Lékařská chemie, biochemie a molekulární biologie Praktická cvičení I

Kolektiv

Lékařská chemie, biochemie a molekulární biologie Praktická cvičení I

Univerzita Karlova v Praze 1. lékařská fakulta Ústav biochemie a experimentální onkologie Vedoucí ústavu: Prof. MUDr. Aleksi Šedo, Dr.Sc.

Autorský kolektiv: Editor: Doc. MUDr. Jaromír Křemen, CSc. MUDr. Jana Stříbrná, CSc. RNDr. Eva Bubnová, CSc. RNDr. Alena Buděšínská, CSc. Doc. MUDr. Zdeněk Kleibl, PhD. Doc. MUDr. Michal Zikán, PhD. MUDr. Petr Bušek, PhD. Mgr. Lucie Šromová

2

OBSAH Úvod Pravidla bezpečnosti práce v laboratoři První pomoc v laboratoři Pomůcky pro praktická cvičení Práce s automatickými pipetami a spektrofotometrem Stanovení koncentrace chloridu železitého Základní chemické pojmy a zákony Roztoky - složení, ředění, osmolarita pH, pufry Stanovení acidity žaludeční šťávy Závislost pH acetátového pufru na poměru látkové koncentrace acetátu a kyseliny octové Změna pH acetátového pufru po přidání kyseliny

5 6 9 10 11 14 16 17 19 20

Výpočet pH kyselin, zásad a pufrů Stechiometrické výpočty, iontový zápis chemických rovnic, iontové rovnice Vlastnosti a reakce biologicky a toxikologicky významných prvků a jejich sloučenin Důkaz vybraných kationtů Důkaz vybraných anionů Analýza roztoku neznámé anorganické sloučeniny Vlastnosti a reakce funkčních skupin biochemicky významných organických sloučenin Oxidace primárních alkoholů Rozpustnost organických kyselin a jejich solí Tvorba komplexních sloučenin Močovina Aminokyseliny Chromatografie aminokyselin na tenké vrstvě Barevné reakce aminokyselin Reversibilní redox systém cystein-cystin Bílkoviny I Biuretová reakce Emulgační schopnost bílkovin Irreversibilní srážení bílkovin Důkaz některých složek bílkovin Dialýza Bílkoviny II Elektroforéza bílkovin Stanovení koncentrace celkové bílkoviny v séru Stanovení koncentrace albuminu v seru Stanovení koncentrace C-reaktivního proteinu v séru

26 29

24 25

31 33 37 39 42 43 46 48 49 50 51 54 58 59 60 62 63 65 66 68 69 72 74 76

3

Enzymy Důkaz substrátove specifity glykosidas Stanovení Michaelisovy konstanty Nukleové kyseliny I Izolace genetického materiálu Nukleové kyseliny II Stanovení koncentrace a čistoty nukleových kyselin Nukleové kyseliny III Analýza známých polymorfismů a častých mutací pomocí PCR a restrikčního štěpení

78 80 81 88 89 91 92 95 107

4

ÚVOD Předkládaná skripta pro výuku praktických cvičení z lékařské chemie, molekulární biologie a biochemie vycházejí z textu publikovaného v roce 2004. Od té doby došlo k řadě různých změn a tak bylo nutno texty upravit pro stávající potřeby. V důsledku inovace ve výuce uvedených oborů byla některá čistě teoretická témata vypuštěna, zejména ta, která budou probírána na seminářích. Naopak jiné kapitoly byly doplněny. Snažili jsme se klást důraz na klinický význam a uplatnění určitých úloh s cílem zvýšení zájmu studentů o obor. Zdá se, že studentům 1. až 3 ročníků chybí informace o důležitosti laboratorních oborů komplementu, kde je nezastupitelná role laboratorně vzdělaného lékaře se základními praktickými návyky. Jejich osvojení je v podstatě propedeutikou pro ostatní laboratorní obory. V molekulárně biologickém oddílu jsme u průkazu genových polymorfismů ApoE prokazovaných PCR a restrikčním štěpením spolu s gelovou elektroforézou, které v současné době v rutinní diagnostice ustupují do pozadí, doplnili moderní přístup průkazu polymorfismů pomocí real-time PCR se specifickou hybridizační FRET sondou. Studenti pracují s vlastním biologickým materiálem získaným bukáním stěrem a mohou tak porovnat náročnost obou přístupů. Praktická cvičení umožňují studentům jednak procvičit teoretické vědomosti, ale i aplikovat teoretické poznatky do praxe. V úvodních kapitolách se studenti seznámí s používáním odměrných zařízení, automatickými pipetami a dávkovači, dále se základním přístrojovým vybavením jako jsou spektrofotometry, elektroforetická zařízení. Současně se také seznámí s používáním základních přístrojů POCT - Point of Care Testing, což znamená provádění měření a testů in vitro v místě péče o pacienta diagnostickými přístroji s jednoduchým ovládáním. Měření a testy provádějí často pracovníci bez specializovaného laboratorního vzdělání na klinických odděleních jako součást péče o pacienta, ale jsou kontrolovány lékařem - klinickým biochemikem. POCT zahrnuje používání techniky u lůžka pacienta včetně přenosných analyzátorů, v praktických a odborných ambulancích (primární péče) nebo techniky vlastněné pacientem (např. sebetestování diabetiků). Analytické postupy, které využívají přístroje a zařízení POCT, jsou používány také při analýze patologických součástí moče nebo důkazu toxických látek v séru, slinách i v moči. Dále jsou zařazeny úlohy, které umožňují provést vyšetření séra a moče simulovaného pacienta a tím snadněji pochopit biochemické podklady závažných onemocnění. Byla zvolena témata týkající se zdravotních problémů velké části populace (např. diabetes mellitus, infarkt myokardu, aterosklerosa). Studentům doporučujeme, aby si před praktickým cvičením pečlivě prostudovali příslušný text cvičení a znalosti doplnili navazujícím textem z učebnice. Praktická cvičení z lékařské chemie, molekulární biologie a biochemie budou publikována v elektronické formě, což studentovi umožní vytisknout příslušnou kapitolu, respektive úlohu, a pracovat s nimi jako s pracovními listy. Závěrem dovolte vyslovit přání, aby praktická výuka i tyto texty, včetně seminářů, vám pomohly nejen ve studiu biochemie, ale i k získáni laboratorní zručnosti a zájmu o obor se stále narůstajícím významem nejen ve vědě, ale i ve všech oblastech klinické medicíny. Nezapomínejte, že se snižují počty lékařů vedoucích laboratorní oddělení a mnozí z vás je budou muset nahradit. Uvědomte si také, že v postgraduálním studiu se základní informace již získávají obtížněji. V Praze 2013

Autoři

5

Pravidla bezpečnosti práce v laboratoři

1. V laboratoři se pracuje v předepsaném pracovním ochranném oděvu: bílý laboratorní plášť by měl být celý zapnutý. Dlouhé vlasy je nutno mít sepnuté. V případě potřeby se doporučuje používat další ochranné pomůcky: gumové rukavice, brýle, ochranný štít nebo roušku. 2. Při práci s biologickým materiálem (krev, sérum, plazma, moč) je nutno vždy používat gumové rukavice. 3. V laboratoři je zakázáno jíst, pít, kouřit. Před odchodem z laboratoře je nutno vždy si umýt ruce mýdlem. 4. Při práci musí být zachován klid a udržována maximální čistota. Pracuje se s maximální pozorností a rozmyslem. 5. Každá kádinka,zkumavka,láhev na pracovním stole musí být čitelně a srozumitelně popsána ( obsah - signatura). 6. S pevnými chemikáliemi se nikdy nemanipuluje rukou, neodsypávají se do dlaně apod. Používá se čistých laboratorních lžiček nebo špachtlí. V případě znečištění chemickou látkou se ruce ihned opláchnou a umyjí mýdlem a vodou. 7. Malé zátky se při práci přidržují v ruce a neodkládají se na pracovní stůl. Zátky větších lahví je nutno položit tak, aby obsah lahve na nich ulpělý nekontaminoval pracovní plochu. Láhve a jiné obaly je po odebrání potřebného množství chemikálie třeba ihned uzavřít. 8. Reagenční roztoky se odlévají z reagenčních lahví na straně odvrácené od signatury tak, aby se nepoškodil štítek na lahvi. Nečitelný nápis a s tím spojená případná záměna může mít nebezpečné následky. 9. Pipetování jedovatých, leptavých, dráždivých a potenciálně infekčních (biologických) kapalin je nutno provádět bezpečnostními pipetami nebo pomocí balonku. Nikdy ne přímo ústy! 10. Při manipulacích s látkami ve zkumavkách a jiných nádobách musí ústí nádoby vždy směřovat od vlastní osoby i od jiných pracovníků. 11. Tekutiny ve zkumavce při zahřívání na otevřeném ohni se zahřívají opatrně a pomalu od hladiny ke dnu. Zkumavkou se přitom pohybuje, aby se obsah rovnoměrně prohříval a nedošlo k náhlému varu a vystříknutí vroucí kapaliny. 12. Pachy látek se nezjišťují přímým přičicháváním; výpary se přivanou mávnutím dlaně. Chemikálie se nikdy nesmí ochutnávat! 13. Koncentrované kyseliny, zvláště kyselina sírová, se ředí vléváním kyseliny do vody. Kyselina se přilévá tenkým proudem, po částech a za stálého promíchávání roztoku skleněnou tyčinkou. Obrácený postup, tj. přilévání vody do kyseliny je nepřípustný. 14. Při rozpouštění pevného hydroxidu sodného nebo draselného se sype hydroxid po malých částech za stálého míchání do vody; vždy se vyčká, až je předchozí podíl rozpuštěn.Pokud se roztok více ohřívá, ochladí se nádoba vodou ve větší nádobě.

6

15. Rozlité koncentrované kyseliny se nejprve ředí opatrně vodou a pak neutralizují zředěným roztokem sody nebo alkalického hydroxidu. Rozlité roztoky louhů se ředí vodou. Kontaminované plochy se pak omyjí vodou. Tyto operace se provádějí v ochranných rukavicích. Drobné kapky kyselin, louhů a jiných nebezpečných látek se nasají do filtračního papíru a potřísněné místo se pak omyje vodou. 16. Roztoky chemikálií se vylévají do odpadu jen za současného ředění nadbytkem vody z vodovodu. 17. Je třeba se vyhnout vdechnutí i minimálních kvant chemických látek. Některé látky, např. kyanovodík, sirovodík, chlor, fosgen aj. mohou usmrtit už po jediném nadechnutí. Jiné, např. rtuť, benzen, tetrachlormethan a 2-naftylamin, mohou způsobit těžká poškození zdraví až po delší době. Pro možnost infekce je třeba dbát úzkostlivé čistoty při práci s biologickým materiálem. 18. S látkami dráždivými, páchnoucími a jedovatými, např. s chlorem, fosgenem, chloroformem, tetrachlormethanem, sirouhlíkem aj., a s látkami snadno vznětlivými, např. s petroletherem, diethyletherem, benzinem, sirouhlíkem, benzenem, acetonem aj. se musí pracovat v dobře odsávané a zapojené digestoři. Při práci s hořlavinami se dbá na to, aby nemohlo dojít ke vznícení par od otevřeného ohně, tj. zejména od blízkých kahanů, ale i elektrických spotřebičů. V jedné digestoři nelze např. pracovat s hořlavým rozpouštědlem a zahřívat cokoli plynovým kahanem. Nebezpečným zdrojem par mohou být i chromatografické vany. Nebezpečnou věcí je postřik chromatogramů, kdy vzniká jemný aerosol činidla; detekci lze provádět jen v dobře odsávané digestoři nebo odsávaném boxu. Také žíhání, spalování a mineralizace látek se provádějí v digestoři. 19. Při rozlití hořlaviny se ihned zhasnou kahany a vypojí elektrické spotřebiče. Při rozlití velkého množství hořlavin se ihned zhasnou všechny hořáky a vypnou elektrické spotřebiče v místnosti, intenzivně se vyvětrá a nezapínají se žádné elektrické spotřebiče, ani světlo. Nejvyšší přípustné množství hořlavin v laboratoři je stanoveno předpisy. Je třeba mít na paměti, že hoří všechny organické látky, které obsahují méně než 70 % halogenu. 20. Při nasazování hadiček na skleněné trubice a zasunování skleněných trubiček, kohoutů a teploměrů do zátek se postupuje opatrně a bez násilí, nejlépe v ochranných rukavicích nebo rukou chráněnou čistou utěrkou; sklo se drží u otvoru, do něhož se vsunuje. Vsunutí skleněných předmětů do otvorů v pryži se usnadní jejich potřením glycerolem. 21. Chemické sklo a skleněné součásti chemických aparatur je třeba před prací prohlédnout; i nepatrná prasklina může mít velmi vážné následky. Poškozené sklo je třeba ihned vyřadit, dát do opravy nebo uložit do zvláštní nádoby na skleněný odpad. Poškozené sklo nesmí přijít do umývárny s ostatním sklem. Střepy skla i drobné střípky na stolech je nutno opatrně a pečlivě odstranit. 22. Při zahřívání, např. destilaci kapalin s teplotou varu pod 100 C, se užívají elektricky vyhřívané vodní lázně, elektricky vyhřívaná topná hnízda a infrazářiče. Pokud k ohřevu slouží zahřívané olejové lázně, nesmí do oleje vniknout voda. 23. Utajenému varu, např. při destilaci, lze zabránit varnými kaménky nebo skleněnými kuličkami, vloženými do nádoby před začátkem zahřívání. Při podezření na utajený var se vypne zdroj tepla a kapalina se nechá bez otřesů zchladnout. 24. Tenkostěnné nádoby s plochým dnem nesmějí být vakuovány, hrozí exploze. Pro vakuovou destilaci se používají výlučně silnostěnné baňky s kulatým nebo oblým dnem.

7

25. Ramena odstředivek musí být stejnoměrně zatížena. Odstředivky musí být během centrifugace uzavřeny, víko nesmí být otevřeno, dokud přístroj není opět v klidu. Většina centrifug je chráněna proti předčasnému otevření pojistkou.

8

První pomoc v laboratoři

1. Vnikne-li chemická látka do úst, je třeba zamezit jejímu spolknutí; vyplivne se a ústa vyplachují vodou. Při požití jedovaté látky nebo roztoku se ústa opakovaně vypláchnou vodou, po vypití asi půl litru tekutiny se vyvolá zvracení (dráždění hrdla prstem) a vyhledá se lékařská pomoc. 2. Při poleptání kůže kyselinami a louhy se postižené místo ihned dostatečně opláchne proudem studené vody. Při větším potřísnění se pak vyhledá lékařská pomoc. Zvlášť nebezpečná poleptání způsobují kyselina fluorovodíková, kyselina dusičná, kyselina sírová, alkalické hydroxidy, peroxid vodíku a fenol. 3. Zasažené oko se ihned vypláchne proudem studené vody, přiloží se sterilní obvaz a ihned se vyhledá lékařská pomoc. 4. Při popálení ohněm nebo horkými předměty je třeba postižená místa ihned ochladit ledovou vodou nebo přikládáním igelitových sáčků s vodou a ledem (ne samotný led). Části oděvu stmelené s popáleninami se zásadně neodstraňují. Při opaření je nutno co nejrychleji stáhnout nasáklý oděv, popálené plochy se kryjí jen sterilním obvazem (žádné masti nebo zásypy). Při těžších popáleninách nebo popálení většího rozsahu je třeba vyhledat lékařskou pomoc. 5. Při úrazu elektrickým proudem, je-li postižený pod napětím, je nutno nejprve přerušit přívod proudu nebo postiženého vyprostit tak, že je zachránce dostatečně izolován od země suchou dřevěnou, gumovou nebo skleněnou podložkou. Zabezpečí se dýchání, srdeční činnost a přivolá se lékařská pomoc. 6. Při vzniku řezných ran, např. laboratorním sklem, se krvácející rána omyje proudem vody, případně desinfikuje. K dezinfekci menších ran je možno použít Ajatin, Famosept, Septonex nebo roztok manganistanu draselného. Rána se přelepí rychloobvazem nebo ováže. Jsou-li v ráně cizí tělesa, např. střepiny skla, musí je vyjmout lékař. Při rozsáhlejším krvácení se přiloží kompresní obvaz a vyhledá lékařské ošetření. 7. Před zahájením praktik jsou studenti povinni se seznámit s teorií používané laboratorní metody a s postupem práce daného experimentu. Před začátkem každé úlohy je třeba se předem zamyslet nad možnými pracovními riziky.

PŘI JAKÉKOLI POCHYBNOSTI NEBO PODEZŘENÍ NA RIZIKO NEBEZPEČÍ SE NIKDY NEROZPAKUJTE DOTÁZAT ASISTENTA.

9

Pomůcky na praktika

1. Identifikační karta studenta 2. Přezutí 3. Bílý laboratorní plášť 4. Lihový popisovač na sklo 5. Návody na prakt. cvičení 6. Psací potřeby 7. Kalkulačka 8. Zámeček na skříňku v šatně 9. Rukavice nesterilní 10. Protokolový sešit

10

PRÁCE S AUTOMATICKÝMI PIPETAMI A SPEKTROFOTOMETREM

Práce s automatickými pipetami Klíčová slova: převod – mililitry,mikrolitry, látková koncentrace, komplexní sloučeniny, spektrofotometrie, transmitance, absorbance, molární absorpční koeficient, měřený vzorek, standardní vzorek, slepý vzorek. Reagencie: 1. 2. 3. 4.

roztok thiokyanatanu draselného 1 mol/l roztok chloridu železitého 400 µmol/l standardní roztok chloridu železitého 200 µmol/l roztok kyseliny sírové 1 mol/l !ŽÍRAVINA!

Pokyny pro práci s automatickými pipetami: 1. Před pipetováním nasaďte na pipetu špičku, jejíž barva obvykle odpovídá barvě tlačítka pístu. 2. PIPETU DRŽTE VŽDY ŠPIČKOU DOLŮ!!! 3. Při pipetování stlačte píst k první zarážce, ponořte pipetu do roztoku a pomalým uvolňováním stlačeného pístu nasajte kapalinu (pozor na vzduchové bubliny). Pomalým stlačením pístu k druhé zarážce vypusťte obsah špičky (špička nesmí být ponořena do kapaliny) do zkumavky.. Špička se při tom dotýká stěny zkumavky. 4. Pro pipetování nového roztoku použijte vždy novou špičku. 5. Pipety odkládejte svisle do stojánku a nepokládejte je na pracovní desku stolu. Nastavení zvoleného objemu: 1. Podle požadovaného objemu roztoku zvolte pipetu s vhodným rozsahem uvedeným na barevném tlačítku pístu pipety! 2. Požadovaný objem nastavte na stupnici pipety otáčením šroubu.

11

Příklady: rozsah pipety 200/1000 (údaj na barevném pístu): nejmenší objem 200 µ1 největší objem 1 000 µl 1 0 0

1000 µl

0 6 6

660 µl

0 2 0

200 µl

160 µl

0 2 0

20 µl

16 ul

0 2 0

2 µl

rozsah pipety 20/200 (údaj na barevném pístu): nejmenší objem 20 µl největší objem 200 µl 2 0 0

200 µl

1 6 0

rozsah pipety 2/20 (údaj na barevném pístu): nejmenší objem 2 µl největší objem 20 µl 2 0 0

20 µl

1 6 0

Spektrofotometrie: Závislost absorbance roztoku na koncentraci rozpuštěné látky podle LambertovaBeerova zákona umožňuje stanovit neznámou koncentraci látky z naměřené hodnoty absorbance příslušného roztoku: A = –log T= ·c·l A = absorbance při zvolené vlnové délce T = transmitace při zvolené vlnové délce  = molární absorbční koeficient při zvolené vlnové délce c = látková koncentrace měřeného roztoku (mol/l) l = tloušťka měřené vrstvy = 1 cm

12

Hodnotu koncentrace lze získat těmito způsoby: a) b) c) d)

výpočtem z Lambertova-Beerova zákona, známe-li molární absorbční koeficient odečtením z kalibračního grafu výpočtem pomocí kalibračního faktoru změřením absorbance standardního roztoku o známé koncentraci, absorbance roztoku vzorku a následným výpočtem ze vztahu: Ast/Avz = cst/c Ast = absorbance standardu Avz = absorbance vzorku cst = látková koncentrace standardu cvz = látková koncentrace vzorku

13

ÚLOHA 1.

Stanovení koncentrace roztoku chloridu železitého Při spektrofotometrickém stanovení koncentrace Fe3+ se využívá intenzívně červeně zbarveného komplexu [Fe(SCN)]2+, který vzniká reakcí Fe3+ s thiokyanatanovými anionty v kyselém prostředí (viz. Vlastnosti a reakce biologicky a toxikologicky významných prvků, (úloha 1.3.). Složení zadaných vzorků: vzorek Fe3+ 400 µmol/l (µl) destilovaná voda (µl)

A

B

C

D

250 750

750 250

200 800

800 200

slepý vzorek – 1000

Pracovní postup: – – – – – – – –

Každý student připravuje jeden ze vzorků A – D podle zadání. Připravte a očíslujte sedm zkumavek. Do zkumavek 1 – 3 připravte vždy 1 ml zadaného vzorku. Tímto způsobem připravíte tři identické vzorky (triplet). Do zkumavek 4 – 6 napipetujte vždy 1000 µl standardního roztoku chloridu železitého 200 µmol/l . Do sedmé zkumavky připravte slepý vzorek (1000 µl destilované vody). Do všech sedmi zkumavek odměřte dávkovačem 0,5 ml roztoku kyseliny sírové (1 mol/l), protřepejte a přidejte 0,5 ml roztoku thiokyanatanu draselného (celkový objem v každé zkumavce bude 2 ml). Obsah zkumavek dobře promíchejte. Po 10 min změřte absorbanci vzorku (Avz) i standardu (Ast) při 530 nm proti slepému vzorku. Naměřené hodnoty zaznamenejte do tabulky 1. a 2.

14

Tabulka 1. vzorek: standard vzorek – – –

absorbance

průměr

Z průměrné hodnoty absorbance vzorku a z průměrné hodnoty absorbance standardu vypočítejte koncentraci Fe3+ (exp.). Ze zadaného složení vzorku (A-D) spočítejte teoretickou koncentraci a porovnejte obě hodnoty. Všechny údaje zapište do tabulky 2.

Tabulka 2. vzorek

Fe3+ (µl)

voda (µl)

průměr Ast průměr Avz

cFe3+ (µmol/l) teoret.

cFe3+ (µmol/l) exp.

