SLEDOVÁNÍ VÝSKYTU KMENŮ S ESBL U VYBRANÝCH DRUHŮ ENTEROBAKTERIÍ V CHOVECH SKOTU V ČR

DIPLOMOVÁ PRÁCE MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA

ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE ODDĚLENÍ MIKROBIOLOGIE

SLEDOVÁNÍ VÝSKYTU KMENŮ S ESBL U VYBRANÝCH DRUHŮ ENTEROBAKTERIÍ V CHOVECH SKOTU V ČR (Diplomová práce studijního programu Biologie oboru Obecná biologie - směr Mikrobiologie)

BRNO, 2010

Zuzana Jurčíčková

Poděkování Na tomto místě bych ráda poděkovala vedoucí své práce Mgr. Lucii Pokludové, Dr. za ochotnou pomoc, informace potřebné k orientaci v dané problematice, za čas, který mi věnovala a cenné rady, kterými napomohla vzniku této práce. Chtěla bych poděkovat také RNDr. Monice Dolejské, Ph.D. za profesionální vedení a výrazné přispění svými odbornými znalostmi, za její názory a přátelský přístup. Mé poděkování patří také kolegyním Petře Slámové a Janě Soukupové za pomoc při zpracování materiálu a oběma laborantkám, paní Marii Slavíkové a Evě Suchanové, za vytvoření příjemného pracovního zázemí. Práci jsem vypracovávala na Ústavu mikrobiologie a imunologie na Fakultě veterinárního lékařství a na Ústavu biologie a chorob volně žijících zvířat na Fakultě veterinární hygieny a ekologie Veterinární a farmaceutické univerzity v Brně. Tato práce vznikla za finanční podpory věnované z grantu P502/10/P083 Grantové agentury České republiky.

Prohlašuji, že jsem tuto diplomovou práci zpracovala samostatně za použití uvedené literatury. V Brně dne 14. května 2010 2

OBSAH ÚVOD ................................................................................................................... 6 1. TEORETICKÝ ÚVOD A PROBLEMATIKA................................................. 7 1.1. Problematika nadužívání antibiotik u potravinových zvířat .............................................7 1.1.1. Spotřeba antibiotik v ČR a srovnání s členskými státy EU.........................................8 1.1.2. Legislativa upravující používání antibiotik ................................................................10 1.2. Srovnání intenzivního chovu mléčného skotu a ekologického chovu .............................14 1.2.1. Srovnání chovu v Těšanech a ekologického chovu na farmě v Luboměři ...............14 1.2.2. Obecná kritéria pro ekologický chov...........................................................................15 1.2.3. Legislativa ekologického zemědělství ..........................................................................16 1.2.4. Ekologický vývoj a význam ekofarem v ČR ...............................................................17 1.3. Antibiotika............................................................................................................................17 1.3.1. β-laktamová antibiotika ...............................................................................................18 1.3.1.1. Peniciliny.................................................................................................................19 1.3.1.2. Cefalosporiny ..........................................................................................................19 1.3.1.2.1. Cefalosporiny 3. a 4. generace – veterinární cefalosporiny s použitím u potravinových zvířat ..........................................................................................................21 1.3.1.2.2. Mastitida ............................................................................................................23 1.4. Rezistence k antimikrobiálním látkám...............................................................................25 1.4.1. Mechanismy rezistence k antibiotikům .......................................................................25 1.4.1.1. Mechanismy rezistence ß-laktamů ...........................................................................26 1.4.1.1.1. Enzymy β-laktamázy .........................................................................................28 1.4.1.2. ESBL ........................................................................................................................29 1.5. Mechanismy přenosu rezistence..........................................................................................34 1.5.1. Horizontální přenos genů..............................................................................................34 1.5.1.1. Plazmidy, transpozony, IS elementy, integrony, genové kazety, GI.......................34 1.5.2. Způsoby přenosu genů ..................................................................................................36 1.5.3. Přenos rezistentních bakterií mezi zvířaty a lidmi .....................................................37 1.5.4. Mléčné filtry ...................................................................................................................38 1.6. Bakterie čeledi Enterobacteriaceae......................................................................................39 1.6.1. Rod Escherichia .............................................................................................................39 1.6.1.1. Escherichia coli ........................................................................................................39

2. CÍLE PRÁCE .................................................................................................. 41 3. METODIKA.................................................................................................... 42 3.1. MIKROORGANISMY ........................................................................................................42 3.2. KULTIVAČNÍ MÉDIA A ROZTOKY ..............................................................................42 3.3. PŘÍSTROJE..........................................................................................................................48 3

3.4. POMŮCKY ...........................................................................................................................48 3.5. CHEMIKÁLIE A OSTATNÍ SUBSTANCE ....................................................................49 3.6. METODY ..............................................................................................................................50 3.6.1. Izolace producentů ESBL .............................................................................................50 3.6.2. Double-disk synergy test - DDST .................................................................................51 3.6.3. Testování citlivosti k dalším antibiotikům diskovou difúzní metodou .....................53 3.6.4. Biochemická identifikace vybraných bakteriálních izolátů testem API 10S ...........54 3.6.5. Detekce genů rezistence metodou PCR .......................................................................56 3.6.5.1. Izolace bakteriální DNA rezistentních izolátů..........................................................56 3.6.5.2. Polymerázová řetězová reakce se specifickými primery..........................................56 3.6.5.3. Schéma testování integronů......................................................................................59 3.6.6. Pulzní gelová elektroforéza...........................................................................................60 3.6.6.1. Příprava PFGE bločků z agarových kultur ...............................................................60 3.6.6.2. Restrikční štěpení DNA v bločcích enzymem XbaI / S1..........................................61 3.6.6.3. Příprava a nastavení programu vlastní PFGE...........................................................62 3.6.6.4. Barvení a vizualizace gelu........................................................................................62 3.6.7. Izolace plazmidové DNA ...............................................................................................63 3.6.8. Konjugace u ESBL+ izolátů ..........................................................................................64 3.6.9. Transformace plazmidové DNA do chemicky kompetentních buněk E. coli ..........66 3.6.10. Multiplex PCR .............................................................................................................67 3.6.11. Polymorfismus délky restrikčních fragmentů - RFLP.............................................69 3.6.11.1. Příprava restrikční směsi ........................................................................................69 3.6.11.2. Agarózová gelová elektroforéza.............................................................................69

4. VÝSLEDKY ................................................................................................... 70 4.1. Farma v Těšanech.................................................................................................................70 4.1.1. Spotřeba antibiotik na farmě v Těšanech ...................................................................70 4.1.2. Výsledky biochemické identifikace ..............................................................................71 4.1.3. Výsledky fenotypových a genotypových metod k detekci antibiotické rezistence u izolátů E. coli z farmy v Těšanech..........................................................................................72 4.2. Ekologický chov Luboměř pod Strážnou ...........................................................................75 4.2.1. Spotřeba antibiotik na ekofarmě v Luboměři ............................................................75 4.2.2. Výsledky fenotypových a genotypových metod k detekci antibiotické rezistence u izolátů E. coli z ekofarmy v Luboměři...................................................................................75 4.3. Výsledky pulzní gelové elektroforézy (PFGE) u ESBL+ izolátů E. coli z farmy v Těšanech a Luboměři ...............................................................................................................77 4.4. Výsledky konjugace u ESBL+ izolátů .................................................................................79 4.5. Výsledky transformace plazmidové DNA do chemicky kompetentních buněk E. coli ..81 4.6. Výsledky RFLP (makrorestrikční analýza) .......................................................................83 4.7. Výsledky Multiplex PCR .....................................................................................................84

4

5. DISKUZE........................................................................................................ 85 5.1. Používání cefalosporinů ve veterinární medicíně a dopad na vznik a šíření rezistence 85 5.1.1. Srovnání antibiotické politiky na farmě v Těšanech a ekofarmě v Luboměři ........86 5.2. Záchyt ESBL+ kmenů a antibiotická rezistence ................................................................86 5.2.1. Výskyt producentů ESBL na farmě v Těšanech a ekofarmě v Luboměři ...............87 5.2.2. Výskyt ESBL+ kmenů ve veterinární oblasti ..............................................................87 5.2.3. Výskyt producentů ESBL v humánní medicíně .........................................................88 5.2.4. „Pandemické“ geny blaCTX-M ........................................................................................89 5.3. Význam ekologických chovů v souvislosti se spotřebou antibiotik a šířením rezistence .......................................................................................................................................................90 5.4. Analýza izolátů E. coli metodou PFGE ..............................................................................91 5.5. Analýza plazmidů nesoucích gen blaCTX-M .........................................................................92 5.6. Horizontální přenos genů.....................................................................................................94 5.6.1. Konjugace.......................................................................................................................94 5.6.2. Transformace .................................................................................................................95

ZÁVĚR................................................................................................................ 96 LITERATURA.................................................................................................... 97 PŘÍLOHY.......................................................................................................... 104

5

ÚVOD

Vše začalo objevem penicilinu a dnes už si lékařskou péči neumíme bez antibiotik ani představit. S objevením antibiotik se zdálo, že lidstvo má vyhráno. Nicméně bakterie se začaly bránit a vyvíjet mechanismy, jak odolat účinkům těchto léků. Povedlo se jim vytvořit několik způsobů obrany, včetně produkce enzymu β-laktamázy se širokým spektrem účinku. Postupně se vznik a šíření bakterií rezistentních k antibiotikům staly celosvětovým problémem. Mezi antibiotika, na které si bakterie vytvořily rezistenci, patří i cefalosporiny. Tyto léky jsou nezbytnými v oblasti humánní i veterinární medicíny a šíření rezistence mezi bakteriemi významně omezuje možnosti léčby. Aktuálním problémem je v současnosti nadužívání veterinárních léčivých přípravků s obsahem cefalosporinů především u potravinových zvířat. Nadměrná aplikace cefalosporinů totiž přispívá k selekci rezistentních klonů, které mohou své geny rezistence dále šířit mezi ostatními zvířaty, lidmi a prostředím. Spojovacím článkem mezi bakteriální mikroflórou zvířat a lidí je bakterie Escherichia coli, která se vyskytuje jako běžná součást lidské i zvířecí střevní mikroflóry. Spotřeba veterinárních léčiv je v České republice zaznamenávána od roku 2002 a je zde především snaha o racionální používání antimikrobiálních léčiv. Cílem je zajistit optimální terapeutický účinek daného léčiva, a to společně s respektováním bezpečnosti antibiotické léčby. Důsledným dodržování racionální antibiotické politiky lze totiž předejít vzniku a šíření rezistentních klonů. Zároveň je potřeba nastavit indikační omezení při použití u zvířat v souladu s požadavky používání antibiotik v humánní medicíně. Rychlost šíření genů rezistence mezi bakteriemi je stále vyšší a boj s bakteriemi, které odolávají účinkům antibiotik, se stává celosvětovým problémem. Proto je třeba uvědomit si závažnost situace a přijmout opatření, která by vedla ke snížení výskytu rezistentních kmenů. Konkrétní opatření by však měla být přijímána především na lokální úrovni a to na základě odborných podkladů. Proto je zcela zásadní získávat informace o stavu citlivosti a rezistence bakterií a rovněž informace o spotřebách antimikrobiálních léčiv na regionální úrovni.

6

1. TEORETICKÝ ÚVOD A PROBLEMATIKA

1.1. Problematika nadužívání antibiotik u potravinových zvířat Nadšení pro používání antibiotik k léčbě potravinových zvířat vyústilo ve zvyšující se počet bakterií, které jsou rezistentní k jednotlivým antibiotikům (Sawant et al., 2007). Rostoucí odolnost bakterií komplikovala a stále komplikuje léčení infekcí v humánní i veterinární medicíně. Tato situace vedla k důležitým změnám v oblasti antibiotické politiky (zpřísnění používání a předepisování léků), zvláště pak v případě nasazování antibiotik jako růstových stimulátorů či profylakticky. V dřívější době byla antibiotika používána k léčbě, preventivně, či jako růstové stimulátory (Sawant et al., 2005). V případě používání antibiotik jako růstových stimulátorů byla podávána v nízkých dávkách po dlouhou dobu. Preventivně se antibiotika používala také v nízkých dávkách z toho důvodu, aby se zabránilo vzniku onemocnění. Antibiotika v subklinických dávkách mohou být z hlediska produkčního považována za užitečná z těchto důvodů: 1. urychlují růst dobytka 2. snižují riziko vzniku onemocnění 3. zlepšují trávení zvířat 4. přírůstek hmotnosti zvířete je vyšší 5. zkracují dobu a množství krmiva, které jsou potřebné pro dosažení porážkové hmotnosti zvířete Na druhou stranu nadměrné podávání antibiotik dobytku umožní bakteriím adaptovat se a rozvíjet mechanismy rezistence (Sawant et al., 2005). Selektivní tlak je hlavním faktorem, který dovolí bakteriím s novými mutacemi či nově získanými vlastnostmi přežít a množit se. Jak uvádí Billová (2007): „Antimikrobiální léčiva mají u potravinových zvířat svou nezastupitelnou úlohu při léčbě a předcházení infekčním onemocněním vyvolaných bakteriemi, jsou nenahraditelná v léčbě infekčních onemocnění lidí a zvířat. Zároveň však jejich neuvážlivé používání může vést k rozvoji rezistence mikroorganismů, rezistentní zárodky se mohou dále šířit a snižovat účinnost terapie nejen ve veterinární sféře, ale i v oblasti humánní medicíny“.

7

Cefalosporiny 3. a 4. generace jsou používány k léčbě hospodářských zvířat a mohou tedy ovlivnit výskyt rezistence (EMEA). Bakterie pocházející z hospodářských zvířat a rezistentní k cefalosporinům 3. a 4. generace jsou považovány za nebezpečné, vyskytují-li se v potravinách. Mohou se uplatňovat přímo jako lidské patogeny (např. Salmonella, Escherichia coli), nebo mohou napomáhat horizontálnímu přenosu genů rezistence. Navíc jsou cefalosporiny na seznamu antibiotik, která jsou velmi důležitá pro použití v humánní i veterinární medicíně. V té humánní oblasti medicíny jsou také často využívána. 1.1.1. Spotřeba antibiotik v ČR a srovnání s členskými státy EU Informace o spotřebě antimikrobiálních látek používaných u hospodářských zvířat nejsou v EU ještě komplexně dostupné, nicméně časem by se to mělo zlepšit (EMEA). Zaznamenaná data jsou většinou uváděna pro všechny druhy zvířat, včetně psů a koček. Navíc vypovídají o „ß-laktamových antibiotikách“ obecně, či jsou záznamy rozděleny na peniciliny a cefalosporiny, a to bez rozlišení jednotlivých generací, jako např. v Tabulce 1. Je proto složité srovnávat údaje o spotřebě cefalosporinů v rámci jednotlivých generací. Tabulka 1. Spotřeba veterinárních léčivých přípravků (VLP) v České republice v letech 2003 – 2008 (vybrané skupiny antibiotik) (upraveno dle Hera et al., 2009a) Skupina antibiotik Cefalosporiny Peniciliny Peniciliny + kyselina klavulanová Celkem

2003 (kg) 2004 (kg) 2005 (kg) 2006 (kg) 2007 (kg) 2008 (kg) 202,53

420,33

546,94

16213,76 19905,89 26590,59 22934,74 12963,91

17865,35

753,16 17169,45

207,62

337,76

520,69

612,02

291,39 571,16

1162,43

636,97

20634,2 27540,37 23797,29 14546,67

19049,26

V Tabulce 1 je zaznamenána spotřeba jednotlivých skupin antimikrobiálních látek v České republice mezi léty 2003 a 2008. Jednotlivá ß-laktamová antibiotika jsou rozdělena na peniciliny a cefalosporiny. Přehledy neuvádějí rozlišení jednotlivých generací cefalosporinů. Spotřeba cefalosporinů vzrostla od roku 2003 více než dvojnásobně, zatímco penicilinových přípravků se spotřebovalo nejvíce v roce 2005, a poté bylo zaznamenáno snížení spotřeby. Co se týče celkové spotřeby antibiotik, je tendence stabilně vzrůstající.

8

V některých členských státech EU je na cefalosporinových lécích uvedeno v souhrnu údajů o přípravku, případně v příbalové informaci nebo na obale zvláštní upozornění o používání v souvislosti s antibiotickou rezistencí (Bilová et al., 2007). Česká republika má tento typ upozornění nazvaný „indikační omezení“ uveden u přípravků obsahujících cefalosporiny 3. a 4. generace (indikační omezení je uvedeno rovněž pro některá další antibiotika, např. pro fluorochinolony). Z Tabulky 2 vyplývá, že zatímco ve Švýcarsku je spotřeba antimikrobiálních látek ročně přibližně stejná jako v České republice, v severských státech je výsledná spotřeba, i přes větší rozlohu státu, téměř poloviční. Je to důsledek dlouhodobé antibiotické politiky těchto států a celkově menšího množství registrovaných léčiv s

antibiotiky, epizootologické situace,

managementu chovů či zainteresovanosti veterinárních lékařů na zisku z prodeje VLP (veterinární léčivé přípravky). Tabulka 2. Spotřeby penicilinů a cefalosporinů (uvedeno v tunách) v různých evropských státech v roce 2007 (EMEA) Skupina antibiotik Peniciliny Cefalosporiny ß-laktamy

ČR 12,96 0,42

Dánsko 35,66 0,66

-

36,32

Holandsko Švédsko Švýcarsko 8,51 12,40 0,95 0,50 64,00

9,46

12,90

Finsko 7,86 1,00 8,86

V Evropě byl zaznamenán zvyšující se výskyt rezistence k cefalosporinům 3. generace (např. u bakterií K. pneumoniae, E. coli) (EMEA). Důvodem je ve většině případů používání cefalosporinů v lékařství, nicméně není vyloučeno ani šíření genů rezistence z potravinových zvířat přes jídlo či okolním prostředím. Vyšší frekvence výskytu rezistence koresponduje rovněž s vyšší frekvencí používání cefalosporinů 3.generace. Graf 1. ukazuje na trendy ve spotřebách cefalosporinů 3. a 4. generace a celkové spotřeby cefalosporinů v porovnání s trendy v počtu hlavních druhů potravinových zvířat zastoupených v ČR. Rostoucí spotřeba cefalosporinů vyšších generací je v posledních letech velmi výrazná, nicméně spotřeba této skupiny antibiotik je relativně nižší ve srovnání s ostatními skupinami antibiotik.

9

Graf 1. Trend ve spotřebě cefalosporinů 3. a 4. generace v letech 2003-2008 v závislost na počtu kusů potravinových zvířat (ovce, skot, prasata) (Pokludová et al., Poster EAVPT Leipzig, 2009)

spotřeba cefalosporinů (kg) / počet kusů zvířat (x 10 000)

Srovnání spotřeby cefalosporinů s počtem zvířat v ČR v letech 2003-2008 600 500 400 300 200 100 0 2003

2004

2005

rok

2006

2007

2008

Cefalosporiny 3. a 4. generace Cefalosporiny všech generací Počet potravinových zvířat (skot, prasata, ovce)

1.1.2. Legislativa upravující používání antibiotik (EMEA) V současnosti nejsou žádná striktní zákonná pravidla určující používání cefalosporinů u hospodářských zvířat (EMEA). Směrnice Evropské federace veterinářů doporučuje: „je-li dostupné antibiotikum s užším spektrem účinku, mělo by být použito přednostně“. Problém většiny států je ovšem v tom, že pokyny pro používání antibiotik v rámci jednotlivých indikací jsou pouze na obecné úrovni a bez specifikace cefalosporinů. V oblasti veterinární medicíny jsou léčiva obsahující antibiotika používána kromě individuální terapie také pro tzv. hromadné použití prostřednictvím medikovaných krmiv. Pro tyto aplikace jsou nutné přísné předpisy, aby se předešlo poškození zdraví lidí rezidui veterinárních léčiv či šíření rezistentních bakteriálních kmenů. V České republice není prostřednictvím hromadné medikace používán žádný přípravek obsahující cefalosporiny 3. a 4. generace.

10

Existuje několik způsobů, jak se mohou rezistentní zárodky k člověku dostat (Billová et al., 2007). Jsou to: 1. přímý kontakt se zvířaty – zdravými nositeli rezistentních organismů, či nemocnými zvířaty 2. prostřednictvím potravního řetězce – skrze potraviny, které jsou kontaminovány rezistentními zárodky 3. přenos genů rezistence mezi jednotlivými druhy bakterií Evropská léková agentura EMEA/CVMP vydala: (EMEA: European Medicines Agency – Evropská léková agentura, od 1.1. 2010 změna označení na EMA, CVMP: Committee for Medicinal Products for Veterinary Use – Komise pro veterinární léčivé přípravky) •

dokument jako revidovaný pokyn upravující SPC (Summary of Products Characteristics – Souhrn údajů o přípravku) antimikrobiálních přípravků platný od 1. května 2008 (EMEA/CVMP/SAGAM/383441/2005)

•

dokument, který pojednává o strategii CVMP v oblasti antibiotik pro období 2006-2010 (EMEA/CVMP/353297/2005)

•

pokyn pro prokázání účinnosti veterinárních léčivých přípravků obsahujících antibiotika (EMEA/CVMP/627/01)

•

také revidovaný dokument věnovaný problematice používání cefalosporinů 3. a 4. generace u potravinových zvířat, který je v platnosti je od 11. března 2009 (EMEA/CVMP/SAGAM/81730/2006-Rev.1*)

CVMP strategie je založena na třech klíčových oblastech: (Hera et al., 2009b) 1. Registrace antimikrobiálních veterinárních léčivých přípravků Požadavky na dokumentaci pro veterinární léčivé přípravky jsou dány Směrnicí 2001/82/EC, ve znění pozdějších předpisů, resp. pro ČR zákonem č. 378/2007 Sb., o léčivech a jeho prováděcími předpisy (vyhláška č. 228/2008 Sb., o registraci léčivých přípravků). Úlohou

11

CVMP je dále vytvářet pokyny pro žadatele a hodnotitele, které zpřesňují požadavky na informace, které musí být doloženy. V České republice je sledování spotřeby antibiotik v kompetenci ÚSKVBL (Ústav pro státní kontrolu veterinárních biopreparátů a léčiv) a podle zákona o léčivech jsou od roku 2005 data o spotřebách antibiotik zveřejňována ve Věstníku této instituce, od roku 2010 jsou pak dostupné rovněž na webové stránce Ústavu (ÚSKVBL1) 2. Mezinárodní aktivity v oblasti antibiotik Na evropské úrovni se oblasti antibiotické politiky a problematice rezistence na antibiotika věnuje vědecká skupina poradců pro antimikrobiální terapii Scientific Advisory Group On Antimicrobials (SAGAM). Tato skupina poskytuje expertízy CVMP k problematice týkající se registrace a používání antimikrobiálních léčiv. Kromě toho předkládá komisi CVMP kritické aspekty k současné situaci a trendům antibiotické rezistence v EU. Podrobné informace jsou veřejně dostupné na stránkách: http://www.ema.europa.eu/htms/general/contacts/CVMP/ CVMP_SAGAM.html. 3. Další rozvoj V oblasti antimikrobiálních léčiv dochází bezesporu k rychlému vývoji a tudíž i častým změnám, zejména pokud jde o vznik určité rezistence či používání antibiotik při léčbě. Proto je nutná aktualizace informací i strategie postupu boje proti rezistenci. V případě cefalosporinů je doporučeno nepoužívat je profylakticky, uvádět doporučení o rozumném používání na obalech, v příbalových informacích a v souhrnu údajů o přípravku. Dále je vhodné sledovat stav rezistence a spotřeby (s rozdělením spotřeby do jednotlivých generací) a vzdělávání veterinářů. Obecný postup při minimalizaci rizika spojeného s užíváním cefalosporinů zahrnuje: (Moulin, 2009) •

Identifikaci nebezpečí – je třeba si uvědomit, že užívání antibiotik (včetně cefalosporinů) vede k selekci bakteriální rezistence

•

Charakteristiku nebezpečí – používání přípravků obsahujících cefalosporiny, zvláště 3. a 4. generace, u zvířat vede ke vzniku rezistence zvířecích patogenů a food-borne patogenů (patogenů pocházejících z potravin) a následně k selhání léčby infekcí, které jsou vyvolány těmito patogeny

12

•

Zhodnocení rizika – provádí se na základě poskytnutých údajů o výši bakteriální rezistence v populaci mikroorganismů a to na základě údajů o spotřebě – je třeba vyhodnotit trendy v této oblasti

•

Řízení rizika – opatření, která vedou ke snížení rizika jsou: o používání přípravků obsahujících cefalosporiny jen v případě závažných infekcí, či není-li jiná vhodná alternativní léčba o omezení využívání cefalosporinů k profylaktickým účelům o definování přesného dávkování o uvedení přesných instrukcí a informací o uvážlivém používání cefalosporinů na obale, v příbalové informaci a v souhrnu údajů o přípravku o vzdělávání veterinářů v oblasti antimikrobiální rezistence CVMP (Komise pro veterinární léčivé přípravky) velmi podporuje následující pokyny

k zamezení šíření rezistence k cefalosporinům: (EMEA) •

Dodržení biologické bezpečnosti (např. potřebná vzdálenost nutná k udržení nemoci z dosahu populace, stáda či skupiny zvířat, ve kterých nemoc nepropukla, nebo omezení šíření nemoci ve stádu)

•

Vzdělávání veterinářů a farmářů v postupech potřebných pro zmenšení či minimalizování antibiotické rezistence

•

Sledování rezistence k cefalosporinům u patogenních bakterií

•

Monitorování používání cefalosporinů v jednotlivých státech a zakročení, je-li to nutné. Následné zaznamenání dat, rozdělení spotřeby cefaloporinů pro lokální či systémové použití a rozlišení cefalosporinů vyšších generací

•

Zábrana distribuce (reklamních nabídek) cefalosporinů majitelům zvířat Od 1.1.2006 nejsou v EU povoleny k používání žádné antibiotické růstové stimulátory

(Billová et al., 2007). Jak Billová, (2007) uvádí: „Rezistence bakterií k antibiotikům se stala vážným celosvětovým problémem. Důvodem je nadměrná spotřeba antimikrobiálních látek a jejich nezodpovědné používání. Důsledky se pak projevují v selhávání léčby, vyšší mortalitě a značných ekonomických nákladech. Při řešení nepříznivé situace musí být aktivně zapojeny 13

všechny složky, kterých se rezistence mikroorganismů k antibiotikům dotýká – od veterinárních lékařů, přes farmaceutický průmysl, po řídící autority (národní lékové agentury, EMA, další mezinárodní organizace a vládní struktury). Jednotná strategie je základem úspěchu v boji proti antimikrobiální rezistenci.“

1.2. Srovnání intenzivního chovu mléčného skotu a ekologického chovu 1.2.1. Srovnání chovu v Těšanech a ekologického chovu na farmě v Luboměři Na obou farmách je chováno plemeno Holštýn. V Těšanech najdeme výhradně plemeno Holštýn černý, v Luboměři je z menší části zastoupeno plemeno Holštýn červený a ve více než 50 % je zde zastoupeno plemeno Čestr zušlechtěné Montbeliardem. Na těšanské farmě je chován pouze mléčný skot, zatímco v Luboměři chovají skot mléčný i masný. Na farmě v Luboměři se dodržují pravidla platná pro ekofarmy a řídí se zde pokyny platnými pro ekochov. Najdeme zde 180 mléčných krav, 80 masných krav a 50 telat, což je zhruba o jednu třetinu méně než v Těšanech, kde mají 360 mléčných krav a 80 telat. Co se týče spotřeby antibiotik, na farmě v Těšanech je vysoká. Frekvence aplikací antibiotik za rok 2008 (392 kusů dobytka) je 2-3 aplikace antibiotika na zvíře za rok. Vyskytují se zde ovšem i dojnice s aplikací 7-10 antimikrobiálních látek z různých farmakologických skupin. Mezi pět nejčastěji používaných antibiotik patří ceftiofur (cefalosporin 3. generace), amoxicilin + kyselina klavulanová, cefoperazon (cefalosporin 3. generace), kloxacilin a penicilin + neomycin. Ve srovnání s chovem v Těšanech vidíme na farmě v Luboměři velký rozdíl ve spotřebě antibiotik. Frekvence aplikací antibiotik je nízká a pohybuje se okolo 0,5 podání antibiotika na zvíře za rok. Mezi pěti nejčastěji používanými antibiotiky jsou CTC (chlortetracyklin), streptomycin, sulfathiazol, penicilin a kloxacilin.

