS, CZ, VW Stiftung I/74679 Germany, and ARPA Foundation, Pisa, Italy.

NOVÁ FLUORAČNÍ ČINIDLA: FLUORACE METHANSULFONYLESTERŮ α-D-PENTOFURANOS JITKA MORAVCOVÁ, ALENA NEDVĚDOVÁ, LUKÁŠ DRAŠAR Ústav chemie přírodních látek, Vysoká škola chemicko-technologická, Technická 5, 166 28 Praha 6; e-mail: [email protected]

Deoxyfluorsacharidy jsou perspektivní chirální synthony pro přípravu biologicky aktivních analogů

nukleosidů

a

dalších

sloučenin.

Jako

příklad

mohou

sloužit

deriváty

deoxyfluoradenosinu, které jsou silnými inhibitory S-adenosylhomocysteinhydrolasy, enzymu, který řídí transmethylační reakce na buněčné úrovni. Obvyklým způsobem zavedení atomu chloru do molekuly sacharidu je SN2 nukleofilní substituce, při které musí být špatně odstupující hydroxylová skupina sacharidu aktivována např. převedením na ester s methansulfonylovou kyselinou (MsOH). Fluoračních činidel je celá řada, od levných (tetrabutylamonium-fluorid) až po drahé (DAST), reakce je většinou velmi citlivá na přítomnost vody a prakticky vždy je doprovázena konkurenční E2 eliminací. Cílem této práce bylo ověřit účinnost a selektivitu nového fluoračního činidla, tetrabutylamonium-fenyldifluordimethylsilikonátu, vyvinutého na Katedře organické chemie VŠCHT Praha. Jako první modelové látky byly zvoleny 3,5-di-O-Ms a 5-O-Ms estery 1,2-O-isopropylidenα-D-xylo a ribofuranosy (1 – 4).

2

O

při bodu varu rozpouštědla za O

O R

Reakce byla prováděna v acetonitrilu

FCH2 O 1 R

MsOCH2 O 1 R

2

R

vyloučení vzdušné vlhkosti a molární poměr sacharidu k činidlu byl 1 : 1.

O

Produkty byly isolovány sloupcovou R1

R2

1, = OMs, =H 2, R1 = H, R2 = OMs 3, R1 = OH, R2 = H 4, R1 = H, R2 = OH

R1

R2

5, = OMs, =H 6, R1 = H, R2 = OMs 7, R1 = OH, R2 = H 8, R1 = H, R2 = OH

chromatografií

a

identifikovány

obvyklým způsobem. Pro diestery 1 a 2 probíhala substituce selektivně

v poloze 5 a výtěžky deoxyfluomesylátů 5 a 6 se pohybovaly mezi 50 a 60 %. Substituent v poloze 3 neměl na rychlost reakce ani na výtěžek žádný vliv. Bohužel v reakční směsi i po dlouhé době zůstávala nezreagovaná výchozí látka, proto se v další práci zaměříme na optimalizaci experimentálních podmínek. Tato práce byla finančně podporována GA ČR v rámci grantu 203/00/1232.

NOVÁ EFEKTIVNÍ SYNTHESA NORMURAMYLOVÝCH ANALOGŮ MURAMYLOVÝCH GLYKOPEPTIDŮ Zyka Daniel, Pavelová Radka, Ledvina Miroslav, Ježek Jan, Šaman David Ústav organické chemie a biochemie, AV ČR, Flemingovo nám. 2, 16610 Praha 6, e-mail: [email protected] Normuramylové glykopeptidy, tj. analoga muramylových glykopeptidů, v jejichž molekule je kyselina muramová nahrazena kyselinou normuramovou, vykazují ve srovnání s muramylovými glykopeptidy příznivější imunofarmakologické parametry a představují proto zajímavou skupinu potencionálních imunofarmak. N-Acetylnormuramoyl-L-2-aminobutanoyl-Disoglutamin (norAbu-MDP), analog „muramyldipeptidu“ (MDP, N-acetylmuramoyl-L-alanyl-Disoglutaminu), je méně pyrogenní a má vyšší imunoadjuvantní aktivitu. Stejná strukturní změna v molekule „glukosaminylmuramyldipeptidu“ (GMDP, 2-acetamido-2-deoxy-β-Dglukopyranosyl-(1→4)-N-acetylnormuramoyl-L-alanyl-D-isoglutaminu) poskytne nepyrogenní a vysoce imunoadjuvantní 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glukopyranosyl-(1→4)-Nacetylnormuramoyl-L-2-aminobutanoyl-D-isoglutamin (norAbu-GMDP). Zavedením objemných lipofilních zbytků do molekul norAbu-MDP a norAbu-GMDP lze následně profilovat jejich imunomodulační aktivitu při zachování příznivých imunofarmakologických parametrů matečných struktur. Pro přehled viz. lit.1-6. V tomto příspěvku bude presentován nový efektivní přístup k synthese této skupiny látek. Byl vypracován postup pro selektivní oxidativní štěpení C=C vazby allylové chránící skupiny na glykoloyletherový zbytek v přítomnosti benzylových chránících skupin, založený na působení in situ generovaného RuO4. To umožňuje v oligosacharidovém řetězci transformovat v jednom stupni v poloze C-3 allylovou skupinou chráněnou glukosaminovou jednotku na normuramylovou jednotku. Standardní postup vyžaduje odstranění allylové skupiny a následné zavedení glykoloyletherového zbytku. Současně jsme zjistili, že vedle zmíněné oxidace benzylové skupiny na skupinu benzoylovou může být konkurenčním procesem též intramolekulární kondenzace intermediálního aldehydu se sousední acetamidovou skupinou za vzniku cyklického produktu. Použitím 2,2,2-trichlorethoxykarbonylové skupiny k přechodnému chránění NH2 skupiny glukosaminové podjednotky prekursoru disacharidové části molekuly norAbu-GMDP byl získán glykopeptidový synthon, který otevřel cestu k efektivní přípravě analogů norAbu-GMDP modifikovaných na NH2 skupině glukosaminové podjednotky lipofilními zbytky. Tyto látky jsou v současnosti studovány jako potencionální imunotherapeutika. Práce byla podporována grantem GAČR r.č. 203/00/0071 a grantem Ministerstva průmyslu a obchodu r.č. PZ-Z2/25/98.

1. 2. 3. 4. 5.

Baschang G.: Tetrahedron 1989, 45, 6331. Farkaš J., Ledvina M., Brokeš J., Ježek J., Zajíček J., Zaoral M.: Carbohydr. Res. 1987, 163, 63. Ledvina M., Šaman D., Ježek J.: Collect. Czech. Chem. Commun. 1992, 57, 579. Ledvina M. Ježek J. Šaman D., Hříbalová V.: Collect. Czech. Chem. Commun. 1998, 63, 590. Ledvina M., Zyka D., Ježek J., Trnka T., Šaman D.: Collect. Czech. Chem. Commun. 1998, 63, 577. 6. Turánek J., Záluská D., Hofer M., Vacek A., Ledvina M., Ježek J.: Int. J. Immunopharm. 1998,19, 611.