Poznámky:

15

ZÁKLADNÍ CHEMICKÉ POJMY A ZÁKONY Klíčová slova: relativní atomová hmotnost (Ar), relativní molekulová hmotnost (Mr), Avogadrova konstanta (NA), látkové množství (n, mol), molární hmotnost (M, g/mol), molární objem (Vm, dm3/mol), hmotnostní zlomek prvku ve sloučenině (w). Příklady na procvičování: 1. Jakou molární hmotnost má: a) oxid uhličitý, b) ethanol, c) glukosa, d) alanin? 2. Jaké látkové množství představuje: a) 90 g vody, b) 6 g kyseliny octové, c) 2,9 g chloridu sodného, d) 4,86 g hydrogenuhličitanu vápenatého? 3. Jaký je za normálních podmínek objem: a) 7 g dusíku, b) 2,2 g oxidu uhličitého ? 4. Jakou hmotnost má za normálních podmínek: a) 1 l amoniaku, b) 10 l kyslíku ? 5. Kolik molů Fe2+ obsahuje 77,5 g jodidu železnatého ? 6. Kolik mmolů Na+ obsahuje 0,67 g oxalátu sodného? 7. Kolik % dusíku obsahuje močovina ? 8. Kolik g dusíku vyloučil pacient za den, když v celkovém objemu moči bylo nalezeno 500 mmol močoviny ? 9. Bílkoviny obsahují v průměru 16 % dusíku. Kolik g bílkovin musíme podat pacientovi, když mu potřebujeme dodat 5 g dusíku? 10. Kolik ml oxidu uhličitého se uvolní při dekarboxylaci 25,5 mg kyseliny acetoctové? Dodatky: Relativní atomové hmotnosti (Ar) vybraných prvků: Na = 23, K = 39, Mg = 24, Ca = 40, P = 31, S = 32, Fe=56, Cl = 35, I = 127 Klíč: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10.

a) 44 g/mol, b) 46 g/mgl, c) 180 g/mol, d) 89 g/mol a) 5 mol, b) 0,1 mol, c) 0,05 mol, d) 0,03 mol a) 5,61, b) 1,121 a) 0,76 g, b) 14,28 g 0,25 mol 10 mmol 46 % 14 g 31,25 g 5,6 ml

Poznámky:

16

ROZTOKY - SLOŽENÍ, ŘEDĚNÍ, OSMOLARITA Klíčová slova: koncentrace látková = molární (mol/l roztoku), koncentrace hmotnostní (g/l roztoku, g/100 ml roztoku = g %), směšovací rovnice, křížové pravidlo, osmotický tlak, osmolarita (látková koncentrace osmoticky aktivních částic), izotonické roztoky. Příklady k procvičovaní: 1. Vypočítejte látkovou koncentraci roztoků o tomto složení: a) 17,4 g chloridu sodného / 300 ml, b) 2,49 mg jodidu draselného / 15 ml c) 385 mg chloridu vápenatého / 0,007 l d) 4.2 g hydrogenuhličitanu sodného / 20 ml e) 4,5 g glukosy / 2.5 l 2. Kolik g kyseliny šťavelové bude obsaženo ve 250 ml roztoku o látkové koncentraci 0,1 mol/l? 3. Roztok glycinu má látkovou koncentraci 3 mmol/l. Kolik mg glycinu bude rozpuštěno v 0,1 1 tohoto roztoku? 4. Kolik g chloridu sodného musíte navážit pro přípravu 350 m1 fyziologického roztoku chloridu sodného (c = l50 mmol/l)? 5. Kolik mmol Fe2+ bude obsaženo v 10 ml roztoku jodidu železnatého o látkové koncentraci 0,5 mol/l? 6. V jakém objemu roztoku chloridu vápenatého o látkové koncentraci 0.1 mol/l budou obsaženy 4 mmol chloridových iontů? 7. Kolik mmol hořečnatých kationtů bude obsaženo ve 100 ml roztoku chloridu hořečnatého o hmotnostní koncentraci 0,94 g/l? 8. Kolik mmol chloridových ionty bude obsaženo ve 100 ml roztoku chloridu hořečnatého o hmotnostní koncentraci 0,94 g/l? 9. Koncentrace draselných iontů v infúzi nesmí přesáhnout 40 mmol/l. Kolik m1 roztoku chloridu draselného o hmotnostní koncentrace 148 g/1 smíme dát do jedné infúzní láhve o objemu 300 ml? 10. Kolik vody musíme přidat ke 2 ml roztoku, chceme-li jej zředit a) 2x, b) 3x, c) 5x, d) 10x, e) 20x? 11. Kolik ml vody musíme přidat k 10 ml 8% (g/100 ml) roztoku glukosy, aby výsledný roztok byl 2%? 12. K 5 ml roztoku močoviny o látkové koncentraci 0,01 mol/l přidáme 20 ml vody. Jaká bude látková koncentrace výsledného roztoku? 13. K 5 m1 roztoku chloridu vápenatého o koncentraci 0,01 mol/l přidáme 20 ml vody. Jaká bude hmotnostní koncentrace výsledného roztoku? 14. Kolikrát musíme zředit roztok chloridu draselného o látkové koncentraci 0,24 mmol/l, když výsledný roztok má mít hmotnostní koncentraci 5,92 mg/l? 15. Jakou osmolaritu má roztok o látkové koncentraci 0,15 mol/l? a) chloridu sodného, b) chloridu hořečnatého c) hydrogenfosforečnanu sodného d) glukosy e) močoviny

17

16. Které z uvedených roztoků jsou izotonické s fyziologickým roztokem chloridu sodného (c = 150 mmol/l)? a) glukosy c = 300 mmol/l b) chloridu vápenatého c = 50 mmol/l c) chloridu draselného c = 300 mmol/l d) dihydrogenfosforečnanu sodného c = 0,15 mol/l 17. Kolik ml vody musíme přidat ke 100 ml roztoku, ve kterém je rozpuštěno 14,2 g hydrogentosforečnanu sodného, abychom získali roztok izotonický s fyziologickým roztokem chloridu sodného? 18. Jakou osmolaritu má roztok připravený smícháním 100 ml roztoku chloridu sodného o hmotnostní koncentraci 5,8 g/l a l00 ml roztoku chloridu vápenatého o hmotnostní koncentraci 11 g/l? Dodatky: Relativní atomové hmotnosti (Ar) vybraných prvků: Na = 23, K = 39, Mg = 24, Ca = 40, P = 31, S=32, Fe = 56, Cl = 35, I = 127 Klíč: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18.

a) 1 mol/l, b) 0,001 mol/l, c) 0,5 mol/l. d) 2,5 mol/l, e) 0,01 mol/l 2,25 g 22,5 mg 3,045 g 5 mmol 20 ml 1 mmol 2 mmol 6 ml a) 2 ml, b) 4 ml, c) 8 ml, d) 18 ml, e) 38 ml 30 ml 0,002 mol/l 0,22 g/l 3x a) 0,3 mol/l, b) 0,45 mol/l, c) 0,45 mol/l, d) 0,15 mol/l, e) 0,15 mol/l a) ano, b) ne, c) ne, d) ano 900 ml 1 8. 0,25 mol/l

Poznámky:

18

pH, PUFRY

Klíčová slova: Hendersonova - Hasselbalchova rovnice, pH pufru, funkce pufru, koncentrace pufru, kapacita pufru, aktuální a titrační acidita. Reagencie: 1. 2. 3. 4. 5.

roztok kyseliny octové 1 mol/l roztok kyseliny chlorovodíkové 0,1 mol/l roztok hydroxidu sodného 1 mol/l fenolová červeň (0,1 g se rozpustí v 60ml ethanolu a doplní do 100ml destil.vodou) vzorky žaludečních šťáv

19

ÚLOHA 1. Stanovení acidity žaludeční šťávy Žaludeční šťáva je čirá bezbarvá kapalina, někdy vazká od přimíšeného hlenu. Má charakteristický zápach a silně kyselou reakci, pocházející od volné kyseliny chlorovodíkové (HCl). pH žaludeční šťávy se pohybuje v rozmezí 0,8 – 1,5, což odpovídá HCl o koncentraci 30-150 mmol/l. Spolknutá potrava ji pufruje na pH 1,8 – 4, které je optimální pro působení pepsinů a žaludeční acidorezistentní lipasy. Hustota šťávy kolísá mezi 1,001 - 1,010 g/ml. Sekrece žaludeční šťávy je regulována neurohumorálně. Produkce se pohybuje v rozmezí 1 000 – 3 000 m1/24 hod. Žaludeční sekret je produkován třemi typy buněk žaludeční sliznice. Hlavní buňky tvoří pepsinogeny, vedlejší, mucinózní buňky produkují hlen a krycí buňky vylučují H+, K+, Cl. Poslední typ buněk vylučuje HCl o koncentraci 143 mmol/l. Kyselina chlorovodíková je v kontaktu se slizničním povrchem zčásti neutralizována alkalickým mucinem, který obsahuje NaHCO3. Kyselost a množství žaludeční šťávy jsou určeny především počtem buněk, které se sekrečního děje účastní. Významným faktorem je hladina peptidového hormonu gastrinu, produkovaného endokrinními buňkami žaludeční sliznice. V klinické praxi je možné přítomnost kyseliny chlorovodíkové v průběhu gastroskopie orientačně stanovit vstříknutím malého množství acidobazického indikátoru kongo červeně (při pH <3 dochází ke zbarvení do modra až černa), v minulosti bylo prováděno i kvantitativní stanovení acidity žaludeční šťávy titrací 0,1 mol/l NaOH (tzv. acidimetrie). Ke kvantitativnímu posouzení sekrece HCl pomocí adicimetrie byl stanoven tzv. výdej kyseliny chlorovodíkové (tj. součin látkové koncentrace HC1 a množství žaludeční šťávy) měřený v určitém časovém intervalu. Tento ukazatel byl měřen jednak v klidových bazálních podmínkách a dále po stimulaci (provokaci) žaludeční sekrece k maximálním možným hodnotám. Ke stimulaci sloužilo podání histaminu nebo syntetického hormonu pentagastrinu. Odběr žaludeční šťávy k stanovení výdeje kyseliny chlorovodíkové: K vyšetření se pacient dostavil ráno po nočním 12 hod lačnění, nekouřil. Žaludeční šťáva byla získána tenkou nasogastrickou sondou, která byla zavedena do nejnižšího místa žaludeční dutiny. Pacient při polykání sondy seděl, nebo mohl ležet na levém boku, poloha konce sondy se kontrolovala skiakopicky rentgenem. Injekční stříkačkou o objemu 20 ml byl odebrán všechen lačný žaludeční obsah, který se nehodnotil, a pak byla tímto způsobem ve 20

2minutových intervalech pod lehkým tlakem odčerpávána žaludeční šťáva po dobu celého odběru. Při dvouhodinovém odběru byla odebírána za bazálních klidových podmínek za 60 minut frakce B. Následně byl podkožně injikován pentagastrin a za další hodinu byly v l5minutových intervalech odebrány frakce S1 až S4. Princip: Odměrnou analýzou (titrací hydroxidem sodným), acidimetrií se stanoví koncentrace HC1 a vyhodnotí se výdej HC1. Pracovní ·postup: - Nejdříve je nutno si všimnout zápachu, barvy a konzistence žaludeční šťávy. Zelená nebo žlutá barva ukazuje příměs žluči, červená nebo tmavá příměs krve. Žaludeční obsah s příměsi žluči, ve které bývá přítomen také pankreatický sekret, nelze kvantitativně na výdej HC1 hodnotit (pankreatická šťáva obsahuje hydrogenkarbonát). - Každá dvojice zpracuje jednu frakci žaludeční šťávy. Jeden pacient je tedy anaylzován ve spolupráci 5ti dvojic studentů, kteří si vzájemně sdělí naměřené hodnoty. - Do titrační baňky (objem 100 ml) se pipetou přesně odměří 2,0 ml frakce, přidají se 3 kapky fenolové červeně a titruje se NaOH o koncentraci 0,1 mol/l. Analýzu provedeme 2x a pro výpočet použijeme průměrnou spotřebu NaOH v ml. *** Bod ekvivalence se při titraci žaludeční šťávy projeví přechodem ze žluté do červené barvy. Pokud se červené zbarvení objeví hned po přidání indikátoru (před titrací), spotřebu NaOH hodnotíme jako nulovou. Vyhodnocení: - Vypočítejte koncentraci HCl v jednotlivých frakcích (B, S1-S4) podle vzorce: mmol HCl v 1 l šťávy = a x 50, kde a = spotřeba 0,1 mol/l NaOH vyjádřená v ml (zdůvodněte výpočet). - Objem frakcí a koncentrací HCl vyneste do grafu, jehož souřadnice jsou na obr. 1.

21

Obr. 1. Titrace HCl v žaludeční šťávě - bazální sekrece a sekrece po stimulaci pentagastrinem

- Vypočítejte bazální sekreci (výdej, odbyt) HCl. Vynásobením objemu (v ml) a koncentrace HCl (v mmol/l) frakce B obdržíte po vydělení 1000 bazální výdej HCl v mmolech za 60 minut (normální hodnota je 1,5 až 4 mmol/60 min). - Podobným způsobem vynásobte objem (v ml) a koncentraci HCl (v mmol/l) ve frakcích S1 až 4 a součet těchto součinů vydělte 1000. Hodnota představuje tzv. vrcholový výdej kyseliny (peak acid out-put, PAO). - Vypočítejte maximální sekreci HCl (maximal acid out-put, MAO). Výpočet se obvykle se provádí takto: z frakcí 1 až 4 se vyberou ty dvě sousední frakce, ve kterých bylo docíleno nejvyššího výdeje (tj. součinu koncentrace HCl v mmol/l a objemu frakce v ml děleného 1000). Oba výdeje se sečtou a násobí dvěma. (Zdůvodněte výpočet.) Normální hodnoty maximální i vrcholové sekrece HCl jsou mezi 10 až 23 mmol/60 min. - Vyhodnoťte zjištěné údaje o vašem pacientovi.

22

Bazální výdej vyšší než 15 mmol/hod bývá přítomen u Zollinger-Ellisonova syndromu (soubor příznaků způsobený nádorem ostrůvků pankreatu nebo hyperplasií gastrinových buněk v antru). Hodnoty maximální sekrece bývají vyšší u pacientů s duodenálním vředem, výskyt duodenálního vředu při bazální achlorhydrii (nepřítomnost HCl v žaludeční šťávě) a stimulované sekreci nižší než 15 mmol/hod u mužů a 10 mmol/hod u žen je naopak málo pravděpodobný. Achlorhydrie při maximálním stimulačním testu ukazuje na zánik krycích buněk, tj. na difúzní poškození žaludeční sliznice (atrofická gastritis). Achlorhydrie bývá asociována s intestinální metaplazií žaludeční sliznice, která může vést k dysplázii, tento stav je proto považován za rizikový z hlediska vzniku zhoubného nádoru (karcinomu žaludku).

Fyziologické hodnoty výdeje HCl: BAO (Basal Acid Output) = bazální výdej HCl na lačno 1 - 5 mmol/hod MAO (Maximal Acid Output) = celková žaludeční sekrece po stimulaci během 60 min 13 - 25 mmol/hod PAO (Peak Acid Output) = součet hodnot dvou po sobě jdoucích 15 minutových frakcí s nejvyšší sekrecí HCl, násobený 2 (přepočet na 1 hodinu) 0 - 34 mmol/hod. Patologické hodnoty při onemocněních zažívacího traktu: BAO:

PAO:

1 - 5 mmol/hod normál, žaludeční vřed možný 5 - 15 mmol/hod duodenální vřed >20 mmol/hod podezření na gastrinom (Zollinger-Ellisonův sy.) atrofie žaludeční sliznice (chronická atrofická gastritis, perniciózní anémie) 5 - 40 mmol/hod normál, žaludeční vřed možný >40 mmol/hod podezření na gastrinom (Zollinger-Ellisonův sy.)

BAO/PAO:

0 mmol/hod

<0,20 normál, žaludeční vřed možný >0,60 gastrinom (Zollinger-Ellisonův sy.)

23

ÚLOHA 2.

Závislost pH acetátového pufru na poměru látkové koncentrace acetátu a kyseliny octové

Acetátový pufr je tvořen slabou kyselinou octovou (pKA = 4,75) a její silnou konjugovanou bází, tj. acetátovým aniontem. Podle Hendersonovy-Hasselbalchovy rovnice je pH pufru závislé na poměru látkových koncentrací obou složek konjugovaného páru. Příslušné hodnoty poměru [Aˉ]/[HA] získáte různým přídavkem roztoku hydroxidu sodného k roztoku kyseliny octové. Pracovní postup:  Do kádinek napipetujte roztoky kyseliny octové 1 mol/l, hydroxidu sodného 1 mol/l a destilovanou vodu podle tabulky 1. Tabulka 1. kádinka [Aˉ]/[HA] CH3COOH 1 mol/l (ml) NaOH 1 mol/l (ml) destilovaná voda (ml)

1 1:3 10 2,5 7,5

2 1:1 10 5 5 ZACHOVAT

3 3:1 10 7,5 2,5

pH naměřené pH vypočtené [pufr] (mol/l)     

Roztoky zamíchejte skleněnou tyčinkou. pH-metrem změřte pH připravených pufrů. Naměřené hodnoty porovnejte s vypočítanými hodnotami pH. Vypočítejte látkovou koncentraci připravených pufrů. Výsledky zapište do tabulky 1.

!POZOR! Pufr připravený v kádince 2 (poměr složek 1:1) budete používat v dalších úlohách.

Poznámky:

24

ÚLOHA 3. Změna pH acetátového pufru po přidání kyseliny Při přidání malého množství silné kyseliny se pH pufru změní jenom málo, díky rezervě, kterou v acetátovém pufru představují acetátové anionty. Pracovní postup:  Do kádinek napipetujte připravený acetátový pufr (poměr složek 1:1), destilovanou vodu a přidejte roztok kyseliny chlorovodíkové 0,1 mol/l podle tabulky 3.  Roztoky zamíchejte skleněnou tyčinkou a změřte pH.  Porovnejte naměřenou hodnotu pH s hodnotou vypočítanou.  Zjistěte, o kolik jednotek se změnilo pH po přidání kyseliny k acetátovému pufru a k destilované vodě.  Výsledky zapište do tabulky 3. Tabulka 3. kádinka

1

2

acetátový pufr (ml)

5

destílovaná voda (ml)

 5

 5

HCl 0,1 mol/l (ml)

5

pH naměřené rozdíl pH (naměřených) pH vypočítané rozdíl pH (vypočítaných).

Poznámky:

25

VÝPOČET pH KYSELIN, ZÁSAD A PUFRŮ Klíčová slova: disociace silných kyselin a zásad, disociace slabých kyselin a zásad, disociace solí, iontový součin vody, disociační konstanty kyselin a zásad, konjugovaný pár, amfolyty, isoelekrický bod, pufr, koncentrace pufru, pufrační kapacita, pH, pOH, pKw, pKA, pKB, pI, Henderson-Hasselbalchova rovnice. Příklady k procvičování: 1.

2.

3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10.

11. 12. 13. 14.

15.

Vypočítejte pH vodných roztoků následujících kyselin: a) kyselina octová c =2,5 mmol/l, b) kyselina octová c =0,025 mol/l c) kyselina uhličtá c = 1,2 mmol/l d) kyselina mravenčí c = 44 mmol/l e) fenol c = 0,7 mol/l Vypočítejte pH vodných roztoků následujících bází: a) amoniak c = 5.10-4 mol/l, b) amoniak c = 50 mmol/l c) anilin c = 0,01 mol/l d) acetátový anion c = 100 mmol/l Vypočítejte látkovou koncentraci hydroxoniových iontů ve vodném roztoku kyseliny octové o pH = 2,87. Vypočítejte látkovou koncentraci kyseliny kyanovodíkové ve vodném roztoku o pH = 5,2. Jakou hodnotu pKA má kyselina mléčná, když její vodný roztok o látkové koncentraci 10 mmol/l má pH = 2,93? Jaká je látková koncentrace hydroxidových iontů ve vodném roztoku kyseliny octové o látkové koncentraci 0,025 mol/l? Jaká je látková koncentrace hydroxoniových iontů ve vodném roztoku pyridinu o látkové koncentraci 100 mmol/l? Vypočítejte pH vodného roztoku dusičnanu amonného o látkové koncentraci 0,05 mol/l. Jaká je látková koncentrace kyanidu draselného ve vodném roztoku o pH = 11,35? Jaké pH bude mít roztok kyseliny mléčné, který získáte tak, že 20x zředíte 10 ml vodného roztoku kyseliny mléčné o látkové koncentraci 100 mmo/l? Kolik ml vody přidáte? Vypočítejte pH roztoku, který obsahuje 25 mmol kyseliny octové a 0,075 mol octanu sodného. V jakém poměru byly smíchány složky acetátového pufru, když hodnota jeho pH je 5,00? Vypočítejte pH roztoku, který vznikne smícháním 500 ml roztoku dihydrogencitrátu sodného a 250 ml roztoku kyseliny citrónové stejné látkové koncentrace. Vypočítejte pH fosforečnanového pufru, který byl připraven smícháním 100 m1 roztoku hydrogenfosforečnanu draselného (c = 0,05 mol/l) a l00 ml roztoku dihydrogenfosforečnanu sodného (c = 0,025 mol/l). Jaká je látková koncentrace tohoto pufru? Kolik g dihydrogencitrátu draselného použijete pro přípravu 100 ml roztoku, který smícháním se 100 ml roztoku kyseliny citrónové o látkové koncentraci 0,1 mol/l poskytne pufr o pH = 1,94?. Jaká bude látková koncentrace tohoto pufru po přidání 800 ml vody? Jaké pH bude mít takto získaný roztok?

