Lékařská chemie, biochemie a molekulární biologie Praktická cvičení II

Kolektiv

Lékařská chemie, biochemie a molekulární biologie Praktická cvičení II

Univerzita Karlova v Praze 1. lékařská fakulta Ústav biochemie a experimentální onkologie Vedoucí ústavu: Prof. MUDr. Aleksi Šedo, DrSc.

1

OBSAH Enzymy Důkaz substrátové specifity glykosidas (sacharasy a α-amylasy) Aktivace a inhibice alfa-amylasy anorganickými ionty Stanovení Michaelisovy konstanty (Km) pro enzym alkalická fosfatasa Biologické oxidace Důkaz dehydrogenas citrátového cyklu Důkaz cytochromoxidasy Důkaz peroxidasy Důkaz katalasy a pseudoperoxidasová reakce Xanthinoxidoreduktasa Sacharidy I Reakce se Schiffovým činidlem Redukční vlastnosti sacharidů Kyselá hydrolýza škrobu Sacharidy II Glukosový toleranční test, denní ztráty glukosy močí Stanovení glykovaného hemoglobinu Monitorování glykemie pomocí glukometru Glukotrend Sacharidy III Redukční vlastnosti kyseliny L-askorbové Stanovení koncentrace kyseliny L-askorbové Stabilita kyseliny L-askorbové Saturační test Stanoveni koncentrace vitaminu C v ovocné šťávě Lipidy I Alkalická hydrolýza tuků - zmýdelnění tuků Vlastnosti mýdel Důkaz přítomnosti dvojných vazeb ve vyšších mastných kyselinách Důkaz některých složek vaječného žloutku Lipidy II Vliv solí žlučových kyselin na štěpení tuků katalyzované pankreatickou lipasou Peroxidace lipidů Lipidy III Stanovení celkového cholesterolu (TC) Stanovení HDL cholesterolu C HDLc) Stanovení triacylglycerolů (TAG) Výpočet HDL indexu a LDL cholesterolu podle Friedewalda Stanovení TC a TAG ve vlastni kapilární krvi pomocí přístroje Reflotron, Roche Hodnocení kardiálního rizika se změnami důležitých parametrů Elektroforesa lipoproteinů Tetrapyrroly Vlastnosti hemoglobinu Vlastnosti tetrapyrrolů Dusíková bilance Stanovení koncentrace močoviny Výpočet dusíkové bilance

4 6 7 9 14 16 18 21 22 23 25 26 27 30 31 32 36 39 41 44 45 46 48 50 51 53 54 57 58 59 62 65 68 72 74 75 77 79 82 83 88 89 93 96 98 101

2

Clearance Stanovení koncentrace kreatininu v séru a moči Zpětná resorpce fosfátů Markery svalové tkáně Stanovení katalytické aktivity kreatinkinasy Stanovení katalytické aktivity AST Stanoveni katalytické aktivity ALT Stanovení katalytické aktivity laktátdehydrogenasy Stanovení ALT (GPT), AST (GOT) a CK pomoci přístroje REFLOTRON®, Roche Elektroforesa isoenzymů laktátdehydrogenesy Základní screening patologických součástí moče Chemické vyšetření moči Xenobiochemie Důkaz ethanolu ve vydechovaném vzduchu Identifikace cizorodých látek a jejich metabolitů v moči Stanovení koncentrace dusitanů a dusičnanů ve vodě Použitá literatura

103 106 109 112 116 118 119 121 123 124 129 131 140 142 144 147 150

3

ENZYMY

Klíčová slova: biokatalýza, aktivita enzymu, holoenzym, apoenzym, koenzym, substrátová a reakční specifita enzymu, pH-optimum, trypsin (EC 3.4.21.4.), sacharasa (EC 3.2.1.26), α-amylasa (EC 3.2.1.1.), aktivace a inhibice enzymů, iontová síla. Reagencie: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19.

20.

roztok trypsinu (z Pancreolanu, směs glycerol : voda 1:1) roztok kaseinu 40 g/1 v uhličitanu sodném 0,01 mol/l koncentrovaná kyselina dusičná !ŽÍRAVINA! roztok sacharasy (50 g kvasnic ve 100 ml ethanolu 500 g/1) roztok α-amylasy (sliny l0x zředěné destilovanou vodou a přefiltrované přes gázu) roztok škrobu 10 g/l suspenze celulosy 2,5 g/l roztok inulinu 2,5 g/1 roztok sacharosy 5 g/l Fehlingův roztok I (síran mědnatý 70 g/l Fehlingův roztok II (125 g hydroxidu sodného a 175 g vinanu sodnodraselného v 1 l vody) Lugolův roztok (roztok jodu 20 g/1 v roztoku jodidu draselného 40 g/l) 50x zředěný roztok chloridu sodného 0,1 mol/l roztok chloridu mědnatého 0,1 mol/l roztok chloridu vápenatého 0,1 mol/l roztok chloridu rtuťnatého 0,1 mol/l !JED! tablety zesíťovaného chromogenního škrobu (Spofa-Test α-amylasa) zastavovací roztok (uhličitan sodný 10 g/l ve směsi voda : aceton 9:1) souprava ALP (BioSystems): a) pufr N-methyl-D-glukamin, pH 10,1 b) substrát 4-nitrofenylfosfat 92 mmol/l c) inhibitor EDTA 30 mmol/l v roztoku hydroxidu sodného 1 mol/l sérum

4

α-amylasa α-amylasa (α-1,4-glukan-4-glukan-hydroláza, EC 3.2.1.1) patří mezi glykosidasy. Glykosidasy náleží mezi hydrolytické enzymy, které jsou specifické vůči typu glykosidové vazby (α-glykosidasy nebo β- glykosidasy) a sacharidu. Pomalu a nespecificky štěpí také inulin. Slinná α-amylasa je α-glykosidasa a štěpí α-1,4-D-glukosidové vazby v substrátech obsahujících tři a více D-glukosových zbytků spojených vazbou α-1,4. V organismu je α-amylasa přítomna ve formě dvou izoenzymů kódovaných dvěma geny ležícími ve stejném lokusu (1p21). Podílí se na trávení sacharidů štěpením škrobu, částečně již v ústní dutině (slinná α-amylasa, S-amylasa), především však v duodenu (pankreatická α-amylasa, P-amylasa). Hladina celkové α-amylasy je zvýšena u onemocnění akutní pankreatitidou, ale i u většiny případů bolestí břicha. Pro diagnostiku pankreatitidy má vyšší diagnostický přínos stanovení pankreatického izoenzymu (P-amylasy). Protože je molekula α-amylasy relativně malá, přestupuje do moči a můžeme její patologické zvýšení u akutní pankreatitidy detekovat i v moči. Toto zvýšení přetrvává déle a nastupuje později než zvýšení hladiny v séru. S-amylasa je zvýšena u onemocnění slinných žláz. Sacharasa z kvasnic štěpí β-fruktosidovou vazbu mezi fruktosou a galaktosou v sacharose, která je α-D-glukopyranosyl-β-D-fruktofuranosid. Cílem této úlohy je prokázat přítomnost produktů štěpení slinnou α-amylasou a sacharasou. Produkty hydrolytické reakce budou mít volné anomerní hydroxylové skupiny, a tudíž budou redukovat Fehlingovo činidlo. Polysacharidy můžeme prokázat reakcí s Lugolovým činidlem (roztok jodu), zatímco produkty enzymatické hydrolýzy tuto reakci neposkytují.

5

ÚLOHA 1.

Důkaz substrátové specifity glykosidas (sacharasy a α-amylasy) Pracovní postup: POZOR! Substráty před použitím protřepejte! – Jako α-amylasu použijte sliny l0x zředěné destilovanou vodou a přefiltrované přes gázu. – Do označených zkumavek připravte směs substrát - enzym podle tabulky 1. – Nechte 30 min inkubovat při 37° C, potom reakci ukončete vyndáním z vodní lázně. – S polovičním množstvím inkubační směsi z každé zkumavky proveďte reakci s Fehlingovým činidlem (poměr činidlo : inkubační směs = 1:1). – Ve zkumavkách, ve kterých byl jako substrát polysacharid, proveďte také reakci s jodem. – Stejnou reakci s jodem proveďte i s nativními polysacharidy a porovnejte zbarvení. – Výsledky zaneste do tabulky 1. pomocí symbolů + a –. Tabulka 1. zkumavka škrob (ml)

1 1

celulosa (ml) inulin (ml) sacharosa (ml) sacharasa (ml) α-amylasa (ml) Fehlingova reakce reakce s jodem

2

3

4

−

−

−

− 1

5 1

6

7

8

−

−

−

− 1

−

−

−

− 1

−

−

−

− 0,25

− 1

− 1

−

−

−

− 1

− 0,25

− 0,25

0,25

−

−

− 0,25

− 0,25

− 0,25

− 0,25

−

−

Poznámky:

6

ÚLOHA 2.

Aktivace a inhibice α-amylasy anorganickými ionty Některé kationty s oxidačním číslem +II (Ca2+, Mg2+, Zn2+) působí jako aktivátory enzymů tvorbou komplexů s enzymem nebo substrátem. Kationty s oxidačním číslem +I a anionty mohou působit jako nespecifické efektory změnou iontové síly. Kationty některých těžkých kovů enzymy zpravidla inhibují. Enzymem v této úloze je opět α-amylasa připravená v úloze 1., substrátem nerozpustný zesíťovaný škrob s kovalentně navázaným modrým barvivem. Enzymovou hydrolýzou vznikají barevné rozpustné oligosacharidy. Intenzita vzniklého zbarvení, která je úměrná aktivitě přítomné α-amylasy, se stanoví fotometricky. Pracovní postup: – Do pěti označených zkumavek připravte inkubační směs podle tabulky 2. Tabulka 2. zkumavka NaCl (ml)

−

2 0,1

CuCl2 (ml)

−

−

− 0,1

CaCl2 (ml)

−

−

−

− 0,1

HgCl2 (ml)

− 2,0 0,1

− 1,9 0,1

− 1,9 0,1

− 1,9 0,1

destilovaná voda (ml) α-amylasa (ml) absorbance 620 nm katal. akt. (µkat/l)

1

3

4

5

−

− − − 0,1 1,9 0,1

– Obsah zkumavek promíchejte a preinkubujte 30 min ve vodní lázni o teplotě 37° C (účinek iontů se projeví výrazněji, jsou-li ponechány v přítomnosti enzymu určitou dobu před začátkem vlastní enzymové reakce). – Po preinkubaci dejte do každé zkumavky pinzetou 1 tabletu škrobu (NEMÍCHAT!), zkumavky přitom nevyndávejte z vodní lázně. – Inkubujte dalších 15 min. – Přesně po 15 min vyjměte zkumavky z vodní lázně. – Ihned přidejte do každé zkumavky z dávkovače 2 ml zastavovacího roztoku pro ukončení enzymové reakce. – Obsah zkumavek dobře promíchejte a nechte stát 5 min. – Potom zfiltrujte do suchých zkumavek. – Změřte absorbanci při 620 nm a naměřené hodnoty absorbance zapište do tabulky 2. – Jako porovnávací vzorek použijte destilovanou vodu. – K naměřeným hodnotám absorbance vyhledejte v přiložené kalibrační tabulce hodnoty katalytické aktivity (µkat/l) a zapište je do tabulky 2. – Vzorek, jehož hodnota absorbance bude větší než 1,00, zřeďte 5x destilovanou vodou (pro ředění odpipetujte 0,5 ml roztoku) a znovu změřte. Vyhledanou hodnotu katalytické aktivity enzymu 5x vynásobte.

7

– Výsledky pro jednotlivé ionty vyjádřete sloupkovým grafem (hodnoty katalytické aktivity α-amylasy naneste na osu y).

Poznámky:

8

ÚLOHA 3.

Stanovení Michaelisovy konstanty (Km) pro enzym alkalická fosfatasa Michaelisova konstanta s určitou dávkou zjednodušení odráží afinitu enzymu k substrátu. Čím je její hodnota nižší, tím vyšší je afinita k příslušnému substrátu. Číselně tato hodnota odpovídá koncentraci substrátu, při které je rychlost reakce rovna polovině rychlosti maximální (limitní). Pro určení Km se měří počáteční rychlost enzymové reakce při nejméně pěti různých koncentracích substrátu, ležících v rozmezí alespoň jednoho řádu zvolené koncentrační oblasti, všechny ostatní faktory (pH, teplota a množství enzymu) musí být konstantní. Ze získaných hodnot sestrojíme graf závislosti počáteční rychlosti reakce na koncentraci substrátu (saturační křivka podle Michaelise a Mentenové).

Graf 1. Závislost A na [S]. Jelikož z tohoto grafu se Km nedá přímo přesně odečíst, vyneseme do grafu i reciproké hodnoty koncentrace substrátu a rychlosti (linearizace podle Lineweavera a Burka). V místě kde nám graf protne osu x získáme hodnotu -1/Km.

9

Graf 2. Závislost 1/A na 1/[S]. Enzym reagující s různými substráty má pro jednotlivé substráty různou hodnotu Km. Např. Km alkoholdehydrogenasy pro ethanol je menší než pro methanol. Tento rozdíl se využívá při léčbě otravy methanolem. Také izoenzymy, katalyzující reakci s jedním substrátem, se mohou lišit hodnotou Km. Glukokinasa, fosforylující glukosu v jaterních buňkách, má Km asi 10 mmol/l, kdežto hexokinasa, která je přítomná ve všech buňkách, má Km pro glukosu asi 0,1 mmol/1. Tuto skutečnost využívá organismus jako jednu z možností regulace metabolismu glukosy.

Alkalická fosfatasa (ALP) v lidském organismu Alkalická fosfatasa odštěpuje fosfátové skupiny (zbytky kyseliny fosforečné) především z molekul proteinů a nukleových kyselin. Enzym má pH optimum v alkalické oblasti. ALP se vyznačuje velkou tkáňovou nespecifitou a vyskytuje se téměř ve všech tkáních těla ve formě izoenzymů, například v játrech, ledvinách, kostech, placentě a střevě. Aktivita ALP v séru se zvyšuje v důsledku mnoha patologických stavů a pro správnou diagnostiku je nutné odlišit tkáň, ze které detekovaný enzym pochází. Zvýšení jaterní ALP je charakteristické pro obstrukci žlučových cest. Důvodem této obstrukce je nejčastěji žlučový kámen nebo zhoubný nádor bránící volnému odtoku žluči. Aktivita kostní ALP se zvyšuje v důsledku některých kostních chorob (osteomalacie, Pagetova choroba), fyziologicky vyšší je u dětí. Při stanovení Km alkalické fosfatasy se sleduje počáteční rychlost štěpení různých koncentrací substrátu (4-nitrofenylfosfátu) konstantním množstvím enzymu. Přírůstek produktu reakce 4- nitrofenolu je úměrný rychlosti enzymové reakce.

10

Pracovní postup: – Do 6 označených zkumavek „eppendorf“ nařeďte substrát dle tabulky 3. – Napipetujte do zkumavky č. 1 0,6 ml neředěného substrátu. – Do "eppendorfek" 2 - 6 napipetujte 0,3 ml destilované vody. – Z "eppendorfky" č. 1 odpipetujte 0,3 ml základního roztoku substrátu do "eppendorfky" č. 2 a promíchejte. – Od "eppendorfky" č. 2 postupujte při ředění substrátu analogicky vždy odpipetujte 0,3 ml roztoku z předcházející "eppendorfky" do následující a dobře promíchejte. Tabulka 3. zkumavka č.

4-nitrofenylfosfát

1 2 3 4 5 6

substrát ředění 1 ředění 2 ředění 3 ředění 4 ředění 5

substrát ml 0,6 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3

destil. voda ml – 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3

c mmol/l 92 46 23 11,5 5,75 2,88

– Do 7 nových skleněných zkumavek napipetujte 1 ml pufru - do zkumavky č. 1 − 6 přidejte 0,02 ml séra. – Zkumavky 1 - 7 inkubujte ve vodní lázni 5 min při 37 C. – Z každé "eppendorfky" 1 – 6 odpipetujte 0,2 ml substrátu do skleněných zkumavek. Zkumavky nevyndávejte z vodní lázně! – Dodržujte 30 sec interval mezi přidáním do jednotlivých zkumavek. – Do zkumavky č. 7 (slepá zkouška) napipetujte 0,2 ml neředěného substrátu (92 mmol/l). – Zkumavky inkubujte 15 min při 37° C. – V 30 sec intervalech vyndávejte zkumavky z vodní lázně a do každé zkumavky přidejte 0,5 ml roztoku inhibitoru. – Do zkumavky č. 7 ( slepá zkouška ) napipetujte 0,02 ml séra. – Do 30 min změřte absorbanci při 420 nm proti slepé zkoušce − výsledky zapište do tabulky č. 4.

11

Tabulka č 4. zkumavka č. 1 2 3 4 5 6

[Sr] 15,00 7,50 3,77 1,88 0,94 0,47

A

1/[S]

1/A

[Sr] je výsledná koncentrace substrátu v reakční směsi, tj. koncentrace připravených zásobních roztoků substrátu vynásobená 0,164 (0,2/1,22). – Na milimetrový papír sestrojte ze získaných hodnot (S], A, 1/[S] a 1/A dva grafy a určete hodnotu Km jako látkovou koncentraci 4-nitrofenolu. Závislost A na [S] (exp.):

Hodnotu Km odečtěte na ose x jako souřadnici průsečíku spojnic odpovídajících hodnot A a [S].

12

Závislost 1/A na 1/[S] (exp.):

Hodnotu –1/Km zjistěte z úseku na ose x, který vytíná přímka proložená experimentálními body. − Výsledky zapište do tabulky 5 a porovnejte získané hodnoty Km. Tabulka 5. graf Km (mmol/l)

1

2

Poznámky:

13

BIOLOGICKÉ OXIDACE

Klíčová slova: oxidace, redukce, redox potenciál, citrátový cyklus, dýchací řetězec, isocitrátdehydrogenasa (EC 1.1.1.41), sukcinátdehydrogenasa (EC 1.3.99.1), malátdehydrogenasa (EC 1.1.1.37), cytochromoxidasa (EC 1.9.3.1), cytochromy, inhibice enzymů, kompetitivní inhibice, hemové enzymy, katalasa (EC 1.11.1.6), peroxidasa (POD EC 1.11.1.7), peroxisomy, superoxidový radikál, superoxiddismutasa (SOD - EC 1.15.1.1), glutathionperoxidasa (EC 1.11.1.9), hypoxanthin, xantin, kyselina močová, xanthinoxidoreduktasa (XOR - EC 1.1.3.22), Reagencie: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14.

čerstvé hovězí srdce fosfátový pufr 0,1 mol/l, pH 7,4 roztok methylenové modře 0,1 g/l roztok jantaranu sodného 0,1 mol/l ve fosfátovém pufru roztok malonanu sodného 1 mol/l ve fosfátovém pufru extrakt z brambor roztok o-tolidinu (3,3´-dimethylbenzidinu) v ledové kyselině octové 0,01 mol/l !JED! peroxid vodíku 1 mol/l krev zředěná vodou 1:300 nepasteurované (čerstvé) mléko svařené mléko roztok methylenové modře 0,1 g/l parafínový olej roztok kyanidu draselného 0,02 mol/l !JED!

14

Oxidoredukční (redoxní) reakce jsou spojeny s přesunem elektronů a mohou být pro organismy zdrojem volné energie. Mezi oxidoreduktasy řadíme enzymy, které svoji reakci uskutečňují jako přenos elektronů (oxidasy), celých atomů vodíku (hydrogenasy, dehydrogenasy) a nebo kyslíku (oxygenasy) a tzv. hydroperoxidasy zajišťující degradaci toxického peroxidu vodíku.

Biologické oxidace I – Citrátový cyklus, dýchací řetězec a oxidativní fosforylace Citrátový cyklus je universální metabolický mlýn, ve kterém se spojuje katabolismus sacharidů, tuků a aminokyselin a jeho cílem je zejména produkce redukovaných koenzymů pro energetické využití. Je lokalizovaný v matrix a vnitřní membráně mitochondrií. V jednom běhu citrátového cyklu (zpracování 1 molekuly acetylkoenzymuA) vznikají 3 molekuly NADH, 1 FADH2, molekula GTP, následně přeměněná na ATP a 2 CO2. Bylo popsáno velmi málo abnormalit enzymů citrátového cyklu, defekty metabolismu tohoto charakteru jsou pravděpodobně neslučitelné se životem. Oxidativní fosforylace je proces tvorby ATP, při využití protonového gradientu vzniklého během přenosu elektronů z NADH a FADH2 na O2 přes řadu přenašečů (dýchací řetězec). Elektronový transportní řetězec je lokalizován na vnitřní mitochodriální membráně a tvoří ho systém membránových komplexů oxidoreduktas (I. NADH – ubichinon oxidoreduktasa, II. sukcinát-ubichinonreduktasa, III. ubichinon-cytochrom c-oxidoreduktasa a IV. cytochrom c-oxidasa) a mobilních přenašečů elektronů (ubichinon, Fe-S proteiny a cytochromy). Společně přenášejí protony a elektrony. Tok protonů pohání uvolňování nasyntetizovaného ATP z ATP syntasy. Elektrony redukují O2 na O2- reagující s protony v mitochondriální matrix na konečný produkt této metabolické dráhy – H2O (tzv. metabolická voda). Rychlost oxidativní fosforylace je určena potřebou ATP. Podmínkou je dostatečná nabídka redukovaných koenzymů, O2, ADP a Pi. Mezi respirační inhibitory patří například barbituráty a insekticid a pesticid rotenon, které blokují přenos elektronů mezi komplexem I a ubichinonem, dále pak antibiotikum antimycin A inhibující řetězec v místě přenosu mezi cytochromem c1 a komplexem III. Oxid uhelnatý, sulfan, azidy a kyanidy blokují přenos elektronů na kyslík na úrovni cytochromoxidasy. Mezi rozpojovače dýchacího řetězce a oxidativní fosforylace se řadí například 2,4-dinitrofenol, nebo ve zvýšených dávkách hormon thyroxin. Tyto látky způsobí, že dochází k přenosu protonů přes vnitřní mitochondriální membránu jiným způsobem než přes ATP syntasu. Nedochází tedy k syntéze ATP a chemiosmotický gradient je přeměněn na teplo. Organismus pociťující nedostatek ATP začne ve zvýšené míře metabolizovat živiny. Hypertyreóza, spojená s nadprodukcí tyroxinu se klinicky projeví hubnutím a zvýšením tělesné teploty. Podobné příznaky má intoxikace 2,4-dinitrofenolem. Vrozené metabolické vady oxidativní fosforylace a dýchacího řetězce se projevují postižením orgánů s vysokým energetickým obratem, jako jsou svaly (myopatie), mozek (encefalopatie) a oční nerv (slepota) – Leberova hereditární optická neuropatie. Biochemicky často nalézáme laktacidózu jako důsledek posunu k anaerobnímu metabolismu.

15

ÚLOHA 1.

Důkaz dehydrogenas citrátového cyklu Oxidační reakce citrátového cyklu, katalyzované isocitrátdehydrogenasou, 2oxoglutarátdehydrogenasou, sukcinátdehydrogenasou a malátdehydrogenasou, jsou zdrojem redukovaných koenzymů NADH a FADH2, které přenášejí atomy vodíku do dýchacího řetězce. Ty jsou dále přenášeny jednotlivými články dýchacího řetězce jako protony a elektrony až na konečný akceptor - molekulový kyslík. Jako substrát je v tomto modelovém pokusu používán sukcinát, jako akceptor atomů vodíku slouží methylenová modř: Ox / Red fumarát / sukcinát methylenová modř / leukoforma O2 / H2O2

E0'(V) +0,03 +0,01 +0,68

Dehydrogenace v tomto uspořádání probíhá spontánně, přestože standardní redox potenciál soustavy fumarát/sukcinát je vyšší (+0,03 V) než redox potenciál soustavy methylenová modř/leukoforma (+0,01 V). Aktuální potenciál redox soustavy záleží podle Nernstovy-Petersovy rovnice i na koncentracích redukované a oxidované složky obou soustav. V tomto uspořádání je vyšší koncentrace redukované formy (sukcinát) jedné redox soustavy a současné je vyšší koncentrace oxidované formy (methylenová modř) druhé soustavy. To ovlivní hodnoty aktuálních redox potenciálů tak, že redukce methylenové modře sukcinátem probíhá samovolně. V tomto modelovém pokusu je také demonstrována inhibice sukcinátdehydrogenasy malonátem, který je kompetitivním inhibitorem tohoto enzymu díky své strukturní podobnosti se sukcinátem. Pracovní postup: – Do 4 zkumavek, napipetujte 2 ml enzymového extraktu. – Do zkumavky č. 3 napipetujte 0,5 ml roztoku malonanu sodného a nechte inkubovat 10 min při laboratorní teplotě (viz tabulka 1.). – Zkumavku č. 4. vložte do vroucí vodní lázně, 2 min povařte. a její obsah přelijte do plastikové zkumavky (4). – Dále postupujte dle tabulky 1. (jednotlivé reagencie přidávejte do všech zkumavek v pořadí určovaném řádky v tabulce). – Po přidání každé reagencie obsah zkumavek protřepejte.

16

Tabulka 1. zkumavka enzymový extrakt (ml) malonan sodný (ml) inkubace 10 min. při laboratorní teplotě povařit 2 min. ve vrouc( vodní lázni pufr (ml) jantaran sodný (ml) methylenová modř (ml) zbarvení

1 1 – – – 1,0 – 0,5

2 1 – – – 0,5 0,5 0,5

3 1 0,5 ano – – 0,5 0,5

4 1 – – ano 0,5 0,5 0,5

– Do každé zkumavky přidejte pomalu po její stěně parafínový olej tak, aby utvořil přibližně 5 mm vysokou vrstvu pro zachování anaerobních podmínek. – Inkubujte 30 min při 37° C a průběžně sledujte postupné odbarvování methylenové modři. – Po odbarvení příslušnou zkumavku protřepejte a nechte znovu reagovat. – Výsledné zbarvení zapište do tabulky. Poznámky:

17

Biologické oxidace II - Reaktivní formy kyslíku Mezi reaktivní formy kyslíku (reactive oxygen species, ROS) patří především volné kyslíkové radikály, tedy atomy nebo molekuly s volným nepárovým elektronem, který sloučenině propůjčuje vysokou reaktivitu. Kromě volných radikálů sem řadíme i další vysoce reaktivní sloučeniny, například peroxid vodíku. Důležití zástupci ROS jsou superoxid O2–, hydroxylový radikál OH. a peroxid vodíku H2O2. Podobnou charakteristiku a význam jako ROS mají také sloučeniny označované jako RNS, reaktivní formy dusíku (reactive nitrogen species). Hlavním místem vzniku ROS v organismu za fyziologických okolností je dýchací řetězec, ve kterém tyto sloučeniny vznikají jako vedlejší produkt při nedokonalé redukci kyslíku. Mimo to mohou kyslíkové radikály vznikat tzv. Fentonovou reakcí. Kovový iont (železo, méně často měď) zde reaguje s peroxidem vodíku za vzniku volného radikálu: Fe2+ + H2O2 → Fe3+ + OH· + OH ROS jsou velmi reaktivní sloučeniny poškozující biologické makromolekuly. Mohou být například příčinou zlomů a mutací DNA, snižují aktivitu enzymů, poškozují iontové kanály v buněčných membránách a peroxidací membránových lipidů mohou měnit propustnost membrán a poškozovat je. S působením ROS je také spojován vznik celé řady onemocnění a patologických stavů, jako je ateroskleróza, reperfuzní poškození ischemické tkáně a v neposlední řadě také neurodegenerativní procesy (Alzheimerova choroba). ROS a především RNS mají však i své významné fyziologické funkce (např. v buněčné imunitě a mezibuněčné signalizaci). Nadbytek ROS je z organismu odstraňován pomocí několika enzymů, mezi něž patří superoxiddismutasa, katalasa a peroxidasa. Superoxiddismutasa katalyzuje přeměnu volného radikálu superoxidu na peroxid vodíku, který je dále rozkládán katalasou a peroxidasou. 2O −2 + H2 → H2O2 + O2 Katalasa rozkládá peroxid vodíku přímo na kyslík a vodu, jak je znázorněno v této reakci: H2O2 → 2 H2O + O2 Peroxidasa potřebuje pro svoji činnost další molekulu, donor elektronů, pomocí kterých redukuje peroxid na vodu a tento donor tedy vystupuje z reakce ve své oxidované formě. Typickým příkladem sloučenin, které poskytují peroxidase elektrony pro redukci H2O2, je glutathion, který je oxidován enzymem glutathionperoxidasou.

18

ÚLOHA 2.

Důkaz peroxidasy Peroxidasa (POD) katalyzuje redukci peroxidu vodíku na vodu za současné oxidace vhodného reaktantu, v tomto případě o-tolidinu. Jeho oxidační produkt je zbarven modrozeleně: POD H2O2 + AH2 → 2 H2O + A Podobné reakce jsou využívány při spektrofotometrickém stanovení koncentrace různých metabolitů (např. glukosy, kyseliny močové, cholesterolu) v séru nebo moči, kde peroxid vodíku vzniká jako vedlejší produkt v příslušné enzymové reakci. Jeho množství, přímo úměrné koncentraci stanovované látky, se zjišťuje v následné peroxidasové reakci. Přidaný chromogen (AH2) se v jejím průběhu oxiduje na barevnou sloučeninu vhodnou k fotometrickému stanovení. Pracovní postup: – Do čtyř kalibrovaných zkumavek připravte inkubační směs, postupujte v pořadí daném řádky v tabulce 3. – Extrakt ve zkumavce 2 povařte asi 2 min ve vroucí vodní lázni. – Výsledné zbarvení v jednotlivých zkumavkách zapište do tabulky 3. Tabulka 2. zkumavka extrakt z brambor (ml) povařit 2 min ve vroucí vodní lázni o-tolidin v kyselině. octové peroxid vodíku (ml) destilovaná voda (ml) zbarvení

1 1 – 4 kapky 0,2 –

2 1 ano 4 kapky 0,2 –

3 1 – 4 kapky – 0,5

4 – 4 kapky 0,2 1

Poznámky:

19

ÚLOHA 3.