14

V roce 2008 byly v Luboměři používány veterinární léčivé přípravky (VLP) obsahující následující účinné látky: (Záznamy ošetřujícího veterinárního lékaře o VLP podávaných léčebně na farmě) •

Betalaktamy: penicilin, prokain benzyl penicillin, kloxacilin benzatin

•

Aminoglykosidy: neomycin, streptomycin sulfát, dihydrostreptomycin

•

Tetracykliny: OTC - oxytetracyklin, CTC - chlortetracyklin

Nebyly používány žádné přípravky z kategorie cefalosporinů 3. a 4. generace. Farma v Těšanech má vyšší užitkovost. Produkce mléka se pohybuje v průměru okolo 30 litrů na jednu dojnici a roční užitkovost je tedy asi 9000 litrů mléka. Produkce mléka v chovu v Luboměři je opět zhruba o jednu třetinu nižší, tedy okolo 6000 litrů mléka ročně. 1.2.2. Obecná kritéria pro ekologický chov (Ekologické zemědělství - http://ec.europa.eu/agriculture/organic/organic-farming/what-organic _cs)

Jak uvedlo Generálního ředitelství pro zemědělství a rozvoj venkova při Evropské komisi v rámci kampaně na zvýšení povědomí o ekologickém zemědělství v celé Evropské unii, představuje ekologické zemědělství systém, který se snaží poskytovat spotřebitelům čerstvé a chutné potraviny, a přitom respektovat přirozené přírodní podmínky (Ekologické zemědělství, cit. 2010). Tohoto dosahuje ekologické zemědělství na základě pravidel a obecných principů, které se zaměřují na snížení negativního působení člověka na životní prostředí. Snahou je, aby celý tento zemědělský systém fungoval co nejvíce přirozeně.

Typické postupy ekologického zemědělství zahrnují např.: •

Velmi přísné limity pro používání syntetických pesticidů, hnojiv a antibiotik u hospodářských zvířat, stejně jako pro používání potravinových aditiv a pomocných látek při zpracování a pro používání jiných podobných vstupů

•

Absolutní zákaz používání geneticky modifikovaných organismů

•

Využívání místních zdrojů, např. statkových hnojiv nebo krmiv vyprodukovaných přímo na farmě

•

Výběr rostlinných a živočišných druhů rezistentních k chorobám a přizpůsobených místním podmínkám

15

•

Chov hospodářských zvířat na pastvě, ve venkovních výbězích a krmení ekologickými krmivy

•

Používání chovatelských postupů odpovídajících různým druhům hospodářských zvířat

1.2.3. Legislativa ekologického zemědělství (Legislativa - http://ec.europa.eu/agriculture/organic/news/press-releases_cs#organic) Pravidla o ekologickém zemědělství byla v EU formulována Nařízením Rady (EHS) č. 2092/91 z 24. června 1991, o ekologické produkci zemědělských výrobků a označování zemědělských produktů a potravin (Legislativa, cit. 2010). Avšak od 1. ledna 2009 musí farmáři, distributoři, kontrolní orgány a kompetentní úřady ve všech členských státech EU používat obnovenou legislativu o ekologickém zemědělství, která zahrnuje: 1. Směrnice rady (ES) č. 834/2007 z 28. června 2007 o ekologické výrobě a označování ekologických výrobků, 2. Směrnicí rady (ES) č. 967/2008 z 29. září 2008 doplňující směrnicí (ES) č. 834/2007, o ekologické výrobě a označování ekologických výrobků, které vstoupily v platnost k 1. lednu 2009 Logo Logo EU pro ekologické zemědělství ubezpečuje spotřebitele o původu a kvalitě potravin a nápojů (Legislativa, cit. 2010). Přítomnost tohoto loga na výrobku zaručuje, že výrobce respektoval Nařízení EU týkající se ekologického zemědělství. V současné době mohou ekologičtí zemědělci umisťovat logo EU na své výrobky dobrovolně, nicméně od 1. července 2010 se stane označování bioproduktů logem povinné. Na Obrázku 1 je logo platné od prvního července 2010. Obrázek 1. Logo EU pro ekologické zemědělství platné od července 2010.

16

1.2.4. Ekologický vývoj a význam ekofarem v ČR (Hrabalová et Zander, 2006) Trh s ekologickými produkty je v ČR malý, možnosti pro nabídku produktů ekologického zemědělství jsou omezené. Z toho důvodu je podpora státem nepostradatelná. Historie a vývoj Počátky ekologických chovů v České republice lze datovat okolo roku 1990. V té době se v zemi vyskytovaly pouze 3 ekologické farmy. Od roku 1990 jsou produkty ekologického zemědělství podporovány z veřejných prostředků Ministerstvem zemědělství. Největší rozmach oblastí využívaných pro ekologické chovy nastal v letech 1998-2001. Zejména tomu napomohlo obnovení státních příspěvků farmářům. Zastoupení zvířat v ekologickém zemědělství Hospodářství v ekologickém zemědělství jsou nejvíce zastoupena pasoucím se dobytkem, většinou skotem pasoucím se na pastvinách. Převažují stáda chovných krav v porovnání s mléčnými farmami, přičemž podíl krav chovaných pro maso a pro mléko je v poměru 95:5. Důležitou otázkou je, zda-li je zisk dostatečně vysoký k pokrytí všech nákladů. Zatím se ukazuje, že ano. Nicméně velká část příjmů u farem v celé západní Evropě je zajištěna státními dotacemi.

1.3. Antibiotika Antibiotika pro potravinová zvířata se rozdělují podle dvou kritérií, která byla stanovena jednotlivými členskými státy EU: (Biological Standards Commission, 2007) Kritérium 1 je splněno v případě, že více než polovina členských zemí považuje určitou antimikrobiální třídu za důležitou. Kritérium 2 je dodrženo, jestliže jsou jednotlivé antimikrobiální látky v rámci třídy nezastupitelné pro danou infekci anebo je pro ně jen velmi málo alternativních látek.

17

Na základě těchto kritérií byly antimikrobiální látky určené pro potravinová zvířata rozděleny do tří skupin: •

Veterinární kriticky významná antibiotika – v případě, že byla splněna obě kritéria (např. aminoglykosidy,

cefalosporiny,

makrolidy,

peniciliny,

amfenikoly,

chinolony,

sulfonamidy, tetracykliny) •

Veterinární vysoce významná antibiotika – je-li splněno jen jedno z kritérií (např. ansamyciny, fosfomycin, linkosamidy, pleuromutiliny a polypeptidy)

•

Veterinární významná antibiotika – ani jedno z kritérií nebylo splněno (např. bicyclomycin, kyselina fusidová, novobiocin) V rámci skupiny vysoce významných antibiotik se mohou některá z nich řadit do skupiny

kriticky významných v případě určitých druhů zvířat. Cefalosporiny U zvířat by měla být tato skupina antibiotik vyhrazena jen pro léčbu závažných onemocnění, v případě, že není jiná alternativa pro léčbu. Cefalosporinové přípravky se mohou podávat ve formě injekce, intramamární suspenze, tablety či prášku, který je určen pro podání léku ve vodě či mléčných náhražkách. Intramamární aplikace antibiotika však snižuje účinnost látky (ve smyslu systémového účinku) (EMEA). V mnoha členských státech jsou cefalosporiny často používány v období laktace či zaprahlosti (období mimo dojení) u skotu, což vede k selekci rezistentních bakterií. Navíc, pokud jsou telata krmena mlékem od nedávno léčené krávy, kdy ještě nevypršela ochranná lhůta (OL) na mléko, je mikroflóra telat vystavena účinkům používaného antibiotika. 1.3.1. β-laktamová antibiotika Mezi ß-laktamová antibiotika řadíme peniciliny, cefalosporiny, karbapenemy a monobaktámy. Významnou skupinou související s ß-laktamy jsou antibiotika označovaná jako inhibitory ß- laktamáz.

18

1.3.1.1. Peniciliny Jak uvádí Votava et al. (2005), jsou peniciliny vysoce účinná antibiotika s nízkou toxicitou. Jsou získávány z kultury plísně Penicillium chrysogenum a dalších plísní, které produkují kyselinu 6-aminopenicilanovou. V molekule této kyseliny se vyskytuje ß-laktamový kruh konjugovaný s pětičlenným thiazolidinovým kruhem. Biochemické substituce tohoto meziproduktu vedou k rozmanitým druhům penicilinů. Liší se šířkou antibakteriálního spektra, stabilitou vůči nízkému pH a vůči ß-laktamázám. 1.3.1.2. Cefalosporiny Cefalosporiny jsou semisyntetická β-laktamová antibiotika odvozená od cefalosporinu C, produkovaného houbou Acremonium chrysogenum (Rafii et al., 2009). Cefalosporiny inhibují biosyntézu peptidoglykanu, ovšem některé bakterie produkují enzymy β-laktamázy schopné tyto cefalosporiny inaktivovat. Třetí a 4. generace cefalospoinů, jako jsou cefotaxim, ceftazidim, cefchinom či ceftiofur, jsou označovány jako širokospektré β-laktamy. Cefalosporiny a cefamyciny se řadí společně do skupiny a jsou klasifikovány na základě svých účinků in vitro, strukturních podobností a v některých případech dle roku jejich objevení (EMEA). ATCvet je systém klasifikace látek určených k terapeutickým účelům ve veterinární medicíně a může sloužit jako nástroj pro vyhledávání a orientaci v lékařsky využívaných výrobcích.

Další

informace

je

možno

získat

na

veřejně

dostupných

stránkách

http://www.whocc.no/atcvet. Podle ATCvet (Anatomic Therapeutic Chemical index) z ledna roku 2010 se rozdělují na tyto čtyři skupiny: •

První generace cefalosporinů – (v ČR registrovány veterinární léčivé přípravky - VLP s účinnými látkami cefalexin, cefadroxil, cefalotin, cefapirin) vyznačují se nejužším spektrem účinku. Výborně působí na grampozitivní koky, včetně stafylokoků produkujících penicilinázu. Naproti tomu účinek na gramnegativní baterie je omezený.

•

Druhá generace cefalosporinů – (v ČR registrován VLP s účinnou látkou cefaclor) v porovnání s první generací vykazují širší spektrum účinku. Obecně působí lépe proti gramnegativním bakteriím. 19

•

Třetí generace cefalosporinů – (v ČR registrovány VLP s účinnými látkami ceftiofur, cefoperazon, cefovecin) je u nich známo, že mají široké spektrum účinku se zvyšující se odolností k mnoha ß-laktamázám. Takovéto ß-laktamázy dovedou inaktivovat první a druhou generaci cefalosporinů, stejně jako ostatní ß-laktamová antibiotika.

•

Čtvrtá generace cefalosporinů – (cefchinom) nalezneme zde rozšířené spektrum účinku proti gramnegativním bakteriím stejně jako vyšší odolnost k ß-laktamázám v porovnání s třetí generací. Prozatím jen pro humánní medicínu je dostupný nezařazený cefalosporin ceftobiprol

medocaril, jenž byl schválen Evropskou lékovou agenturou (EMA) k použití v humánních léčivech na podzim roku 2008 (Doc.Ref.EMEA/CHMP/552347/2008). Historie Cefalosporiny 3. a 4. generace představují antibiotika, která jsou velmi důležitá pro léčbu závažných a invazivních lidských infekcí, proto jsou pod dohledem zdravotnictví (EMEA). V 80. letech 20. století bylo zaznamenáno první velké propuknutí výskytu bakterií, které odolávaly účinkům těchto cefalosporinů prostřednictvím produkce ß-laktamáz. Následně se ukázalo, že je výskyt infekcí způsobených těmito rezistentními bakteriemi celosvětovým problémem. Dříve byly v Evropě bakteriální infekce s rezistencí k cefalosporinům 3. a 4. generace nejčastěji způsobovány bakterií K. pneumoniae. V posledním desetiletí se ovšem situace změnila a rezistentních bakterií rapidně přibývá a to nejen v nemocnicích, ale i v kolektivech. Patogeny nesoucími geny, které kódují rezistenci k cefalosporinům 3. a 4. generace, jsou nyní především bakterie E. coli a Salmonella. Zavedení cefalosporinů 3. generace do praxe počátkem 80. let 20. století velmi napomohlo rozšíření léčebných prostředků v humánní i veterinární medicíně (Vo et al., 2007). Bohužel zanedlouho byla objevena jejich rezistence k širokospektrým cefalosporinům. Tato rezistence byla studována nejprve u lidských izolátů čeledi Enterobacteriaceae a následně i u izolátů z hospodářských zvířat. Jedinou indikací k použití cefalosporinů 3 a 4. generace u skotu je závažná mastitida se život ohrožující sepsí, která je způsobena zástupcem z čeledi Enterobacteriaceae (např. E. coli, Klebsiella) (EMEA). Cefalosporiny vyšších generací se navíc jen zřídkakdy dostanou do mléka. Možné alternativy cefalosporinů, které prokázaly odpovídající účinnost při léčbě mastitid jsou florochinolony, nebo cefalosproiny 3 a 4. generace 20

1.3.1.2.1. Cefalosporiny 3. a 4. generace – veterinární cefalosporiny s použitím u potravinových zvířat Ceftiofur Ceftiofur je širokospektré antibiotikum, které patří mezi cefalosporiny 3. generace a používá se ve veterinární oblasti (Oliver et al., 2004). Mechanismem účinku je inhibice syntézy bakteriální stěny působením na enzymy, které jsou pro syntézu buněčné stěny nezbytné. To vede k lyzi buněčné stěny a přispívá tak k baktericidním účinkům tohoto antibiotika. Ceftiofur je vhodný k léčbě subklinické mastitidy krav v období laktace způsobené rozličnými druhy bakterií. Ve Spojených státech byl ceftiofur poprvé schválen k léčbě bakteriálních infekcí skotu a ostatních zvířat v roce 1988 (Rafii et al., 2009). Po injekčním podání je hlavním metabolitem v plazmě desfuroylceftiofur, který také obsahuje β-laktamový kruh a je aktivní vůči patogenům, viz Obrázek 2. Další produkty metabolismu ceftiofuru jsou vyloučeny do stolice a moči, přičemž ne všechny metabolity v moči jsou mikrobiologicky aktivní a ty ve stolici dokonce všechny postrádají baktericidní účinek. Obrázek 2. Chemické vzorce ceftiofuru a desfuroylceftiofuru (upraveno dle Salmon et al., 1996)

21

Podobně jako ostatní cefalosporinové antimikrobiální přípravky obsahující 3-acetoxy metylovou skupinu, jako např. cefotaxim, cefalotin a cefapirin, je i ceftiofur metabolizován in vivo v krevní plazmě na desfuroylceftiofur - deesterifikovaná forma (Salmon et al., 1996). Širokospektré antibiotikum ceftiofur bylo původně využíváno k léčbě onemocnění dýchacích cest hovězího dobytka (bovinne respiratory disease – BRD). Později se začalo používat i k léčbě koní, drůbeže a prasat. Ceftiofur (ceftiofurum natricum) je schválen pro použití u skotu, prasat a koní (intramuskulární podání) k léčbě respiračních infekcí, septikémií, polyartritid a polyserositid způsobených známým patogenem (EMEA). Ceftiofur hydrochlorid je ve většině států schválen k intramuskulárnímu a subkutánnímu podání u skotu a k intramuskulárnímu podání u prasat. Ceftiofur ve formě krystalické kyseliny je účinnou látkou přípravku prozatím schváleného pro intramuskulární aplikaci prasatům. V této chvíli nejsou schváleny k používání žádné přípravky pro drůbež, které by obsahovaly cefalosporiny. Jako příklad injekčního cefalosporinu může sloužit přípravek CEFTIOMAX 50 mg/ml injekční suspenze pro prasata a skot, který obsahuje účinnou látku ceftiofur (cefalosporin třetí generace) (ÚSKVBL2). Tento přípravek je generikem léku EXCENEL RTU, který byl v ČR registrován 25. 7. 2003 pro použití u skotu a prasat. CEFTIOMAX je s indikačním omezením a je indikován u infekcí způsobených zárodky citlivými na ceftiofur hydrochlorid, a to u prasat pro léčbu bakteriálních respiračních onemocnění vyvolaných organismy Pasteurella multocida, Actinobacillus pleuropneumoniae a Streptococcus suis a u skotu pro léčbu bakteriálních respiračních onemocnění vyvolaných organismy Mannheimia haemolytica (dříve Pasteurella haemolytica), P. multocida a Histophilus somni (dříve Haemophilus somnus). Dále je indikován pro léčbu akutní interdigitální nekrobacilózy (panaritium, foot rot) spojené s infekcemi Fusobacterium necrophorum a Bacteroides melaninogenicus (Porphyromonas asaccharolytica) a léčbu akutní poporodní metritidy bakteriálního původu v období 10 dnů po otelení vyvolané infekcemi E. coli, Arcanobacterium pyogenes a F. necrophorum. Tento přípravek má ochrannou lhůtu pro maso skotu 8 dní, pro maso prasat 5 dní a je bez ochranné lhůty na mléko. V případě humánních infekcí způsobených bakteriemi E. coli či Salmonella, které jsou rezistentní k cefalosporinům 3. a 4. generace jsou alternativními možnostmi léčby karbapenemy, florochinolony či aminoglykosidy (EMEA). Zkřížená rezistence je často důvodem omezení možností léčby. Některé alternativní postupy léčby také nesou vysoké riziko nežádoucích vedlejších účinků.

22

Cefchinom Cefchinom (cefalosporin 4. generace) je v některých státech povolen pro systémové používání u skotu, prasat a koní (EMEA). Indikací k léčbě cefchinomem jsou infekce dýchacího traktu, septikémie způsobená bakterií E. coli u telat a hříbat, streptokokové infekce koní. Dále pak např. bovinní mastitida, jejíž původcem je bakterie E. coli a meningitida či artritida selat. V ČR a některých dalších EU státech jsou registrovány i intramammární přípravky jak pro laktující krávy, tak pro krávy v zaprahlosti. Důvody, proč jsou ceftiofur a cefchinom s oblibou a hojně používány, jsou široké spektrum účinku, krátká nebo dokonce nulová ochranná lhůta na mléko a možnost dlouhodobého působení v případě některých indikací. Jednou z velmi častých indikací, pro které jsou v praxi cefalosporiny 3. a 4. generace využívány je mastitida. V ČR je autorizováno několik přípravků v lékové formě určené pro intramammární použití při léčbě mastitidy. 1.3.1.2.2. Mastitida Mastitida je zánětlivé onemocnění vemene, které postihuje vysoké procento krav po celém světě (Oliver et al., 2004). Dvě hlavní formy onemocnění jsou klinická a subklinická mastitida. Klinická forma onemocnění vede ke změnám vlastností mléka a snížení jeho produkce. Zároveň se zvyšuje tělesná teplota zvířete. Vemeno následkem infekce otéká, je zarudlé. Klinická forma onemocnění je lehce rozpoznatelná a vyznačuje se typickými příznaky. Rozpoznat výskyt subklinické mastitidy je složitější, protože se objevuje bezpříznakově. Z toho důvodu zůstane subklinické onemocnění často neodhalené, ač se vyskytuje častěji než klinická forma. Intramamární subklinická onemocnění mají tendenci v organismu persistovat, což způsobí trvalý pokles produkce mléka. Přetrvávání infekce může vést k šíření patogenů z nemocných na zdravé krávy. Původci mastitidy jsou rozděleni na infekční (kontagiózní) a environmentální. Infekční patogenní bakterie žijí a množí se v mléčné žláze zvířete a jsou přenášeny mezi kravami kontaktem v období laktace. Mezi infekční patogeny patří: Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Mycoplasma sp., Corynebacterium bovis. Environmentální patogeni žijí v prostředí, kde pobývají krávy. Nejčastěji izolovaní původci mastitidy jsou streptokoky (kromě S. agalactiae) a gramnegativní bakterie. Mezi environmentální streptokoky patří S. uberis, S. dysagalactiae, S. equi a dále pak enterokoky.

23

Gramnegativní patogeni způsobující mastitidu jsou E. coli, K. pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter spp., z nichž nejčastěji se objevující jsou E. coli a K. pneumoniae. Mastitida je nejčastějším závažným onemocněním mléčného skotu a vede ve svém důsledku k velkým finančním ztrátám (Andrew et al., 2009). Některé studie dokazují, že organismus skotu může poskytnout útočiště intramamárním patogenům ještě v době před zabřeznutím. Navíc se tyto patogeny mohou v organismu udržet i v průběhu laktace. Výsledky některých studií ukázaly snížení výskytu původců mastitidy u jalovic v období březosti, které ovšem dostaly intramamárně antibiotika ještě před zabřeznutím. Studie potvrzují pravidlo, že čím těsněji před zabřeznutím se antibiotikum podá, tím vyšší je riziko obsahu reziduí v mléce. A právě vyhnutí se přítomnosti reziduí v mléce je jedním z cílů mléčného průmyslu. Uvážlivé používání antibiotik spolu s odpovídajícím intervalem vynechání dojení a kontrola množství reziduí v mléce jsou základními aspekty kvality mléka. Ochranná lhůta u přípravků podávaných dojnicím musí být specifikována jako pro maso (znamená včetně vnitřností), tak pro mléko (Pokludová et al., 2007). Ochranná lhůta je specifická pro jednotlivé přípravky, zatímco MRL (maximální limit reziduí) je hodnota specifická pro účinnou látku. Ochranná lhůta je doba, která uplyne od poslední aplikace přípravku do okamžiku, než klesne hladina reziduí pod přípustnou hodnotu , tedy pod MRL. Nízké riziko přítomnosti antibiotických reziduí v mléce je v případě, že je nasazena terapie v období zaprahlosti (dry cow therapy) a doba zaprahlosti se pohybuje v rozmezí normální délky (45-60 dnů) Andrew et al., (2009). Množství reziduí v mléce také závisí na rozpustnosti antibiotika v tucích. Antibiotika s vyšší schopnosti rozpouštět se v tucích jsou z mléčné žlázy rychleji vyloučena, a to nejspíš vlivem tkáňové absorpce. Ukázalo se tedy, že testování mléka na přítomnost antibiotických reziduí, jestliže byla kráva léčena antibiotiky před zabřeznutím, je nezbytné ke snížení rizika kontaminace mléka (Andrew et al., 2009). Proto také mlékárny provádějí standardně vyšetření na tzv. RIL (rezidua inhibičních látek) (Navrátilová, 2002). Pod pojmem inhibiční látky rozumíme látky, které svými baktericidními, případně bakteriostatickými účinky znesnadňují nebo úplně znemožňují zpracování mléka na mléčné výrobky, při jejichž výrobě se používají čisté mlékařské kultury (ČMK), např. kysané mléčné výrobky, sýry a tvarohy (Hozová, 1994). Výsledky jsou známy za několik hodin od otestování a vyhovující mléko pak lze propustit pro další průmyslové zpracování (Navrátilová, 2002).

24

1.4. Rezistence k antimikrobiálním látkám 1.4.1. Mechanismy rezistence k antibiotikům Antibiotická rezistence Většina antibiotik používaných v současné době v humánní a veterinární medicíně jsou nízkomolekulární látky schopné inhibovat růst bakterií, či je zabít (Schwarz et Chaslus-Dancla, 2001). Bakterie však přišly do kontaktu s antibiotiky již mnohem dříve, než byla první antibiotika uvedena do praxe. (viz Tabulka 3) Důvodem je přirozená tvorba látek s antibakteriálním či fungicidním účinkem bakteriemi v půdě a houbami, což jim poskytuje selektivní výhodu v boji o přežití. Nicméně v pre-klinické éře antibiotik se kontakt mezi nimi a k nim citlivými organismy uskutečňoval v daleko menší míře než dnes. Z toho důvodu se selektují rezistentní organismy, které jsou schopny uniknout inhibičním účinkům antibiotik ve větším množství než dříve. Tabulka 3. Srovnání roku objevení, uvedení do klinické práce a objevení rezistentních bakterií jednotlivých antibiotik (upraveno dle Schwarz et Chaslus-Dancla, 2001) Antimikrobiální látka

Rok objevení

Rok uvedení do klinické praxe

Rok prvního výskytu rezistentních bakterií

Penicilin

1940

1943

1940

Streptomycin

1944

1947

1947

Tetracyklin

1948

1952

1956

Kyselina nalidixová

1960

1962

1966

Fluorochinolony

1978

1982

1985

Existují tři hlavní způsoby, jak mohou bakterie získat rezistenci (podle Schwarz et Chaslus-Dancla, 2001): 1. Získání genů rezistence od producentů antibiotik Geny rezistence jsou často situovány na chromozomu, což znamená, že pokud je bakterie chtějí předat, musí tyto geny začlenit do některého z mobilních elementů (plazmidy, transpozony).