26

16. Jaká bude látková koncentrace roztoku hydrogenfosforečnanu sodného a látková koncentrace roztoku dihydrogenfosforečnanu sodného, když smícháním 500 ml obou roztoků získáme pufr o pH = 7,12, jehož osmolarita je stejná jako osmolarita fyziologického roztoku chloridu sodného (c = 150 mmol/l)? 17. Jaké pH bude mít roztok připravený smícháním 150 ml roztoku kyseliny octové o látkové koncentraci c = 0,2 mol/l a 100 ml roztoku hydroxidu sodného o hmotnostní koncentraci 8 g/l? 18. O kolik jednotek se změní pH acetátového pufru (c = 0,4 mol/l, poměr látkových koncentrací acetátu a kyseliny octové je 4:1), jestliže k 50 m1 pufru přidáte 10 m1 roztoku kyseliny chlorovodíkové (c = 0,4 mol/l)? O kolik jednotek se změní pH, jestliže totéž množství roztoku kyseliny chlorovodíkové přidáte k 50 ml vody? 19. Kolik ml roztoku NaOH o látkové koncentraci 0,2 mol/l musíte přidat k 500 ml fosforečnanového pufru (c = 180 mmol/l) o pH = 7,42, aby se jeho pH změnilo o 0,4? Jaká bude koncentrace vzniklého pufru? O kolik jednotek se změní pH, jestliže totéž množství roztoku NaOH přidáte k 500 ml vody? Dodatky: Relativní atomové hmotnosti (Ar) vybraných prvků: Na = 23 K = 39 Mg = 24 Ca = 40 P = 31 S = 32 Fe = 56 Cl = 35 I = 127 Hodnoty pKA (25 °C) vybraných kyselin: H2CO3 = 6,52, NH = 9.25 C6H5OH = 9,89

HCOOH = 3,75 H2PO =7,12 HCN = 9,40

CH3COOH = 4,75 HPO = 12,32 k. citrónová = 2,94

Hodnoty pKB (25° C) vybraných bází: NH3 = 4,75 C6H5NH2 = 9,38

CH3COOˉ = 9.25 C5H5N = 8,82

HPO = 6,88 CNˉ = 4 ,60

Klíč: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17.

a) 3,68, b) 3,18, c) 4,72, d) 2,55, e) 5,45 a) 9,97, b) 10.97, c) 8,31, d) 8,87 0,00135 mol/l 0,1 mol/l 3,86 1,5.10-11 mol/l 8,13.10-10 mol/l 5,28 0,2 mol/l pH = 3,08, 190 ml 5,23 1,78 3,24 pH = 7,42, 0,0375 mol/l 0,23 g, 0,011 mol/l, pH =1,94 120 mmol/l 5,05 27

18. o 0,42 jednotek (pH1 = 5,35, pH2 = 4,93), o 5,83 jednotek (pH = 1,17) 19. 75 m1, 0,157 mol/l, o 5,41 jednotek Poznámky:

28

STECHIOMETRICKÉ VÝPOČTY, IONTOVÝ ZÁPIS CHEMICKÝCH ROVNIC, IONTOVÉ ROVNICE

Klíčová slova: stechiometrie, iontový zápis, iontová rovnice, součin rozpustnosti, disociace solí, rozpustnost solí ve vodě, rozpustnost solí v kyselinách. Chemická rovnice: Iontový zápis: Iontová rovnice:

AgNO3 + NaCl  AgCl + NaNO3 Ag+ +NO + Na+ + Clˉ  AgCl + Na+ + NO Ag+ + Clˉ  AgCl

Příklady na procvičování (chemické rovnice vyjadřujte iontovým zápisem): 1. Smrtelná dávka kyanidu draselného pro člověka je 200 mg. Kolik m1 kyanovodíku se uvolní z tohoto množství působením kyseliny chlorovodíkové v žaludku? 2. Kolik mg oxalátu amonného potřebujete k vysrážení Ca2+ z 2 ml roztoku o látkové koncentraci Ca2+ c=0.01 mol/l? 3. Maximální hodnota přípustné koncentrace dusitanů ve vodě je v České republice 0,1 mg/l. Kolik mmolů kyseliny dusité se uvolní z 0,1 mg dusitanu sodného reakcí s kyselinou chlorovodíkovou? 4. Jakou hmotnostní koncentraci má roztok jodidu železnatého, když při titraci 10 ml tohoto roztoku bylo spotřebováno 5 ml roztoku dusičnanu stříbrného o látkové koncentraci c=0,4 mol/l? 5. Při titraci 10 ml acetátového pufru o pH 5,75 bylo spotřebováno 40 ml kyseliny chlorovodíkové (c = 0,25 mol/l). Jaká složka pufru se touto titrací stanoví? Jaká je její koncentrace? Jaká je koncentrace pufru? 6. Koncentrace roztoku hydrogenuhličitanu se stanovuje zpětnou titrací nezreagované kyseliny chlorovodíkové přidané v nadbytku. Jaká bude teoretická spotřeba roztoku hydroxidu sodného (c = 0,4 g/l) použitého při zpětné titraci nezreagované kyseliny chloorovodikové, když k 1 ml roztoku hydrogenuhličitanu sodného (c = 24 mmol/l bylo přidáno 5 ml roztoku kyseliny chlorovodíkové (c = 10 mmol)? 7. Vypočítejte o kolik jednotek se změní pH roztoku z původní hodnoty pH = 3, když bylo do tohoto roztoku přidáno takové množství amoniaku, že koncentrace vzniklého NH 4 byla 0,0009 mol/l. 8. Kolik mmolů vápenatých kationtů se uvolní ze 64 mg oxalátu vápenatého po přidání 20 ml kyseliny chlorovodíkové (c = 0,1 mol/l)? 9. Kolik ml oxidu uhličitého se uvolní z 84 mg hydrogenuhličitanu sodného reakcí s 500 ml kyseliny chlorovodíkové o pH = 2? 10. Tableta Superpyrinu obsahuje 400 mg acetylsalicylátu hlinitého. Vypočítejte, kolik mmolů kationtů hlinitých se uvolní v žaludku při podání tří tablet Superpyrinu. 11. Jakou osmolaritu bude mít roztok, který vznikne smícháním 10 ml roztoku rhodanidu (thiokyanátu) draselného o osmolaritě 200 mmol osmoticky aktivních částic/l a 10 ml

29

roztoku chloridu železitého o osmolaritě 400 mmol osmoticky aktivních částic/l? Jedním z produktů je chlorid thiokyanátoželezitý. 12. K 100 ml roztoku dihydrogenfosforečnanu sodného o látkové koncentraci c = 0,1 mol/l přidáte 25 ml roztoku hydroxidu sodného o látkové koncentraci c = 0,1 mol/l. Vypočítejte hodnoty následujících veličin ve výsledném roztoku: a) látková koncentrace dihydrogenfosforečnanu sodného b) látková koncentrace hydrogenfosforečnanu sodného c) látková koncentrace kationtů sodných d) osmolarita e) pH Dodatky: Relativní atomové hmotnosti (Ar) vybraných prvků: Al = 27 Na = 23 K = 39 Mg = 24 Ca = 40 P = 31 S = 32 Fe = 56 Cl = 35 I = 127 Klíč: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12.

68,9 ml 2,48 mg 0,0015 mmol 31 g/l acetát, 1 mol/l, 1,1 mol/l 2,6 ml 1 jednotku 0,5 mmol 22,4 ml 2,13 mmol 250 mosmol/l 0,06 mol/l, 0,02 mol/l, 0,1 mol/l, 0,18 osmol/l, 6,64

Poznámky:

30

VLASTNOSTI A REAKCE BIOLOGICKY A TOXIKOLOGICKY VÝZNAMNÝCH PRVKŮ A JEJICH SLOUČENIN

Klíčová slova: periodický systém, toxicita prvků a jejich sloučenin, disociace, kationty, anionty, oxidační číslo, rozpustnost solí ve vodě, rozpustnost solí v kyselinách a zásadách, součin rozpustnosti, iontový zápis, iontová rovnice, názvosloví, kvalitativní analýza, skupinová činidla. Reagencie: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21.

zředěná kyselina chlorovodíková 1:1 nasycený vodný roztok sulfanu !JED! nasycený vodný roztok sulfidu amonného roztok uhličitanu amonného 1 mol/l) roztok dusičnanu stříbrného 0,1 mol/l roztok dusičnanu barnatého 0,2 mol/l !JED! zředěná kyselina dusičná 1:1 zředěná kyselina sírová 1:1 koncentrovaný vodný roztok amoniaku roztok hydroxidu sodného 2 mol/l !ŽÍRAVINA! roztok chromanu draselného 0,25 mol/l roztok jodidu draselného 0,5 mol/l roztok chloridu amonného 1 mol/l roztok ferrikyanidu draselného 0,01 mol/l roztok thiokyanatanu draselného 0,3 mol/l roztok hydrogenfosforečnanu sodného 0,3 mol/l roztok molybdenanu amonného v kyselině dusičné (7,5 g molybdenanu amonného ve 100 ml vody + 100 ml kyseliny dusičné 320 g/1) roztok difenylaminu v kyselině sírové 0,06 mol/l roztoky vzorků obsahující zkoumané kationty roztoky vzorků obsahující zkoumané anionty roztoky vzorků neznámých sloučenin

31

Kvalitativní analýza: Uvedený postup kvalitativní analýzy je vhodný pro poznání vlastností biologicky a toxikologicky významných prvků a jejich sloučenin. Zahrnuje pouze reakce, které jsou potřebné k důkazu vybraných kationtů a aniontů. Vybrané kationty: Ag+, Pb2+, Hg 22 , Hg2+, Cu2+, Zn2+, Fe2+, Fe3+, Ca2+, Ba2+, Mg2+, Na+, K+, NH 4 Vybrané anionty: HCO 3 , CO 32 , PO 34 , Cl‾, I‾, SO 24 , NO 3 Kationty a anionty jsou rozděleny do skupin podle reakce s vhodně zvolenou látkou skupinovým činidlem. Toto činidlo tvoří sraženiny vždy jen s ionty příslušné skupiny. Jednotlivé kationty a anionty ve skupinách se pak dokazují speciálními reakcemi. Základní pravidla pro rozpustnost solí ve vodě: Rozpustné sole: a) obsahují anionty NO 3 , Cl‾ (mimo Ag+, Pb2+, Hg 22 ), SO 24 (mimo Ba2+, Pb2+). b) obsahuji kationty Na+, K+, NH 4 . Nerozpustné sole: obsahuji anionty S2‾, CO 32 , HPO 24 a PO 34 (mimo Na+, K+, NH 4 ). Sloučeniny obsahující hydrogenanionty jsou rozpustnější. Sole slabých kyselin jsou rozpustné v roztocích silnějších kyselin, uvolní se původní slabá kyselina. Sole slabých bází jsou rozpustné v roztocích silnějších bází, uvolní se původní slabá báze. POZOR! Pro jednotlivé reakce používejte maximálně 1 ml roztoku vzorků i činidel. Protože jde pouze o kvalitativní reakce, není třeba objemy roztoků odměřovat!

32

ÚLOHA 1.

Důkaz vybraných kationtů K uvedeným reakcím použijte připravené roztoky, které obsahují příslušný kation. Ke každé reakci použijte nový roztok vzorku. 1.1. Kationty: Ag+, Pb2+, Hg 22 Skupinové činidlo je zředěná HCl. Chloridy těchto kationtů jsou ve vodě nerozpustné. Také sulfidy těchto kationtů jsou nerozpustné ve vodě a nerozpouštějí se ani ve zředěných silných kyselinách, protože jejich součiny rozpustnosti jsou extrémně nízké: AgCl = 1,8.10-10 PbCl2 = 1,7.10-5 Hg2Cl2 = 1,3.10-18

K s:

Ag2S = 2,5.10-50 PbS = 2,5.10-27 Hg2S ~ 10-45

Ag2CrO4 = 1,1.10-12

Pracovní postup: Ag+: Ag+ + HCl



AgCl + H+ bílá sraženina rozpustná v NH3  [Ag(NH3)2]+

2 Ag+ + K2CrO4



Ag2CrO4 + 2 K+ červenohnědá sraženina

Pb2+ + 2 HCl

 PbCl2 + 2 H+ bílá sraženina rozpustná v horké vodě

Pb2+ + K2CrO4

 PbCrO4 + 2 K+ žlutá sraženina

Pb2+:

Hg 22 : Hg 22 + 2 HCl

 Hg2Cl2 + 2 H+ bílá sraženina, reakcí s NH3 černá vyloučeným Hg2O

33

1.2. Kationty: Hg2+, Cu2+ Skupinové činidlo je H2S. Chloridy těchto kationtů jsou ve vodě rozpustné. Sulfidy jsou nerozpustné ve vodě i ve zředěných silných kyselinách, protože součiny rozpustnosti těchto sulfidů mají extrémně nízké hodnoty: CuS = 8,5.10‾45

K s:

HgS = 1,6.10‾52:

Pracovní postup: POZOR! Před přidáváním roztoku H2S vzorek okyselte několika kapkami zředěné HCl. Hg2+: Hg2+ + H2S

 HgS + 2 H+ černá sraženina nerozpustná v kyselinách

Hg2+ + 2 KI

 HgI2 + 2 K+ oranžovočervená sraženina rozpustná v přebytku KI  K2[HgI4]

Cu2+ + H2S

 CuS + 2 H+ hnědočerná sraženina nerozpustná v kyselinách

Cu2+ + 2 NaOH

 Cu(OH)2 + 2 Na+ bleděmodrá sraženina [Cu(NH3)4]2+

Cu2+:

rozpustná

v

NH3



1.3. Kationty: Zn2+, Fe2+, Fe3+ Skupinovým činidlem je (NH4)2S. Vzniklé sulfidy jsou ve vodě nerozpustné, ve zředěných silných kyselinách jsou však rozpustné, protože hodnoty jejich součinů rozpustnosti jsou vyšší: ZnS = 6,9.10‾26

K s:

FeS = 3,7.10‾19

Pracovní postup: POZOR! Před reakcí s (NH4)2S zkontrolujte pH vzorku zkoumaného roztoku. Zn2+: Zn2+ + (NH4)2S

 ZnS + 2 NH 4 bílá sraženina rozpustná v kyselinách

34

Fe2+: Fe2+ + (NH4)2S

 FeS + 2 NH 4 černá sraženina rozpustná v kyselinách

Fe2+ + 2 NaOH

 Fe(OH)2 + 2 Na+ bílá sraženina, barví se modrozeleně a hnědne oxidací na Fe(OH)3

Fe2+ + K3[Fe(CN)6]  "berlínská modř" Fe3+: 2 Fe3+ + 3 (NH4)2S

 2 FeS + S + 6 NH 4 černá sraženina rozpustná v kyselinách

Fe3+ + 3 NaOH

 Fe(OH)3 + 3 Na+ hnědá sraženina

Fe3+ + KCNS

 [Fe(CNS)]2+ + K+ červený komplex

1.4. Kationty: Ca2+, Ba2+ Skupinovým činidlem je (NH4)2CO3. Uhličitany těchto kationtů jsou ve vodě nerozpustné, ale rozpouštějí se ve zředěných roztocích silných kyselin. Sulfidy jsou ve vodě rozpustné. Tyto prvky mají schopnost již v nepatrném množství barvit nesvítivý plamen, jsou-li do něj vneseny ve formě těkavých sloučenin. Na tomto principu je založena plamenová fotometrie, umožňující rychlé stanovení některých prvků. Pracovní postup: POZOR! Před reakcí s (NH4)3CO3 zkontrolujte pH vzorku zkoumaného roztoku. Reakce v plameni: – Do zkumavky odlijte malé množství zředěné HCl, ponořte do ní platinový drátek a vyžíhejte jej v nesvítivém plameni. Tento postup několikrát zopakujte, aby samotný drátek plamen nebarvil. – Po ochlazení namočte drátek do zkoušeného roztoku, vneste jej do plamene a pozorujte jeho zbarvení. Ca2+: Kation vápenatý barví plamen oranžově. Ca2+ + (NH4)2CO3



CaCO3 + 2 NH 4 bílá sraženina rozpustná v zředěných kyselinách

Ca2+ + Na2HPO4



CaHPO4 + 2 Na+ bílá sraženina rozpustná v zředěných kyselinách

Ba2+: Kation barnatý barvi plamen světle zeleně. 35

Ba2+ + (NH4)2CO3



BaCO3 + 2 NH 4 bílá sraženina rozpustná v zředěných kyselinách

Ba2+ + H2SO4



BaSO4 + 2H+ bílá sraženina nerozpustná v zředěných kyselinách

1.5. Kationty: Mg2+, Na+, K+, NH 4 Pro tyto kationty není žádné skupinové činidlo, jednotlivé kationty se dokazují specifickými reakcemi. Pracovní postup: Mg2+: K 1 ml zkoumaného roztoku přidejte nejprve 1 ml roztoku NH 4Cl, aby se nesrážel hydroxid hořečnatý. Mg2+ + Na2HPO4 + NH3 

MgNH4PO4 + 2 Na+ bílá sraženina

Na+: Kation sodný barví plamen žlutě. K +: Katíon draselný barví plamen fialově (zbarveni je výraznější při pozorování přes kobaltové sklo). NH 4 : NH 4 + NaOH

 NH3 + Na+ + H2O navlhčený universální indikátorový papírek zmodrá (papírek držte pouze nad zkumavkou)

Poznámky:

36

ÚLOHA 2.

Důkaz vybraných aniontů K uvedeným reakcím použijte připravené roztoky, které obsahují příslušný anion. Reakce jednotlivých aniontů porovnejte s analogickými reakcemi používanými pro důkaz kationtů v úloze 1. 2.1. Anionty: HCO 3 , CO 32 , PO 34 Skupinovým činidlem je Ba(NO3)2, který poskytuje s uvedenými anionty sraženiny, rozpustné ve zředěných silných kyselinách. Pracovní postup: HCO 3 : Roztok reaguje slabě alkalicky, pKB(HCO 3 ) = 7,48. 2 HCO 3 + Ba(NO3)2

 Ba(HCO3)2 + 2NO 3 nestálý, přechází na BaCO3 bílá sraženina rozpustná ve zředěných kyselinách (uniká CO2)

CO 32 : Roztok reaguje alkalicky, pKB(CO 32 ) = 3,6. CO 32 + Ba(NO3)2

 BaCO3 + 2 NO 3 bílá sraženina rozpustná ve zředěných kyselinách (uniká CO2)

2 PO 34 + 3 Ba(NO3)2

 Ba3(PO4)2 + 6 NO 3 bílá sraženina rozpustná ve zředěných kyselinách

PO 34

PO 34 + (NH4)2MoO4  po zahřátí vznikne žlutá sraženina fosfomolybdenanu amonného

37

2.2. Anionty: Cl‾, I‾ Anionty této skupiny tvoří sraženinu s AgNO3, vzniklá sraženina je nerozpustná ve zředěných kyselinách. Pracovní postup: Cl‾: Cl‾ + AgNO3

 AgCl + NO 3 bílá sraženina rozpustná v NH3 [Ag(NH3)2]+ nerozpustná ve zředěných kyselinách

I‾ + AgNO3

 AgI + NO 3 žlutá sraženina nerozpustná v NH3 a nerozpustná ve zředěných kyselinách

2.3. Anion SO 24 : Tento anion tvoří sraženinu s Ba(NO3)2, vzniklá sraženina je nerozpustná ve zředěných kyselinách. Pracovní postup: SO 24 : SO 24 + Ba(NO3)2

 BaSO4 + 2 NO 3 bílá sraženina nerozpustná ve zředěných kyselinách

2.4. Anion NO 3 Tento anion netvoří sraženinu ani s Ba(NO3)2 ani s AgNO 3 . Pracovní postup: NO 3 : K několika kapkám roztoku vzorku přidejte několik kapek roztoku difenylaminu. Objeví se tmavěmodré zbarvení.

Poznámky:

38

ÚLOHA 3.

Analýza roztoku neznámé anorganické sloučeniny. V roztoku neznámé anorganické sloučeniny dokažte kation a anion. Podle postupu uvedeného v úloze 3.1. a 3.2. nejdříve zjistěte, do jaké skupiny kationtů nebo aniontů patří ionty analyzované sloučeniny. Příslušný kation a anion potom dokažte speciálními reakcemi uvedenými v úloze 1. a 2. (použijte vždy nový roztok vzorku!). Nezapomeňte na zjištění pH analyzovaného roztoku - tato informace vám pomůže při identifikaci neznámé sloučeniny! 3.1. Analýza kationtů - zařazení do skupiny Pracovní postup:

1 ml vzorku + HCl

sraženina Hg 22 , Pb2+, Ag+

roztok Hg2+, Cu2+ Zn2+, Fe2+, Fe3+ Ca2+, Ba2+ Mg2+, Na+, K+, NH 4

+ H2S v nadbytku

sraženina Hg2+, Cu2+

roztok Zn2+, Fe2+, Fe3+ Ca2+, Ba2+ Mg2+, Na+, K+, NH 4

39

1 ml nového vzorku + případná neutralizace NH3 + NH4Cl + (NH4)2S

sraženina Zn2+, Fe2+, Fe3+

roztok Ca2+, Ba2+ Mg2+, Na+, K+, NH 4

1 ml nového vzorku + případná neutralizace NH3 + NH4Cl + (NH4)2CO3

sraženina Ca2+, Ba2+ –

roztok Mg2+, Na+, K+, NH 4

Po zařazení kationtu do skupiny proveďte jeho důkaz speciálními reakcemi uvedenými v úloze 1.

40

3.2. Analýza aniontů - zařazení do skupiny Pracovní postup: 1 ml vzorku + Ba(NO3)2

sraženina

roztok

PO 34 HCO 3 , CO3‾, SO 24

Cl‾. I‾, NO 3

+ zřeďená HCl

roztok

sraženina

PO 34

SO 24

+ AgNO3

sraženina

roztok

C1‾, I‾

NO 3

únik CO2

– –

Po zařazeni aniontu do skupiny proveďte jeho důkaz speciálními reakcemi uvedenými v úloze 2. Výsledek analýzy vzorku neznámé sloučeniny zapište do tabulky:

vzorek č.

pH

vzorec

název

Poznámky:

41

VLASTNOSTI A REAKCE FUNKČNÍCH SKUPIN BIOCHEMICKY VÝZNAMNÝCH ORGANICKÝCH SLOUČENIN

Klíčová slova: hydroxysloučeniny, oxosloučeniny, alkoholy, aldehydy, ketony, oxidace alkoholů, adiční reakce oxoskupiny, kyseliny, báze, fenoly, aminy, karboxylové kyseliny, soli, estery, amidy, komplexní sloučeniny. Reagencie: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17.

methanol !JED! ethanol 4% roztok formaldehydu kyselina salicylová kyselina šťavelová 70% roztok fenolu močovina dichroman draselný koncentrovaná kyselina sírová !ŽÍRAVINA! Schiffovo činidlo (roztok fialového barviva fuchsinu odbarveného hydrogensiřičitanem sodným) roztok hydroxidu sodného 2 mol/l !ŽÍRAVINA! koncentrovaný roztok amoniaku zředěná kyselina chlorovodíková 1:1 roztok chloridu vápenatého 0,1 mol/l roztok chloridu železitého 0,05 mol/l roztok síranu mědnatého 0,02 mol/l kyselina mléčná

42

ÚLOHA 1.

Oxidace alkoholů a aldehydů Primární alkoholy se oxidují na karbonylové sloučeniny – aldehydy. V praxi se této reakce využívalo např. při detekci ethanolu v dechu (oranžový dichroman draselný v prostředí kyseliny sírové se v přítomnosti alkoholu redukuje na zelený síran chromitý, zatímco ethanol se oxiduje na acetaldehyd). K průkazu aldehydů lze dále použít tzv. Schiffova činidla (úloha 1.). Toto činidlo poskytuje reakcí s aldehydy barevnou sloučeninu za vzniku tzv. Schiffovy báze (aldiminu) (úloha 5.). Aldehydová skupina je přítomna v celém spektru biologicky významných organických molekul (sacharidy). K jejímu funkčnímu průkazu se používá zpravidla tzv. Fehlingovy zkoušky. Vinan měďnatý v alkalickém roztoku reaguje s aldehydem za vzniku příslušné kyseliny, oxidu měďného a vinanu sodného (úloha 1.2.). Fehlingovo činidlo se připravuje vždy těsně před použitím smícháním roztoků Fehling I (síran měďnatý) a Fehling II (hydroxid sodný a vínan sodnodraselný) v poměru 1:1.

43

1.1. Reakce aldehydů se Schiffovým činidlem Pracovní postup: – – – – – – –

Reakci proveďte s methylalkoholem i ethylalkoholem. Do zkumavky dejte malé množství dichromanu draselného a velice opatrně přidejte plastikovým kapátkem 5 kapek koncentrované kyseliny sírové. Přilijte 1 ml alkoholu a opatrně promíchejte, Zkumavku zahřívejte ve vroucí vodní lázni. Na ústřižek filtračního papíru kápněte 1 kapku Schiffova činidla. Nad ústím zkumavky přidržujte filtrační papír se Schiffovým činidlem, které se vznikajícím aldehydem barví červenofialově. Zapište chemickými rovnicemi oxidaci methanolu a ethanolu: a) b)

Poznámky:

44

1.2. Příprava a redukce Fehlingova činidla . Kyselina vinná, alifatická hydroxykyselina, tvoří velmi snadno komplexy s ionty kovů. Nerozpustný hydroxid mědnatý přejde po přidání kyseliny vinné do roztoku, protože vznikající komplexní sloučenina zabrání reakci Cu2+ s hydroxidovými anionty. Komplexně vázaný Cu2+ se snadno redukuje na Cu+, který již komplexní ion netvoří. Aldehydy, které se velmi snadno oxidují, vyredukují z tohoto roztoku nerozpustný červený oxid měďný. Tato reakce je principem tzv. Fehlingova činidla. Pracovní postup: –

V jedné zkumavce si připravte asi 2 ml vodného roztoku kyseliny vinné.