Důkaz katalasy a pseudoperoxidasová reakce Katalasa je hemový enzym, přítomný ve většině aerobních buněk. V lidském organismu je její aktivita nejvyšší v hepatocytech a erythrocytech. Na subcelulární úrovni je lokalizována převážně v peroxisomech (obsahují enzymy, produkující peroxid vodíku). Odstraňování peroxidu vodíku peroxidasou a katalasou má význam např. v prevenci Fentonovy reakce. V této úloze je demonstrována katalasová aktivita krve, která se projeví vývojem kyslíku. Katalasa je inhibována kyanidem, podobně jako cytochromoxidasa. V krvi lze kromě aktivity katalasy a peroxidasy prokázat také pseudoperoxidasovou aktivitu. Ta je vázána na přítomnost železnatého iontu v krevním barvivu hemoglobinu. Fe2+ katalyzuje rozklad peroxidu vodíku. Výsledkem je opět redukce peroxidu na vodu a oxidace o-tolidinu na zelenomodrý oxidační produkt. Protože tato reakce není enzymově katalyzovaná, nedá se, na rozdíl od reakce katalyzované peroxidasou, inaktivovat varem. Pseudoperoxidasová reakce se používá k důkazu krve v moči. Pracovní postup: – – – –

Do tří zkumavek odměřte po 1 ml zředěné krve. Krev ve zkumavce 2 povařte asi 2 min ve vroucí vodní lázni. Do všech zkumavek odměřte reagencie v pořadí daném řádky v tabulce 4. Roztok kyanidu draselného přidejte z dávkovače!

Tabulka 4. zkumavka zředěná krev (ml) povařit 2 min ve vroucí vodní lázni kyanid draselný (ml) peroxid vodíku (ml) vývoj kyslíku o-tolidin v k. octové zbarvení

1 1 – – 0,2

2 1 ano – 0,2

3 1 – 0,2 0,2

2 kapky

2 kapky

2 kapky

Poznámky:

20

ÚLOHA 4.

Xanthinoxidoreduktasa Xanthinoxidoreduktasa (XOR) je flavoprotein, který obsahuje prostetickou skupinu FAD, dále molybden a Fe-S centrum. Enzym není inhibován kyanidem. Vyskytuje se např. v savčím mléku, krvi nebo v endotheliálních buňkách cév. V katabolismu purinů katatyzuje oxidaci hypoxanthinu a xanthinu na kyselinu močovou. Její specifita je poměrně malá, substrátem mohou být i alifatické aldehydy, akceptorem atomů vodíku může být methylenová modř. Obě tyto skutečnosti využívá modelový pokus, demonstrující aktivitu XOR v nepasteurovaném mléku. Přirozeným akceptorem atomů vodíku je buď molekulární kyslík nebo NAD+ podle formy enzymu. Pro D-formu xanthindehydrogenasy (XOR, XD) je výlučným akceptorem atomů vodíku NAD+. Xanthinoxidasa v O-formě (XOR, XO) přenáší atomy vodíku na molekulový kyslík za tvorby velice reaktivního superoxidového radikálu: XO hypoxanthin + H2O + 2 O2 → xanthin + 2 O2 + 2 H+ Fyziologický poměr XD/XO je vysoký. Může být změněn ve prospěch nežádoucí XO např. oxidací sulfhydrylových skupin -SH přítomných v molekule enzymu, nebo proteolýzou. Proteolytické enzymy konvertují XO z XD při ischemizaci tkáně, substrát pro její činnost vzniká degradací ATP při ischemii. Po vyčerpání obranného systému (antioxidanty, superoxiddismutasa, glutathionperoxidasa, katalasa, atd.) jsou vznikající volné radikály hlavní příčinou reperfusního poškození tkání, např. při infarktu myokardu. Pracovní postup: – Do tří zkumavek připravte inkubační směs podle řádků tabulky 5. Tabulka 4. zkumavka čerstvé mléko (ml) svařené mléko (ml) methylenová modř (ml) formaldehyd zbarvení

1 2,5 – 0,5 2 kapky

2 – 2,5 0,5 2 kapky

– Obsah zkumavek dobře promíchejte! – Do každé zkumavky přidejte pomalu po stěně parafínový olej tak, aby utvořil přibližně 5 mm vysokou vrstvu pro zachování anaerobních podmínek. – Inkubujte při 37° C a kontrolujte, ve kterých zkumavkách dojde k odbarvení inkubační směsi. – Po protřepání se vzduchem směs znovu zmodrá, po vložení do lázně se obsah zkumavky opět odbarví. Proces lze opakovat, dokud se nespotřebuje všechen formaldehyd.

21

– Výsledné zbarvení zapište do tabulky.

Poznámky:

22

SACHARIDY I

Klíčová slova: monosacharidy, disacharidy, polysacharidy, adiční reakce aldehydů, poloacetály, acetály, glykosidy, oxidace, redukce, komplexní sloučeniny, hydrolýza, kyselá hydrolýza škrobu, složení a struktura škrobu. Reagencie: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19.

roztok glukosy 0;05 mol/l roztok fruktosy 0,05 mol/l roztok ribosy 0,05 mol/l roztok kyseliny glukuronové 0,05 mol/l roztok maltosy 0,03 mol/l roztok sacharosy 0,02 mol/l roztok škrobu 10 g/1 4% roztok formaldehydu Schiffovo činidlo (roztok barviva fuchsinu odbarvený hydrogensiřičitanem sodným) Fehlingův roztok I (síran měďnatý 70 g/1) Fehlingův roztok II (250 g hydroxidu sodného a 350 g vinanu sodnodraselného v 1 1 vody) Benedictovo činidlo (1 1 činidla obsahuje 17,3 g síranu mědnatého, 100 g. bezvodého uhličitanu sodného a 173 g citrátu sodného) roztok hydroxidu sodného 2 mol/l !ŽÍRAVINA! Lugolův roztok (roztok jodu 20 g/1 v roztoku jodidu draselného 40 g/1) 100x zředěný koncentrovaná kyselina chlorovodíková !ŽÍRAVINA! Bialovo činidlo: 1,25 g orcinu a 0,1 g FeCl3 a doplnit 707 mol/ HCl do 500 ml. Tollensovo-Wheelerovo (floroglucinolové) činidlo: 0,5 g floroglucinolu ve 100 ml koncetrované HCl. Selivanovo činidlo: ve směsi 50 ml konc. HCl a 50 ml vody rozpustit 0,05 g resorcinolu Discheho činidlo: 1 g difenylaminu rozpustit ve 2,5 ml konc. kyseliny sírové a doplnít do 100 ml kyselinou octovou ledovou)

23

ÚLOHA 1.

Reakce se Schiffovým činidlem Charakteristickými reakcemi aldehydů a ketonů jsou adice (viz Reakce funkčních skupin biochemicky významných organických sloučenin, úloha 1.1. a 4.). Protože však monosacharidy existují ve vodném roztoku převážně v cyklické formě, vzniklé intramolekulární adicí, neposkytují všechny adiční reakce, které jsou běžné pro oxosloučeniny. Pracovní postup: – K 1 ml roztoku glukosy přidejte kapátkem 2 kapky Schiffova činidla. – Stejnou reakci proveďte i s roztokem formaldehydu. – Porovnejte výsledek obou reakcí.

Poznámky:

24

ÚLOHA 2.

Redukční vlastnosti sacharidů 2.1. Redukční vlastnosti glukosy (Glc) Přestože glukosa nemá volnou aldehydovou skupinu, reaguje zvláště v alkalickém prostředí snadno s oxidačními činidly (např. komplexními kationty některých těžkých kovů). Podmínkou redukčních vlastností glukosy je přítomnost volné hemiacetálové hydroxyskupiny v její molekule. Při zahřívání v alkalickém prostředí poskytuje glukosa štěpné produkty, které mají silné redukční účinky. 2.1.1. Fehlingova zkouška Pracovní postup: – Ve zkumavce smíchejte Fehlingův roztok I a II v poměru 1 : 1, celkový objem 1 ml, promíchejte. – Ke vzniklému modrému roztoku přidejte 1 ml roztoku glukosy, promíchejte a zahřívejte ve vroucí vodní lázni. – Po krátkém povaření se vyloučí červená sraženina oxidu měďného. – Do tabulky 1. uveďte komplexotvornou složku! 2.1.2. Benedictova zkouška Pracovní postup: – K 1 ml Benedictova činidla přidejte asi 3 kapky roztoku glukosy, promíchejte. – Obsah zkumavky zahřívejte ve vroucí vodní lázni asi 2 min, oxid měďný se vyloučí jako červená sraženina. – Do tabulky 1. uveďte komplexotvornou složku! 2.1.3. Zkouška Trommerova (viz Reakce funkčních skupin biochemicky významných organických sloučenin, úloha 3.3.). Pracovní postup: – Ve zkumavce smíchejte 1 ml roztoku hydroxidu sodného a 3 kapky roztoku síranu měďnatého. Vznikne bleděmodrá sraženina. – Za protřepávání obsahu zkumavky přidávejte roztok glukosy, dokud se sraženina nerozpustí na modrý roztok. – Potom zkumavku zahřívejte ve vroucí vodní lázni a pozorujte vznik sraženiny oxidu měďného. – Zkuste stejnou reakci bez přidání glukosy a zapište průběh reakce chemickými rovnicemi: a) NaOH + CuSO4 →

b)

zahřátí →

– Do tabulky 1. uveďte komplexotvornou složku!

25

Tabulka 1. redukované činidlo

Fehling

Benedict

Trommer

ligand

Zkouška Fehlingova a Benedictova se používá k důkazu glukosy v moči.

Poznámky:

26

2.2. Redukční vlastnosti vybraných sacharidů Sacharidy, které mají ve své molekule volný hemiacetálový hydroxyl, vykazují redukční vlastnosti podobně jako glukosa. V alkalickém prostředí tedy redukují komplexní kation mědnatý na kation měďný, který komplexní ion netvoří a vyloučí se jako nerozpustný oxid měďný. Pracovní postup: – Podle postupu uvedeného v 2.1.1. ověřte redukční vlastnosti fruktosy (Fru), ribosy (Rib), kyseliny glukuronové (GlcUA), maltosy, sacharosy a škrobu. – Výsledky zapište do tabulky 2. Tabulka 2. sacharid

Fru

Rib

GlcUA

maltosa

sacharosa

škrob

redukce

Poznámky:

27

ÚLOHA 3

Rozlišení aldohexos a ketohexos 3.1. Reakce fruktosy se Selivanovým činidlem Pracovní postup: − K 1 ml fruktosy přidejte 1 ml Selivanova činidla a krátce zahřejte ve vroucí lázni. − V přítomnosti fruktosy vzniká rychle červené zbarvení. − Tutéž reakci proveďte s roztokem glukosy a porovnejte výsledek reakce.

Poznámky:

28

ÚLOHA 4

Reakce pentos 3.1. Reakce s orcinolem (Bialovým činidlem): Pracovní postup: – Do zkumavky odměřte 1 ml Bialova činidla a přidejte 5−6 kapek vzorku. – Zahřejte do varu. – Za 2 − 3 minuty vznikne zelené zabarvení, které přísluší ribose. 3.2. Reakce s floroglucinolovým činidlem (Tollensova-Wheelerova reakce): Pracovní postup: – 1ml roztoku floroglucinolu zahřejte s 0,5 ml vzorku. – Vznikne červené zabarveni, jež přísluší ribose. 3.3. Reakce s difenylaminem (Discheho činidlem): Pracovní postup: – K 1 ml vzorku přidejte 2 ml Discheho činidla. – Protřepejte a zahřívejte 10 min ve vroucí vodní lázni. – Vzniklé modré zabarvení dává deoxyribosa.

29

ÚLOHA 4.

Kyselá hydrolýza škrobu Molekuly glukosy jsou ve škrobu vázány α-D-(1→4) glykosidovými vazbami, které nejsou stálé v kyselém prostředí. Proto se kyselou hydrolýzou polysacharidy postupně štěpí na polysacharidy s kratším řetězcem, oligosacharidy, maltosu a nakonec D-glukosu. Průběh hydrolýzy se projevuje postupnou změnou zbarvení hydrolyzátu s jodem, protože zkracování šroubovice amylosy mění barvu komplexu škrobu s jodem. Pracovní postup: – Připravte 8 zkumavek a do každé odlejte asi 1 ml zředěného Lugolova roztoku. – Do malé Erlenmeyerovy baňky odměřte válečkem 10 ml škrobového mazu a zahřejte na ploténce k varu. – Z dávkovače odměřte do další zkumavky 0,5 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové a opatrně ji přilijte k vroucí směsi. Baňku přikryjte hliníkovou folií a udržujte mírný var. – Okamžitě odeberte pomocí plastikové pipetky malý vzorek reakční směsi a přidejte do první zkumavky s Lugolovým roztokem. – Tento postup opakujte každou minutu a pozorujte změnu zbarvení. – Jestliže se již Lugolův roztok hydrolyzátem nebarví, povařte reakční směs ještě 5 min, aby hydrolýza proběhla úplně. – Se vzorkem hydrolyzátu proveďte Fehlingovu zkoušku. – Zbarvení jednotlivých frakcí zapište do tabulky 3. Tabulka 3. zkumavka

1

2

3

4

5

6

7

8

zbarvení

Poznámky:

30

SACHARIDY II

Klíčová slova: glykemie, glukosový toleranční test, glykemická křivka, glukosurie, glukosaoxidasa (GOD - EC 1.1.3.4), peroxidasa (POD - EC 1.11.1.7), glykace proteinů, HbA1C glykovaný hemoglobin, afinitní chromatografie. Reagencie: 1. 2. 3. 4. 5.

vzorky séra S1, S2, S3 vzorek moče U vzorek nesrážlivé krve K standardní roztok glukosy c = 10 mmol/l souprava Glukosa GOD-PAP, (BioSystems): enzymové činidlo: fosfátový pufr 140 mmol/l, pH 8 glukosaoxidasa (GOD) 166 µkat/l peroxidasa (PAP) 16 µkat/l 3-methylfenol (chromogen) 10 mmol/l 4-aminoantipyrin (chromogen) 1 mmol/l 6. souprava Hemoglobin A1c (BioSystems): činidlo č.1: ftalát draselný 50 mmol/l, detergent 5 g/l, pH 5,0, azid sodný 0,95 g/l činidlo č.2: fosfátový pufr 30 mmol/l, pH 6,5, azid sodný 0,95 g/l činidlo č.3: fosfátový pufr 72 mmol/l, pH 6,5, azid sodný 0,95 g/l

31

ÚLOHA 1.

Glukosový toleranční test, denní ztráty glukosy močí Koncentrace glukosy v krvi se nazývá glykemie, nověji glukosemie. Její hodnota je výsledkem působení řady regulačních faktorů, mezi nimiž hrají dominantní roli insulin a kontrainsulinární hormony − glukagon, katecholaminy, glukokortikoidy a somatotropní hormon. Hlavním orgánem, který zajišťuje homeostázu glukosy jsou játra. U zdravého člověka je glykemie nalačno udržována v poměrně úzkém rozmezí (asi 4 − 6 mmol/l) a po jídle nepřevyšuje ve venosní plazmě 11 mmol/l. Netrvá-li toto zvýšení déle než 60 min po příjmu potravy je považováno za fyziologické. Porucha mechanismů podílejících se na udržování euglykemie se může projevit ve smyslu trvalého zvýšení koncentrace glukosy (hyperglykemie) nebo naopak jejího snížení (hypoglykemie). V obou případech jde o stavy ohrožující pacienta jednak chronicky, jednak akutně. Dlouhodobá hyperglykemie u dekompenzovaného diabetika je spojena s řadou orgánových komplikací. Těžší hyperglykemie, stejně jako hypoglykemie, mohou vyústit až do bezvědomí a bez včasné odborné pomoci ohrožují pacienta na životě. Nejčastější poruchou regulace metabolismu sacharidů je diabetes mellitus (DM, asi 7 − 8 % populace v ČR). Toto onemocnění je způsobeno absolutním nebo relativním nedostatkem insulinu. Dominujícím laboratorním nálezem u neléčeného diabetika je chronická hyperglykemie doprovázená charakteristickými známkami DM (polyurie, polydipsie, hubnutí, únava). Pro diagnózu diabetu svědčí: a) přítomnost klinické symptomatologie provázené náhodnou glykemií vyšší než 11,0 mmol/l a následně glykemií v žilní plazmě nalačno vyšší než 7,0 mmol/l b) při nepřítomnosti klinických projevů nález glykemie v žilní plazmě nalačno vyšší než 7,0 mmol/l po osmihodinovém lačnění. c) nález glykemie za 2 hodiny při oGTT (orální glukosový toleranční test) vyšší než 11,0 mmol/l Při nálezu hraničních hodnot glykemie nebo rozporu mezi náhodnou glykemií a glykemií nalačno je indikován zátěžový test tzv. orální glukosový toleranční test (oGTT). Test je založen na sledování reakce organismu po perorálním podání definovaného množství glukosy (75 g ve 200-250 ml vody). Hodnotí se, zda je organismus schopen v daném časovém úseku udržovat glykemii ve fyziologickém rozmezí. V moči se glukosa fyziologicky vyskytuje jen v nepatrném množství, neboť je zpětně resorbována a běžnými metodami není prokazatelná. Teprve při překročení renálního prahu pro glukosu (0,16 − 0,18 g/l, resp. 9 − 10 mmol/l po dobu 15 min.) se objevuje glykosurie. Jako fyziologickou lze označit přechodnou alimentární glykosurii po požití velkého množství koncentrovaných sacharidů. Ztráta, též odpad glukosy (množství glukosy v gramech vyloučené močí za 24 hod.) se dříve používala k monitorování kompenzace diabetu. Odběr krve pro stanovení glykemie se nejčastěji provádí nalačno. Je-li indikován oGTT, stanovují se glykemie nalačno, za 60 a 120 min po zátěži. Odebírá se kapilární (ev. venosní) krev, koncentrace glukosy se stanovuje v plné krvi, v plazmě nebo v séru. V plazmě a séru jsou koncentrace glukosy o 10 – 15 % vyšší než hodnoty naměřené v plné krvi a při hodnocení glykemie je třeba na toto brát zřetel.

32

Z naměřených hodnot glykemie v jednotlivých odběrech získáme glykemickou křivku. Z jejího průběhu je možno usuzovat, zda vyšetřovaný organismus reaguje na glukosovou zátěž adekvátně či nikoliv. K nejčastěji diagnostikovaným odchylkám patří diabetes mellitus a porušená glukosová tolerance. Ke stanovení koncentrace glukosy se využívá spřažené glukosaoxidasové -peroxidasové reakce. Enzym glukosaoxidasa (GOD) katalyzuje oxidaci glukosy kyslíkem za vzniku kyseliny glukonové (přecházející na vnitřní ester glukonolakton) a peroxidu vodíku: GOD D-glukosa + O2 → glukono-1,5-lakton + H2O2 Nízká koncentrace glukosy v reakční směsi (10−4 mol/l) ve srovnání s hodnotou Km glukosy pro GOD (3,3.10−2 mol/1) způsobuje, že reakce probíhá podle kinetiky 1. řádu. Rychlost reakce je tedy přímo úměrná koncentraci glukosy. Nevratný průběh této reakce umožňuje oxidaci celého množství glukosy. Vzniklý peroxid vodíku se stanovuje pomocí spřažené oxidace chromogenu, která je katalyzována enzymem peroxidasou (viz Biologické oxidace, úloha 3). Koncentrace vzniklého barviva, určená fotometricky, je úměrná koncentraci glukosy. Pro sestrojení glykemické křivky obdržíte tři vzorky od pacienta označeného číslem: S1 = sérum nalačno S2 = sérum 1 hod po Glc zátěži S3 = sérum 2 hod po Glc zátěži Pro výpočet denní ztráty glukosy močí stanovíte koncentraci glukosy ve vzorku moči z 24 hod sběru s údajem o diuréze, označený U. POZOR! MOČ ZŘEĎTE 10 x. VÝSLEDEK VYNÁSOBTE ŘEDĚNÍM. Každý vzorek séra, moče a standard zpracujte v tripletu, slepý vzorek pouze jednou. Pracovní postup: – Do očíslovaných zkumavek napipetujte inkubační směs podle tabulky 1. Tabulka 1. reagencie (ml)

VzorekS

vzorekU

standard

slepý vzorek

0,01

−

− −

zředěná moč

−

− 0,01

standardní roztok glukosy

−

−

− 0,01

− 1,5

− 1,5

− 1,5

sérum

destilovaná voda enzymové činidlo

− 0,01 1,5

– Všechny zkumavky dobře protřepejte a nechte 30 min inkubovat při pokojové teplotě v temnu (v laboratorním stole). – Změřte absorbance vzorků i standardního roztoku proti slepému vzorku do 30 min po ukončení inkubace při vlnové délce 500 nm. Naměřené hodnoty zapište do tabulky 2. – Z průměru naměřených hodnot absorbance vzorků a standardu a z koncentrace standardního roztoku glukosy vypočítejte koncentrace glukosy v séru a v moči.

33

– Výsledky zapište do tabulky 2. Tabulka 2. vzorek č.:

absorbance

standard S1 S2 S3 U

průměr

c (mmol/l) 10

– Ze získaných hodnot nakreslete glykemickou křivku. Určete, o který typ poruchy se může jednat v případě sledovaného pacienta:

– Vypočítejte denní ztráty glukosy močí (g/24 hod) z hodnoty koncentrace glukosy v moči (g/1) a diurézy (udána u vzorku moče). – Výsledky zapište do tabulky 3. Tabulka 3. c Glc v moči (g/l)

diuréza (l/24 hod)

denní ztráty (g/24 hod)

34

Poznámky:

35

ÚLOHA 2.

Glykovaný hemoglobin Glykovaný hemoglobin vzniká glykací bílkovinných řetězců hemoglobinu. Obecně se jedná o neenzymovou reakci mezi aldehydovou skupinou glukosy (ev. i jiného monosacharidu) a volné aminoskupiny bílkoviny. Tou může být nejen hemoglobin, ale i jakýkoliv jiný protein v plazmě nebo tkáních. V případě hemoglobinu monosacharid reaguje s N-terminálním valinem globinového řetězce nebo s ε-aminoskupinou lysinu v jeho řetězcích. Reakce probíhá ve dvou krocích. Nejdříve vzniká labilní aldimin (Schiffova báze), který se přesmykem stabilizuje na aminoketon (viz Reakce funkčních skupin biochemicky významných organických sloučenin, úloha 4.):

Nejreaktivnějším místem pro glykaci hemoglobinu je N-terminální valin β-řetězce (asi 60 % vázané glukosy), tato majoritní komponenta je označována HbA1c. Zbývajících 40 % glukosy se váže na dalších 44 glykačních míst. Celkový glykovaný hemoglobin Glyc-Hb je tedy směsí několika frakcí, které se liší jak místem, v němž proběhla glykace, tak druhem navázaného sacharidu. Podíl HbA1c je úměrný koncentraci glukosy v krvi, u zdravého člověka se pohybuje v rozmezí 2,8 – 4,0 %, u pacientů s diabetes mellitus jsou hodnoty zvýšené v závislosti na hodnotách glykemie. Hodnota HbA1c poskytuje nepřímou informaci o průměrné hladině glykemie v časovém období 4 − 6 týdnů (biologický poločas přežívání erytrocytů) před odběrem krve. Je tedy objektivnějším kriteriem pro hodnocení kompenzace diabetiků než hodnota glykemie.. Glykace hemoglobinu vede samozřejmě ke změně struktury a tedy i vlastností původní molekuly. Bylo zjištěno, že Glyc-Hb má vyšší afinitu ke kyslíku než neglykovaný hemoglobin, protože glukosa se váže na stejné místo jako hlavní allosterický regulátor 2,3BPG. Z toho důvodu se zhoršuje uvolňování kyslíku z Glyc-Hb. Podobně jako hemoglobin jsou glykovány i ostatní proteiny. Glykace je jednou z nejdůležitějších posttranslačních modifikací proteinů nejen v plazmě, ale i ve tkáních. Tato spontánní reakce souvisí s poškozováním tkání některých orgánů a projevy komplikací u pacientů s diabetem. Pro stanovení glykovaného hemoglobinu HbA1c se využívá principu ionexové chromatografie, tj. molekuly jsou separovány podle náboje. Stacionární fází (iontoměnič, ionex) je makromolekulární matrice obsahující kyselou nebo bazickou funkční skupinu. Pro zachycení HbA1c frakce slouží iontoměniče s kyselou funkční skupinou (sulfo-kyselina, karboxylová kyselina) nesoucí záporný náboj – katexy. Ion obsažený v ionexu je vyměněn za ion obsažený v mobilní fázi nebo ve vzorku a na principu soutěžení ionexu o tyto ionty dochází k separaci. Ionty ze vzorku jsou obvykle ionexem pevně připoutány a uvolní se. elucí 36

roztokem o vyšší iontové síle než bylo použito u roztoku pro nanesení vzorku Vytěsnění navázané frakce je založeno na faktu, že síla elektrostatické vazby mezi iontem a ionexem klesá s velikostí iontu. Malé ionty (např. Na+ nebo Cl–) v dostatečné koncentraci jsou proto schopny vytěsnit ionty větší. Pracovní postup: − Připravte krevní hemolyzát: do „eppendorfky“ odpipetujte 50 µl protřepané krve pacienta (vzorek K, z „eppendorfky“ stejné barvy jako vzorky séra a moči v úloze 1). − Přidejte 200 µl hemolyzačního činidla č.1., dobře protřepejte a nechte 10 min stát. − Sejměte horní i dolní uzávěr chromatografické mikrokolonky. Zatlačte horní disk skleněnou tyčinkou těsně nad povrch iontoměniče. Nestlačujte pryskyřici! Pod kolonku umístěte zkumavku. − Kapalinu na pryskyřici nechejte prokapat přes spodní uzávěr. − Na filtr kolonky opatrně napipetujte 50 µl hemolyzované krve a ponechte volně vytékat do zkumavky. − Přidejte 200 µl činidla č. 2., nechte tekutinu volně odtékat do zkumavky. − Přidejte 2 ml činidla č. 2. a nechte opět tekutinu volně odtékat do stejné zkumavky. − Pod kolonku dejte novou zkumavku! − Na kolonku napipetujte 4 ml činidla č. 3. (elučního pufru). Získaný eluát obsahuje frakci glykovaného hemoglobinu HbA1c. − Eluát důkladně promíchejte a změřte absorbanci frakce HbA1C při 615 nm proti destilované vodě (AHbA1C). − Pro zjištění koncentrace celkového hemoglobinu napipetujte do testovací zkumavky 12 ml činidla č. 3. a přidejte 50 µl hemolyzátu a dobře protřepejte. Změřte A615 nm proti destilované vodě (AHb TOTAL). − Z naměřených hodnot absorbancí vypočítejte procentuální obsah HbA1cpodle vztahů: % HbA1C =

AHbA1C ⋅ VHbA1C ⋅ 100 ATOTAL ⋅ VTOTAL

Objem HbA1C (VHbA1C) = 4 ml, Objem HbTOTAL (VHb TOTAL) = 12 ml % HbA1C =

100 AHbA1C ⋅ 3 ATOTAL

Přepočet na US NGSP (US Glycohemoglobin Standardization Program): %HbA1C-US NGSP = 0,86 · %HbA1C-BioSystems + 0,24 Přepočet na IFCC (International Federation of Clinical Chemistry): %HbA1C-IFCC = 0,94 · % HbA1C-BioSystems – 2,09 − Získané hodnoty zapište do tabulky 4.

37

Tabulka 4. AHbA1C

AHb TOTAL

% Hb1C

VYHODNOCENÍ: REFERENČNÍ HODNOTY normální tolerance Glc porucha tolerance Glc diabetes mellitus

nalačno <6 <8

glykemíe (mmol/l) po 1 hod ≤ 11 ≥ 11

≥8

≥ 11

REFERENČNÍ HODNOTY

% HbA1C

normální tolerance Glc suspektní hodnota diabetes mellitus

4,4 – 6,5 6,5 – 10 > 11

po 2 hod <6 8 − 11 ≥ 11

Tabulka 5. vzorek séra č.: glykemie (mmol/l) nalačno po 1 hod po 2 hod

denní ztráty Glc močí (g/24 hod)

%HbA1C

38

ÚLOHA 3.

Monitorování glykemie pomocí glukometru GLUCOTREND® ROCHE

Obr. 1. Glukometr GLUKOTREND® a testovací proužek GLUKOTREND® je přístroj pro rychlé měření koncentrace glukosy v čerstvé kapilární krvi pomocí reflexní fotometrie. Reflexní fotometr kvantitativně vyhodnocuje enzymovou reakci probíhající na testovací zóně testovacího proužku (obr. 1.). Vlákna testovací zóny proužku jsou impregnována činidly, k jejichž aktivaci stačí pouze voda obsažená v naneseném vzorku krve (princip "suché chemie"). Glukometr GLUKOTREND® umožňuje spolehlivě a velmi jednoduše měřit glykemii v rozmezí 0,6 – 33,3 mmol/l. Stačí kápnout jednu kapku kapilární krve na testovací proužek a ten vložit do přístroje. GLUKTREND® automaticky stanoví optimální dobu měření a po 30 s zobrazí na displeji koncentraci glukosy v krvi. Vzhledem k jednoduchosti obsluhy a rychlosti stanovení je glukometr velice výhodný pro sledování glykemie u lůžka pacienta nebo pro domácí měření pacienty samými – self monitoring.