25

2. Mutace v genech důležitých pro metabolismus buňky Geny jsou upraveny tak, aby byla změněna substrátová specifita. Rozmezí substrátů se změní z metabolitů biosyntetických či biodegradativních drah pouze na antibiotika. Např. enzymy zapojené do inaktivace aminoglykosidů či chloramfenikolu, které vykazují acetyl-, adenyl- či fosforyl-transferázovou aktivitu se vyvinuly touto cestou. Enzymy inaktivují antibiotika tím, že přenesou funkční skupinu (acetyl, adenyl či fosforyl) na specifické místo daného antibiotika, čímž inhibují jejich antimikrobiální aktivitu. Další typy enzymů, jako např. β-laktamázy, esterázy či hydroxylázy, napadnou přímo molekulu antibiotika, rozštěpí ji a tím zničí. 3. Modifikace struktury cílového místa Bakterie dokáží změnit strukturu cílové molekuly pro antibiotikum buď v jediném kroku (streptomycinová rezistence) či ve více krocích (penicilinová rezistence). Chemická modifikace cílového místa, např. metylací, učiní cílové místo nedostupné pro dané antibiotikum. Ve spojitosti s tetracyklinovou rezistencí je znám mechanismus ochrany cílového místa proteiny, které zabrání navázání antibiotika do cílové struktury. 1.4.1.1. Mechanismy rezistence ß-laktamů Mechanismus antibiotického účinku cefalosporinů a cefamycinů je v podstatě stejný jako u benzylpenicilinu a ostatních ß-laktamových antibiotik, které zasahují do sestavování buněčné stěny tím, že se naváží na enzym působící na syntézu peptidoglykanu (EMEA). Tímto enzymem je transpeptidáza, nazývaná také penicilin-vázající bílkovina (PBP, penicilin-binding protein). Všechny cefalosporiny obsahují molekulu 7-aminocefalosporinové kyseliny složené z ß-laktamového kruhu nezbytného pro aktivitu a také šestičlenný dihydrothiazinový kruh (viz Obrázek 3). Varianty cefalosporinů vznikají náhradou různých skupin v některé z pozic na cefalosporinovém jádře. Cefamyciny se od cefalosporinů liší přítomností methoxy skupiny v pozici 7 cefalosporinového jádra. Cefamyciny jsou stabilní k mnoha ß-laktamázám. Obrázek 3. Obecný vzorec cefalosporinů (http://bacteriology.suite101.com/article. cfm/moa_of_cephalosporin_antibiotics)

26

Bakteriální rezistence k β-laktamům je založena v zásadě na třech mechanismech (Livermore, 2005). Jsou jimi: nepropustnost pro antibiotikum, dále pak změna struktury cílového místa a v neposlední řadě inaktivace antibiotika β-laktamázami, viz Tabulka 4. 1. Nepropustnost buněčné stěny: Propustnost vnější membrány gramnegativních bakterií a efluxní systém (umožní vylouční antibiotika ven z bakteriální buňky) jsou důležitými prvky rezistence u těchto bakterií (Li et Nikaido, 2004). Mutace a inducibilní změny vnější membrány a eflux systému způsobí rychlejší eflux (vyloučení antibiotika vně buňky) a zpomalí tím influx (průnik do buňky) antibiotika z vnějšího prostředí do buňky. Tímto je zabráněno vstupu antibiotika do buňky a navozuje tedy rezistenci různých, i strukturálně nepodobných antibiotik včetně β-laktamů. 2. Změna cílové struktury Změna ve struktuře PBP (penicilin-vázající bílkoviny) je zodpovědná za rezistenci především v případě grampozitivních bakterií (Li et al., 2007). Příkladem mohou být PBP2a bakterie S. aureus rezistentní na meticilin (MRSA) či PBP5 rezistentních bakterií rodu Enterococcus spp. 3. β-laktamázy Převažujícím mechanismem β-laktamové rezistence u gramnegativních bakterií je produkce enzymů β-laktamáz (Livermore, 1995). Zmíněné enzymy jsou kódovány geny situovanými na chromozomu či plazmidech a inaktivují β-laktamová antibiotika tím, že štěpí β-laktamový kruh penicilinů či cefalosporinů. Tabulka 4. Bakteriální mechanismy rezistence k ß-laktamům (upraveno dle Li et al., 2007) Umístění genů

Označení genů

Mechanismus

Chromozom či plazmid

Geny kódující ß-laktamázy

Chromozom

Geny kódující penicilin-vázající Modifikace proteiny místa

Chromozom

Geny kódující efluxní pumpy

Aktivní eflux nadměrnou expresí efluxních pump

Chromozom

Geny kódující poriny

Snížený influx z důvodu ztráty porinů

27

Enzymatická inaktivace struktury

cílového

1.4.1.1.1. Enzymy β-laktamázy U enterobakterií je rezistence k cefalosporinům primárně způsobena produkcí ß-laktamáz s širokým či dokonce rozšířeným spektrem účinku, to znamená se substrátovou specifitou nejen k penicilinům, ale i k cefalosporinům (EMEA). Dnes je známo několik stovek různých ß-laktamáz, přičemž jsou tyto enzymy klasifikovány dle několika hledisek. Většinou jsou rozlišovány podle funkčních vlastností dle Bushe et al., (1995) či strukturních podobností dle Amblera (1980), nebo kombinací obou. β-laktamázy jsou klasifikovány do 4 tříd dle Amblera, jsou to třídy A-D, přičemž do tříd A, C a D patří serinové enzymy a třída B zahrnuje metalo-β-laktamázy (Li et al., 2007). Lze je třídit také podle Bushe et al. do různých funkčních skupin a podskupin. Např. rezistence k cefalosporinům 3. generace může být podmíněna enzymy třídy C (tedy AmpC β-laktamázy), třídy A (ESBL jako například blaTEM, blaSHV, blaCTX-M) nebo třídy D (ESBL typu blaOXA) (Bradford, 2001). β-laktamázy CMY (cefamycinázy) Cefamycinázy jsou kódovány geny blaCMY a podobají se β-laktamáze typu AmpC (Li et al., 2007). Poprvé byly zaznamenány v 80. letech 20. století a izolovány z bakterie K. pneumoniae. Dělí se do dvou skupin – CMY-1 a CMY-2. V případě E. coli a salmonel zvířecího původu se řadí mezi nejrozšířenější plazmidem přenášené geny pro β-laktamázy. Cefamycinázy patří do třídy C (dle Amblera), jsou řazeny do funkční skupiny 1 (podle Bushe et al.) a jejich vlastností je schopnost hydrolyzovat širokospektré cefalosporiny. Nutno poznamenat, že cefamycinázy nejsou považovány za ESBL (definovány jako β-laktamázy hydrolyzující oxyiminocefalosporiny a jsou inhibovány kyselinou klavulanovou) právě z toho důvodu, že na rozdíl od ESBL vykazují aktivitu proti cefamycinům (cefoxitin) a nejsou inhibovány kyselinou klavulanovou (Bradford, 2001). Srovnání β-laktamáz typu CMY a CTX-M v Tabulce 5.

28

Tabulka 5. Charakteristika a srovnání CMY a CTX-M β-laktamáz (upraveno dle Li et al., 2007) CMY

CTX-M

Bakteriální druhy

E. coli, Salmonella spp.

E. coli, Salmonella spp. a ostatní enterobakterie

Umístění genů

Plazmid

Plazmid

Genetická spojitost Často spojeny s antimikrobiální Často spojeny s geny blaTEM-1 a rezistencí a transpozony/integrony jejich deriváty, s antimikrobiální rezistencí a transpozony/integrony Molekulární třída Třída C (Bush et al., 1995)

Třída A

Funkční skupina (Ambler, 1980)

Skupina 1

Skupina 2be

Řazen mezi ESBL

Ne

Ano

Využívané substráty

Peniciliny a cefalosproriny, včetně Peniciliny a cefalosporiny, včetně cefamycinů a oxyiminocefalosporinů a oxyiminocefalosporinů. monobaktamů. Ne cefamyciny ani karbapenemy.

Inhibitory

Aztreonam a/nebo kloxacilin. Ne Kyselina klavulanová, sulbaktam, kyselina klavulanová. tazobaktam.

1.4.1.2. ESBL Vznik rezistence k cefalosporinům u čeledi Enterobacteriaceae je zapříčiněn tvorbou enzymu β-laktamázy s rozšířeným spektrem účinku, tzn. mající substrátovou specificitu nejen k penicilinům, ale také k cefalosporinům (EMEA). Dnes je známo několik set druhů β-laktamáz. Širokospektré β-laktamázy se řadí do tříd A či D (podle Amblera) a náleží do funkční skupiny 2be, nebo 2d (Bush et al.). Nejčastěji se vyskytují β-laktamázy typu TEM, SHV, OXA a CTX-M. (Bradford, 2001). Ve většině případů izolátů pocházejících ze zvířat se objevují β-laktamázy typu CTX-M (Li et al., 2007). První objev enzymu typu CTX-M byl zaznamenán v Japonsku roku 1988 (Matsumoto, 1988). Byl izolován z laboratorního psa určeného k farmaceutickým výzkumům nových β-laktamáz. Stále zvyšující se skupina enzymů β-laktamáz typu CTX-M vykazuje nejen vysoký stupeň rezistence k amino-, karboxy-, ureido- penicilinům a cefalosporinům 1. a 2. generace, ale i k vyšším generacím cefalosporinů (Bonnet, 2004). Plazmidy kódující β-laktamázy typu CTX-M často nesou geny blaTEM, stejně jako geny rezistence k aminoglykosidům, chloramfenikolu, sulfonamidům, trimetoprimu a tetracyklinům.

29

Historie ESBL Již před objevením penicilinu existovalo povědomí o rezistenci k ß-laktamovým antibiotikům (Bradford, 2001). V začátcích používání penicilinu byl zaznamenán nárůst rezistence u bakterie Staphylococcus aureus. Důvodem této rezistence byla penicilináza kódovaná geny na plazmidu. Tato ß-laktamáza se rychle šířila mezi klinicky významnými izoláty druhu S. aureus, stejně jako mezi ostatními druhy rodu Staphylococcus. První ß-laktamáza přenosná plazmidy gramnegativních bakterií byla TEM-1, popsána v 60. letech 20. století (Datta et Kontomichalou, 1965). Tento enzym byl poprvé objeven v Řecku u bakterie E. coli izolované z krevního roztěru pacientky jménem Temoniera, proto název TEM (Medeiros, 1984). V následujících letech se ß-laktamáza TEM-1 rozšířila po celém světě a dnes je možno ji nalézt u různých druhů čeledi Enterobacteriaceae, dále u druhů Pseudomonas aeruginosa, Haemophilus influenzae a Neisseria gonorrhoeae (Bradford, 2001). Další ß-laktamázou, která je přenosná plazmidy, je SHV-1 (odvozeno od „sulphydryl variable“) (Bradford, 2001). Nalézá se u druhů K. pneumoniae a E. coli. ß-laktamáza SHV-1 je u druhu K. pneumoniae ve většině případů kódována geny na chromozomu, zatímco u izolátů E. coli je SHV-1 přenosná většinou plazmidy. Roku 1983 byla objevena první β-laktamáza, pojmenovaná SHV-2, schopná rozkládat širokospektré cefalosporiny (Knothe et al., 1983). Proto označení širokospektré β-laktamázy. ESBL poskytují svému hostiteli navíc rezistenci k cefalosporinům 3. a 4. generace. Nejstarší záznam o výskytu β-laktamáz typu CTX-M pocházejících z potravinového zvířete je znám ze Španělské studie (Briñas, 2003). Izoláty E. coli s geny blaCTX-M byly získány ze vzorků stolice zdravých kuřat. Izoláty vykazovaly kromě penicilinů také vysoký stupeň rezistence k cefotaximu, ceftazidimu a ceftriaxonu. V posledních 20 letech bylo vyvinuto mnoho nových ß-laktamových antibiotik navržených tak, aby byly odolné k hydrolytické aktivitě enzymů ß-laktamáz (Bradford, 2001). Nicméně s každým použitím těchto nových antibiotik k léčbě pacientů vznikaly další nové ß-laktamázy rezistentní k dané skupině léků. Podle všeho selekční tlak při užívání a nadužívání nových antibiotik vedl ke vzniku nových variant ß-laktamáz. Charakteristika ESBL Většina ESBL obsahuje ve svém aktivním místě aminokyselinu serin a patří do třídy A (Ambler, 1980). Enzymy třídy A jsou tedy typické aktivním místem obsahující serin, molekulovou hmotností přibližně 29 000 Da (Dalton) a přednostně hydrolyzují peniciliny.

30

Tato třída enzymů zahrnuje například ß-laktamázu typu TEM-1, SHV-1 nebo penicilinázu bakterie S. aureus. Jiná klasifikace (Bush et al., 1995) využívá biochemických vlastností enzymu spolu s molekulární strukturou a sekvencí nukleotidů genu. ß-laktamázy rozděluje do několika funkčních skupin. S použitím této klasifikace jsou ESBL definovány jako ß-laktamázy schopné hydrolyzovat oximinocefalosporiny, které jsou však inhibovány kyselinou klavulanovou a patří do funkční skupiny 2be. Dále je definována skupina 2d, která má jako hlavní substráty peniciliny, oxaciliny a cefalosporiny kromě cefamycinů. Typy ESBL (Bradford, 2001) Většina širokospektrých ß-laktamáz je odvozena od enzymů TEM a SHV. Enzymy TEM a SHV se nejčastěji objevují u bakterií E. coli a K. pneumoniae, ale mohou se vyskytnout také u rodů Proteus, Providencia nebo u jiných druhů čeledi Enterobacteriaceae. •

TEM

Více než 90 % rezistencí na antibiotikum ampicilin u bakterie E. coli je způsobeno právě produkcí enzymu TEM-1. Je zodpovědný také za rezistenci k ampicilinu a penicilinu u bakterií H. influenzae a N. gonorrhoeae. TEM-3, objevena roku 1989, byla první ß-laktamázou typu TEM, která se projevovala fenotypem ESBL. V následujících letech bylo popsáno ještě dalších asi 90 ß-laktamáz typu TEM. Inhibitor-Resistant ß-lactamases Přestože Inhibitor-Resistant ß-laktamázy nejsou ESBL, jsou často zmiňovány společně právě proto, že jsou odvozeny od laktamáz typu TEM a SHV. IR ß-laktamázy byly objeveny počátkem 90. let 20. století. Jsou odolné vůči inhibičnímu účinku kyseliny klavulanové. Sekvenování odhalilo, že IR ß-laktamázy jsou varianty TEM-1 a TEM-2 ß-laktamáz. Původně dostaly název IRT (Inhibitor-Resistant TEM ß-lactamases), ale později byly přejmenovány na TEM s číselným označením. Můžeme je nalézt v klinických izolátech bakterií E. coli, K. pneumonie, K. oxytoca, Proteus mirabilis a Citrobacter freundii. I když jsou IR ß-laktamázy rezistentní k inhibičním účinkům kyseliny klavulanové a sulbaktamu, stále zůstávají citlivé k tazobktamu a následně i kombinaci piperacilinu s tazobaktamem. 31

•

SHV

ß-laktamázy typu SHV-1 se nejčastěji vyskytují u bakterie rodu K. pneumoniae. Na rozdíl od typu TEM mají ß-laktamázy typu SHV-1 poměrně málo derivátů. U většiny variant SHV, které vykazují fenotyp ESBL, nalézáme náhradu aminokyseliny serinu za glycin v pozici 238 či nahrazení aminokyseliny lysinu za glutamin v pozici 240. Serin v pozici 238 je významný pro účinnou hydrolýzu antibiotika ceftazidimu, zatímco lysin v pozici 240 je zodpovědný za hydrolýzu cefotaximu. •

OXA

Dalším skupinou ß-laktamáz jsou enzymy typu OXA. Na rozdíl od typu TEM a SHV patří do molekulární třídy D a funkční skupiny 2d. ß-laktamázy typu OXA propůjčují bakteriím rezistenci k ampicilinu a cefalotinu, charakteristické jsou hydrolytickou aktivitou vůči oxacilinu a cloxacilinu a skutečností, že jejich účinek je jen slabě inhibován kyselinou klavulanovou (Bush et al., 1995). Původně byla tato skupina ß-laktamáz navržena spíše na základě podobného fenyotypu než genotypu, proto zde nalezneme jen asi 20 % sekvenční homologii mezi jednotlivými členy skupiny (Bradford, 2001). Zatímco ostatní typy širokospektrých ß-laktamáz se nacházejí u bakterií rodu E. coli, K. pneumoniae, jakož i u dalších zástupců čeledi Enterobacteriaceae, širokospektré ß-laktamázy typu OXA se vyskytují převážně u Pseudomonas aeruginosa. Zatímco u transkonjugantů E. coli typ OXA poskytuje pouze slabou rezistenci k oxyiminocefalosporinům, bakterii P. aeruginosa propůjčují mnohem vyšší stupeň rezistence. •

CTX-M

V nedávných letech byla objevena nová rodina ESBL s názvem CTX-M (CefoTaXime, poprvé izolováno v Mnichově). Jsou přenosné plazmidem a přednostně hydrolyzují cefotaxim. Tyto enzymy byly nalezeny především u bakterií Salmonella enterica serovar Typhimurium a E. coli. Enzymy typu CTX-M nejsou příliš podobné typům TEM a SHV a byla u nich nalezena jen asi 40 % shoda. Ukázalo se, že ß-laktamázy typu CTX-M hydrolyzují antibiotika cefalotin či cefaloridin lépe než benzylpenicilin. Přednostně však štěpí cefotaxim a ceftazidim, přičemž preferují hydrolýzu cefotaximu. I přesto, že CTX-M jsou enzymy štěpící ceftazidim, většinou není hydrolýza tohoto antibiotika natolik účinná, aby poskytla klinickou rezistenci k ceftazidimu organismu, ve kterém se právě CTX-M nacházejí. Jejich specifickou vlastností je, že jsou lépe inhibovány tazobaktamem než sulbaktamem či solí kyseliny klavulanové.

32

Enzymy patřící do třídy CTX-M se dále dělí do několika skupin. Skupiny se mezi sebou liší v sekvencích aminokyselin (Cartelle et al., 2004). •

Skupina CTX-M-1 zahrnuje: CTX-M-1 nebo MEN-1, CTX-M-3, CTX-M-10, CTX-M-12, CTX-M-15 a CTXM-32

•

Skupina CTX-M-2 zahrnuje: CTX-M-2, CTX-M-4, CTX-M-5, CTX-M-6, CTX-M-7, CTX-20, a Toho-1

•

Skupina CTX-M-8

•

Skupina CTX-M-9 zahrnuje: CTX-M-9, CTX-M-13, CTXM-14, CTX-M-16, CTX-M-18, CTX-M-19, CTX-M-21, a Toho-2

•

Skupina CTX-M-25 zahrnuje: CTX-M-25 a CTX-M-26 (Bonnet, 2004)

Geny blaCTX-M zodpovědné za rezistenci k β-laktamázám jsou kódovány plazmidy, které patří do jedné ze dvou skupin (Carattoli et al., 2005). Patří buď do skupiny plazmidů s úzkým rozmezím hostitelů (inkompatibilní skupiny např. IncFI, IncFII, IncHI2 nebo IncI) nebo se širokým rozmezím hostitelů (inkompatibilní skupiny např. IncN, IncP-1-a, IncL/M či IncA/C). Ostatní ESBL I když většina ESBL je odvozena od typů TEM a SHV, existují i jiné typy ß-laktamáz (Bradford, 2001). Jsou to například PER 2, VEB-1, TLA-1, CME-1 či GES-1. Typy SHV a TEM jsou si blízce příbuzné, přičemž všechny ze třídy A jsou si vývojově bližší než se kteroukoliv ß-laktamázou typu OXA patřící do třídy D. Geny kódující širokospektré ß-laktamázy se často nacházejí na genetických strukturách, které jsou přenosné (EMEA). Mohou to být velké přenosné plazmidy, transpozony či integrony. Integrony jsou genetické elementy, které obvykle nesou genovou kazetu s geny pro rezistenci k antibiotikům.

33

1.5. Mechanismy přenosu rezistence 1.5.1. Horizontální přenos genů (Schwarz et Chaslus-Dancla, 2001) Šíření rezistence mezi jednotlivými bakteriálními druhy či dokonce rody je velmi často způsobeno právě horizontálním přenosem genů. Mezi elementy, které přispívají k přenosu genů rezistence, řadíme plazmidy, transpozony či integrony a genové kazety. Všechny tyto typy elementů jsou tvořeny dvouvláknovou DNA, nicméně liší se svou velikostí, strukturou, biologickými vlastnostmi a způsobem přenosu. 1.5.1.1. Plazmidy, transpozony, IS elementy, integrony, genové kazety, GI Plazmidy Plazmidy jsou extrachromozomální elementy nalezené u většiny klinicky i veterinárně významných patogenních druhů bakterií. Nacházejí se mimo jiné i u bakterií osídlujících kůži a sliznice lidí i zvířat. Velikost plazmidů se pohybuje v rozmezí od 2 kbp až po více než 100 kbp. Tyto elementy jsou schopny autonomní replikace uvnitř buňky. Dělí se do inkompatibilních skupin dle stupně příbuznosti. Vlastnosti, které buňce poskytuje plazmid, nejsou nezbytné k přežití bakterie, ale udílí buňce nové, často výhodné vlastnosti, které umožní bakterii lépe přežít v daných podmínkách. Mezi tyto výhody se řadí rezistence k antibiotikům, desinfekčním přípravkům, těžkým kovům apod. Určité typy plazmidů mají také virulentní a fertilitní funkce. Plazmidy mohou tvořit kointegráty s jinými plazmidy, či se mohou začlenit nebo být začleněny do chromozomu. Významnou roli hrají také jako vektory přenášející transpozony či integrony a genové kazety. Velké plazmidy mohou nést geny tra, což jim umožňuje přemisťovat se svépomocí do jiných bakterií. Tento typ plazmidů je označován jako konjugativní. Transpozony Na rozdíl od plazmidů nemají transpozony svůj replikační systém, tudíž je pro jejich udržení v buňce nutné, aby se integrovaly do chromozomu či plazmidu. Transpozony mají velikost 1 - 60 kbp a liší se navzájem strukturou. Nejmenší z transpozonů, známé jako inzerční sekvence, obsahují pouze geny pro enzym transponázu (zodpovědný za vyčlenění a začlenění transpozonu). Větší transpozony už obvykle nesou i další geny, většinou kódující antibiotickou 34

rezistenci. Transpozony se obvykle nezačleňují do specifických sekvencí, což znamená, že se mohou začlenit do jakéhokoliv místa na chromozomu či plazmidu. Mnoho genů antibiotické rezistence je situováno na plazmidech a transpozonech, což umožňuje přenos těchto genů mezi rozdílnými bakteriálními druhy (Lévesque et al., 1995). Dalším mechanismem přenosu, kromě konjugace a transpozice, je místně specifická rekombinace. Právě tímto způsobem se přenášejí integrony. Integrony a genové kazety Genové kazety jsou malé mobilní elementy o velikosti do 2 kbp a dosud byly nejčastěji nalézány pouze u gramnegativních bakterií. Práce z posledních let však prokazují výskyt rovněž u některých grampozitivních bakterií. Zástupci grampozitivních bakterií s genovými kazetami jsou např. Corynebacterium glutamicum (Nešvera et al., 1998) a Rhodococcus opacus (Nagy et al., 1997). Genové kazety obsahují místa pro specifickou rekombinaci a jeden gen, nejčastěji pro rezistenci k antibiotiku (Schwarz et Chaslus-Dancla, 2001). Genové kazety se liší od plazmidů tím, že nemají svůj vlastní replikační systém a na rozdíl od transpozonů nejsou schopny transpozice. Častokrát je můžeme nalézt v určitém místě integronu. Integrony jsou přirozeně se vyskytující vektory, u kterých probíhá inzerce genů kódujících antibiotickou rezistenci mechanismem místně specifické rekombinace (Lévesque et al., 1995). Integrony obsahují dvě konzervativní oblasti (Schwarz et Chaslus-Dancla, 2001). Jedna z nich, 5´-oblast, kóduje enzym integrázu. Integráza umožní integronu začlenit místně specifickou rekombinací genovou kazetu. Druhá z nich, 3´-oblast, může obsahovat další geny rezistence (gen sul1 zodpovědný za rezistenci k sulfonamidům). Obě konzervativní oblasti jsou odděleny úsekem DNA, který obsahuje geny kódující antibiotickou rezistenci či genové kazety s neznámou funkcí (Lévesque et al., 1995). Integrony a geny rezistence (EMEA) Izoláty rezistentní k cefalosporinům jsou také často rezistentní k chinolonům a nezřídka nesou integrony obsahující geny, které kódují rezistenci k antibiotikům. Tato skutečnost omezuje léčebné možnosti. Integrony obsahují genetické determinanty, které umožní rozpoznat genom jiné bakterie a začlenit do něj mobilní genetické kazety. Mezi třemi doposud známými typy integronů, které se vyskytují u bakterií čeledi Enterobacteriaceae, jsou integrony třídy 1 (class 1) nejvýznamnější.

35

Nebezpečí šíření rezistence navíc ještě vzroste v případě, že se zmíněné genetické determinanty nacházejí na přenosném plazmidu. 1.5.2. Způsoby přenosu genů (Schwarz et Chaslus-Dancla, 2001) Geny se mohou šířit horizontálně, prostřednictvím transpozonů, plazmidů, integronů či genových kazet (viz výše), ale i vertikálně dělením mateřské buňky. Geny rezistence se mohou přenášet také transdukcí, konjugací a transformací. Transdukce Transdukce je přenos genů prostřednictvím bakteriofágů (viry bakterií). V jednom případě je fágová DNA injikována do hostitelské buňky a začne produkovat nové fágové částice, tedy viriony (infekční částice). Tento proces je ukončen lyzí hostitelské buňky a uvolněním virionů do okolí. Ve druhém případě se může fágová DNA začlenit do chromozomu hostitelské buňky jako profág a po dlouhou dobu zůstat v inaktivním stavu (lyzogenní cyklus). Fyzikální stimulátory jako např. UV záření způsobí aktivaci profága a jeho vstup do lytického cyklu, který zapříčiní lyzi buňky. Přenos genů rezistence je umožněn tím, že se nacházejí na chromozomu v blízkosti fágové DNA. V případě, že je fág vyčleněn nepřesně, jsou geny rezistence vyčleněny společně s fágem a šíří se tak mezi bakteriemi. Podobně plazmidy nesoucí geny rezistence mohou být náhodně sbaleny do fágové hlavičky namísto vlastní fágové DNA. Vznikají pseudofágy schopné infikovat buňku a napomáhat tak šíření rezistence. Pro přenos fága je nutné, aby měla bakteriální buňka vhodné receptory pro přichycení fága. Konjugace Konjugace je přenos DNA z buňky donorové do buňky recipientní prostřednictvím konjugativních plazmidů či transpozonů. Na rozdíl od transdukce a transformace je k samotné konjugaci vyžadován kontakt buněk. Konjugativní plazmidy mají geny tra a další, nutné k přenosu. Menší plazmidy, které tyto geny nemají, mohou být taktéž přeneseny. Tento proces je nazýván mobilizace a podmínkou je, aby měl malý plazmid místo oriT (origin of transfer). Konjugativní plazmidy a transpozony byly pozorovány u grampozitivních i gramnegativních bakteriálních patogenů.

36

Transformace Přenos volné DNA z donorové do kompetentní recipientní buňky je popisován jako transformace. Transformace je důležitým mechanismem dopravení plazmidů do buněk in vitro a je velmi často používána v oblasti genového inženýrství. I když je volná DNA velmi náchylná k degradaci okolními podmínkami, přesto je umělá transformace jednou z nejpoužívanějších metod vnesení plazmidu do buněk. Navíc je známo, že ne všechny bakterie jsou schopny přirozené transformace, což je další důvod k využití transformace umělé. 1.5.3. Přenos rezistentních bakterií mezi zvířaty a lidmi Slovo zoonóza je složeno z řeckých slov „zoon“ – zvíře a „nosos“ – onemocnění, choroba (Krauss et al., 2003). Zoonóza je definována jako jakákoliv nemoc či infekce, která je přirozeně přenosná mezi obratlovci (zvířaty) a člověkem, přičemž směr přenosu není určen. Proto byla tato definice upřesněna zavedením pojmů zooantroponóza (přenos nemoci ze zvířete na člověka, jako např. vzteklina) a antropozoonóza (přenos z člověka na zvíře, jako např. tuberkulóza). Původci zoonózy mohou být viry, bakterie, priony, parazité či houby. Existují 3 modely přenosu ze zvířat na lidi: (graficky znázorněno na Obrázku 4), (Moodley, 2008) •

Přenos potravinami

(konzumace kontaminovaného jídla, či pití kontaminované vody) Infekce z potravin jsou nejčastěji způsobovány bakteriemi, které se do těla člověka dostanou požitím kontaminovaného jídla či pití a jsou spojovány hlavně s průjmovými onemocněními. Nejběžnějšími infekcemi jsou salmonelóza, kampylobakterióza, shigellóza a infekce způsobené bakterií E. coli (enterotoxigenní, enterohemoragickou, enteropatogenní a dalšími). Potravinové infekce jsou důsledkem konzumace nedostatečně tepelně upraveného masa, vajec či mléka, dále pak kontaminace během přípravy jídel (kuchyňské povrchy, kontakt syrového masa a zeleniny). • (přímé

Přímý přenos vystavení

se

zvířatům,

která

jsou

kolonizována

či

infikována

přenosnými

mikroorganismy) Za přímý přenos bakterií mezi zvířaty a lidmi je považován dotek, zvířecí kousnutí či škrábnutí apod. Místa, kde lidé přijdou do kontaktu se zvířaty, jsou obecně považována za 37

rizikové pro vznik zoonózy. Domácí zvířata jsou často infikována požitím kontaminované potravy, z prostředí či od ostatních zvířat. Neméně důležitou skupinou lidí jsou pacienti, kteří jsou součástí léčebného programu zahrnujícího kontakt se zvířaty. Tato zvířata se ukázala být nosiči např. bakterie E. coli produkující ESBL, salmonel či toxigenní Clostridium difficile. Rizikovou skupinou jsou samozřejmě také farmáři, ošetřovatelé či veterináři. •

Přenos prostředím

(nepřímý přenos přes kontaminované prostředí) Ohnisko nákazy bývá často spojeno s požitím ovoce a syrové zeleniny, které jsou kontaminovány střevním obsahem zvířat používaným jako hnojivo. Zvířata ve volné přírodě, jako např. ptáci či bezobratlí, mohou být rezervoáry rezistentních bakterií a kontaminovat např. zeleninu rostoucí na zahrádce či na poli. Obrázek 4. Grafické znázornění modelů přenosu rezistentních bakterií ze zvířat na lidi (upraveno dle Moodley, 2008)

1.5.4. Mléčné filtry (Čížek et al., 2008) Mléčný filtr se ukázal být vhodným typem vzorku pro sledování výskytu původců alimentárních infekcí (infekce z potravin a otravy) člověka. V mléčných filtrech je možno nalézt kontaminující materiál z okolního prostředí stáje, ze zvířat či z dojících zařízení. To může poskytnout orientační výsledky o situaci výskytu původců alimentárních nákaz na farmě. 38

Bakterie získané z mléčných filtrů mohou navíc sloužit jako ukazatelé úrovně získané rezistence k antibiotikům. Některé komenzální bakterie se vlivem selekčního tlaku antibiotik vyvinuly ve významné původce nosokomiálních nákaz (např. Enterococcus faecalis, E. faecium). Proto je důležité omezit spotřebu antibiotik u potravinových zvířat a eliminovat možné riziko šíření rezistentních kmenů bakterií potravním řetězcem do lidské populace. Bakterie E. coli je vhodným ukazatelem, na kterém se účinky antibiotik projeví rychlou selekcí a šířením rezistentních klonů. U některých izolátů E. coli byla také prokázána přítomnost integronů třídy 1, tedy genetických elementů obsahujících tzv. genové kazety. Kazety mohou obsahovat různý počet genů pro rezistenci.