Výzkum strukturních a vazebných vlastností sacharid vázající domény lymfocytárního antigenu CD69 Jiří Pavlíček1, Bruno Sopko1, Ondřej Plíhal1, Barbara Staňková1, Petr Novák1,2 a Karel Bezouška1,2 1

Katedra biochemie PřFUK, Hlavova 8, 12840 Praha 2, 2Laboratoř přirozené buněčné imunity, MBÚ AV ČR, Vídeňská 1083, 14220 Praha 4, e-mail: [email protected]. CD69 je důležitý časný aktivační antigen lymfocytů (1). Jedná se o transmembránový protein II. typu exprimovaný na povrchu leukocytů ve formě homodimeru. Každá podjednotka tohoto receptoru obsahuje na C-terminálním konci sacharid vázající doménu charakteristickou pro rodinu živočišných lektinů C-typu. V této studii byly charakterizovány vazebné vlastnosti této lektinové domény na proteinu připraveném pomocí nové technologie skládání proteinu přímo na chromatografické koloně. Byly nalezeny podmínky pro odštěpení histidinové kotvy od poskládaného proteinu pomocí endoproteinasy enterokinasy. Kvalita výsledného proteinu byla ověřena pomocí SDS elektroforesy v polyakrylamidovém gelu a hmotové spektrometrie MALDI. Gelová filtrace na sloupci Superdexu 75HR potrdila monomerické uspořádání isolovaného proteinu. U takto získaného proteinu byl stanoven obsah vápníku po dlouhodobé dialýze za různých podmínek metodou AAS. Bylo zjištěno, že protein váže vápník za neutrálního pH, avšak po okyselení dochází ke ztrátě vápníku. Přímé stanovení vazby N-acetyl-D-glukosaminu, který byl námi identifikován jako ligand (2), rovnovážnou dialýzou odhalilo téměř desetinásobné zvýšení vazebné afinity pro tento monosacharid u proteinu obsahujícího vápník oproti proteinu zbaveného vápníku dlouhodobou dialýzou v kyselém prostředí (obr.1). Byl sestrojen computerový model, který umožnil identifikovat aminokyseliny odpovědné za vazbu vápníku a sacharidů. V současné době probíhají experimenty s fluorescenční spektroskopií proteinů u nichž byl vápník nahrazen europiem nebo terbiem s cílem objasnit povahu vazebného místa pro vápník a sacharidy. Tyto studie budou dále doplněny přímým stanovením vazby vápníku a monosacharidů u mutantních proteinů obsahující aminokyseliny pozměněné na základě předpovědí molekulárního modelu. Podporováno výzkumným záměrem MSM113100001, granty GAČR 303/99/1382, 524/00/1275 a 203/01/1018, a nadací Volkswagen Stiftung. (1) Testi R, et al. (1994) Immunol. Today 15, 479-483. (2) Bezouška K, et al. (1995) BBRC 208, 68-74. 1,5

1,5

a) - Ca2+ w/o

GlcNAcbound / GlcNAcfree

2+

b) + Ca

1,0

1,0

0,5

0,5

0,0

2+

0,0 0

1

2

GlcNAcbound

3

0

1

2

3

GlcNAcbound

Obr.1. Scatchardův výnos pro vazbu 3H-GlcNAc na CD69 antigen v nepřítomnosti (a) a v přítomnosti vápníku (b).

OCCURRENCE OF N-ACETYLMANNOSAMINE AND ITS ROLE IN BIOLOGICAL RECOGNITION PHENOMENA A. Pišvejcová1, L. Hušáková 1, K. Bezouška2 and V. Křen1 1

Institute of Microbiology, Laboratory of Biotransformation, CZ-142 20 Prague 4, the Czech

Republic, 2Faculty of Science, Charles University Prague, CZ-128 40 Prague 2, Czech Republic, e-mail: [email protected] The amino sugars are ubiquitous and abundant in nature and are present in a range of both simple and complex biopolymers. Most glycoconjugates (glycoproteins and glycolypids) of mammalian cell surfaces contain amino sugars, including sialic acid residues, where the oligosaccharide chains of these conjugates are important ligands for cellular recognition. The sialic acids are a series of N- and O-substituted derivatives of N-acetylneuraminic acid (NANA), a compound which is formed by the condensation of N-acetylmannosamine (ManNAc) and pyruvate. N-acetylglucosamine (GlcNAc) and NANA are good carbon sources for E. coli K-12, whereas ManNAc is metabolised very slowly. The β-ManNAc unit is an integral part of a number of bacterial capsular polysaccharides and lipopolysaccharides. The capsular polysaccharides display type-specific immunogenic character.1 Apart from the capsular polysaccharides the most abundant source of the β-ManNAc unit is in naturally occurring lipopolysaccharides. In the cell walls of gram-positive bacteria, various types of teichoic acids have been reported to be attached to muramic acid 6-phosphate residues of peptidoglycan through special linkage units, which commonly consist of a linkage disaccharide, ManNAc-β(1→4)GlcNAc or Glc-β(1→4)GlcNAc, and glycerol phosphate-containing parts. Disaccharide GlcNAc-β(1→4)ManNAc was identified as one of the strongest oligosaccharidic ligands of NK-cell activating receptor NKR-P1.2 ACKNOWLEDGEMENT Grant Agency of the Czech Republic, grant no. 303/99/1382 is gratefully acknowledged. REFERENCES 1. J. J. Gridley, H. M. I. Osborn, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1 (2000) 1471-1491 2. P. Sedmera, V. Přikrylová, K. Bezouška, E. Rajnochová, J. Thiem, V. Křen, J. Carbohydrate Chemistry 17(9) (1998) 1351-1357

ISOLACE, CHARAKTERIZACE, A MOLEKULÁRNÍ KLONOVÁNÍ βHEXOSAMINIDASY Z ASPERGILLUS ORYZAE CCM1066, SEKRETOVANÉHO GLYKOPROTEINU S TYPICKÝMI RYSY RODINY GLYKOSYLHYDROLAS 20 Ondřej Plíhal1, Jan Sklenář1, Petr Matoušek1 Lenka Weignerová2, Zdena Huňková2, Vladimír Křen2 a Karel Bezouška1,3 1