39

Pracovní postup: – Zapněte přístroj, na displejovém okénku se objeví Gluc a třímístné kódové číslo. Nad tímto číslem se krátce objeví nápis CODE a malý testovací proužek. Červený bod F se krátce objeví ve vedení testovacích proužků E. – Srovnejte číslo kódu v okénku displeje nakódovaného glukometru s číslem kódu vytištěném na štítku tuby s testovacími proužky. – Vyjměte testovací proužek z tuby a ihned ji uzavřete. Neuzavření tuby má za následek znehodnocení hygroskopického činidla v zátce. Testovací proužky jsou pak nepoužitelné. – Uchopte proužek tak, že nápis GLUKOTREND je obrácen nahoru (viz. obr. l.). Vložte proužek do vkládací štěrbiny D ve směru šipky, až zapadne s lehkým cvaknutím. – Nápis CODE a třímístné číslo zmizí. V okénku displeje problikává testovací zóna na malém testovacím proužku a nad ní je zobrazena kapka krve. Červený bod na testovacím proužku stále bliká. – Promasírujte lehce špičku prstu, abyste zvýšili prokrvení a tak usnadnili odběr. Nezapomeňte na dezinfekci! – Použijte zařízení pro vpich do prstu (Softclix II a lanceta Softclix II). – Vyjměte testovací proužek vodorovně mimo vodící lištu E. V displejovém okénku se krátce objeví malý testovací proužek a kapka krve. Hlášení GLUC se zastaví. – Nechte vsáknout kapku krve do žluté zóny testovacího proužku. Krev neroztírejte ani nenanášejte další kapku. – Proužek vložte (nápisem GLUKOTREND nahoru) do vkládací štěrbiny D ve směru šipky až správně zaklapne. Ihned se ozve krátké zapípání a ikonka ukáže, že přístroj pracuje. Po 30 s se naměřená hodnota ukáže v okénku displeje. – Přístroj vypněte, naměřená hodnota je automaticky uložena.

Poznámky:

40

SACHARIDY III Klíčová slova: lakton, enol, oxidace, redukce, kyselina L-gulonová, kyselina D-glukuronová. Reagencie: 1. 2. 3. 4. 5. 6.

roztok kyseliny L-askorbové 2 mmol/l v kyselině chlorovodíkové 20 g/l roztok síranu železnatého 0,4 mmol/l roztok chloridu železitého 0,4 mmol/l roztok hexakyanoželezitanu draselného 0,01 mol/l Fehlingův roztok I (síran mědnatý 70 g/l Fehlingův roztok II (250 g hydroxidu sodného a 350 g vinanu sodnodraselného v 1 1 vody) 7. roztok sodné sole 2,6-dichlorfenolindofenolu 1 mmol/l ve fosfátovém pufru, 30 mmol/l, pH 7 8. koncentrovaná kyselina chlorovodíková !ŽÍRAVINA! 9. pomerančová šťáva 10x zředěná vodou

41

Kyselina askorbová Kyselina askorbová, γ-lakton kyseliny 2-oxo-L-gulonové, neboli vitamin C je ve vodě rozpustný vitamin odvozený od sacharidů.

Vyskytuje se v čerstvém ovoci a zelenině, zejména bramborách a zelí, ale i v čerstvém mase. Savci, kromě vyšších primátů a morčete, ji syntetizují z D-glukuronové kyseliny a proto pro ně není vitaminem. Askorbát je silné redukční činidlo, oxiduje se na dehydroaskorbovou kyselinu, resp. její lakton. Jako kofaktor se účastní několika důležitých reakcí, především posttranslační hydroxylace prolinu (prolylhydroxylasa resp. prokolagen-prolin-dioxygenasa [EC 1.14.11.2]) a lysinu (lysylhydroxylasa, resp. prokolagen-lysin-5-dioxygenasa [EC 1.14.11.4]) v kolagenu. Oba enzymy obsahují jako aktivátor kation Fe2+, který se během reakce oxiduje na Fe3+ a askorbát jej opět redukuje. Při nedostatku vitaminu C tato posttranslační modifikace neprobíhá; postupně je poškozována pojivová tkáň (endotel cév – fragilita cév a tvorba petechií, úpony zubů – uvolňování a vypadávání) a vzniká onemocnění zvané kurděje (skorbut). Název vitaminu je odvozen od skorbutu a znamená látku „působící proti kurdějím“. Jako vitamin je znám již od roku 1742, kdy byl použit při léčbě kurdějí. Působí také jako antioxidant. V lidském organismu je důležitý pro vstřebávání železa (Fe2+) z potravy. Při jeho nedostatku dochází ke vzniku mikrocytární anemie. Kyselina askorbová se objevuje v moči při vysokém příjmu potravou. Jako silné redukční činidlo může ovlivnit stanovení některých analytů v moči, zejména těch, které při reakcích využívají peroxid vodíku. Ten je kyselinou askorbovou přímo redukován. Rovněž rychle rozkládá diazoniové sole používané k azokopulačním reakcím. Fehlingovo činidlo redukuje za studena (intenzita zbarvení závisí na množství kyseliny askorbové). Kvantitativní stanovení askorbové kyseliny odměrnou analýzou neboli titrací se používá k zjišťování saturace organismu askorbátem. Titrace je kvantitativní metoda umožňující stanovit koncentraci látky v roztoku tak, že k odměřenému množství analyzovaného roztoku se přidává z byrety roztok odměrného činidla o známé koncentraci. Jako odměrné činidlo se používá taková sloučenina, která se stanovovanou látkou reaguje kvantitativně ve stechiometrických poměrech. Titrace je ukončena, když celkové množství látky přítomné v analyzovaném roztoku úplné zreagovalo s odměrným činidlem. Tento okamžik se nazývá ekvivalenční bod. K jeho vizuálnímu určení se používají indikátory, které se přidávají k titrovanému roztoku. Jsou to látky, které v ekvivalenčním bodě mění svoje zbarvení.

42

Výpočet koncentrace stanovované látky: Výpočet koncentrace stanovované látky vychází z rovnice příslušné chemické reakce. V ekvivalenčním bodě je počet molů chemických ekvivalentů titrované látky (1) roven počtu molů chemických ekvivalentů v odměrném činidle (2): n1 = n2 c1 ⋅ V1 = c2 ⋅ V2 c1 = c2 ⋅ V2 / V1

n = počet molů chemických ekvivalentů c = látková koncentrace chemických ekvivalentů V1 = objem titrovaného roztoku v ml V2 = objem odměrného roztoku v m1 (spotřeba)

43

ÚLOHA 1.

Redukční vlastnosti kyseliny L-askorbové Kyselina L-askorbová je sacharidový derivát odvozený od kyseliny L-gulonové. Endiolové hydroxyl-skupiny na C2 a C3 podmiňují její kyselý charakter (pKA = 4,2) a silné redukční vlastnosti (E´0= 0,08 V). Se svým oxidačním produktem, kyselinou Ldehydroaskorbovou, tvoří redox systém, který při biochemických reakcích účinkuje jako neenzymový přenašeč vodíku. Kyselina L-askorbová redukuje železité ionty na železnaté E´0 Fe3+/Fe2+ = 0,77 V), které poskytují s roztokem hexakyanoželezitanu draselného sytě modré zbarvení tzv. berlínské modři (komplexní sloučenina kationtů Fe3+ a Fe2+ s kyanidovými aniony, (viz Vlastnosti a reakce biologicky a toxikologicky významných prvků.). Zelené zbarvení není průkazné. Pracovní postup: – Do tří zkumavek připravte reakční směs podle tabulky 1. Tabulka 1. zkumavka 3+

roztok Fe (ml) roztok Fe3+ (ml) roztok kyseliny askorbové (ml) destilovaná voda (ml) roztok K3[Fe(CN)6] zbarvení

1 1 − − 1 3 kapky

2 − 1 1 − 3kapky

3 − 1 − 1 3 kapky

– Pozorujte, ve kterých zkumavkách dojde k pozitivní reakci (asi po 30 min). – Výsledky zapište do tabulky 1.

44

ÚLOHA 2.

Stanovení koncentrace kyseliny L-askorbové Titrační stanovení kyseliny L- askorbové je založeno na její snadné oxidovatelnosti za vzniku kyseliny L-dehydroaskorbové. Jako odměrné činidlo se používá roztok sodné sole 2,6-dichlorfenolindofenolu (E´0 = 0,22 V), která je v neutrálním a alkalickém prostředí modrá, v kyselém prostředí růžová. Redukcí kyselinou L-askorbovou přechází modře zbarvená sůl na bezbarvou leukoformu. Ekvivalenční bod je určen vznikem růžového zbarvení kyselého titrovaného roztoku (kyselina askorbová je rozpuštěna v kyselině chlorovodíkové). Pracovní postup: – –

Do Erlenmeyerovy baňky napipetujte 2 ml roztoku kyseliny L-askorbové. Titrujte roztokem sodné sole 2,6-dichlorfenolindofenolu do růžového zabarvení, titraci proveďte třikrát a vypočítejte průměrnou spotřebu

Výpočet: Mr ⋅ cčinidlo ⋅ Včinidlo L-askorbová kyselina (mg/l) = Vtitrovaný Mr – relativní molekulová hmotnost L-askorbové kyseliny = 176,1 Včinidlo – objem 2,5-dichlorfenolindofenolu potřebný pro titraci vzorku v ml Vtitrovaný – objem kyseliny askorbové, který byl titrován v ml Tabulka 2. spotřeba činidla v ml průměrná spotřeba mg/l kys. L-askorbové mmol/l kys. L-askorbově

45

ÚLOHA 3.

Stabilita kyseliny L-askorbové Kyselina L-askorbová je v kyselém prostředí poměrně stálá, ale přítomnost i malého množství kovových iontů např. Fe3+, Cu2+ (viz úloha 1.) nebo zvýšená teplota, katalyzují její oxidaci vzdušným kyslíkem za současného vzniku peroxidu vodíku. 3.1. Katalýza oxidace kyseliny L-askorbové ionty Fe3+ Pracovní postup: – Do Erlenmeyerovy baňky odpipetujte 2 ml roztoku kyseliny L-askorbové, přidejte 0,5 ml roztoku chloridu železitého, zamíchejte a nechte stát 5 min. – Titrujte odměrným činidlem do růžového zbarvení. – Ze spotřeby činidla a koncentrace výchozího roztoku kyseliny L-askorbové vypočítejte její procentuální úbytek v roztoku po přidání železitých iontů. – Výsledek zapište do tabulky 3. 3.2. Vliv teploty na stabilitu kyseliny L-askorbové v roztoku Pracovní postup: – Do Erlenmeyerovy baňky odměřte 5 ml roztoku kyseliny L-askorbové. – Baňku zakryjte hliníkovou folií a povařte 10 min na vařiči (udržujte pouze mírný var, přibližně stupeň 6). – Roztok ochlaďte, přelijte do kalibrované zkumavky a doplňte destilovanou vodou na původní objem 5 ml, zamíchejte. – Odpipetujte 2 ml tohoto roztoku do Erlenmeyerovy baňky a titrujte odměrným činidlem do růžového zbarvení. – Ze spotřeby činidla a koncentrace výchozího roztoku kyseliny L-askorbové vypočítejte její procentuální úbytek v povařeném roztoku. – Výsledek zapište do tabulky 3.

46

3.3. Vliv vzdušného kyslíku na stabilitu kyseliny L-askorbové v roztoku Pracovní postup: – Do Erlenmeyerovy baňky odpipetujte 2 ml roztoku kyseliny L-askorbové. – Během 10 min roztok několikrát důkladně protřepejte. – Titrujte odměrným činidlem do růžového zbarvení. – Ze spotřeby činidla, a koncentrace výchozího roztoku kyseliny L-askorbové vypočítejte její procentuální úbytek v roztoku. – Výsledek zapište do tabulky 3. Tabulka 3. Fe3+

teplota

vzdušný kyslík

spotřeba odměrného činidla (ml) výchozí koncentrace k. askorbové(mmol) úbytek k. askorbové (mmol) úbytek k. askorbové (%)

Poznámky:

47

ÚLOHA 4.

"Saturační test" Kyselina L-askorbová, vitamín C, je účinné redukční činidlo, na kterém jsou závislé hydroxylační reakce, např. při syntéze kolagenu. Nízká saturace organismu vitamínem C se považuje za příčinu zvýšené vnímavosti vůči infekcím (obecný význam však zatím není uspokojivě vysvětlen). Lidský organismus má velkou potřebu vitamínu C, denně 50 − 75 mg (zásoba 1,5 g, nejvíce v nadledvinách), proto je nutný jeho trvalý přívod potravou, především rostlinnou. V tomto pokuse je sledována saturace organismu vitamínem C. Stanovuje se množství kyseliny L-askorbové vyloučené močí během 3 hod po vypití roztoku 1 g vitamínu C. Organismus je saturován vitamínem C, vyloučí-li se během tříhodinové periody více než 50 mg kyseliny L-askorbové. Pro zvýšení stability kyseliny L-askorbové je nutno moč ihned okyselit, v konečném objemu moči mají být 2 % (objemová) kyseliny chlorovodíkové. Pracovní postup: – Při zahájení testu (po vymočení) vypijte l g kyseliny L-askorbové (2 tablety šumivého Celaskonu 500 mg) rozpuštěné ve vodě. Zaznamenejte čas. – Přesně po 3 hodinách od vypití roztoku kyseliny L-askorbové se vymočte a objem moče změřte v odměrném válci (98 %). – Okyselte vypočítaným objemem koncentrované kys. chlorovodíkové a dobře promíchejte. – Celkový objem okyselené moče zapište do tabulky 4. – Zjistěte, zda je přítomnost kyseliny L-askorbové prokazatelná Fehlingovým činidlem. Postupujte podle návodu v úloze 2.1.1., Sacharidy I. – Výsledek zapište do tabulky 4. – Pro stanovení koncentrace kyseliny L-askorbové v moči odpipetujte 2 ml okyselené moče do Erlenmeyerovy baňky, přidejte asi 5 ml destilované vody. – Titrujte roztokem sodné sole 2,6-dichlorfenolindofenolu do růžového zbarveni. Spotřebu odměrného činidla zapište do tabulky 4. – Ze spotřeby odměrného činidla, a objemu okyselené moče vypočítejte celkové množství kyseliny L-askorbové (v mg) vyloučené močí během 3 hod a výsledek zapište do tabulky 4. – Na základě získaného výsledku zhodnoťte saturaci organismu vitamínem C. Tabulka 4. objem okyselené moče (ml) důkaz kyseliny L-askorbové Fehlingovým činidlem spotřeba odměrného činidla (ml) koncentrace kyseliny L-askorbové (mg/l) vyloučené množství kyseliny L-askorbové (mg) saturace organismu

48

Poznámky:

49

ÚLOHA 5.

Stanovení koncentrace vitamínu C v ovocné šťávě Pracovní postup: – Do Erlenmeyerovy baňky odpipetujte 2 ml ovocné šťávy (10x zředěné destilovanou vodou) a titrujte odměrným činidlem do růžového zbarvení. – Ze spotřeby odměrného činidla vypočítejte koncentraci vitamínu C ve zředěné pomerančové šťávě (mg/l). Výsledek vynásobte 10x a zapište do tabulky 5. – Výsledek porovnejte s údajem výrobce na obalu, zhodnoťte také způsob konzervace šťávy. Tabulka 5. spotřeba odměrného činidla (ml) koncentrace kyseliny L-askorbové ve zředěné šťávě (mg/l) koncentrace kyseliny L-askorbové v původní šťávě (mg/l) údaj výrobce (mg/l)

Poznámky:

50

LIPIDY I Klíčová slova: jednoduché lipidy, složené lipidy, dehydratace, hydrolýza, alkalická hydrolýza tuků, mýdla, rozpustnost solí, disociace solí, emulgace, tenzidy ionogenní a neionogenní, oxidace nenasycených sloučenin. Reagencie: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18.

slunečnicový olej olivový olej kyselina olejová kyselina palmitová roztok hydroxidu draselného 1 mol/l v ethanolu !ŽÍRAVINA! ethanol roztok chloridu vápenatého 0,05 mol/l zředěný roztok Ajatinu 1:1 zředěný roztok Jaru 1:50 roztok mýdla v ethanolu 10 g/1 roztok fenolftaleinu 2 g/1 ve zředěném ethanolu 1:1 roztok manganistanu draselného 0,01 mol/l koncentrovaná kyselina sírová !ŽÍRAVINA! emulze vaječného žloutku ve vodě chloroform acetanhydrid koncentrovaná kyselina chlorovodíková !ŽÍRAVINA! roztok molybdenanu amonného v kyselině dusičné (7,5 g molybdenanu amonného ve 100 ml vody + 100 ml kyseliny dusičné 320 g/1)

51

Lipidy tvoří heterogenní skupinu přirozeně se vyskytujících látek, jejichž společnou vlastností je nerozpustnost ve vodě, ale naopak velmi dobrá rozpustnost v organických (tukových) rozpouštědlech. Zahrnují triglyceridy (tuky), mono- a diglyceridy, fosfolipidy, vosky, mastné kyseliny, eikosanoidy, steroidy a v tucích rozpustné vitaminy (ADEK). V organismu mají význam hlavně jako rezervní zdroj energie. Dále jsou strukturální složkou biologických membrán a důležité signalizační molekuly. Lipidy se vyskytují buď jako hydrofobní nebo jako amfifilní malé molekuly. Amfifilní lipidy umožňují tvořit ve vodném prostředí vesikuly, liposomy nebo membrány. Biologické membrány jsou tvořeny dvojvrstvou fosfolipidů, do níž je zanořen cholesterol a membránové proteiny (povrchové a transmembránové). Cholesterol spolu s membránovými proteiny se podílí na „fluiditě membrány“. Biologické lipidy vznikají úplně nebo částečně ze dvou odlišných typů biochemických podjednotek čili „stavebních bloků”: ketoacylových nebo isoprenových skupin. Z tohoto pohledu lze je rozdělit do 8 kategorií: A. odvozené z kondenzace ketoacylových podjednotek 1. 2. 3. 4. 5. 6.

mastné kyseliny, glycerollipidy (triacylglyceroly), glycerofosfolipidy, sfingolipidy, sacharolipidy, polyketidy,

B. odvozené od kondenzace isoprenových podjednotek: 7. steroidy 8. prenolové lipidy. Pojem lipid se někdy používá jako synonymum pro tuky a naopak termínem tuky bývá myšlena celá skupina lipidů, což není zcela správné, neboť se jedná o podskupinu lipidů triglyceridy (triacylglyceroly), tj, estery glycerolu a mastných kyselin.

52

ÚLOHA 1.

Alkalická hydrolýza tuků - zmýdelnění tuků Mýdla jsou soli mastných kyselin a vznikají alkalickou hydrolýzou triacylglycerolů. Proces se nazývá zmýdelnění. Mýdla také vznikají z tuků v duodenu hydrolytickým působením alkalické střevní šťávy a napomáhají tak emulgaci dalších molekul esterifikovaných lipidů bezprostředně po vstupu žaludečního obsahu. Pracovní postup: – – – –

Do kádinky odměřte pasterkou 2 ml oleje a přidejte 10 ml alkoholického roztoku KOH. Za stálého míchání zvolna zahřívejte, zmýdelnění proběhne asi za 5 – 10 min. Obsah kádinky přelijte do 25 ml horké destilované vody Takto získáte roztok alkalického mýdla. Pomocí indikátorového papírku ověřte jeho pH.

Poznámky:

53

ÚLOHA 2.

Vlastnosti mýdel 2.1. Rozpustnost ve vodě Draselná mýdla jsou mazlavé látky a sodná pevné, obojí jsou ve vodě rozpustné a mají emulgační schopnosti. Mýdla vápenatá, hořečnatá a těžkých kovů jsou ve vodě nerozpustná. Při mytí v tvrdé vodě vznikají nerozpustná vápenatá a hořečnatá mýdla a ta jsou velmi dobrou živnou půdou pro dermatofyta a kvasinky, případně i bakterie, které jsou pak příčinou zánětlivých onemocnění kůže. Proto je potřeba při mytí všechny kožní záhyby (tzv. intertriginózní místa) i meziprstní prostory důkladně opláchnout tekoucí vodou. Pracovní postup: – –

K 1 ml roztoku chloridu vápenatého pomalu přidávejte několik kapek mýdlového roztoku získaného v úloze 1. Pozorovanou chemickou reakci vyjádřete iontovým zápisem:

– Mýdla sodná jsou ve vodě: – pH jejich vodného roztoku je: – Mýdla vápenatá jsou ve vodě:

Poznámky:

54

2.2. Emulgační schopnost mýdel Mýdla, soli mastných kyselin, patří podle své struktury mezi anionaktivní tenzidy (viz Bílkoviny, úloha 2.). K anionaktivním tenzidům patří i sodné sole alkylsírových či alkylsulfonových kyselin, např. dodecylsulfát sodný (SDS), který se používá k solubilizaci buněčných membrán. Patří k nim také soli žlučových kyselin, které jsou součástí žluče a přispívají k emulgaci tuků. Běžný desinfekční prostředek Ajatin, kvartérní amoniová sůl s alkylem C8 − C18 jako substituentem (viz Bílkoviny, úloha 3.), patří mezi velmi účinné kation-aktivní tenzidy, stejně jako další desinfekční prostředek Septonex. Vedle obou výše uvedených skupin ionogenních tenzidů, existuje velká skupina neionogenních tenzidů, které se díky své zanedbatelné toxicitě používají např. v prostředcích na mytí nádobí. Polární část jejich molekuly tvoří větší počet atomů kyslíku, které jsou součástí etherových a esterových vazeb v molekulách těchto typů tenzidů. Příkladem jsou vyšší estery a ethery polyethylenglykolu s komerčními názvy např. Triton a Tween. K neionogenním emulgátorům lze počítat i ethanol (viz úloha 2.). Pracovní postup: – – –

Ve zkumavce protřepejte kapku oleje s vodou a vzniklou emulzi ponechte stát. Po chvíli se opět obě složky oddělí. Přidejte malé množství mýdlového roztoku (z úlohy 1.) a dobře protřepejte. Vznikne jemná emulze. Stejným způsobem vyzkoušejte emulgačni schopnost zředěných roztoků Ajatinu a Jaru.

Poznámky:

55

2.3. Disociace sodných solí vyšších mastných kyselin Z hodnot dielektrických konstant vody (81) a ethanolu (25) vyplývá, že voda je mnohem polárnější rozpouštědlo než ethanol a proto usnadňuje elektrolytickou disociaci. Pracovní postup: – Do suché zkumavky dejte 1 ml ethanolového roztoku mýdla z reagenčního aparátu (před použitím protřepat) a přidejte několik kapek fenolftaleinu, vznikne bezbarvý roztok. – Indikátorovým papírkem ověřte jeho hodnotu pH. – Postupně přidávejte po 1 ml vodu, (vždy ověřte pH) až do červenofialového zbarvení. – Naměřené hodnoty pH zapište do tabulky 1. Tabulka 1. celkový objem vody (ml)

0

1

2

3

4

5

6

7

pH

Poznámky:

56

ÚLOHA 3.

Důkaz přítomnosti dvojných vazeb ve vyšších mastných kyselinách Sloučeniny, obsahující jednu nebo více násobných vazeb, jsou velmi citlivé k oxidaci, čímž se liší od sloučenin nasycených. Použijeme-li jako oxidační činidlo roztok manganistanu draselného v kyselém prostředí, dojde k hydroxylaci dvojné vazby a k redukci manganistanu. Triglyceridy s krátkým řetězcem a vyšším počtem násobných vazeb jsou oleje. S prodlužující se délkou řetězce mastných kyselin a klesajícím počtem násobných vazeb stoupá jejich konzistence (mazlavé až pevné tuky). Pracovní postup: – Do zkumavky odlijte 0,5 ml slunečnicového oleje, 1 m1 roztoku manganistanu draselného a plastikovou pipetkou přidejte 1! kapku koncentrované kyseliny sírové (nadbytek koncentrované H2SO4 způsobuje ztmavnutí organické sloučeniny, protože dochází k její mineralizaci). – Obsah zkumavky dobře, ale opatrně protřepejte. Pozorujte změnu zbarvení. – Tutéž reakci proveďte i s olivovým olejem, a také s kyselinou olejovou a několika krystaly kyseliny palmitové. – Stupeň nenasycenosti zapište do tabulky 2. Použijte znamének +, ++ atd. Tabulka 2. sloučenina slunečnicový olej olivový olej kyselina olejová kyselina palmitová

zbarvení

stupeň nenasycenosti

Poznámky:

57

ÚLOHA 4.

Důkaz některých složek vaječného žloutku Žloutek slepičího vejce obsahuje látky důležité pro zdravý vývoj nového jedince ovoglobuliny (ovoalbuminy jsou obsaženy v bílku), lecithiny, železo, cholesterol a vitamíny např. retinol, tokoferol, riboflavin, kobalamin. Obsah sacharidů je zanedbatelný. 5.1. Důkaz cholesterolu Pracovní postup: – Do zkumavky dejte 1 ml emulze žloutku ve vodě, přidejte 2 ml chloroformu a třepejte asi 1 min. – Směs přefiltrujte do suché skleněné zkumavky. – K filtrátu přidejte 5 kapek acetanhydridu, řádně protřepejte (v případě, že se filtrát po přidání acetanhydridu zakalí, směs znovu zfiltrujte). – Pak opatrně (po stěně zkumavky) přidejte plastikovou pipetkou 1 kapku koncentrované kyseliny sírové. – Během 5 min se objeví modrozelené zbarvení. 5.2. Důkaz kyseliny fosforečné (viz Vlastnosti a reakce biologicky a toxikologicky významných prvků a jejich sloučenin, úloha 2.1.) Pracovní postup: – Připravte si vroucí vodní lázeň. – Do zkumavky odlijte asi 1 ml emulze žloutku ve vodě, přidejte 0,5 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové (z dávkovače) a protřepejte. – Pak přidejte 1 ml roztoku molybdenanu amonného a zahřejte ve vroucí vodní lázni. – Žlutá sraženina fosfomolybdenanu amonného prokazuje fosfáty.

Poznámky:

58

LIPIDY II Klíčová slova: lipidy, triacylglyceroly, 2-monoacylglyceroly, mastné kyseliny, esterová vazba, hydrolytické štěpení tuků, pankreatická lipasa (EC 3.1.1.3), tenzidy, soli žlučových kyselin, volné radikály, řetězová reakce, buněčné membrány, peroxidy, reakce aldehydů s aminoskupinami, antioxidanty, cheláty. Reagencie: 1. extrakt pankreatické lipasy (obsah 20 dražé Pancreolanu, ZENTIVA, rozpustit ve 400 ml směsi voda - glycerol 1:1, zfiltrovat) 2. slunečnicový olej 3. ethanol 4. roztok hydroxidu sodného 0,01 mol/l 5. roztok fenolftaleinu v ethanolu 2 g/l. 6. roztok rybího tuku (Infadin) v hexanu 40 g/1 7. fosfátový pufr 0,05 mol/l, pH 7 8. fosfátový pufr 0,05 mol/l, pH 9 9. roztok solí žlučových kyselin 100g/l 10. roztok kyseliny olejové 10 g/l v ethanolu 11. roztok síranu železnatého 0,4 mmol/l 12. Erevit (tocoferoli acetas 50 mg v 1 ml olejového roztoku) ZENTIVA 13. roztok dvojsodné sole EDTA 2 mmol/l ve fosfátovém pufru 14. roztok citrátu sodného 0,1 mol/l 15. TBA činidlo pro důkaz malondialdehydu (20 % kyselina octová pH 3,4, , nasycený roztok kyseliny thiobarbiturové a destilovaná voda v poměru 2:2:1)

59

Trávení a vstřebávání lipidů Tuky by měly ve vyvážené stravě dospělého člověka představovat přibližně 25 - 30 % energetického příjmu. Jedná se především o triacylglyceroly, tj. estery glycerolu a mastných kyselin, které slouží jako hlavní energetická zásoba u většiny živočichů. Při jejich trávení v tenkém střevě dochází nejprve k hydrolýze esterových vazeb za vzniku 2monoacylglycerolů a mastných kyselin (pouze 20 % triacylglycerolů je rozloženo až na glycerol poté co dojde ke spontánní izomerizaci 2-monoacylglycerolu na 1- či 3monoacylglycerol). Volné mastné kyseliny podléhají zmýdelnění a také fungují jako přídatné detergenty, resp. emulgátory. Po vstřebání do enterocytu dochází k resyntéze triacylglycerolů, které jsou následně uvolněny do krevního oběhu ve formě chylomiker. Význam žlučových kyselin Triacylglyceroly jsou ve střevě vzhledem ke své hydrofobii přítomny ve formě tukových kapének, pro jejich efektivní trávení musí nejprve dojít k emulgaci na menší částice. Tomu napomáhá peristaltika trávicího traktu a zejména přítomnost žlučových kyselin a fosfolipidů žluči. Žlučové kyseliny jsou syntetizovány v hepatocytech z cholesterolu (primární žlučové kyseliny cholová a chenodeoxycholová) a secernovány do žluči. Působí jako detergenty, hydrofobní část představuje cyklopentanoperhydrofenantrenové jádro, za hydrofílii jsou zodpovědné hydroxylové skupiny a karboxylová skupina, na kterou může být amidovou vazbou navázán glycin či taurin (konjugované žlučové kyseliny). 90 − 95 % žlučových kyselin je v terminálním ileu zpětně resorbováno a prodělává tzv. enterohepatální oběh. Působením střevních bakterií může u části primárních žlučových kyselin dojít k dekonjugaci a k odstranění hydroxylové skupiny v poloze 7 za vzniku sekundárních žlučových kyselin (kyselina deoxycholová a litocholová). Pankreatická lipasa Hlavním enzymem zodpovědným za hydrolýzu triacylglycerolů je pankreatická lipasa, část lipidů obsahujících mastné kyseliny s krátkým a středně dlouhým řetězcem (do 12 atomů uhlíku, obsažené především v kravském mléku) je rozkládána působením lingvální a žaludeční lipasy. U novorozenců je sekrece pankreatické lipasy nedostatečná, na štěpení tuků se podílí lipasa přítomná v mateřském mléce, která je odolná k působení nízkého žaludečního pH a vyžaduje nižší množství žlučových kyselin. Pankreatická lipasa je do duodena uvolňována společně s proteinovým kofaktorem (kolipázou), který tvoří s lipázou komplex a zvyšuje její aktivitu. Ke štěpení triacylglycerolů dochází na povrchu emulze tukových kapének o velikosti 200 − 500 nm. Vznikající monoacylglyceroly, diacylglyceroly a mastné kyseliny vytvářejí společně se žlučovými kyselinami, molekulami cholesterolu, kyselinou lysofosfatidovou a v tucích rozpustnými vitamíny směsné micely o velikosti 3 − 10 nm. Následně dochází pasivní difuzí či pomocí přenašečů ke vstřebání jednotlivých součástí směsných micel do enterocytů. V hladkém endoplazmatickém retikulu enterocytu dochází k reesterifikaci monoacylglycerolů a mastných kyselin s dlouhým řetězcem na triacylglyceroly, které jsou ve formě chylomiker uvolňovány do lymfatického oběhu. Mastné kyseliny s kratším řetězcem (do C10 event. C12) jsou transportovány cestou portálního oběhu bez reesterifikace. Cílem praktika je demonstrovat emulgační schopnosti žlučových kyselin a jejich význam pro funkci pankreatické lipasy.