1.6. Bakterie čeledi Enterobacteriaceae 1.6.1. Rod Escherichia Tento rod zahrnuje gramnegativní rovné tyčinky vyskytující se jednotlivě a ve dvojicích (Sedláček, 2007). Mohou se pohybovat pomocí peritrichálních bičíků či být nepohyblivé, jsou fakultativně anaerobní, chemoorganotrofní a mají jak respiratorní tak i fermentatorní typ metabolismu. Optimální růstová teplota je 37 oC, rostou na běžných půdách, jejich biochemická aktivita je vysoká. Okyselují glukózu a jiné sacharidy za tvorby plynu. Z dalších vlastností lze uvést, že zástupci rodu Escherichia jsou oxidáza negativní, kataláza pozitivní, metylčerveň pozitivní, citráty většinou negativní. 1.6.1.1. Escherichia coli Doména: Bacteria Kmen: Proteobacteria Třída: Gammaproteobacteria Řád: Enterobacteriales Čeleď: Enterobacteriaceae Rod: Escherichia Druh: Escherichia coli

39

Kmeny Escherichia coli se vyskytují jako normální střevní mikroflóra savců (Sedláček, 2007). Produkují enterotoxin a/nebo jiné stimulátory virulence, způsobují průjmová onemocnění. Tento druh E. coli je také hlavním původcem infekcí močových cest a nozokomiálních infekcí včetně septikémií a meningitid. Epidemiologicky patogenní kmeny jsou charakterizovány a identifikovány sérologicky na základě somatických (O), kapsulárních (K) a bičíkových (H) antigenů. Escherichia coli se vyskytuje ve střevní mikroflóře obratlovců, slouží zde jako užitečný komenzál (neškodný parazit, který se živí zbytky potravy hostitele).

40

2. CÍLE PRÁCE

•

Shrnout dostupné informace o prevalenci producentů ESBL v oblasti humánní a veterinární medicíny včetně údajů pro Českou republiku a střední Evropu, zvláště se zaměřením na dostupné údaje z veterinární oblasti v České republice

•

Zjistit situaci ve spotřebě antimikrobiálních látek ze skupiny cefalosporinů, které jsou registrovány ve veterinárních léčivých přípravcích v rámci České republiky

•

Získat informace o výskytu kmenů produkujících enzym β-laktamázu se širokým spektrem účinku (ESBL) v chovech skotu v České republice (zastoupení ESBL+ kmenů, genetická typizace) a z dostupných zdrojů informace z regionu střední Evropy

41

3. METODIKA

3.1. MIKROORGANISMY Odebrané izoláty •

514 izolátů Escherichia coli a koliformních bakterií, které byly získány z farem mléčného a masného skotu v ČR o 311 izolátů z farmy v Těšanech (Jihomoravský kraj, ČR) o 203 izolátů ze zemědělské správy Heroltovice středisko Luboměř pod Strážnou (Moravskoslezský kraj, ČR) - od dubna 2009 certifikovaný ekologický chov skotu

Kontroly a referenční kmeny, recipienti •

Salmonella Braenderup H9812

- PFGE

•

Klebsiella pneumoniae ATCC 700603

- DDST

•

Escherichia coli ATCC 25922.

- DDST

•

Escherichia coli 39R861

- izolace plazmidové DNA

•

Escherichia coli MT 102

- konjugace

•

Salmonella Typhimurium SL 5325

- konjugace

Chemicky kompetentní buňky E. coli DH5α – komerčně dodávané (InvitrogenTM Life Technology (USA)

- transformace

3.2. KULTIVAČNÍ MÉDIA A ROZTOKY Kryoprotektivní (zamražovací) médium Složení: 43,5 ml glycerolu (Fakultní lékárna FaF, VFU, ČR), 50 ml 1,5 % BactoPeptonu (Difco, USA), 6,5 ml destilované vody

42

MacConkey agar – MCA (Oxoid, Velká Británire) Složení: 20 g/l peptonu, 10 g/l žlučových solí, 1,5 g/l NaCl, 0,03 g/l neutrální červeni, 0,001 g/l krystalové violeti, 15 g/l agaru MacConkey bujón (Oxoid, Velká Británie) Složení: 20 g/l peptonu, 10 g/l laktózy, 5 g/l žlučových solí, 5 g/l NaCl, 0,075 g/l neutrální červeni Masopeptonový agar – MPA (Columbia blood agar base, Oxoid, Velká Británie) Složení: 23 g/l peptonu, 1 g/l škrobu, 5 g/l NaCl, 10 g/l agaru BrillianceTM E. coli / coliform medium - Chromogenní médium (Oxoid, Velká Británie) Složení: 5 g/l peptonu, 2,5 g/l laktózy, 3 g/l kvasničného extraktu, 5 g/l NaCl, 0,03 g/l neutrální červeni, 3,5 g/l hydrogenfosforečnanu sodného - Na2(HPO4), 1,5 g/l dihydrogenfosforečnanu draselného K(H2PO4), 15 g/l agaru, 20,3 g/l chromogenní směsi Mueller-Hinton agar – M-H (Oxoid, Velká Británie) Složení: 300 g/l hovězího extraktu, 17,5 g/l kaseinového hydrolyzátu, 1,5 g/l škrobu, 17 g/l agaru Luria-Bertani agar – LB agar (Difco, Francie) Složení: 10 g/l tryptonu, 5 g/l kvasničného extraktu, 10 g/l NaCl, 15 g/l agaru Luria-Bertani bujón - LBB (Difco, Francie) Složení: 10 g/l tryptonu, 5 g/l kvasničného extraktu, 10 g/l NaCl Brain Heart Infusion bujón – BHI (Oxoid, Velká Británie) Složení: 12,5 g/l telecího mozkového extraktu, 10 g/l peptonu (proteose peptone), 2 g/l glukózy, 5 g/l NaCl, 2,5 g/l hydrogenfosforečnanu sodného - Na2(HPO4) Média byla připravena podle instrukcí výrobce. (The Oxoid Manual. 1998. 8th edition. Oxoid Limited, UK, p. 116 ) Pufrovaná peptonová voda (Oxoid, Velká Británie) Složení: 10 g/l peptonu, 5 g/l NaCl, 3,5 g/l hydrogenfosforečnanu sodného - Na2(HPO4), 1,5 g/l dihydrogenfosforečnanu draselného - K(H2PO4) Pufrovaný fyziologický roztok - PBS Složení: 0,85 g NaCl, 0,07 g K(H2PO4), 0,015 g NaOH (vše Lachema, ČR), navážka byla doplněna destilovanou vodou do objemu 100 ml, pH připraveného roztoku musí být 7,2 – 7,3.

43

TBE – pufr I Složení: 53,90 g 0,089M Tris-base (Sigma-Aldrich, USA), 27,514 g kyseliny borsírové (SigmaAldrich, USA); 3,722 g 0,002M EDTA Na2·2H2O (Sigma-Aldrich, USA); navážku doplnit destilovanou vodou do objemu 1000 ml a přidat 11 ml 5N HCl (Lachema, ČR), aby pH vzniklého pufru bylo 8,0. Pufr se před použitím ředí destilovanou vodou v poměru 1:9. Roztoky pro PFGE Zásobní roztoky •

1M Tris (pH 8)

Tris-base (Sigma-Aldrich, USA)

121,14 g

sterilní deionizovaná voda

do 1000 ml

Postup: navážku 121,14 g Tris rozpustit v 800 ml destilované vody, pomocí neředěné HCl upravit pH (asi 15 –20 ml) a doplnit do objemu 1000 ml, autoklávovat při 121 °C po dobu 20 minut. •

0,25 M EDTA (pH 8)

EDTA (Sigma-Aldrich, USA)

93,06 g

sterilní deionizovaná voda

do 1000 ml

Postup: navážku 93,06 g rozpustit v 800 ml destilované vody, přidáním pevného NaOH (až 20 g) upravit pH a doplnit do finálního objemu, autoklávovat při 121°C po dobu 20 minut. •

10x TBE pufr II (pH 8)

Tris-base (Sigma-Aldrich, USA)

107,6 g

kyselina boritá H3BO3 (Sigma-Aldrich, USA)

55,03 g

0,5M EDTA (Sigma-Aldrich, USA)

7,44 g

sterilní deionizovaná voda

do 1000 ml

•

20 % Sodium dodecyl sulfát - SDS

SDS (Sigma-Aldrich, USA)

5g

sterilní deionizovaná voda

20 ml

44

•

Proteináza K (20 mg/ml)

proteináza K (Serva, Německo)

100 mg

sterilní deionizovaná voda

5 ml

spotřeba – 45 µl / vzorek, rozplnit do menších objemů (např. 250 µl) a uchovávat při –20°C •

Ethidium bromid (10 mg/ml)

EtBr (Top Bio, ČR)

1g

Sterilní deionizovaná voda

do 100 ml

(uchovávat v chladu a temnu) Pracovní roztoky •

TE pufr (10 mM Tris : 1 mM EDTA, pH 8)

1 M Tris (Sigma-Aldrich, USA)

10 ml

0,25 M EDTA (Sigma-Aldrich, USA)

4 ml

sterilní deionizovaná voda

do 1000 ml

•

CSB – Cell Suspension Buffer (100 mM Tris: 100 mM EDTA, pH 8)

1 M Tris (Sigma-Aldrich, USA)

10 ml

0,25 M EDTA (Sigma-Aldrich, USA)

40 ml

sterilní deionizovaná voda

do 100 ml

•

CLB – Cell Lysis Buffer (50 mM Tris: 50 mM EDTA, pH 8 + 1 % Sarcosylu)

1% Sarcosyl (Sigma, USA)

5g

1 M Tris (Sigma-Aldrich, USA)

25 ml

0,25 M EDTA (Sigma-Aldrich, USA)

100 ml

sterilní deionizovaná voda

do 500 ml

•

2% agaróza – příprava bločků

agaróza SeaKem Gold (Lonza, USA)

0,32 g

10x TE pufr (sterilní)

20 ml

(zahřívat v mikrovlnné troubě na 600 W po dobu 1-2 min.)

45

Enzymy a ostatní - PFGE •

Enzym XbaI – 40 U/ul (Takara, Japonsko) 5'...T^C T A G A...3'

původ: Xanthomonas badrii

3'...A G A T C^T ...5' •

Nukleáza S1 – 98 U/µl (Promega, USA) - štěpí jednořetězce od 5´konce

původ: Aspergillus oryzae

•

Hovězí sérový albumin – BSA (Takara, Japonsko)

•

10x M pufr (Takara, Japonsko)

•

S1 reakční pufr 10x (Promega, USA)

Enzymy a ostatní – RFLP •

Enzym EcoRV - 50 U/μl (Takara, Japonsko) 5´… G A T^A T C …3´

původ: E. coli, která nese gen

3´… C T A^T A G …5

z plazmidu J62 pLG74

•

Hovězí sérový albumin – BSA (Takara, Japonsko)

•

10x M pufr 3 (Takara, Japonsko)

Roztoky pro izolaci plazmidové DNA •

lauryl sulfát - SDS (Sigma-Aldrich, USA)

•

lysozym (Amreco, USA)

•

roztok č.1 – 0,901 g 50 mM glukózy, 0,372 g 10 mM EDTA, 0,303 g 25 mM Tris-base, doplnit destilovanou vodou do objemu 100 ml (pH 8)

•

roztok č.2 – SDS v 0,2 N NaOH (1 % roztok SDS)

•

roztok č.3 – 40,824 g 3 M Na-acetátu, doplnit destilovanou vodou do objemu 100 ml, pH 4,8

•

roztok č.4 (TE pufr) – 0,605 g 10 mM Tris-base (Sigma-Aldrich, USA), 0,185 g 1 mM EDTA (Sigma-Aldrich, USA), 350 ml sterilní destilované vody, pH 8

•

Fenol-chloroform-isoamylalkohol 25:24:1 (Fluka, Sigma-Aldrich, USA)

•

STOP mix – 7,5 ml glycerolu, 1 ml Evans Blue 1:100 (Sigma-Aldrich, USA)

46

Komponenty pro PCR a gelovou elektroforézu •

DNA markery (BioLabs) – viz Obrázek 1-příloha

100 bp DNA ladder, 100-1500 bp

– testování genů rezistence, Inc skupiny plazmidů

2-log DNA ladder, 0,1-10 kb

– testování integronů, RFLP

•

PCR voda (Top Bio, ČR)

•

PPP Master Mix (Taq-Purple DNA polymeráza PCR Master Mix s MgCl2) (Top Bio, ČR)

Složení: 150 mM Tris-Cl, 40 mM (NH4)2SO4, 0,02% Tween 20, 5 mM MgCl2, 400 μM dATP, 400 μM dCTP, 400 μM dGTP a 400 μM dTTP, 100 U/ml Taq-Purple DNA polymeráza, stabilizátory a aditiva, pH 8,8 •

PCR primery nasyntetizovány firmou InvitrogenTM Life Technology (USA) (seznam primerů viz Tabulka 1–příloha)

Sada pro biochemickou identifikaci API 10S •

Identifikační souprava API 10S (bioMérieux, Francie)

•

API suspenzní médium – 5 ml (bioMérieux, Francie)

•

reagencie – THAMES, TDA a činidla NIT1 a NIT2 (bioMérieux, Francie)

Antibiotika pro konjugace u ESBL+ izolátů / transformace (Sigma-Aldrich, USA) •

kyselina nalidixová - Nal (zásobní koncentrace 20 mg/ml, výsledná 32 mg/l)

•

rifampicin – Rif (zásobní koncentrace 125 mg/ml, výsledná 25 mg/l)

•

cefotaxim – CTX (zásobní koncentrace 2 mg/ml, výsledná 2 mg/l )

•

azid sodný – Azid (zásobní koncentrace 200 mg/ml, výsledná 200 mg/l)

Antibiotické disky pro diskovou difúzní metodu (Oxoid, Velká Británie) amoxicilin-kyselina klavulanová (AMC, 30/20+10 μg), ampicilin (AMP, 10 μg), cefotaxim (CTX, 30 µg), ceftazidim (CAZ, 30 μg), cefalotin (KF, 30 μg), ciprofloxacin (CIP, 5 μg), gentamicin (GN, 10 μg), chloramfenikol (C, 30 μg), kyselina nalidixová (NA, 30 μg), streptomycin (S, 30 μg), sulfonamidy (S3, 300 μg), tetracyklin (TE, 30 μg), trimethoprimsulfametoxazol (SXT, 1,25/23,7 μg)

47

3.3. PŘÍSTROJE •

termostat Sanyo MIR-153 (Sanyo, Japonsko)

•

fotometr (Densi-La-Meter, LIAP, Litva)

•

chlazená odstředivka Micro 22 R (Hettich, Německo) / centrifuga MC 6400 (Wiggenhauser, Tajvan)

•

autokláv PS 20A (Chirana, ČR) / Stolní autokláv IP 44 (CertoClav, Rakousko)

•

PCR-box UV4 PCR (SCIE-PLAS, Velká Británie) / Laminární box II. bezpečnostní třídy (Steril Antares, Itálie)

•

transiluminátor Ultra Lum MUVB-15 (Claremont, USA)

•

fotoaparát Camedia C –5060 (Olympus)

•

PFGE system CHEF-DR III (Bio-Rad, USA)

•

termocycler XP cycler (BIOER, Čína) / Life express (BIOER, Čína)

•

spektrofotometr BioPhotometer (Eppendorf, Německo)

•

zdroj elektrického napětí Power Pac 300 (Bio-Rad, USA)

•

vortex MS 2 Minishaker (IKA-WORKS, USA) / Lab Dancer V (IKA, Německo)

•

dispenzor antibiotických disků (Oxoid, Velká Británie)

•

suchá lázeň Mixing Block MB-102 (BIOER, Čína)

•

vodní lázeň NB-303 (N-BIOTEK, Korea)

•

mikrovlnná trouba Bosch / Daewoo

•

předvážky (A&D, Japonsko) / Předvážky Kern 440 (Ecotech, ČR)

3.4. POMŮCKY •

zkumavky typu Eppendorf (objem 1,5 ml nebo 200 µl)

•

URIN zkumavky – objem 10 ml (CC-CITO-CONT, ČR)

•

densila zkumavky – objem 15 ml (DispoLab, ČR)

•

zkumavky - objem 50 ml (DispoLab, ČR)

•

kryozkumavky Nunc – objem 1,8 ml (Thermo Fisher Scientific, Dánsko)

•

jednorázové plastové Pasteurovy pipety (Copan, Itálie)

•

nastavitelné mikropipety (Gilson, Francie) / (Labnet, USA)

•

plastové Petriho misky (průměr 90 mm) / skleněná Petriho miska 48

•

zařízení pro elektroforézu (Bio-Rad, USA) / (Owl Scientific)

•

sada pro PFGE (Bio-Rad, USA)

•

děrované víčko (Bio-Rad, USA)

•

bakteriologické filtry – velikost pórů 22 µm (Millipore, USA)

•

běžné laboratorní sklo

•

sterilní vatové tampony (Copan, Itálie)

•

sterilní jednorázová plastová klička - objem 1 µl (Biologix, USA)

•

polystyrenová nádoba na led, ledová tříšť

•

pravítko, čepička, skalpel, filtrační papír, sterilní injekční jehla

•

hokejka, pinzeta, líh, cooler

3.5. CHEMIKÁLIE A OSTATNÍ SUBSTANCE •

parafínový olej (Lachema, ČR)

•

ethidium bromid (Top Bio, ČR)

•

ethanol (Penta, ČR)

•

agaróza SeaKem Gold (Lonza, USA)

- PFGE

•

agaróza pro elektroforézu (Serva, Německo)

- PCR

•

agaróza For Routine Use (Sigma-Aldrich, USA)

- plazmidy

Antibiotické disky pro double-disk synergy test (Oxoid, Velká Británie) amoxicilin – kyselina klavulanová (AMC, 30 µg) cefotaxim (CTX, 30 µg). ceftazidim (CAZ, 30 µg)

49

3.6. METODY 3.6.1. Izolace producentů ESBL (upraveno dle Wu et al., 2008) Mléčné filtry: (Čížek et al., 2008) Mléčné filtry z ranního dojení byly odebrány laktologem a vyplněn dotazník s údaji o stádu, produkci mléka, technice dojení apod. Tkaninové filtry vložit do sterilních plastových uzavíratelných sáčků a sáčky následně označit. Během 12 až 36 hodin vložit filtry do izotermického boxu, přepravit do laboratoře a zpracovat. Izoláty z rektálního výtěru: Ze zamražených vzorků pomnožené peptonové vody ve zkumavkách typu Eppendorf provést stěr sterilním vatovým tamponem (nutno zamezit rozmrznutí vzorku uchováním v „cooleru“), který se poté ponoří do předem připravené URIN zkumavky s obsahem 4 ml MacConkey (MC) bujónu. Zkumavky čitelně popsat číslem vzorku a kultivovat v termostatu při 37 oC do druhého dne. Druhý den naočkovat na ¼ MCA s cefotaximem (2 mg/l) sterilní jednorázovou plastovou kličkou o objemu 1 μl vzorek pomnožený v MC bujónu (při očkování zajet kličkou až na dno zkumavky a jemně promíchat). Naočkované misky umístit do termostatu do 37 oC přes noc. Druhý den zkontrolovat nárůst vzorku na MCA s cefotaximem (viz Obrázek 1) Vzorky, které narostou (tzn. jsou rezistentní k tomuto antibiotiku) přeočkovat na polovinu MCA bez antibiotika a polovinu chromogenního média (viz Obrázek 2). Na chromogenním médiu udělat základní segment, a ten rozočkovat po celé polovině agaru s cílem izolovat jednotlivé čisté kolonie (schéma postupu rozočkování vzorku viz Obrázek 3). Misky kultivovat v termostatu při 37 oC do druhého dne. Následující den zkontrolovat čistotu kultury. Zapsat růst vzorku na MCA a chromogenním médiu (dále pracovat s koloniemi s růžovým a fialovým nárůstem). Pokud se nepodaří izolovat jednotlivé čisté kolonie postup je nutno zopakovat (opětovně přeočkovat z misky s MCA bez antibiotika na nový MCA bez antibiotika). Jednu izolovanou čistou kolinii z chromogenního média přeočkovat „hádkem“ na ½ MPA. Misky opět nechat kultivovat přes noc v termostatu a použít pro double-disk synergy test.

50

Obrázek 1. Růst bakterie E. coli na MacConkey

Obrázek 2. Růst bakterie E. coli na

agaru (MCA) s cefotaximem

chromogenním médiu (laktóza pozitivní)

Obrázek 3. Rozočkování bakteriální kultury narostlé na MCA s cefotaximem na MCA bez antibiotika a chromogenní agar s cílem izolovat jednotlivé čisté kolonie.

3.6.2. Double-disk synergy test - DDST (upraveno dle Jarlier et al., 1988) Čistou dvacetičtyřhodinovou kulturu narostlou na MPA (viz předešlý bod, popřípadě vyočkovat ze zamražených čistých kultur na 1/6 MPA) je možno použít pro double-disk synergy test. DDST je specifický test na průkaz producentů ESBL. Potřebné množství misek s M-H agarem o průměru 90 mm (1 miska pro jeden testovaný izolát), které byly skladovány při 4 oC, vyjmout z chladničky a ponechat při pokojové teplotě až do vyrovnání teploty. Misky s kapkami kondenzované vody nechat krátce vysušit v termostatu při 37 oC. Několik kolonií (přibližně 3 – 4 kolonie) resuspendovat ve 2 ml sterilní destilované vody (použít densila zkumavky). Bakteriální suspenzi ve zkumavce homogenizovat

51

promícháním na vortexu. Zákal suspenze bakterií nastavit fotometrem na hodnotu 0,5 McFarlandovy stupnice. Výchozí

inokulum

ředit

ve

fyziologickém

roztoku

v poměru

1:100,

20 µl

homogenizované suspenze přenést mikropipetou do 2 ml sterilního fyziologického roztoku (URIN zkumavky). Počet buněk ve výsledné suspenzi určené pro očkování misek tedy přibližně odpovídá 106 CFU/ml. Suspenzi ihned (nejdéle však do 15 minut od přípravy) sterilně napipetovat Pasteurovou pipetou na celý povrch misky s M-H agarem. Přelití celého povrchu misky lze docílit jejím nakláněním na všechny strany. Přebytek inokula je třeba odpipetovat. Inokulum naočkované na povrchu M-H agaru nechat před aplikací disků dobře zaschnout. Zaschnutí možno urychlit odložením víčka Petriho misky na 5 – 15 minut (ne déle). Na vlhkých miskách se vytváří nehodnotitelné zóny inhibice. Do středu naočkované misky položit sterilní injekční jehlou disk s amoxicilinem-kyselinou klavulanovou (AMC, 30 µg) a ve vzdálenosti 25 mm od středu disku položit 2 cefalosporinové disky. Nalevo od disku s amoxicilinem-kyselinou klavulanovou položit disk s ceftazidimem (CAZ, 30 µg) a napravo pak disk s cefotaximem (CTX, 30 µg). Schéma rozmístění disků viz Obrázek 4. Po rozmístění disků umístit misky do termostatu (víčkem nahoru, neotáčet misku, disky by mohly odpadnout) a inkubovat při teplotě 37 oC do druhého dne. Jako pozitivní kontrola byl použit kmen Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 a jako negativní kontrola kmen Escherichia coli ATCC 25922. Při pozitivním výsledku testu je možno zaznamenat zvětšení inhibiční zóny v okolí cefotaximu a ceftazidimu u strany přilehlé k disku obsahujícího amoxicilin-kyselinu klavulanovou v důsledku inhibice produkce širokospektré β-laktamázy inhibitorem - kyselinou klavulanovou (viz Obrázek 5). Změřit inhibiční zóny v okolí všech disků (v případě CAZ a CTX na straně vzdálenější od disku AMC). Výsledky zaznamenat. Vzorky s pozitivním výsledkem setřít z misky s M-H agarem sterilním vatovým tampónem, přenést do zamražovacího média a popsat. Vzorky uchovávat při -80 oC pro další použití.

52

Obrázek 4: Schéma umístění disků při double-disk synergy testu.

Obrázek 5. Pozitivní reakce double-disk synergy testu.

3.6.3. Testování citlivosti k dalším antibiotikům diskovou difúzní metodou (upraveno dle CLSI - Clinical and Laboratory Standards Institute Guidelines - dříve NCCLS, 2002) Za použití diskové difúzní metody se u všech zamražených izolátů E. coli testovala citlivost ke 12 vybraným antibiotikům. Postup při diskové difúzní metodě je shodný s postupem u double-disk synergy testu (DDST), jen s některými rozdíly. Výchozí inokulum oproti DDST ředit ve fyziologickém roztoku v poměru 1:100, 30 µl homogenizované suspenze přenést mikropipetou do 3 ml fyziologického roztoku (URIN zkumavky). Po naočkování půdy inokulem umístit na povrch misek otiskem dispenzoru 6 antibiotických disků (na první misku disky 1-6, na druhou misku disky 7-12). Po nakladení disků umístit misky do termostatu a inkubovat při 37 oC po dobu 24 hodin.

53

Po inkubaci změřit zóny inhbice vytvořené v okolí antibiotických disků. Výsledky vyhodnotit porovnáním s průměry inhibičních zón pro enterobakterie uvedené v metodických listech NCCLS (M31-A2, 2002) a shrnuté v Tabulce 1. Izoláty s průměrem zóny daného antibiotika shodnou nebo vyšší než je hraniční průměr pro citlivé a intermediální kmeny označit jako citlivé k tomuto antibiotiku a obdobně izoláty s průměrem zóny daného antibiotika shodnou nebo nižší než je hraniční průměr pro rezistentní kmeny označit jako rezistentní k tomuto antibiotiku. Tabulka 1. Sestava antibiotických disků a průměry inhibičních zón pro hodnocení citlivých a rezistentních izolátů antibiotický disk disk číslo 1 2 3 4

zkratka AMP S S3 TE

5 6 7 8 9 10

SXT C KF NA CAZ GN

11 12

AMC CIP

název ampicilin streptomycin sulfonamidy cp. tetracyklin trimethoprimsulfametoxazol chloramfenikol cefalotin kyselina nalidixová ceftazidim gentamicin amoxicilin- kyselina klavulanová ciprofloxacin

množství průměr inhibiční zóny antibiotika v disku R I S (μg) rezistentní intermediální citlivý 10 ≤ 13 14 - 16 ≥ 17 30 ≤ 11 12 - 14 ≥ 15 300 ≤ 12 13 - 16 ≥ 17 30 ≤ 14 15 - 18 ≥ 19 1,25/23,7 30 30 30 30 10

≤ 10 ≤ 12 ≤ 14 ≤ 13 ≤ 14 ≤ 12

11 13 15 14 15 13

-

15 17 17 18 17 14

30 (20+10) 5

≤ 13 ≤ 16

14 - 17 17 - 22

≥ ≥ ≥ ≥ ≥ ≥

16 18 18 19 18 15

≥ 18 ≥ 23

3.6.4. Biochemická identifikace vybraných bakteriálních izolátů testem API 10S (postup dle doporučení výrobce – bioMérieux, Francie) Bakteriální kultury uchovávané v zamražovacím médiu vyočkovat křížovým roztěrem na MCA a kultivovat v termostatu při 37 oC po dobu 24 hodin. Druhý den zkontrolovat čistotu kultury. Z misky přeočkovat jednu kolonii na ¼ MPA a kulturu umístit do termostatu nastaveného na teplotu 37 oC po dobu 24 hodin. Kulturu vyrostlou na MPA použít pro přípravu inokula. Jednu kolonii přeočkovat do 5 ml API suspenzního média a dobře homogenizovanou suspenzi ihned použít pro inokulaci. 54

Stripy vložit do inkubačních komůrek, do kterých je nutno předem napipetovat 3 ml destilované vody pro zajištění vlhké atmosféry. Do jednotlivých jamek stripu pipetovat 150 ml bakteriální suspenze. Pro zajištění anaerobního prostředí zakápnout testy LDC, ODC, H2S a URE kapkou parafinového oleje. Inkubační komůrku se stripem uzavřít a inkubovat v termostatu při 37 oC po dobu 24 hodin. Po příslušné době inkubace přidat k testu TDA kapku reagencie TDA, k testu IND kapku reagencie JAMES a prokázat redukci nitrátů, po odečtení testu GLU, přidáním po jedné kapce činidel NIT1 a NIT2 k testu GLU. Při odečítání výsledků je možno použít Obrázek 6 a Tabulku 2. Výsledky všech 11 testů zaznamenat

na

identifikační

kartičky

a

vyhodnotit

softwarovým

programem

(http://www.apiweb.com).