Katedra biochemie PřFUK, Hlavova 8, 12840 Praha 2, 2Laboratoř biotransformací a 3Laboratoř přirozené buněčné imunity, MBÚ AV ČR, Vídeňská 1083, 14220 Praha 4. e-mail: [email protected]. Nižší eukaryotické organismy sekretují řadu hydrolytických enzymů do vnějšího prostředí (exocelulární trávení). Mezi těmito enzymy byla v Laboratoři biotransformací MBÚ AV ČR identifikována též β-hexosaminidasa, která se ukázala jako velmi užitečná při enzymových syntézách mnoha zajímavých oligosacharidových struktur. Tento enzym je možné isolovat do homogenního stavu ze síranového precipitátu extracelulárního média organismu Aspergillus oryzae CCM1066 kombinací hydrofobní a ionexové chromatografie. Jedná se o glykoprotein, jehož oligosacharidové komponenty je možné kvantitativně a velmi účinně odstranit za nedenaturutujících podmínek účinkem N-glakanasy. Strukturní studium sacharidových komponent odhalilo přítomnost vysoce mannosových struktur, jejichž odstranění vede k významnému zvýšení aktivity enzymu. S využitím peptidových sekvencí byly navrženy degenerované oligonukleotidové primery, a ty použity pro klonování metodou RT-PCR. Byl získán a sekvenován N-terminální fragment o délce 161 aminokyselin, o němž bylo prokázáno, že P.chrysog., 82% A.oryzae

A.nidulans, 87% C.albicans, 74%

definuje

hexosaminidas jeho

studium enzymu

C.elegans, 61% M.musculus, 62% D.melanogaster, 62%

V.cholerae, 52% S.coelicolor, 49%

S.marcescens, 47%

β-

(Obr).

Získání kompletního DNA klonu,

H.sapiens, 61%

rodinu

exprese

a

rekombinantního bude

předmětem

dalších studií. Podobnost

N-terminálního

fragmentu β-hexosaminidasy

A. oryzae s jinými členy rodiny 20 glykosylhydrolas. Znázorněno je % identických aminokyselin. Bakteriální enzym ze S. marcescens byl charakterizován strukturně (podtrženo). Podporováno výzkumným záměrem MŠMT 113100001, granty GAČR 303/99/1382 a 203/01/1018, a nadací Volkswagen Stiftung.

SYNTÉZA NOVÉ SKUPINY POTENCIÁLNÍCH OLIGOSACHARIDOVÝCH MIMETIK PŘIROZENÝCH LIGANDŮ AKTIVAČNÍHO RECEPTORU NK BUNĚK Rohlenová Anna1,2, Ledvina Miroslav2, Křen Vladimír3, Bezouška Karel3,4 1

Ústav organické chemie a biochemie, AV ČR, Flemingovo nám. 2, 16610 Praha 6, e-mail: [email protected]; 2Katedra organické chemie PřF UK, Hlavova 8,e-mail: [email protected]; 12840 Praha 2, 3Laboratoř biotransformací, Mikrobiologický ústav AV ČR, Vídeňská 1083, 14220 Praha 4, e-mail: [email protected]; [email protected]; 4Katedra biochemie PřF UK, Hlavova 8, 12840 Praha 2. Působení přirozených zabijáckých buněk je jedním z přírodních mechanismů, který dokáže rozpoznat a odstranit poškozené, nádorové nebo viry napadené buňky. Jejich aktivita je potencována, nebo naopak inhibována signály z vnějších receptorů, jako je např. lektinový aktivační receptor NKR-P1. Jeho přirozenými ligandy jsou komplikované oligosacharidové struktury vyskytující se na povrchu buněk (např. polysacharidy látek krevních skupin)i. Uplatnění těchto látek jako terapeutik brání jejich špatná dostupnost. Jako řešení tohoto problému se nabízí využití jejich mimetik, tj. jednodušších a synteticky dostupnějších sacharidových struktur, které by vykazovaly stejnou biologickou aktivitu. Je například známo, že afinitu k tomuto receptoru vykazují některé 2-acetamido-2-deoxy-D-hexopyranosyii, a že roste v řadě N-acetyl-Dglukosamin, N-acetyl-D-glataktosamin a N-acetyl-D-mannosamin. Dále je prokázáno, že aktivita stoupá s elongací sacharidového řetězce; v případě chitooligomerů, tj. lineárních oligosacharidů tvořených

2-acetamido-2-deoxy-D-glukopyranosovými

jednotkami

spojenými

β−(1→4)

glykosidickou vazbou roste do tří sacharidových jednotekiii. Předmětem tohoto sdělení bude syntéza analogu chitobiosy s β−(1→3) glykosidickou vazbou

(2-acetamido-2-deoxy-β−D-glukopyranosyl-(1→3)-2-acetamido-2-deoxy-D-

glukopyranosy) a větveného analogu chitotriosy s β−(1→4) a β−(1→3) glykosidickou vazbou (2acetamido-2-deoxy-β−D-glukopyranosyl-(1→4)-[2-acetamido-2-deoxy-β−D-glukopyranosyl(1→3)]-2-acetamido-2-deoxy-D-glukopyranosy). Cílem práce je ověřit

vliv charakteru

glykosidické vazby a větvení na vazebnou afinitu oligosacharidů tvořených 2-acetamido-2deoxy-D-glukopyranosovými jednotkami. i. Bezouška K. a spol.: Nature 1994, 372, 150. ii. Bezouška K. a spol.: The Journal of Biological Chemistry 1994, 269, 16945. iii. Bezouška K. a spol.: Biochem. Biophis. Res. Commun. 1997, 238, 149.