–

Ve druhé zkumavce smíchejte 0,5 ml síranu měďnatého s 0,5 ml roztoku hydroxidu sodného. Vznikne modrá sraženina hydroxidu mědnatého.

–

Potom přikapávejte roztok kyseliny vinné, dokud se sraženina nerozpustí.

Pozn. Vzhledem k nestabilitě vzniklého komplexu se Fehlingovo činidlo připravuje krátce před použitím a to smícháním roztoků Fehling I (roztok síranu měďnatého 70g/l) a Fehling II (250g hydroxidu sodného a 350g vinanu sodnodraselného v 1 litru vody) v poměru 1:1 a důsledně se směs protřepe. –

Přidejte 2 kapky formaldehydu a krátce zahřejte ve vroucí vodní lázni.

–

V přítomnosti aldehydu dojde k vyredukování červeného oxidu měďného.

Poznámky:

45

ÚLOHA 2.

Rozpustnost organických kyselin a jejich solí 2.1. Kyselina salicylová Kyselina salicylová (prekurzor pro výrobu kys. acetylsalicylové) je špatně rozpustná ve vodě, zatímco její sodná sůl se ve vodě rozpouští poměrně dobře. Pracovní postup: – – –

Do zkumavky dejte několik krystalů kyseliny salicylové, přidejte asi 1 ml vody a protřepejte. Část látky zůstane nerozpuštěna. Přidejte asi 2 ml roztoku hydroxidu sodného. Vzniklá sodná sůl je ve vodě rozpustná. Reakci zapište formou iontového zápisu:

Poznámky:

46

2.2. Kyselina šťavelová Ze solí kyseliny šťavelové je významný oxalát vápenatý, který je nerozpustný ve vodě, ale rozpouští se ve zředěných silných kyselinách. Tvorba nerozpustného oxalátu vápenatého je příčinou toxicity kyseliny šťavelové. Oxalát (šťavelan) vápenatý se může vyskytovat v moči, kde tvoří snadno močové kameny. Pracovní postup: – – – – –

Ve zkumavce rozpusťte ve vodě několik krystalů kyseliny šťavelové. Vzniklý roztok zalkalizujte koncentrovaným roztokem amoniaku (použijte plastikovou pipeptku). Zkontrolujte indikátorovým papírem pH (a). Přidávejte po kapkách roztok chloridu vápenatého a pozorujte vznik bílé sraženiny (b). Sraženinu oxalátu vápenatého rozpusťte přidáním zředěné kyseliny chlorovodíkové, reakce probíhá kolem pH = 5 (c). Všechny tři reakce označené a), b), c), vyjádřete formou iontového zápisu: a) b) c)

Poznámky:

47

ÚLOHA 3.

Tvorba komplexních sloučenin Reakce s chloridem železitým Roztoky aromatických hydroxysloučenin poskytují s roztokem chloridu železitého charakteristické barevné reakce, způsobené tvorbou komplexních sloučenin. Fialově zbarvený roztok, vzniklý reakcí fenolu s chloridem železitým, se pod názvem Uffelmannovo činidlo používal k průkazu kyseliny mléčné, patologicky přítomné v žaludeční šťávě. Kyselina mléčná, stejně jako některé další alifatické hydroxykyseliny, tvoří snadno komplexy s ionty kovů. Protože vazba Fe3+ s kyselinou mléčnou (chelátový ligand) je pevnější než jeho vazba s fenolem, vytěsní kyselina mléčná fenol z jeho komplexu s chloridem železitým. Pracovní postup: – – – –

Do zkumavky dejte 1 ml roztoku fenolu a přidejte 1–2 kapky roztoku chloridu železitého. Roztok se zbarví fialově (Uffelmannovo činidlo). Za míchání přikapávejte kyselinu mléčnou (použijte plastikové kapátko) do změny fialového zbarvení na žluté (komplex kyseliny mléčné s Fe3+ je světle žlutý). Analogicky jako s fenolem proveďte i reakci chloridu železitého s kyselinou salicylovou, kterou v tomto případě rozpusťte v 1 ml ethanolu. Vznikne červenofialový roztok komplexní sole. Vysvětlete rozdíl ve zbarvení komplexů!

Poznámky:

48

ÚLOHA 4.

Močovina 4.1. Hydrolýza Močovina (urea), látka velmi dobře rozpustná ve vodě, je diamid kyseliny uhličité. Proto ji lze, jako jiné amidy, rozštěpit alkalickou hydrolýzou na amoniak a alkalickou sůl původní kyseliny, v tomto případě uhličitan sodný. Pracovní postup: – – – – –

Ve zkumavce rozpusťte malé množství močoviny v 1 ml vody. Přidejte 2 ml roztoku hydroxidu sodného a protřepejte. Reakční směs zahřívejte ve vroucí vodní lázni několik minut. Přes ústí zkumavky položte navlhčený indikátorový papírek, který se unikajícím amoniakem zbarví modře. Alkalickou hydrolýzu močoviny zapište chemickou rovnicí;

Poznámky:

49

AMINOKYSELINY

Klíčová slova: funkční skupiny kyselé a bazické, izoelektrický bod, tvorba komplexních sloučenin, nitrace, oxidace, redukce, hydrolýza bílkovin, rozdělovací rovnováhy, adsorpce, látky polární a nepolární, afinita. Reagencie: POZOR! Reagencie ad 1) - 6) jsou určeny pouze pro chromatografii! 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25.

roztok glycinu 0,005 mol/l (standard) roztok argininu 0,005 mol/l (standard) roztok methioninu 0,005 mol/l (standard) roztok alaninu 0,005 mol/l (standard) vzorek - směs aminokyselin vyvíjecí směs: chloroform, methanol, vodný roztok amoniaku 6 mol/l v poměru 3 : 3 :1 kyselina glutamová roztok tyrosinu 1,25 mmol/l roztok tryptofanu 1,25 mmol/l roztok kaseinu 5 g/l roztok kyselého hydrolyzátu kaseinu 5 g/1 roztok želatiny 5 g/l roztok hydroxidu sodného 2 mol/l, !ŽÍRAVINA! zředěná kyselina chlorovodíková 1:1 roztok ninhydrinu v butanolu 2 g/l Millonovo činidlo (40 g rtuti v 57 ml koncentrované kyselině dusičné, po zahřátí zředěno 2 objemy vody), !JED! koncentrovaná kyselina dusičná, !ŽÍRAVINA! koncentrovaná kyselina sírová, !ŽÍRAVINA! Ehrlichovo aldehydové činidlo (4-dimethylaminobenzaldehyd 10 g/1 v kyselině chlorovodíkové 200 g/1) roztok cysteinu 0,008 mol/l v HCl 1 mol/l roztok cystinu 0,004 mol/l v HCl 1 mol/l nitroprussid sodný koncentrovaný vodný roztok amoniaku nasycený vodný roztok sulfanu síran amonný

50

ÚLOHA 1.

Chromatografie aminokyselin na tenké vrstvě Chromatografie je souhrnným označením pro separační metodiky používané k dělení směsi látek na základě jejich rozdílné afinity ke stacionární a mobilní fázi. Jednotlivé složky směsi rozpuštěné v mobilní (pohyblivé) fázi jsou při průchodu přes stacionární (zakotvenou) fázi v závislosti na svých fyzikálně-chemických vlastnostech v různé míře „zbrzděny“ a dochází tak k jejich rozdělení. Mobilní fáze může být kapalina či plyn, zatímco stacionární fáze je pevná látka (např. papír, Al2O3) nebo kapalina na pevném nosiči. Podle druhu mobilní fáze se chromatografické metody dělí na dva základní typy: kapalinovou a plynovou chromatografii. Kapalinová chromatografie (LC; liquid chromatography): K proudění mobilní fáze dochází za atmosférického tlaku, nízkého tlaku (FPLC; fast protein liquid chromatography) nebo vysokého tlaku (HPLC; high-performance liquid chromatography či high-pressure liquid chromatography), přičemž se vzrůstajícím tlakem roste rychlost separace směsi látek. K rozdělení směsi na jednotlivé složky dochází podle charakteru stacionární a mobilní fáze na základě: 1) velikosti separovaných částic (kapalinová vylučovací chromatografie, gelová filtrace). Tento typ chromatografie je používán k separaci syntetických nebo biologických polymerů (proteinů, nukleových kyselin, polysacharidů). Stacionární fázi tvoří mikroskopické gelové kuličky (agarosa, polyakrylamid, dextran) o definované porozitě, umístěné v chromatografické koloně. Po nalití směsi látek do kolony pronikají do pórů stacionární fáze pouze molekuly menší než je velikost pórů, čímž se jejich průchod kolonou zdrží. Frakce jímané po průchodu kolonou tak obsahují látky s postupně klesající velikostí molekuly, tj. kolonou nejrychleji prochází velké částice (srovnej s gelovou elektroforézou proteinů či nukleových kyselin!). 2) náboje částic (iontoměničová či iontová chromatografie). Ionty (kationty, anionty) či organické sloučeniny nesoucí elektrický náboj (proteiny, aminokyseliny, krátké oligonukleotidy) jsou děleny na základě interakce s opačně nabitou stacionární fází. Stacionární fáze je tvořena gelovými kuličkami (agarosa, celulosa) s kovalentně navázanými funkčními skupinami nesoucími záporný (katex) či kladný (anex) náboj. Navázané složky směsi mohou být následně ze stacionární fáze uvolněny např. promytím kolony roztokem obsahujícím ionty se shodným nábojem jako izolovaná látka, čímž dojde k jejímu vytěsnění. V klinické praxi je ionexová chromatografie užívána v diagnostice některých vrozených poruch metabolismu např. k identifikaci aminokyselin. 3) hydrofobicity (chromatografie na reverzní fázi). Tento typ chromatografie slouží k izolaci hydrofobních látek nesených hydrofilní mobilní fází. Stacionární fázi tvoří organické sloučeniny s alifatickým uhlíkovým řetězcem (C4-C18, s délkou řetězce narůstá jejich hydrofobní charakter). Navázané hydrofobní součásti dělené směsi látek jsou následně uvolněny promytím kolony organickým rozpouštědlem (methanol, acetonitril).

51

4) vazebné specifity (afinitní chromatografie). K separaci látek ze směsi dochází na základě vysoce specifické interakce separované látky se stacionární fází. Příkladem této interakce je např. vazba ligand – receptor, antigen – protilátka či enzym – substrát. V klinické biochemii a toxikologii je široce užívána HPLC díky své rychlosti (čas separace méně než 1hodina), vysoké rozlišovací schopnosti, citlivosti (detekce pikomolárních množství látek) a možnosti automatizace. Slouží k detekci a stanovení hladiny např.: 1) léků (antiarytmikum amiodaron, psychofarmaka jako např. alprazolam, amitriptylin, diazepam, zolpidem atd.) 2) metabolitů hromadících se při vrozených či získaných defektech metabolismu (katecholaminy, homocystein, porfyriny, puriny, pyrimidiny atd.) 3) vitamínů (koenzym Q10, vitamín E, A či jeho prekurzor beta karoten). 4) glykovaného hemoglobinu (HbA1c, jeden ze základních parametrů používaných k hodnocení kompenzace pacientů s diabetes mellitus, viz Sacharidy II). Plynová chromatografie (GC; gas chromatography): Plynová chromatografie využívá jako mobilní fázi plyn. Skleněná či kovová kolona, ve které separace probíhá, je umístěna v termostatu. Stacionární fáze je tvořena mikroskopickou vrstvou kapaliny nebo pevnou látkou a mobilní fáze tzv. nosným plynem (např. helium nebo dusík). Vzorek (kapalina či plyn) se vstřikuje do nástřikového portu, v případě kapalného vzorku musí být nástřikový port předehřátý na dostatečně vysokou teplotu, aby byl vzorek ihned po vstříknutí převeden na plynnou fázi. Nosný plyn unáší vzorek přes kolonu, kde dochází k dělení jednolitých složek na základě jejich fyzikálněchemických vlastností a rozdílné interakce se stacionární fází. Po průchodu kolonou jsou jednotlivé složky vzorku detekovány na detektoru, který je připojen na počítač. Časový průběh detekovaného signálu představuje chromatogram tvořený souborem vrcholů, z nichž v ideálním případě každý odpovídá jedné složce směsi. V klinické biochemii a toxikologii je GC samotná či v kombinaci s hmotnostní spektrometrií (MS) využívána k detekci a kvantifikaci ethanolu a řady drog v tělních tekutinách. Chromatografie na tenké vrstvě (TLC; thin layer chromatography): TLC představuje variantu kapalinové chromatografie, kde je stacionární fáze tvořena tenkou vrstvou adsorbentu (silikagel, oxid hlinitý, celulosa) nanesenou na inertní destičku (sklo, plastik, hliníková folie). Destička s nanesenými vzorky se umístí do chromatografické vany s mobilní fází, která vzlíná po povrchu fáze stacionární. Nanesené vzorky se při průchodu mobilní fáze v ní rozpustí a v závislosti na své polaritě/hydrofobicitě jsou s mobilní fází unášeny. Pokud je stacionární fáze tvořena polárním silikagelem a mobilní fáze převážně nepolárními rozpouštědly, je hydrofobní vzorek unášen dále než vzorek polární, který je poután k silikagelu větší silou. Po ukončení chromatografie jsou separované látky přímo viditelné, pokud separujeme směs barevných sloučenin, či u fluoreskujících látek po osvícení desky UV zářením, v ostatních případech lze vizualizovat jednotlivé skvrny postříkáním destičky vhodným detekčním činidlem. Při separaci směsi aminokyselin je detekce prováděna pomocí ninhydrinu, který reaguje s volnými aminoskupinami za vzniku tmavě modrého nebo fialového zabarvení (Ruhemanova violeť). Identifikaci jednotlivých složek směsi lze následně provést stanovením tzv. retenčního faktoru (Rf) a jeho srovnáním s Rf standardních vzorků. Rf se vypočítá podle vzorce: Rf = vzdálenost vzorku od startu / vzdálenost čelo start (Rf =1 mají látky putující s čelem mobilní fáze, Rf =0 látky zůstávající na startu) TLC je v klinické praxi užívána k detekci a průkazu některých léčiv a především drog.

52

V této úloze budete pro dělení směsi aminokyselin používat chromatografii na tenké vrstvě (TLC). Adsorbentem (stacionární fázi) je v tomto případě silikagel na hliníkové folii (destičky Silufol), mobilní fází je směs rozpouštědel, mající pH blízko pI dělených aminokyselin. Jednotlivé aminokyseliny ve směsi budete po detekci identifikovat pomocí standardních vzorků aminokyselin. Pracovní postup: a b a = vzdálenost středu skvrny od startu

Rf =

b = vzdálenost čela rozpouštědla od startu 1. Arg 2. Gly 3. vzorek (směs AMK) 4. Ala 5. Met

 Na kratší straně destičky Silufol obyčejnou tužkou lehce vyznačte start (asi 2 cm od okraje destičky) a pět bodů (po stranách destičky ponechte 1 cm), na které budete nanášet roztoky AMK (viz schéma).  Mikropipetkami naneste na příslušné body roztoky standardních AMK a vzorku (opatrně, aby nedošlo k porušení tenké vrstvy!).  Destičku vložte do chromatografické vany s připravenou mobilní fází. Start musí být nad hladinou kapaliny.  Vanu dobře přikryjte skleněným víkem.  Když čelo rozpouštědla dosáhne do vzdálenosti 1-2 cm od horního okraje, chromatogram vyndejte z vany.  Čelo rozpouštědla označte tužkou a chromatogram sušte nad ploténkou (stupeň 6). POZOR! Nespálit!  Suchý chromatogram v digestoři detekujte postřikem roztokem ninhydrinu v butanolu ze vzdálenosti asi 0,5 cm.  Chromatogram zahřívejte asi 3 min nad ploténkou (stupeň 6). POZOR! Nespálit!  Skvrny na chromatogramu odpovídající jednotlivým amininokyselinám obtáhněte tužkou.  Pomocí vypočítaných hodnot Rf standardů i vzorků identifikujte jednotlivé AMK. Vzorek č.: …. obsahoval tyto AMK:

Poznámky:

53

ÚLOHA 2.

Barevné reakce aminokyselin Tyto reakce se používají k důkazu aminokyselin. Velmi citlivá ninhydrinová reakce je pro aminokyseliny obecná (s výjimkou prolinu) a využívá se nejen k jejich důkazu (detekce aminokyselin při chromatografii, viz úloha 1.), ale i k jejich fotometrickému stanovení. Ostatní reakce jsou specifické pouze pro aminokyseliny určité struktury. 2.1. Ninhydrinová reakce Kondenzací aminokyselin se dvěma molekulami ninhydrinu (hydrát indantrionu) vzniká modrofialově zbarvený produkt.

Pracovní postup:  Připravte si vroucí vodní lázeň.  K 1 ml roztoku tyrosinu přidejte 0,5 ml roztoku ninhydrinu v butanolu, promíchejte.  Reakční směs zahřívejte asi 5 min ve vroucí vodní lázni. Po chvíli se objeví v horní organické vrstvě růžové až modrofialové zbarvení.  Tutéž reakci vyzkoušejte i s kyselým hydrolyzátem kaseinu.

54

Poznámky:

55

Následující reakce 2.2.2.4, proveďte s tyrosinem, tryptofanem, kyselým hydrolyzátem kaseinu (indolové jádro je v kyselém prostředí nestabilní!), kaseinem a želatinou. Všechny výsledky provedených reakcí zapište do tabulky 1. 2.2. Reakce s koncentrovanou kyselinou dusičnou Aromatické aminokyseliny poskytují reakcí s kyselinou dusičnou žlutě zbarvené nitrosloučeniny. Tyrosin a tryptofan se za těchto podmínek nitrují zvlášť snadno. V alkalickém prostředí se zbarvení změní na oranžové, protože vznikne alkalická sůl tautomerní formy nitrosloučeniny. Stejnou reakci poskytují i bílkoviny, obsahující tyto aminokyseliny s aromatickým jádrem (xanthoproteinová reakce). Pracovní postup:  Do zkumavky odlijte 1 ml zkoumaného roztoku a z dávkovače přidejte 0,5 ml koncentrované kyseliny dusičné.  Zahřívejte ve vroucí vodní lázni (případně vzniklá sraženina se rozpustí) do vzniku žlutého zbarvení.  Zkumavku ochlaďte pod tekoucí vodou.  Opatrně přikapávejte plastikovou pipetkou roztok hydroxidu sodného až do vytvoření oranžového zbarvení. 2.3. Reakce s Millonovým činidlem Sloučeniny, obsahující v molekule hydroxyskupinu vázanou na aromatické jádro, poskytují s Millonovým činidlem komplexní rtuťnatou sůl svých nitroderivátů . Pracovní postup:  K 1 ml zkoumaného roztoku přidejte plastikovou pipetkou 5 kapek Millonova činidla.  Vzniklou bílou sraženinu zahřívejte ve vroucí vodní lázni do objevení červeného zbarveni komplexní rtuťnaté soli.

56

2.4. Reakce s Ehrlichovým činidlem K důkazu tryptofanu se využívá kondenzační reakce indolového jádra s oxoskupinou aldehydu, obsaženého v Ehrlichově činidle. Produkty této reakce jsou v kyselém prostředí fialově zbarveny. Pracovní postup:  K 1 ml zkoumaného roztoku přidejte plastikovou pipetkou několik kapek Ehrlichova činidla a protřepejte.  Z dávkovače přidejte pomalu po stěně zkumavky 1 m1 koncentrované kyseliny sírové. V pozitivním případě vznikne na rozhraní obou vrstev fialový prstenec lépe viditelný proti bílému pozadí. Tabulka 1. AMK

HNO3

Millon

Ehrlich

tyrosin tryptofan hydrolyzát kaseinu kasein želatina

Poznámky:

57

ÚLOHA 3.

Reverzibilní redox systém cystein - cystin Sloučeniny obsahující -SH skupinu tvoří v alkalickém prostředí s nitroprussidem sodným (pentakyanonitrosylželezitan sodný) červenofialově zbarvenou komplexní sloučeninu. Pracovní postup:  Ve zkumavce si připravte asi 3 ml roztoku nitroprussidu sodného rozpuštěním velmi malého množství látky ve vodě.  Dále si připravte tři zkumavky.  Do první zkumavky odlijte 1 ml vodného roztoku sulfanu.  Do druhé zkumavky odlijte 1 ml roztoku cysteinu.  Do třetí zkumavky odlijte 1 ml roztoku cystinu.  Do všech třech zkumavek přidejte 1 ml roztoku nitroprussidu sodného.  Za míchání roztok nasyťte síranem amonným.  Roztoky ve všech třech zkumavkách pomalu alkalizujte amoniakem a pozorujte vznik barevné komplexní sloučeniny.  Asi po 5 min porovnejte zbarvení ve všech třech zkumavkách a výsledky zaznamenejte do tabulky 2.  Vysvětlete průběh jednotlivých reakcí. Tabulka 2. sloučenina

sulfan

cystein

cystin

zbarvení

Poznámky:

58

BÍLKOVINY I

Klíčová slova: biuret, peptidová vazba, koloidní roztok, izoelektrický bod, amfionty, amfolyty, amfotéry, vliv pH na ionizaci bílkovin, hydrofilní a hydrofobní skupiny, emulgace, reverzibilní a irreverzibilní srážení bílkovin. Reagencie: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25.

roztok kaseinu 10 g/1 ve fyziologickém roztoku roztok vaječného bílku ve fyziologickém roztoku (1:10) roztok síranu mědnatého 0,02 mol/l roztok hydroxidu sodného 2 mol/l !ŽÍRAVINA! slunečnicový olej roztok octanu olovnatého 0,01 mol/l !JED! roztok kyseliny sulfosalicylové 0,8 mol/l koncentrovaná kyselina dusičná roztok Ajatinu zředěný 1:4 roztok kyseliny octové 0,15 mol/l roztok kyseliny octové 1,5 mol/l chlorid sodný fyziologický roztok (roztok chloridu sodného 0,15 mol/l) krevní sérum zředěné fyziologickým roztokem (1 : 1) roztok močoviny 3 mol/l a laktátu lithného 0,2 mol/l roztok dusičnanu stříbrného 0,06 mol/l činidlo pro stanovení močoviny (kyselina sírová 0,9 mol/l + 1 tableta diacetylmonoxinu 0,05 mmol/l do 50 ml vody) 70% roztok fenolu roztok chloridu železitého 0,05 mol/l roztok hydrogenuhličitanu sodného 0.4 mol/l roztok dusičnanu barnatého 0,2 mol/ !JED! Molischovo činidlo (roztok 1-naftolu v ethanolu 3 g/l) koncentrovaná kyselina sírová !ŽÍRAVINA! koncentrovaná kyselina chlorovodíková !ŽÍRAVINA! roztok molybdenanu amonného v kyselině dusičné (7,5 g molybdenanu amonného ve 100 ml vody + 100 ml kyseliny dusičné 320 g/l)

59

ÚLOHA 1.