Tabulka 2. Tabulka pro odečítání testu API 10S výsledek

test

substrát

reakce/enzym

ONPG

2-nitrofenyl-β-galaktopyranosid

β-galaktosidáza

GLU

D-glukóza

ARA LDC ODC CIT H2S URE TDA IND NO2

negativní

pozitivní

bezbarvá

žlutá

fermentace/oxidace modrozelená / modrá žlutá / žlutozelená glukózy

fermentace/oxidace modrozelená / modrá žlutá arabinózy L-lyzin dekarboxylace lyzinu žlutá červená / oranžová dekarboxylace L-ornitin žlutá červená / oranžová modrozelená / trisodium citrát utilizace citrátu světle zelená / žlutá modrá černý střed / tenká sodium thiosulfonát produkce H2S bezbarvá / našedlá linie urea ureáza žlutá červená / oranžová L-tryptofan deaminace tryptofanu žlutá červenohnědá bezbarvá / světle L-tryptofan produkce indolu růžová zelená, žlutá L-arabinóza

(GLU test)

produkce NO2

žlutá

55

červená

Obrázek 6. Pozitivní a negativní reakce testu API 10S pozitivní

negativní

3.6.5. Detekce genů rezistence metodou PCR (podle pracovního protokolu Ústavu mikrobiologie a imunologie FVL VFU Brno) Metodou polymerázové řetězové reakce (PCR, Polymerase Chain Reaction) se testuje přítomnost genů kódujících širokospektré β-laktamázy (geny bla) a geny odpovědné za rezistenci k ostatním antibiotikům. 3.6.5.1. Izolace bakteriální DNA rezistentních izolátů Bakteriální izoláty uchovávané v zamražovacím médiu je nutno vyočkovat na ¼ MPA (není nutné rozočkovávat na jednu kolonii) a kultivovat v termostatu při teplotě 37 oC přes noc. Několik kolonií resuspendovat ve zkumavce typu Eppendorf ve 250 μl sterilní destilované vody. Víčko zkumavky přetáhnout parafilmem nebo nasadit „čepičku“, aby se zamezilo samovolnému otevírání zkumavek během lyze. Buňky nechat lyzovat v suché lázni při 100 oC po dobu 10 minut. Směs zcentrifugovat při 13 000 ot./min po dobu 2 minut. Odebrat 200 μl supernatantu s DNA do nové sterilní zkumavky typu Eppendorf a uchovávat zamražením pro následné použití (popsat víčko i bok zkumavky). 3.6.5.2. Polymerázová řetězová reakce se specifickými primery Všechny komponenty PCR reakce se uchovávají v mrazničce. Po rozmražení krátce zvortexovat a zcentrifugovat a těsně před použitím promíchat obsah špičkou. Při přípravě PCR směsi se musí přísně dodržovat zásady sterilní práce. Pro přípravu PCR směsi je doporučeno zvolit postup namíchání „master-mixu” tak, že objemy jednotlivých komponent je třeba vynásobit počtem analyzovaných vzorků plus 1 vzorek navíc. Jednotlivé složky směsi napipetovat a smíchat v jedné zkumavce typu Eppendorf (kromě DNA). Přesné objemy jednotlivých komponent PCR směsi obsažené v jednom vzorku jsou rozepsány v Tabulce 3. Ke každé PCR reakci je zapotřebí přidat pozitivní kontrolu (seznam viz Tabulka 3-příloha) a 56

negativní kontrolu (PCR voda). Směs krátce zhomogenizovat pomocí vortexu a rozpipetovat po 24 μl do zkumavek typu Eppendorf o objemu 200 µl. Nakonec do každé zkumavky přidat 1 µl bakteriální DNA připravené teplotní lyzí a uchované zamražením. Celkový objem reakční směsi tedy činí 25 µl. Seznam použitých primerů včetně jejich annelingové teploty (Ta), délky amplifikovaného úseku a pozitivních kontrol jsou přehledně shrnuty v Tabulce 1-příloha. Pro specifikaci genu blaCTX-M byly použity primery a pozitivní kontroly uvedené v Tabulce 2-příloha) Zkumavky typu Eppendorf se vzorky obsahujícími všechny reakční složky umístit do termocycleru a spustit příslušný program (seznam programů viz Tabulka 4). Jednotlivé kroky PCR reakce jsou rozepsány v Tabulce 5. Tabulka 3. Komponenty PCR směsi na 1 vzorek

50 51

reakční komponenty objem (µl) PPP Master Mix PCR voda primer P1 primer P2 DNA matrice

Tabulka 4. Přehled programů

12,5 11,3 0,1 0,1 1

55 58 68

dhfr17, floR aadA1, dhfr12, sul3 bla, dhfr1, aadA2, aadA5, tet, cat, cmlA, integron 1 a 2, int1, int2, sat, estX strA, sul2 sul1

Tabulka 5. Kroky PCR reakce krok 1 2 3 4 5 6 7

parametry

funkce

o

teplota ( C ) 94 94 Ta 72

úvodní denaturace DNA denaturace DNA připojení primerů syntéza DNA řetězce opakování kroků 2 - 4 závěrečná syntéza DNA chlazení

čas 3 min 40 s 45 s 1 min 35x

72 4

10 min minimálně 5 min Ta…teplota použitá pro připojení primerů v PCR (annelingová teplota)

57

Detekce PCR produktu agarózovou gelovou elektroforézou Pro detekci PCR produktu byl použit 1,5 % agarózový gel. Pro přípravu gelu nutno navážit 1,2 g agarózy do 80 ml 1×TBE pufru I. Agarózu rozvařit v mikrovlnné troubě při 450 kW po dobu 2,5 min (popřípadě 180 kW na 10 minut). Po vychladnutí přibližně na 60 oC přidat 80 μl naředěného ethidium bromidu, popřípadě 2μl neředěného ethidium bromidu. Agarózu s ethidium bromidem nalít do předem připravené vaničky s hřebínkem (je možné vložit dva hřebeny nad sebou). Případné bublinky odstranit špičkou. Gel ponechat ve vaničce ve vodorovné poloze při pokojové teplotě až do ztuhnutí po dobu 20 - 30 minut. Po ztuhnutí opatrně vyjmout hřebínek a gel přenést do elektroforetické vaničky s TBE pufrem I (hladina pufru by měla být přibližně 0,5 cm nad gelem). Vzorky DNA v množství 10 µl včetně kontrol (pozitivní - PK a negativní - NK) opatrně nanést mikropipetou do komůrek v gelu v elektroforetické vaničce. Nakonec napipetovat do jedné komůrky gelu 2 µl DNA markeru (M). Elektroforetickou vaničku s gelem umístit v takové orientaci, aby záporně nabitá DNA mohla migrovat gelem směrem k anodě. Komůrky s DNA umístit ke katodě. Elektroforézu spustit při napětí 130 V po dobu 25 minut (ve dvou liniích) a v případě integronů 75 minut (pouze v jedné linii) až do oddělení jednotlivých fragmentů markeru. Nakonec vypnout elektrický proud a elektrody odpojit. Gel přenést na transiluminátor a po zapnutí UV světla prohlížet přes sklo. Gel vyfotografovat digitálním fotoaparátem (ukázka gelu viz Obrázek 7). Obrázek 7. Agarózový gel s obsahem DNA, barveno ethidium bromidem

Jako standard o definovaném počtu bazí použít při elektroforéze multiplikovaného úseku DNA fragmentu komerčně dostupný DNA marker (viz Obrázek 1-příloha). Marker se separuje 58

do fragmentů různých velikostí, nejblíže startu je vždy fragment o největším počtu páru bazí. Z fotografie porovnat vzdálenost jednotlivých fragmentů vzorku s fragmenty DNA markeru a rovněž s pozitivní a negativní kontrolou. Výsledky elektroforetické detekce PCR produktu zaznamenat. DNA markery (viz Obrázek 1–příloha) A: firma BioLabs (100 bp DNA ladder, 100-1500 bp)

- testování genů rezistence, - Inc skupiny plazmidů

B: firma BioLabs (2-log DNA ladder, 0,1-10 kb)

- testování integronů, RFLP

3.6.5.3. Schéma testování integronů (podle pracovního protokolu Ústavu mikrobiologie a imunologie FVL VFU Brno) Příprava směsí DNA Připravit směs pěti vzorků pipetováním ze zamražené izolované DNA všech izolátů s prokázanou rezistencí k jednomu nebo více antibiotikům 20 μl do jedné zkumavky typu Eppendorf o objemu 1,5 ml. Směs zcentrifugovat, popsat a zamrazit. Zaznamenat rozpis jednotlivých DNA ve směsných vzorcích.

Testování genů int1 a int2 ve směsných vzorcích Směsi DNA lze využít pro metodu PCR. Je nutno provést PCR dvakrát, poprvé na průkaz genu int1 a podruhé na gen int2. Jednotlivé komponenty PCR reakce pro jeden vzorek pipetovat podle Tabulky 6. Tabulka 6. Komponenty PCR reakce pro jeden vzorek při testování genů int1 a int2. reakční komponenty

objem (µl)

PPP Master Mix PCR voda primer P1 (int1/F, int2/F) primer P2 (int1/R, int2/R) DNA matrice (směs 5 vzorků)

59

12,5 7,3 0,1 0,1 5

Směs bez DNA zvortexovat a rozplnit po 20 μl do PCR zkumavek typu Eppendorf o objemu 200 μl a přidat 5 μl příslušné DNA směsi. Další postup viz PCR. Pozitivní směsné vzorky je nutné „rozbalit“, tzn. otestovat všechny vzorky DNA z pozitivní směsi jednotlivě, aby bylo možno zjistit, který vzorek/vzorky ze směsi byl pozitivní na daný gen int. Vzorky pozitivní na gen int1 testovat na přítomnost integronu třídy 1 (primery 5´CS, 3´CS) a genové kazety (aadA1, aadA2, aadA5, dhfr1, dhfr12, dhfr17, sat, estX). U vzorků pozitivních na gen int2 prokázat integron třídy 2 (primery Hep74, Hep51) a genové kazety (aadA1, aadA2, aadA5, dhfr1, dhfr12, dhfr17, sat, estX). V případě testování integronů je nutno při nanášení vzorků na agarózový gel nanést a marker 2-log. Elektroforézu nechat probíhat po dobu 50 – 70 minut při 120 V. 3.6.6. Pulzní gelová elektroforéza (PFGE, Pulse Field Gel Electrophoresis) (upraveno dle PulseNet PFGE Manual, 2002) Pulzní gelová elektroforéza je metoda, při které je bakteriální genom štěpen restrikčním enzymem štěpícím s nízkou frekvencí (Foley et al., 2009). Vzniklé fragmenty jsou odděleny pomocí speciální elektroforézy. Rozdíly v restrikčních profilech jsou použity pro srovnání izolátů. V současnosti je PFGE považována za „zlatý standard“ molekulárně typizačních metod pro detekci potravinových patogenů, jako jsou Salmonella, E. coli, Campylobacter, Listeria, atd... Zalití celých buněk do agarózy chrání chromozomální DNA před mechanickým poškozením, na rozdíl od volné DNA. Enzymy nejběžněji používané při analýze potravinových patogenů (E. coli, Salmonella) jsou XbaI či SpeI. Během elektroforézy se směr proudu mění v pravidelných intervalech, což umožní oddělení fragmentů v rozmezí velikostí 20-800 kb. Jako „univerzální“ standard k určení molekulárních velikostí fragmentů slouží DNA bakterie Salmonella enterica serovar Braenderup (H9812) štěpena enzymem XbaI. (viz Obrázek 8). 3.6.6.1. Příprava PFGE bločků z agarových kultur Vodní lázeň temperovat na 55 °C. Připravit 1,6 % agarózu a udržovat při teplotě 55 °C. Ve 2 ml CSB připravit suspenzi testovaných kmenů (ze 14-18 hodinových kultur na neselektivním médiu) a ověřit koncentraci měřením optické denzity (600 nm / A = 1,3 – 1,4), McF = 2. Do zkumavek typu Eppendorf o objemu 1,5 ml napipetovat 10 µl proteinázy K (20 mg/ml). Přidat 200 µl buněčné suspenze a pipetou jemně promíchat opakovaným nasátím 60

a vypuštěním. (Pokud suspenze nemá pokojovou teplotu, je třeba ji před přidáním agarózy na několik minut umístit do vodní lázně o teplotě 37 °C). K 0,2 ml buněčné suspenze přidat 200 µl 1,6 % agarózy a opakovaným nasátím a vypuštěním pipetou promíchat. Směs co nejrychleji nanést do tvořítek tak, aby se nevytvořily bubliny. Necháme ztuhnout 10 – 15 miut při pokojové teplotě, popř. v lednici (5 minut). Lyze buněk v agarózových bločcích Připravit příslušné množství Cell Lysis / Proteináza K pufru: 5ml CLB + 25 µl proteinázy K (20 mg/ml) – 1 vzorek (3-4 bločky). Bločky přemístit do 5 ml lyzačního pufru (50 ml zkumavky) předehřátého na 50 °C a nechat inkubovat při 54 °C po dobu 2 hodin ve vodorovné poloze při 150 ot./min. Bločky musí být pod hladinou lyzačního pufru. Promývání agarózových bločků Předehřát 800 ml sterilní destilované vody a 2 litry TE pufr na 50 °C. Po skončení lyze vyměnit lyzační pufr za destilovanou vodu (pomocí děrovaného víčka) a vzorky nechat inkubovat při pokojové teplotě po dobu 10 minut za stálého třepání 150 ot./min. Krok ještě jednou opakovat. Promývací krok opakovat 4x s TE pufrem opět předehřátým na 50 °C. Promyté bločky je možné uchovávat v TE pufru při chladničkové teplotě po dobu 3 měsíců. 3.6.6.2. Restrikční štěpení DNA v bločcích enzymem XbaI / S1 Suchou lázeň předehřát na 37 °C. Roztok pro restrikční štěpení se připravuje pro celkový počet testovaných kmenů najednou a rozplní se do zkumavek typu Eppendorf o objemu 200 µl po 100 µl. Příprava restrikčních směsí je v Tabulce 7. Do jedné jamky se dává S. Braenderup H9812 jako kontrolní kmen (viz Obrázek 8) – ke vzorkům je nutné připočítat i příslušný počet řezů kontrolního kmene. Z bločku odříznout 1 - 2 mm široký řez, který se inkubuje ve směsi restrikčního enzymu při 37 °C po dobu 3 hodin popř. přes noc. Finální koncentrace restrikčního enzymu XbaI je 50 U/vzorek, enzymu S1 pak 5 U/vzorek. Připravit 1% gel: 1,5 g agarózy do 150 ml 0,5x TBE II – udržovat při teplotě 55 °C. Po skončení štěpení vyměnit reakční směs za 100 µl 0,5x TBE II a nechat inkubovat 10 min při pokojové teplotě. Řezy umisťovat do gelu vždy ve vertikální poloze. Do jedné jamky se vkládá referenční kmen S. Braenderup H9812. Bločky nejprve umístit na hřebínek, osušit a nechat

61

30 min zaschnout. Poté vložit hřebínek do formy a opatrně zalít agarózou. Po zatuhnutí gelu vyjmout hřebínek. Gel vložit do vany PFGE a spustit program. Tabulka 7. Příprava restrikčních směsí (s obsahem enzymů XbaI a S1)

SDV pufr 10xM BSA enzym XbaI / S1 celkem

1 vzorek XbaI 79 µl 10 µl 10 µl 1 µl (50 U/µl) 100 µl

30 vzorků

15 vzorků

2370 µl 300 µl 300 µl 30 µl

1185 µl 150 µl 150 µl 15 µl

3000 µl

1500 µl

1 vzorek S1 89 µl 10 µl --1 µl (5 U/µl) 100 µl

15 vzorků 1335 µl 150 µl --15 µl 1500 µl

3.6.6.3. Příprava a nastavení programu vlastní PFGE Asi 30 minut před spuštěním programu naplnit vanu 2,5 litry 0,5x TBE II a ze systému vypudit bublinky (150 ml 10x TBE II do 3 litrů SDV, zředěno 20x, zchlazený na 14 oC). Chlazení nastavit na 14 °C, rychlost toku cca 70. Podmínky elektroforézy pro E. coli: XbaI: Initial time: 2,2 s, Final time: 54,2 s; Start ratio: 1; Voltage: 200V (6V/cm); Run time: 22h S1: Initial time: 6,8 s, Final time: 38,4 s; Start ratio: 1; Voltage: 200V (6V/cm); Run time: 19h 3.6.6.4. Barvení a vizualizace gelu Připravit barvící roztok smícháním 100 µl EtBr (10 mg/ml) s 1 litrem chlazené destilované vody. Gel barvit v uzavřené nádobě po dobu 20 minut. Odbarvovat v 1 litru chlazené destilované vody za mírného třepání. Vodu vyměňovat po 20 minutách (odbarvovat 60 - 80 minut). Potom gel opláchnout ve vodní lázni a přenést na desku transiluminátoru a vyfotografovat. Optimální čas běhu se určuje podle referenčního kmene, jehož nejmenší proužky by měly být 1 – 1,5 cm od konce gelu.

62

Obrázek 8. Kontrolní kmen Salmonella

Obrázek 9. Kontrolní kmen E. coli

enterica serovar Braenderup (H9812)

39R861 (Olsen, 1990)

štěpena enzymem XbaI (Hunter et al., 2004)

(izolace dle Birnboim et Doly, 1979)

Šipka na levé straně obrázku značí směr pohybu fragmentů v el. poli

Chr. – chromozomální DNA

3.6.7. Izolace plazmidové DNA (upraveno dle Birnboim et Doly, 1979) Kmeny pomnožit přes noc v 5 ml LB bujónu ve vodní lázni (150 ot./min.) při 37 °C. Připravit čerstvý 1 % roztok SDS (roztok č.2) v malé lahvičce (0,05 g lauryl sulfate + 5 ml 0,2 N NaOH). Dále pipetovat 1 ml kultury do zkumavky typu Eppendorf. Následuje centrifugace po dobu 1 minuty při max. otáčkách (12 000 ot./min). Pasteurovou pipetou odsát supernatant. Následně připravit čerstvý roztok lysozymu (10 mg lysozym + 2 ml roztoku č.1 pro analýzu DNA) a uložit na led. Přidat 100 μl roztoku lysozymu k peletům a několikrát promíchat opakovaným nasátím a vypuštěním. Lyzi nechat probíhat 5 minut při pokojové teplotě. Přidat 200 μl roztoku č.2, promíchat (2-4x obrátit) a ihned vložit do ledu na 5 minut. Poté přidat 150 μl roztoku.č.3, promíchat (2-4x obrátit) a nechat stát v ledu 5-10 minut. Centrifugace 5-10 minut při 12 000 ot./min. při teplotě 0 oC. Pipetou odebrat vodní fázi a přenést do nové zkumavky typu Eppendorf. Následně přidat 200 μl fenol-chloroformu (před pipetováním nutno promíchat) 63

a několikrát obracením zkumavky promíchat obsah. Centrifugace 2-3 minuty při 12 000 ot./min. při teplotě 0 oC. Vodní fázi odsát pipetou s ustřihnutou špičkou do nové zkumavky typu Eppendorf a přidat dvojnásobný objem 96 % etanolu zchlazeného na –20°C (cca 600-700 μl) a promíchat. Postup můžeme přerušit a vzorky uložit při –20°C několik dnů. Při zpracování téhož dne dáme na 1 – 1,5 hodiny do mrazicího boxu. Nejprve necháme probíhat centrifugaci po dobu 10 minut při 12 000 ot./min. při teplotě 0 oC (patent uzávěru ve směru odstředivé síly). Připravit agarózu (rozvařit 0,8 % agarózu v 0,5x TBE pufru II, při 60 °C rozlévat; 2 μl ethidium bromidu). Poté slít supernatant, opláchnout DNA 500 μl 70 % etanolu, nechat okapat na filtračním papíru. Přidat 0,5 ml 96 % etanolu a opatrně otáčením zkumavky opláchnout stěny. Centrifugace 5 minut při 12 000 ot./min. při teplotě 0 oC. Slít supernatant a pipetou odsát z opačné strany než je sediment DNA zbytky alkoholu a umísit zkumavky dnem vzhůru do stojánku a vložit na 20 -30 minut do termostatu vysušit (ve vodorovné poloze na plastovém tácku). Rozpustit plazmidovou DNA ve 20 μl TE (roztok č.4), opakovaným nasáváním a stíráním odstraňovat ze stěny zkumavky DNA. Dát na 10 minut do termostatu, pak do mrazáku. Následně přidat 5 μl STOP mixu a před nanesením promíchat. Do elektroforetické vaničky nalít 0,5x TBE pufr II tak, aby byly jamky gelu pod hladinou. Do jamek gelu nenést 12 μl směsi pDNA a STOP mixu. Přidat kontrolní kmen E. coli 39R861 o známém počtu a délce fragmentů (viz Obrázek 9). Nechat probíhat elektroforézu po dobu 2,5 hodiny při 120 V. Připravit barvící roztok smícháním 100 µl EtBr (10 mg/ml) s 1 litrem chlazené destilované vody. Gel barvit v uzavřené nádobě po dobu 20 minut. Odbarvovat v 1 litru chlazené destilované vody za mírného třepání. Vodu vyměňovat po 20 minutách (odbarvovat 40-50 minut). Potom gel opláchnout ve vodní lázni a přenést na desku transiluminátoru a vyfotografovat. 3.6.8. Konjugace u ESBL+ izolátů (Caroff et al., 1999, Olesen et al., 2004) Vyočkovat na neselektivní médium (MPA) testované kmeny (donory) a recipienty (E. coli MT 102 a Salmonella Typhimurium SL 5325) a rozočkovat na jednu kolonii. V případě, že testovaný donorový kmen nevykazuje rezistenci ke kyselině nalidixové či ciprofloxacinu, použijeme jako recipientní kmen E. coli MT 102 NalRif (rezistentní ke kyselině nalidixové a rifampicinu) a Salmonella Typhimurium SL 5323 NalRif. Pokud je donor rezistentní ke kyselině

64

nalidixové či ciprofloxacinu, jako recipienta použijeme E. coli MT 102 Azid (rezistence k azidu sodnému) a Salmonella Typhimurium SL 5325 Azid. Rozplnit BHI médium po 10 ml do 50 ml zkumavek – vždy jedna zkumavka na donora a jedna zkumavka na každého z recipientů. Donor: 10 ml BHI + 10 μl cefotaximu (výsledná koncentrace 2 mg/l) V případě BHI média, do kterého se budou očkovat recipienti, se přidávané antibiotikum volí podle rezistence tohoto donora a to: Recipient: MT 102 NalRif:

10 ml BHI + 2 μl Rif (25 mg/l) + 16 μl Nal (32 mg/l)

SL 5325 NalRif:

10 ml BHI + 2 μl Rif (25 mg/l) + 16 μl Nal (32 mg/l)

MT 102 Azid:

10 ml BHI + 10 μl Azid (200 mg/l)

SL 5325 Azid:

10 ml BHI + 10 μl Azid (200 mg/l)

Pozor: Rifamipicin se na denním světle rozkládá, je tedy nutné uchovávat antibiotikum i půdy obsahující toto antibiotikum ve tmě (např. obalit alobalem). Naočkovat jednu izolovanou kolonii ESBL+ donora (náš testovaný kmen) narostlého na neselektivním médiu do 10 ml BHI bujónu obsahujícího 2 mg/l cefotaximu. Rovněž jednu kolonii recipientního kmene naočkovat do 10 ml BHI s příslušným antibiotikem podle návodu výše. Kultivace při 37 oC přes noc za třepání. Druhý den přenést 100 μl homogenizované kultury (po zvortexování) v 10 ml BHI bujónu s antibiotikem – donoři i recipienti – do 5 ml nového BHI bujónu bez antibiotik. Kultury v BHI bujónu inkubovat 3 hodiny při 37 oC za stálého třepání. Připravit odpovídající množství neselektivního média (např. LB agar, MPA). Počet misek odpovídá počtu vzorků (donorů) násobeno dvěma (v případě, že testujeme konjugaci se dvěma recipienty – E. coli i salmonelou). Do středu misky umístit pinzetou otřenou lihem bakteriologický filtr a nechat přilnout k povrchu agaru. Po zvortexování rozplnit BHI bujón s příslušným recipientem do sterilních zkumavek typu Eppendorf po 300 μl (počet zkumavek odpovídá počtu donorů - jedna řada s recipientem E. coli MT 102 a druhá řada se Salmonella Typhimurium SL 5325). Ke 300 µl každého recipienta přidat 300 μl příslušného donora. Směs promíchat pipetováním nahoru a dolů. Opatrně aplikovat 500 μl suspenze do středu membrány. S miskou nehýbat, nechat zaschnout (trvá asi 12 hodiny) a poté přenést do termostatu (nechat víčkem nahoru). Kultivace přes noc při 37 oC. Třetí den sterilně (pinzetu po každém vzorku dezinfikovat v alkoholu) přenést do 5-10 ml sterilního PBS. Roztok spolu s membránou zvortexovat tak, aby se kultura z povrchu membrány 65

resuspendovala v roztoku. Přenést 100 μl roztoku na LB agar s obsahem Nal (32 mg/l), Rif (25 mg/l) a CTX (2 mg/l) v případě, že jsou používáni recipienti NalRif nebo na LB agar s azidem sodným (200 mg/l) a CTX (2 mg/l) v případě použití recipientů Azid. Suspenzi rozetřít „hokejkou“ na polovinu povrchu agaru a na druhou polovinu rozočkovat bakteriologickou kličkou s cílem získat jednotlivé kolonie. Nechat zaschnout a kultivovat přes noc při 37 oC. Čtvrtý den vyhodnotit výsledky konjugace. Nárůst na BHI se třemi antibiotiky značí pozitivní výsledek. Dvě kolonie narostlého konjuganta opět přeočkovat na ¼ BHI se 3 antibiotiky a kultivovat do následujícího dne. Následující den kulturu zamrazit popřípadě izolovat DNA. 3.6.9. Transformace plazmidové DNA do chemicky kompetentních buněk E. coli (dle instrukcí výrobce kompetentních buněk – Invitrogen, USA) Připravit ledovou tříšť do polystyrenové nádoby za účelem chlazení kompetentních buněk i DNA. Plazmidovou DNA (pDNA) uložit na led. Do popsaných zkumavek typu Eppendorf napipetovat 1 µl plazmidové DNA příslušného vzorku. Připravit si na led kompetentní buňky

E. coli DH5α (uloženy na -80 oC), které jsou zamraženy po 200 µl.

K 1 µl DNA přidat 20 µl kompetentních buněk a směs opatrně promíchat pipetováním nahoru a dolů. Zkumavky (obsahující směs kompetentních buněk a DNA) umístit na 30 - 60 minut na led. Po inkubaci na ledu podrobit buňky teplotnímu šoku umístěním do suché lázně nastavené na 42 oC po dobu 30 sekund. Ze suché lázně ihned přemístit zpět na led na 2 minuty. Zkumavky vyjmout z ledu a přidat do každé 1 ml LB bujónu a promíchat pipetováním nahoru a dolů. Inkubovat v termostatu při 37 oC 1 hodinu. Po inkubaci buňky centrifugovat při 5 000 ot./min. po dobu 5 minut (chlazená centrifuga na 4 oC). Slít supernatant převrácením zkumavky (ne kompletně, ponechat trochu na dně pro snadnou resuspendaci peletu–cca 100 µl). Pipetováním resuspendovat pelet se zbytkem LB bujónu a veškerou kulturu ze zkumavky aplikovat na LB agar s cefotaximem (2 mg/l). Kulturu na LB agaru rozetřít po celém povrchu plotny „hokejkou“. Misky kultivovat dnem vzhůru do druhého dne při 37 oC. Druhý den zkontrolovat růst. Na misce by měli vyrůst transformanti - buňky E. coli DH5α, které přijaly pDNA obsahující gen rezistence k cefalosporinům. Z každé misky odpíchnout 4 kolonie a přeočkovat „hádkem“ na ¼ LB agaru s cefotaximem (2 mg/l). Zkontrolovat přenos genu pro ESBL (genu bla): z transformantů izolovat DNA a provést PCR na průkaz genu ESBL, který byl prokázán u donorového kmene, jehož DNA byla použita pro transformaci. 66