MAKROMOLEKULÁRNÍ CHEMOTERAPEUTIKA SMĚROVANÁ LEKTINY B. Říhová1, M.Jelínková1, J.Strohalm2, O.Hovorka1, M. Kovář1, M. Šťastný1, D.Plocová2, K.Ulbrich2 1 Mikrobiologický ústav AV ČR, Vídeňská 1083, 142 20 Praha 4 2 Ústav makromolekulární chemie AV ČR, Heyrovského nám.2, 162 06 Praha 6 Dosud získaná experimentální a klinická data jednoznačně prokazují, že budoucnost léčby nádorů je v používání vodorozpustných polymerních konjugátů protinádorových léčiv. Tato tzv. polymerní proléčiva jsou nejúčinnější pokud jsou směrována monoklonálními nebo polyklonálními protilátkami, růstovými hormony, transferinem, sacharidy nebo lektiny. Mezi jejich výhody patří a) zvýšená účinnost, b) zvýšená maximální tolerovaná dávka, c) snížená nespecifická toxicita vůči zdravým orgánům a tkáním, d) směrovatelnost, e) schopnost částečně překonat mnohočetnou lékovou rezistenci (multidrug resistance; MDR), f) zvýšená rozpustnost, g) zvýšená akumulace v nádorech, h) zvýšená indukce apoptózy, ch) ochrana imunitního systému. Nevýhodou je složitější příprava. V případě vodorozpustných makromolekulárních terapeutik na bázi N-(2hydroxypropyl)metakrylamidu (HPMA) jsou cytostatika navázána na polymerní nosič pomocí oligopeptidické spojky, většinou GlyPheLeuGly. Ta zaručuje, že konjugát je stabilní a hlavně neúčinný během transportu v krevním řečišti a léčivo je z něj ve farmakologicky aktivní podobě uvolňováno až v cílové buňce aktivitou lysozomálních enzymů, jmenovitě katepsinů D, H a L. Předpokládá se, že výrazně lepší farmakologický účinek směrovaných polymerních léčiv je dán jejich změněnou biodistribucí, farmakokinetikou a intracelulární lokalizací. Cytostatický účinek HPMA konjugátů, které jako léčivo obsahovaly antracyklinové antibiotikum doxorubicin a jako směrující strukturu lektiny, a to buď PNA (peanut agglutinin, lektin z Arachis hypogea) nebo WGA (wheat germ agglutinin, lektin z Triticum vulgare) jsme porovnávali s cytostatickým účinkem konjugátů HPMA a doxorubicinu, které byly směrovány monoklonální protilátkou proti Thy 1.2 antigenu nebo galaktosaminem. Jako modelové linie jsme použili linie lidského kolorektálního karcinomu primárního (SW480, HT29), metastazujícího (SW620) a transfektanta, nesoucího myší gen pro Thy 1.2 jako xenogení znak (SW620/T). Cytostatický účinek, který byl testován inkorporací 3H-thymidinu do cílových buněk, závisel na intenzitě vazby směrujících molekul (lektinů, galaktosaminu, monoklonální protilátky) s komplementárními molekulami na nádorových liniích, na rychlosti receptorem-mediované endocytozy studovaných konjugátů a na citlivosti jednotlivých linií na doxorubicin. Konjugáty, obsahující jako směrující složku WGA, byly co do účinnosti srovnatelné s monoklonální protilátkou. Konjugáty, obsahující PNA, byly vůči lidskému kolorektálnímu karcinomu sice méně cytotoxické, ale specifičtější. Je to způsobeno tím, že maligní transformace je pouze u některých buněk z heterogenní populace nádoru doprovázena změnami v biosyntetických drahách, které se projeví změněnou expresí sacharidů na jejich buněčném povrchu. Účinné byly i konjugáty směrované monoklonální protilátkou proti myšímu Thy 1.2 antigenu, exprimovaném na povrchu lidské nádorové linie (transfektant SW 620/T). Je to první důkaz toho, že tento způsob léčby lze využít i pro zabití lidských nádorových linií, které jsou záměrně označeny vybraným xenogením znakem. Nejméně účinné byly konjugáty směrované galaktosaminem.

COMPUTATIONAL AND NMR STUDY OF MULTIPLE ANTIGENIC GLYCOPEPTIDES WITH TN ANTIGENS. Sejbal J.1, Vondrášek J.2, Velek J.2, Vepřek P.2, Trnka T.1, Ježek J.2 1 2

Dept. of Organic Chemistry, Charles University, Albertov 6, 128 40 Prague 2, Czech Republic Inst. of Org. Chem. and Biochem., Academy of Sciences, Flemingovo nám. 2, 166 10 Prague 6,

Multiple antigenic peptides (MAPs) and glycopeptides bearing dimeric Tn antigen (MAGs), i.e. Lys2-Lys-β-Ala-NH2, [Ac-Lys(Ac)]2-Lys-β-Ala-NH2, (Lys-γ-Abu)2-Lys-β-Ala-NH2, [Ac-Lys(Ac)-γ-Abu]2-Lys-β-Ala-NH2, (Ac-γ-Abu)4.-Lys2-Lys-β-Ala-NH2, [Ac-γ-Abu-Lys(Ac-γAbu)-γ-Abu]2-Lys-β-Ala-NH2 and [Ac-(Tn)2-γ-Abu]4-Lys2-Lys-β-Ala-NH2 (I), were prepared by SPPS using Fmoc chemistry. NMR and molecular dynamics simulation were selected to describe conformational properties and prevailing conformational states in vacuo, DMSO, micellar environment and water. Small differences in chemical shifts for signals in Lys and γ-Abu residues located in various positions, absence of medium distance contacts, high intensity of dαN(i,i+1) and lack of dNN(i,i+1) together with values for coupling constants are indicative for no proffered secondary structure in water solution for all compounds studied. Surprisingly, all the spectra of target glycopeptide I in the solution containing SDS micelles were nearly the same as it was for water solution. This led to the conclusion, that there is no interaction of glycopeptide I with SDS micelles. Contacts dαN(2,4), dNN(2,3) and dNN(3,4) found for I in deuterated dimethylsulfoxide in the part of sequence AcTn-Tn-γ-Abu- are indicative of N-terminal type I β turn. We carried out MD simulations in the absence as well as in the presence of solvent (vacuo model) in order to assess the role of water or solvent. We show that conformations of the studied dendrimer are flexible in water and DMSO and that there is no predominated conformational state exposing the terminal in vaccuo

in DMSO solvate

dimeric Tn antigen in ordered manner. This result is in contrast to MD simulation in vacuo conditions where all dendrimers show tightly packed core with numerous hydrogen bonds. Conclusions: -

tightly packed core in vacuo (MD) extended structure with N-terminal β turns in DMSO (NMR) extended structure in water solution (MD, NMR) no interaction with SDS micelles (NMR).

This work was supported by grants No. VS 96140 and LB 98233 (Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech Republic).

Studium syntézy (1→3) C-disacharidů. Ladislav Kniežo*, Petr Štěpánek, Ondřej Šimák Ústav chemie přírodních látek, Vysoká škola chemicko-technologická, Technická 5, 166 28 Praha 6, e-mail: [email protected]

Pro syntézu (1→3) C-disacharidů jsme využili předchozích zkušeností, podle kterých je možno deriváty hexopyranos připravit pomocí cykloadiční reakce substituovaných

1-

1,2

oxabutadienů s enolethery . Výchozí aldehyd 1 jsme připravili ozonolýzou známého propenového derivátu 23. Jeho reakcí s ylidem 3 byl připraven substituovaný 1-oxabutadien 4, který cykloadiční reakcí s ethylvinyletherem poskytl s vysokou endo selektivitou směs jenom dvou cis cykloaduktů 5 a 6, jenž byly chromatograficky separovány. V dalších dvou reakčních krocích plánujeme známým postupem1,2 z látky 5 stereoselektivně připravit C-disacharid 7, ve kterém má nová hexopyranosa konfiguraci D, a z látky 6 analogický derivát 8, v němž je nová hexopyranosa v konfiguraci L. O Bn BnO