Biuretová reakce Biuret je látka vznikající tepelnou kondenzací dvou molekul močoviny za uvolnění amoniaku a vzniku vazby –CO-NH-. 2 NH2–CO–NH2  NH2–CO–NH–CO–NH2 + NH3 Biuret, stejně jako ostatní sloučeniny, obsahující dvě nebo více peptidových (amidových) vazeb, tvoří s ionty Cu2+ fialově zbarvenou komplexní sloučeninu (chelát).

Biuretová reakce se používá k průkazu i kvantitativnímu stanovení látek ve kterých jsou přítomné vazby –CO-NH-, tedy i bílkovin. V alkalickém prostředí tvoří bílkoviny s měďnatými kationty komplexní sole, které jsou fialově zbarveny. Volné elektronové páry pro tvorbu komplexu poskytují elektronegatívní atomy peptidové vazby CONH. Název reakce je odvozen od biuretu POZOR! Při nadbytku Cu2+ je fialové zbarvení překryto modrou sraženinou hydroxidu mědnatého. Pracovní postup:  Do jedné zkumavky odlijte 1 ml roztoku kaseinu (před upotřebením zásobní roztok protřepejte), do druhé 1 ml roztoku vaječného bílku.  Ke každému roztoku bílkoviny přilijte 1 ml roztoku hydroxidu sodného 2 mol/l.  Do obou zkumavek přidávejte po kapkách roztok síranu měďnatého až do vzniku fialového zbarvení.

60

Poznámky:

61

ÚLOHA 2.

Emulgační schopnost bílkovin Protože bílkoviny obsahují hydrofilní i hydrofobní skupiny, mají emulgační schopnosti podobně jako jiné tenzidy. Tenzidy, které jsou součástí detergentů, snižují povrchové napětí na rozhraní hydrofilní a hydrofobní fáze. Jejich účinkem vzniká poměrně stabilní emulze tuků ve vodě. Tato vlastnost bílkovin, především albuminu, se uplatňuje při transportu hydrofobních látek krví (např. mastných kyselin, steroidních hormonů, bilirubínu). Přirozenou emulzí tuků ve vodě je mléko, v němž bílkoviny působí jako emulgátor. Pracovní postup:  Do zkumavky odlijte 1 ml roztoku bílku a 1 kapku slunečnicového oleje. Po protřepání se vytvoří emulze.  Do druhé zkumavky odlijte 1 ml destilované vody a 1 kapku slunečnicového oleje. Po protřepání se obě vrstvy opět oddělí.

Poznámky:

62

ÚLOHA 3.

Ireverzibilní srážení bílkovin Denaturace je změna konformace nativní molekuly bílkoviny, která tím přechází na méně uspořádanou formu a ztrácí svou biologickou funkci. Denaturačně působí všechny vlivy, které porušují nekovaletní interakce vytvářející sekundární a terciární strukturu bílkovin. Mezi fyzikální vlivy patří především rozptýlení bílkoviny na velkém povrchu (pěněním roztoků) a zvýšená teplota. Srážení varem nastává nejrychleji v okolí pI bílkovin. K chemické denaturaci dochází např. působením silných kyselin, které ruší iontové interakce změnou náboje, naproti tomu organická rozpouštědla a tenzidy narušují nepolární interakce. Primárním účinkem všech denaturačních činidel je rozvinutí peptidového řetězce, snížení solvatace molekuly a tím i rozpustnosti bílkoviny. Srážení bílkovin, při kterém dochází k denaturaci bílkovin, může být vyvoláno např. i ionty těžkých kovů, které s bílkovinami vytvářejí sole nebo komplexní sloučeniny. Díky této schopnosti se mohou bílkoviny používat jako antidotum při otravách těžkými kovy. Denaturace bílkovin koncentrovanou kyselinou dusičnou se využívala jako Hellerova zkouška pro důkaz bílkovin v moči. V současné době se používá reakce s kyselinou sulfosalicylovou, která je nejcitlivější. Podobný účinek na bílkoviny jako kyselina sulfosalicylová mají i další silné organické kyseliny např. kyselina trichloroctová nebo pikrová, které slouží jako deproteinační činidla. Denaturaci způsobují i kvartérní alkylamoniové sole, které vytvářejí s negativně nabitými ionty bílkovin těžce rozpustné soli. Na tomto jevu jsou založeny desinfekční účinky Ajatinu (kvartérní amoniové sole s alkylem C8C18 jako substituentem). Podobnou strukturu a tedy i vlastnosti má i další desinfekční prostředek Septonex. Kationty těchto tenzidů se adsorbují na buněčné stěny mikrobů, denaturují jejich životné důležité bílkoviny a tím blokují transportní funkci membrány mikrobů. Ajatin, Benzododecinií bromidum: CH3  RN+CH2C6H5Brˉ  CH3

R = C8C18

63

POZOR! V následujících úlohách používejte jako bílkovinu roztok vaječného bílku. 3.1. Srážení těžkými kovy Pracovní postup:  Do zkumavky odlijte 1 ml bílkoviny a po kapkách přidávejte roztok octanu olovnatého dokud nevznikne sraženina. V nadbytku soli se sraženina rozpustí. 3.2. Srážení kyselinami Pracovní postup:  Do zkumavky odlijte 1 ml bílkoviny a přidejte několik kapek roztoku kyseliny sulfosalicylové, vytvoří se bílá sraženina. 3.3. Srážení Ajatinem Pracovní postup:  Do zkumavky odlijte 1 ml bílkoviny a po kapkách přidávejte roztok Ajatinu, dokud nevznikne sraženina. 3.4. Srážení varem Pracovní postup:  Do 5 zkumavek odlijte 1 ml bílkoviny a další reagencie dle návodu: zkumavka 1  pouze bílkovina zkumavka 2  přidejte kapku kyseliny octové 0,15 mol/l zkumavka 3  přidejte několik kapek kyseliny octové 1,5 mol/l zkumavka 4  přidejte několik kapek kyseliny octové 1,5 mol/l a malé množství chloridu sodného zkumavka 5  přidejte několik kapek roztoku hydroxidu sodného 2 mol/l  Zkumavky povařte ve vodní lázni.  Výsledky zapište do tabulky 1., vznik sraženiny označte +. Tabulka 1. zkumavka

1

2

3

4

5

sraženina

Poznámky:

64

ÚLOHA 4.

Důkaz některých složek bílkovin 4.1. Důkaz cukerné složky Molischovou zkouškou Mnoho bílkovin (např. řada plazmatických bílkovin) patří mezi glykoproteiny. Jejich prostetickou skupinu lze dokázat obecnou reakcí pro důkaz sacharidů - Molischovou zkouškou. Reakce je založena na dehydrataci sacharidů účinkem silných kyselin. Produkty této dehydratace snadno kondenzuji s fenoly na barevné sloučeniny. Pracovní postup:  Do zkumavky odlijte 1 ml roztoku séra, přidejte přibližně 0,5 ml Molischova činidla, promíchejte.  Po stěně zkumavky pomalu přidejte z dávkovače 1 ml koncentrované kyseliny sírové, aby došlo k podvrstvení roztoku. Na styčné ploše obou vrstev se v přítomnosti sacharidů vytvoří fialový prstenec. 4.2. Důkaz kyseliny fosforečné ve fosfoproteinech K důkazu lze použít reakci s molybdenanem amonným, která je vhodná k důkazu anorganického fosfátu stejně jako pro důkaz kyseliny fosforečné ve fosfolipidech (viz Vlastnosti a reakce biologicky a toxikologicky významných prvků a jejich sloučenin, úloha 2.1. ) Pracovní postup:  Do jedné zkumavky odlijte 1 ml roztoku kaseinu (před upotřebením zásobní roztok protřepejte), do druhé 1 ml roztoku vaječného bílku.  Ke každé bílkovině přidejte z dávkovače 0,5 ml kyseliny chlorovodíkové a protřepejte.  Po 2 min přidejte do každé zkumavky 1 ml roztoku molybdenanu amonného a zahřívejte na vodní lázni asi 2 min. V přítomnosti fosfoproteinů vznikne žlutý až oranžový zákal, případně sraženina. ` Poznámky:

65

ÚLOHA 5

Dialýza Dialýza je proces, který umožňuje pomocí polopropustné membrány oddělovat z roztoku látky nízkomolekulární od látek vysokomolekulárních. Na jejím principu je založena funkce umělé ledviny, kdy krev protéká soustavou dialyzačních trubic omývaných roztokem o specifickém složení iontů. Je samozřejmé, že ionty i ostatní nízkomolekulární látky mohou membránou procházet oběma směry. Schéma uspořádání:

Pracovní postup:  POZOR! Pro důkazy používejte vždy max. 1 ml roztoku!  Připravte si vroucí vodní lázeň pro důkaz dialyzovaných látek a fosforečnanů (viz Vlastnosti a reakce biologicky a toxikologicky významných prvků a jejich sloučenin, úloha 2.1)  Jeden konec dialyzační trubice připevněte kolíčkem na vnitřní okraj kádinky pro dialýzu.  Ve zkumavce smíchejte 1 ml séra, 2 ml roztoku močoviny a laktátu, přidejte 9 ml fyziologického roztoku.  7 ml takto připraveného roztoku vlijte do dialyzační trubice připevněné kolíčkem ke kádince. Zbytek roztoku použijte k důkazu látek přítomných v roztoku před dialýzou.  Druhý konec dialyzační trubice připevněte kolíčkem na protilehlou stranu kádinky.  Do kádinky nalijte roztok hydrogenuhličitanu sodného tak, aby dialyzovaný roztok byl ponořen ve vodě, dialýzu nechte probíhat 20 min.  Zbývající množství původního roztoku rozdělte do pěti zkumavek.

66

 V první zkumavce dokažte přítomnost chloridových iontů reakcí s roztokem dusičnanu stříbrného (viz Vlastnosti a reakce biologicky a toxikologicky významných prvků a jejich sloučenin, úloha 2.2.).  Ve druhé zkumavce dokažte přítomnost bílkovin reakcí s roztokem kyseliny sulfosalicylové (viz Bílkoviny I, úloha 3.2.).  Ve třetí zkumavce dokažte přítomnost močoviny: k 1 ml roztoku přidejte 2 ml činidla pro důkaz močoviny a zkumavku zahřívejte 10 min ve vroucí vodní lázni. Přítomnost močoviny se projeví vznikem červeného zbarvení. Tato reakce se rovněž používá i ke kvantitativnímu stanoveni močoviny v séru.  Ve čtvrté dokažte, zda jsou přítomny hydrogenuhličitany reakcí s roztokem dusičnanu barnatého (viz Vlastnosti a reakce biologicky a toxikologicky významných prvků a jejich sloučenin, úloha 2.1.)  V páté zkumavce dokažte přítomnost laktátu reakcí s Uffelmannovým činidlem: k 1 ml roztoku fenolu přidejte 1 až 2 kapky chloridu železitého (roztok se zbarví fialově).  Stejnými reakcemi dokažte přítomnost uvedených látek v dialyzátu i dialyzovaném roztoku po dialýze.  Výsledky zapište do tabulky I. Tabulka 1. roztok

Clˉ

HCO 3

močovina

laktát

bílkoviny

dialyzovaný roztok před dialýzou dialyzát dialyzovaný roztok po dialýze

Poznámky:

67

BÍLKOVINY II

Klíčová slova: elektroforéza, izoelektrický bod, amfolyty, vliv pH na ionizaci bílkovin, peptidová vazba, biuretová reakce, krevní plazma, krevní sérum, bílkoviny krevní plazmy, hypoproteinemie, hyperproteinemie, onkotický tlak, transportní proteiny, reverzibilní a irreverzibilní srážení bílkovin, iontová síla. Reagencie: 1. souprava Hydragel protein, SEBIA: a) Tris-barbitalový pufr pH 8,5 b) barvící lázeň – roztok amidočerni c) odbarvovací lázeň – roztok kys. citronové 0,05 g/l 2. standardní lyofilyzované bílkoviny pro ELFO ředěné fyziologickým roztokem dle komerčního návodu 3. vzorky krevního séra 4. souprava Celkové bílkoviny, BioSystems: a) biuretové činidlo: síran mědnatý 0,015 mol/l hydroxid sodný 1,0 mol/l Chelaton IIl 0,018 mol/l b) standardní roztok bílkoviny (koncentrace standardu podle aktuálního zadání) 5. souprava Albumin, Biosystems: a) pracovní roztok pro stanovení albuminu: bromkresolová zeleň 0,27 mmol/l citrátový pufr 0,1 mol/l, pH 4,1 b) standardní roztok albuminu (koncentrace standardu podle aktuálního zadání) 6. souprava QuikRead CRP, Orion diagnostika

68

ÚLOHA 1.

Elektroforéza bílkovin Elektroforéza je separační metoda umožňující rozdělit ve stejnosměrném elektrickém poli směs látek, které mají v roztoku elektrický náboj. Částice látek rozpuštěných v pufru o určitém pH migrují v nosiči k elektrodě s opačným nábojem. Rozdělení směsi, dané pohyblivostí částic, závisí na napětí mezi elektrodami, na typu nosiče, na velkosti částice a jejím náboji závislým na pH použitého pufru (při fyziologickém pH existuje většina proteinů ve formě aniontů). Pomoci připojeného densitometru lze odečíst po obarvení i množství látky v jednotlivých oddělených frakcích (viz Lipidy III, úloha 7.). Elektroforéza má široké použití nejen ve vědeckém výzkumu, ale je nepostradatelnou metodou i v klinicko-biochemických laboratořích. V této úloze budete používat pro elektroforézu bílkovin zařízení SEBIA. Proteiny jsou děleny na agarosovém gelu v Tris-barbiturátovém pufru o pH 8,5. Elektroforeogram je barven roztokem amidočerně. Pracovní postup: – – – – – – – – – – – – – –

Úmístěte Hydragel K20 aplikátorový nosič na rovnou plochu a zvedněte část s očíslovanými zuby (obr. A). Naneste 120 µl destil. vody na dolní třetinu rámečku vyznačené na nosiči aplikátoru. Z obalu vyjmětě agarosovou plotnu a rychle ji osušte filtračním papírem. Opřete plotnu okrajem o zarážku v dolní části vyznačeného rámečku – gelem k sobě. Gel ohněte a pokládejte tak, aby se voda rovnoměrně rozprostřela pod celým gelem bez tvorby vzduchových bublin. Gel musí být v rámečku zarovnán (obr. B). Snižte nosič aplikátoru očíslovanými zoubky dolů do střední polohy se západkou v horní poloze. Umístěte aplikátor na rovnou plochu s čísly jamek v pravé horní pozici (obr. C). Do jamek aplikátoru napipetujte rychle 10 µl vzorku. Vzorky je nutno napipetovat během 2 min. Odlomte ochranný rámeček zoubků aplikátoru. Umístěte aplikátor do pozice č. 5 na nosiči, čísla musí směřovat k obsluze (obr. D). Pomalu snižte nosič tak, aby se aplikátor dostal do kontaktu s povrchem gelu. Po 40 sec. aplikátor uvolněte, vyjměte a vyhoďte. Gelovou plochu vložte do migrační elektroforetické komory podle polarity vyznačené na gelu – dolní částí gelu na katodickou stranu. Při použití komory SEBIA K20 vložte plotnu do zubů můstku gelem dolů a ten pak ponořte do pufru (asi 1 cm). Připojte dělící komoru ke zdroji proudu.

PODMÍNKY DĚLENÍ Objem pufru ke každé elektrodě Celkový objem pufru Čas dělení Konstantní napětí Počáteční proud (na gel) –

SEBIA K20 150 ml 300 ml 20 min 90 V 12 ± 3 mA

Po migraci odpojte komoru a vyjměte gelovou plotnu.

69

– – – – –

Gel osušte v sušičce při 80° C asi 10 min. Usušený gel ponořte do barvícího roztoku amidočerně na 4 min. Odbarvěte ve 3 po sobě následujících lázních odbarvovacím roztokem (kys. citronové), dokud není pozadí zcela bezbarvé. Odsajte přebytečnou tekutinu z gelu filtračním papírem a vysušte gel při 80° C. Vyhodnoťte gel denzitometrem při 570 nm.

70

ELEKTROFORÉZA PLAZMATICKÝCH BILKOVIN

Obr.4. Elektroforéza plazmatických bílkovin FRAKCE Albumin Alfa-1 globuliny Alfa-2 globuliny Beta-1 globuliny Beta-2 globuliny Gama-globuliny

NORMÁLNÍ HODNOTY 59,4 – 74 % 1,2 – 3,1 % 7,0 – 12,2 % 4,9 – 9,4 % 1,6 – 5,6 % 6,9 – 14,7 %

Poznámky:

71

ÚLOHA 2.

Stanovení koncentrace bílkovin v séru Krevní plazma obsahuje asi 100 různých proteinů, podle jejich elektroforetických vlastností jsou obvykle rozdělovány do 5 různých skupin - albumin a 1, 2-, ß- a γglobuliny. Bílkoviny krevní plazmy kromě svých specifických funkcí zajišťují koloidně osmotický (onkotický) tlak, který má význam pro udržení normálního objemu krve. Dále se podílejí na udržování acidobazické rovnováhy a transportu lipofilních látek a iontů kovů. Většina plazmatických bílkovin je syntetizována v játrech (mimo imunoglobuliny a proteohormony). S výjimkou albuminu jsou bílkoviny krevní plazmy glykoproteiny. Za fyziologického stavu jsou plazmatické proteiny ve vzájemné rovnováze a neustále se obnovují. Za patologických stavů dochází k porušení této rovnováhy, a tím i ke změnám jejich koncentrace a vzájemného zastoupení jednotlivých frakcí (dysproteinemie) (viz úloha 1.). Koncentrace celkových bílkovin je snížená (hypoproteinemie) při jejich nedostatku v potravě, nedostatečném vstřebávání nebo syntéze, při jejich zvýšené spotřebě (např. u dlouhodobých infekčních onemocněních nebo u nádorových procesů) nebo ztrátě (u nefrotického syndromu, u popálenin, při silném krvácení). Zvýšená koncentrace bílkovin (hyperproteinemie) bývá např. při dehydrataci nebo paraproteinemii. Koncentrace celkové bílkoviny se stanovuje v krevním séru, jednou z používaných metod je biuretová reakce (viz. Bílkoviny I, úloha 1.). Intenzita modrofialového zbarvení komplexu se stanovuje spektrofotometricky a je přímo úměrná počtu peptidových vazeb. Jinou možností je UV spektroskopie, využívající absorbanci peptidové vazby při 280 nm. Pracovní postup:  Vzorek séra i standard zpracujte v tripletu, slepý vzorek jednou.  Do zkumavek napipetujte reagencie podle tabulky 1., malé objemy pipetujte ke dnu zkumavky! Tabulka 1. reagencie (ml) sérum standardní roztok bílkoviny destilovaná voda biuretové činidlo

vzorek 0,02 – – 1,5

standard – 0,02 – 1,5

slepý vzorek – – 0,02 1,5

   

Každou zkumavku dobře promíchejte. Přesně po 12 min změřte absorbanci při 540 nm proti slepému vzorku. Naměřené hodnoty zapište do tabulky 2. Z průměrných hodnot absorbance vzorku (Avz) a standardu (Ast) vypočítejte koncentraci celkové bílkoviny (g/l) v určeném séru.  Výsledek zapište do tabulky 2.

72

Tabulka 2. vzorek č.:

absorbance

průměr

c (g/l)

standard PROT sérum

Poznámky:

73

ÚLOHA 3

Stanovení koncentrace albuminu v séru Nejdůležitějším proteinem v krvi je z kvantitativního pohledu albumin (tvoří 60 % všech bílkovin krevní plazmy). Fyziologická funkce albuminu spočívá v regulaci plazmatického objemu, dále plní transportní funkci (přenáší např. mastné kyseliny, lipidy, bilirubin, některé hormony, vitaminy, ionty kovů, léky i toxické látky). Má i funkci rezervní bílkoviny a při zátěži organismu slouží jako bohatá rezerva aminokyselin, zvláště esenciálních. Zvýšená koncentrace albuminu v krvi (hyperalbuminemie) bývá obvykle jen sekundární následek dehydratace. Hypoalbuminemie doprovází mnoho onemocnění (např. infekce, choroby jater, nefrotický syndrom), biochemickou příčinou je bud' snížení jeho syntézy nebo zvýšení jeho odbourávání. Albumin se řadí mezi tzv. negativní proteiny akutní fáze podobně jako transferrin, glykoprotein přenášející krevní plazmou železo jako Fe3+. V akutní fázi je jejich koncentrace v plazmě nižší, protože na jejich úkor připadá zvýšená syntéza pozitivních proteinů akutní fáze (např. C-reaktivní protein). Ke stanovení albuminu je také vhodné sérum. Běžná metoda využívá reakce albuminu s bromkresolovou zelení, která tvoří s albuminem, v slabě kyselém prostředí a za přítomnosti povrchově aktivních látek, barevný komplex vhodný k fotometrování (s globuliny nereaguje). Pracovní postup:  Stanovení albuminu proveďte ve stejném séru, ve kterém jste stanovovali koncetraci bílkovin.  Vzorek séra i standard zpracujte v tripletu, slepý vzorek jednou.  Do zkumavek napipetujte reagencie podle tabulky 3., malé objemy pipetujte ke dnu zkumavky!

