Glykobiologie Glykoproteomika Funkční glykomika „Glycobiology – how sweet it is!“
Monosacharidy (glukosa, fruktosa, galaktosa…) Oligosacharidy (maltosa, isomaltosa, sacharosa, laktosa.., oligosacharidové řetězce tzv. glykany v glykoproteinech a glykolipidech) Polysacharidy (celulosa, škrob, pektin, chitin, glykogen, hyaluronová kyselina atd.) mají podíl na architektuře buňky – strukturní funkce, slouží jako zásobárna energie, významná role v metabolismu
1
Glykosylace je nejběžnější posttranslační modifikací proteinů: membránově vázané receptory, mnoho rozpustrozpustných proteinů a dokonce i nukleoproteiny. nukleoproteiny Posttranslační glykosylace proteinů probíhá v endoplasmatickém retikulu s katalytickou účastí glykosylačních enzymů N-glykany jsou vázány přes N-acetyl-β-D-glukosamin (βGlcNAc) na amidový dusík v L-asparaginu. Pro tuto glykosylaci musí být přítomná signální sekvence Asn-XxxSer/Thr, přičemž Xxx může být jakákoli aminokyselina s vyjímkou Pro a Asp. O-glykany jsou vázány na hydroxylovou skupinu L-serinu nebo L-threoninu, a to přes N-acetyl-α-D-galaktosamin (αGalNAc). Na základě současných vědomostí pro Oglykany neexistuje žádná signální sekvence.
2
3
O-glykany
4
V glykosylaci téhož glykoproteinu existuje běžně variabilita daná přítomnosti více glykosylačních míst. Glykoformy jediného glykoproteinu mají shodnou sekvenci polypeptidového řetězce. Rozmanitost v umístění, stupni saturace na jednotlivých glykosylačních místech a složení glykanových řetězců však přispívá k mikroheterogenitě v molekulové hmotnosti a náboji. Glykosylace proteinů vykazuje čtyři typy specifičnosti. Druhová specifičnost - odlišnosti mezi analogickými proteiny např. lidskými a jinými savčími. Tkáňová specifičnost: specifičnost glykosylační typ ledvinových glykoproteinů se liší od typu charakteristického pro pojivovou tkáň. Buněčná specifičnost je dána vlastnostmi a funkcí určité buňky. Proteinová specifičnost (nejnižší úroveň), kdy proteiny produkované např. stejnou buněčnou linií za stejných kultivačních podmínek mají různou glykosylaci.
5
Peptidoglykany u bakterií
6
Sialové kyseliny
Sialové kyseliny u člověka a živočichů představují zakončení oligosacharidů na povrchu buněk.
7
Monosacharidy běžné v glykoproteinech
8
Jaké informace se získávají při analýze glykoproteinů?
1.Glykosylační místa – počet; 2.Jejich obsazení oligosacharidovými řetězci; 3.Sekvence řetězců; 4.Místa větvení; 5.Vazebné propojení a konfigurace monosacharidů; 6.Odlišení izobarických struktur.
9
Afinitní chromatografie s použitím lektinů
10
APTS značení glykanů před separací kapilární elfo – výsledkem stejný náboj (po předchozí desialylaci, rozdílná velikost má vliv na migraci
11
Permethylace Methylace oligosacharidů pro MS analýzu – umožňuje současně analyzovat neutrální a sialylované struktury; -umožňuje RP-HPLC separaci permethylovaných struktur; - zdokonaluje výsledky MS/MS a zjednodušuje jejich interpretaci; Provedení: dimethylsulfoxidem smíseným s práškovým hydroxidem sodným a methyljodidem. Ciucanu I, Kerek F Carbohydr. Res. 1984,131, 209-217
12
Hmotnostní spektrometrie glykanů Zejména MALDI-TOF MS. 1. Měření intaktních molekul (velikost). 2. Fragmentace (pro určení struktury). tři typy fragmentačních experimentů: - PSD (post-source decay), fragmenty vznikají po extrakci iontů z iontového zdroje ISD (in-source decay), fragmenty vznikají uvnitř iontového zdroje - CID (collision-induced dissociation), fragmenty vznikají v kolizní cele pomocí kolizního plynu
13
14
15
Určení N-glykosylačních míst a heterogenity
Ann et al., Anal. Chem. 75 (2003) 5628.
Amidasová reakce N-glykosidasy F (PNGasa F)
Deglykosylace použitím hydrazinu
16
β-Eliminace s použitím amoniaku
Enzymová sekvenční analýza
17
18
19
On-plate sekvencování
20
Funkční glykomika Některé nemoci spojené s glykokonjugáty 1.Oslabení imunity díky infekčním chorobám, včetně AIDS; 2.Revmatická artritida (ovlivněno složení IgG a hladina MBP v séru – mannose-binding protein); 3.Prionové choroby; 4.Vrozené choroby glykosylace (vzácné, poškození CNS); 5.Choroby ústní dutiny; 6.Cystická fibrosa; 7.Srdeční choroby; 8.Rakovina.