O Bn

Me 3 Si

O

BnO

BnO

O Bn

N S

O Bn O

BnO

O3

BnO

O Bn

O Me

O

BnO

O Bn

2

1

CHO

O O Bn

3

PPh 3

O

BnO BnO

S N

O Bn

4

O O Et

O Bn O

BnO BnO

O

BnO S

O Bn

5

O Bn BnO

N +

O

O O Et

O Bn O O Bn H O

7

N

6

O Et

BnO BnO

S

O Bn

O Bn

HO O O Et

BnO BnO

O O Bn

8

HO

OH O OEt

Práce byla provedena v rámci řešení výzkumného záměru MŠMT č. 223300006

Literatura : 1. Dondoni A., Kniežo L., Martinková M, Imrich .: Chem Eur.J. 1997, 3, 424 2. Kniežo L., Buděšínský M., Vojtíšek P., Martinková M.: Enantiomer 1999, 4, 351 3. Hosomi A., Sakata Y., Sakurai H.: Carbohydr. Res. 1987, 171, 223

α-GALACTOSIDASES – THEIR NATURAL AND NON-NATURAL SUBSTRATES AND THEIR USE FOR TRANSGLYCOSYLATION REACTIONS P. Simerská1, L. Hušáková1, Z. Huňková1, M. Kuzma1, S. Nicotra2, S. Riva2, V. Křen1 1

Institute of Microbiology, Laboratory of Biotransformation, CZ-142 20 Prague 4, Czech Republic 2 CNR, Ist. Di Biocatalisi e Riconoscimento Molecolare, Via Mario Bianco, 9, 20133 Milano, Italy Chemical synthesis of oligosaccharides is often accompanied by a number of protection/deprotection steps. The enzymatic approach is an attractive alternative. Glycosidases are more versatile than transferases in respect to the acceptor structure. Thirteen extracellular α-D-galactosidases of fungal origin were screened for their activity upon modified α-galactoside substrates. Modified substrate 2 was prepared by enzymatic acylation of pNP-α-D-galactopyranoside (1) using lipase from Candida antartica. Acylation at 6-position completely prevents enzymatic hydrolysis of the glycoside 2. Compound 2 can however serve as acceptor for further glycosylation using α-galactosidases from Talaromyces flavus (CCF 2686) and Penicillium chrysogenum (CCF 1269). HO

HO

py/acetone vinyl acetate

O

HO

lipase from Candida antartica 30 oC

OH O

OAc O

HO

HO

OH O

1

2 NO2

NO2 HO

HO O

HO

HO

HO

HO O +

HO

OH O

HO

OAc O

OH

O

α-Galactosidase from Talaromyces flavus

OH O +

pH=5.0, 37 oC

OH O

NO2 OAc O

HO

1

OAc O

HO

2 NO2

NO2

HO HO

HO

O HO

O

O OH

NO2

SACHARIDOVÉ, PROTEINOVÉ A PEPTIDOVÉ MYKOBAKTERIÁLNÍ LIGANDY LIDSKÝCH LEKTINOVÝCH RECEPTORŮ CD69 A HNKR-P1. Jan Sklenář1, Jiří Pavlíček1, Ondrej Horváth2, Anna Fišerová2, Miloslav Pospíšil2, Giovana Batoni3, Mario Campa3, Karel Bezouška1 1

Katedra biochemie PřFUK, Hlavova 8, 12840 Praha 2, 2Laboratoř přirozené buněčné imunity, MBÚ AV ČR, Vídeňská 1083, 14220 Praha 4, 3Dipartimento di Patologia Sperimentale, Universita degli Studi di Pisa, Via S. Zeno 39, Pisa, Italy. e-mail: [email protected]. Výzkum ligandů pro receptory lidských zabíječských lymfocytů, CD69 a hNKR-P1, je velkým předmětem zájmu imunologie, strukturní biologie a glykobiologie. Ačkoliv se z určitých předběžných studií zdá, že by ligandy pro receptory zabíječských buněk mohly být povahy sacharidů, proteinů i peptidů, v případě molekul CD69 a hNKR-P1 zatím přesné údaje o jejich fyziologických ligandech chybí. V rámci řešení evropského projektu 4. rámcového programu byly studovány inhibiční aktivity frakcí získaných na spolupracujícím pracovišti v Pise z Mycobacterium bovis. Frakce tohoto mikroorganismu byly separovány frakční centrifugací, gelovou filtrací, a extrakčními technikami. Gelová filtrace na Superdexu 30 ukázala, že inhibující látky jsou přítomny zejména v makromolekulární frakci >10 kDa. Tato frakce byla přečištěna mnohonásobnou extrakcí, a vazba rekombinantních receptorů CD69 a hNKR-P1 poté sledována pomocí přímých vazebných a inhibičních testů. Bylo zjištěno, že CD69 se váže zejména na chaperonové proteiny hsp65 (Obr.1), hsp16.3 a hsp70. Byl identifikován společný peptidový motiv (LELTE) u těchto proteinů, příslušný syntetický peptid se ukázal jako velmi aktivní v inhibičních testech. Protein hNKR-P1 se vázal na mykobakteriální superoxid dismutasu. Oba rekombinantní proteiny dále interagovaly s mykobakteriálním arabinogalaktanem. Molekulární model interakce peptidu LELTE s antigenem CD69 umožnil objasnit interferenci této vazby s vazbou sacharidů: peptid se vázal jednak poblíž vazebného místa pro sacharid, jednak v dimerizační doméně. Obr.1. Interakce rekombinantního proteinu CD69 s variantami proteinu hsp65 vyšetřovaná v přímém vazebném testu. Zony 1 až 4 jsou různé varianty proteinu hsp65, což bylo prokázáno proteinovou sekvenací přímo z PVDF blotu (levý panel). Vazba proteinu CD69 byla ovšem prokázána pouze u zon 1 až 3, které všechny obsahovaly sekvenci LELTE (pravý panel).

DETERMINATION OF GLYCOCLUSTERS IN THE COMPLEX MATRIXES BY HPAEC-PAD Jan Sklenář1,2, Ondřej Plíhal1,2, Luca Vannucci3,Thisbe K. Lindhorst4 and Karel Bezouška1,2, 1

Katedra biochemie PřFUK, Hlavova 8, 12840 Praha 2; 2Laboratoř přirozené buněčné imunity, Vídeňská 1083, 14220 Praha 4; 3Division of General Surgery, Department of Oncology, University of Pisa, Via Paradisa 2, 56124 Pisa, Itálie; 4Institute of Organic Chemistry, Christiana Albertina University of Kiel, Otto-Hahn-Platz 4, D-24098 Kiel, SRN The saccharides play important role in the cell recognition and signalization. The

managing of saccharide - protein interactions may influence such events as the response of the immune system and subsequently the development of a disease. One approach is the mimicking of the native ligands with endogenously added ones to stimulate ‘the saccharide sensitive cells’– e.g. natural killer cells and start its cytotoxic activity hereafter. The ligands used in our experiments are synthetic thiourea-bridged glycoclusters with eight peripheral N-acetyl-D-glucosamines (See NH

picture). They are now being tested as anti cancer

drugs

in

treatment

of

HN O

HN

colorectal

carcinoma of rats. Because the treatment

HN NH

S

S N H

H N

N H

O

O

NH

O

N H

O

N O H N

O

H N

NH

N H

S

protocol for their determination. Considering the resolution and sensitivity needed we decided to