60

Klinické poznámky: ∗ Při onemocněních pankreatu dochází ke zvýšení hladiny pankreatické lipasy v plazmě. Stanovení pankreatické lipasy společně s pankreatickým izoenzymem α-amylasy se využívá při diagnostice akutní pankreatitidy. ∗ Orlistat (tetrahydrolipstatin) je irreverzibilní inhibitor žaludeční a pankreatické lipasy. Spolu s režimovými opatřeními může být použit k léčbě obezity. Snižuje absorpci přijatého tuku ve stravě až o 30 %, z mechanismu účinku vyplývá nežádoucí účinek, steatorhea. ∗ Při závažných chronických onemocněních slinivky břišní (nejčastěji chronická pankreatitida, ale též cystická fibróza - mukoviscidóza) může dojít k projevům nedostatečné zevně sekretorické funkce pankreatu, na níž se největší měrou podílí nedostatek pankreatické lipasy. Dochází k poruše trávení a vstřebávání tuků a v tucích rozpustných vitamínů, onemocnění se projevuje váhovým úbytkem, průjmy a steatoreou. V diagnostice lze využít např. dechový test, kterým se stanoví schopnost organismu rozložit triacylglyceroly značené izotopem uhlíku 13C. Nedostatek trávicích enzymů lze nahradit podáváním výtažku vepřového pankreatu ve formě enterosolventních tablet. ∗ Abetalipoproteinemie (Bassen-Kornzweigův syndrom) je vzácné vrozené onemocnění způsobené poruchou funkce proteinu přenášejícího triacylglyceroly do lumen endoplazmatického retikula v enterocytech a hepatocytech (microsomal triglyceride transfer protein, MTP). Je porušena tvorba chylomiker a VLDL, onemocnění se projevuje malabsorpcí lipidů a steatorheou, komplikací je postižení nervového systému.

61

ÚLOHA 1.

Vliv solí žlučových kyselin na štěpení tuků katalyzované pankreatickou lipasou Pankreatická lipasa katalyzuje štěpení esterové vazby triacylglycerolů především v poloze 1 a 3. Produktem tohoto štěpení jsou 2-monoacylglyceroly a volné mastné kyseliny. Soli žlučových kyselin, působící jako anionaktivní tenzidy (viz Bílkoviny, úloha 2. a Lipidy I, úloha 2.2.) emulgují v tenkém střevě tuky a tím usnadňují interakci mezi tuky a pankreatickou lipasou. Enzym je v tucích nerozpustný a proto může projevovat svoji katalytickou účinnost pouze na povrchu tukových kapének, jejichž celkový povrch se zvyšuje právě emulgací. Lipasa je tímto způsobem aktivována nepřímo. Pracovní postup: – Do tří zkumavek napipetujte po 1 ml extraktu lipasy. – Obsah zkumavky 1 povařte 3 min ve vroucí vodní lázni. Ochlaďte pod tekoucí vodou (slepý vzorek). – Pokračujte v přípravě inkubačních směsí podle tabulky 1. současně ve všech třech zkumavkách. Tabulka 1. zkumavka extrakt lipasy (ml) povařit 3 min ve vroucí vodní lázni

1 1 ano

destilovaná voda (ml) roztok žlučových kyselin (ml) olivový olej (ml) spotřeba NaOH (ml) skutečná spotřeba NaOH (ml) volné mastné kyseliny (mmol)

2 1

3 1 −

0,5

− 0,5

− 0,25

− 0,25

− 0,5 0,25

– Obsah zkumavek promíchejte a inkubujte 60 min při 37° C. – Po skončení inkubace přelijte obsah zkumavek do Erlenmeyerových baněk, zkumavky vypláchněte 2 x 1 ml ethanolu a ethanol přilijte do odpovídajících baněk. – Hydrolyzáty, obsahující volné mastné kyseliny, titrujte roztokem hydroxidu sodného v přítomnosti několika kapek fenolftaleinu až do růžového zbarvení. – Spotřeby hydroxidu sodného zapište do tabulky 1. – Spotřebu hydroxidu sodného v první baňce (slepý pokus, odpovídá množství volných mastných kyselin přítomných v olivovém oleji před lipolýzou) odečtěte od spotřeby v Erlenmeyerových baňkách 2 a 3. Získané skutečné spotřeby zapište do tabulky 1. – Ze skutečné spotřeby vypočítejte množství volných mastných kyselin (mmol), vzniklých štěpením olivového oleje. – Výsledky zapište do tabulky 1.

62

Poznámky:

63

ÚLOHA 1.1.

Emulgační schopnost žlučových kyselin Štěpení tuků v tenkém střevě lipasou a vstřebávání monoacylglycerolů a mastných kyselin závisí na jejich rozptýlení ve vodní fázi. Tomu napomáhají soli žlučových kyselin, které jsou součástí žluče. Snižují povrchové napětí na rozhraní obou fází jako anionaktivní tenzidy. Pracovní postup: – Do zkumavek napipetujte reagencie dle tabulky: zkumavka č. pufr pH 7 (ml) pufr pH 9 (ml) destilovaná H2O (ml) roztok solí žluč. kyselin (ml) ethanol (ml) roztok kyseliny olejové (kapky) vyhodnocení

1 1,0 − 0,5 − − 2

2 1,0 − − 0,5 − 2

3 1,0 − − − 0,5 2

4 − 1,0 0,5 − − 2

– Zkumavky dobře protřepejte a inkubujte 10 min ve vodní lázni při 37° C – Porovnejte emulgační schopnost solí žlučových kyselin, ethanolu a vyššího pH podle projasnění obsahu zkumavek. – K hodnocení výsledků použijte znamének +, −

64

ÚLOHA 2.

Peroxidace lipidů Mastné kyseliny buněčných membrán jsou velmi citlivé k účinkům volných kyslíkatých radikálů (VKR), přednostně jsou napadány vícenásobně nenasycené mastné kyseliny. Hydroxylový radikál, který je nejreaktivnější z VKR, odštěpuje z řetězce mastné kyseliny atom vodíku za vzniku vody a uhlíkatého radikálu:

Ten reaguje nejčastěji s kyslíkem za vzniku alkylperoxidového radikálu:

Alkylperoxidový radikál atakuje řetězec další mastné kyseliny, ze kterého odštěpí opět atom vodíku za vzniku hydroperoxidu mastné kyseliny. Současně vzniká nový uhlíkatý radikál a řetězová reakce může pokračovat:

Jeden hydroxylový radikál je tak schopen vyvolat přeměnu velkého počtu řetězců mastných kyselin na hydroperoxidy, které poskytují substrát pro tvorbu dalších cytotoxických produktů, především aldehydů. Ty mohou reagovat s bílkovinami buněčných membrán i s enzymy vázanými v membránách. Poškození buněčné membrány porušením její struktury může způsobit změnu její permeability, a tím zásadně ovlivnit buněčný metabolismus. V iniciaci a propagaci lipoperoxidace hrají významnou roli ionty kovů. Zejména ion 2+ Fe svým autokatalytickým působením stimuluje lipoperoxidaci. Kromě toho může mít vliv na vznik hydroxylového radikálu katalýzou rozkladu peroxidu vodíku (Fentonova reakce, viz Biologické oxidace II.). Při některých fyziologických pochodech je úloha VKR v organismu nezastupitelná (např. jsou vlastním baktericidním činidlem makrofágů), ale zároveň mohou ireversibilně poškodit nejrůznější struktury na celulární i subcelulární úrovni. Ochranu před účinky VKR zajišťují enzymové i neenzymové systémy. Příkladem enzymů chránících buňky jsou superoxiddismutasa, glutathionperoxidasa nebo katalasa (viz Biologické oxidace II.). Neenzymovou ochranu představují scavengery (antioxidanty), ke kterým patří látky fyziologicky se vyskytující v organismu např. α-tokoferol, kyselina L-askorbová (může mít i prooxidační účinky), glutathion, β-karoten, kyselina močová, citrát, bilirubin, ceruloplazmin, albumin, ale i některé látky syntetické. Nejdůležitějším lipofilním antioxidantem v tkáních a

65

plazmě je vitamín E, α-tokoferol. Jeho základní funkcí je ochrana celulárních i subcelulárních membrán před účinky VKR. Volné kyslíkaté radikály negativně působí i v patogenesi mnoha onemocnění, kromě jiného při reperfusním poškození tkáně po infarktu myokardu nebo při posttransplantačních komplikacích. Jednou z možností jak tato rizika snížit, je podávání antioxidantů a chelatačních látek. V lékařské praxi se jako chelátor využívá i deferoxamin (komerční název Desferal), který váže železnaté ionty do pevného komplexu. Jedním z degradačních produktů lipoperoxidace je malondialdehyd O=CH–CH2–CH=O. Pro organismus je toxický, protože v důsledku přítomnosti dvou aldehydových funkčních skupin může vyvolat polymeraci a zesíťování bílkovin a nukleotidů. Malondialdehyd se používá jako marker pro stanovení míry lipoperoxidace. Spektrofotometrické stanovení tohoto degradačního produktu je založeno na měření absorbance (při 532 nm) růžově zbarveného komplexu, který vznikne reakcí dvou molekul kyseliny thiobarbiturové s jednou molekulou malondialdehydu. . V modelovém pokusu je používán jako substrát roztok rybího tuku v hexanu, který obsahuje asi 50 % nenasycených mastných kyselin. Jejich peroxidace je katalyzována Fe2+ v různé koncentraci. Antioxidační účinky vitamínu E jsou ověřeny pomocí komerčního preparátu Erevit. Příznivý vliv chelatace Fe2+ je demonstrován přidáním roztoku sodné sole EDTA (místo finančně nákladného deferoxaminu) a roztoku citrátu sodného (běžný fyziologický chelátor). K detekci vzniklého malondialdehydu slouží TBA činidlo, intenzita vzniklého zbarvení je hodnocena pouze vizuálně. Pracovní postup: – Do sedmi zkumavek napipetujte inkubační směs podle tabulky 2., konečný objem v každé zkumavce je 2 ml. Tabulka 2. zkumavka roztok rybího tuku (ml) pufr (ml) roztok Fe2+ (ml) Erevit (ml) roztok EDTA Na2 (ml) roztok citrátu Na (ml) intenzita zbarvení

1 0,1 1,9 − − − −

2 0,1 0,9 1,0 − − −

3 0,1 1,8 0,1 − − −

4 0,1 1,89 0,01 − − −

5 0,1 1,75 0,1 0,05 − −

6 0,1 1,6 0,1 − 0,2 −

7 0,1 1,6 0,1 − − 0,2

– Obsah všech zkumavek protřepejte a nechte je inkubovat 20 min při 37 °C. – Připravte si a očíslujte sedm nových zkumavek, do každé odpipetujte 2 ml TBA činidla. – Do každé zkumavky dále napipetujte inkubační směs ze zkumavky se stejným číslem, obsah zkumavek protřepejte. – Zkumavky zahřívejte 20 min ve vroucí vodní lázni. – Přítomnost malondialdehydu se projeví růžovým zbarvením. – Porovnejte intenzitu zabarvení v jednotlivých zkumavkách. Zbarvení slepého pokusu (zkumavka č.l.) označte +, intenzitu zbarvení v ostatních zkumavkách vyjádřete symboly +, ++, +++.

66

– Výsledky zapište do tabulky 2. Poznámky:

67

LIPIDY III Klíčová slova: cholesterol, estery cholesterolu, HDL cholesterol, LDL cholesterol, triacylglyceroly, lipoproteiny, cholesterolesterasa (CHES - EC 3.1.1.13), cholesteroloxidasa CHOD - EC 1.1.3.6), lipoproteinová lipasa (LPL - EC 3.1.1.34), glycerolkinasa (GYK – EC 2.7.1.30), glycerolfosfátoxidasa (G30 - EC 1.1.99.5). Reagencie: 1. vzorek séra 2. souprava Cholesterol (BioSystems): a) pracovní roztok TC: PIPES 35 mmol/l, pH 7,0 cholát sodný 0,5 mmol/l fenol 28 mmol/l 4-aminoantipyrin 0,5 mmol/l chlorid sodný 20,0 mmol/l cholesterolesterasa > 0,2 U/l cholesteroloxidasa > 0,1 U/l peroxidasa > 0,8 U/l b) standard TC, koncentrace dle údaje výrobce 3. souprava HDL-Cholesterol, (Biosystems): a) srážecí roztok HDLc: fosfowolframan 0,4 mmol/l chlorid hořečnatý 20,0 mmol/l 4. souprava Triglyceridy (Biosystems): a) pracovní roztok TAG: PIPES 45mmol/l, pH 7 chlorid hořečnatý 5 mmol/l ATP 0,9mmol/l 4-aminoantipyrin 0,75 mmol/l 4-chlorfenol 6 mmol/l L-glycerol-3-fosfátoxidasa > 4 U/l glycerolkinasa > 1,5 U/l peroxidasa > 0,8 U/l lipasa > 100 U/l b) standard TAG, koncentrace dle údaje výrobce 5. souprava Hydragel LIPO, SEBIA: a) TRIS-barbiturátový pufr, pH 8,5 b) koncentrovaný roztok sudanové černě c) ethanol 96% d) ethanol 45%

68

Lipidy stanovované při biochemickém vyšetření zahrnují celkový cholesterol (TC), HDL cholesterol (HDLc) a triacylglyceroly (TAG). Lipidy jako hydrofobní látky jsou v krevním řečišti transportovány ve formě hydrofilních lipoproteinových částic složených z apoproteinů, triacylglycerolů (TAG), cholesterolu, esterů cholesterolu a fosfolipidů. Volné mastné kyseliny jsou transportovány vázané na albumin. Podle fyzikálních vlastností a chemického složení jsou lipoproteiny děleny do 4 základních tříd (viz tabulka): Tabulka 1. Základní rozdělení a charakteristika lipoproteinových částic dělení dle hustoty (ultracentrifugace) elektroforetická pohyblivost hustota (g/ml) velikost typický apoprotein % zastoupení proteinu % zastoupení cholesterolu % zastoupení TAG % zastoupení PL základní funkce

chylomikra

VLDL

LDL

HDL

zůstanou na startu 0,98

pre-beta

beta

alfa

1,006

100 − 1 000 nm B-48 1 5,5

30 − 70 nm B-100 10 19

1,019 − 1,063 15 − 25 nm B-100 20 45

1,063 − 1,21 7,5 − 10 nm A-I 50 15

90 3,5 transport TAG přijatých v potravě k periferním tkáním

50 20 transport TAG z jater k periferním tkáním

10 25 transport cholesterolu k periferním tkáním

5 30 reverzní transport cholesterolu z tkání do jater

Lipoproteinové částice jsou produkovány v játrech (VLDL, HDL), v tenkém střevě (chylomikra, HDL), LDL a IDL vznikají katabolismem VLDL v krevním řečišti. Jednotlivé apoproteiny jsou důležitou strukturní součástí lipoproteinové částice zodpovědnou za její hydrofílii (apoB-48, apoB-100, apoA), slouží jako vazebné molekuly pro buněčné receptory (apoB-100, apoE) a jako kofaktory enzymů (apoC-II, apoC-III, apoA-I). Dalším lipoproteinem je lipoprotein (a) [Lp(a)]. Je to částice, která se skládá z molekuly LDL, jejíž apolipoprotein apo-B-100 se váže disulfidovou vazbou se specifickým glykoproteinem apo(a). Lp(a) může mít různé velikosti v závislosti na izoformách. Ukazuje se, že apolipoprotein (a) může inhibovat fibrinolýzu, která vzhledem ke značné strukturální homologii soupeří s plazminogenem. Tento efekt není možno pozorovat u LDL bez apolipoproteinu (a). Gen kódující apo(a) se nachází na dlouhém raménku chromosomu 6 poblíž genu pro plazminogen. Lp(a) je považován za aterogenní rizikový faktor, který je nezávislý na dalších lipidových parametrech a na exogenních faktorech, jako je např. dieta. Jeho hladina je většinou geneticky determinovana. Zvýšené hladiny Lp(a) nad 0,3 g/l mají vysokou prediktivní hodnotu pro koronární srdeční onemocnění, zejména v kombinaci se zvýšenými hladinami LDL cholesterolu. Zatímco stanovení celkového cholesterolu a triacylglycerolů se používá pro účely skríningu, měření Lp(a) je, kromě LDL cholesterolu, HDL cholesterolu, apolipoproteinu A I a apolipoproteinu B, cenným nástrojem pro diferenciální diagnózu koronárních srdečních onemocnění. Normální hodnota je <0,3 g/l.

69

V periferních tkáních jsou z částic bohatých na TAG (chylomikra, VLDL) působením lipoproteinové lipasy (LPL) uvolňovány volné mastné kyseliny, které jsou v buňkách využity jako zdroj energie nebo uloženy ve formě triacylglycerolů. HDL částice mají schopnost odebírat cholesterol z buněčných membrán a hrají klíčovou úlohu v reverzním transportu cholesterolu. Biochemické vyšetření lipidového metabolismu obvykle zahrnuje stanovení hladiny TAG a celkového cholesterolu a ev. jeho HDL a LDL frakce. Spíše než přímým stanovením je LDL cholesterol dopočítán podle tzv. Friedewaldova vzorce (LDL-cholesterol = celkový cholesterol – HDL-cholesterol – TAG/2,2). Výpočet je založen na odhadu obsahu cholesterolu ve VLDL částicích na základě sérové koncentrace TAG, nelze ho však použít při hladině TAG vyšší než 4 - 4,5 mmol/l. Alternativou stanovení cholesterolu v jednotlivých frakcích lipoproteinů je přímé stanovení jednotlivých apoproteinů reprezentujících aterogenní částice (apo B-100) a HDL (apo A-I) částice. Poměr apoB-100/apoA-I může v některých případech (diabetici, pacienti s metabolickým syndromem, s hypertriacylglycerolemií) přesněji přispívat k odhadu rizika kardiovaskulární příhody. Elektroforéza lipoproteinů (Obr. 1.) je v běžné lékařské praxi využívána jen málo, byla však základem pro dříve používanou klasifikaci hyperlipoproteinemií dle Fredricksona.

Obr. 1. Srovnání elektroforeogramu séra obarveného na proteiny (A) a lipidy (B) Klinické poznámky: ∗ Dyslipidemie (dyslipoproteinemie) jsou charakterizovány zvýšenou hladinou a/nebo nevhodným zastoupením jednotlivých lipoproteinových částic (nejčastěji snížením HDL). Hladina lipidů v krvi představuje jeden z významných rizikových faktorů aterosklerózy a jejích komplikací (ischemická choroba srdeční, cévní mozkové příhody, ischemická choroba dolních končetin). Kromě znalosti celkové hladiny cholesterolu v plazmě je však k odhadu kardiovaskulárního rizika důležitá též znalost zastoupení cholesterolu v jednotlivých typech lipoproteinových částic. Vysoká hladina HDL cholesterolu představuje protektivní faktor, zatímco LDL cholesterol a především malé denzní LDL částice jsou vysoce aterogenní. ∗ Dyslipidemie dělíme na 1) izolovanou hypercholesterolemii 2) kombinovanou hyperlipidemii 3) izolovanou hypertriacylglycerolemii

70

Toto dělení nahradilo vzhledem ke své praktičnosti dříve používanou klasifikaci dle Fredricksona. Hranice, pod kterou jsou koncentrace celkového, LDL cholesterolu a TAG považovány za normální, se neustále snižuje a závisí mj. na dalších rizikových faktorech kardiovaskulárních onemocnění. Doporučené hodnoty pro běžnou populaci v ČR uvádí tabulka 2. Před rozhodnutím o zahájení léčby dyslipidemie mají být provedeny alespoň 2 odběry v rozmezí 1 − 8 týdnů ve stejné laboratoři (pacient má v té době dodržovat svůj obvyklý životní styl, způsob stravování a výrazněji neměnit svou tělesnou hmotnost). Při větším než 15 − 20% rozdílu výsledků obou vyšetření je vhodné třetí stanovení. 10leté riziko fatálního kardiovaskulárního onemocnění lze odhadnout na základě pohlaví, věku, systolického TK, celkového cholesterolu a kuřáckých návyků z tabulek SCORE. Za osoby s vysokým kardiovaskulárním rizikem považujeme všechny osoby s 10letým rizikem úmrtí na kardiovaskulární příhodu ve výši ≥5 %. Tabulka 2. Cílové hodnoty pro běžnou populaci ČR (Česká společnost pro aterosklerózu 2007) celkový cholesterol LDL cholesterol HDL cholesterol TAG

< 5 mmol/l < 3 mmol/l muži > 1,0 mmol/l , ženy > 1,2 mmol/l < 1,7 mmol/l

Obr. 2. Tabulky SCORE pro českou republiku

71

ÚLOHA 1.

Stanovení celkového cholesterolu (TC) Pro stanovení celkového cholesterolu se používá enzymová metoda, která zahrnuje tyto tři enzymové reakce: 1. Hydrolýzu esterů cholesterolu cholesterolesterasou (CHES): CHES estery cholesterolu → cholesterol + mastné kyseliny 2. Oxidaci cholesterolu cholesteroloxidasou (CHOD) za současné tvorby peroxidu vodíku: CHOD cholesterol + O2 → 4-cholesten-3-on + H2O2 3. Oxidativní kopulaci 4-aminoantipyrinu s fenolem a peroxidem katalyzovanou peroxidasou (POD) za tvorby barevného produktu:

vodíku

POD 2 H2O2 + 4-aminoantipyrin + fenol → barevný produkt Pracovní postup: – Vzorek séra i standard zpracujte v tripletu, slepý vzorek jednou. – Do zkumavek napipetujte roztoky podle tabulky 3. Malé objemy pipetujte ke dnu zkumavek. Tabulka 3. reagencie (ml) sérum standard TC destilovaná voda pracovní roztok TC

vzorek 0,01 − − 1,0

standard − 0,01 − 1,0

slepý vzorek − − 0,01 1,0

– Reakční směs nechte inkubovat 10 min při pokojové teplotě. – Do 10 min po skončení inkubace změřte absorbanci vzorků séra (Avz) i standardu (Ast) při 500 nm, výsledek zapište do tabulky 4. – Z průměru naměřených hodnot absorbance vzorku a standardu a z koncentrace standardního roztoku TC vypočítejte koncentraci celkového cholesterolu. – Výsledky zapište do tabulky 4.

72

Tabulka 4. vzorek č.:

absorbance

průměr

c (mmol/l)

sérum standard

Poznámky:

73

ÚLOHA 2.

Stanovení HDL cholesterolu (HDL-C) Lipoproteiny VLDL a LDL jsou selektivně vysráženy účinkem fosfowolframanu a hořečnatých iontů Mg2+. Pracovní postup: – – – – –

Do eppendorfské zkumavky napipetujte 0,2 ml séra (stejný vzorek jako v úloze 1.) a 0,5 ml srážecího roztoku a protřepejte. Nechte stát 10 min při laboratorní teplotě a potom centrifugujte 10 min při 4000 ot./min. Supernatant opatrně odlijte do zkumavky "eppendorf" a použijte k přípravě vzorku pro stanovení HDLC. Vzorek séra (supernatant) a standard zpracujte v tripletu, slepý vzorek jednou. Do zkumavek napipetujte roztoky podle tabulky 5. Malé objemy pipetujte ke dnu zkumavek.

Tabulka 5. reagencie (ml) supernatant standard TC destilovaná voda pracovní roztok TC

vzorek 0,05 − − 1,0

standard

slepý vzorek

− POZOR! 0,01 0,05

− − 0,05

1,0

1,0

– Reakční směs nechte inkubovat 30 min při pokojové teplotě. – Do 10 min po skončení inkubace změřte absorbanci vzorků séra (Avz) i standardu (Ast) při 500 nm, výsledek zapište do tabulky 6. – Z průměru naměřených hodnot absorbance vzorku a standardu a z koncentrace standardního roztoku TC vypočítejte koncentraci HDL cholesterolu. – Výsledky zapište do tabulky 6. Tabulka 6. vzorek č.: sérum standard

absorbance

průměr

c (mmol/l)

Poznámky:

74

ÚLOHA 3.

Stanovení triacylglycerolů (TAG) Enzymové stanovení triacylglycerolů zahrnuje tyto reakce: 1. Hydrolýzu triacylglycerolů katalyzovanou lipoproteinovou lipasou (LPL): LPL triacylglyceroly + H2O → glycerol + mastné kyseliny 2. Fosforylaci uvolněného glycerolu katalyzovanou glycerolkinasou (GK): GK glycerol + ATP → glycerol-3-fosfát + ADP 3. Oxidaci glycerol-3-fosfátu na dihydroxyacetonfosfát katalyzovanou enzymem glycerolfosfátoxidasou (GPO): GPO glycerol-3-fosfát → dihydroxyacetonfosfát + H2O2 4. Vzniklý peroxid vodíku se využívá k oxidační kopulaci 4-aminoantipyrinu s 4-chlorfenolem na barevný produkt. Reakce je katalyzovaná peroxidasou (POD): POD 2 H2O2 + 4-aminoantipyrin + 4-chlorfenol → barevný produkt Pracovní postup: – Vzorek séra (používaný y úloze 1. a 2.) i standard TAG zpracujte v tripletu, slepý vzorek jednou. – Do zkumavek napipetujte roztoky podle tabulky 7. Malé objemy pipetujte ke dnu zkumavek. Tabulka 7. reagencie (ml) sérum standard TAG destilovaná voda inkubační směs TAG

vzorek 0,01 − − 1,0

standard − 0,01 − 1,0

slepý vzorek − − 0,01 1,0

– Reakční směs nechte inkubovat 15 min při pokojové teplotě. – Do 60 min po skončení inkubace změřte absorbanci vzorků (Avz) i standardu (Ast) při 500 nm, výsledek zapište do tabulky 8. – Z průměru naměřených hodnot absorbance vzorku a standardu a koncentrace standardního roztoku TAG vypočítejte koncentraci triacylglycerolů.

75

– Výsledky zapište do tabulky 8. Tabulka 8. vzorek č.:

absorbance

průměr

c (mmol/l)

sérum standard

Poznámky:

76

ÚLOHA 4.

Výpočet LDL cholesterolu a HDL indexu podle Friedewalda Distribuci cholesterolu v krevní plazmě lze vyjádřit vztahem: celkový cholesterol = c1 + c2 + c3 c1 = HDL cholesterol c2 = LDL cholesterol c3 = VLDL cholesterol Frakce VLDL obsahuje všechny typy triacylglycerolů, jejichž molární frakce je konstantní. Koncentraci VLDL cholesterolu je možno nahradit přibližně jednou polovinou koncentrace TAG ve vzorku séra (TAG/2,2). Pro výpočet distribuce cholesterolu mezi lipoproteiny stačí tedy stanovit celkový cholesterol, HDL cholesterol a triacylglyceroly ve vzorku séra. LDLc (mmol/l) = TC − HDLc − VLDL = TC − HDLc - TAG/2,2 TC HDL index = HDLc K výpočtu použijte naměřené hodnoty a výsledky zapište do tabulky 9. VYHODNOCENÍ: Tabulka 9.

TC (mmol/l)

REFERENČNÍ HODNOTY normální hraniční rizikové <5,2 >6,5 5,2 − 6,5

HDLc (mmol/l)

>1,0

0,9 − 1,0

<0,9

LDLc (mmol/l)

<4,0

4,0 − 5,0

>5,0

TAG (mmol/l)

<2,0

2,0 − 2,5

>2,5

<3

3−4

HDL index

NAMÉŘENÉ HODNOTY

POZOR! Pro výpočet HDL indexu lze použít i obrácený vzorec: HDLc HDL index = TC

77

Potom platí tyto referenční hodnoty:

normální >0,25 hraniční 0,2 – 0,25 rizikové <0,2

Poznámky:

78

ÚLOHA 5.

Stanovení TC a TAG ve vlastní kapilární krvi pomocí přístroje REFLOTRON® Roche Analyzátor Reflotron® (obr. 1.) využívá ke stanovení analytů principu tzv. suché chemie. Vlastní měření je založeno na technice reflexní fotometrie, při níž se měří intenzita odraženého záření od homogenně zbarvené podložky.

Obr. 1. Reflotron Plus (Roche). 1 – tiskárna, 2 – displey, 3 – indikační LED diody, 4 – podavač a komora pro měření reagenčního proužku, 5 – stojánek na reagencie Reakce probíhají na pevném nosiči (reagenční zóna proužku), který obsahuje suchá činidla, aktivovatelná vodou obsaženou v naneseném vyšetřovaném vzorku. Reagencie potřebné pro reakci jsou nanesené až pod vrstvou skleněných vláken, na kterých se zachytí krvinky. Reflotron může analyzovat plnou krev, plazmu nebo sérum. Připojený počítač umožňuje ze stanovených hodnot spočítat koncentraci LDLC dle Friedewalda a vyhodnotit kardiální riziko pacientů. Pracovní postup: – Zapněte přístroj - na displeji se objeví datum a čas. – Vyčkejte, až se zobrazí zpráva PŘIPRAVEN K MĚŘENÍ – Vyjměte testovací proužek z tuby a ihned ji uzavřete. Neuzavření tuby má za následek znehodnocení hygroskopického činidla uloženého v zátce, a tím znehodnocení testovacích proužků.