74

Tabulka 3. reagencie (ml)

vzorek

standard

slepý vzorek

sérum

0,01

–

–

standardní roztok albuminu

–

0,01

–

destilovaná voda

–

–

0,01

pracovní roztok

1,0

1,0

1,0

    

Každou zkumavku dobře promíchejte. Nechte inkubovat 10 min při pokojové teplotě. Změřte absorbanci vzorku i standardu při vlnové délce 630 nm proti slepému vzorku. Naměřené hodnoty zapište do tabulky 4. Z průměrných hodnot absorbance vzorku (Avz) a standardu (Ast) vypočítejte koncentraci albuminu (g/1) v určeném séru.  Výsledek zapište do tabulky 4. Tabulka 4. vzorek č.:

absorbance

průměr

c (g/l)

standard ALB sérum

VYHODNOCENÍ: Tabulka 5. vzorek séra č.: stanovovaná bílkovina

REFERENČNÍ HODNOTY

celková bílkovina (g/l)

65 - 85

albumin (g/l)

35 - 53

NAMĚŘENÉ HODNOTY

75

ÚLOHA 4. Stanovení koncentrace C-reaktivního proteinu (CRP) v séru C-reaktivní protein (CRP) je markerem akutní fáze zánětu. Normálně je přítomen v séru zdravých lidí v nízkých koncentracích - méně než 6 mg/l. Je produkován játry, jeho plazmatická koncentrace se zvyšuje již během 6–12 hodin po vypuknutí zánětlivého procesu a maxima dosahuje za 24–48 hodin. Vzestup koncentrace může být až 1000x vyšší proti fyziologické hodnotě. Stanovení CRP pomáhá určit, zda se jedná o infekci bakteriální nebo virovou a zvolit odpovídající způsob terapie. Zda zánět probíhá a v jaké fázi, určuje monitorování CRP. Vzhledem k tomu, že zánětlivým procesem reaguje náš organismus prakticky na cokoliv, jsou zvýšené bílkoviny akutní fáze a tedy i CRP poměrně častým nálezem. K jejich zvýšení dochází u infekcí jakéhokoliv původu, pooperačních stavů, u nádorových onemocnění i u autoimunitních chorob. Vyšší plazmatická koncentrace CRP také predikuje riziko infarktu myokardu nebo mozkové mrtvice. CRP byl objeven v roce 1930 Tilletem a Francisem, kteří zjistili, že séra některých akutně nemocných osob precipitují kapsulární C polysacharid bakterie Streptococcus pneumoniae. Sérový faktor, způsobující precipitaci, byl později identifikován jako protein a označen jako C-reaktivní protein. CRP aktivuje klasickou cestu komplementu a má funkci jako opsonin v leukocytové fagocytóze, stimulaci lymfocytů nebo aktivaci monocytů/makrofágů. CRP koncentrace v séru se zvyšují a snižují rychleji než sedimentace erytrocytů (FW), jako odpověď na změny ve stavu pacienta. Přetrvávající zvýšení hladiny CRP v plazmě indikuje neustávající zánět a obvykle znamená neúspěšnou terapii a špatnou prognózu (např. u maligních onemocnění, infekce a infarktu myokardu). Malé zvýšení CRP má predikční hodnotu pro výskyt kardiovaskulárních příhod u pacientů s koronárním srdečním onemocněním a stejně tak i u osob dosud zdravých. Ukazuje se, že má větší prognostický význam než hladina HDL a LDL. Stanovení koncentrace CRP je založeno na měření tvorby komplexu antigenu a protilátky. Reakci rozpustného antigenu s odpovídající protilátkou můžeme prokázat vznikem precipitátu v roztoku, V oblasti nadbytku protilátky je množství komplexu antigen-protilátka úměrné koncentraci přítomného antigenu. Stupeň zákalu roztoku se kvantitativně měří pomocí imunoturbidimetrie nebo imunonefelometrie. Pracovní postup:  Zapněte přístroj – na displeji se objeví NAČTĚTE KARTU a poté PŘIPRAVEN K MĚŘENÍ  Připravte si kyvetu s pufrem, sejměte ochranný kryt.  Sestavte si kapiláru – vsuňte píst do kapiláry tam, kde je na kapiláře modrý proužek.  Proveďte odběr krve z prstu, otřete první kapku se stopami desinfekce.  Přiložte kapiláru a další kapku krve nechte navzlínat po bílou zátku (20 ul), kapiláru zvenku pečlivě otřete.  Vložte kapiláru se vzorkem krve do kyvety s pufrem a vytlačte krev pístem.  Uzavřete kyvetu víčkem, které vyndáte z tuby. Pozor zatím nepromáčkněte modrý střed. Razantně promíchejte obsah kyvety – nepřevracejte kyvetu dnem vzhůru – obsah kyvety bude červeně čirý.  Vložte kyvetu do přístroje – na displeji se objeví MĚŘENÍ BLANKU (slepé zkoušky). Je-li vše v pořádku, asi po 30 s se na displeji objeví PŘIDEJTE ČINIDLO a VYNDEJTE KYVETU

76

 Promáčkněte modrý střed kyvety, která je stále v přístroji. Kyvetu vyndejte z přístroje a pečlivě promíchejte její obsah převracením dna vzhůru. Na displeji mezitím probíhá hlášení PROTŘEPEJTE OBSAH KYVETY.  Až se na displeji objeví hlášení VLOŽTE KYVETU, neprodleně vložte kyvetu s promíchaným obsahem zpět do přístroje.  Na displeji mezitím probíhá hlášení PROBÍHÁ MĚŘENÍ a během dvou minut se na displeji objeví výsledek koncentrace CRP v jednotkách mg/l.

Poznámky:

77

ENZYMY

Klíčová slova: biokatalýza, aktivita enzymu, holoenzym, apoenzym, koenzym, substrátová a reakční specifita enzymu, pH-optimum, sacharasa (EC 3.2.1.26), α-amylasa (EC 3.2.1.1.), iontová síla. Reagencie: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

roztok sacharasy (50 g kvasnic ve 100 ml ethanolu 500 g/1) roztok α-amylasy (sliny l0x zředěné destilovanou vodou a přefiltrované přes gázu) roztok škrobu 10 g/l suspenze celulosy 2,5 g/l roztok sacharosy 5 g/l Fehlingův roztok I (síran mědnatý 70 g/l Fehlingův roztok II (125 g hydroxidu sodného a 175 g vinanu sodnodraselného v 1 l vody) Lugolův roztok (roztok jodu 20 g/1 v roztoku jodidu draselného 40 g/l) 50x zředěný

9.

souprava ALP (BioSystems): a) pufr N-methyl-D-glukamin, pH 10,1 b) substrát 4-nitrofenylfosfat 92 mmol/l c) inhibitor EDTA 30 mmol/l v roztoku hydroxidu sodného 1 mol/l 10. sérum

78

-amylasa -amylasa (-1,4-glukan-4-glukan-hydroláza, EC 3.2.1.1) patří mezi glykosidasy. Glykosidasy náleží mezi hydrolytické enzymy, které jsou specifické vůči typu glykosidové vazby (α-glykosidasy nebo - glykosidasy) a sacharidu. Pomalu a nespecificky štěpí také inulin. Slinná α-amylasa je -glykosidasa a štěpí α-1,4-D-glukosidové vazby v substrátech obsahujících tři a více D-glukosových zbytků spojených vazbou α-1,4. V organismu je α-amylasa přítomna ve formě dvou izoenzymů kódovaných dvěma geny ležícími ve stejném lokusu (1p21). Podílí se na trávení sacharidů štěpením škrobu, částečně již v ústní dutině (slinná α-amylasa, S-amylasa), především však v duodenu (pankreatická α-amylasa, P-amylasa). Hladina celkové -amylasy je zvýšena u onemocnění akutní pankreatitidou, ale i u většiny případů bolestí břicha. Pro diagnostiku pankreatitidy má vyšší diagnostický přínos stanovení pankreatického izoenzymu (P-amylasy). Protože je molekula α-amylasy relativně malá, přestupuje do moči a můžeme její patologické zvýšení u akutní pankreatitidy detekovat i v moči. Toto zvýšení přetrvává déle a nastupuje později než zvýšení hladiny v séru. S-amylasa je zvýšena u onemocnění slinných žláz. Sacharasa z kvasnic štěpí β-fruktosidovou vazbu mezi fruktosou a glukosou v sacharose, která je α-D-glukopyranosyl-β-D-fruktofuranosid. Cílem této úlohy je prokázat přítomnost produktů štěpení slinnou α-amylasou a sacharasou. Produkty hydrolytické reakce budou mít volné anomerní hydroxylové skupiny, a tudíž budou redukovat Fehlingovo činidlo. Polysacharidy můžeme prokázat reakcí s Lugolovým činidlem (roztok jodu), zatímco produkty enzymatické hydrolýzy tuto reakci neposkytují.

79

ÚLOHA 1.

Důkaz substrátové specifity glykosidas (sacharasy a α-amylasy) Pracovní postup: POZOR! Substráty před použitím protřepejte! – Jako -amylasu použijte sliny l0x zředěné destilovanou vodou a přefiltrované přes gázu. – Do označených zkumavek připravte směs substrát - enzym podle tabulky 1. – Nechte 30 min inkubovat při 37° C, potom reakci ukončete vyndáním z vodní lázně. – S polovičním množstvím inkubační směsi z každé zkumavky proveďte reakci s Fehlingovým činidlem (poměr činidlo : inkubační směs = 1:1). – – Ve zkumavkách, ve kterých byl jako substrát polysacharid, proveďte také reakci s jodem. – Stejnou reakci s jodem proveďte i s nativními polysacharidy a porovnejte zbarvení. – Výsledky zaneste do tabulky 1. pomocí symbolů + a –. Tabulka 1. zkumavka škrob (ml)

1 1

celulosa (ml) sacharosa (ml) sacharasa (ml) -amylasa (ml) Fehlingova reakce reakce s jodem

2

4 



 1

 0,25 

5 1

6

8 



 0,25

 1

 1





 1

0,25





 0,25

 0,25

 0,25

Poznámky:

ÚLOHA 2.

80

Stanovení Michaelisovy konstanty (Km) pro enzym alkalická fosfatasa Michaelisova konstanta s určitou dávkou zjednodušení odráží afinitu enzymu k substrátu. Čím je její hodnota nižší, tím vyšší je afinita k příslušnému substrátu. Číselně tato hodnota odpovídá koncentraci substrátu, při které je rychlost reakce rovna polovině rychlosti maximální (limitní). Pro určení Km se měří počáteční rychlost enzymové reakce při nejméně pěti různých koncentracích substrátu, ležících v rozmezí alespoň jednoho řádu zvolené koncentrační oblasti, všechny ostatní faktory (pH, teplota a množství enzymu) musí být konstantní. Ze získaných hodnot sestrojíme graf závislosti počáteční rychlosti reakce na koncentraci substrátu (saturační křivka podle Michaelise a Mentenové).

Graf 1. Závislost A na [S]. Jelikož z tohoto grafu se Km nedá přímo přesně odečíst, vyneseme do grafu i reciproké hodnoty koncentrace substrátu a rychlosti (linearizace podle Lineweavera a Burka). V místě kde nám graf protne osu x získáme hodnotu -1/Km.

81

Graf 2. Závislost 1/A na 1/[S]. Enzym reagující s různými substráty má pro jednotlivé substráty různou hodnotu Km. Např. Km alkoholdehydrogenasy pro ethanol je menší než pro methanol. Tento rozdíl se využívá při léčbě otravy methanolem. Také izoenzymy, katalyzující reakci s jedním substrátem, se mohou lišit hodnotou Km. Glukokinasa, fosforylující glukosu v jaterních buňkách, má Km asi 10 mmol/l, kdežto hexokinasa, která je přítomná ve všech buňkách, má Km pro glukosu asi 0,1 mmol/1. Tuto skutečnost využívá organismus jako jednu z možností regulace metabolismu glukosy.

Alkalická fosfatasa (ALP) v lidském organismu Alkalická fosfatasa odštěpuje fosfátové skupiny (zbytky kyseliny fosforečné) především z molekul proteinů a nukleových kyselin. Enzym má pH optimum v alkalické oblasti. ALP se vyznačuje velkou tkáňovou nespecifitou a vyskytuje se téměř ve všech tkáních těla ve formě izoenzymů a enzymových izoforem, například v játrech, ledvinách, kostech, střevě a placentě. Isoenzymy ALP jsou kódováné 4 geny: ALP-L (L,B,K), ALP-I, ALP-P, ALP-PL (GALP). Tentýž gen může produkovat izoformy, které se liší stupněm glykace a sacharidovou strukturou. 1. Tkáňově nespecifická alkalická fosfatasa (TNAP), ALP-L/B/K nebo také jaterní zahrnuje 3 základní izoformy lišící se glykací: játra L (L1,2), kost (B), ledvina (K) L (liver) - je částečně inaktivována (30 %) při 56°C/10 min B (bone) – je úplně inaktivována při 65°C/10 min 2. Intestinální alkalická fosfatasa, ALP-I (I1-3), vyskytuje se ve 3 izoformách a je tvořena vě střevu. Není glykosylovaná a je inhibována L‑fenylalaninem. 3. Placentární alkalická fosfatasa se vyskytuje ve 2 izoformách: a) ALP-P (P1) tvořená v placentě. Je glykosylovaná a termostabilní Zvýšeně je exprimována na konci 3. trimestru b) Pseudoplacentární alklalická fosfatasa, (Placenta Like Alkaline Phosphatase – PLAP, ALP-PL, ALP-P2) je glykosylovanou dimérní izoformou ALP-P, 82

produkovánou především v germinálních buňkách – GALP (germinal alkaline phosphatase) a embryonální tkáni. Vyskytuje se také v testis, thymu a určitých nádorech z germinálních buněk, např. seminom, embryonální karcinom Tabulka č. 3 ukazuje základní charakteristiky izoenzymů a izoforem ALP: Tabulka 3. Vliv teploty a inhibitorů na izoenzymy AP: Izoenzym AP

Teplota

PLAP/GCAP

stabilní ještě při 70°C

IAP Kostní izoforma TNAP

stabilní ještě při 56°C labilní při 55°C

Jaterní izoforma TNAP Ledvinová izoforma TNAP

Specifické inhibitory neuramidáza, deoxycholát sodný, L-fenylalanin L-fenylalanin. L-tryptofan

L-homarginin. při 55°C stabilnější než neuramidáza, deoxycholát kostní izoforma sodný labilní již při 45°C

Příslušné izoenzymy a isoformy alkalické fosfatasy ukazuje obrázek č. 1.

Obrázek č. 1. Genová lokalizace, isoenzymy a izoformy alkalické fosfatasy ALP-L (jaterní) se učastní transportních procesů přes membránu a je vázána v cytoplasmatické membráně hepatocytů přivrácené do žlučových cest.

83

ALP-B (kostní) je součástí membrány osteoblastů, účastní tvorby kostní architektuy a podílí se na zabudovávání Ca2+. ALP-K (ledvinová, kidney) je lokalizovaná vo membráně ledvinových tubulárních buněk ALP-I (střevní) se podílí na přenosu mastných kyselin a absorpci Ca 2+. Normální zastoupení ALP v krvi (séru, plasmě): ALP-L (L1,2) – 30 - 50 % ALP-B – 60 - 70 % ALP-K – normálně se v séru nevyskytuje ALP-I (I1-3) – <20 % ALP-P (P1,2) – objevuje se v těhotenství Aktivita ALP v séru se zvyšuje v důsledku mnoha patologických stavů a pro správnou diagnostiku je nutné odlišit tkáň, ze které detekovaný enzym pochází. Zvýšení jaterní ALP je charakteristické pro obstrukci žlučových cest. Důvodem této obstrukce je nejčastěji žlučový kámen nebo zhoubný nádor bránící volnému odtoku žluči. Aktivita kostní ALP se zvyšuje v důsledku některých kostních chorob (osteomalacie, Pagetova choroba, osteblastické sarkomy). ALP je fyziologicky je vyšší u dětí a mění se s věkěm. Patologické změny v zastoupení ALP v krvi (séru, plasmě): ALP-L – cholestáza, zánět žlučových cest (cholecystitis a cholangoitis), hepatopatie, nádory – zejména hepatom ALP-B – osteosarkom (osteoblastický), osteopatie, systémové choroby, některé nádory; terapie osteoporózy ALP-I – diabetes mellitus, nádory střeva, jaterní cirhosa, renální insuficience ALP-P – epiteliální karcinom ovaria, žaludku, pankreatu, sarkomy Při stanovení Km alkalické fosfatasy se sleduje počáteční rychlost štěpení různých koncentrací substrátu (4-nitrofenylfosfátu) konstantním množstvím enzymu. Přírůstek produktu reakce 4- nitrofenolu je úměrný rychlosti enzymové reakce.

84

Pracovní postup: Do 6 označených zkumavek „eppendorf“ nařeďte substrát dle tabulky 3. Napipetujte do zkumavky č. 1 0,6 ml neředěného substrátu. Do "eppendorfek" 2 - 6 napipetujte 0,3 ml destilované vody. Z "eppendorfky" č. 1 odpipetujte 0,3 ml základního roztoku substrátu do "eppendorfky" č. 2 a promíchejte. – Od "eppendorfky" č. 2 postupujte při ředění substrátu analogicky vždy odpipetujte 0,3 ml roztoku z předcházející "eppendorfky" do následující a dobře promíchejte. – – – –

Tabulka 3. zkumavka č.

4-nitrofenylfosfát

1 2 3 4 5 6

substrát ředění 1 ředění 2 ředění 3 ředění 4 ředění 5

substrát ml 0,6 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3

destil. voda ml – 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3

c mmol/l 92 46 23 11,5 5,75 2,88

– Do 7 nových skleněných zkumavek napipetujte 1 ml pufru - do zkumavky č. 1  6 přidejte 0,02 ml séra. – Zkumavky 1 - 7 inkubujte ve vodní lázni 5 min při 37 C. – Z každé "eppendorfky" 1 – 6 odpipetujte 0,2 ml substrátu do skleněných zkumavek. Zkumavky nevyndávejte z vodní lázně! – Dodržujte 30 sec interval mezi přidáním do jednotlivých zkumavek. – Do zkumavky č. 7 (slepá zkouška) napipetujte 0,2 ml neředěného substrátu (92 mmol/l). – Zkumavky inkubujte 15 min při 37° C. – V 30 sec intervalech vyndávejte zkumavky z vodní lázně a do každé zkumavky přidejte 0,5 ml roztoku inhibitoru. – Do zkumavky č. 7 ( slepá zkouška ) napipetujte 0,02 ml séra. – Do 30 min změřte absorbanci při 420 nm proti slepé zkoušce  výsledky zapište do tabulky č. 4.

85

Tabulka č 4. zkumavka č. 1 2 3 4 5 6

[Sr] 15,00 7,50 3,77 1,88 0,94 0,47

A

1/[S]

1/A

[Sr] je výsledná koncentrace substrátu v reakční směsi, tj. koncentrace připravených zásobních roztoků substrátu vynásobená 0,164 (0,2/1,22). – Na milimetrový papír sestrojte ze získaných hodnot (S], A, 1/[S] a 1/A dva grafy a určete hodnotu Km jako látkovou koncentraci 4-nitrofenolu. Závislost A na [S] (exp.):

Hodnotu Km odečtěte na ose x jako souřadnici průsečíku spojnic odpovídajících hodnot A a [S].

86

Závislost 1/A na 1/[S] (exp.):

Hodnotu –1/Km zjistěte z úseku na ose x, který vytíná přímka proložená experimentálními body.  Výsledky zapište do tabulky 5 a porovnejte získané hodnoty K m. Tabulka 5. graf Km (mmol/l)

1

2

Poznámky:

87

NUKLEOVÉ KYSELINY I

Klíčová slova: biopolyméry, DNA, RNA, nukleoproteiny, vysolování. Reagencie: 1. Wizard Genomic DNA Purification Kit, Promega: a) Cell Lysis Solution b) Nuclei Lysis Solution c) Protein Precipitation Solution 2. isopropanol 3. 70% ethanol 4. redestilovaná voda (ddH2O)

88

ÚLOHA 1.

Izolace genetického materiálu Prvním krokem molekulárně-biologických analýz je izolace genetického materiálu – DNA a RNA. Práce s genetickým materiálem přináší některé zvláštní aspekty. Detekcí dědičných, charakteristik genetického materiálu konkrétního jedince se získávají velmi citlivá osobní data, se kterými je nutné zacházet náležitým způsobem. Na rozdíl od většiny biochemických vyšetřeni, která jsou dynamickým obrazem aktuálního dění v těle vyšetřované osoby, vyšetření genetického materiálu přináší informace o neměnných charakteristikách jedince, nebo i celých rodin. Izolace DNA Izolaci genomové DNA lze provést z libovolného materiálu obsahujícího jaderné buňky. Nejčastěji je genomová DNA izolována z periferní nesrážlivé krve, kde se nachází v leukocytech. Při izolaci DNA z tkání je nejprve nezbytné rozrušit tkáň na jednotlivé buňky (tento krok odpadá při izolaci DNA z krve / kostní dřené nebo buněčné suspenze), lyzovat cytoplazmatickou a jadernou membránu buněk a uvolnit DNA z nukleoproteinových komplexů. DNA se následně z roztoku vysráží pomocí isopropanolu nebo ethanolu. Sražená DNA se po vysušení rozpustí v redestilované vodě. Pro izolaci genomové DNA použijeme Wizard® Genomic DNA Purification Kit firmy Promega). Izolace probíhá ve čtyřech krocích: 1. lýza erythrocytů pomocí Cell Lysis Solutio 2. lýza leukocytů a jejich jader pomocí Nuclei Lysis Solution 3. precipitace proteinů účinkem Protein Precípitation Solution 4. vysrážení DNA isopropanolem Práce s genetickým materiálem klade vysoké nároky na přesnost a čistotu laboratorních postupů. Základem většiny analýz nukleových kyselin je amplifikace cílového úseku DNA/cDNA. Amplifikace znamená zmnožení cílové sekvence v řádech 10 5  107. Z tohoto důvodu je nezbytné zachovávat přísně sterilní podmínky (práce v rukavicích, sterilní roztoky, sterilní zkumavky, špičky), aby analyzovaný genetický materiál nebyl kontaminován cizorodou DNA (např. jiným vzorkem), nebo DNA z "vnějšího prostředí".

89

Izolace DNA z bukální sliznice Dnes se pro molekulárně genetické vyšetření stále častěji používá stěru z bukální sliznice, který je zcela neínvazivní a je snadno proveditelný i neodborníkem. Pro izolaci se používají výše uvedené reagenční systémy. Pracovní postup:  Vzorky bukální sliznice získejte stěrem buněk bukálni sliznice krouživým pohybem pomocí speciální stěrky Před odběrem si vypláchněte ústa vodou. Doporučená doba mezi odběrem a posledním příjmem potravy je nejméně 10 min.  Stěrku vložte do 2 ml zkumavky s 300 µl Nuclei Lysis Solution a 10 µl Proteinasy K, ulomte horní část stěrky.  Zkumavku protřepejte na vortexu a inkubujte 15 min při 65° C.  Centrifugujte 1 minutu při 13 000 ot./min (maximální rychlost).  Supernatant odpipetujte do nové 1,5 ml zkumavky, roztok je viskózní.  Připipetujte 100 µl Protein Precipitation Solutíon a ihned intenzívně zvortexujte 20 s.  Centrifugujte 3 minuty maximální rychlostí.  Opatrně odpipetujte supernatant obsahující DNA do čisté eppendorfky. Pelet se zkumavkou vyhoďte.  K supernatantu přidejte 300 µl isopropanolu a zkumavku opatrně obracejte, dokud neuvidíte formující se sraženinu DNA.  Centrifugujte 4 min maximální rychlostí.  Na dně je viditelný pelet DNA. Supernatant opatrné slijte do odpadní kádinky tak, abyste nevylili pelet a osušte ústí eppendorfky na filtračním papíru.  K peletu připipetujte 300 µl 70% ethanolu. Eppendorfku několikrát jemně převraťte pro omytí peletu.  Centrifugujte 1 min maximální rychlostí.  Supernatant opatrně slijte do odpadní kádinky. Osušte opatrně vnitřek eppendortky filtračním papírem srolovaným pomocí pinzety do ruličky tak, abyste se nedotkli peletu.  Otevřenou eppendorfku otočte dnem vzhůru a nechte stát na stole, dokud se neodpaří zbytky ethanolu (cca 10 minut). K peletu DNA připipetujte 40 µl redestilované H 2O.  Zkumavku uzavřete a jemně zvortexujte  Opatřete zkumavku přiděleným číslem a odevzdejte praktikovému asistentovi.  Izolovaná DNA se uchovává při 4° C pro další analýzy. Poznámky:

90

NUKLEOVÉ KYSELINY II

Klíčová slova: nukleové kyseliny, DNA, integrita, spektrofotometrie absorpční maximum, gelová elektroforéza. Reagencie: 1. 2. 3. 4.

vzorkový pufr (0,25% bromfenolová modř , 0,25% xylencyanol , 30% glycerol) TAE pufr ( Tris- acetát 0,04 mol/l, EDTA 0,001 mol/l) 2,5% agarosový gel v 1 x TAE obsahující GelRed Nucleic Acid Gel Stain (Biotium) redestilovaná H2O (ddH2O)

91

ÚLOHA 1.