N H

N

of glycocluster concentration in blood, urine and other organs we developed a non-radioactive

HN

O

demands the exact observation of the oscilation

S

H N

N

N

S

NH

N

HN S

NH NH

O

O O

HN N

O

H N

H N

N H

S

NH HN

S HN

separate glycoclusters by high performance anion exchange chromatography with pulsed amperometry detection (HPAEC-PAD). The cleanup of the samples was accomplished by reverse phase chromatography. The detection limit of our PAD detector was around 10pmoles of the GlcNAc8-cluster. In comparison with the most usual standard oligosaccharides the GlcNAc8-cluster was eluted even after the four times charged tetrasialotetraantennary complex oligosaccharide and between maltooligosaccharides of DP 9 and 10 in the gradient of 0-0.4M sodium acetate in 0.1M sodium hydroxide. The late retention of the glycocluster promises to avoid the most interfering substances from the complex matrixes such as the blood plasma. Podporováno výzkumným záměrem MŠMT 113100001, granty GAČR 312/98/K034, 303/99/1382 a 203/01/1018, grantem AAV A702006, a nadací Volkswagen Stiftung (projekt I-74679)

MOLEKULÁRNÍ MODEL SACHARIDOVÉ VAZEBNÉ DOMÉNY PROTEINU NKR-P1 Bruno Sopko1, Jiří Pavlíček1, Jan Sklenář1,2 a Karel Bezouška1,2 1

Katedra biochemie PřFUK, Hlavova 8, 12840 Praha 2, 2Laboratoř přirozené buněčné imunity,

MBÚ AV ČR, Vídeňská 1083, 14220 Praha 4, e-mail: [email protected]. NKR-P1 antigen leukocytů představuje rodinu receptorů důležitých pro aktivaci přirozených zabíječských buněk u hlodavců a lidí. Tento receptor je exprimován na membráně jako transmembránový protein II. typu, a vyskytuje se v přirozeném materiálu ve formě homodimeru. V naší laboratoři je studována rozpustná dimerní forma tohoto receptoru. Pro tento protein bylo v předchozích pokusech ukázáno, že se jedná o lektin s unikátní vlastností vázat jak vápník tak i sacharidy s vysokou afinitou. Bylo zjištěno, že zatímco GlcNAc je sám o sobě velmi dobrým inhibitorem vazby tohoto receptoru na neoglykoproteinové ligandy, aktivita ManNAc je ještě asi desetkrát vyšší. Nalezení takového vysokoafinitního ligandu mj. umožnilo též zahájit systematické studium sacharidy vázající proteinové domény receptoru NKR-P1. Bylo zjištěno, že minimální délka receptoru se zachovanou vazebnou aktivitou pro sacharid odpovídá dobře minimální neboli zkrácené doméně rodiny živočišných lektinů C-typu, a že pro dobrou vazebnou aktivitu musí být zachovány všechny čtyři cysteinové zbytky tvořící v molekule dva disulfidové můstky. Vazebná data s lineárními a větvenými sacharidovými ligandy ukazují na možnou existenci “protaženého” vazebného místa pro sacharid v molekule NKR-P1. Na základě těchto experimentálních dat byl sestrojen molekulární model lektinové domény receptoru NKR-P1. Vápník je hluboce zanořen ve struktuře proteinové domény, jeho kalkulovaná vazebná energie je velmi vysoká (asi 360 kJ/mol), a vazba na protein zahrnuje kromě tradičních koordinací kyselých aminokyselin a jejich amidů též unikátní interakci se serinem. Vazba vápníku má vliv na celkovou konformaci lektinové domény, a je na něm závislé správné utvoření druhého helixu charakteristické pro tuto lektinovou rodinu. Přesné místo vazby jednotlivých monosacharidových ligandů je předmětem současných studií na sérii mutantů inaktivující jednotlivé úseky tetrasacharidové vazebné rýhy. Podporováno výzkumným záměrem MŠMT 113100001, granty GAČR 303/99/1382, 524/00/1275 a 203/01/1018, a nadací Volkswagen Stiftung.

β-Galaktosidasa antarktické bakterie Arthrobacter sp. C2-2: předběžné studium pomocí modelování založeného na homologii Vojtěch Spiwok, Hynek Strnad, Petra Karasová, Šárka Malá, Blanka Králová Ústav biochemie a mikrobiologie, Vysoká škola chemicko-technologická v Praze, Technická 3, Praha 6, 166 28 Tel.: 02/24 35 30 28 Fax.: 02/24 35 51 67 [email protected] Enzymy z psychrofilních a psychrotrofních mikroorganismů aktivní při nízkých teplotách představují perspektivní katalysátory pro moderní biotechnologie. βGalaktosidasy organismů adaptovaných na život při nízkých teplotách je možné aplikovat například v potravinářském průmyslu při výrobě bezlaktosového mléka a pro přípravu galaktooligosacharidů. Bakterie Arthrobacter sp. C2-2 isolovaná v Antarktické oblasti byla vybrána jako vhodný zdroj β-galaktosidasy vzhledem k teplotním charakteristikám tohoto enzymu a vzhledem ke schopnosti katalysovat transglykosylační reakce. Probíhající sekvenování genu kódujícího tento enzym ukazuje vysoký stupeň jeho homologie s jedním z popsaných isoenzymů β-galaktosidasy bakterie Arthrobacter psychrolactophilus. Na základě srovnání předpovězené aminokyselinové sekvence s

dalšími β-galaktosidasami je možné oba enzymy zařadit do rodiny 2 klasifikace glykosidas. Pro oba enzymy byl vytvořen strukturní model okolí aktivního místa na základě jejich homologie s enzymy rodiny 2 se známou prostorovou strukturou (βgalaktosidasa z E.coli a lidská β-glukuronidasa). Model umožňuje lokalizovat jejich vzájemně odlišné úseky v rámci katalytické domény. Srovnání enzymů na úrovni prostorových struktur je nezbytné pro studium podstaty jejich adaptace pro funkci při nízkých teplotách.