79

– Promasírujte lehce špičku prstu, abyste zvýšili prokrvení a tak usnadnili odběr. Nezapomeňte na dezinfekci! Použijte zařízení pro vpich do prstu (lanceta a Autoclix). Optimální místo vpichu u dospělých je střed bříška prstu (ze strany). – Kapilární krev nechte volně vzlínat (pouze vlivem kapilárních sil) po barevnou rysku do heparinizovaných kapilár. Přebytečnou krev otřete na vnějším povrchu kapiláry čtverečkem buničiny. – Odtrhněte krycí folii z reagenčního proužku. – Pomocí aplikátoru naneste 32 µl krve z kapiláry na příslušný reagenční proužek. – Reagenční proužek umístěte vodorovně do podavače přístroje, na displeji se objeví zpráva ZAVŘETE DVÍŘKA. – Po zavření dvířek probíhá čtení magnetického kódu a na displeji se objeví název zadaného analytu. – Po ukončení měření přístroj zobrazí stanovenou koncentraci. – Získané hodnoty zapište do tabulky 8. – Naměřené hodnoty TC a TAG použijte k výpočtu LDLC (klávesa F3) a kardiálního rizika (klávesa F2). – Při výpočtech zadávejte příslušné parametry podle požadavků počítače, každou odpověď potvrďte klávesou ENTER. Poznámka: Při výpočtu kardiálního rizika přístroj udá tyto výsledky: výskyt − pravděpodobnost infarktu v průběhu 4 let v % faktor − kolikrát je rizikový faktor pacienta vyšší ve srovnání s lidmi stejné věkové skupiny

80

Tabulka 10. celkový cholesterol (mmol/l) HDL cholesterol (mmol/l) (nutno zadat, nestanovuje se) triacylglyceroly (mmol/l) LDL cholesterol (mmol/l) HDL index kardiální riziko – výskyt – faktor

Poznámky

81

ÚLOHA 6.

Hodnocení kardiálního rizika se změnami důležitých parametrů Pracovní postup: – Hodnoty uvedené v tabulce 11. zadejte do počítačového programu Reflotronu pro výpočet LDLC podle Friedewalda (klávesa F3) jednotlivých pacientů. – Výsledky doplňte do tabulky 11. – Pomocí počítačového programu Reflotronu porovnejte kardiální riziko (klávesa F2) pacientů při optimálních podmínkách (nízký věk, nekuřák atd.) a při nepříznivých parametrech. – Zhodnoťte, jak nepříznivé parametry zvyšují kardiální riziko. Tabulka 11. pacient celkový cholesterol (mmol/l) HDL-cholesterol (mmol/l) triacylglyceroly (mmol/l) LDL-cholesterol (mmol/l) HDL index kardiální riziko – výskyt – faktor

A 5,37 1,24 1,25

B 4,71 1,81 0,86

C 5,65 1,81 3,10

D 6,50 2,70 0,66

Poznámky:

82

ÚLOHA 7.

Elektroforéza lipoproteinů Elektroforéza lipoproteinů krevního séra na agarosovém gelu představuje cennou informační metodu o kvantitativním zastoupení jednotlivých lipoproteinů, které úzce souvisí s vývojem aterosklerotického procesu. Lipoproteinové částice lze rozdělit na základě jejich rozdílné elektroforetické pohyblivosti na čtyři základní frakce: chylomikrony (zůstávají na startu), β-lipoproteiny (LDL), pre-β-lipoproteiny (VLDL), liporotein (a) – Lp(a) a αlipoproteiny (HDL). Lp(a) se při elektroforéze pohybuje před pre-β-lipoproteiny, resp. mezi VLDL a HDL. Lipoproteiny jsou děleny v elektroforetickém zařízení SEBIA na agarosovém gelu v Tris-barbiturátovém pufru o pH 8,5. Elektroforeogram je barven roztokem sudanové černě. Pracovní postup: Současně se vzorky je třeba analyzovat i kontrolní vzorek s normální koncentrací cholesterolu a triacylglycerolů. – – – – – – – – – – – – –

–

Umístěte Hydragel K20 aplikátorový nosič na rovnou plochu a zvedněte část s očíslovanými zuby (obr. A). Naneste 120 µl destil. vody na dolní třetinu rámečku vyznačené na nosiči aplikátoru. Z obalu vyjmětě agarosovou plotnu a rychle ji osušte filtračním papírem. Opřete plotnu okrajem o zarážku v dolní části vyznačeného rámečku – gelem k sobě. Gel ohněte a pokládejte tak, aby se voda rovnoměrně rozprostřela pod celým gelem bez tvorby vzduchových bublin. Gel musí být v rámečku zarovnán (obr. B). Snižte nosič aplikátoru očíslovanými zoubky dolů do střední polohy se západkou v horní poloze. Umístěte aplikátor na rovnou plochu s čísly jamek v pravé horní pozici (obr. C). Do jamek aplikátoru napipetujte rychle 10 µl vzorku. Vzorky je nutno napipetovat během 2 min. Odlomte ochranný rámeček zoubků aplikátoru. Umístěte aplikátor do pozice č. 5 na nosiči, čísla musí směřovat k obsluze (obr. D). Pomalu snižte nosič tak, aby se aplikátor dostal do kontaktu s povrchem gelu. Po 40 sec. aplikátor uvolněte, vyjměte a vyhoďte. Gelovou plochu vložte do migrační elektroforetické komory podle polarity vyznačené na gelu – dolní částí gelu na katodickou stranu. Při použití komory SEBIA K20 vložte plotnu do zubů můstku gelem dolů a ten pak ponořte do pufru (asi 1 cm). Připojte dělící komoru ke zdroji proudu.

PODMÍNKY DĚLENÍ Objem pufru ke každé elektrodě Celkový objem pufru Čas dělení Konstantní napětí Počáteční proud (na gel) –

SEBIA K20 150 ml 300 ml 50 min 90 V 22 ± 2 mA

Po migraci odpojte komoru a vyjměte gelovou plotnu. 83

– – – – – –

Gel osušte v sušičce při 80° C asi 20 min. Usušený gel ponořte do barvícího roztoku sudanové černě přesně na 15 min. Odbarvujte přesně 5 min v 45% ethanolu. Oplachujte gel několik minut v lázni s destilovanou vodou. Vysušte gel při 80° C. Vyhodnoťte gel denzitometrem při 570 nm.

84

Obr. 3. Elektroforeogram a denzitogram lipoproteinů

REFERENČNÍ HODNOTY (SEBIA) pro ELFO lipoproteinů: α-lipoproteiny (HDL) pre-β-lipoproteiny (VLDL) β-lipoproteiny (LDL) chilomikra Lp(a)

23 – 46 % 3 – 18 % 42 – 63 % 0– 4% 0%

85

Obr. 4. Příklady vyhodnocení elektroforeogramů lipoproteinů.

86

Tabulka 12. INTERPRETACE ELEKTROPHORÉZY LIPOPROTEINŮ TYP HYPERLIPEMIE

TYP I

TYP IIa

TYP IIb

TYP III

TYP IV

TYP V

CELKOVÝ CHOLESTEROL

2-4 g/l 5,2 - 10,4 mmol/l

3-10 g/l 7,8 - 26 mmol/l

2,8-3,5 g/l 7,3 - 9,1 mmol/l

3-5 g/l 7,8 - 13 mmol/l

< 2,7 g/l < 7 mmol/l

až do 5 g/l až do 13 mmol/l

TRIGLYCERIDY

30-70 g/l 34 - 79 mmol/l

< 1,6 g/l < 2 mmol/l

2-5 g/l 2,3 - 5,6 mmol/l

2-9 g/l 2,3 - 10,2 mmol/l

2-10 g/l 2,3 - 11,3 mM/l

až do 30 g/l až do 34 mmol/l

VZHLED SÉRA

mléčný

čirý

čirý až lehce zakalený

čirý až lehce zakalený

zakalený

mléčný

CHYLOMIKRA

++++

0

0

0

0

++++

LDL

↓↓↓

↑↑↑

↑↑

↑↑

↓

↓

VLDL

N až ↓↓↓

N

↑

↑↑

↑↑

↑↑

HDL

↓↓↓

N až ↓↓

N až ↓

↓

↓

↓

87

TETRAPYRROLY

Klíčová slova: komplexní sloučeniny, pyrrol, porfyriny, hem, myoglobin, hemoglobin, hemoproteiny, metaloproteiny, prostetická skupina, bilirubin, konjugovaný bilirubin, glukuronosid. Reagencie: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11.

nesrážlivá krev krev nasycená oxidem uhelnatým Ajatin vzorek nesrážlivé krve pro stanovení hemoglobinu Drapkinovo činidlo (roztok 50 mg kyanidu draselného a 200 mg ferrikyanidu draselného v 1 ml roztoku dihydrogenfosforečnanu draselného 140 mg/l) !JED! vzorek krevního séra pro stanovení bilirubinu fyziologický roztok činidlo diazo I (roztok kyseliny sulfanilové 5 g/l v kyselině chlorovodíkové 0,6 mol/l) činidlo diazo II (roztok dusitanu sodného 5 g/l) roztok akcelerátoru (kofein a benzoan sodný) Fehlingův roztok II (250 g hydroxidu sodného a 350 g vinanu sodnodraselného kryst. v 1 l vody)

88

ÚLOHA 1 Vlastnosti hemoglobinu Mezi tetrapyrroly, tj. sloučeniny obsahující ve své struktuře čtyři pyrrolová jádra spojená methylenovými nebo methinovými můstky, náleží hem − prostetická skupina hemoglobinu a dalších hemoproteinů (myoglobin, některé oxidoreduktasy). Pyrrolová jádra spojená methylenovými můstky se nazývají porfyrinogeny, kdežto pyrroly spojené methinovými můstky jsou profyriny k nimž náleží hem. Hlavní funkcí hemoglobinu je transport O2 a CO2, mezi plícemi a tkáněmi. Podílí se rovněž na udržování acidobazické rovnováhy vnitřního prostředí (transport H+ a CO2). Oxid uhelnatý se váže na hem asi 250x pevněji než O2 a tak blokuje transport kyslíku. Kromě toho je hem schopen přenášet CN¯ a SH¯ k cytochromům dýchacího řetězce, kde v důsledku pevné vazby na Fe3+ cytochromoxidasy blokují přenos elektronů na O2¯. Při první pomoci u intoxikací kyanidy musí být terapie nasazena během několika minut: čicháním amylnitritu se hemoglobin oxiduje na methemoglobin, který pevně naváže CN¯ za vzniku kyanomethemoglobinu. Dále se podá i.v. roztok Na2SO3, kterým se působením enzymu kyanidsulfurtransferasy neboli rhodanadasy převedou volné CN– na netoxický thiokyanát (SCN–) a ten se snadno vyloučí močí. Takto se zabrání vazbě CN– na hemové proteiny včetně cytochromu P450. Místo amylnitritu lze v prvé fázi podat i.v. kobalamin (vitamin B12) který rovněž vyváže volné CN¯ za vzniku kyanokobalaminu. Produktem katabolismu hemu je bilirubin a tzv. žlučová barviva.

1.1. Spektrální křivky derivátů hemoglobinu Při otravách oxidem uhelnatým (výfukové plyny, nedostatečné spalování, zdrojem exposice je i kouření) se na hemoglobin (ferrohemoglobin) váže oxid uhelnatý. Vzniklý karbonylhemoglobin nemůže vázat kyslík, tím se snižuje přísun kyslíku do tkání a vzniká tkáňová hypoxie. Účinkem oxidačních činidel dochází k oxidaci Fe2+ na Fe3+, vzniká hemiglobin (methemoglobin, ferrihemoglobin) a je inhibován přenos kyslíku. K methemoglobinemii dochází například při otravách dusitany, chlorečnany, anilinem a anilinovými barvivy, nitrobenzenem i některými léky jako je např. fenacetin, antipyrin. Pro rychlou identifikaci hemoglobinových derivátů lze využít jejich absorpční spektra. Absorpční spektrum oxygenovaného hemoglobinu (oxyhemoglobin, HbO2,) má dvě charakteristická maxima při 576 a 541 nm. Spektrum deoxygenovaného hemoglobinu (Hb) vykazuje pouze jedno absorpční maximum při 555 nm. Spektrum karbonylhemoglobinu (HbCO) má dva vrcholy při 572 a 539 nm, hlavní maximum hemiglobinu (MetHb) leží při 633 nm. Sulfhemoglobin (SHb), který vzniká při intoxikaci sulfanem (sirovodíkem), má výrazné absorbční maximum při 622 nm. Spektrální křivky HbO2 a HbCO lze dále rozlišit redukcí (např. pomocí S2¯) HbO na Hb. Tato změna se odrazí ve změně příslušné spektrální křivky, v případě HbCO se poloha maxim ve spektru nezmění.

89

Obr. 1. Spektrální křivky Pracovní postup: − Porovnejte spektrální křivky deoxygenovaného hemoglobinu, oxyhemoglobinu, methemoglobinu a karbonylhemoglobinu.

1.2. Důkaz karbonylhemoglobinu zkouškou s Ajatinem Pracovní postup: − Nesrážlivou krev před použitím promíchejte. − Do jedné malé zkumavky napipetujte 0,05 ml nesrážlivé krve, do druhé 0,05 ml krve obsahující karbonylhemoglobin (porovnejte zbarvení). − Do obou zkumavek přidejte 0,25 ml Ajatinu a zkumavky lehce protřepejte (roztok nesmí příliš pěnit). − Do každé zkumavky přidejte 5 ml destilované vody a promíchejte. − Po 5 min porovnejte zbarvení v obou zkumavkách. Normální krev poskytuje hnědé zbarvení, které stáním přechází do zelena, v přítomnosti karbonylhemoglobinu je zbarvení jasně červené a stálé.

1.3. Stanovení koncentrace hemoglobinu v krvi Tato metoda využívá měření absorbance stabilního kyanohemiglobinu. jehož jediný absorpční pás při 540 nm má molární absorpční koeficient 44 000. Drapkinovo (kyanidové) činidlo, používané v tomto stanovení, obsahuje hexakyanoželezitan draselný a kyanid draselný. Hexakyanoželezitan draselný oxiduje hemoglobin v nesrážlivé krvi na hemiglobin, na jehož Fe3+ se následně váží kyanidové anionty.

90

Kyanidové anionty mají výrazně vyšší afinitu k železitému iontu než k železnatému; v organismu blokují ionty CN¯ buněčné dýchání, protože vazbou na Fe3+ cytochromoxidasy dýchacího řetězce v mitochondriích je zablokován přenos elektronů na kyslík. Pracovní postup: − Vzorek krve zpracujte v tripletu. − Do každé zkumavky odměřte z dávkovače 2.5 ml Drapkinova činidla a automatickou pipetou přidejte 10 µl krve (krev před pipetováním dobře promíchejte krouživým pohybem, pipetujte ode dna nádobky). − Špičku pipety vždy ještě 3x vypláchněte obsahem zkumavky (špičku pipety nevyndávejte z kapaliny). − Připravené vzorky dobře promíchejte a nechte stát 10 min při laboratorní teplotě. − Změřte absorbanci vzorků proti kyanidovému činidlu při 540 nm. Výsledky zapište do tabulky 1. − Z naměřených hodnot spočítejte průměrnou hodnotu absorbance, kterou použijete k výpočtu. − Látkovou koncentraci hemoglobinu vypočítejte pomocí molárního absorpčního koeficientu (= 44 000) podle vztahu (viz Práce s automatickými pipetami a spektrofotometrem): Avz .2,51 cHb (mmol/l) =

= Avz ⋅ 5,7

44 · 0,01 − Výsledek zapište do tabulky 1. − Hmotnostní koncentraci hemoglobinu (Mr = 64 458) vypočítejte ze vztahu: cHb (g/l) =Avz ⋅ 368 Tabulka 1. vzorek 6.:

absorbance

průměr

c (mmol/l)

krev

VYHODNOCENÍ: Zvýšené hodnoty koncentrace hemoglobinu se vyskytují u onemocnění s abnormální proliferací erythrocytů, při dehydrataci organismu, delším pobytu ve vyšších nadmořských výškách. Snížené hodnoty jsou běžné u anemií nebo po ztrátách krve.

91

Tabulka 2. vzorek krve č.: REFERENČNÍ HODNOTY koncentrace Hb (mmol/l)

muži 2,15 − 2,65 ženy 1,85 − 2,35

koncentrace Hb (g/l)

muži 140 − 170 ženy 120 − 150

NAMĚŘENÉ HODNOTY

Poznámky:

92

ÚLOHA 2.

Vlastnosti tetrapyrrolů 2.1. Vlastnosti porfyrinů Poruchy biosyntézy hemu jsou provázeny ukládáním hemových prekurzorů - porfyrinů v tkáních a jejich vylučováním do moči. Příčinou mohou být dědičné nebo získané defekty některých enzymů - porfyrie. Z nejčastějších příčin je to zejména toxické působení polyhalogenovaných uhlovodíků, olova, chronická infekce virem hepatitidy C (HCV) v kombinaci s abusem alkoholu. K průkazu porfyrinů v moči i v krvi se využívá fluorescence hematoporfyrinu v UV světle. Hematoporfyrin vzniká reakcí krve s koncentrovanou kyselinou sírovou, při které se z hemoglobinu odštěpí globin i železnatý ion a hydratují se vinylové skupiny hemu. Tento test lze použít i při důkazu krevních skvrn. Pracovní postup: – Pozorujte červenou fluorescenci hematoporfyrinu v UV světle proti srovnávacím vzorkům kyseliny sírové bez krve a krve bez kyseliny sírové.

2.2. Stanovení celkového bilirubinu v séru Hemoglobin je účinkem hemoxygenasy a biliverdinreduktasy degradován v buňkách retikuloendoteliálního systému na bilirubin. Další přeměna bilirubinu probíhá v játrech. Protože je bilirubin v plazmě téměř nerozpustný, je při transportu do jater vázán na albumin. V hepatocytech se jeho rozpustnost zvyšuje konjugací s kyselinou glukuronovou. Vzniklý bilirubindiglukuronát je vyloučen žlučí do střeva. Plazmatická koncentrace bilirubinu je výsledkem rovnováhy mezi produkcí bilirubinu z degradovaného hemoglobinu a schopností jater odstraňovat bilirubin z plazmy. Při hyperbilirubinemii přestupuje bilirubin z plazmy do periferních tkání a dodává jim charakteristické nažloutlé zbarvení. Vznik žloutenky (ikteru) může být podmíněn zvýšenou tvorbou bilirubinu způsobenou nadměrným rozpadem erythrocytů − hemolytický ikterus. Snížení exkrece bilirubinu v důsledku vrozených nebo získaných poruch jaterní funkce vede k hepatocelulárnímu ikteru. Blokáda jeho transportu žlučí do střeva způsobuje obstrukční ikterus. Pouze konjugovaný bilirubin může být vylučován močí. Pro fotometrické stanovení bilirubinu se využívá jeho kopulace s diazotovanou kyselinou sulfanilovou na azobarvivo. Reakce nastupuje rychle u konjugovaného bilirubinu (tzv. přímá van der Berghova reakce − přímý bilirubin) a pomalu u nekonjugovaného bilirubinu. V tomto případě může být reakce urychlena alkoholem nebo purinovým derivátem, např. kofeinem (nepřímá van der Berghova reakce − nepřímý bilirubin). Pracovní postup: – Vzorek séra zpracujte v tripletu, kompenzační roztok a slepý vzorek připravte pouze jednou. – Do pěti zkumavek napipetujte reagencie podle tabulky 3.

93

Tabulka 3 reagencie (ml) činidlo diazo I činidlo diazo II akcelerátor fyziologický roztok sérum

vzorek séra 0,1 1 kapka

kompenzační roztok 0,1

0,5

− 0,5

− 0,1

− 0,1

slepý vzorek 0,1 1 kapka 0,5 0,1 −

– Zkumavky dobře promíchejte a po 10 min přidejte do každé zkumavky 0,5 ml Fehlingova roztoku II a opět dobře promíchejte. – V rozmezí 10 – 60 min změřte absorbanci vzorku a kompenzačního roztoku proti slepému vzorku při 605 nm. – Výsledky zapište do tabulky 4. – Z naměřených hodnot absorbancí vzorku vypočítejte průměr, odečtěte od něj absorbanci kompenzačního roztoku a pro takto získanou hodnotu odečtěte z kalibrační křivky odpovídající koncentraci celkového bilirubinu ve vzorku séra. Tabulka 4. vzorek č.:

absorbance

průměr

c (µmol/l)

sérum kompenzační roztok rozdíl absorbancí VYHODNOCENÍ: Zvýšené hodnoty nacházíme u ikterů, nádorů jater a žlučových cest. Tabulka 5. vzorek séra č.: REFERENČNÍ HODNOTY koncentrace celkového bilirubinu (µmol/l)

NAMĚŘENÉ HODNOTY

2,0 – 17,0

94

Poznámky:

95

DUSÍKOVÁ BILANCE

Klíčová slova: močovina, kreatinin, kyselina močová, esenciální aminokyseliny, metabolismus bílkovin, katabolismus, anabolismus Reagencie: vzorky séra S1 a S2 2. vzorek moče 3. standardní roztok močoviny, koncentrace dle údajů výrobce 4. souprava Močovina BUN-color (BioSystems): a) pracovní roztok A: salicylát sodný 62 mmol/l nitroprusid sodný 3,4 mmol/l fosfátový pufr 20 mmol/l, pH 6,9 ureasa 500 U/ml b) pracovní roztok B: chlornan sodný 7 mmol/l hydroxid sodný 150 mmol/l 1.

96

Dusíková bilance je rozdíl mezi množstvím dusíku do organismu přijatého a množstvím dusíku z organismu vyloučeného. Hlavní zdroj přísunu dusíku představuje dusík obsažený v aminokyselinách bílkovin. Rovná-li se množství dusíku do organismu dodaného množství dusíku z organismu vyloučeného, hovoříme o vyrovnané dusíkové bilanci. Kladná dusíková bilance nastává v případech, kdy je množství přijatého dusíku vyšší, než množství dusíku z organismu vyloučeného. Naopak, záporná dusíková bilance nastává v situacích, kdy je množství vylučovaného dusíku vyšší, než množství dusíku dodaného. V klinické praxi se dusíková bilance využívá pro monitorování nutričního stavu pacienta, zejména tam, kde hrozí vznik stavu malnutrice. Malnutrici z klinického hlediska dělíme na dva typy, a to na prosté hladovění a stresové hladovění. Prosté hladovění vzniká při omezení přísunu živin. Ke stresovému hladovění dochází při stresové reakci organismu, která spouští proteokatabolismus i v případech, kdy je vyvážený přísun živin zajištěn. Stavy stresového hladovění vznikají při těžkých úrazech, např. při rozsáhlých popáleninách. Výpočet dusíkové bilance je zde vhodnou metodou pro monitorování metabolismu bílkovin. Pro stanovení dusíkové bilance je třeba připomenout, že vylučování dusíku se neděje pouze ve formě močoviny, ale určitý podíl je také vylučován v moči ve formě kreatininu, NH +4 , kyseliny močové, dále ve stolici a kůží.

97

ÚLOHA 1.

Stanovení koncentrace močoviny Močovina je konečný produkt detoxikace amoniaku, který je hlavním produktem metabolismu bílkovin. Dále vzniká jako produkt bakteriálního metabolismu ve střevě, kde dochází k jeho vstřebávání do portálního řečiště a zpracování na močovinu v játrech. Protože koncentrace močoviny v krvi závisí na metabolickém obratu bílkovin, funkci jater, funkci ledvin, kterými je vylučována a hydrataci organismu, údaje o koncentraci močoviny v krvi představují cennou informaci pro klinické hodnocení řady parametrů. Pohybuje se v rozmezí 2,0 – 8,0 mmol/l. Metabolismus bílkovin je úzce propojen s metabolismem sacharidů a mastných kyselin. Při určitém zjednodušení je možné konstatovat, že u zdravého dospělého jedince je při vyváženém a dostatečném přísunu energetických zdrojů v podobě sacharidů a mastných kyselin metabolismus bílkovin v rovnováze, intenzita proteokatabolických a proteoanabolických dějů je vyrovnaná. Za určitých situací, jako je růst dětského organismu, růst plodu v těhotenství nebo reparace poškozených tkání, dochází k převaze dějů proteoanabolických. Zvýšená syntéza bílkovin poskytuje stavební materiál potřebný pro růst a reparaci tkání. Naproti tomu v situacích, kdy je přísun energetických zdrojů a bílkovin omezen nebo dochází k intenzivním stresovým reakcím v důsledku závažného poškození organismu, proteokatabolické děje převáží. V případě proteokatabolismu jsou strukturální bílkoviny organismu degradovány a jejich štěpné produkty aminokyseliny jsou spotřebovávány za účelem syntézy glukosy v reakcích glukoneogeneze. Jelikož jsou při syntéze glukosy využívány pouze uhlíkové skelety aminokyselin, jejich aminoskupiny musí být odštěpeny. To se děje prostřednictvím transaminačních procesů nebo za vzniku amoniaku. Aby mohly být aminoskupiny a toxický amoniak vyloučeny z organismu, jsou v ornitinovém cyklu zpracovány tak, že vzniká netoxická močovina, která je následně v moči vyloučena z organismu. Z popsaného principu vyplývá, že v situacích, kdy dochází k posunu metabolismu bílkovin ve smyslu jejich degradace, dochází zároveň i ke zvýšené produkci močoviny. Stanovení močoviny v moči společně s dalšími údaji poskytuje cenné informace pro posuzování metabolického stavu organismu. Denně se močí vyloučí 400 – 500 mmol, tj. 25 – 30 g močoviny za 24 hod.

98

Pro stanovení dusíkaté bilance obdržíte tři vzorky od jednoho pacienta: S1 = první odběr séra S2 = sérum odebrané po 24 hod U = vzorek moče z 24 hod sběru POZOR! MOČ JE ZŘEDĚNA 50x, VÝSLEDEK VYNÁSOBTE ŘEDĚNÍM. Stanovení je založeno na hydrolytickém štěpení močoviny, katalyzovaném ureasou, na amoniak a oxid uhličitý: ureasa močovina + H2O

2 NH +4 + CO2

Vzniklý amoniak se stanovuje barevnou reakcí se salicylátem sodným a alkalickým roztokem chlornanu sodného: nitroprusid + 4

NH + salicylát + NaClO

indofenol

Pracovní postup: − −

Vzorky séra, moče a standard zpracujte v dubletu, slepý vzorek pouze jednou. Napipetujte reagencie do zkumavek podle tabulky 1.

Tabulka 1 reagencie (ml)

sérum (S) moč (U) standard sérum 0.01 − − moč (zředěná 50x) − 0.01 − standard − − 0.01 destil.voda − − − pracovní roztok A 1 1 1 promíchat a inkubovat 10 min při pokojové teplotě pracovní roztok B 1 1 1

blank − − − 0.01 1 1

– Promíchejte a inkubujte 10 minut při pokojové teplotě. – Změřte absorbanci standardu a vzorku proti slepému vzorku při 600 nm. Zbarvení je stabilní nejméně 2 hodiny. – Vypočítanou koncentraci moči vynásobte ředěním (50x), výsledky napište do tabulky 2.

99

Tabulka 2 vzorek

absorbance

průměrná hodnota

c (mmol/l)

standard S1 S2 U

100

ÚLOHA 2.

Výpočet dusíkové bilance Dusíková bilance je určována metabolismem proteinů. Za normálních okolností se organismus nachází v dusíkové rovnováze, tzn. přívod dusíku v potravě je stejný jako jeho ztráty v exkretech. Minimální příjem bílkovin pro udržení vyvážené dusíkové bilance je 30 g/24 hod. Když příjem dusíku převyšuje jeho výdej, jde o pozitivní dusíkovou bilanci. Negativní dusíková bilance je charakterizována převahou ztrát. Má-li být dusíková bilance vyvážená, musí bílkoviny v potravě obsahovat aminokyseliny postradatelné i nepostradatelné v přiměřeném množství a poměru. Nedostatek jediné esenciální aminokyseliny změní dusíkovou bilanci na negativní a ani velký přebytek postradatelných aminokyselin tento stav nezlepší. Pro výpočet dusíkové bilance uvedených pacientů použijte hodnoty získané v úloze 1. pacient hmotnost (kg) příjem bílkovin (g) diuréza (1/24 hod)* teplota (°C)

A muž 70 150

B žena 60 150

C muž 60 150

D žena 70 150

38,2

36,4

37,1

36,7

* bude zadána Příjem (g N/24 hod): definovaná výživa: – příjem dusíku vypočítejte z uvedeného příjmu bílkovin, výsledek zapište do tabulky 4. Výdej (g N/24 hod): ztráty N močí: – 80 % se vylučuje formou močoviny (vypočítejte z hodnot získaných v úloze 1.) – 20 % se vylučuje formou kreatininu, NH +4 a kyseliny močové (vypočítejte z hodnoty N vyloučeného močovinou) – vypočítejte celkový dusík vyloučený močí − výsledky zapište do tabulky 3. ztráty N kůží a stolicí: – jsou přibližně stabilní, mění se podle tělesné teploty: – do 37° C 1,0 g – 37 − 38° C 1,3 g – 38 − 39° C 1,5 g – 39 − 40° C 1,8 g – ztráty vypočítejte podle zadané teploty pacienta – výsledek zapište do tabulky 3.