Během transformace mohlo dojít k přenosu i více plazmidů kromě plazmidu nesoucího gen ESBL, pro další práci je nutné použít pouze transformanty pozitivní na gen ESBL a nesoucí pouze jeden plazmid (na němž se předpokládá přítomnost genu bla). U dvou transformantů od každého vzorku je tedy nutné zkontrolovat počet přítomných plazmidů, a to buď izolací plazmidové DNA a elektroforézou nebo S1 PFGE. 3.6.10. Multiplex PCR (Carattoli et al., 2005) Multiplex PCR je polymerázová řetězová reakce s obsahem více párů primerů v jednom vzorku. Zároveň jsou na agarózový gel nanášeny příslušné pozitivní kontroly – v počtu více než jedna. Cílem je v jedné reakci detekovat více genů, v tomto případě úseky DNA typické pro inkompatibilní skupiny plazmidů (Inc). V tomto případě bylo navrženo 16 párů primerů rozdělených do 3 multiplex reakcí, díky nimž je možno zařadit plazmidy do replikonů FIA, FIB, FIC, HI1, HI2, I1, L/M, N, P, W, T, A/C, B/O, X, Y a K, které představují hlavní inkompatibilní skupiny plazmidů kolujících mezi bakteriemi čeledi Enterobacteriaceae. Rozdělení do 3 multiplex reakcí je uvedeno v Tabulce 9. Dnes je známo celkem 27 Inc skupin plazmidů čeledi Enterobacteriaceae zahrnujících kromě výše zmíněných navíc 6 variant IncF (FII-FVII) a 3 varianty IncI (I1, Iγ, I2) a dále pak IncF a FIIA. Připravit reakční směs podobně jako PCR reakci (postup viz 3.6.5.2. Polymerázová řetězová reakce se specifickými primery) jen s rozdílnými objemy reakčních komponent pro jeden vzorek (viz Tabulka 8) a určitým počtem párů primerů a příslušných pozitivních kontrol. Další postup je shodný s PCR (viz výše). Tabulka 8. Komponenty Multiplex PCR směsí pro jeden vzorek Reakční komponenty PPP Master Mix (µl) PCR voda (µl) primer (Forvard) (µl) primer (Reverse) (µl) DNA matrice (µl) Celkem (µl)

Multiplex 1 12,5 10 0,25 0,25 1 24

67

Multiplex 2 12,5 9,5 0,25 + 0,25 0,25 + 0,25 1 23

Multiplex 3 12,5 10,5 0,25 + 0,25 0,25 + 0,25 1 24

Tabulka 9. Rozřazení párů primerů do jednotlivých multiplex reakcí. Jednotlivé primery detailně viz Carattoli et al., 2005. Multiplex 1 Primery (Forward) Primery (Forward) DNA polymeráza Délka PCR produktu Pozitivní kontroly Multiplex 2 Primery (Forward) Primery (Forward) Primery (Reverse) Primery (Reverse) DNA polymeráza Délka PCR produktu Pozitivní kontroly Multiplex 3 Primery (Forward) Primery (Forward) Primery (Reverse) Primery (Reverse) DNA polymeráza Délka PCR produktu Pozitivní kontroly

B/O, FIC, A/C, P, T P1P1 P1P2 AmpliTaq Gold 159 bp, 262 bp, 465 bp, 534 bp, 750 bp, B/O, FIC, A/C, P, T K/B, W, FIIA, FIA, FIB, Y P2P1 P2P2 P2P3 P2P4 AmpliTaq Gold 139 bp, 376 bp, 471 bp, 559 bp, 644 bp, 785 bp, K, W, FIIA, FIA, FIB, Y I1, HI1, N, HI2, L/M P3P1 P3P2 P3P3 P3P4 AmpliTaq Gold 139 bp, 376 bp, 471 bp, 559 bp, 644 bp, 785 bp, I1, HI1, N, HI2, L/M,

Tabulka 10. Kroky Multiplex PCR krok 1 2 3 4 5 6 7

parametry

funkce

o

teplota ( C ) 94 94 60 72

úvodní denaturace DNA denaturace DNA připojení primerů (Ta) syntéza DNA řetězce opakování kroků 2 - 4 závěrečná syntéza DNA chlazení

čas 5 min. 1 min. 30 s. 1 min. 30x

72 4

68

5 min. minimálně 5 min

3.6.11. Polymorfismus délky restrikčních fragmentů - RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Metodou RFLP je bakteriální genom štěpen specifickým restrikčním enzymem (Foley et al., 2009). Vzniklé fragmenty jsou odděleny pomocí agarózové gelové elektroforézy. Rozdíly v restrikčních profilech jsou použity pro srovnání jednotlivých izolátů. 3.6.11.1. Příprava restrikční směsi (dle instrukcí výrobce – Takara, Japonsko) Suchou lázeň předehřát na 37 °C. Roztok pro restrikční štěpení se připravuje pro celkový počet testovaných kmenů najednou a rozplní se do zkumavek typu Eppendorf o objemu 200 µl po 10 µl. Příprava restrikčních směsí je zaznačena v Tabulce 11. Následně k restrikční směsi přidat 10 µl plazmidové DNA a vše inkubovat při 37 °C po dobu 1 hodiny. Finální koncentrace restrikčního enzymu EcoRV je 2,5 U/vzorek. Tabulka 11. Příprava restrikční směsi (s obsahem enzymu EcoRV) 1 vzorek EcoRV 7 µl 2 µl 1 µl (50 U/µl) 10 µl

PCR voda pufr (10xM) enzym EcoRV celkem 3.6.11.2. Agarózová gelová elektroforéza (upraveno dle Birnboim et Doly, 1979)

Do elektroforetické vaničky nalít 0,5x TBE pufr II tak, aby byly jamky gelu pod hladinou. Do jamek gelu nanést 25 μl směsi pDNA (20 μl) a STOP mixu (5 μl). Přidat 2 µl markeru 2-log o známém počtu a délce fragmentů. Nechat probíhat elektroforézu 3 hodiny při 120 V. Připravit barvící roztok smícháním 100 µl EtBr (10 mg/ml) s 1 litrem chlazené destilované vody. Gel barvit v uzavřené nádobě po dobu 20 minut. Odbarvovat v 1 litru chlazené destilované vody za mírného třepání. Vodu vyměňovat po 20 minutách (odbarvovat 40-50 minut). Potom gel opláchnout ve vodní lázni, přenést na desku transiluminátoru a vyfotografovat. 69

4. VÝSLEDKY

4.1. Farma v Těšanech 4.1.1. Spotřeba antibiotik na farmě v Těšanech Spotřeba antibiotik na farmě v Těšanech je poměrně vysoká, v průměru 2-3 podání antibiotika na zvíře za rok (konkrétně rok 2008) viz Tabulka 1. Objevují se i dojnice s počtem podání 7-10 antibiotik na jedno zvíře (antibiotika z různých farmakologických skupin). Na farmě v Těšanech byly k léčbě používány cefalosporiny viz Tabulka 2. Tabulka 1. Počet aplikovaných antibiotik na jednu dojnici (údaje získané z farmy) Počet ATB Počet dojnic s tímto počtem ATB 0 87 1 76 2 41 3 35 4 30 5 37 6 36 7 22 8 13 9 0 10 2 Celkem: 379

Procentuální vyjádření 22,95 20,05 10,80 9,25 7,90 9,80 9,50 5,80 3,45 0 0,50 100 %

Tabulka 2. Podíl ESBL+ dojnic ve skupinách bez použití antibiotik a s nejméně dvěma antibiotiky (cefalosporiny vyšších generací) – (údaje získané z farmy) Skupina dojnic Počet dojnic ve sk. Z toho ESBL+ Podíl ESBL+ v % Skupina I 87 23 26,45 Skupina II 83 30 36,15 Skupina I: Dojnice, které nedostávaly léčebně antibiotika (některé z těchto dojnic dostávaly cefalosporiny 4. generace při zaprahování – dry cow therapy) Skupina II: Dojnice s nejméně 2 antibiotiky ze skupiny cefalosporinů vyšších generací

70

Antibiotika používaná na farmě v Těšanech Cefalosporiny - ceftiofur, cefoperazon, cefchinom Ostatní - alamycin (oxytetracyklin), kloxacilin-ampicilin, amoxicilin, cefalexin, kloxacilin, SA-trimetoprim, enrofloxacin, rifaximin, gentamicin + amoxicilin, linkomycin, neomycin, ampiciln + kolistin, amoxicilin-kyselina klavulanová, penicilin, spiramycin, ursocylin (oxytetracyklin), dihydrostreptomycin, novobiocin 4.1.2. Výsledky biochemické identifikace Na základě výsledků testu API 10S bylo potvrzeno, že se jedná o izoláty druhu Escherichia coli. Výsledky byly vyhodnoceny pomocí webové adresy http://www.apiweb.com. Ukázka zaznamenávání výsledků jednotlivých biochemických testů na Obrázku 1. Obrázek 1. Schematické zaznamenání výsledků jednotlivých biochemických testů sady API 10S

71

4.1.3. Výsledky fenotypových a genotypových metod k detekci antibiotické rezistence u izolátů E. coli z farmy v Těšanech Rektálním odběrem bylo získáno celkem 309 izolátů dojnic, od každé dojnice jeden izolát. Produkce ESBL byla nalezena celkem u 120 izolátů pomocí metody double-disk synergy test. Podíl ESBL+ izolátů je tedy 38,8 %. Shrnutí výsledků testování izolátů na produkci širokospektré β-laktamázy je v Tabulce 3. Pro ověření byly izoláty testovány metodou PCR na přítomnost genu blaCTX-M. Tento gen byl nalezen u 119 izolátů (kromě vzorku č. 158, viz Obrázek 2). Všech 120 ESBL+ izolátů bylo zamraženo a označeno „číslo vzorku/B“. Tabulka 3. Podíl ESBL+ z celkového počtu izolátů (výsledky DDST) sekce

počet vzorků

1 2 3 4 5 6 7 8 celkem

42 49 46 46 32 30 32 32 309

z toho producentů ESBL 17 25 21 25 4 3 19 6 120

procentuální vyjádření 40,5 51,0 45,7 54,3 12,5 10,0 59,4 18,8 38,8 %

Izoláty, které se vyznačovaly produkcí ESBL byly dále podrobeny diskové difúzní metodě s 12 antibiotickými disky (seznam disků viz Metodika – Tabulka 1). Rezistenci vykazovalo 119 izolátů z celkového počtu 120 (citlivý ke všem použitým antibiotikům byl pouze vzorek č. 158). Všechny izoláty, až tedy na jeden, vykazovaly multirezistenci (rezistenci ke dvěma a více antibiotikům). U 114 izolátů byla zjištěna rezistence pouze ke 2 antibiotikům (ampicilin a cefalotin), celkem 3 izoláty vykazovaly rezistenci ke 3 antibiotikům (kromě ampicilinu a cefalotinu ještě k ceftazidimu), a 2 izoláty k 5 antibiotikům (kromě ampicilinu a cefalotinu ještě k sulfonamidům, streptomycinu a tetracyklinu / kyselině nalidixové). Tabulka 4 ukazuje kolik izolátů bylo rezistentních k danému antibiotiku.

72

Tabulka 4. Počet izolátů rezistentních k danému antibiotiku (Seznam ESBL+ izolátů viz Tabulka 4-příloha) Antibiotikum Počet rezistentních izolátů Filtr 1 Ampicilin 119 1 Streptomycin 2 (č. 290 a 296) 1 Sulfonamidy 2 (č. 290 a 296) 1 Tetracykliny 1 (č. 290) 1 Sulfametoxazol-trimethoprim 0 Chloramfenikol 0 Cefalotin 119 1 Kyselina nalidixová 1 (č. 296) Ceftazidim 3 (č. 8, 10 a 23) Gentamicin 0 Amoxicilin-kys. klavulanová 0 Ciprofloxacin 0

Obrázek 2. PCR se specifickými primery – detekce genu blaCTX-M

Izoláty rezistentní v diskovém difúzním testu ke 3 a více antibiotikům, u kterých lze testovat přítomnost genů rezistence (tetracykliny, streptomycin, sulfonamidy), byly dále testovány pomocí metody PCR (výsledky v Tabulce 5). Přiřazení genů rezistence k testovanému antibiotiku v Tabulce 1-příloha.

Tabulka 5. Výsledky rezistencí u ESBL+ izolátů testovaných pomocí metody PCR Číslo vzorku tetA tetB strA-B aadA1, A2, A5 sul1 sul2 sul3 Filtr 1 + + + 290/B + + + 296/B N N + + N – netestováno, protože vzorek nevykazoval rezistenci v diskové difúzní metodě

73

Dále byly ESBL+ izoláty testovány na přítomnost genů int1 a int2 kódujících enzym integrázu. Ze všech 121 vzorků (včetně F1 – viz dále) byly vytvořeny směsi po 5 vzorcích a v nich byly metodou PCR prokazovány geny int1 a int2. Přítomnost genu int1 byla detekována u vzorků č. 179/B, 289/B, 296/B a 322/B. Gen int2 nebyl nalezen u žádného vzorku. Následně byly vzorky pozitivní pro inetgrázu (int1) testovány na přítomnost integronů první a druhé třídy (class 1 a 2) a v souvislosti s tím i na přítomnost genových kazet aadA1, aadA2, aadA5, sul1, dhfr1, dhfr12 a dhfr17 (přiřazení genů rezistence k testovanému antibiotiku v Tabulce 1příloha). Výsledky testování vzorků pozitivních na integrázu byly v případě integronů první a druhé třídy i v případě genových kazet negativní. Mléčné filtry (Těšany) Na farmě v Těšanech byly dále odebrány i dva mléčné filtry. Doble-disk synergy testem byla prokázána produkce ESBL pouze u jednoho z obou filtrů a ten byl zahrnut do dalšího testování pod označením F1. Zároveň byla u vzorku F1 ověřena produkce ESBL pomocí metody PCR na průkaz genu blaCTX-M. Vzorek F1 byl dále podroben diskové difúzní metodě a otestován tímto na přítomnost rezistence ke 12 zvoleným antibiotikům, přičemž byla prokázána rezistence k ampicilinu, sulfonamidům, streptomycinu, tetracyklinu a cefalotinu. Vzorek F1 tedy vykazoval multirezistenci.

74

4.2. Ekologický chov Luboměř pod Strážnou 4.2.1. Spotřeba antibiotik na ekofarmě v Luboměři

Spotřeba antibiotik je na ekofarmě nízká. Frekvence podání antibiotik se pohybovala kolem 0,5 podání antibiotika na zvíře za rok (konkrétně za rok 2008). Antibiotika používaná na ekofarmě v Luboměři β-laktamy: penicilin, prokain benzyl penicilin, kloxacilin benzatin Aminoglykosidy: neomycin, streptomycin sulfát, dihydrostreptomycin Tetracykliny: OTC (oxytetracyklin), CTC (chlortetracyklin) Na ekofarmě v Luboměři, kde dodržují pravidla platná pro ekologický chov skotu nebyly používány žádné přípravky z kategorie cefalosporinů 3. a 4. generace. 4.2.2. Výsledky fenotypových a genotypových metod k detekci antibiotické rezistence u izolátů E. coli z ekofarmy v Luboměři Rektálním odběrem bylo získáno celkem 201 izolátů E. coli a 2 mléčné filtry. Izoláty byly odebrány z dojnic, prvotelek a telat. Označení vzorků je znázorněno v Tabulce 6. Tabulka 6. Označení vzorků odebraných na farmě v Luboměři D1 I. – D60 I. P61 – P108 D109 II. – D132 II. Z133 – Z144 145 - 191

Tr192 – Tr201 F-1, F-2

Dojnice I. Prvotelky Dojnice II Dojeny 1x denně před zaprahnutím Telata: 147 – 162: Tv1 – Tv15 (telata venkovní ustájení) 163 – 184: Ts1 – Ts22 (telata ustájení teletník-větší) 185 – 191: T1 – T7 (telata ustájení teletník-malá) Odebrán trus, volné ustájení (zaprahnuté) Filtr 1, Filtr 2

Pomocí double-disk synergy testu byly určeny izoláty produkující ESBL (viz Obrázek 3). Z celkového počtu 201 izolátu byl detekován jediný ESBL+ izolát (D12 I.), což tvoří podíl 0,5 % ESBL+ vzorků. Produkce širokospektré β-laktamázy byla ověřena pomocí 75

metody PCR na průkaz genu blaCTX-M. Tento izolát byl dále testován společně s ESBL+ izoláty z farmy v Těšanech. Z důvodu výskytu jediného ESBL+ vzorku mezi izoláty z farmy v Luboměři byl tento izolát (D12 I) dále označován jako vzorek „EKO“. Izoláty E. coli z ekofarmy v Luboměři byly dále podrobeny diskové difúzní metodě pro zjištění rezistence / citlivosti ke 12 vybraných antibiotikům (seznam antibiotických disků viz Metodika – Tabulka 1). Touto metodou bylo zjištěno 7 izolátů, které vykazovaly rezistenci k některému z antibiotik. Všech 7 izolátů bylo multirezistentních a byla u nich prokázána rezistence k ampicilinu a cefalotinu. U šesti ze zmíněných sedmi izolátů byla navíc detekována rezistence k amoxicilin-kyselině klavulanové a jeden vzorek byl intermediálně citlivý ke streptomycinu. Těchto 7 rezistentních izolátů bylo odebráno dojnicím I a telatům z teletníků (větším). Vzorek EKO vykazoval rezistenci k ampicilinu a cefalotinu. Izolát EKO byl dále metodou PCR testován na přítomnost genů int1 a int2 kódujících enzym integrázu, přičemž výsledek byl v obou případech negativní. Přítomnost integronů první a druhé třídy (class 1 a 2) se již dále neprokazoval. Obrázek 3. Pozitivní reakce double-disk synergy testu u izolátu EKO

Mléčné filtry (Luboměř) Při odběru vzorků na ekofarmě v Luboměři byly odebrány i dva mléčné filtry. Po provedení double-disk synergy testu a diskové difúzní metody se zjistilo, že izoláty z mléčných filtrů nejsou producenty ESBL a rovněž nevykazují rezistenci ke zvoleným antibiotikům, proto nebyly dále testovány.

76

4.3. Výsledky pulzní gelové elektroforézy (PFGE) u ESBL+ izolátů E. coli z farmy v Těšanech a Luboměři Izoláty s produkcí širokospektré β-laktamázy byly podrobeny pulzní gelové elektroforéze (PFGE). Jednalo se o 120 izolátů E. coli z rektálního výtěru dojnic a 1 mléčný filtr z farmy v Těšanech a dále 1 izolát E. coli z rektálního výtěru dojnice z ekofarmy v Luboměři. Pomocí PFGE byly získány jednotlivé pulzotypy, na základě kterých byly vzorky rozděleny do 12 skupin. Jeden z pulzotypů je izolát č. 296 - lytický kmen, který bez přidání thiomočoviny není možné na gelu vizualizovat (viz Obrázek 7). Označení pulzotypů a počet vzorků, které náleží do jednotlivých skupin jsou shrnuty v Tabulce 7. Vybraní zástupci pulzotypů (vždy první vzorek daného pulzotypu z Tabulky 7) a jejich restrikční profily jsou znázorněny na Obrázku 4. Dále už byly analyzovány pouze izoláty představující zástupce jednotlivých pulzotypů. Tabulka 7. Označení pulzotypů, výčet a označení jednotlivých vzorků náležících k danému pulzotypu. Pulzotyp Počet vzorků Označení vzorků A 104 15/B, 20/B (a ostatní vzorky z Tabulky 4-příloha, které nejsou uvedeny zde v tabulce) A1 2 106/B, 158/B B 1 76/B C 1 83/B D 6 197/B, (277/B, 102/B, 114/B, 191/B, 288/B) D1 1 279/B E 1 290/B, Filtr 1 F 1 289/B G 1 300/B H 1 96/B I 1 296/B Eko 1 EKO Celkem: 121

Na Obrázku 4 je písmenem K označen kontrolní kmen Salmonella enterica serovar Braenderup (viz Metodika – Obrázek 8) a jednotlivá písmena A-H, včetně Eko, představují pulzotypy. Pulzotypy A a A1 se liší polohou jediného proužku, stejně tak pulzotypy D a D1, proto nebyly označeny různými písmeny abecedy, ale pomocí indexu 1.

77

Obrázek 4. Pulzotypy vybraných 11 izolátů (zástupci pulzotypů)

U izolátů, které patřily do jednotlivých pulzotypů, byla provedena S1 PFGE. Pulzní gelová elektroforéza s použitím enzymu S1 odhalí plazmidy, viz Obrázek 5. Byly zde testovány izoláty 76/B, 83/B, 96/B, 106/B, 158/B, 197/B, 277/B, 279/B, 289/B, 290/B, 300/B a F1. Obrázek 5. Výsledky S1 PFGE izolátů E. coli z farmy v Těšanech

78

Na Obrázku je písmenem K označen kontrolní kmen Salmonella enterica serovar Braenderup (viz Metodika – Obrázek 8). Jednotlivé proužky znázorňují plazmidy. Pomocí S1 PFGE je možno (na rozdíl od izolace plazmidové DNA dle Birnbiom et Doly, 1979) vizualizovat plazmidy větší velikost. Rozmezí velikosti plazmidů, které lze touto metodou odhalit je 20 – 1135 bp. Na obrázku je patrný plazmid o velikosti asi 40 kb (vyznačen šipkou), který je možno nalézt téměř u všech izolátů (kromě izolátu 158/B, ten však nemá gen blaCTX-M-1). Tento plazmid nese gen blaCTX-M-1 (viz dále).

4.4. Výsledky konjugace u ESBL+ izolátů

U vybraných 12 izolátů (izoláty představující zástupce jednotlivých pulzotypů) byla testována schopnost konjugace a tím tedy přenos plazmidů nesoucích geny rezistence do recipientní buňky. U izolátů č. 15/B, 106/B, 76/B, 83/B, 197/B, 279/B, 290/B, 289/B, 300/B, 96/B a EKO se prováděla konjugace do recipientních buněk E. coli MT 102 nesoucích rezistenci k rifampicinu (Rif) a kyselině nalidixové (Nal) a S. Typhimurium SL 5325 (NalRif). Jelikož izolát č. 296/B vykazoval rezistenci ke kyselině nalidixové, byly pro konjugaci použity recipientní buňky E. coli MT 102 s rezistencí k azidu sodnému (Azid) a S. Typhimurium SL 5235 (Azid). Pro ověření přenesení plazmidu nesoucího rezistenci byla u konjugantů provedena metoda PCR na průkaz genu blaCTX-M. Pro rozlišení konjugantů od donorových kmenů E. coli bylo využito chromogenního média (odlišná barva jednotlivých konjugantů a donorových kmenů E. coli). Výsledky konjugace a rozlišení barevnosti na chromogenním médiu jsou shrnuty v Tabulce 8. Růst na chromogenním médiu je znázorněn na Obrázku 6.

79

Obrázek 6. Růst konjugantů a donorových kmenů E. coli na chromogenním médiu

Bílá barva – kmen S. Typhimurium SL 5325, konjugant Modrá barva – kmen E. coli MT 102, konjugant Fialová barva – donorový kmen E. coli

Tabulka 8. Výsledky konjugace ESBL+ izolátů (zástupci jednotlivých pulzotypů) Označení Barva na Přítomnost konjuganta CHROMu genu blaCTX-M 15 MT 1 modrá + 15 MT 2 modrá + 106 MT 1 modrá + 106 MT 2 modrá + 76 MT 1 modrá + 76 MT 2 modrá + 83 MT 1 modrá + 83 MT 2 modrá + 197 MT 1 modrá + 197 MT 2 modrá + 279 MT 1 modrá + 279 MT 2 modrá + 290 MT 1 modrá + 290 MT 2 modrá + 289 MT 1 modrá 289 MT 2 modrá 300 MT 1 modrá + 300 MT 2 modrá + 96 MT 1 modrá + 96 MT 2 modrá + 296 MT 1 modrá 296 MT 2 modrá + EKO MT 1 modrá EKO MT 2 neroste +

Určení Označení Barva na Přítomnost konjuganta CHROMu genu blaCTX-M TC 15 SL 1 bílá + TC 15 SL 2 bílá + TC 106 SL 1 bílá + TC 106 SL 2 bílá + TC 76 SL 1 bílá + TC 76 SL 2 bílá + TC 83 SL 1 bílá + TC 83 SL 2 neroste + TC 197 SL 1 bílá + TC 197 SL 2 bílá + TC 279 SL 1 bílá + TC 279 SL 2 bílá + TC 290 SL 1 bílá + TC 290 SL 2 bílá + recip 289 SL 1 bílá + recip 289 SL 2 bílá + TC 300 SL 1 neroste + TC 300 SL 2 modrá + TC 96 SL 1 neroste + TC 96 SL 2 fialová + recip 296 SL 1 neroste + TC 296 SL 2 růžová + recip EKO SL 1 bílá donor EKO SL 2 bílá -

Určení TC TC TC TC TC TC TC donor TC TC TC TC TC TC TC TC donor TC donor donor donor donor recip recip

MT – konjugant E. coli MT 102, SL – konjugant S. Typhimurium SL 5325, TC – konjugant (transkonjugant), recip. – recipient, donor – donorový kmen E. coli, neroste – kmen nevyrostl na LB agaru s rifampicinem a kyselinou nalidixovou, CHROM – chromogenní médium

80

4.5. Výsledky transformace plazmidové DNA do chemicky kompetentních buněk E. coli Z vybraných izolátů představujících zástupce jednotlivých pulzotypů byla izolována plazmidová DNA a pomocí agarózové gelové elektroforézy byly vizualizovány plazmidy, které donorové kmeny E. coli obsahovaly (Obrázek 7). Následně byly donorové kmeny E. coli podrobeny umělé transformaci do chemicky kompetentních buněk E. coli DH5α. Ze zvolených 4 kolonií transformantů narostlých na LB agaru s obsahem cefotaximu byla vybrána jedna kolonie (označení TF1) a z této kolonie byla izolována plazmidová DNA a vizualizována na agarózovém gelu (Obrázek 8) pro srovnání počtu a velikosti plazmidů, které se procesem transformace přenesly do kompetentních buněk E. coli DH5α. Z buněk transformantů byla izolována DNA a metodou PCR byla ověřena přítomnost genu blaCTX-M-1 (u 12 zvolených izolátů byl specifikován gen blaCTX-M do skupin, přičemž všech 12 izolátů bylo na základě metody PCR se specifickými primery zařazeno do skupiny CTX-M-1, seznam primerů viz Tabulka 2-příloha). U zmíněných 12 izolátů se potvrdila přítomnost genu blaCTX-M-1, jednalo se tedy o transformanty. Na Obrázku 7 je možno vidět plazmidy jednotlivých izolátů donorových kmenů E. coli. Plazmidy se zde vyskytují v různém počtu a velikosti, nicméně všechny izoláty (kromě vzorku EKO) mají stejně velký plazmid o velikosti asi 40 kb. Tento plazmid se přenesl transformací do chemicky kompetentních buněk E. coli DH5α, což je vidět na Obrázku 8. Tímto se společně s plazmidy přenesla do kompetentních buněk i rezistence k β-laktamovým antibiotikům kódovaná genem blaCTX-M-1. Vzorek č. 15/B má stejný profil jako vzorek č. 106/B (na Obrázku 7) a na fotografii není umístěn z kapacitních důvodů. Metodou izolace plazmidové DNA (dle Birnboim et Doly, 1979) je možno vizualizovat plazmidy v rozmezí velikostí 7 – 147 kb. Ve srovnání s metodou S1 PFGE je zde možno odhalit spíše plazmidy menší velikosti.