INTERACTION OF ANIONIC POLYSACCHARIDES WITH OLIGOPYRROLE MACROCYCLES Alla Synytsyaa, Vladimír Král, Andriy Synytsya, Jana Čopíková and Karel Volka Institute of Chemical Technology, Technická 5, 166 28 Prague Tel.: (02) 24354106; E-mail: [email protected] Sapphyrins, pentapyrrolic expanded porphyrins, have been testing as agents for photodynamic cancer therapy. An interaction of sapphyrins with biopolymers seems to be important for their antitumour activity. In this work the interactions of three novel sapphyrins, which are substituted by cationic (1, 2) and neutral (3) substituents, with ι-, κ-, λ- carrageenans and heparin were studied by UV-VIS spectroscopic titration. At quite low concentrations of studied sapphyrins in aqueous solutions (~10-10 mol l-1), a single absorption band at 452-456 nm was observed and assigned to the monomeric form. In the case of increased concentrations up to 5×10-6 mol l-1, the second absorption band at ~420 nm for 1 and 2 or at ~400 nm for 3 was observed and became very intense. The presence of this band indicates aggregated forms of sapphyrins. Titration of 1 and 2 with studied polysaccharides was followed by blue shift with significant hypochromism of Soret-like band. These spectral changes can be assigned to formation of highly ordered aggregated sapphyrins associated with the polysaccharide backbone. In contrast, the titration of 3 with λ-carrageenan leads to absorption maximum at 430 nm instead of that at 400 nm, whereas the spectral changes were negligible in the case of the other polysaccharides. The red shift, observed in the case of λ-carrageenan, can be assigned to partially deaggregated form of macrocycles, may be dimers. Such difference in results of UV-VIS spectroscopic titration for cationic 1, 2 and neutral 3 substituted sapphyrins confirms the importance of ionic interaction in stabilisation of non-covalent complexes between sapphyrins and anionic polysaccharides in aqueous solutions. Financial support from the Howard Hughes Medical Institute (grant No. 75195-541101 to V.K.), Czech Grant Agency (grants Nos. 301/98/K042 to V.K.), a grant of the Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech Republic (grant VS 97135 to V.K.), are gratefully acknowledged.

13

C CP/MAS NMR SPECTROSCOPY IN STRUCTURAL ANALYSIS OF PECTINS Andriy Synytsya1, Jana Čopíková1 and Jiři Brus2 1

2

Institute of Chemical Technology, Technická 5, 166 28 Prague 6,the Czech Republic

Institute of Macromolecular Chemistry, Czech Academy of Science, Heyrovsky sq. 2, 162 06 Prague 6 Tel.: (02) 24353113; E-mail: [email protected] 13

C CP/MAS NMR spectra of pectins presented in the previous work1 were

used in more detail investigation. The spectra of pectins were divided into six structural regions: 180-160 ppm (C-6), 160-110 ppm (aromatic), 110-90 ppm (C-1), 90-60 ppm (C-2-5), 60-40 ppm (OCH3) and 30-10 ppm (CH3). All this regions are informative for analysis of pectin structure. The C-6 region possesses information about the relationship between different carboxylic carbons in pectin. The aromatic region indicates the presence of such minor components as protein, anthocianides and feruloyls. The C-1 and C-2-5 regions are interesting in study of neutral sugars and pectin conformation. Peak-fitting analysis of C-1 region confirms 31 conformation of citrus pectin but some irregularity occurs and increases with increasing of DM. The last two regions (OCH3 and CH3) can be used mainly for estimation of methoxyl and acetyl content. The values of methylation (DM), amidation (DA) and acetylation (DAc) degrees were obtained by peak-fitting analysis of C-6, OCH3 and CH3 regions. [1] A. Sinitsya, J. Čopiková and H. Pavliková, J. Carbohydr. Chem., 17/ 2 (1998), 279 - 292.

SYNTÉZA GLYKOPEPTIDŮ A GLYKOPEPTIDOVÝCH DENDRIMERŮ S Tn ANTIGENEM Tomáš Trnka, Jan Ježek* a Pavel Vepřek*

Univerzita Karlova, Katedra organické chemie Přírodovědecké fakulty, Albertov 2030, 128 40 Praha 2, [email protected] *Ústav organické chemie a biochemie, Flemingovo nám. 2, 166 10 Praha 6-Dejvice, [email protected], [email protected] Sacharidové složky přirozených glykokonjugátů hrají rozhodující roli v rozpoznávacích mechanismech u řady fyziologicky významných procesů. Podstatou těchto rozpoznávacích mechanismů je interakce proteinových receptorů s nejrůznějšími sacharidovými strukturami. Naopak připojením definované sacharidové struktury na přírodní makromolekulární látku (protein, peptid popř. lipid) je možné významně ovlivnit její konformaci a tím i tepelnou stabilitu či odolnost vůči působení enzymů a také biologické vlastnosti a distribuci v živém organismu. Sacharidová část glykopeptidu je kovalentně vázána k peptidové kostře O-glykosidovou vazbou (na serin, threonin, tyrosin, hydroxyprolin) popřípadě jako N-glykosid (přes asparagin). Syntézy glykopeptidů jsou vzhledem k přítomnosti až 10 druhů funkčních skupin značně náročné a proto strategie vhodného ortogonálního chránění umožňující selektivní zavedení i odchránění příslušné skupiny představuje podstatnou část syntézy. Příprava vhodného glykosyldonoru je další z problémů s ohledem na skutečnost, že diskutované glykopeptidy obsahují jako sacharidovou složku obvykle GalNAc nebo GlcNAc. Tyto sacharidy díky participující acetamidové skupině poskytují běžnými reakcemi pouze β-glykosidy, takže je nutné používat při přípravě α-glykosidů donorů s neparticipující skupinou na uhlíku C-2, např. azidoskupinu. Z hlediska výstavby cílové molekuly je významný i způsob oligomerace, je možné volit mezi lineární či konvergentní strategií, event. kombinaci obou přístupů. V příspěvku je věnována pozornost i glykoproteinům mucinového typu, v jejichž postraních řetězcích se mohou vyskytovat různé nádorové antigeny, jejichž přítomnost obvykle signalizuje nádorové onemocnění. Tyto antigeny obsahují jako strukturní jednotku zpravidla GalNAcα1→O-Ser/Thr (Tn), NeuNAcα2→6GalNAcα1→O-Ser/Thr (sTn) event. Galβ1→3GalNAcα1→O-Ser/Thr (T). Tyto struktury jsou potenciálně využitelné pro imunoterapii některých nádorových onemocnění nebo k indikaci ranných stádií těchto nemocí, a proto je syntézám větších molekul zahrnující tento strukturní motiv věnována mimořádná pozornost. Literatura: 1. 2. 3.