101

zadržený N v tělesné vodě: – stoupne-li během 24 hod koncentrace močoviny v séru, znamená to, že část vytvořené močoviny nebyla vyloučena. Vzhledem ke své dokonalé rozpustnosti je močovina distribuována v celkové tělesné vodě. Zvýšení koncentrace močoviny v séru o 1 mmol/l během 24 hod znamená u 100 kg muže zadržení 60 mmol urey (celková tělesná voda u muže = 0,6 tělesné hmotnosti, u ženy = 0,55 tělesné hmotnosti). – zádrž vypočítejte z rozdílu koncentrací v séru (viz tabulka 2), výsledek zapište do tabulky 3. Tabulka 3. N vyloučený močovinou/24h (g)

celkový N vyloučený močí (g)

ztráty N kůží a stolici (g)

N zadržený v tělesné vodě (g)

celkový N vyloučený močí (g/24 hod) = cu (mmol/24 hod) · 0,028 · 1,25 celkový N zadržený v tělesné vodě = cS1 − cS2 · 0,028 · t.hm. · faktor t.hm. přepočet mmol močoviny na g N = 0,028 výpočet ztráty celkového N močí = 1,25 VYHODNOCENÍ: Příjem větší než výdej: anabolismus. efektivní zpracovávání bílkovin potravy (růst, hojení ran) Výdej větší než příjem: katabolismus, nedostatečná výživa, odbourávání bílkovin těla. Tabulka 4. vzorek č.

příjem N (g)

výdej N (g)

N bilance

102

CLEARANCE

Klíčová slova: kreatin, kreatinin, cystatin C, glomerulární filtrace (GRF), tubulární sekrece, zpětná resorpce, clearance, exkrece, parathyrin (parathormom, PTH), kalcitonin, kalcitriol. Reagencie: 1. vzorek deproteinovaného séra S 2. vzorek moče U 3. standard K (kreatinin) 4. roztok kyseliny trichloroctové 1,22 mol/l !ŽÍRAVINA! 5. roztok kyseliny pikrové 0,04 mol/l 6. roztok hydroxidu sodného 0,75 mol/l 7. standard P (fosfát) 8. činidlo P (roztok vanadičnanu amonného 2 mmol/l a roztok molybdenanu amonného 30 mmol/l, 1:1) pro stanovení fosfátu

103

Ledviny jsou jedním ze základných orgánů, podílejících se na udržování homeostázy organismu. Vylučují koncové metabolity dusíkatých látek močovinu (viz. Dusíková bilance.) a kreatinin, dále kyselinu močovou, ionty, H+, atd. Kreatinin je cyklický imid kyseliny N-metylguanidinoctové. Vzniká ve svalové tkáni neenzymaticky jako koncový produkt metabolismu kreatinu a kreatinfosfátu. Referenční rozmezí koncentrace kreatininu v plazmě (kreatininemie) je 70 − 125 µmol/l pro muže a 50 −105 µmol/l pro ženy. Kreatininemie je za fyziologických podmínek ovlivněna množstvím svalové hmoty. Proto se s nižšími hladinami setkáváme u dětí, osob s malým množstvím svalové hmoty, pacientů dlouhodobě připoutaných na lůžko (úbytek svalů z inaktivity) či u pacientů s myodystrofíí. Zvýšenou hladinu kreatininu v séru pozorujeme při selhávání ledvin (renální insuficienci). Hladina kreatininu v krvi je jen podstatně méně ovlivněna jeho příjmem v potravě a tělesnou námahou. Většina kreatininu se do moči dostává glomerulární filtrací (90 %), pouze minoritní podíl tubulární sekrecí (10 %). Za patologických okolností se na vzestupu kreatininemie podílí významně i porucha tubulární sekrece. Koncentrace kreatininu v definitivní moči je přibližně 100x vyšší než jeho koncentrace v plazmě. Celkové množství vyloučené za 24 hod se za normálních podmínek pohybuje mezi 9 − 16 mmol (tj.1 − 1,8 g). Důležitou roli v diagnostice poruch ledvinných funkcí má posouzení glomerulární filtrace, nejčastěji pomocí tzv. clearance endogenního kreatininu. Clearance nějaké látky představuje teoretický objem krevní plazmy zcela očištěné ledvinami od této látky za jednotku času (sekundu). V případě látky vylučované pouze glomerulární filtrací odráží clearance rychlost glomerulární filtrace (GFR). Optimální indikátorovou látkou pro monitorování glomerulární filtrace je ta, která se do moči dostává výhradně glomerulární filtrací a není dále v tubulech ani resorbována ani secernována. Tyto podmínky splňuje inulin, zásobní sacharid rostlin. Jeho nevýhodou je především obtížné zajištění stabilní koncentrace v plazmě (nevyskytuje se přirozeně v lidském organismu, musel by být podáván intravenózně). Jeho využití je tedy spíše pro vědecké účely. Pro výpočet clearance je potřeba znát koncentraci indikátorové látky v plazmě a moči, dále objem moči za definovaný časový interval (nejčastěji 24 hod). GFR =

U⋅V P

U – koncentrace látky v moči P – koncentrace látky v plazmě V – diuréza za 24 h [ml/s] (objem definitivní moči v ml / 86400 s)

V praxi lze použít odhadu clearance kreatininu dle vzorce Cockroftova a Gaulta. Zohledňuje fakt, že vlastní koncentrace kreatininu závisí na svalové hmotě, pohlaví a věku pacienta, není nutný sběr moči. Pro ženy se vypočtená hodnota musí vynásobit koeficientem 0,85. Clkr =

(140 – věk[roky]) ⋅ t.hm. [kg] 44,5 · Skr [µmol/l]

Clkr – clearance kreatininu Skr – sérová koncentrace kreatininu

V klinické praxi se hodnoty kreatininemie a clearance kreatininu využívá k monitorování renálních funkcí − zejména hloubky chronické renální insuficience. Normální Clkr se pohybuje v rozmezí 1,3 − 2,8 ml/s/1,73 m2 tj. hodnoty připadající na ideální povrch těla, tyto hodnoty se musí korigovat u pacientů s abnormálním povrchem těla (obezita). Při

104

poklesu clearance pod 0,5 ml/s/1,73 m2 mluvíme o renální nedostatečnosti při poklesu pod 0,15 ml/s/1,73 m2 o renálním selhání. Vhodnější biomarker funkce ledvin je cystatin C. Je to malý neglykosylovaný bazický protein (13,3 kD), patřící mezi inhibitory superrodiny cysteinových proteas. Cystatin C je produkován prakticky všemi jadernými buňkami a je přítomen ve všech vyšetřovaných tělesných tekutinách. Úroveň produkce je konstantní a není ovlivněna zánětlivými procesy, pohlavím, věkem a svalovou hmotností. V normální ledvině je cystatin C téměř volně filtrován glomerulární membránou a potom téměř úplně reabsorbován a degradován buňkami proximálního tubulu. Plazmatická koncentrace cystatinu C je tedy výhradně určena rychlostí glomerulární filtrace (GFR), což činí cystatin C výborným indikátorem GFR. Změny jeho sérové hladiny odhalí postižení ledvin dříve (v iniciální fázi), než je možné prokázat kreatininovou clearancí. Pro vyšetření stačí jen změřit jeho hladinu v séru, oproti kreatininu odpadá sběr moči za 24 hodin. Koncentrace cystatinu v séru je mírou glomerulární filtrace, jeho koncentrace v moči je mírou poškození buněk proximálních tubulů. REFERENČNÍ HODNOTY

věk (roky)

cystatin C (mg/l)

3 – 50

0,63 – 1,33

> 50

0.74 − 1.55

Zvýšená hladina v krvi • snížení glomerulární filtrace • u některých nádorů (melanom, kolorektální karcinom) Zvýšená hladina v krvi i moči – urémie (poškození glomerulů i tubulů)

105

ÚLOHA 1. 1.1. Stanovení koncentrace kreatininu v séru a moči Stanovení je založeno na Jaffého reakci v deproteinovaném séru. Při reakci kreatininu s kyselinou pikrovou v alkalickém prostředí vzniká červenooranžově zbarvený produkt, jehož koncentrace se stanovuje fotometricky. Pro stanovení koncentrace kreatininu v séru a moči obdržíte vzorek deproteinovaného séra a moče pacienta označeného číslem: S = deproteinované sérum U = moč POZOR! VZOREK MOČE ZŘEĎTE PŘED STANOVENÍM 50x. VÝSLEDEK JE TŘEBA VYNÁSOBIT 50x ! Pracovní postup: − Sérum, zředěnou moč i standard zpracujte vždy v tripletu, slepý vzorek pouze jednou − Do očíslovaných zkumavek napipetujte reagencie podle tabulky 1. Tabulka 1. reagencie (ml) deproteinované sérum

vzoreks

vzorekv

standard

0,25

− 0,25

−

− standardní roztok K 0,25 − − destilovaná voda 0,50 0,50 0,50 kyselina trichloroctová 0,25 0,25 0,25 promíchat, nechat stát 5 min při laboratorní teplotě kyselina pikrová 0,50 0,50 0,50 hydroxid sodný 0,50 0,50 0,50 moč zředěná 50x

−

slepý vzorek − − 0,75 0,25 0,50 0,50

– Obsah zkumavek dobře promíchejte. – Přesně po 20 min změřte absorbanci vzorků i standardu proti slepému vzorku při 505 nm. – Naměřené hodnoty zapište do tabulky 2. – Vypočítejte průměrné hodnoty absorbance a zapište je do tabulky 2. – Z průměrných hodnot absorbance vzorků a standardu vypočítejte koncentraci kreatininu v séru cP (µmol/l) a v moči cU (mmol/l). – Vypočítanou koncentraci v moči vynásobte ředěním (50x). – Výsledky zapište do tabulky 2.

106

Tabulka 2. vzorek č.: standard K S U

absorbance

průměr

koncentrace µmol/l mmol/l

1.2. Výpočet clearance Látkové množství kreatininu n, které za sekundu přejde do glomerulárního filtrátu, se rovná součinu jeho koncentrace ve filtrátu a objemu filtrátu vytvořeného za sekundu. Protože kreatinin je nízkomolekulární látka, je jeho koncentrace ve filtrátu stejná jako v plazmě (cP). Objem vytvořeného filtrátu musí být stejný jako objem plazmy, která by se filtrací kreatininu zcela zbavila (VP), tedy n = cP · VP. Totéž látkové množství kreatininu n z glomerulárního filtrátu se pak za každou sekundu vylučuje definitivní močí. Je tedy současně rovno součinu koncentrace kreatininu v definitivní moči (cU) a objemu moče vyloučeného za sekundu (VU). Platí tedy n = cU · VU. Pro výpočet kreatininové clearance GFR vyplývá následující vztah: VP (ml/s) = GFR =

cU ⋅ VU CP

Hodnota GFR se obvykle ještě koriguje na standardní tělesný povrch 1,73 m2. Přitom se vychází z předpokladu, že plocha filtračního média v glomerulech je úměrná tělesnému povrchu. Tělesný povrch A pacienta se vypočítá ze vztahu: A = 0,167 ⋅

m ⋅l

0,167 je empirický faktor, m hmotnost pacienta v kg a l jeho výška v m. Pro výpočet korigované GFRkor platí: GFRkor (ml/s) =

cU ⋅ VU ⋅ 1,73 cP ⋅ A

Pro výpočet clearance je tedy třeba znát kreatininemii (mmo/l), kreatininurii (mmol/l), diurézu pro výpočet objemu moče za sekundu (ml/s), tělesnou výšku a hmotnost pacienta.

107

Tabulka 3. pacient diuréza* (ml/24 hod) hmotnost (kg) výška (cm)

A muž

B žena

C muž

D žena

E muž

F žena

82 170

58 170

95 190

58 165

90 180

70 160

* bude zadána Pracovní postup: – Z hodnot naměřených v úloze 1.1. vypočítejte kreatininovou clearance a exkreci kreatininu močí u zadaného pacienta: GFRkor = …………... ml/s exkrece = ………….. mmol/24hod Poznámky:

108

ÚLOHA 2. Zpětná resorpce fosfátů Anorganický fosfor se v plazmě (séru) vyskytuje v podobě hydrogenfosforečnanů a dihydrogenfosforečnanů, které jsou při pH 7,4 zastoupeny ve vzájemném poměru 4:1. Jeho vylučování je hormonálně regulováno parathormonem (PTH), který brání zpětné resorpci fosfátů, tedy zvyšuje fosfátovou clearance a vylučování fosfátů močí. Metabolismus fosforu v lidském organismu je velice úzce spjat s metabolismem vápníku. Hyperfosfátemie stimuluje sekreci parathormonu přímým působením na příštítná tělíska i nepřímo snížením koncentrace ionizovaného kalcia. Kalcitriol (aktivní forma vitamínu D3) zvyšuje střevní absorpci vápníku i fosfátů. Kalcitonin inhibuje činnost osteoklastů (tabulka 4.). Stanovení clearance fosfátů a výpočet jejich zpětné resorpce umožňuje odlišit poruchy metabolismu fosfátů způsobené změnou funkce příštítných tělísek od ostatních poruch (hyper- nebo hypovitaminózy D, selhání ledvin, zvýšené hladiny STH, malabsorpční syndrom, atd.). Koncentrace fosfátů v krvi je fyziologicky zvýšená u dětí (anabolismus kostní tkáně), hyperfosfátemie se patologicky objevuje např. při nedostatečnosti ledvin (vázne glomerulární filtrace fosfátů), hypoparathyreóze, pseudohypoparathyreóze (zvýšená tubulární resorpce fosfátů), intoxikace vitamínem D (zvýšená absorpce ze střeva i zpětná resorpce v tubulech ledvin) a vzácněji např. u gigantismu nebo u diabetické ketoacidózy. K hypofosfátemii může dojít v důsledku inhibice zpětné resorpce fosfátů v tubulech (hyperfosfáturie) např. u hyperparathyreodismu, rachitis. Tabulka 4: Regulace vstřebávání/vylučování Ca2+ a P hormon

kosti ↑ uvolnění Ca

2+

ledviny ↑ zpětné vstřebávání Ca

střeva 2+

↑ vstřebávání Ca2+ (nepřímo – vitamín D)

PTH

↑ uvolnění P

↓ zpětné vstřebávání P

↑ vstřebávání P (nepřímo – vitamín D)

↑ zpětné vstřebávání Ca2+

↑ vstřebávání Ca2+

vitamín D

ve fyziologických koncentrací ↑ zabudovávaní Ca2+ do kostí ↑ zabudovávaní P do kostí

↑ zpětné vstřebávání P

↑ vstřebávání P

↓ uvolnění Ca

↓ zpětné vstřebávání Ca

kalcitonin

↓ uvolnění P

2+

2+

↓ resorpci Ca2+

↓ zpětné vstřebávání P

Ke stanovení anorganických fosfátů v deproteinovaném biologickém materiálu se využívá reakce vanadičnanu a molybdenanu amonného s kyselinou fosforečnou. V kyselém prostředí vzniká rozpustná, žlutě zbarvená komplexní sloučenina, jejíž koncentraci je možno stanovit fotometricky. Pro stanovení koncentrace fosfátů v séru a v moči použijte vzorek deproteinovaného séra a moče stejného pacienta jako v úloze 1. POZOR! VZOREK MOČE ZŘEĎTE PŘED STANOVENÍM 5x. VÝSLEDEK JE TŘEBA VYNÁSOBIT 5x !

109

2.1. Stanovení koncentrace anorganického fosfátu v séru a v moči Pracovní postup: – Sérum, zředěnou moč i standard zpracujte vždy v tripletu, slepý vzorek pouze jednou. – Do očíslovaných zkumavek napipetujte reagencie podle tabulky 5. Tabulka 5. reagencie (ml) deproteinované sérum moč zředěná 5x! standardní roztok P destilovaná voda kyselina trichloroctová

vzorekS

vzorekU

standard

slepý vzorek

0,1

−

−

−

− 0,1

− 0,3 0,4

− 0,3 0,4

− 0,1 0,3 0,4

− 0,4 0,4

– – – – – –

Obsah zkumavek dobře promíchejte a nechte stát 5 min. Do každé zkumavky přidejte 1 ml činidla P a obsah zkumavek promíchejte. Po 20 min změřte absorbanci vzorků i standardu proti slepému vzorku při 400 nm. Naměřené hodnoty zapište do tabulky 5. Vypočítejte průměrné hodnoty absorbance a zapište je do tabulky 5. Z průměrných hodnot absorbance vzorků a standardu vypočítejte koncentraci fosfátů v séru cP a v moči cU . – Vypočítanou koncentraci v moči vynásobte ředěním (5x). – Výsledky zapište do tabulky 6.

Tabulka 6. vzorek č.:

absorbance

průměr

c (mmol/l)

standard P S U

2.2. Výpočet zpětné resorpce fosfátů v ledvinových tubulech Pro výpočet exkreční frakce nebo zpětné resorpce fosfátů (i kterékoliv nízkomolekulární látky) se používají tyto vztahy: exkrece (fosfát) =

cU (fosfát) ⋅ cP (kreatinin) cP (fosfát) ⋅ cU (kreatinin)

resorpce (fosfát) = 1 - exkrece Těchto výpočtů se stále častěji používá k hodnocení exkrece a resorpce např. hlavních kationtů moče, fosfátů, hydrogenkarbonátu, kyseliny močové. K vyšetření není třeba sbírat moč v přesně stanoveném období.

110

Pracovní postup: – Z hodnot naměřených v úloze 2.1. vypočítejte zpětnou resorpci fosfátů zadaného pacienta. – Výsledky zapište do tabulky 7. VYHODNOCENÍ: Tabulka 7. vzorek č.:

kreatininemie (µmol/l) exkrece kreatininu moči mmol/24 hod GFR (ml/s) fosfátemie (mmol/l) resorpce fosfátů

REFERENČNÍ HODNOTY ženy 53 – 97 muži 61 –1 15 ženy 7,5 – 15 muži 9 – 18 ženy 7,58 – 2,68 muži 1,63 – 2,6 0,81 – 1,48 0,8 – 0,98

NAMĚŘENÉ HODNOTY

Poznámky:

111

MARKERY SVALOVÉ TKÁNĚ

Klíčová slova: aktivita enzymů, cytoplazmatické enzymy, mitochondriální enzymy, laktátdehydrogenasa (LD – EC 1.1.1.27.), alaninaminotransferasa (ALT – EC 2.6.1.2.), aspartátaminotransferasa (AST – EC 2.6.1.1.), kreatinkinasa (CK – EC 2.7.3.2.), kreatin, myoglobin, troponin, izoenzymy, elektroforéza. Reagencie 1. vzorek séra 2. souprava Kreatinkinasa (Biosystems): pracovní roztokCK: (směs činidla A a činidla B 4:1) a) činidloCKA: (imidazol 125mmol/l,EDTA 2 mmol/l, octan hořečnatý·25mmol/l, D-glukosa 25 mmol/l, N-acetylcystein 25 mmol/l, hexokinasa 6,000 U/l, NADP 24 mmol/l, pH 6 7). b) činidloCK B: (kreatinfosfát 250 mmol/l, ADP 15 mmol/l, AMP 25 mmol/l, P1,P5-di(adenosin-5)-pentafosfát 102 mmol/l, glukosa-6-fosfát-dehydrogenasa 8,000 U/l 3. souprava Aspartátaminotransferasa (Biosystems): pracovní roztokAST: (směs činidla A a činidla B 4:1) a) činidloAST A: (Tris 121 mmol/l , L-aspartát 362 mmol/l, malátdehydrogenasa > 460 U/l, laktát dehydrogenasa > 660 U/l, hydroxid sodný 255 mmol/l, pH 7,8 b) činidloAST B: (NADH 13 mmol/l, 2-oxoglutarát 75 mmol/l hydroxid sodný 148 mmol/l, azid sodný 9,5 g/l ) 4. souprava Alaninaminotransferasa (Biosystems): pracovní roztokALT: (směs činidla A a činidla B 4:1) a) činidloALT A: (Tris 150 mmol/l,L-Alanin 150 mmol/l laktátdehydrogenasa 1350 U/l, pH 7,3) b) činidloALT B: (NADH 1,3 mmol/l, 2-oxoglutarát 76 µmol/l, hydroxid sodný 148 mmol, azid sodný 9,5 g/l) 5. souprava Laktátdehydrogenasa (Biosystems): pracovní roztokLDH: (směs činidla A a činidla B 4:1) a) činidloLDH A(N-metyl-D-glukamin 0,406 mol/l, laktát 62,5 mmol/l, pH 9,4) b) činidloLDH B:(NAD+ 50 mmol/l ) 6. souprava HYDRAGEL ISO-LDH K20 (SEBIA) a) pufr TRIS-barbiturátový, pH 8,3 b) ISO-LDH substrát: NAD+, nitro-blue tetrazolium, fenasin-methosulfát, laktát lithný c) zastavovací roztok: kys. octová 50 g/l a kys. citronová 5 g/l d) odbarvovací roztok: kys. citronová 0,5g/l

112

Stanovení aktivity některých enzymů v séru je pomocným vodítkem při diagnostice bolesti na hrudi, jejíž příčinou může být řada onemocnění: infarkt myokardu, plicní embolie, angína pectoris. Rychlost rozpoznání příčiny vyvolávající bolest je zejména v případě akutního infarktu myokardu (AIM) rozhodující pro úspěšnou terapii. V důsledku zvýšené propustnosti membrán buněk srdečního svalu poškozených ischemií, jsou do krevního oběhu uvolňovány některé cytoplazmatické enzymy: kreatinkinasa, aspartátaminotransferasa, izoenzym LD1 laktátdehydrogenasy a BB-izoenzym glykogenfosforylasy B. V současné době k uvedeným enzymovým markerům přistupuje i stanovení myoglobinu, troponinu I a troponinu T (komponenty troponinového regulačního systému, který se nachází v kontraktilním aparátu příčné pruhovaného svalu). Myoglobin je rychlým markerem, signalizujícím poškození myokardu, protože se při poruše integrity sarkolemy vyplavuje do krve. Zvýšení koncentrace myoglobinu nastupuje již za 2 hod od prvých příznaků. Maxima, tj. až 30 násobného zvýšení koncentrace myoglobinu proti normě, dosahuje již po 4 − 6 hod, což je přibližně o 8 − 10 hod dříve, než je tomu u izoenzymu CKMB kreatinkinasy, který je jedním z nejčasnějších enzymových markerů poškození myokardu. Podle nejnovějších kritérií WHO je troponin-T nebo I uznáván jako hlavní biochemický marker AIM, myoglobin je považován za nejčasnější marker. V diagnostice onemocnění svalové tkáně (myokardu nebo kosterního svalstva) se kromě klinického vyšetření a pomocných metodik (EKG – myokard; EMG, svalová biopsie, molekulárně genetické vyšetření – kosterní svalstvo), významně uplatňuje laboratorní vyšetření biochemických markerů svalového poškození. Mezi základní markery svalového poškození patří: myoglobin, laktátdehydrogenasa (LD), kreatininkinasa (CK) zvláště izoenzymy CK-MB, aspartátaminotransferasa (AST), troponin T či I. Laboratorní diagnostika infarktu myokardu Biochemická diagnostika bolestí na hrudi, která může být příznakem akutního infarktu myokardu (AIM), nestabilní anginy pectoris nebo plicní embolie, je založena na detekci intracelulárních cytoplazmatických nebo mitochondriálních bílkovin, které se dostávají do krevního řečiště. K jejich uvolnění z buňky dochází při ischémii, kdy se nejprve zvyšuje permeabilita plazmatické membrány a při pokračující ischémii dochází ke kompletní destrukci buňky. Mezi klasické testy patří stanovení aspartátaminotransferasy (AST). Jedná se o cytoplazmatický, ale i mitochondriální enzym, jehož aktivita začíná stoupat za 4 – 6 h po vzniku ischémie myokardu a maximum dosahuje za 1 – 2 dny, k normě se navrací do 5 dnů. Zvýšení hladiny AST není specifické pro postižení myokardu, dochází k němu i při postižení jater, kosterního svalstva nebo při hemolýze. V některých případech (selhávání krevního oběhu, městnání krve v játrech) může dojít i k vzestupu ALT (alaninaminotransferasy), která je citlivým a poměrně specifickým markerem postižení hepatocytů. Kreatininkinasa (CK) kopíruje průběh AST, aktivita stoupá ale o něco dříve. Její stanovení má význam v diagnostice AIM pouze při stanovení jejího izoenzymu CK-MB. Izoenzym CK-MB tvoří 3 % celkové CK v kosterním svalstvu, ale představuje 40 % aktivity CK v myokardu. Relativní nárůst podílu CK-MB na celkové hladině CK podporuje diagnózu AIM. Celková CK i její izoenzym CK-MB se stanovují na základně své enzymatické aktivity. Nově se stanovuje antigen CK-MB tzv. CK-MB mass pomocí specifické protilátky. Tento test je citlivější, protože je schopen detekovat i neaktivní, degradované formy CK-MB, je však ekonomicky nákladnější. Laktátdehydrogenasa (LD) je nejméně specifickým markem poškození myokardu, větší specifičnost má stanovení jejích izoenzymů (při AIM je zvýšená aktivita izoenzymu H4, poměr LD1/LD2 se zvýší na hodnotu vyšší než 1). Aktivita po AIM stoupá poměrně pozdě, 113

má však význam pro diagnostiku infarktu, který proběhl před několika dny. Zvýšená aktivita LD v séru může být důsledkem hemolýzy (izoenzym LD1) a poškození jaterního parenchymu (izoenzym LD5). K cenným markerům patří myoglobin, jehož hladina v séru stoupá za 0,5 – 2 h po vzniku AIM. Jedná se tedy o marker časný, avšak poměrně nespecifický. Hladina v séru může být zvýšena v důsledku poškození kosterního svalstva či snížených renálních funkcí. Za nejspecifičtější a nejcitlivější marker kardiálního postižení se pokládá stanovení troponinu T (TnT) nebo I (TnI). Jsou součástí tzv. troponinového komplexu, který zabezpečuje posun aktinových a myosinových vláken a tím kontrakci svalu. Primární struktura TnI a TnT myokardu je jiná než v kosterním svalstvu, proto k jejich zvýšení v krvi dochází specificky při poškození kardiomyocytů. Vzestup hladiny Tn nastává po 3 hodinách od začátku bolesti při AIM, maxima dosahuje kolem 4. dne, zvýšená hladina TnI přetrvává po proběhlém AIM 7 − 10 dní, v případě TnT ještě déle.

Obr.1.: Kinetika změn koncentrací srdečních markerů v počátečních hodinách po AIM Dle doporučení WHO se v běžné klinické praxi nejvíce používá v laboratorní diagnostice stanovení CK, CK-MB, CK-MBmass, troponin I a myoglobinu.

114

Mezi nové diagnostické testy, které zatím nejsou součástí klinické praxe, patří stanovení kardiospecifického izoenzymu glykogenfosforylasy BB, H-FABP (heart fatty acids binding protein) a albuminu s modifikovanou N terminální částí (tzv.: ischemia-modified albumin, IMA).

Laboratorní diagnostika rhabdomyolýzy Dalším z poměrně vážných stavů, které jsou spojené s poškozením svalové buňky, je rhadomyolýza. Při ní dochází k rozpadu buněk příčně pruhovaného svalstva. V séru jsou detekované vysoké hladiny myoglobinu, celkové CK, AST, LD a aldolasy. Optický Wartburgův test Pro stanovení aktivity řady enzymů (LD, ALT, AST) se využívá tzv. Wartburgův optický test. Principem tohoto stanovení je schopnost redukovaných forem koenzymů NADH a NADPH absorbovat záření vlnových délek 330 - 370 nm (v praxi měříme obvykle při 340 nm).

Obr. 2. Srovnání absorpčních spekter NAD a jeho redukované formy NADH Změny absorbance v této oblasti spektra jsou přímo úměrné změně množství redukovaných/oxidovaných molekul koenzymu za jednotku času. Pro stanovení aktivity pomocí tohoto testu není nezbytné, aby některý z koenzymů byl substrátem daného enzymu (jako je tomu např. v případě LD). První reakcí, která je zároveň limitní reakcí, je reakce stanovovaného enzymu a poslední je reakce produkující/spotřebovávající NAD(P)H. Systému spřažených reakcí se využívá například pro stanovení katalytické aktivity CK, ALT, AST (viz návody).

115

ÚLOHA 1.

Stanovení katalytické aktivity kreatinkinasy (CK) Kreatinkinasa (CK) katalyzuje v přítomnosti kreatinfosfátu, fosforylaci ADP za vzniku ATP a kreatinu. Katalytická aktivita se určuje jako míra vzniku NADPH, který se měří při 340 nm a je výsledkem spřažených reakcí hexokinasy (HK) a glukosa-6-fosfátdehydrogenasy (G6P-OH) CK kreatinfosfát + ADP → kreatin + ATP HK ATP + glukosa → ADP + glukosa-6-fosfát G-6-P-DH glukosa-6-fosfát + NADP → 6-fosfoglukonát + NADPH + H+ Pracovní postup: − Pipetujte do označených zkumavek: vzorek pracovní roztok CK

50 µl 1,0 ml

− Promíchejte a nasajte do kyvety fotometru a zapněte stopky. − Po 3 minutách změřte počáteční absorbanci a pak ji odečítejte v minutových intervalech po dobu 3 minut. − Vypočtěte rozdíl mezi následnými absorbancemi a průměrnou nulovou absorbancí (∆A/min). Výpočet aktivity CK: Vt ⋅ 106 ∆A/min ⋅  = U/l ε ⋅ l ⋅ Vs Molární absorbance (ε) NADPH při 340 nm je 6 300, světelná cesta (l) je 1 cm, celkový reakční objem (Vt) je 1,05, objem vzorku (Vs) je 0,05 a 1 U/l odpovídá 16,67 nkat/l. Následující rovnice je pro výpočet katalytické aktivity CK: ∆A/min

x 3333=U/l x 55561= nkat/l

116

Obr. 3. Elektroforéza izoenzymů kreatinkinasy

117

ÚLOHA 2.

Stanovení katalytické aktivity AST Aspartátaminotransferasa (AST neboli GOT) katalyzuje přenos aminoskupiny z aspartátu na 2-oxoglutarát za vzniku oxalacetátu a glutamátu. Katalytická aktivita se určuje jako míra úbytku NADH, k čemuž dochází vlivem spřažené reakce s malátdehydrogenasou (MDH). Úbytek NADH se měří fotometricky při 340 nm. AST aspartát + 2-oxoglutarát → oxalacetát + glutamát MDH oxalacetát + NADH + H+ → malát + NAD+ Pracovní postup: − Pipetujte do označených zkumavek reakční teplota pracovní roztokAST vzorek

37° C 1,0 ml 50 µl

25° C 1,0 ml 100 µl

− Promíchejte, nasajte do kyvety fotometru a zapněte stopky. − Po 1 minutě odečtěte počáteční absorbanci a pak ji odečítejte v minutových intervalech po dobu 3 min. − Vypočtěte rozdíl mezi následnými absorbancemi a průměrnou minutovou absorbanci (∆A/min) Výpočet aktivity AST: Vt ⋅ 106 ∆A/min ⋅  = U/1 ε ⋅ l ⋅ Vs µkat/l = 60 U/l Molární absorbance (ε); NADH při 340 nm je 6 300, světelná dráha ((l) je 1 cm. celkový reakční objem (Vt) je 1,05 při 37°C a 1,1 při 30° C. objem vzorku (Vs) je 0.05 při 37° C a 0,1 při 30° C, 1 U/l odpovídá 0,0166 µkat/l. Následující rovnice je pro výpočet katalytické aktivity CK: Faktory pro výpočet: 37°C ∆A/min x 3333 = U/l x 55,55 = µkat/l 30° C ∆A/min x 1746 = U/l x 29,1 = µkat/l

118

ÚLOHA 3.