81

Obrázek 7. Plazmidová DNA izolovaná z donorových kmenů E. coli

K – kontrolní kmen E. coli 39R861 (velikost jednotlivých plazmidů viz Metodika – Obrázek 9)

Obrázek 8. Plazmidová DNA izolovaná z transformantů TF1

K – kontrolní kmen E. coli 39R861 (velikost jednotlivých plazmidů viz Metodika – Obrázek 9)

82

4.6. Výsledky RFLP (makrorestrikční analýza) Z vybraných vzorků transformantů (TF1) představujících zástupce jednotlivých pulzotypů byla izolována plazmidová DNA, která byla smíchána s restrikční směsí obsahující enzym EcoRV a dále byla provedena restrikční analýza. Výsledkem bylo získání restrikčních profilů (Obrázek 9). Obrázek 9. Restrikční profily po štěpení enzymem EcoRV

Na Obrázku 9 byl písmenem M označen marker 2-log (viz Metodika – komponenty pro PCR / Obrázek 1-příloha). Písmena abecedy označují jednotlivé restrikční profily. Celkem byly metodou RFLP získány 4 restrikční profily, přičemž profil A byl zastoupen 5 vzorky (15/B, 83/B, 290/B, 289/B a 300/B), profil B jen 2 vzorky (197/B a 279/B), profil C představoval jediný vzorek (296/B) a profil D byl zastoupen 3 vzorky (76/B, 96/B a 106/B). Použití enzymu EcoRV nebylo zvoleno zcela optimálně z důvodu získání nízkého počtu fragmentů. Lepší variantou by byl enzym, který by štěpil plazmidovou DNA transformantů s vyšší frekvencí a výsledkem by pak bylo získání vyššího počtu fragmentů u jednotlivých izolátů.

83

4.7. Výsledky Multiplex PCR (PCR-based replicon typing – PBRT)

Na základě restrikční analýzy bylo vybráno 5 rozdílných restrikčních profilů. U vybraných pěti vzorků (TF1), kteří představují zástupce rozdílných restrikčních profilů, byla pro přiřazení vybraných izolátů do inkompatibilní skupiny plazmidů provedena Multiplex PCR se 16 páry primerů (viz Metodika - Tabulka 9). Reakce ukázala, že všechny vzorky plazmidové DNA transformantů patří do inkompatibilní skupiny N (IncN) viz Obrázek 10. Obrázek 10. Multiplex PCR – přiřazení k inkompatibilní skupině plazmidů

Na Obrázku 10 je písmenem M označen marker 100 bp (viz Metodika – komponenty pro PCR / Obrázek 1-příloha) a nalevo od něj jsou umístěny pozitivní kontroly k daným Inc skupinám plazmidů (viz Metodika – Tabulka 9). Všech 5 vzorků, které představují zástupce rozdílných restrikčních profilů bylo na základě Multiplex PCR zařazeno do Inc skupiny N, délka PCR produktu byla 471 bp. V případě pozitivní kontroly HI2 se ve stejné výšce jako pozitivní kontrola N nachází nespecifický produkt PCR.

84

5. DISKUZE

5.1. Používání cefalosporinů ve veterinární medicíně a dopad na vznik a šíření rezistence Mezi významné veterinární cefalosporiny 3. a 4. generace patří ceftiofur a cefchinom (FAO/WHO/OIE, 2007). Tato dvě antibiotika jsou indikována u respiračních infekcí prasat, cefchinom navíc u zánětu epidermis a meningitid. Další antibiotika používána ve veterinární medicíně jsou cefalotin, cefalexin, cefazolin a cefapyrin (první generace cefalosporinů), cefuroxim (druhá generace) a cefoperazon (třetí generace), a to většinou k léčbě mastitidy u skotu. Na farmě v Těšanech byly používány cefalosporiny vyšších generací a z nich byl nejčastěji podáván ceftiofur. Rezistence k cefalosporinům byla kódována genem blaCTX-M-1 neseném na plazmidu. Šíření plazmidů nesoucích geny blaCTX-M-1 mezi zvířaty se zdá být umocňováno používáním širokospektrých cefalosporinů ve veterinární medicíně (Cavaco, 2008). Prokázaly to i pokusy in vivo, kdy se zvýšila rychlost růstu a selektovaly se kmeny E. coli ze střevní mikroflóy prasat nesoucí geny blaCTX-M-1. Selekce těchto kmenů byla následkem léčby prasat amoxicilinem, ceftiofurem či cefchinomem. Výskyt bakterie E. coli rezistentní k cefalosporinům byl zaznamenán ve většině oblastí světa (Cavaco, 2008). Nejrozšířenějšími enzymy, které jsou zodpovědné za rezistenci k cefalosporinům jsou v Evropě β-laktamázy typu CTX-M a ve Spojených státech CMY-2. Rezistence k cefalosporinům byla častěji zjištěna u bakterií zvířecího původu. Rostoucí rezistence k cefalosporinům mezi bakteriemi izolovanými z potravinových zvířat je předmětem zájmu především pro potravinářský průmysl, a to z důvodu možného přenosu rezistentních patogenů ze zvířat na lidi prostřednictvím potravního řetězce (Collignon et Aarestrup, 2007). Na farmách v Těšanech i v Luboměři byly rektálním odběrem získány izoláty bakterie E. coli, která je komenzální bakterií gastrointestinálního traktu zvířat i lidí. Vzhledem k celosvětovému rozšíření a výskytu u mnoha živočichů je bakterie E. coli považována za jeden z hlavních rezervoárů genů antibiotické rezistence, které je schopna přenášet mezi zvířaty, lidmi a prostředím (Cavaco, 2008). Přenos genů rezistence je možný přímým kontaktem, či nepřímo 85

přes potravní řetězec (Collignon et Aarestrup, 2007). Jedním ze závažných dopadů šíření antibiotické rezistence je omezení možností léčby či úplné selhání léčby antibiotiky z důvodu vzniku rezistence na tyto léky. Širokospektré cefalosporiny byly Světovou zdravotnickou organizací (WHO) zařazeny mezi kriticky důležitá antibiotika v humánní medicíně (Moodley et Guardabassi, 2009). Konkrétně antibiotikum ceftiofur, které bylo nejčastěji indikováno právě na farmě v Těšanech, je cefalosporin 3. generace, který je možno použít k léčbě respiračních infekcí prasat a skotu. Různí autoři původních sdělení upozorňují na to, že používání cefalosporinů vyšších generací ve veterinární medicíně může vést k selekci rezistentních bakterií z čeledi Enterobacteriaceae u zvířat, přičemž důsledkem je pak zvýšení rizika zoonotického přenosu bakterií či plazmidů nesoucích geny rezistence k β-laktamovým antibiotikům (Cavaco, 2008; Jiang et al., 2006; Tragesser et al., 2006). 5.1.1. Srovnání antibiotické politiky na farmě v Těšanech a ekofarmě v Luboměři Zatímco na farmě v Těšanech byla léčebně používána antibiotika včetně cefalosporinů vyšších generací, na ekofarmě v Luboměři (kde dodržují pravidla platná pro ekologický chov skotu) nebyly používány žádné přípravky z kategorie cefalosporinů 3. a 4. generace. V Luboměři byly v průběhu roku 2008 podávány pouze peniciliny, aminoglykosidy a tetracykliny, nikoliv však cefalosporiny, v Těšanech byla situace opačná. Zde byla dojnicím aplikována antibiotika ze skupiny cefalosporinů 3. a 4. generace (ceftiofur, cefoperazon, cefchinom) a další včetně penicilinů, oxytetracyklinu, enrofloxacinu, aminoglykosidů či amoxicilin-kyseliny klavulanové.

5.2. Záchyt ESBL+ kmenů a antibiotická rezistence Antibiotická rezistence je přirozený důsledek selektivního tlaku, který je vyvíjen na bakterie přítomností antibiotik (Moodley, 2008). V případě gramnegativních bakterií je jedním z nejdůležitějších mechanismů rezistence produkce enzymu β-laktamázy. Tento enzym inhibuje transpeptidázu, která se podílí na výstavbě buněčné stěny bakterií (Kolář et al., 2010). Širokospektré β-laktamázy jsou schopny inhibovat účinky cefalosporinů vyšších generací a penicilinů. Tvorba těchto enzymů u zástupců čeledi Enterobacteriaceae představuje problém, který by mohl vyústit ve vysoké procento úmrtnosti pacientů i zvířat. V odborné literatuře se stále častěji objevují informace o výskytu ESBL+ izolátů bakterie E. coli ve střevní mikroflóře 86

zdravých potravinových zvířat či v potravinách. Výskyt producentů ESBL byl zaznamenán v různých evropských státech (Collignon et Aarestrup, 2007; Blanc et al., 2008; Briñas et al., 2003; Girlich et al., 2007). 5.2.1. Výskyt producentů ESBL na farmě v Těšanech a ekofarmě v Luboměři Výsledkem používání cefalosporinů vyšších generací a ostatních antibiotik na farmě v Těšanech byla pravděpodobně selekce ESBL+ izolátů E. coli, které navíc vykazovaly multirezistenci v diskové difúzní metodě. U izolátů byla prokázána rezistence k ampicilinu, cefalotinu, streptomycinu, sulfonamidům, tetracyklinům, ceftazidimu a kyselině nalidixové. Podíl izolátů produkujících širokospektré β-laktamázy tvořil 38,8 %. V případě ekofarmy v Luboměři pod Strážnou byl výsledkem uvážlivého používání antibiotik k léčbě skotu pouze jediný ESBL+ izolát, což činí podíl 0,5 % z celkového počtu izolátů E. coli odebraných na farmě. 5.2.2. Výskyt ESBL+ kmenů ve veterinární oblasti V ČR byl výskyt kmenů z čeledi Enterobacteriaceae s produkcí ESBL zaznamenán u drůbeže (Kolář et al., 2010). V případě krůt byl podíl ESBL+ izolátů roven 4 % (celkem 6 izolátů ze 150), přičemž 3 z nich nesly geny blaCTX-M-1. U brojlerů byl detekován jediný izolát s produkcí ESBL z celkového počtu 154 izolátů, což činí podíl 0,65 %. Rezistence k jiným než β-laktamovým antibiotikům byla zjištěna pro florochinolony a tetracykliny, které patří u drůbeže k nejpoužívanějším. U drůbeže se tedy vyskytuje celkově nižší procento ESBL+ kmenů, jedním z důvodů je pravděpodobně skutečnost, že cefalosporiny nejsou u drůbeže v ČR používány. Pro srovnání uvádím studii Girlich et al. (2007), ve které bylo cílem nalézt bakterie produkující β-laktamázu typu CTX-M u zdravé drůbeže v oblastech východní Francie, což je hlavní region chovu brojlerů. Výsledkem bylo 12 ESBL+ izolátů, což tvoří 10,7 % vzorků. Všechny izoláty s produkcí ESBL nesly stejný gen blaCTX-M-1. Ve srovnání s brojlery v Portugalsku je prevalence ESBL+ izolátů vyšší. Costa et al., (2009) uvádějí 40,1 % rezistentních izolátů E. coli izolovaných z brojlerů. V tomto případě 5 z nich neslo geny blaCTX-M. Navíc 85 % izolátů vykazovalo multirezistenci k dalším antibiotikům včetně tetracyklinů, streptomycinu a kyseliny nalidixové. Možným důvodem vysokého záchytu ESBL+ kmenů je v tomto případě používání cefalosporinů vyšších generací i 87

přesto, že podávání cefalosporinových antibiotik není v těchto typech chovů běžné. Jinou pravděpodobnou příčinou by mohlo být používání ostatních antibiotik (chinolonů, tetracyklinů, sulfonamidů apod.), což zřejmě mohlo způsobit ko-selekci ESBL+ kmenů, které na svých mobilních elementech mohou nést více typů rezistence (k β-laktamovým antibiotikům společně s chinolony či jinými). V případě prasat z farmy ve Španělsku byl zjištěn záchyt 39 ESBL+ kmenů z celkového počtu 131 izolátů (což je 29,8 %), přičemž 27 ESBL+ izolátů neslo gen blaCTX-M-1 (Blanc et al., 2006). Většina kmenů byla také multirezistetních a nesla geny kódující rezistenci k tetracyklinům, sulfonamidům a kyselině nalidixové. I zde výsledky poukazují na ko-selekci, protože geny rezistence k β-laktamázám jsou přenášeny prostřednictvím kmenů bakterie E. coli, které jsou multirezistentní k jiným než β-laktamovým antibiotikům. U drůbeže je totiž léčba cefalosporiny velmi málo praktikována a z toho důvodu je přítomnost genů kódujících β-laktamázy pak následkem ko-selekce. Geny rezistence k β-laktamovým antibiotikům mohou být zřejmě součástí stejného mobilního elementu, jako jsou geny rezistence k ostatním antimikrobiálním látkám. Kmeny produkujících ESBL byly zachyceny u skotu i ve Francii (Madec et al., 2008). Ze 657 nemocných kusů dobytka bylo izolováno 41 ESBL+ izolátů bakterie E. coli, což činí 6,2 %. Ze zmíněných 41 vzorků neslo 12 z nich gen blaCTX-M-1. Vzorky byly odebrány i zdravým kusům, kde byla prokázána prevalence ESBL+ kmenů 4,1 % (25 izolátů ze 607). Zde nesla většina gen blaCTX-M-1. Situaci s ohledem na vyšší výskyty ESBL+ izolátů ve Španělsku a ve Francii lze vysvětlit i skutečností, že obě země patří v rámci Evropy ke státům s nejvyšší spotřebou antibiotik jak ve veterinární tak v humánní oblasti (EMEA/CVMP/447259/2009). 5.2.3. Výskyt producentů ESBL v humánní medicíně Stejně jako ve veterinární oblasti, také v humánní medicíně byl v posledních letech zaznamenán nárůst bakteriálních kmenů z čeledi Enterobacteriaceae, které produkují ESBL (Frankhauser et al., 2009). Průzkumy z roku 2007 odhadly, že ve Spojených státech je 6 % kmenů E. coli a 12 % K. pneumonie producenty ESBL. Odhady pro evropské země jsou vyšší, nicméně poukazují na zastoupení ESBL+ izolátů v rozmezí 2,7 – 30 % pro bakterii E. coli. Ve Švýcarsku se v roce 2008 odhadoval výskyt kmenů E. coli rezistentních k cefalosporinům 3. generace na 4,2 %. V Itálii vyšetřovali 2682 vzorků od pacientů a 232 z nich bylo ESBL+ (tedy 8,65 %) (Pagani et al., 2003). Bylo to vůbec poprvé, kdy byly v Itálii 88

z nemocničních pacientů izolovány kmeny z čeledi Enterobacteriaceae s produkcí β-laktamázy typu CTX-M (CTX-M-1, -2 a -15). 5.2.4. „Pandemické“ geny blaCTX-M V minulosti byla rezistence k cefalosporinům spojována s nosokomiálními nákazami, přičemž nejčastějšími typy infekcí byly ty způsobované bakteriemi rodu Klebsiella, které nesly geny rezistence blaTEM a blaSHV (Collignon et Aarestrup, 2007). Tato situace se však po přelomu tisíciletí změnila a hlavním zdrojem genů rezistence k β-laktamázám se stala bakterie E. coli, přičemž se zdá být problémem častějším v komunitách, než v nemocnicích (Cantón et Coque, 2006). Nová situace přinesla také navýšení počtu typů β-laktamáz CTX-M a výskyt více klonů a genetických elementů nesoucích geny blaCTX-M. Ukázalo se také, že šíření enzymů CTX-M nebylo důsledkem množení jediného klonu, nýbrž výskytem více klonů a/nebo mobilních genetických elementů. Následně se bakterie produkující ESBL rozšířily po celém světě. Dnes jsou β-laktamázy typu CTX-M nejčastějšími ESBL a enterobakterie produkující tyto enzymy je možno nalézt nejen u nemocničních pacientů, ale i v komunitách, u zvířat, v potravinářství a v prostředí. (Cantón et Coque, 2006; Livermore et al., 2007; Meunier et al., 2006). Po roce 2000 se rozšířily kmeny E. coli nesoucí geny pro β-laktamázu typu CTX-M prakticky celosvětově a byly proto nazvány „pandemické geny blaCTX-M“ (Peirano et Pitout, 2010) V průběhu posledních 5 let pak tyto geny nahradily původně nejrozšířenější blaTEM a blaSHV a dnes jsou nejběžnějším typem β-laktamáz ve většině oblastí světa. V dnešní době je známo 80 různých typů β-laktamáz CTX-M, které jsou rozděleny na základě podobnosti aminokyselin do 5 skupin (CTX-M-1, -2, -8, -9 a -25). Endemická situace je především v Evropě, Asii a Jižní Americe (Cantón et Coque, 2006). Ve Spojených státech, ne však v Kanadě, byl zaznamenán výskyt spíše jen sporadicky. Určité typy β-laktamáz typu CTX-M se objevovaly v určitých státech, jako např. CTX-M-9 a -14 ve Španělsku (Novais et al., 2006), CTX-M-1 v Itálii (Brigante et al., 2005) či CTX-M-2 ve většině jihoamerických států, Japonsku a Izraeli (Ben-Ami et al., 2006) a typ CTX-M-15 byl rozšířen celosvětově, viz Obrázek 1.

89

Obrázek 1. Výskyt β-laktamáz typu CTX-M v různých geografických oblastech v roce 2006 (upraveno dle Cantón et Coque, 2006)

5.3. Význam ekologických chovů v souvislosti se spotřebou antibiotik a šířením rezistence Ekologické chovy dojnic, prasat a drůbeže v ČR sice dosud pokulhávají za nejrozvinutějšími zeměmi EU, mají však velký potenciál rychlého růstu, který je dán zejména očekávanou poptávkou po dalších biopotravinách živočišného původu a exportními možnostmi v rámci EU. Ekologický chov skotu v Luboměři pod Strážnou je certifikovaným chovem od dubna roku 2009. Bylo zde nalezeno 0,5 % ESBL+ izolátů E. coli (což představovalo jeden vzorek z 201). V dnešní době je k dostání na trhu maso z konvenčních chovů skotu, které je poměrně kvalitní a za rozumnou cenu (Miranda et al., 2009). Nicméně zvířata vyrůstají a žijí ve stísněných podmínkách, což velmi napomáhá vzniku různých infekcí, které je následně leckdy potřeba léčit antibiotiky. V tom nejspíše tkví riziko selekce rezistentních kmenů a tím i 90

nebezpečí šíření rezistence ze zvířat na lidi. Podmínky v ekologických chovech jsou pro zvířata přirozenější a není zde tolik prostoru pro vznik a šíření infekcí. Jak potvrzuje Vaarst et al. (2005), jedním z hlavních způsobů, jak snížit počet nemocí, které by vyžadovaly antibiotickou léčbu, je poskytnout zvířatům lepší životní podmínky, čímž by se v důsledku mohl snížit i počet infekcí. Podle Sato et al. (2005) vykazují farmy, kde se antibiotika často podávají, vyšší podíl rezistentních bakterií a také vyšší procento kmenů, které jsou multirezistentní. Vyšetřovali 1121 izolátů E. coli z konvenčních farem skotu a ekologických chovů. Výsledky ukázaly, že ve srovnání s ekologickým chovem vykazují izoláty z konvenčních chovů vyšší rezistenci k ampicilinu, streptomycinu, kanamycinu gentamycinu, chloramfenikolu, tetracyklinu a sulfametoxazolu.

Farma

v Těšanech

tento

názor

potvrzuje,

protože

celkový

počet

multirezistetních kmenů byl 119 z 309 (tedy 38,5 %), zatímco na ekofarmě v Luboměři bylo 7 multirezistentních kmenů E. coli z 201 (3,5 %).

5.4. Analýza izolátů E. coli metodou PFGE U všech ESBL+ izolátů získaných z farmy v Těšanech byl nalezen gen blaCTX-M-1. Restrikční profily jednotlivých kmenů byly srovnány metodou PFGE s použitím restrikčního enzymu XbaI. Izoláty z farmy v Těšanech byly rozděleny celkem do 11 různých pulzotypů, z nichž pulzotyp „A“ zahrnoval naprostou většinu izolátů, tedy 104. Je zde tedy předpoklad klonálního šíření kmenů na farmě. ESBL+ izolát získaný z ekofarmy v Luboměři byl zařazen do samostatného pulzotypu, protože se neshodoval s žádným pulzotypem z farmy v Těšanech. Výsledky PFGE a analýza plazmidů (Moodley et Guardabassi, 2009) izolátů z prasat v Dánsku ukázaly, že za šíření bakterie E. coli produkující enzym CTX-M-1 mezi prasaty a pracovníky farmy je zodpovědný horizontální přenos genů. Vysoká genetická rozdílnost kmenů (zjištěna metodou PFGE) naznačuje, že šíření genu blaCTX-M-1 nebylo výsledkem rozšíření jednoho klonu, ale již zmíněného horizontálního přenosu genů rezistence mezi několika různými bakteriálními kmeny. Výsledek v případě izolátů z farmy v Těšanech naznačuje šíření jediného klonu mezi dojnicemi, nicméně pulzotypů bylo v Těšanech prokázáno celkem 11 a tedy je i zde velmi pravděpodobný horizontální přenos genů rezistence. Izoláty, které náležely do stejného pulzotypu „A“, byly všechny rezistentní k cefalotinu a ampicilinu, tři z nich navíc k ceftazidimu (izoláty č. 8, 10 a 23). 91

5.5. Analýza plazmidů nesoucích gen blaCTX-M Plazmidy podporují horizontální přenos genů rezistence mezi bakteriemi stejných či různých druhů prostřednictvím procesu konjugace (Carattoli, 2009). V roce 1971 bylo poprvé zavedeno schéma klasifikace plazmidů spočívající ve stabilitě plazmidů během konjugace, což bylo nazváno plazmidovou inkompatibilitou (Datta et Hedges, 1971). Inkompatibilita je vyjádření příbuznosti plazmidů, které mají stejný kontrolní systém pro replikaci. Inkompatibilita je tedy neschopnost dvou příbuzných plazmidů existovat spolu stabilně v jedné buňce. Proto mohou být v buňce konjuganta pouze kompatibilní, tedy nepříbuzné plazmidy. Dnes je známo 27 inkompatibilních skupin plazmidů čeledi Enterobacteriaceae (Carattoli, 2009). V případě izolátů z farmy v Těšanech byl na plazmidu nesen gen blaCTX-M-1. Plazmid nesoucí tento gen měl velikost přibližně 40 kb, náležel do skupiny IncN a bylo možno jej přenést z donorové do recipientní buňky jak procesem konjugace tak i umělou transformací. Podobné výsledky získala Blanc et al. (2008) při analýze izolátů E. coli na zvířecích farmách ve Španělsku. Plazmidy, které byly detekovány u izolátů z prasečí farmy, patřily do inkompatibilní skupiny IncN a ze 71 % byly asociovány s přítomností enzymu CTX-M-1. V dalším případě to byla drůbeží farma, kde byly nalezeny plazmidy náležící do skupiny IncN. I když u izolátů z této farmy se vyskytovalo větší množství různých β-laktamových enzymů a inkompatibilních skupin plazmidů, i zde se geny blaCTX-M-1 nacházely na plazmidech skupiny IncN o velikosti 40 – 46 kb. Stejně tak Moodley a Guardabassi (2009) ve své studii detekovali u izolátů E. coli z prasat v Dánsku plazmidy skupiny IncN o velikosti přibližně 45 kb. Srovnatelně velký plazmid byl nalezen i mezi nosokomiálními kmeny E. coli v severní Itálii (Pagani et al., 2003). U získaných transkonjugantů se objevoval stejný plazmid (nazvaný pSMEC10), jehož velikost byla na základě restrikční analýzy odhadnuta na 50 kb. Plazmidy získané z izolátů z farmy v Těšanech byly podrobeny makrorestrikční analýze, kdy byl jako restrikční enzym použit EcoRV. Na základě RFLP s enzymem EcoRV byly získány pouze 4 restrikční profily, přičemž každý z nich obsahoval jen 3 fragmenty. Takto malý počet fragmentů po naštěpení je nedostačující a bylo by vhodnější izoláty štěpit jiným enzymem. Nicméně z časových důvodů nebylo možné podrobit vzorky štěpení jinými enzymy za účelem zjištění vhodného restrikčního enzymu. Ve své studii Moodley (2008) také použila k restrikčnímu štěpení enzym EcoRV a výsledek byl obdobný, jako v případě izolátů z farmy v Těšanech. Výsledkem byly pouze

92

4 makrorestrikční profily. Proto izoláty následně podrobila makrorestrikční analýze s použitím enzymu HincII. Dřívější studie s využitím párovacích pokusů ke zjištění inkompatibilní skupiny plazmidů ukázaly, že geny ESBL typu blaTEM a blaSHV patří do několika určitých inkompatibilních skupin plazmidů včetně IncM, IncC, IncI a IncHI2 (Novais et al., 2006). Pro přiřazení plazmidů nesoucích geny blaCTX-M byla použita speciální multiplex PCR (PCR-based replicon typing PBRT), která ukázala, že geny blaCTX-M jsou neseny na plazmidech s nízkým spektrem hostitelů (IncFI, IncFII, IncHI2 a IncI) nebo se širokým spektrem hostitelů ( IncN, IncP, IncL/M a IncA/C). Rezistentní izoláty E. coli z farmy v Těšanech nesly gen blaCTX-M-1 zodpovědný za tvorbu enzymu širokospektré β-laktamázy, který byl detekován na plazmidu náležícího do inkompatibilní skupiny IncN. K podobným výsledkům jako v případě izolátů z farmy v Těšanech došli i Moodley a Guardabassi (2009), kteří u svých izolátů E. coli z farem v Dánsku detekovali přítomnost genu blaCTX-M-1 neseného také na plazmidu inkompatibilní skupiny IncN. Ve své studii Moodley a Guardabassi zkoumali přenos a šíření genu blaCTX-M-1 mezi prasaty, pracovníky farmy a prostředím farmy. Odebrali fekální vzorky prasat, rektální výtěry pracovníků a povrchové stěry z prostředí farmy. V případě farmy v Těšanech nebyly odebrány vzorky pracovníků. Bylo by zajímavé zjistit, zda by se i zde prokázal stejný plazmid ze skupiny IncN nesoucí geny rezistence blaCTX-M-1, čímž by se potvrdila možnost horizontálního přenosu genů rezistence ze zvířat na lidi přímým kontaktem se zvířaty. Podle Moodley a Guardabassi (2009) tři ze čtyř vyšetřovaných pracovníků farmy, u kterých byl zjištěna přítomnost bakterie E. coli nesoucí plazmid s geny blaCTX-M-1, neměli 6 měsíců před odebíráním vzorků žádný kontakt s nemocničním prostředím a nebyli ani léčeni žádnými antibiotiky. Proto je pravděpodobné, že pracovníci získali plazmid skupiny IncN s geny rezistence blaCTX-M-1 od prasat, u kterých však byla tato rezistence vyselektována používáním antibiotik. Spojení plazmidů skupiny IncN a genů blaCTX-M-1 bylo již dříve objeveno v Dánsku u klinických izolátů E. coli z prasat (Jørgensen et al., 2007). Klinické izoláty z lidí, u kterých byla nalezena bakterie E. coli nesoucí plazmid skupiny IncN s geny blaCTX-M-1, byly nalezeny ve Španělsku (Novais et al., 2007) a Itálii (Mugnaioli et al.,2006 ).