Jak se projevuje rakovina? 1. Zvýšené větvení a sialylace N-glykanů; fukosylace 2. Zvýšená sialylace O-glykanů 3. Výskyt polysialylace 4. Zkrácení některých O-glykanů
21
Mapování glykanů pro diagnostické účely
22
Lipidy ve vodě nerozpustné látky, které mají v živém organismu řadu funkcí: 1) udržování elektrochemického gradientu 2) tvorba subcelulárních struktur (kompartmentace) 3) úloha v buněčné signalizaci (první a druhý posel) 4) uchovávání energie 5) transport proteinů a jejich kotvení v membránách
Řada onemocnění souvisí s poruchami metabolismu lipidů např. atheroskleróza, diabetes, obezita, Alzheimerova choroba.
tuky
1
fosfolipidy
Sójový lecithin
2
Tukové buňky (fat cells)
3
Biosyntéza hlavních fosfolipidů v savčí buňce
kinasy
transferasy
Lipidomika - definice Journal of Lipid Research, Vol. 47, 2101-2111, October 2006 Lipidomics: a global approach to lipid analysis in biological systems by Andrew D. Watson Lipidomika, která je odvětvím vědecké disciplíny zvané metabolomika, znamená systematické studium všech lipidů, jejich struktury, zastoupení a funkce v buňce, a dále molekul se kterými interagují (z těchto se myslí zejména proteiny).
4
Nedávná zdokonalení měkkých ionizačních technologií pro hmotnostní spektrometrii v kombinaci se zavedenými separačními technikami (LC, GC) umožnila rychlou a citlivou detekci rozmanitých lipidových látek s minimalizovanou náročností přípravy vzorku. Pojmem "lipidový profil" surového lipidového extraktu (buň. či tkáňová kultura) se myslí hmotnostní spektrum, které ukazuje složení a abundanci obsažených lipidů. Lipidový profil můžeme použít k monitorování změn v čase a v rámci odezvy na určité podněty. Lipidomika spolu s genomikou, proteomikou a metabolomikou přispěje k pochopení funkce lipidů v biologickém systému a bude mocným nástrojem pro vysvětlení mechanismů nemocí spojených s lipidy, sledování biomarkerů a monitorování farmakoterapie.
5
J. Lipid Res. (2005), Vol. 46, 839-861.
SP
GP
6
7
Extrakce lipidů Protokoly v literatuře, např. „Lipid analyses were carried out according to the methods of Kates (1986). Briefly, lipids were extracted from the washed whole cells obtained by centrifugation by stirring three times in chloroform-methanol (2:1 [vol/vol]), and each time the cells were separated by filtration. The filtrates were accumulated together, purified by the method of Folch et al. (1957), and used as total extractable lipid (TEL).“ „Mouse myocardial lipids were extracted by a modified Bligh & Dyer (1959) method.“ Směs chloroform-methanol, přídavek LiCl/LiOH nebo NH4Cl/NH4OH.
GC separace
8
HPLC separace
hmotnostní spektrometrická analýza surového extraktu bez separace
9
SHOTGUN Lipidomics
Hmotnostní spektrometrie lipidů
10
Hmotnostní spektrum extraktu (MS), „lipidový profil“
negativní mód
Strategie
MS/MS v lipidomice
Product ion scan Precursor ion scan Neutral loss scan
11
2-D PI scan
MS/MS
12
Biomarkery – Alzheimerova choroba (AD) plasmalogeny oxidace!
13
LIPID MAPS
Lipid Metabolites and Pathways Strategy
cíle LIPID MAPS (1) Separovat a detekovat všechny lipidy v dané buňce, objevit a charakterizovat nové lipidy, které by navíc mohly být přítomné. (2) Kvantifikovat každý z přítomných lipidových metabolitů a změny v jeho hladinách a lokalizaci během buněčného života. (3) Definovat metabolické dráhy vlastní každému lipidu a vytvořit z nich lipidové mapy, které by ukazovaly sítě vzájemných interakcí.
14
Klasifikace lipidů
FA GL GP SP
– – – –
Fatty acyls Glycerolipids Glycerophospholipids Sphingolipids
www.lipidmaps.org
ST – Sterol lipids PR – Prenol lipids SL – Saccharolipids PK – Polyketides
15
The LIPID MAPS Structure Database (LMSD) http://www.lipidmaps.org/data/structure/index.html The LIPID MAPS Proteome Database (LMPD) Proteinové sekvence mající souvislost s lipidy; k tomu anotace z databází UniProt, EntrezGene, ENZYME, GO, KEGG a dalších veřejně dostupných zdrojů.
16
17
Kyselina arachidonová, MS/MS spektrum
18
Cholesterol, MS/MS spektrum
2,3-Bis-(3R-hydroxy-tetradecanoyl)-αDglucosamine-1-phosphate tzv. Lipid X, MS/MS spektrum
[M-H]-
19
20