Glykopeptides and Related Compounds: eds. D. G. Large a C. D. Waren, Marcel Dekker New York – Basel – Hong Kong 1997 H. Herzner, T. Reipen, M. Schultz a H. Kunz: Synthesis of Glycopeptides Containing Carbohydrate and Peptide Recognition Motifs. Chem. Rev. 2000, 100, 4495 – 4537, J. Ježek, J. Velek, P. Vepřek, V. Velková, T. Trnka, J. Pecka, M. Ledvina, J. Vondrášek a M. Písačka: Solid Phase Synthesis of Glycopeptide Dendrimers with Tn Antigenic Structure and their Biological Activities. Part I. J. Pept. Sci. 1999, 5, 46 – 55

SYNTHESIS OF A NEW 3,10,12-TRIOXA-6-AZATRICYCLO[7.2.1.02,7]DODECANE SKELETON T. Trtek, M. Černý, T. Trnka, M. Buděšínský Department of Organic Chemistry, Charles University, Albertov 2030, 128 40 Praha, Czech Republic

A new heterocyclic system 3 was prepared by a six-step synthesis using 1,6-anhydro-β-Dglucopyranose 1 as a chiral synthon. The synthetic route was based on reaction of tosylepoxide 2 following the scheme:

OH O OH

O

O 2 steps

O

O

OH

1

OTs

2

References and notes: Part of the project No. MSM 1131 00001.

1. ClCH2CH2OH 2. Ac2O 3. NaN3 4. H2/Pd 5. MeONa 6. t, base

O O N O H

3

OH

SYNTHESIS OF ORTHOGONALLY PROTECTED 2-AMINO-2-DEOXY-D-HEXOPYRANOSES1 J.Veselý1, J.Jindřich1, T.Trnka1, M.Ledvina2 1

Department of Organic Chemistry, Charles University, Albertov 2030,

128 40 Praha, Czech Republic, email: [email protected]; 2Institute of Organic Chemistry and Biochemistry, Academy of Sciences of the Czech republic, Flemingovo nám. 2, 166 10 Prague 6, Czech Republic Orthogonally protected 2-amino-2-deoxy-hexopyranoses are very convenient for stepwise construction2 of cyclic 1,2-trans-glycosidic bonded galacto- and manno-oligosaccharides. Galactopyranosides 1 and 2 have been prepared by inversion of configuration at C-4 carbon atom from corresponding glucopyranosides. We have described an efficient way for synthesis of phthalimido protected amino sugar 3 (Scheme 1). Thioglycoside 5 has been synthetized from glycoside 4 by method in situ anomerisation using Me3SiOTf as a promotor of ethylthio glycosylation (Scheme 2). AcO

OBn

AcO OBn O

BnO

O

NP ht

S Et

AllO

NP ht

1

S Et

2 OAc

1 . p yrid in e , D M A P p h th a lic a n h yd rid e G lc -N H 2 .H C l

O

AcO AcO

2 . Ac 2O

3

NP ht

OAc

S chem e 1

1 .p yrid in e , p h th a lic a n h yd rid e M a n -N H 2 .H C l AcO AcO 2 . A c 2O

OAc

OAc NP ht O

E tS H OAc

Me 3 S iOT f

AcO AcO

4 S chem e 2

References and notes: 1. Part of the project No MSM 1131 0001 and GACR 203/00/0071 2. Gattuso G., Nepogodiev S. A., Stoddart J. F.: Chem. Rev. 1998, 98, 1919.

NP ht O S Et 5

CHEMICAL AND ENZYMIC SYNTHESIS AND TRANSFORMATION OF β-D-GLUCOPYRANOSIDES OF C(α)-SUBSTITUTED CYCLANOLS Zdeněk Wimmer Institute of Organic Chemistry and Biochemistry AS CR, Flemingovo náměstí 2, CZ-16610 Prague 6, Czech Republic; Telephone: (+420 2) 2018 3281; mail: [email protected] 2-Substituted secondary cyclanols of the general formula 1 have been studied as potential insect juvenile hormone bioanalogs during our long-term research program. Phylogenetically different insect species, living under different conditions, require different approach in being treated properly by the tested compounds both under laboratory and field conditions [1]. Therefore, the presence of a secondary hydroxyl in the molecules of the studied compounds (1) has been advantageous in enabling us to synthesize a variety of derivatives of parent alcohols 1. To modify physico-chemical properties of secondary cyclanols 1, several types of their derivatives were investigated, such as fatty acid esters, glyceride anologs or β-Dglucopyranosides [1]. Generally, alkyl β-D-glucopyranosides (3) display higher polarity in comparison with (1), and, therefore, have been considered as convenient derivatives of biologically active cyclanols 1 for systemic application against herbivorous insect species [1]. Based on earlier results of ours achieved, a project has been established to investigate alkyl OR

Koenigs-Knorr or related

OR

on chemical and enzymic OO

1 enzymic process

R = (CH 2)2C(CH 3)2OCH 2CH 3, CH2C(CH 3)=CHCOOCH 2CH 3, (CH2)2NHCOOCH 2CH 3

OR

OAc O AcO

4

transformations of alkyl β-Dglucopyranosides 3 (Scheme OR

HO

1), and on investigation of biological activity of the compounds 3 and 5 on

OO OH

5 OGlu

methods of synthesis and OH- or Zn(OAc) 2

enzymic resolution

OR

OH

2

OAc

+

(3).

Attention has been focused AcO

OH

β-D-glucopyranosides

selected insect pests. 3

O HO OH

Scheme 1

References: [1] Wimmer Z., Rejzek M., Zarevúcka M., Kuldová J., Hrdý I., Němec V., Romaňuk M.: J. Chem. Ecol. 23, 605-628 (1997). Acknowledgment: This research has been supported by the Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech Republic through the COST D10.10 (D10/0005/98) project.

STANOVENÍ SACHARIDŮ V OVOCNÝCH NÁPOJÍCH POMOCÍ KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZY A MALDI-TOF HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE Jitka Žídková, Lubomír Přibyla a Josef Chmelík

Ústav analytické chemie AV ČR, Veveří 97, Brno e-mail: [email protected], [email protected], [email protected], tel. 05-41636145, fax 05-41212113

Byla vyvinuta metoda pro stanovení autenticity ovocných šťáv, založená na kombinaci elektroforézy a hmotnostní spektrometrie. Detekce doslazování potravin bohatých na sacharidy je komplikována přítomností různých komerčních sladidel, jejichž sacharidické složení je podobné složení těchto potravin. Kapilární elektroforéza byla použita pro kvantitativní stanovení sacharidů nejvíce zastoupených v ovocných šťávách (glukosy, fruktosy a sacharosy). Byl zkonstruován prototyp levného přístroje pro stanovení sladidel na bázi sacharidů v ovocných nápojích. Na základě známého poměru koncentrací majoritních sacharidů je možné odhalit doslazování sacharosou. Použití sladidel na bázi škrobových hydrolyzátů lze spolehlivě detekovat na základě přítomnosti oligosacharidů hydrolyzátů, které se v ovocných šťávách nevyskytují. Byla vypracována metoda na principu MALDI-TOF hmotnostní spektrometrie pro stanovení doslazování šťáv hydrolyzáty škrobu.

Tato práce vznikla za podpory grantu číslo Ep9410 Národní agentury pro zemědělský výzkum.