Stanovení katalytické aktivity ALT Alaninamiotransferasa (ALT neboli GPT) katalyzuje přenos aminoskupiny z alaninu na 2-oxoglutarát, za vzniku pyruvátu a glutamátu. Katalytická aktivita je určena poměrem úbytku NADH, k němuž dochází vlivem spřažené reakce s laktátdehydrogenasou (LDH). Úbytek je měřen při 340 nm. ALT alanin + 2-oxoglutarát → pyruvát + glutamát LDH pyruvát + NADH + H+ → laktát + NAD+ Pracovní postup: − Pipetujte do označených zkumavek: reakční teplota pracovní roztokALT vzorek

37° C 1,0 ml 50 µl

25° C 1,0 ml 100 µl

− Promíchejte, nasajte do kyvety fotometru a zapněte stopky. − Po 1 minutě odečtěte počáteční absorbanci a pak ji odečítejte v minutových intervalech po dobu 3 min. − Vypočtěte rozdíl mezi následnými absorbancemi a průměrnou minutovou absorbanci (∆A/min) Výpočet aktivity ALT: Vt ⋅ 106 ∆A/min ⋅  = U/l ε ⋅ l ⋅ Vs µkat/l = 60 U/l Molární absorbance (ε) NADH při 340 nm je 6 300 světelná dráha (l) je 1 cm celkový reakční objem (Vt) je 1,05 při 37° C a 1,1 při 30° C objem vzorku (Vs) je 0,05 při 37° C a 0,1 při 30° C, 1 U/l odpovídá 0,0166 µkat/l. Následující rovnice je pro výpočet katalytické aktivity CK:

119

Faktory pro výpočet:

37°C ∆A/min x 3333 = U/l x 55,55 = µkat/l 30°C ∆A/min x 1746 = U/l x 29,1 = µkat/l

120

ÚLOHA 4.

Stanovení katalytické aktivity laktátdehydrogenasy (LD)

Laktátdehydrogenása (LD neboli LDH) katalyzuje redukci pyruvátu pomocí NADH za vzniku laktátu a NAD+. Katalytická aktivita se určuje jako míra úbytku NADH, který se měří se při 340 nm. LD pyruvát + NADH + H+ → laktát + NAD+ Pracovní postup: − Pipetujte do označených zkumavek: pracovní roztokLD vzorek

1,0 ml 20 µI

− Promíchejte, nasajte do kyvety fotometru a zapněte stopky. − Po 30 vteřinách inkubace odečtěte počáteční absorbanci a pak ji odečítejte v minutových intervalech po dobu 3 min. − Vypočtěte rozdíl mezi následnými absorbancemi a průměrnou minutovou absorbanci (∆A/min).

Výpočet aktivity LD: Vt ⋅ 106 ∆A/min  = U/L ε · l · Vs ∆A/min x 6508 = U/L x 108 = µkat/L

121

VYHODNOCENÍ: marker CK AST ALT LD

REFERENČNÍ HODNOTY NAMĚŘENÉ HODNOTY muži 10 − 65U/l ženy 7 − 55U/l < 29 U/l < 25 U/l 83 − 143 U/l

0,167 − 1,084 µkat/l 0,117 − 0,917 µkat/l < 0,48 µkat/l < 0,42 µkat/l 1,38 − 2,38 µkat/l

122

ÚLOHA 5.

Stanovení ALT (GPT), AST (GOT) a CK pomoci přístroje REFLOTRON®, Roche Stanovení koncentrace katalytické aktivity těchto enzymů je založeno na technice reflexní fotometrie, při níž se měří intenzita odraženého záření od homogenně zbarvené podložky. Reakce probíhají na pevném nosiči (reagenční zóna proužku), který obsahuje suchá činidla, aktivovatelná vodou obsaženou v naneseném vyšetřovaném vzorku. Reagencie potřebné pro reakci jsou nanesené až pod vrstvou skleněných vláken, na kterých se zachytí krvinky. Reflotron® může analyzovat plnou krev, plazmu nebo sérum. 5.1. Stanovení ALT (GPT), AST (GOT) a CK ve vlastní kapilární krvi Při stanovení postupujte podle návodu uvedeného v praktickém cvičení Stanovení celkového cholesterolu (TC), HDL cholesterolu (HDL-C) a triacylglycerolů (TAG), úloha 5. POZOR ! Přístroj Reflotron® udává výsledky v U/l. Získané údaje převeďte do jednotek µkat/l podle vztahu: 1 U = 0,0166 µkat 5.2. Stanoveni ALT (GPT), AST (GOT) a CK v séru používaném v úlohách 1-3 Pracovní postup: – Stejným postupem jako v úloze 5.1. stanovte koncentraci katalytické aktivity uvedených enzymů v séru používaném v úlohách 1-3. – Sérum nanášejte na příslušné reagenční proužky pipetou Reflotron (pevný objem 32 µl). – Pipeta má tři zarážky. Při nasáváni vzorku stiskněte píst k první zarážce a pomalu uvolňujte píst do základní polohy (vzorek musí být nabrán bez vzduchových bublin). – Vzorek naneste na reagenční zónu proužku stisknutím pístu k druhé zarážce. – Špičku odstraňte úplným stisknutím pístu pipety.

123

ÚLOHA 6.

Elektroforéza izoenzymů laktátdehydrogenasy Laktátdehydrogenasa je cytoplazmatický enzym, který se vyskytuje v buňkách téměř všech orgánů. Jeho kvartérní struktura je tvořena čtyřmi podjednotkami (tetramer) dvojího typu, H (heart) nebo M (muscle). Výsledkem kombinace obou typů podjednotek je pět izoenzymů, které se podílejí na celkové aktivitě LDH: LD-1 LD-2 LD-3 LD-4 LD-5

(H4) (H3M) (H2M2) (HM3) (M4)

Jednotlivé izoenzymy mohou být charakterizovány podle své elektroforetické pohyblivosti. Izoenzymy, které se pohybují nejrychleji směrem k anodě (LD-1, LD-2) jsou zastoupeny především v buňkách srdečního svalu a v erytrocytech. V hepatocytech a v buňkách kosterního svalstva jsou dominantní LD-4 a LD-5, které se pohybují v elektrickém poli směrem ke katodě. Elektroforetické vyšetření izoenzymů umožní lokalizovat tkáň, která je zdrojem zvýšené celkové aktivity LDH v séru. Po elektroforetickém rozdělení se prokáží jednotlivé izoenzymy reakcí, v níž katalyzují oxidaci laktátu na pyruvát. Vznikající NADH redukuje ve spřažené reakci přidaný chromogen, který vizualizuje výsledek elektroforézy. Pro elektroforézu izoenzymů LDH je použita souprava Hydragel ISO-LDH K20, SEBIA. Pracovní postup: – – – – – – – – – – – –

Umístěte Hydragel K20 aplikátorový nosič na rovnou plochu a zvedněte část s očíslovanými zuby (obr. A). Naneste 120 µl destil. vody na dolní třetinu rámečku vyznačené na nosiči aplikátoru. Z obalu vyjmětě agarosovou plotnu a rychle ji osušte filtračním papírem. Opřete plotnu okrajem o zarážku v dolní části vyznačeného rámečku – gelem k sobě. Gel ohněte a pokládejte tak, aby se voda rovnoměrně rozprostřela pod celým gelem bez tvorby vzduchových bublin. Gel musí být v rámečku zarovnán (obr. B). Snižte nosič aplikátoru očíslovanými zoubky dolů do střední polohy se západkou v horní poloze. Umístěte aplikátor na rovnou plochu s čísly jamek v pravé horní pozici (obr. C). Do jamek aplikátoru napipetujte rychle 10 µl vzorku. Vzorky je nutno napipetovat během 2 min. Odlomte ochranný rámeček zoubků aplikátoru. Umístěte aplikátor do pozice č. 5 na nosiči, čísla musí směřovat k obsluze (obr. D). Pomalu snižte nosič tak, aby se aplikátor dostal do kontaktu s povrchem gelu. Po 5 min. aplikátor uvolněte, vyjměte a vyhoďte.

124

–

Gelovou plochu vložte do migrační elektroforetické komory podle polarity vyznačené na gelu – dolní částí gelu na katodickou stranu. Při použití komory SEBIA K20 vložte plotnu do zubů můstku gelem dolů a ten pak ponořte do pufru (asi 1 cm). – Připojte dělící komoru ke zdroji proudu. PODMÍNKY DĚLENÍ Objem pufru ke každé elektrodě Celkový objem pufru Čas dělení Konstantní napětí Počáteční proud (na gel) –

SEBIA K20 150 ml 300 ml 25 min 80 V 10 ± 2 mA

Po migraci odpojte komoru a vyjměte gelovou plotnu.

Inkubace s ISO-LD substrátem − Úmístěte nosič šablon na rovný povrch a zvedněte víko. − Na spodní třetinu vyznačeného rámečku napipetujte 120 µl destil. vody. − Úmístěte plotnu gelem nahoru a okrajem proti značce STOP na spodku rámečku (obr. E). − Plotnu ohněte položte ji na napipetovanou vodu a zajistěte, aby se voda rozprostřela po celou plotnu bez vzduchových bublin, zarovnanou s tištěným rámečkem (obr. F). − Aplikační šablonu ENZ 4 ml nastavte na nosiči následujícím způsobem: (obr. G). • umístěte aplikační šablonu na ukotvující příchytky, • držte šablonu jako za úchyt a položte ji na gel. – Napipetujte 2,25 ml roztoku substrátu ISO-LDH následujícím způsobem: (obr. H) • pipetu držte ve vertikální poloze • lehce vtiskněte pipetu do otvoru na šabloně • lehce pipetujte reagencii pod šablonu bez vniknutí vzduchových bublin. – Nosič šablony přikryjte víkem (obr. CH) – Nosič se šablonou umístěte do inkubátoru při 51° C na 25 min. – Po inkubaci vyjměte nosič šablony z inkubátoru a umístěte ho na rovnou plochu. – Sejměte víko a nechte 5 min stát při pokojové teplotě. – Odstraňte roztok substrátu pipetou drženou ve vertikální poloze a lehce vtisknutou v otvoru šablony a vytáhněte přebytek reagencie. – Napipetujte 2 ml zastavovacího roztoku a ponechte 10 min při pokojové teplotě bez víka. – Odstraňte zastavovací roztok. – Vyjměte šablonu a uchopte ji za držátko a zvedněte. – Na gel na nosiči na 3 min přiložte silný filtrační papír. Přitiskněte ho celou plochou, aby dokonale přilnul k povrchu gelu. – Odstraňte filtrační papír a gel vysušte při 51° C. – Šablonu opláchněte destilovanou vodou a osušte ji savým papírem. – Vyhodnoťte gel denzitometricky při 570 nm.

125

126

VYHODNOCENÍ: Po elektroforetickém rozdělení a vizualizaci jsou jednotlivé frakce identifikovány takto: LD1 − nejrychlejší frakce se nachází v zóně albuminu, LD5 − frakce nejblíže ke katodě se vyskytuje v zóně γ-globulinu. U normálních vzorků je největší frakcí LD2, následována LD1 a LD3, LD4 a LD5 jsou menšími složkami, Normální hodnoty (průměr ± 2 SD) jednotlivých frakcí stanovené metodou HYDRAGEL ISO-LDH K20 byly stanoveny vyšetřením 200 zdravých dospělých jedinců (mužů i žen): LD1 : 16,1 – 31,5 % LD2 : 29,2 – 41,6 % LD3 : 17,0 – 26,2 % LD4 : 5,9 – 12,3 % LD5 : 3,2 – 17,3 % Interpretace: Výsledky rozdělení LD izoenzymů by neměly být interpretovány bez znalosti pacientova klinického stavu a anamnézy. Příklady abnormálního rozdělení LD izoenzymů a jejich interpretace: 1. Zvýšení LD1 a LD2 - hodnota frakce LD1 je větší než hodnota LD2 (LD1/LD2): – infarkt myokardu – stavy po chirurgických výkonech, – perniciózní anémie, hemolytická anemie, akutní srpkovitá anemie a megaloblastická anemie – Duchennova svalová dystrofie (relativní zvýšeni LD1 a LD2), 2. Zvýšení frakcí "střední zóny" - LD3 a obecně i frakci LD2 a LD4: – masivní rozpad krevních destiček - např. u plicního infarktu, – postižení lymfatického systému - infekční mononukleóza, lymfomy u lymfatické leukemie. 3. Zvýšení LD5 : – poranění, zánětlivá a degenerativní onemocnění kosterního svalstva, – poškození jater - cirhóza jater, zánět jater, městnání v játrech, – městnavé srdeční selhání.

127

Obr. 4. Elektroforéza izoenzymů laktátdehydrogenasy

128

ZÁKLADNÍ MOČE

SCREENING

PATOLOGICKÝCH

SOUČÁSTI

Klíčová slova: složení moče, sediment, hustota, osmolalita, pH, patologické součásti. Reagencie: 1. Sulkowitchovo činidlo (25 g kyseliny šťavelové, 25 g šťavelanu amonného, 50 ml koncentrované kyseliny octové v 1,5 l vody) 2. roztok kyseliny sulfosalicylové 0,8 mol/l 3. kyselina octová zředěná 1:1 4. krystalický chlorid sodný 5. roztok o-tolidinu (3,3'- dimethylbenzidinu) v ledové kyselině octové 0,01 mol/l !JED! 6. peroxid vodíku 1 mol/l 7. Heitz -Boyerovo činidlo (bezbarvý redukovaný fenolftalein v alkalickém prostředí) 8. Fehlingův roztok I (síran mědnatý 70 g/l) 9. Fehlingův roztok II (250 g hydroxidu sodného a 350 g viněnu sodnodraselného v 1 l vody) 10. Benedictovo činidlo (1 l činidla obsahuje 17,3 g síranu měďnatého, 100 g bezvodého uhličitanu sodného a 173 g citrátu sodného) 11. krystalický nitroprussid sodný 12. roztok hydroxidu sodného 2 mol/l !ŽÍRAVINA! 13. koncentrovaná kyselina octová !ŽÍRAVINA! 14. Lestradetovo činidlo (směs síranu amonného, bezvodého uhličitanu sodného a nitroprussidu sodného v poměru 200:200:1) 15. Lugolův roztok (roztok jodu 20 g/l v roztoku jodidu draselného 40 g/l) 16. l6. roztok chloridu železitého 0,4 mol/l 17. jodová tinktura (roztok jodu v ethanolu 10 g/l) 18. koncentrovaná kyselina dusičná !ŽÍRAVINA! 19. Hammarstenovo činidlo: směs 1 obj. 25 %kys. dusičné a 19 obj. 25 % kys. chlorovodíkové. 1 obj. směsi kyselin se smíchá se 4 obj. ethanolu 20. Ehrlichovo činidlo (4-dimethylaminobenzaldehyd 10 g/l v kys. chlorovodíkové 200 g/l) 21. chloroform 22. nasycený roztok octanu sodného 23. koncentrovaná kyselina sírová !ŽÍRAVINA! 24. souprava Quik Read U-ALB, Orion diagnostica

129

Močí je z organismu vylučována naprostá většina cizorodých i endogenních látek, jejichž kvalitativní a kvantitativní stanovení je důležitým ukazatelem celkového stavu pacienta a jeho metabolismu. Vzhledem k snadné dostupnosti vzorku bez větších nároků na pacienta a vzhledem k množství informací, které lze z jejich rozboru získat je analýza moči jedním ze základních vyšetření, umožňujících stanovit diagnózu, sledovat průběh onemocnění a jeho léčbu. Stejně jako u všech laboratorních vyšetření, je pro správnost výsledků kriticky důležitá kvalita vzorku. Ta může být nepříznivě ovlivněna způsobem odběru, intervalu sběru moče a dobou mezi odběrem a samotnou analýzou. Pro většinu případů se používá první ranní moč (koncentrovaná), která musí být zpracována do jedné hodiny od odběru. Pro speciální vyšetření, kde jsou větší časové nároky, je nutno moč konzervovat, neboť je vyšší riziko bakteriální, případně plísňové kontaminace. Tato kontaminace může mít za následek např. úbytek glukosy, posun pH do alkalické oblasti vlivem uvolňovaného amoniaku, nebo rozklad žlučových kyselin. Mezi základní vyšetření moči patří stanovení jejích fyzikálních a chemických vlastností a dále mikroskopické vyšetření močového sedimentu. Z fyzikálního hlediska je hodnocen objem, barva, zákal, hustota a pH moči. Základní látky, které se v moči stanovují chemickým vyšetřením, jsou glukosa, ketolátky, proteiny, hemoglobin, ionty a metabolické produkty degradace hemu. Mikroskopicky se v močovém sedimentu stanovuje množství, typ a morfologie buněk, válce a eventuálně močové konkrementy. Mezi speciální vyšetření moči patří detekce produktů vznikajících konkrétní metabolickou poruchou, například kyselina fenylpyrohroznová, nebo homocystein, případně se provádí speciální toxikologická analýza.

130

ÚLOHA 1.

Chemické vyšetření moče V současné době se k důkazu příp. semikvantitativnímu stanovení součástí moče často používají diagnostické proužky, které podle svého složení mohou být monofunkční, polyfunkční a speciální. Vyšetření moče diagnostickými proužky je jednoduché, rychlé a lze ho provádět i u lůžka pacienta. Chemické principy, na kterých je založena funkce indikačních zón proužků, vycházejí z klasické chemické analýzy moče. Na stejných principech jsou založeny í automatické analyzátory, využívané v klinickobiochemických laboratořích pro kvantitativní stanovení. 1.1 pH pH čerstvé moče se pohybuje v rozmezí 5 − 7, hodnota pH je ovlivněna potravou. Patologické hodnoty jsou především důsledkem poruch acidobazické rovnováhy organismu. Hodnota pH se zjišťuje indikátorovými papírky nebo pH-metrem. 1.2. Vápenaté ionty Vápenaté ionty jsou fyziologickou součástí moče. Zvýšený příjem vápníku potravou i porucha zpětné resorpce Ca2+ se projevuje zvýšenou koncentrací Ca2+ v moči. Zkouška je založena na reakci vápenatých iontů s oxalátovými ionty (viz Reakce biochemicky významných funkčních skupin organických sloučenin, úloha 3.2.). Pracovní postup: – K l ml moče přidejte 1 ml Sulkowitchova činidla a promíchejte. – Po 2 min vyhodnoťte vznik zákalu nebo sraženiny, použijte stupnici: + malý zákal (normální nález) ++ větší zákal a sraženina +++ značný zákal a sraženina ++++ hustý zákal a sraženina – Zapište chemickou reakci iontovou rovnicí:

131

1.3. Bílkoviny V moči zdravého člověka jsou bílkoviny přítomny jen ve stopovém množství, které nepřesahuje 0,15 g/24 hod (fyziologická proteinurie). Koncentrace vylučovaných proteinů močí je závislá na poloze těla i na tělesné námaze. Proto je nutné vyšetřovat první ranní moč, aby se zachytila noční proteinurie. Za patologickou proteinurii se považuje trvalé vylučování více než 100 mg bílkoviny do moče za 24 hod. Pří velkých ztrátách plazmatických bílkovin močí dochází k poklesu onkotického tlaku krevní plazmy, a tím i k možnému úniku tekutiny do intersticia. Při plazmocytomu, kdy dochází k atypické syntéze imunoglobulinů se objevuje v moči BenceJonesova bílkovina tzv. paraprotein. Jsou to lehké řetězce imunoglobulinů, které snadno přecházejí do moče. Pro tuto bílkovinu je charakteristický vznik zákalu již při teplotě 50 − 60° C a jeho rozpuštění při zahřívání na vyšší teplotu. Důkaz bílkovin v moči je založen na denaturačních reakcích (viz Bílkoviny I, úloha 3.2.). Zkoušky pro důkaz přítomnosti bílkovin se provádějí v přefiltrované moči. Vyšetřování mikroalbuminurie je diagnostická metoda sloužící jako klinicky významný indikátor zhoršující se funkce ledvin (viz úloha 1.3.3.). Zvláště významné je toto vyšetření u nemocných s diabetem (I. i II. typu) a nemocných s hypertenzí. Nefropatie patří k nejčastějším a nejvážnějším komplikacím diabetu. Je rovněž známo, že nemocní s mikroalbuminurií mají vyšší výskyt kardiovaskulárních příhod a časnou mortalitu. Nález mikroalbuminurie upozorňuje klinika na nezbytnost léčebného postupu, protože časná léčebná intervence může progresi nefropatie zastavit nebo zvrátit. Pokles mikroalbuminurie je navíc projevem pozitivní reakce na zvolený terapeutický postup. Mikroalbuminurie je definována jako mírný vzestup exkrece albuminu do moči, který není prokazatelný indikátorovými proužky ke stanovení proteinurie. Exkrece albuminu do moči je mírou glomerulární integrity i tubulární reabsorpce. 1.3.1. Důkaz kyselinou sulfosalicylovou (nejcitlivější a nejpoužívanější zkouška) Pracovní postup: – K 1 ml moče přidejte několik kapek roztoku kyseliny sulfosalicylové. – Vyhodnoťte vznik opalescence nebo zákalu, případně sraženiny. Podle intenzity reakce lze zkoušku hodnotit i semikvantitativně. Použijte stupnici: 0 opalescence do 0,1 g/l + průhledný zákal 0,1 − 0,25 g/1 ++ neprůhledný zákal 0,25 − 2,0 g/1 +++ vločky 0,25 − 4,0 g/1 ++++ tvarohovitá sraženina nad 4,0 g/1 1.3.2. Důkaz varem Pracovní postup: – Do zkumavky odlijte asi 2 ml moče. – Pokud je pH vyšší, okyselte moč zředěnou kyselinou octovou na pH 4 − 4,5. Pokud je pH nižší, přidejte malé množství krystalického chloridu sodného, který umožní vysrážení bílkoviny i při tomto nižším pH (viz Bílkoviny I, úloha 5.4.). – Z tohoto upraveného vzorku odeberte 1 ml. – Povařte ve vroucí vodní lázni a výsledek porovnejte s vyhodnocením v úloze 1.3.1. 132

1.3.3. Stanovení albuminu v moči - mikroalbuminurie Stanovení je založeno na měření komplexu antigenu a protilátky pomocí imunoturbidimetrie (Bílkoviny II, úloha 4.). 1.4. Krev a krevní barvivo Za patologických okolností se může v moči vyskytovat krev (hematurie) nebo hemoglobin bez přítomnosti erythrocytů (hemoglobinurie). Příčiny hematurie jsou různé, např. krvácení z močového měchýře a ledvin následkem poranění nebo onemocnění ledvin a močových cest. K hemoglobinurii dochází také při vysoké koncentraci hemoglobinu v plazmě, např. při vyčerpané vazebné kapacitě haptoglobinu nebo u těžkých hemolytických anemií. Vzácněji se může v moči vyskytovat myoglobin (myoglobinurie) např. u těžkých popálenin, těsně po infarktu myokardu nebo při zhmoždění svalů při sportu. Rozlišení hematurie a hemoglobinurie umožní mikroskopické vyšetření močového sedimentu. Důkaz hemoglobinu se provádí vždy, je-li v moči přítomna bílkovina. V případě pozitivního testu na krevní barvivo je nutné provést mikroskopické vyšetření močového sedimentu. Zkoušky používané k důkazu krve a krevního barviva jsou založeny na peroxidasové a pseudoperoxidasové reakci (viz Biologické oxidace II., úloha 4.). Zkoušky jsou pozitivní i v přítomnosti leukocytů v moči. Jejich peroxidasovou aktivitu lze odstranit povařením moče. 1.4.1. Důkaz Heitz - Boyerovým činidlem (velmi citlivá zkouška) Pracovní postup: – K 1 ml moče přidejte 1 ml Heitz-Boyerova činidla a promíchejte. – Opatrně po stěně zkumavky přidávejte "pasteurkou" roztok peroxidu vodíku (asi 0,5 ml). – V případě pozitivní reakce vznikne na styčné ploše červenofialový prstenec. 1.4.2. Důkaz o-tolidinem Pracovní postup: – K 1 ml moče přidejte 4 kapky roztoku o-tolidinu a 0,5 ml roztoku peroxidu vodíku. – V případě pozitivní reakce vznikne modré až modrozelené zbarvení. 1.5. Sacharidy Normální moč obsahuje pouze stopová množství sacharidů. Nejčastěji se vyšetřuje přítomnost glukosy, méně často fruktosy, galaktosy, laktosy, pentos apod. Fyziologická koncentrace glukosy v moči může být přechodně zvýšená po požití velkého množství stravy bohaté na sacharidy, jestliže její koncentrace v krvi překročí reabsorpční schopnost ledvinových tubulů (alimentární glykosurie). Za patologických okolností se glukosa vylučuje ve zvýšeném množství do moče u diabetické glykosurie, dále v případech, kdy je ledvinový práh pro glukosu snížen pod 9 mmol/l (renální glykosurie) např. u těhotných žen a u onemocnění ledvin. U renální glykosurie není zvýšená koncentrace glukosy v krvi. Glykosurie se také objevuje u vystupňovaných stresových stavů v důsledku působení adrenalinu a glukokortikoidů na glykemii.

133

Glukosa v moči se dokazuje bud nespecifickými zkouškami založenými na redukčních vlastnostech glukosy nebo specifickou glukosoxidasovou reakcí (semikvantitativní stanovení diagnostickými proužky a kvantitativní stanovení (viz Sacharidy II, úloha 1.). Při důkazu glukosy redukčními zkouškami nesmí moč obsahovat bílkoviny, které se musí odstranit vysrážením a filtrací (deproteinovaná moč). Falešně pozitivní reakci způsobuje např. přítomnost kyseliny močové, homogentisové nebo askorbové v moči při nedodržení reakčních podmínek. 1.5.1. Důkaz Fehlingovou zkouškou (viz Sacharidy I, úloha 2.1.1.) Pracovní postup: – Ve zkumavce smíchejte Fehlingův roztok I a II v poměru 1:1, promíchejte, celkový objem činidla asi 1 ml. – Ke vzniklému modrému roztoku přidejte 1 ml deproteinované moče, dobře promíchejte a zahřívejte ve vroucí vodní lázni. – V pozitivním případě se po krátkém povaření vyloučí červená sraženina oxidu měďného. 1.5.2. Důkaz Benedictovou zkouškou (viz Sacharidy I, úloha 2.1.2.) Pracovní postup: – K 1 ml Benedictova činidla přidejte asi 3 kapky deproteinované moče a dobře promíchejte. – Obsah zkumavky zahřívejte ve vroucí vodní lázni asi 2 min. – V pozitivním případě se vyloučí oxid měďný jako červená sraženina. Poznámka: Oxido-redukční reakce mohou být falešně pozitivní, užívá-li pacient některé léky – např. nalidixovou kyselinu (Nalidixin, NegGram) používanou při infekci močových cest, probenecid při terapii dny a cefalosporinová antibiotika. Přítomnost kys. askorbové (vitamin C) způsobuje pozitivitu oxidoredukčních testů. Fehlingova zkouška (zbarvení dle množství kyseliny askorbové) je pozitivní již za studena. S Benedictovým činidlem vytváří za studena bílou sraženinu, která do 5 min. přechází přes žlutou barvu na oranžovou, nebo při slabém zahřátí, kdežto v případě Nylanderova činidla za studena nereaguje a po 2 min. povaření přechází ve slabě černě zabarvený čirý roztok. 1.6. Ketolátky Ke skupině ketonových látek, dokazovaných v moči, patří kyselina acetoctová, z ní vznikající kyselina 3-hydroxymáselná a aceton. Vzestup koncentrace ketolátek v krvi je provázen jejich vylučováním močí (ketonurie). Průkaz ketolátek v moči má význam hlavně pro včasné rozpoznání metabolické dekompenzace diabetiků (diabetická ketoacidosa), při hladovění, po těžké námaze a po požití většího množství tuků. Důkaz kyseliny acetoctové a acetonu je založen na vzniku barevného komplexu reakcí s nitroprussidem sodným v alkalickém prostředí.

134

1.6.1. Důkaz Legalovou zkouškou Pracovní postup: – Několik krystalků nitroprussidu sodného rozpusťte v 1 ml destilované vody (zbytek uchovat pro úlohu 1.9.). – K 1 ml moče přidejte 2 kapky připraveného roztoku nitroprussidu sodného a 1 ml roztoku hydroxidu sodného. – Červeně zbarvený roztok rozdělte do dvou zkumavek. – Do jedné zkumavky přidejte několik kapek koncentrované kyseliny octové. – V přítomnosti ketolátek se zbarvení prohloubí do červenofialova. – V negativním případě se roztok odbarví (původní červené zbarvení roztoku způsobuje kreatinin vždy přítomný v moči). 1.6.2. Důkaz Lestradetovým činidlem Pracovní postup: – Na porcelánovou odpařovací misku položte kolečko filtračního papíru a dejte na něj malé množství Lestradetova činidla. – "Pasteurkou" kápněte malé množství moče na filtrační papír vedle činidla. Asi po 5 min se na styku vzlínající moče s činidlem objeví fialové zbarvení, které je důkazem ketolátek. 1.6.3. Důkaz acetonu jodoformovou reakcí Pracovní postup: – Ve zkumavce smíchejte asi 0,5 ml moče s 1 ml roztoku hydroxidu sodného, přidejte přibližně 3 ml Lugolova roztoku. – V přítomnosti acetonu se roztok zakalí vyloučeným jodoformem. 1.6.4. Důkaz kyseliny acetoctové Pracovní postup: – K 1 ml moče přidejte několik kapek roztoku chloridu železitého a moč zfiltrujte. – V přítomnosti kyseliny acetoctové má filtrát tmavě červenou barvu. – V případě pochybnosti povařte nový vzorek moče. Kyselina acetoctová dekarboxyluje, vznikající aceton vytěká a zkouška je negativní. 1.7. Žlučová barviva Do skupiny žlučových barviv, která se dokazují v moči, patří bilirubin, urobilinogen, sterkobilinogen, jejich oxidační produkty urobilin a sterkobilin (viz Tetrapyrroly.). Bilirubin se v játrech konjuguje s kyselinou glukuronovou a se žlučí odchází do duodena. Za patologických stavů např. při obstrukci žlučových cest (obstrukční ikterus) nebo při těžkém poškození jaterního parenchymu (hepatocelulární ikterus), stoupne koncentrace bilirubinu nad ledvinový práh (30 − 34 µmol/l a konjugovaný bilirubin se vylučuje do moče (bilirubinurie). U hemolytických žloutenek se v krvi zvyšuje koncentrace nekonjugovaného bilirubinu, který ale do moče neproniká.