Stanovení koncentrace a čistoty nukleových kyselin Pro další analýzy je nutné určit koncentraci izolované nukleové kyseliny a ověřit její čistotu a kvalitu - integritu (neporušenost). Koncentrace nukleových kyselin se určuje spektrofotometricky. Nukleové kyseliny absorbují v důsledku přítomnosti dusíkatých bází v ultrafialové oblasti spektra s absorpčním maximem při 260 nm. Pro určení koncentrace vycházíme z toho, že při měření v 1 cm kyvetě je optická denzita: 1 OD260 nm dsDNA = 50 µgml-1 1 OD260 nm RNA = 40 µgml-1 1 OD260 nm ssDNA = 33 µgml-1 Vzhledem k tomu, že izolované nukleové kyseliny mohou být často kontaminovány proteiny, které dosahují absorpčních maxim při 280 nm, provádíme při stanovení koncentrace nukleových kyselin i vyhodnocení poměru OD260 nm/280 nm. Tento poměr by u čistého roztoku DNA měl dosahovat hodnot kolem 1,8. K ověření integrity nukleové kyseliny slouží gelová elektroforéza. Elektroforézu lze provádět v agarosovém nebo polyakrylamidovém gelu. Výběr gelové matrice záleží na délce analyzované nukleové kyseliny. Pro běžné analýzy DNA používáme agarosový gel, který je schopen separovat DNA fragmenty od 100 bp do 20 kbp. Pro fragmenty kolem 100 bp a kratší a pro analýzy proteinů používáme gely založené na bázi akrylamidu. Určení velikostí analyzované DNA/RNA se provádí porovnáním s velikostním standardem DNA/RNA o známé délce fragmentů. Pro vizualizaci dvouřetězcových nukleových kyselin se užívá eihidiumbromid - interkalační činidlo, které se vmezeřuje mezi planárně orientované báze DNA/RNA spojené vodíkovými můstky (obr. 5.). Po prosvětlení gelu UV světlem emituje ethidiumbromid viditelné jasně oranžové světlo v místech jeho vysoké koncentrace, tedy v místech, kde se nachází DNA.

Obr. 5. Vizualizace nukleových kyselin pomocí ethidiumbromidu. Pro vizualizaci dvouřetězcové i jednořetězcové DNA nebo RNA v agarosových i polyakrylamidových gelech lze místo mutagenního ethidiumbromidu použít fluorescenčního barviva GelRed, které má navíc i vyšší citlivost.

92

1.1. Měření koncentrace DNA Pracovní postup: 1.1.1. Měření na spektrofotometru NanoDrop 1000 (Thermo Scientific) –

Zvedněte „vzorkové rameno“ přístroje a pipetou (0 – 2 µl) naneste na dolní měřící plošku 1 µl vzorku DNA (viz obr.)

 Přiklopte „vzorkové rameno“ a na obrazovce počítače odečtěte koncentraci vzorku DNA a poměr její čistoty 260/280 nm.  Před dalším měřením obě měřící plošky otřete čtverečkem buničiny. 1.1.2. 1.1.1. Měření na spektrofotometru Jenway Genova  Zkumavku se vzorkem DNA krátce promíchejte na vortexu a zcentrifugujte.  Do sterilní označené 0,5 ml eppendorfky napipetujte 190 µl redestilovné H 2O a přidejte 10 µl DNA.  Promíchejte na vortexu a zcentrifugujte při 13 000 ot/min.  Do spektrofotometrické 100 µl mikrokyvety odměřte 100 µl roztoku DNA a změřte OD260 nm a OD280 nm. Výsledek zapište do tabulky 1.  Z mikrokyvety odsajte pipetou zpět 100 µl roztoku DNA.  Vypočítejte koncentraci DNA podle vzorce: cDNA µg/ml] = OD260 nm x 50 x ředění  Vyhodnoťte čistotu DNA pomocí poměru OD260 nm/280 nm.

93

Tabulka 1. vzorek č.

OD260 nm

OD280 nm

µg/ml

OD260 nm/280 nm

1.2. Kontrola integrity DNA elektroforézou v agarosovém gelu Vzorek smíchaný s vzorkovým pufrem se nanáší do jamek v agarosovém gelu umístěného v elektroforetické vaně obsahující lx TAE pufr. Vzorkový pufr obsahuje glycerol, který je zde proto, aby při pipetování vzorku klesal vlivem zvýšené hustoty roztok analyzované DNA na dno jamky. Barevná komponenta ve vzorkovém pufru je směs dvou barev – bromfenolové modři a xylencyanolu a slouží pro vizuální kontrolu migrace molekul v průběhu elektroforézy. Bromfenolová modř se pohybuje stejnou rychlostí jako dsDNA o velikosti 300 bp, kdežto xylencyanol jako dsDNA dlouhá 4 kb. Pohyb molekul DNA v gelu ve stejnosměrném elektrickém poli (7 V/cm délky gelu) závisí nepřímo na logaritmu délky DNA fragmentů. Pracovní postup:  Do označené 0,2 ml eppendorfky napipetujte 3 µl modrého vzorkového pufru a 3 µl vaší DNA.  Promíchejte na vortexu a krátce zcentrifugujte při 13 000 ot/min.  Naneste celý objem vzorku (6 µl) na dno jamky v agarosovém gelu umístěném ve vaně s 1 x TAE pufrem.  Zaznamenejte si číslo jamky (zleva) s vaším vzorkem DNA.  Připojte elektroforetickou vanu na zdroj el. proudu (cca 100 V).  Elektroforézu ukončete při vyputování bromfenolové modři z gelu.  Vyjměte gel a zkontrolujte jej pod UV světlem.

Poznámky:

94

NUKLEOVÉ KYSELINY III

Klíčová slova. genetický kód, polymerasová řetězová reakce - PCR, RT-PCR, real-time PCR, polymorfismus, bodové mutace, apolipoprotein E, restrikční enzymy, rekogniční místo, restrikční fragmenty, palindrom, fragmenty s kohezními a tupými konci, izoschizomery, gelová elektroforéza, ethidiumbromid. Reagencie: 1. mastermix [obsahuje 1 U Faststart Taq DNA Polymerase (Roche), 2,5 µl 10x PCR buffer, 2,5 µl 50x dTP (2,5 mM každého] 2. restrikční mix (APOE) : 10x restrikční pufr s MgCl2, bovinní sérový albumin v koncentraci 1 µg/µl a 0,25 U restrikční endonukleasy HhaI), 3. vzorkový pufr (0,25% bromfenolová modř, 0,25% xylencyanol, 30% glycerol) 4. TAE pufr (Tris- acetát 0,04 mol/l, EDTA 0,001 mol/l) 5. 2,5% agarosový gel v 1x TAE obsahující GelRed Nucleic Acid Gel Stain (Biotium)

95

PCR – polymerasová řetězová reakce Podstatou PCR je opakující se enzymová syntéza nových řetězců vybraných úseků dvouřetězcové DNA, ke které dochází po připojení dvou primerů vázajících se na protilehlé řetězce DNA tak, že jejich 3´OH-konce směřují proti sobě. Jako primery se obvykle používají dva uměle připravené krátké oligonukleotidy o délce 16 - 30 bází, odvozené z koncových sekvencí DNA určených k amplifikaci. Podmínkou pro jejich syntézu je znalost sekvence studované nukleové kyseliny. Primery ohraničující amplifikovanou oblast, slouží jako iniciátory polymerační reakce a jsou DNA polymerasou prodlužovány ve směru 5´3´. Provedení vlastní PCR trvá přibližně 2 hodiny a kompletní analýza prováděná například pro diagnostické účely obvykle nepřesáhne 48 hodin. Podle typu výchozího templátu rozeznáváme dvě varianty polymerasové řetězové reakce: DNA-PCR a RNA-PCR (reverzní PCR, RT-PCR). Obě metody nacházejí široké uplatnění ve výzkumu i v klinické diagnostice. DNA-PCR DNA-PCR je určena pro selektivní amplifikaci vybraných úseků DNA in vitro. Principem metody je amplifikace cílových úseků DNA vymezených primery mnohonásobným opakováním cyklů PCR (Tab. 1.). Každý cyklus tvoří 3 periody: 1. tepelná denaturace cílové DNA 2. vazba primerů hybridizací ("annealing") s jednořetězcovýmitempláty 3. extenze (elongace) primerů pomocí termostabilní DNA-polymerasy. Tabulka 1. REAKČNÍ PODMÍNKY teplota čas 1. CYKLUS 1. ÚVODNÍ DENATURACE 94 - 96°C 3 - 10 min 2. VAZBA PRIMERŮ (annealing) 50 - 65°C 30 - 60 sec 3. EXTENZE – POLYMERACE 72°C 30 - 60 sec 2. - 40. CYKLUS 1. DENATURACE 94 - 96°C 25 - 35 sec 2. VAZBA PRIMERŮ (annealing) 50 - 65°C 30 - 60 sec 3. EXTENZE – POLYMERACE 72°C 30 - 60 sec POSLEDNÍ CYKLUS 1. DENATURACE 94 - 96°C 25 - 35 sec 2. VAZBA PRIMERŮ (annealing) 50 - 65°C 30 - 60 sec 3. EXTENZE – POLYMRACE 72°C 3 - 10 min 4. OCHLAZENÍ 5°C dle potřeby PERIODA

První cyklus PCR má vždy prodlouženou denaturační fázi a poslední cyklus fázi polymerační. Účelem je účinná aktivace termostabilní polymerasy a terminální elongace produktu PCR. Původně se používala jako polymerační enzym termolabilní DNA-polymerasa I z E. coli, která se však inaktivuje vysokou teplotou (94°C) v denaturační periodě. Enzym se 96

proto musel znovu přidávat v každém cyklu. Problém odstranilo zavedení termostabilní DNA-polymerasy, Taq DNA-polymerasy, izolované z termofilní bakterie Thermus aquaticus. Enzym je aktivní při teplotách 37 - 80°C, má také 5´3´ exonukleasovou aktivitu, postrádá však 3´5´ exonukleasovou aktivitu. Polymerační rychlost je 2 - 4 kbp/min.V současné době se používají rekombinantní enzymy. Cílový úsek molekuly DNA je po tepelné denaturaci vymezen dvěma oligonukleotidovými primery, které hybridizují s komplementárními sekvencemi na okrajích studovaného segmentu (jeden je komplementární k "+" vláknu a druhý k "-" vláknu DNA). Primery nesmí obsahovat vzájemně komplementární úseky a jim odpovídající sekvence se musí v analyzované DNA vyskytovat pouze v jediné kopii. Ideální primery by měly mít přibližně shodné zastoupení pyrimidinových a purinových bází . Koncentrace primerů a teplotní podmínky pro jejich nasednutí (annealing) na templát se pohybují v rozmezí 50 - 65° C (podle zastoupení nukleotidů v primeru). Teplotní optimum pro prodlužování (elongaci primerů se v závislosti na nukleotidovém složení templátu obvykle pohybuje mezi 70° - 75° C. K prodlužování primeru dochází již během jeho asociace s templátem, což je důležité pro stabilizaci vznikajícího hybridu. Primery musí být vzhledem ke koncentraci amplifikované DNA přítomny v reakční směsi v nadbytku.

Obr. 1. První 3 cykly klasické PCR. Jelikož produkty každého cyklu PCR slouží zároveň jako templáty pro následující cykly, narůstá každým opakováním počet kopií amplifikované oblasti exponenciálně (2 n). Po třetím cyklu jsou produkovány převážně řetězce, jejichž délka odpovídá úseku DNA ohraničenému

97

primery. Většinou postačuje 30 - 35 cyklů, během nichž se může specifická sekvence amplifikovat teoreticky až 1011krát Automatické opakování jednotlivých cyklů umožňují speciální programovatelné a procesorem řízené termostaty, tzv. PCR-termocyklery (obr.2), ve kterých lze dosáhnout přesně definovaných změn inkubačních teplot během krátkých intervalů (s rychlostí změny přibližně 1°C/sec). Délka amplifikovaných úseků činí většinou několik desítek, set bází až 10 kb, za speciálních podmínek lze dosáhnout až 47 kb. Současně se vzorky provádí tzv. negativní kontrola (kompletní reakční směs bez templátu). Amplifikované úseky DNA se nejčastěji analyzují elektroforeticky v agarosovém gelu a zviditelňuje se ethidiumbromidem nebo fluorescenčním barvivem GelRed. K průkazu bodových mutací v produktu PCR slouží elektroforéza v gradientu denaturující látky a sekvenování.

Obr. 2. MJ Research PTC-100 Thermal Cycler RNA-PCR (RT-PCR) Techniku PCR lze rovněž použít při analýzách RNA-molekul, zejména při studiu expresní aktivity genu a průkazu RNA virů, např. viru hepatitidy C (HCV, VHC). Reverzní transkriptasová PCR se může provádět dvěma způsoby: 1. Dvoukroková RT-PCR a) Dvouzkumavková, dvoukroková RT-PCR b) Jednozkumavková, dvoukroková RT-PCR 2. Jednokroková, jednozkumavková RT PCR Pro RT-PCR se používají reverzní transkriptasy viru ptačí myeloblastosy (Avian myeloblastosis virus - AMV) nebo Moloneyové viru myší leukemie (např. Moloney murine leukemia virus - M-MLV). Při dvojkrokové, dvouzkumavkové RT-PCR (obr. 3) se používají dva polymerační systémy, jeden s reverzní transkriptasou v jedné zkumavce a druhým je klasická PCR s termostabilní DNA-polymerasou ve druhé. V první zkmavce se pomocí reverzní transkriptasy nasyntetizuje jednovláknová komplementární DNA (cDNA) při použití oligodT nebo random hexanukleotidů jako primerů. Druhým krokem v další zkumavce, po přidání ekvivalentního množství cDNA z předchozí reverzní reakce a dvou sekvenčně specifických primerů, je amplifikace cDNA klasickou PCR. Jednokroková RT PCR se provádí v jednom systému obsahujícím oba enzymy, reverzní

98

transkriptasu i termostabilní DNA polymerasu. Reakce se provádí nejprve při teplotě 55° C a je syntetizováná cDNA, potom nastupuje klasická PCR. Schéma RT PCR ukazuje obr. 3.

Obr. 3. Schéma RT PCR Uplatnění PCR v klinické diagnostice PCR umožňuje přímo identifikovat v infikovaném biologickém materiálu přítomnost velmi malých množství DNA virových nebo bakteriálních patogenů. Proto nachází široké uplatnění v rychlé mikrobiologické a virologické diagnostice u řady infekčních onemocnění, zejména těch, jejichž původci se obtížně nebo zdlouhavě kultivují (chlamydie, mykobakterie, Treponema pallidum, legionelly, virů hepatitidy B a C, lidského papilomového viru HPV, HIV atd.). PCR a následná analýza amplifikovaných sekvencí jsou důležité při identifikaci osob v kriminalistice, při potvrzování rodičovství v paternitních sporech a při typizaci biologického materiálu (DNA-fingerprinting). Výhodou je potřeba minimálního množství biologického materiálu (postačující je jediný vlas, kapka krve, spermatu, potu či slin atd.). Vzhledem k vysoké stabilitě DNA lze amplifikaci a analýzu provádět i ve vzorcích, jejichž stáří může dosahovat tisíců let (antropologické, paleoantropologicé i paleozoologické studie). V onkologii slouží PCR k detekci mutací některých genů, u nichž se předpokládá vztah k maligní transformaci buňky. Detekcí tzv. minimálního rezidua nádorové choroby prokázat přetrvávání nádorové choroby po provedené terapii. U hematologických maligních onemocnění se PCR a RNA-PCR uplatňuje zejména při zjišťování chromosomových translokací (např. translokace mezi chromosomy 9 a 22 u chronické myeloidní leukemie - Philadelphský chromosom). Širokého uplatnění dosáhla PCR v prenatální diagnostice dědičných onemocnění, kde poskytuje přímou informaci o eventuálním postižení plodu. Významně časově zkrátila detekci bodových mutací, které jsou častou příčinou těchto chorob. Materiálem pro izolaci DNA jsou buňky amniové tekutiny nebo choriových klků a cirkulující fetální DNA v maternální krvi. Pomocí PCR lze také z minimálního počtu buněk amplifikovat sekvence DNA 99

specifické pro pohlaví plodu. Markerem chromosomu Y je repetitivní sekvence Hae 3,4. Přehled využití PCR v základním výzkumu i klinické diagnostice ukazuje tabulka 3. Tabulka 3. Základní výzkum

Aplikovaný genetický výzkum

Klinické disciplíny

Ostatní

izolace genů nebo jejich částí

Detekce mutací v genech

detekce patogenních bakterií, virů, prvoků archeologie a hub

sekvenace lidského genomu

studium polymorfismu genů

typizace patogenních kriminalistika mikroorganismů (identifikace jedince)

mutageneze in vitro, modifikace konců populační genetika DNA analýza klonů z genových knihoven příprava značených sond

identifikace onkogenů

soudnictví (určení otcovství)

typizace nádorů diagnostika dědičných metabolických chorob stanovení pohlaví prenatální diagnostika dědičných chorob

Převzato z Jan Šmarda a kolektiv, Metody molekulární biologie.

100

Real-time PCR (R-T PCR) Základem real-time PCR je klasická PCR se 2 primery, ale s fluorescenční sondou, což umožňuje kontinuálně monitorovat přírůstky amplikonů během každého cyklu (u klasického PCR se detekuje až finální produkt). Amplifikace a detekce produktu se provádí buď ve skleněných či polykarbonátových kapilárách, mikrozkumavkách nebo mikrodestičkách s 96 – 384 jamkami ve speciálních termocyklerech, které umožňují snímat a kvantifikovat fluorescenci v každém cyklu. Obr. 3. Lightcycler 2.0 Real-time PCR umožňuje kvantifikovat DNA nebo pomocí RT-PCR RNA. Základní podmínkou je přítomnost fluorescenční sondy, která se váže na syntetizované amplikony a úroveň detekované fluorescence pak odráží množství vytvořené nukleové kyseliny. Data jsou sbírána během celého PCR procesu ve speciálních "termocyklerech" s optikou umožňující excitaci sondy a následnou detekci fluorescence v každém kapiláře nebo jamce a vyhodnocení speciálním softwarem. Základní schéma excitace a detekce fluorescence je na obr. 3. Základní schéma Lightcycleru 2.0® Roche, včetně optické detekční jednotky je na obr. 4.

Obr. 3. Základní schéma excitace a detekce fluorescence. Excitační laserový paprsek prochází vzorkem s fluorescenční sondou a emituje fluorescenční světlo, které je snímáno a vyhodnocováno fluorometrickým analyzátorem.

101

Obr. 4. Funkční schéma Lightcycleru 2.0 Roche. Levá část ukazuje vzduchový termocykler s kapiláramy se vzorkem a pravá část optickou měřící jednotku. Fluorescenční sondy používané v real-time PCR se dělí do dvou základních skupin: 1. nespecifické - barviva vázající se nespecificky na dvouvláknovou strukturu DNA jako je SYBR® Green nebo LC Green (Obr. 5A); 2. specifické - oligonukleotidové sondy, které hybridizují s amplikonem PCR. Fungují na principu FRET (fluorescence resonance energy transfer) mezi fluorescenčním barvivem (fluorofor - F nebo R) a zhášečem (quencher - Q): a) TaqMan, neboli duální hydrolyzující sondy (Obr. 5B) – v tomto případě nárůst fluorescenční aktivity je způsoben zvýšením vzdálenosti mezi molekulou R a Q po rozštěpení navázané sondy polymerasou

102

Obr. 5. Nespecifická sonda SYBR Green (A). Specifická hydrolyzující sonda Taqman (B) b) Hybridizační FRET sondy Roche (obr. 6 A, B, C) – se sestávají ze dvou různě značených sond. Jedna je značená na 5´-konci excitačním barvivem a druhá emitorovým, fluorescenčním barvivem. Fluorescence nastává po dokonalém a těsném nasednutí obou sond barvivy proti sobě. Fluorescence se snímá při teplotě nasednutí primerů (annealingu). Tento typ sondy umožňuje prokazovat polymorfismy na základě změny Tm.

Obr. 6 A. Diagram dvou značených B. Fluorescence emitovaná ve FRET sond užívaných ve FRET systému. systemu. Oligo 1 je donorová Oligo 1 je donorová molekula a molekula a Oligo 2 je receptor. Oligo 2 je receptor.

C. Oligo 1 a 2 jsou dostatečně těsné, aby přenesly světelnou energii k akceptorové molekule, která potom fluoreskuje.

103

c) Molekular Beacons neboli molekulární majáky (obr. 7) obsahují vlásenkovou, komplementární strukturu a smyčku tvořenou sondou. Na 3´-konci vázán reporter (fluorogen), případně přes tzv. bloker, a na 5´-konci zhášeč.

Obr. 7. Molekulární majáková sonda (molecular beacon probe). Ve vlásenkové formě, nevázané na cílové sekvencce amplikonů je sonda fluorescenčně neaktivní, při denaturaci dojde k rozvolnění vlásenkové struktury. Při reasociační teplotě (annealingu) dojde k hybridizaci sondy smyčkou s amplikony, dokonalému oddálení reportéru a zhášeče a emisi fluorescence. d) Škorpionové primer-sondy (Scorpion probe) jsou bifunkční molekuly, ve kterých je primer kovalentně vázán k sondě (obr. 8). Molekuly také obsahují fluorofor a zhášeč. V nepřítomnosti cílu, zhášeč téměř úplně absorbuje fluorescenci emitovanou fluoroforem. Během škorpionové PCR ve fázi annealingu v přítomnosti cílové molekuly se separují fluorofor a zhášeč, což vede k vzestupu fluorescenční emise. Fluorescence pak může být detekovaná a měřená v reakční zkumavce. Na rozdíl od TaqManu, FRET hybridizačních sond a molekulárních majáků, reakce škorpionové primer-sondy, je reakce vedoucí ke tvorbě signálu monomolekulární, vzhledem k tomu, že sonda je kovalentně spojena s primerem.

104

Obr. 8. Funkce škorpion primer-sondy. Po jednom cyklu PCR se kompletuje extenze primeru sondy a nově syntetizovaná cílová oblast se připojí k témuž řetězci jako sonda. Při následujícím druhém cyklu, denaturace a annealing, hybridizují sonda a cíl na elongovaném primeru. Denaturace vlásenkové smyčky vyžaduje méně energie, než tvorba nové duplexní DNA. Následně, vlásenková struktura hybridizuje k části nově tvořeného produktu PCR, což vede k separaci fluoroforu od zhášeče a vzniku emise světla. Využití real-time PCR Real-time PCR na rozdíl od klasické PCR má daleko širší využití:  detekce a identifikace patogenů (bakterií, hub, virů i parazitů – např. detekce a kvantifikace cirkulující DNA Plazmodia falciparum.)  kvantifikace bakteriální a virové nálože  diferenciální genová exprese pomocí reverzní real-time PCR, zejména v onkologii při zjišťování exprese genů asociovaných s nádorovým onemocněním  monitorování minimální nádorové choroby, jak na úrovni DNA cirkulujících nádorových buněk, tak na úrovni exprimované RNA  monitorování efektivity léčby

105

 SNP genotypizace, resp. zjišťování mutací (např. zjišťování polymorfismu

      

ApoE, FVL – Lydenské mutace faktoru V, faktoru I – protrombinu, methylentetrahydrofolátreduktasy 677 a 1298 methylace DNA validace RNA pro DNA čipy detekce nepříznivého výsledku transplantace analýza genetických chorob – cystické fibrosy, fenylketonurie, thalassemie, hemofilie, srpkovité anemie a favismu neinvazivní prenatální diagnostika analysou fetální DNA v mateřské plazmě. detekce potravinových a environmentálních patogenů forenzní studie – identifikace jedince, zjišťování paternity (otcovství)

106

ÚLOHA 1.