135

Urobilinogen a sterkobilinogen (tzv. Ehrlich pozitivní látky) se v moči vyskytují jen v malém množství. Při poškození jaterního parenchymu, (infekční žloutenka, cirhosa) nebo při nadměrné tvorbě bilirubinu (hemolytická žloutenka, hemolytická anemie) se jejich koncentrace v moči zvyšuje. 1.7.1. Důkaz konjugovaného bílirubinu Podstatou používaných reakci je oxidace bilirubinmono- a diglukuronátů na zelené bíliverdinglukuronáty. Moč je třeba vyšetřit co nejdříve, aby se předešlo samovolné oxidaci bilirubinu. 1.7.1.1. Důkaz Rosinovou zkouškou - roztokem jodu Pracovní postup: – 1 ml moče převrstvěte 1 ml jodové tinktury. – V pozitivním případě se na styčné ploše vytvoří zelený prstenec biliverdinu. 1.7.1.2. Důkaz Gmelinovou zkouškou - kyselinou dusičnou Pracovní postup: – 1 ml moče převrstvěte 1 ml koncentrované kyseliny dusičné (dávkovač). – V pozitivním případě se na styčné ploše vytvoří zelený prstenec biliverdinu. 1.7.1.3. Důkaz Hammarstenovou zkouškou (varianta Gmelinovy zkoušky) Pracovní postup: 1 obj. Hammarstenova činidla se smíchá se 4 obj. ethanolu a přidá se kapka moči k přibližně 2 ml činidla. – V přítomnosti bilirubinu vznikne zelené zbarvení biliverdinu. – Přidá-li se postupně více kyseliny, zabarvení směsi se mění přes celou stupnici Gmelinovy reakce, vzhledem k progresivní oxidaci bilirubinu přes stadium zeleně, biliverdin, modř – bilicyanin a nakonec červený pigment – bilipurin, který se mění na žluť, která je choletelin.

–

Hammarstenova zkouška je vhodná pro testování přítomnosti bilirubinu v moči, která obsahuje malé množství bilirubinu nebo velká množství urobilinu a indoxylu 1.7.2. Důkaz urobilinogenu a sterkobilinogenu Urobilinogen a sterkobilinogen tvoří za studena v silně kyselém prostředí s Ehrlichovým činidlem červeně zbarvené kondenzační produkty. Reakce je nespecifická. Porfobilinogen poskytuje barevné kondenzační produkty, které nejdou vytřepat do chloroformu. Indol a indolové melanogeny tvoří s Ehrlichovým činidlem červenofialové zbarvení, které vymizí po protřepání s nasyceným roztokem octanu sodného. V přítomnosti sulfonamidů vzniká žluté až oranžové zbarvení, (viz Reakce biochemicky významných funkčních skupin organických sloučenin, úloha 4.). Urobilinogen a sterkobilinogen reagují s Ehrlichovým činidlem za studena, proto se vyšetřují v čerstvé, vychladlé moči. V čerstvě vymočené moči vznikne červené zbarvení vždy (pozitivitu způsobuje fyziologické množství barviv). Pokud zbarvení v tomto případě

136

nevznikne, jedná se o snížení koncentrace nebo úplné chybění urobilinogenu (např. u obstrukčního ikteru). Hodnocení nálezu žlučových barviv v moči hemolytický ikterus

hepatocelulární ikterus

obstrukční ikterus

negativní

negativní

+

+

negativní

+

+

negativní

žlučová barviva normální nález konjugovaný bilirubin urobilinogen Pracovní postup: – – – – – – – – –

Ke 3 ml chladné čerstvé moče přidejte 0,5 ml Ehrlichova činidla. V přítomností urobilinogenu a sterkobilinogenu se do 5 min vytvoří červené zbarvení. Polovinu roztoku odlijte do druhé zkumavky. Do jedné zkumavky přidejte l ml chloroformu a protřepejte. Zbarví-1i se chloroformová vrstva červeně, jsou přítomny urobilinogen a sterkobilinogen. Je-li červeně zbarvená vodná vrstva, jedná se o falešnou pozitivitu Ehrlichovy zkoušky (porfobilinogen). Do druhé zkumavky přidejte 1 ml nasyceného roztoku octanu sodného. Pokud zbarvení vymizí, jedná se opět o falešnou pozitivitu Ehrlichovy zkoušky (indol a jeho deriváty). V další zkumavce smíchejte 7 ml čerstvě vymočené moče a 5 kapek Ehrlichova činidla. Pozorujte zda vznikne červené zbarvení.

1.8. Porfyriny Zvýšené vylučování porfyrinů (tetrapyrrolových prekurzorů hemu) močí - porfyrinurie, se vyskytuje při vrozených vadách biosyntézy hemu – porfyriích, ale také u jaterní cirhózy, u pacientů s chronickou infekcí virem hepatitidy C (HCV) s abusem alkoholu a při některých otravách (olovo, hexachlorbenzen, otravách léky - barbituráty, sulfonamidy, chloramfenikol atd.). Moč obsahující porfyriny na světle tmavne a dává pozitivní Ehrlichovu reakci (porfobilinogen, viz úloha 1.7.2.) Důkaz porfyrinů využívá jejich červenou fluorescenci v UV světle (viz Tetrapyrroly, úloha 2.1.). Určité typy porfyrií (akutní jaterní porfyrie) a otravy (např. aktutní otrava Pb) jsou provázeny vylučováním netetrapyrrolových prekurzorů – 5-aminolevulátu (∆-aminolevulátu) a porfobilinogenu. 5-aminolevulát se stanovuje HPLC a porfobilinogen v eluátu po absorpční chromatografií na anionickém iontoměniči fotometricky Ehrlichovým činidlem.. Pracovní postup: – K 1 ml moče přidejte pipetkou 1 kapku koncentrované kyseliny sírové a moč pozorujte v UV světle. – V přítomnosti porfyrinů se objeví červená fluorescence.

137

1.9. Indolové melanogeny Indolové melanogeny vznikají jako meziprodukty při biosyntéze melaninu z tyrosinu. Jejich vylučování močí ve zvýšeném množství svědčí pro přítomnost nádoru pigmentových buněk (maligní melanom). Moč obsahující melanogeny na vzduchu tmavne, protože jejich oxidací vzniká černý pigment tzv. močový melanin. Indolové melanogeny se prokazují Thormählenovou zkouškou, která se provádí stejně jako zkouška Legalova pro důkaz ketolátek, ale po přidání kyseliny octové se objeví modré zbarvení (viz úloha 1.6.1.). Pracovní postup: – K 1 ml moče přidejte 2 kapky připraveného roztoku nitroprussidu sodného z úlohy 1.6.1., 1 ml roztoku hydroxidu sodného a několik kapek koncentrované kyseliny octové. – V pozitivním případě se objeví modré až modrozelené zbarvení. 1.10. Kyselina fenylpyrohroznová Při dědičné metabolické poruše funkce enzymu fenylalaninhydroxylasy je blokována přeměna fenylalaninu na tyrosin. Koncentrace fenylalaninu a jeho metabolitů (fenylpyruvát, fenyllaktát, fenylacetát) v krvi se zvyšuje a dochází k jejich vylučování močí (fenylketonurie). Důkaz je založen na reakci kyseliny fenylpyrohroznové s chloridem železitým za vzniku zeleně zbarveného komplexu. Pracovní postup: – K 1 ml moče přidejte 1 kapku roztoku chloridu železitého. – V pozitivním případě se během několika minut objeví tmavě zelené zbarvení vzniklého komplexu. VYHODNOCENÍ: vzorek č. pH vápenaté ionty bílkoviny krev glukosa aceton kyselina acetoctová bilirubin urobilinogen porfyriny melanogeny kys.fenylpyrohroznová

138

Poznámky:

139

XENOBIOCHEMIE

Klíčová slova: cizorodé látky, smrtelná dávka toxické látky, alkoholdehydrogenasa, biotransformace cizorodých látek, dusičnany, dusitany, redukce, oxidace. nitrosaminy. Reagencie: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24.

digitální Alkohol tester, JETT 6 roztok amobarbitalu v ethanolu 2 g/l roztok fenobarbitalu v ethanolu 2 g/l roztok pentobarbitalu v ethanolu 2 g/l kyselý extrakt vzorku moče mobilní fáze pro chromatografii kyselých látek (25 ml chloroformu, 25 ml acetonu, 2 ml amoniaku) roztok síranu rtuťnatého v kyselině sirové (k suspensi 5 g žlutého oxidu rtuťnatého ve 100 ml vody postupně přidávat 20 ml koncentrované kyseliny sírové, po ochlazení doplnit vodou na 250 ml) !JED! roztok chlorpromazinu v ethanolu 2 g/l roztok levopromazinu v ethanolu 2 g/l roztok prochlorperazinu v ethanolu 2 g/1 roztok thioridazinu v ethanolu 2 g/l roztok chlorprothixenu v ethanolu 2 g/l roztok kodeinu v ethanolu 2 g/l bazický extrakt vzorku moče mobilní fáze pro chromatografii bazických látek (36 ml ethylacetátu, 2 ml ethanolu, 2 ml amoniaku) směs ethanol: koncentrovaná kyselina sírová 1:1 !ŽÍRAVINA! tři vzorky vody roztok kyseliny sulfanilové 20 mmol/l v roztoku hydrogensíranu draselného 0;2 mol/l činidlo: roztok N-(1-naftyl)-ethylendiaminhydrochloridu 0.04 g/100 ml roztok hydroxidu sodného 300 g/l !ŽÍRAVINA! roztok salicylanu sodného 10 g/: zředěná kyselina sírová 1:10 !ŽÍRAVINA! vzorek moče na identifikaci drog testovací proužky DrugControl® pro stanovení kanabinoidů a amfetaminu v moči.

140

Xenobiochemie se zabývá metabolismem cizorodých látek. V prostředí, ve kterém žijeme, přicházíme do neustálého kontaktu s množstvím látek, které mohou na náš organismus působit škodlivě a které mohou být příčinou vzniku některých onemocnění, nebo závažných intoxikací. Organismus je pro tyto případy vybaven enzymatickým aparátem, který umožňuje deaktivaci, ale někdy i aktivaci a vyloučení těchto látek. Metabolismus cizorodých látek se skládá ze dvou fází, I. biotransformační, jejímž cílem je specifické snížení negativního účinku daného xenobiotika a II. konjugační, kdy je transformovaná cizorodá látka konjugována s endogenním substrátem a v této formě vyloučena močí nebo stolicí v závislosti na polaritě molekuly. V naprosté většině případů jsou za metabolismus xenobiotik v I. fázi zodpovědné enzymy z rodiny cytochromu P450. Aktivita těchto enzymů je nejvyšší v játrech a je pozitivně ovlivňována (indukována) koncentrací cizorodých látek. Znalost mechanismů detoxikace cizorodých látek je velmi důležitá zejména pro farmakologii, toxikologii, ale i terapii některých chorob, např. akutních porfyrií.

141

ÚLOHA 1.

Důkaz ethanolu ve vydechovaném vzduchu Ethanol je řazen mezi cizorodé látky, ale jeho požívání je natolik rozšířené, že se, de facto, stal v současné společnosti součástí výživy jako poživatina se všemi z toho vyplývajícími důsledky. Hlavní farmaceutický význam ethanolu je dán jeho použitím jako rozpouštědla velkého počtu organických látek, z přímého využití lze zmínit používání 60% roztoku ethanolu k desinfekčním a antiseptickým účelům. Požitý ethanol se snadno resorbuje již v žaludku, 2 – 10 % se ho vylučuje plícemi a ledvinami, zbytek je přeměněn v játrech. Největší podíl ethanolu je metabolizován v cytoplazmě jaterních buněk dvoustupňovou dehydrogenací, katalyzovanou alkoholdehydrogenasou. K orientačnímu průkazu ethanolu ve vydechovaném vzduchu jsou používány detekční trubičky obsahující žlutý dichroman draselný v kyselině sírové. Podle intenzity zeleného zabarvení vyredukované chromité soli, lze odhadnout koncentraci alkoholu v krvi (viz Reakce funkčních skupin biochemicky významných organických sloučenin, úloha l.). Na stejném principu je založeno stanovení ethanolu Widmarkovou metodou, která však není specifická (stanoví se i všechny ostatní těkavé látky v krvi, oxidovatelné za daných podmínek). Pro specifické stanovení ethanolu v krvi se využívá plynová chromatografie nebo oxidace alkoholu katalyzovaná alkoholdehydrogenasou. Při orientačním průkazu ethanolu se v současné doby detekční trubičky nahrazují spektrofotometry. Absorpce infračerveného záření v charakteristické oblasti parami ethanolu specificky udává jeho množství ve vydechovaném vzduchu. Z tohoto množství se vypočítá koncentrace ethanolu v krvi v g/l (‰). Značení piva Způsob značení piva určuje vyhláška č. 335/1997 Sb.. Uvádí se název druhu a skupiny (např. pivo ležák), obsah alkoholu v %, zda jde o světlé či tmavé pivo a některé další údaje. Kromě toho se nepovinně uvádí údaj o extraktu obsahu původní mladiny. Vyhlášce neodpovídá značení piva ve stupních (např. 10° nebo 12° pivo) a v současnosti je nezákonné. Místo stupňů je nutno správně uvádět tzv. extrakt původní mladiny (EPM) a to v hmotnostních procentech (např. 12% pivo − nelze plést s procenty alkoholu, která se u běžných piv pohybují mezi 4 − 5 %). 1.1. Detekce ethanolu ve vydechovaném vzduchu Pracovní postup: – Bezprostředně po požití 1 piva proveďte dechovou zkoušku pomocí alkohol testeru. – Zkoušku opakujte po 30 a 60 min. – Výsledky zapište do tabulky 1., k vyhodnocení použijte znamének + a −.

142

Tabulka 1 čas (min)

0

30

60

pivo ..........% koncentrace EtOH (g/l) 1.2. Výpočty koncentrace alkoholu v krvi Koncentraci ethanolu v krvi lze vypočítat podle vztahu: množství požitého čistého alkoholu (g) c (g/l) =  0,7 ⋅ tělesná hmotnost (kg) Koncentrace ethanolu v krvi klesá zpravidla průměrně o 0.25 g/l za hodinu. V rychlosti detoxikace hraje roli mnoho faktorů, např. věk, pohlaví, fyzická kondice, stav nalačno, tolerance atd. Obsah ethanolu v běžných nápojích: pivo 10% pivo 11% pivo 12% víno lihoviny

30 g/1 35 g/l 40 g/l 120 g/l 400 g/l

Příklady: a) Vypočítejte, jaká bude koncentrace ethanolu v krví vyšetřované osoby ihned po požití 1 piva a dále po 30 a 60 min. Výsledky zapište do tabulky 1. b) Vypočítejte, za kolik hodin klesne koncentrace alkoholu v krvi na hodnotu 0,1 g/l, jestliže muž o hmotnosti 80 kg vypil v krátké době šest 12% piv a dvě malé odlivky rumu (malá odlivka = 0,02 1): (15,5 hod) c) Vypočítejte, jaký objem lihoviny by teoreticky stačil k dosažení smrtelné koncentrace ethanolu v krvi (4 g/1) pro osobu o tělesné hmotnosti 70 kg: (490 ml) Poznámky:

143

ÚLOHA 2.

Identifikace cizorodých látek (xenobiotik) a jejich metabolitů v moči Cizorodé látky, které se dostávají do lidského organismu (potravinářská barviva a stabilizační látky, léčiva) jsou vylučovány ledvinami buď v původní formě, nebo transformované na metabolity. Hlavním orgánem, v němž se uskutečňuje metabolismus cizorodých látek, jsou játra. Xenobiotika se dokazují ve vzorcích nativní moči nebo podle povahy analyzovaných látek v jejím kyselém či bazickém extraktu (extrakci často předchází hydrolýza případných konjugátů). Pro důkaz jednotlivých látek se využívá např. tenkovrstevná chromatografie (TLC), která je rychlá a ekonomicky výhodná (viz Aminokyseliny, úloha 1.1. V současné době k těmto klasickým metodám přistupuje i využití automatických přístrojů. 2.1. Identifikace kyselých látek (amobarbital, fenobarbital, pentobarbital) Barbituráty se řadí podle svého účinku mezi hypnotika a sedativa. Ve směsi s dalšími léčivy se používají jako analgetika a antiepileptika. Pracovní postup: – Na silufolové desce lehce vyznačte obyčejnou tužkou start {asi 2 cm od spodního okraje desky) a čtyři body, na které opatrně naneste mikropipetkami standardní roztoky barbiturátů a ethanolový roztok kyselého extraktu moče (nepoškodit tenkou vrstvu!). – Desku vložte do chromatografické vany s připravenou mobilní fází pro chromatografii kyselých látek. Start musí být nad hladinou kapaliny. – Vanu dobře přikryjte skleněným víkem. – Když čelo rozpouštědla dosáhne do vzdálenosti 1 − 2 cm od horního okraje desky, chromatogram vyndejte z vany. – Čelo rozpouštědla označte tužkou a chromatogram nechte na vzduchu uschnout. – Suchý chromatogram opatrně detekujte postřikem roztokem síranu rtuťnatého (v digestoři). Barbituráty vytvoří bílé skvrny, vystupující nad povrch tenké vrstvy. – Pomocí vypočítaných hodnot Rf standardů i vzorku identifikujte jednotlivé barbituráty. – Výsledky zapište do tabulky 2. 2.2. Identifikace bazických látek (chlorpromazin, levopromazin, prochlorperazin, thioridazin, chlorprothixen, kodein) Prvních pět látek jsou léčiva patřící do skupiny neuroleptik (psychofarmaka). Kodein je methylderivátem alkaloidu morfinu. Užívá se jako antitusikum a jako součást velmi účinných analgetik. Není většinou návykový, ale je zneužíván k přípravě heroinu. Ten již nemá jakékoliv terapeutické použití, zato je však silně návykový.

144

Pracovní postup: – Analogickým postupem jako v úloze 2., proveďte chromatografii standardů a vzorku bazického extraktu moče stejného čísla jako v úloze 2.1. – K vyvíjení chromatogramu použijte mobilní fázi pro bazické látky. – Usušený chromatogram rovnoměrně postříkejte směsí ethanolu a kyseliny sírové. Ihned po detekci se objeví barevné skvrny. – Podle hodnot Rf a zbarvení jednotlivých skvrn identifikujte léčiva ve vzorku. – Výsledky zapište do tabulky 2. 2.3 Stanovení kanabinoidů a amfetaminu v moči pomocí testovacích proužků DrugControl© 2.3.1. Kanabinoidy Zdrojem těchto látek, které patři mezi halucinogeny, jsou listy a výhonky (marihuana, hašiš − pryskyřice) některých odrůd konopí setého (Cannabis sativa). Účinnou látkou je především ∆9-3,4-trans-tetrahydrokanabinol (∆9-THC ).

∆9-3,4-trans-tetrahydrokanabinol Při kouření se rychle absorbuje z plic do krve, ze žaludku při orálním užívání se absorbuje do krve pomaleji. Ovlivňuje CNS (včetně narušeni motorické koordinace) a kardiovaskulární systém (zvýšení krevního tlaku a srdečního tepu). Droga se eliminuje přibližně z 80 % během prvních pěti dnů, největší podíl stolicí, zbytek močí. Metabolity mohou být v moči detekovány i desátý den po příležitostném užití, při chronickém užíváni až do 36 dní. 2.3.2. Amfetamin Patři do skupiny látek, nazývaných sympatomimetika, která stimulují adrenergní reakce. Přirozeným sympatomimetikem je adrenalin a jeho demethylovaný prekursor noradrenalin. Efedrin, alkaloid obsažený v rostlinách řádu Efedra, který také patří k těmto látkám, má navíc výrazně dráždivé účinky na CNS, právě tak jako z něj synteticky vyráběný amfetamin a 2-Nmethylamfetamin (Pervitin), který je návykový.

145

Efedrin

Amfetamin

Vylučování moči začíná během 20 min po aplikaci, v průběhu 24 hod se vyloučí 30 % amfetaminu v původní podobě. Při občasném užití jednotlivých dávek (asi 10 mg) je jeho koncentrace v moči během prvních 24 hod 0,5 - 4.0 mg/l, při chronickém užívání se koncentrace v moči pohybuje mezi 25 – 300 mg/l. Pracovní postup: – Vytemperovanou obálku s testovacím proužkem otevřete až těsně před použitím. – Proužek ponořte označeným koncem do moči. Hladina nesmí přesahovat označenou linku. – Proužek nechejte nasáknout po dobu asi 30 vteřin. – Položte proužek na vodorovnou podložku a výsledek odečtěte po 5 − 10 minutách. Tabulka 2. vzorek moče č.: kyselé látky

bazické látky

kanabinoidy

amfetamin

146

ÚLOHA 3.

Stanovení koncentrace dusitanů a dusičnanů ve vodě V životním prostředí dochází k hromadění dusičnanů při intenzivní zemědělské produkci (umělá dusíková hnojiva). Dusičnany jsou většinou redukovány na dusitany mikroorganismy přítomnými ve vodě, půdě i ústní dutině. Dusičnany, které nejsou v organismu přeměněny bakteriální flórou na dusitany, se vstřebávají, nepronikají však do buněk a jsou vylučovány močí. Dusitany se používají ve velké míře i při výrobě uzenin. Jsou pro lidský organismus toxické. Jednou z příčin jejich toxicity je oxidace Fe2+ hemoglobinu na Fe3+ za vzniku nefunkčního hemiglobinu (viz Tetrapyrroly): Při chronickém přívodu dusitanů spočívá riziko v tvorbě nitrosaminů, které mají především účinky hepatotoxické a již ve velmi malých dávkách jsou mutagenní a karcinogenní. Nejvyšší přípustná koncentrace podle státní normy je pro dusičnany 50 mg/l (pro kojence do 6 měsíců pouze 15 mg/l) a pro dusitany pouze 0,1 mg/l. 3.1. Stanovení dusitanů Podstatou stanoveni dusitanů ve vodě je diazotace kyseliny sulfanilové přítomnými dusitany a následující kopulace vzniklé diazoniové soli s N-(1naftyl)-ethylendiaminem za vzniku červeného azobarviva. Intenzita zbarvení, stanovovaná fotometricky při 550 nm, je přímo úměrná koncentraci dusitanů. Analogický test se využívá pro nepřímý průkaz bakteriurie. Čím více bakterií je v moči, tím více dusitanů vznikne redukcí dusičnanů přítomných v moči. Pro správnost vyšetření je třeba zajistit dostatečný přívod dusičnanů potravou a dostatečně dlouhé setrvání moče v močovém měchýři (4 − 6 hod). Pracovní postup: – Koncentraci dusitanů stanovte v běžné pitné vodě z vodovodní sítě, v balené pitné vodě a ve vodě studniční. – Do čtyř zkumavek napipetujte reagencie podle tabulky 3, jako slepý vzorek použijte destilovanou vodu. – Potom napipetujte do každé zkumavky 2 ml destilované vody (konečný objem 5 ml) a změřte absorbance vzorků pří 550 nm proti slepému vzorku. – Naměřené hodnoty absorbancí zapište do tabulky 5. – Z kalibračního grafu odečtěte odpovídající hmotnostní koncentraci dusitanů v jednotlivých vzorcích vody. – Výsledky zapište do tabulky 5.

147

Tabulka 3. reagencie (ml) vzorek vody kyselina sulfanilová činidlo

pitná voda balená voda studniční voda slepý vzorek 2,5 2,5 2,5 2,5 0,25 0,2 5 0.25 0.25 promíchat, nechat stát 10 min 0,25 0,25 0,25 0,25 promíchat, nechat stát 20 min

Poznámky:

148

3.2 Stanovení dusičnanů Toto stanovení je založeno na reakci dusičnanů se salicylanem sodným v prostředí koncentrované kyseliny sírové. Po alkalizaci vzniká žlutě zbarvená sůl kyseliny nitrosalicylové, která je vhodná k fotometrování. Pracovní postup: – Koncentraci dusičnanů stanovte v běžné pitné vodě z vodovodní sítě, v balené pitné vodě a ve vodě studniční, jako slepý vzorek použijte destilovanou vodu. – Do čtyř čistých odpařovacích misek napipetujte reagencie podle tabulky 4. Tabulka 4 reagencie (ml) vzorek vody hydroxid sodný salicylan sodný

pitná voda 1,0 0,02 0,1

balená voda 1,0 0,02 0,1

studniční voda 1,0 0,02 0,1

slepý vzorek 1,0 0,02 0,1

– Obsah na miskách opatrně promíchejte a odpařte na vroucí vodní lázni do sucha. – K horkému odparku na každé misce opatrně přidejte 0,2 ml kyseliny sírové zředěné 1:10 (celý odparek musí být zvlhčen kyselinou) a nechte na vodní lázni působit 2 – 3 min. – Sundejte odpařovací misky z vodní lázně a po ochlazení vzorku opatrné přidejte do každé misky 2 ml destilované vody a promíchejte. – Přidejte 0,5 ml roztoku hydroxidu sodného. – Obsah na každé misce znovu opatrně promíchejte, přelijte do kalibrované zkumavky, misku 2x vypláchněte malým množstvím destilované vody a spojte s obsahem kalibrované zkumavky. – Objem vzorků ve zkumavkách doplňte destilovanou vodou na 5 ml a promíchejte. – Změřte absorbanci vzorků při 410 nm proti slepému vzorku. – Naměřené hodnoty zapište do tabulky 5. VYHODNOCENÍ: Tabulka 5. pitná voda

balená voda

studniční voda

absorbance NO −2 mg NO −2 /l absorbance NO 3− mg NO 3− /l vyhodnocení

149

POUŽITÁ LITERATURA Biochemistry Course. Laboratory Notes. St.Thomas's Hospital Medical School, London. Edition 12, 1977. Bubnová, E. a kol.: Praktická cvičení z lékařské chemie a biochemie. Karolinum, Praha 2002. Couch, F. J, Weber, B. L: Breast cancer; in Vogelstein B, Kinzler KW (eds). The genetic basis of human cancer. New York, McGraw-Hill 1995, pp 537-563. Dane, E., Wille, F.: Kleines chemisches Praktikum. Verlag Chemie, GmbH, Weinheim 1961. Doležalová, V a kol.: Principy biochemických vyšetřovacích metod, I. a II. část, Institut pro další vzdělávání pracovníků ve zdravotnictví v Brně, 1995. Doubrava, J., Koštíř, J., Pospíšil, J.: Základy biochemie, SPN Praha 1984. Dzúrik, R. a kol.: Štandardná klinickobiochemická diagnostika. Osveta, Martin 1996. Gräser, H.: Biochemisches praktikum. VEB Deutcher Verlag der Wissenschaften Berlin 1971. Henning, H.-G., Jugelt, W., Sauer, G.:Praktische Chemie. Ein Studentenbuch für Biowissenschaftler. VEB Verlag Volk und Gesundheit, Berlin 1991. Hiršová, D.: Chemické názvosloví. Karolinum 1999 Kalous, V., Pavlíček, Z.: Biofyzikální chemie, SNTL Praha 1980. Kaplan, L. A., Pesce, A. J., Kazmierczak, S. C.: Clinical Chemistry, 4th edition, 2003 Kraml, J. a kol.: Návody k praktickým cvičením z lékařské chemie a biochemie. Karolinum, Praha 2000. Křemen, J., Pohlreich, P., Stříbrná, J.: Techniky molekulární biologie a jejich využití v medicíně. Karolinum, Praha 1998. Kušnír, J.: Návody k praktickým úlohám z biochemie. Univerzita P J. Šafárika, Košice 1994. Masopust, J., Průša, R.: Patobiochemie metabolických drah. UK, 2. LF Praha 1999 Melichar, B.: Chemická léčiva. Avicenum Praha 1972. Musil, J.: Molekulové základy klinické biochemie, Grada Avicenum Praha 1994. Musil, J. a kol.: Lékařská chemie a biochemie. Praktikum. Avicenum, Praha 1991. Ohkawa, H., Ohishi, N., Yagi, K.: Assay for Lipid Peroxides in Animal Tissues by Thiobarbituric Acid Reaction. Anal. Biochem. 95, 351-358, 1979. Peprla, J., Kuklínek, P.: Přehled laboratorních vyšetření. Lachema Brno 1995. Prokeš, J.: Úvod do toxikologie. Karolinum, Praha 1991. Racek, J. a kol.: Klinická biochemie. Karolinum Praha 1999. Rácz, O. a kol.: Glykohemoglobín, glykácia bielkovin a diabetes mellitus. Osveta, Martin 1989. Soška, V.: Volné kyslíkové radikály a jejich scavangery. Klin. Biochem. Metab. 1 (22), 57-61, 1993. Štípek, S. a kol.: The Effect of Quinolinate on Rat Brain Lipid Peroxidation is Dependent on Iron. Neurochem. Int. 30, 233-237, 1997. Štípek, S. a kol.: Xanthine oxidoreductase. Sborník lékařský, 95, 289-295, 1994. 150

Táborská, E. a kol.: Návody ke cvičením z biochemie. Masarykova universita, Brno 1993. Vodrážka, Z.: Fyzikální chemie pro biologické vědy. SNTL Praha 1982. VopršalovÁ, M., Žáčková, P.: Základy toxikologie pro farmaceuty. Karolinum, Praha 1996. Zikán, M., Jančárková, N., Pohlreich, P., Matouš, B., Kleibl, Z., Stříbrná, J., Živný, J.: Hereditární dispozice ke vzniku karcinomu prsu a ovaria. Čas. Lék. Česk. 2004;143(1):26-30. Zima, T.: Přehled laboratorních vyšetření, VFN 2002.

151