Analýza známých polymorfismů a častých mutací pomocí PCR s restrikčním štěpením Pro detekci známých polymorfismů a bodových mutací se často využívá amplifikace studovaného úseku DNA pomocí polymerasové řetězové reakce (PCR) s následnou restrikční analýzou, tj. rozštěpení fragmentu zkoumaného genu enzymem – restrikční endonukleázou, který má schopnost rozeznat a rozštěpit specifickou sekvenci DNA. Protože restrikční analýza je volena tak, aby restrikční reakce zasahovala místo polymorfní sekvence, změna této sekvence vede k vytvoření nebo naopak k zániku restrikčního místa. Produkty restrikční reakce jsou následně separovány na agarosovém (případně polyakrylamidovém) gelu. Vizualizace se provádí obarvením DNA fragmentů ethidiumbromidem. Cílem praktického cvičení je genotypizace genu APOE u pacientů s hyperlipidémií a/nebo hypercholesterolémií a obezitou nebo detekce specifické mutace genu BRCA 1.

1.1.

Analýza alel genu APOE

Gen APOE je lokalizován na 19 chromosomu (19q13.2). Protein ApoE (apolipoprotein E) je exprimován v řadě tkání. Je součástí lipoproteinových komplexů remnantních částic chylomiker, HDL, IDL a LDL. ApoE je důležitou součástí pro receptory remnantních částic a HDL v jaterních buňkách. V remnantních částicích chylomiker a IDL resp. LDL se objevuje ApoE sekundárně; během intravazální interakce těchto lipoproteinů s částicemi HDL. V exonu 3 genu APOE se nacházejí polymorfní lokusy, které vytvářejí tři alely, označované jako ε2, ε3 a ε4 (tabulka 1). Tyto alely jsou charakterizovány záměnou nukleotidu 3932 (kodon 130) a/nebo nukleotidu 4070 (kodon 176). V obou případech se jedná o záměnu C za T na prvním místě tripletu kódujícího příslušnou aminokyselinu. To znamená, že se v daném místě nachází buď triplet TGC, kodující cystein (C) nebo triplet CGC, kodující arginin (R). Tabulka 1. Alela ε2 ε3 ε4

Aminokyselina 130 TGC (C) TGC (C) CGC (R)

Aminokyselina 176 TGC (C) CGC (R) CGC (R)

V populaci se nacházejí jak jedinci homozygotní, tak heterozygoti s kombinací jednotlivých alel. Nejčastější je výskyt homozygotní alely ε3. Tato alela znamená expresi plně funkčního proteinu ApoE. Vzhledem k tomu, že záměna C za T vede ke změně tripletu kódujícího příslušný aminokyselinový zbytek v polypeptidovém řetězci genu Apo-E, lze předpokládat, že jednotlivé sekvenční varianty genu mohou mít (a ve skutečnosti mají) dopad na strukturní a funkční charakteristiky výsledného proteinu ApoE, který se podílí na

107

rozpoznání remnantních chylomiker a LDL částic jejich receptory (záměna Cys za Arg je záměnou hydrofobní aminokyseliny za kladně nabitou, polární aminokyselinu). U normálních osob jsou zbytky chylomiker a LDL částice rychle odstraňovány z cirkulace receptorem zprostředkovanou endocytózou především v hepatocytech. Při onemocnění familiální dysbetalipoproteinemii nebo hypolipoproteinémii typu III se setkáváme se zvýšenou plazmatickou hladinou cholesterolu a triacylglycerolů, která je důsledkem poruchy clearance remnantních chylomiker a LDL na základě defektu apolipoproteinu E. Akumulace lipoproteinových komplexů v cirkulaci způsobuje vznik xantomů a předčasné aterosklerózy koronárních a/nebo periferních tepen se všemi závažnými klinickými důsledky (angina pectoris, akutní infarkt myokardu, apod) v mladém věku. Většina pacientů s familiální dysbetalipoproteinemií jsou homozygoti ε2/ ε2. Osoby s alelou ε4 jsou ohroženy zvýšeným rizikem vzniku Alzheimerovy choroby (nejčastější forma demence v dospělé populaci; progresivní neurodegenerativní onemocnění CNS). LOCUS DEFINITION ACCESSION KEYWORDS SOURCE ORGANISM REFERENCE AUTHORS TITLE JOURNAL MEDLINE PUBMED

1 61 121 181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901 961 1021 1081 1141 1201 1261 1321 1381 1441 1501 1561 1621 1681

HUMAPOE4 5515 bp DNA linear PRI 09-NOV-1994 Human apolipoprotein E (epsilon-4 allele) gene, complete cds. M10065 J03053 J03054 Alu repeat; allelic variation; apolipoprotein; apolipoprotein E; lipoprotein; repeat region; very low density lipoprotein. Homo sapiens (human) Homo sapiens Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi; Mammalia; Eutheria; Primates; Catarrhini; Hominidae; Homo. 1 (bases 1 to 5515) Das,H.K., McPherson,J., Bruns,G.A., Karathanasis,S.K. and Breslow,J.L. Isolation, characterization, and mapping to chromosome 19 of the human apolipoprotein E gene J. Biol. Chem. 260 (10), 6240-6247 (1985) 85207610 3922972

ggaacttgat agacgagatt gcttcaagcc ttcacatgtg aaaacccagg ccctcccatc gacagtctcc ccgcctcccg cgcccgccac tggccaggct tgctgggatt cccctagccc ttacattcat ctccacattc cgaggtgtcc tccttcctcc gggctgccca ggacaagtct ccaggagccg gagctgggac ggcttgggga ctgggcagca gatgtaagcc gtccccagtg ccgtcgattg taactgtgag agatggaacc atggaatttt ttaaataggg

gctcagagag cacgccctgg ctggaaacca gggagggggc tcccatttgc ccacttctgt ctcttgctga ggttcaagcg cacgcctggc ggtctcaaac acaggcgtga tactttcttt ccaggcacag cccttccacg tcccttcctg ctctgccctg gcccgcccta gggatccttg gtgagaagcg cctgggaagc gaggaggagc gagacgaccc atagcaggac tcctcagatc gagaacttta gttggagctt ggcggtgggg ctatggaggc aatgggttgg

gacaagtcat caatttgact caatacctgt tcctgtgctc aaagcctcga ccagccgcct ggctggagtg attctcctgc taacttttgt tcctgacctt gctaccgccc ctgggatcca gaaaggacag cttggccccc gggactgtgg ctgtgcctgg tccctggggg agtcctactc cagtcggggg cctggcctcc gggggtgagg gacccgctag tccacgagtt tccataactg aaatgaggac agaatgtgaa agggggtggg cgacctgggg gggcggcttg

ttgcccaagg ccagaatcct ggcagccagg aaggtcacaa cttttagcag agccccactt cagtggcgag ctcagcctcc atttttagta aagtgattcg ccagcccctc ggagtccaga ggtcaggaaa agaatggagg ggggtggtca ggcaggggga agggggcggg agccccagcg cacggggatg aggtagtctc caagcagcag aaggtggggt gtcactatca gggagccagg tgaattagct gggagaatga gggatggaat atggggagat gtaaatgtgc

tcacacagct aaccttaacc gggaggtgct ccaaagagga gtgcatcata tctttttttt atctcggctc caagtagcta gagatggggt cccactgtgg ccatcccact tccccagccc ggaggactct agggtgtctg aaagacctct gaacagccca acagggggag gaggtgaagg agctcagggg aggagagcta gggactggac ggggagagca ttatcgagca ggcagcgaca cataaatgga ggaatgcgag ttgaaccccg aagagaagac tgggattagg

ggcaactggc cagaagcacg ggaatctcat agctgtgatt ctgttcccac ctttttttga actgtaacct ggattacagg ttcaccatgt cctcccaaag tctgtccagc cctctccaga gggcggcagc tattactggg atgccccacc cctcgtgact ccctataatt acgtccttcc cctctagaaa ctcggggtcg ctgggaaggg gctggactgg cctactgggt cggtagctag acacggcgct actgggactg ggagaggaag caggagggag ctgttgcaga

108

1741 taatgcaaca aggcttggaa ggctaacctg gggtgaggcc gggttggggg cgctgggggt 1801 gggaggagtc ctcactggcg gttgattgac agtttctcct tccccagact ggccaatcac 1 M K V L W A A L L V T F L A G 1861 aggcaggaag ATGAAGGTTC TGTGGGCTGC GTTGCTGGTC ACATTCCTGG CAGgtatggg tccgtccttc TACTTCCAAG ACACCCGACG CAACGACCAG TGTAAGGACC GTCcataccc 1921 1981 2041 2101 2161 2221 2281 2341 2401 2461 2521 2581 2641 2701 2761 2821 2881 2941

ggcggggctt ccccattcag gaacagcgat agttgttttg ctgtcgccca ggtccacgcc cacacccgac ctggtctgga ttacaggcgt gatagtgaat cctgcctggg cctgtaatcc acaccagcct gcatggtgcc gagcccagaa gacagagcaa ccctcaccct taggtagcta

gctcggttcc acagaccctg ttgacgctct ttgttgttgt ggctggagtg attctcctgc taactttttt actcctgacc gagccaccgc accagacacg gcacacaagg cagcactttg gggcaacata acacacctgt ggtcaaggtt gaccctgttt gcccaccatg gatgcctgga

ccccgctcct ggccccctct ctgggcctcg ttgttgttgt cagtggcggg ctcagcctcc gtattttcag tcaggtgatc acctggctgg gggcagctgt acactcaata ggaggccaag gtgagaccct gctctcagct gcagtgaacc ataaatacat gctccaaaga cggggtcaga

ccccctctca tctgaggctt gtttccccca tgttttgttt atctcggctc caagtagctg tagagacggg tgcccgtttc gagttagagg gatctttatt catgcttttc gtgggaggat gtctctacta actcaggagg atgttcaggc aatgctttcc agcatttgtg aggaccctga

tcctcacctc ctgtgctgct tccttgagat ttttgagatg actgcaagct ggactacagg gtttcaccat gatctcccaa tttctaatgc ctccatcacc cgctgggccg cacttgagcc aaaatacaaa ctgaggcagg cgctgcactc aagtgattaa gagcaccttc cccgaccttg

aacctcctgg tcctggctct aggagttaga aagtctcgct ccgcctccca cacatgccac gttggccagg agtgctggga attgcaggca cccacacagc gtggctcacc caggagttca aattagccag aggatcgctt cagcctgggt accgactccc tgtgtgcccc aacttgttcc

16 C Q A K V E Q A V E T E P E P E L R 3001 acacagGATG CCAGGCCAAG GTGGAGCAAG CGGTGGAGAC AGAGCCGGAG CCCGAGCTGC tgtgtcCTAC GGTCCGGTTC CACCTCGTTC GCCACCTCTG TCTCGGCCTC GGGCTCGACG 34 Q Q T E W Q S G Q R W E L A L G R F W D 3061 GCCAGCAGAC CGAGTGGCAG AGCGGCCAGC GCTGGGAACT GGCACTGGGT CGCTTTTGGG CGGTCGTCTG GCTCACCGTC TCGCCGGTCG CGACCCTTGA CCGTGACCCA GCGAAAACCC 54 Y L R W V Q T L S E Q V Q E E L L S S Q 3121 ATTACCTGCG CTGGGTGCAG ACACTGTCTG AGCAGGTGCA GGAGGAGCTG CTCAGCTCCC TAATGGACGC GACCCACGTC TGTGACAGAC TCGTCCACGT CCTCCTCGAC GAGTCGAGGG 74 V T Q E L R 3181 AGGTCACCCA GGAACTGAGg tgagtgtccc catcctggcc cttgaccctc ctggtgggcg TCCAGTGGGT CCTTGACTCc actcacaggg gtaggaccgg gaactgggag gaccacccgc 3241 3301 3361 3421 3481 3541 3601 3661 3721

gctatacctc ggtctctgct attctctctc ctggctctgt ctgtgttgcc ccaaagtgct tctgcctctg tgccccgttc tcccagccct agggtcggga

cccaggtcca ggttctagct tcagctttgt ctctgtcctt caggctggtc gggattagag ccctctgcat cttctctccc tctcccccgc agagggggcg

ggtttcattc tcctcttccc ctctctctct ccctagctct ttgaacttct gcatgagcac ctgctctctg tcttgggtct ctccccactg gaggggtgac

tgcccctgtc atttctgact tcccttctga tttatataga gggctcaagc cttgcccggc catctgtctc ctctggctca tgcgacaccc acgctgtggg

gctaagtctt cctggcttta ctcagtctct gacagagaga gatcctcccg ctcctagctc tgtctccttc tccccatctc tcccgccctc agggcgggag

ggggggcctg gctctctgga cacactcgtc tggggtctca cctcggcctc cttcttcgtc tctcggcctc gcccgcccca tcggccgcag agccggcgtc

80 A L M D E T M K E L K A Y K S E L E E Q 3781 GGCGCTGATG GACGAGACCA TGAAGGAGTT GAAGGCCTAC AAATCGGAAC TGGAGGAACA CCGCGACTAC CTGCTCTGGT ACTTCCTCAA CTTCCGGATG TTTAGCCTTG ACCTCCTTGT 100 L T P V A E E T R A R L S K E L Q A A Q 3841 ACTGACCCCG GTGGCGGAGG AGACGCGGGC ACGGCTGTCC AAGGAGCTGC AGGCGGCGCA TGACTGGGGC CACCGCCTCC TCTGCGCCCG TGCCGACAGG TTCCTCGACG TCCGCCGCGT

109

120 A R L G A D M E D V R G R L V Q Y R G E 3901 GGCCCGGCTG GGCGCGGACA TGGAGGACGT GCGCGGCCGC CTGGTGCAGT ACCGCGGCGA CCGGGCCGAC CCGCGCCTGT ACCTCCTGCA CGCGCCGGCG GACCACGTCA TGGCGCCGCT 140 V Q A M L G Q S T E E L R V R L A S H L 3961 GGTGCAGGCC ATGCTCGGCC AGAGCACCGA GGAGCTGCGG GTGCGCCTCG CCTCCCACCT CCACGTCCGG TACGAGCCGG TCTCGTGGCT CCTCGACGCC CACGCGGAGC GGAGGGTGGA 160 R K L R K R L L R D A D D L Q K R L A V 4021 GCGCAAGCTG CGTAAGCGGC TCCTCCGCGA TGCCGATGAC CTGCAGAAGC GCCTGGCAGT CGCGTTCGAC GCATTCGCCG AGGAGGCGCT ACGGCTACTG GACGTCTTCG CGGACCGTCA 180 Y Q A G A R E G A E R G L S A I R E R L 4081 GTACCAGGCC GGGGCCCGCG AGGGCGCCGA GCGCGGCCTC AGCGCCATCC GCGAGCGCCT CATGGTCCGG CCCCGGGCGC TCCCGCGGCT CGCGCCGGAG TCGCGGTAGG CGCTCGCGGA 200 G P L V E Q G R V R A A T V G S L A G Q 4141 GGGGCCCCTG GTGGAACAGG GCCGCGTGCG GGCCGCCACT GTGGGCTCCC TGGCCGGCCA CCCCGGGGAC CACCTTGTCC CGGCGCACGC CCGGCGGTGA CACCCGAGGG ACCGGCCGGT 220 P L Q E R A Q A W G E R L R A R M E E M 4201 GCCGCTACAG GAGCGGGCCC AGGCCTGGGG CGAGCGGCTG CGCGCGCGGA TGGAGGAGAT CGGCGATGTC CTCGCCCGGG TCCGGACCCC GCTCGCCGAC GCGCGCGCCT ACCTCCTCTA 240 G S R T R D R L D E V K E Q V A E V R A 4261 GGGCAGCCGG ACCCGCGACC GCCTGGACGA GGTGAAGGAG CAGGTGGCGG AGGTGCGCGC CCCGTCGGCC TGGGCGCTGG CGGACCTGCT CCACTTCCTC GTCCACCGCC TCCACGCGCG 260 K L E E Q A Q Q I R L Q A E A F Q A R L 4321 CAAGCTGGAG GAGCAGGCCC AGCAGATACG CCTGCAGGCC GAGGCCTTCC AGGCCCGCCT GTTCGACCTC CTCGTCCGGG TCGTCTATGC GGACGTCCGG CTCCGGAAGG TCCGGGCGGA 280 K S W F E P L V E D M Q R Q W A G L V E 4381 CAAGAGCTGG TTCGAGCCCC TGGTGGAAGA CATGCAGCGC CAGTGGGCCG GGCTGGTGGA GTTCTCGACC AAGCTCGGGG ACCACCTTCT GTACGTCGCG GTCACCCGGC CCGACCACCT 300 4441 4501 4561 4621 4681 4741 4801 4861 4921 4981 5041 5101 5161 5221 5281 5341 5401 5461

K V Q GAAGGTGCAG gccgaagcct gcagcgggag agattcacca ctcagtttct gtgtctgtgt cacccaggct caagcgattc tttttgtatt tgaccaagtg tgcccggcct cgccatcaca cctcagcctt ggtggtgtgt ctcaagcgat cacccagctt tcaaacccct catgggctcc

A A V G GCTGCCGTGG gcagccatgc accctgtccc agtttcacgc ctttctgccc gtatctttct agagtgcagt tgctgcctca tttagtagag atccacccgc ctgcccctct gctcactgca tccagtagct gtggagatgg actcccacct tttattatta ggctcaagag gagcggcctg

T S A GCACCAGCGC gaccccacgc cgccccagcc atctgctggc acatactgcc ctctgccctt ggcacgatct gtagctggga acgagctttc cggcctccca ttctttttta gcctccacct gagactacag ggtctggctt tggcctcctg tttgtagaga atcctccgcc cccaacttaa

A P V P CGCCCCTGTG caccccgtgc gtcctcctgg ctccccctgt acacaattct tttttttttt tggctcactg ttacaggctc accatgttgg aagtgctgag gggggcaggg cctggactca gcgcatacca tgttggccag agtagctgag caaggtctca atcggcctcc taatattgtt

S D N CCCAGCGACA ctcctgcctc ggtggaccct gatttcctct cagccccctc tagacggagt caacctctgc acaccaccac ccaggcaggt attacaggcc aaaggtctca agtgataagt ctaggattaa gctgatgtgg actactggct atatgttgcc caaagtgctg cctagagttg

H * ATCACTGAac cgcgcagcct agtttaataa aagccccagc ctctccatct ctggctctgt ctcttgggtt acccggctaa ctcaaactcc tgagccacca ccctgtcacc gatcctcccg tttggggggg aattcctggg agcaccacca caggctagtc ggattccagg cactc

110

Vysvětlivky: 

Kódující sekvence s exony je vyznačena jako dsDNA



Sekvence aminokyselin je vyznačena nad kódující sekvencí v jednopísmenkovém kódu.



Sekvence signálního peptidu (AA 1 – 18) je označena kurzívou.



Sekvence primerů jsou označeny podtrženě a kurzívou



Rekogniční místa HhaI jsou vyznačena v tmavých rámečcích (šedě – nepolymorfní místa, černě – místa možných polymorfismů CGC->TGC (C->R)

Sekvenci genů naleznete na stránkách serveru NCBI (National Center for Biotechnology Information) v databázi nukleotidů (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gquery/gquery.fcgi

1.1.1. PCR amplifikace fragmentu exonu 3 genu APOE Pracovní postup: – Sterilní 0,2 ml PCR zkumavku si na víčko označte uvedeným způsobem: např. A10; A je amplifikace APOE, 10 je číslo vaší DNA. – Do zkumavky napipetujte reakční směs dle tabulky 1: mastermix, 15 pmol každého ze dvou primerů, 200 ng vaší DNA a doplňte ddH20 na celkový objem 20l. Tabulka 1. reakční směs mastermix* primer 1: 5'-GCGGACATGGAGGACGT-3' (5 M) primer 2: 5'-GGCCTCCTACACTGCCAG-3' (5M) DNA ( ____ mg/ml) ddH20 ad 20 l konečný objem

(l) 8 3 3

20

– Reakční směs zvortexujte a krátce zcentrifugujte. – Zkumavku vložte do bloku cykleru GeneAmp PCR System 2700 a aktivujte program “apo-E”

111

1.1.2. Elektroforéza PCR produktu Pracovní postup: – Označte sterilní 0,2 ml eppendorfku, na víčko dle instrukcí (např. AR10; AR je restrikce APOE, 10 je číslo vaší DNA) – Do zkumavky napipetujte 1 l modrého vzorkového pufru a 5 l vašeho PCR produktu. Zvortexujte a krátce zcentrifugujte. – Naneste celý objem vzorku (6 l) na dno jamky v agarosovém gelu umístěném ve vaně s pufrem. Zaznamenejte si číslo jamky (zleva). – Po nanesení všech vzorků připojte vanu na zdroj stejnosměrného proudu (7V/cm). – Elektroforézu ukončete při vyputování bromfenolové modři z gelu. – Vyjměte gel a proveďte vyhodnocení po skupinách pod UV světlem.

1.1.3. Restrikční analýza PCR APOE Pracovní postup: – Označte 0,2ml eppendorfku na víčko číslem svého PCR produktu. Napipetujte do ní 6 l restrikční směsi a 6 l svého PCR produktu. – Zvortexujte a krátce centrifugujte. – Umístěte zkumavku do bloku cycleru GeneAmp PCR System 2700 a aktivujte program “restrikce”. Inkubujte 2 hod při 37°C.

1.1.4. Elektroforéza restrikční reakce produktu PCR APOE Pracovní postup: – Označte 0,2 ml eppendorfku na víčko číslem svého PCR produktu. Napipetujte do ní 1 l modrého vzorkového pufru a 5 l neštěpeného PCR produktu. – Do zkumavky s restrikční reakcí (12 l) přidejte 3 l nanášecího pufru. – Obě zkumavky protřepejte na vortexu a krátce centrifugujte. – Naneste celý objem vzorků (9 l a 15 l) na dno dvou sousedních jamek v agarosovém gelu umístěném ve vaně s pufrem (1. jamka – neštěpený PCR produkt; 2. jamka – produkt po restrikci). – Zaznamenejte čísla jamek (zleva) a vašich vzorků. – Po nanesení všech vzorků aplikujte stejnosměrný proud (7V/cm). – Elektroforézu ukončete po 40 minutách. – Vyjměte gel a vyhodnoťte jej po skupinách pod UV světlem.

112

Použité zkratky: agaróza bp

lineární polysacharid z D-galaktózy a 3,6-anhydro-L-galaktózy base pairs (páry bází) komplementární jednořetězcová DNA, která vznikne reverzním přepisem cDNA mRNA. ddH2O redestilovaná sterilní voda DMSO dimethylsulfoxid dNTP’s dinukleotidtrifosfáty (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) dsDNA double-stranded (dvouřetězcová) DNA EDTA ethylendiaminotetraoctová kyselina kbp kilo base pairs OD260nm optická densita při 260 nm pufr TAE pufr z TRIS – acetátu – EDTA RT room temperature (laboratorní teplota) ssDNA single-stranded (jednořetězcová) DNA PSM PCR-mediated site directed mutagenesis PCR polymerase chain reaction (polymerázová řetězová reakce) wt wild type (zdravá alela)

113