93

5.6. Horizontální přenos genů Rezistence k antibiotikům může být zděděná, či získaná (Cavaco, 2008). Rezistenci k antibiotikům lze tedy buď získat mutací v genech pro rezistenci, přičemž se tato mutace bude přenášet vertikálně (z mateřské buňky na dceřinnou), nebo jestliže jsou geny rezistence součástí mobilních genetických elementů (plazmidy, transpozony, integrony) mohou být mezi bakteriemi přenášeny horizontálně (horizontální přenos genů). Za horizontální přenos genů jsou považovány i procesy konjugace a transformace. 5.6.1. Konjugace U izolátů E. coli z farem v Těšanech a Luboměři byla zkoumána schopnost konjugace do recipientních buněk E. coli a Salmonella. Schopnost konjugace do recipientních buněk E. coli byla zjištěna u 10 izolátů z 11 testovaných a v případě recipientních buněk Salmonella konjugovalo 9 izolátů z 11 testovaných. Schopnost konjugace potvrzuje možnost horizontálního přenosu genů rezistence mezi bakteriemi stejného i rozdílného druhu. Protože byl procesem konjugace přenesen plazmid nesoucí gen blaCTX-M-1 a tudíž i rezistenci k cefotaximu, je právě procesem konjugace zajištěn horizontální přenos genů a tedy šíření antibiotické rezistence. V případě izolátů z farmy v Těšanech by byla možnost šíření kmenů produkujících ESBL. Na rozdíl od farmy v Těšanech izolát EKO z ekofarmy v Luboměři nevykazoval schopnost konjugace do žádné z použitých recipientních buněk. Možnost šíření rezistence konjugací tedy nebyla prokázána. Toto může být i vysvětlením nízkého záchytu producentů ESBL na ekofarmě v Luboměři. Kdyby byl plazmid konjugativní, bylo by zde i vyšší riziko jeho rozšíření na ekofarmě. Šíření plazmidů nesoucích geny blaCTX-M může přinést závažné důsledky v oblasti zdraví lidí i zvířat (Moodley et Guardabassi, 2009). Kromě rizika přenosu zoonózy ze zvířat na lidi, je zde také riziko přenosu konjugativních plazmidů nesoucích rezistenci z komenzální bakterie E. coli člověka na patogeny respiračního traktu zvířat, což by vedlo k onemocnění zvířete a ekonomickým ztrátám. Na základě mnoha publikovaných studií by měl být např. ceftiofur a vybraná veterinární antibiotika, např. z kategorie cefalosporinů 3. a 4. generace, používána s rozvahou a mělo by být vyloučeno jejich preventivní použití.

94

5.6.2. Transformace U bakterie E. coli není dosud znám proces přirozené konjugace, nicméně byla provedena umělá transformace do chemicky kompetentních buněk E. coli DH5α. K této transformaci byly použity ESBL+ izoláty z farem v Těšanech a Luboměři. Získáním transformantů byla potvrzena schopnost vnitrodruhové transformace u všech 11 izolátů z farmy v Těšanech, nicméně u izolátu z ekofarmy v Luboměři nebyli získáni žádní transformanti. Při procesu transformace byl, v případě izolátů z farmy v Těšanech, do kompetentních buněk E. coli přenesen jediný plazmid nesoucí gen blaCTX-M-1. Tímto způsobem byl na kompetentní buňku E. coli přenesen i fenotyp ESBL. Možnost transformace naznačuje možnost horizontálního přenosu genů rezistence mezi bakteriemi. Transformace byla též prováděna za účelem získání transfromantů s jediným plazmidem. Ti pak byli dále zkoumáni, analyzováni a charakterizováni.

95

ZÁVĚR

Ekologické zemědělství nabývá v České republice na významu. Snahou je poskytnout zvířatům přirozené podmínky, dobrou veterinární péči a mimo jiné i omezit léčbu antibiotiky. V práci byly srovnávány konvenční (intenzivní) a ekologický chov skotu na farmách v České republice. Zjištěné poznatky z této práce potvrdily výsledky jiných studií, že nadměrné používání antibiotik selektuje rezistentní kmeny, které se dále šíří mezi ostatními zvířaty, lidmi a prostředím. Konkrétně bylo zjištěno, že používání cefalosporinů u mléčného skotu vedlo k selekci kmenů produkujících enzymy β-laktamázy se širokým spektrem účinku kódovaných genem blaCTX-M-1 neseném na plazmidu. Šíření těchto genů se stává problémem nejen v České republice, ale i v ostatních státech EU. Cefalosporiny jsou hodnoceny jako kriticky důležitá antibiotika v humánní i veterinární medicíně. V obou případech je třeba léčivé přípravky obsahující cefalosporiny, zejména 3. a 4. generace, předepisovat uvážlivě a pouze na základě mikrobiologického vyšetření. V oblasti veterinární medicíny je to však poněkud komplikováno skutečností, že veterinární léčivé přípravky s obsahem cefalosporinů vyšších generací mají nízké či dokonce nulové ochranné lhůty na mléko. Proto je jejich předepisování pro dojnice častější v porovnání s přípravky patřícími mezi tzv. léky první volby, u kterých je ochranná lhůta pro mléko delší. Řešením situace spojené se šířením rezistentních kmenů by bylo zdokonalení pravidel antibiotické politiky a rozumné používání veterinárních léčivých přípravků obsahujících cefalosporiny vyšších generací. Ve srovnání se severskými státy (např. při srovnání se Švédskem), kde je spotřeba antibiotik velmi nízká, má Česká republika spotřebu poměrně vysokou, i když jde o obdobně velké populace léčených zvířat. V posledních letech byl v oblasti cefalosporinových přípravků zaznamenán spíše nárůst spotřeby nežli pokles. V rámci Evropské unie však existují i státy s výrazně vyšší spotřebou antibiotik než u nás. Je zde však také zaznamenávána vyšší prevalence kmenů rezistentních na antibiotika, a to jak v oblasti veterinární, tak humánní. Tato práce je součástí snahy o získání ucelených a objektivních informací o výskytu ESBL pozitivních kmenů v rámci České republiky a může přispět k doplnění mozaiky údajů v rámci prostoru Evropské unie.

96

LITERATURA Amber, R.P. 1980. The structure of beta-lactamases. Philos. Trans. R Soc. Lond. B Biol. Sci. 289: 321-331. Andrew, S.M., Moyes, K.M., Borm, A.A., Fox, L.K., Leslie, K.E., Hogan, J.S., Oliver, S.P., Schukken, Y.H., Owens, W.E., Norman, C. 2009. Factors associated with the risk of antibiotik residuem and intramammary pathogen presence in milk from heifers administered prepartum intramammary antibiotik therapy. J. Vet. Microbiol. 134: 150156. Ben-Ami., R, Schwaber, M.J., Navon-Venezia, S., Schwarz, D., Giladi, M., Chmelnitsky, I., Leavitt, A., Carmeli, Y. 2006. Influx of extended-spectrum β-lactamase-producing Enterobacteriaceae into the hospital. J.Clin. Infect. Dis. 42: 925-934. Billová, V., Hera, A., Novotná, P. 2007. Minimalizace rizik používání vybraných skupin antimikrobiálních léčiv u potravinových zvířat. [online] [cit. 29. dubna 2009] Dostupné na www: Biological Standards Commission. 2007. Report of the Meeting of the OIE ad hoc Group on Antimicrobial Resistence. Příloha V: p. 22-44. Birnboim, H.C. et Doly, J. 1979. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. J. Nucleic Acid Res. 7(6): 1513-1523. Blanc, V., Cortés, P., Mesa, R.J., Miró, E., Navarro, F., Llagostera, M. 2008. Characterisation of plasmids encoding extended-spectrum β-lactamase and CMY-2 in Escherichia coli isolated from animal farms. Int. J. Antimicrob. Agents 31: 76-90. Blanc, V., Mesa, R., Saco, M., Lavilla, S., Prats, G., Miró, E., Navarro, F., Cortés, P. Llagostera, M. 2006. ESBL- and plasmidic class C β-lactamase-producing E. coli strains isolated from poultry, pig and rabbit farms. J. Vet. Microbiol. 118: 299-304. Brigante, G., Luzzaro, F., Perlili, M., Lombardi, G., Coli, A., Rossolini, G.M., Amicosante, G., Toniolo, A. 2005. Evolution of CTX-M-type β-lactamases in isolates of Escherichia coli infecting hospital and community patients. Int. J. Antimicrob. Agents. 25: 157-162. Bonnet, R. 2004. Growing Group of Extended-Spectrum β-lactamases: the CTX-M Enzymes. J. Antimicrob. Agents Chemother. 48: 1-14. Bradford, P.A. 2001 Extended-spectrum β-lactamases in the 21st Century: Characterization, Epidemiology, and Detection of This Improtant Resistance Threat. J. Clin. Microbiol. Rev. 14: 933-951. Briñas, L., Moreno, M.A., Zarazaga, M., Porrero, C., Saenz, Y., Garcia, M., Dominguez, L., Torres, C. 2003. Detection of CMY-2, CTX-M-14, and SHV-12 β-lactamases in Escherichia coli fecal-sample isolates from healthy chickens. J. Antimicrob. Agents Chemother. 47: 2056-2058. 97

Bush, K., Jacoby, G.A., Medeiros, A.A. 1995. A functional classification scheme for blactamases and its correlation with molecularstructure. J. Antimicrob. Agents Chemother. 39: 1211–1233. Cantón, R. et Coque, T.M. 2006. The CTX-M β-lactamase pandemic. J. Curr. Opin. Microbiol. 9: 466-475. Carattoli A., Bertini, A., Villa L., Falbo, V., Hopkins, K.L., Threlfall, E.J. 2005. Identification of plasmids by PCR-based replicon typing. J. Microbiol. Methods. 63: 219228. Carattoli, A. 2009. Resistence Plasmid Families in Enterobacteriaceae. J. Antimicrob. Agents Chemother. 53(6): 2227-2238. Caroff, N., Espaze, E., Berard, I., Rochet, H., Reynaud, A. 1999. Mutations in the ampC promoter of Escherichia coli isolates resistant to oxyiminocephalosporins without extended spectrum beta-lactamase production. FEMS J. Microbiol. Let. 173: 459–465. Cartelle, M., Tomas, M., Molina, F., Moure, R., Villanueva, R., Bou, G. 2004. High-Level Resistence to Ceftazidime Conferred by a Novel Enzyme, CTX-M-32, Derived from CTX-M-1 through a Single Asp240-Gly Substitution. J. Antimicrob. Agents Chemother. 48(6): 2308-2313. Cavaco, L.M. 2008. Mechanisms and selection of resistance to quinolones and cephalosporins in Escherichia coli. Faculty of Life Sciences, University of Copenhagen, Denmark. Collignon, P. et Aarestrup, F.M. 2007. Extended-spectrum beta-lactamases, food and cephalosporin use in food animals. J. Clin. Infect. Dis. 44(10): 1391-1392. Costa, D., Vinué, L., Poeta, P., Coelho, A.C., Matos, M., Saénz, Y., Somalo, S., Zarazaga, M., Rodrigues, J., Torres, C. 2009. Prevalence of extended-spectrum beta-lactamaseproducting Escherichia coli isolates in fecal samples of broilers. J. Vet. Microbiol. 138: 339-344. Čížek, A., Dolejská, M., Novotná, R., Brychta, J., Bardoň, J., Haas, D., Bednář, V., Hlaváček, J., Smola, J. 2008. Využití mléčných filtrů ke sledování výskytu původců alimentárních onemocnění člověka a indikátorových bakterií rezistentních vůči antimikrobiálním látkám na mléčných farmách. J. Veterinářství. 4: 250-256. Datta, N. et Hedges, R.W. 1971. Compatibility groups among fi- R factors. J. Nature. 234: 222223. Datta, N. et Kontomichalou, P. 1965. Penicillinase synthesis controlled by infectious R factors in Enterobacteriaceae. J. Nature. 208: 239-244. Evropská léková agentura - EMEA [online] [cit. 21. dubna 2009] EMEA/CVMP/SAGAM/81730/2006-Rev.1* (označení v textu: EMEA) Dostupné na www: < www.emea.europa.eu/pdfs/vet/sagam/8173006enfin.pdf>

98

EMEA/CVMP/353297/2005 Dostupné na www: <www.emea.europa.eu/pdfs/vet/swp/35329705.pdf> Evropská léková agentura – EMA [online] [cit. 26. února 2010] EMEA/CVMP/SAGAM/383441/2005 Dostupné na www: <www.ema.europa.eu/pdfs/vet/sagam/38344105enfin.pdf> EMEA/CVMP/627/01 Dostupné na www: <www.ema.europa.eu/pdfs/vet/ewp/062701en.pdf> EMEA/CVMP/SAGAM/383441/2005 Dostupné na www: <www.ema.europa.eu/pdfs/vet/sagam/38344105enfin.pdf.> Doc.Ref.EMEA/CHMP/552347/2008 Committee for medicinbal products for human use summary of positive opinion for Zevtera Dostupné na www: EMEA/CVMP/447259/2009 Joint Opinion on antimicrobial resistance (AMR) focused on zoonotic infections Dostupné na www: FAO/WHO/OIE – Food and Agriculture Organization of the United Nations/World Health Organization/Office international des epizooties (World organization for Animal Health). 2007. Point FAO/WHO/OIE Expert Meeting on Critically important Antimicrobials. Report of the FAO/WHO/OIE Expert meeting. [online] [cit. 9. dubna 2010] Dostupné na www: Foley, S.L., Lynne, A.M., Nayak, R. 2009. Molecular typing methodologies for microbial source tracking and epidemiological investigations of Gram-negative bacterial foodborne pathogens. J. Infection, Genetics and Evolution. 9: 430-440. Frankhauser, C., Zingg, W., Francois, P., Dharan, S., Schrenzel, J., Pittet, D., Harbarth, S. 2009. Surveillance of Extended-Spectrum-β-Lactamase-Producing Enterobacteriaceae in a Swiss Tertiary Care Hospital. J. Swiss Med. Wkly. 139: 747-751. Generální ředitelství pro zemědělství a rozvoj venkova při Evropské komisi Ekologické zemědělství [online] [cit. 2. února 2010] Dostupné na www: < http://ec.europa.eu/agriculture/organic/organic-farming/what-organic_cs> Legislativa [online] [cit. 2. února 2010] Dostupné na www: < http://ec.europa.eu/agriculture/organic/news/press-releases_cs#organic> Girlich, D., Poirel, L., Carattoli, A., Kempf, I., Lartigue, M-F., Bertini, A., Nordmann, P. 2007. Extended-Spectrum β-Lactamase CTX-M-1 in Escherichia coli Isolates from Healthy Poultry in France. J. Appl. Environ. Microbiol. 73(14): 4681-4685. Hera, A., Billová, V., Novotná, P., Pokludová, L., Bureš, J. 2009b. Racionální používání antimikrobiálních látek ve veterinární medicíně. J. Vet. Klinika. 6: 32-39. Hera, A., Koutecká, L., Dorn, D. 2009a. Věstník ÚSKVBL (3/2009). Nukleus HK, p. 33-38. 99

Hozová, B., Görner, F., Sklenárová, Z. 1994. Novšie poznatky z oblasti stanovenia inhibičných látok v mlieku. J. Potrav. Vědy. 12: 489-496. Hrabalová, A. et Zander, K. 2006. Ekologický chov skotu v České republice: struktura, vývoj a ekonomická výkonnost. J. Agric. Econ. – Czech. 52: 89-100. Hunter, S.B., Vauterin P., Lambert-Fair, M.A., Van Duyne, M.S., Kubota, K., Graves, L., Wringley, D., Barrett, T., Ribot, E. 2004. Establishment of a Universal Size Standard Strain for Use with the PulseNet Standardized Pulsed-Field Gel Electrophoresis Protocols: Converting the National Databases to the New Size Standard. J. Clin, Microbiol. 43(3): 1045-1050. Jarlier, V., Nicolas, M., Fournier, G., Philippon, A. 1988. Extended broad-spectrum βlactamases conferring transferable resistance to newer β-lactam agents in Enterobacteriaceae: hospital prevalence and suspectibility pattern. J. Rev. Infect. Dis. 10: 867-878. Jiang, X., Yang, H., Dettman, B., Doyle, M. P. 2006. Analysis of fecal microbial flora for antibiotic resistance in ceftiofur-treated calves. J. Foodborne Pathog. Dis. 3: 355–365. Jørgensen, C.J., Cavaco, L.M., Hasman, H., Embarg, H-D., Guardabassi, L. 2007. Occurrence of CTX-M-1-producing Escherichia coli in pigs treated with ceftiofur. J. Antimicrob. Chemother. 59(5): 1040-1042. Kolář, M., Bardoň, J., Chromá, M., Hricová, K., Štosová, T., Bauer, P., Koukalová, D. 2010. ESBL and AmpC beta-lactamase-producing Enterobacteriaceae in poultry in the Czech Republic. J. Veterinární medicína. 55(3): 119-124. Knothe, H., Shah, P., Krcmery, V., Antal, M., Mitsuhashi, S. 1983. Transferable resistance to cefotaxime, cefoxitin, cefamandole and cefuroxime in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Serratia marcescens. J. Infection. 11: 315-317. Krauss, H., Weber, A., Appel, M., Enders, B., Isenberg, H.D., Schiefer, H.G., Slenczka, W., Graevenitz, A., Zahner, H. 2003. Zoonosis. Infectious Diseases Transmissible from Animals to Humans. 3rd ed. ASM Press, Washington, DC. Lévesque, C., Piché, L., Larose, Ch., Roy, P.H. 1995. PCR Mapping of Integrons Reveals Several Novel Combinations of Resistance Genes. J. Antimicrob. Agents Chemother. 39: 185-191. Li, X.-Z., Methrotra, M., Ghimire, S., Adewoye, L. 2007. β-lactam resistance and β-lactamases in bacteria of animal origin. J. Vet. Microbiol. 121: 197-214. Li, X.-Z. et Nikaido, H. 2004. Efflux-mediated drug resistance in bacteria. J. Drugs. 64: 159204. Livermore, D.M. 1995. β-lactamases in Laboratory and Clinical Resistance. J. Clin. Microbiol. Rev. 8:557-584.

100

Livermore, D.M., Cantón, R., Gniadkowski, M., Nordmann, P., Rossolini, G.M., Arlet, G., Ayala, J., Coque, T.M., Kern-Zdanowicz, I., Luzzaro, F., Poirel, L., Woodford, N. 2007. CTX-M: changing the face of ESBLs in Europe. J. Antimicrob. Chemother. 59: 165-174. Madec, J.Y., Lazizzera, C., Chậtre, P., Meunier, D., Martin, S., Lepage, G., Ménard, M-F., Lebreton, P., Rambaud, T. 2008. Prevalence of Fecal Carriage of Acquired ExpandedSpectrum Cephalosporin Resistance in Enterobacteriaceae Strains from Cattle in France. J. Clin. Microbiol. 46(4): 1566-1567. Matsumoto, Y., Ikeda, F., Kamimura, T., Yokota, Y., Mine, Y. 1988. Novel plasmidmediated β-lactamase from Escherichia coli that inactivates oxyimino-cephalosporins. Antimicrob. Agents Chemother. 32: 1243-1246. Medeiros, A.A. 1984. β-lactamases. Br. Med. Bull. 40: 18-27. Meunier, D., Jouy, E., Lazizzera, C., Kobisch, M., Madec, J.Y. 2006. CTX-M-1 and CTX-M-15 type beta-lactamases in clinical Escherichia coli isolates recovered from food-producing animals in France. Int. J. Antimicrob. Agents. 28(5): 402-407. Miranda, J.M., Mondragón, A., Vázquez, B.I., Fente, C.A., Cepeda, A., Franco, C.M. 2009. Influence of farming methods on microbiological contamination and prevalence of resistance to antimicrobial drugs in isolates from beef. J. Meat Science. 82: 284-288. Moodley, A. 2008. Zoonotic Transmission of Antimicrobial Resistant Bacteria of Human Clinical Significance by Direct Contact with Animals. Faculty of Life Sciences, University of Copenhagen, Denmark. p. 19-22. Moodley, A. et Guardabassi, L. 2009. Transmission of IncN plasmids carrying blaCTX-M-1 between commensal Escherichia coli in pigs and farm workers. J. Antimicrob. Agents Chemother. 53: 1709-1711. Moulin, G. Focus Group Meeting on Fluoroquinolones [online] [cit. 29. dubna 2009] Dostupné na www: < www.emea.europa.eu/pdfs/conferenceflyers/fluoro/40841506.pdf> Mugnaioli, C., De Luca, F., Carattoli, A., Rossolini,. G. M. 2006. Characterisation of conjugative plasmids encoding CTX-M-type extended-spectrum beta-lactamases in Italian clinical isolates of Escherichia coli. J. Clin. Microbiol. Infect. 12(4): 24–25. Navrátilová, P. 2002. Problematika reziduí inhibičních látek v syrovém kravském mléce. J. Veterinářství. 52: 478-481. Nagy, I., Schoofs, G., Vanderleyden, J., de Mot, R. 1997. Transposition of the IS21-related element IS1415 in Rhodococcus erythropolis. J. Bacteriol. 179: 4635-4638. NCCLS. 2002. Performance standards for antimicrobial disk and dilution suspectibility tests for bacteria isolated from animals, approved standard-second edition. NCCLS document M31-A2. Edited by NCCLS, Wayne, Pensylvania, p. 85.

101

Nešvera, J., Hochmannová, J., Pátek, M. 1998. An integron of class1 is present on the plasmid pCG4 from gram-positive bacterium Corynebacterium glutamicum. FEMS Microbiol. Lett. 169: 391-395. Novais, A., Cantón, R., Moreira, R., Peixe, L., Baquero, F., Coque, T. M. 2007. Emergence and dissemination of Enterobacteriaceae isolates producing CTX-M-1-like enzymes in Spain are associated with IncFII (CTX-M-15) and broad-host-range (CTX-M-1, -3, and -32) plasmids. J. Antimicrob. Agents Chemother. 51: 796–799. Novais, A., Cantón, R., Valverde, A., Machalo, E., Galán, J.C., Deixe, L., Carattoli, A., Baquero, F., Coque, T.M. 2006. Dissemination and persistence of blaCTX-M-9 are linked to class 1 integrons containing CR1 associated with defective transposon derivatives from Tn402 located in early antibiotic resistence plasmids of IncHI2, IncP1-a, and IncFI Groups. J. Antimicrob. Agents Chemother. 50: 2741-2750. Olesen, I., Hasman, H., Aarestrup, F.M. 2004. Prevalence of beta-lactamases among ampicillin-resistant Escherichia coli and Salmonella isolated from food animals in Denmark. J. Microb. Drug. Res. 10: 334-340. Oliver, S.P., Gillespie, B.E., Headrick, S.J., Moorehead, H., Lunn, P., Dowlen, H.H., Johnson, D.L., Lamar, K.C., Chester, S.T., Moseley, W.M. 2004. Efficacy of Extended Ceftiofur Intramammary Therapy for Treatment of Subclinical Mastitis in Lactating Dairy Cows. J. Dairy Sci. 87: 2393-2400. Olsen, J.E. 1990. An improved method for rapid isolation of plasmid DNA from wild-type Gram-negative bacteria for plasmid restriction profile analysis. J. Let. Appl. Microbiol. 10: 209-212. Pagani, L., Amico, E., Migliavacca, R., D´Andrea, M.M., Giacobone, E., Amicosante, G., Romero, E., Rossolini, G.M. 2003. Multiple CTX-M Type Extended-Spectrum β-Lactamases in Nosocomial Isolates of Enterobacteriaceae from a Hospital in Northern Italy. J. Clin. Microbiol. 41(9): 4264-4269. Peirano, G. et Pitout, J.D.D. 2010. Molecular epidemiology of Escherichia coli producing CTX-M β-lactamases: the worldwide emergence of clone ST131 O25:H4. Int. J. Antimicrob. Agents. 35: 316-321. Pokludová, L., Novotná, P., Hera, A. 2007. Současné možnosti antimikrobní terapie mastitid v ČR. J. Veterinářství. 1/2007. p. 28-35. PulseNet PFGE Manual. 2002. One-Day (24-28 h) Standardized Laboratory Protocol for Molecular Subtyping of Escherichia coli O157:H7, non-typhoidal Salmonella serotypes, and Shigella sonnei by Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE). Rafii, F., Williams, A.J., Park, M., Sims, L.M., Heinze, T.M., Cerniglia, C.E., Sutherland, J.B. 2009. Isolation of bacterial strains from bovine fecal microflora capable of degradation of ceftiofur. J. Vet. Microbiol. 139: 89-96. Salmon, S.A., Watts, J.L., Yancey, Jr., R.J. 1996. In vitro activity of ceftiofur and its primary metabolite, desfuroylceftiofur, against organisms of veterinary importance. J. Vet. Diagn. Incest. 8: 332-336. 102

Sato, K., Bartlett, P., Saeed, M.A. 2005. Antimicrobial susceptibility of Escherichia coli isolates from dairy farms using organic versus conventional production methods. JAVMA. 226(4): 589-594. Sawant, A.A., Hedge, N.V., Starley, B.A., Donaldson, S.C., Love, B.C., Knabel, S.J., Jayarao, B.M. 2007. Antimicrobial-Resistant Enteric Bacteria from Dairy Cattle. J. Appl. Environ. Microbiol. 73: 156-163. Sawant, A.A., Sordillo, L.M., Jayarao, B.M. 2005. A survey on Antibiotik Usage in Dairy Herds in Pennyslvania. J. Dairy Sci. 88: 2991-2999. Sedláček, I. 2007. Taxonomie prokaryot. Masarykova univerzita, Brno. p.126. Schwarz, S. et Chaslus-Dancla, E. 2001. Use of antimicrobials in veterinary medicine and mechanisms of resistance. J. Vet. Res. 32: 201-225. Tragesser, L. A., Wittum, T. E., Funk, J. A., Winokur, P. L., Rajala-Schultz, P. J. 2006. Association between ceftiofur use and isolation of Escherichia coli with reduced susceptibility to ceftriaxone from fecal samples of dairy cows. Am. J. Vet. Res. 67: 1696–1700. ÚSKVBL – Ústav pro státní kontrolu veterinárních biopreparátů a léčiv 1 www.uskvbl.cz 2

SPC přípravku CEFTIOMAX 50 mg/ml [online] [cit. 26. února 2010] Dostupné na www: http://www.uskvbl.cz/attachments/spc/0910f7c7800906d2.doc Vaarst, M., Padel, S., Hovi, M., Younie, D., Sundrum, A. 2005. Sustaining animal health and food safety in European organic livestock farming. J. Livestock Prod. Sci. 94: 61-69. Vo, A.T.T., van Duijkeren, E., Fluit, A.C., Gaastra, W. 2007. Characteristics of extendedspectrum cephalosporin resistant Escherichia coli and Klebsiella pneumonie isolates from horses. J. Vet. Microbiol. 124: 248-255. Votava, M.. 2005. Lékařská mikrobiologie obecná. Neptun, Brno. p.248. Wu, S., Chouliara, E., Hasman, H., Dalsgaard, A., Vieira, A., Jenses, L.B. 2008. Detection of a single isolate of CTX-M-1-producing Escherichia coli from healthy pigs in Denmark. J Antimicrob. Chemother. 61(3): 747-749.

103

PŘÍLOHY Přehled ß-laktamových antibiotik a inhibitorů ß-laktamáz 1. ß-LAKTAMY 1.1. PENICILINY 1.1.1. Úzkospektré (základní) peniciliny Benzylpeniclin a jeho soli a estery: • benzylpenicilin • prokainbenzylpenicilin • benzathin-benzylpenicilin • penethacilin • benethamin-penicilin Fenoxypeniciliny: • fenoxymethylpenicilin 1.1.2. Úzkospektré antistafylokokové peniciliny Isoxazolylpeniciiíny (penicilináza rezistentní): • oxacilin • kloxacilin • dikloxacilin • nafcilin • meticilin 1.1.3. Širokospektré peniciliny Aminopeniciliny: • ampicilin • amoxicilin Karbopeniciliny: • karbenicilin • tikarcilin Acylaminopeniciliny: • azlocilin • piperacilin Peniciliny se stabilitou vůči ß-laktamázám: • temocilin

104

1.1.4. Amidinopeniciliny Amidinociliny: • mecilinam (amdinocilin) • pivmecilinam (amdinocilin pivoxil) 1.2. CEFALOSPORINY 1.2.1. Cefalosporiny 1. generace • • • • • • • • •

cefalotin - humánní cefacetril (intramamární) - veterinární cefapirin (intramamární) – veterinární / (parenterální) - humánní cefazolin cefaloridin cefalexin (perorální) - veterinární cefadroxil (perorální) – veterinární i humánní cefalonium (intramamární) - veterinární cefalexin – (intramamární, parenterální) - veterinární / (perorální) – humánní i veterinární

1.2.2. Cefalosporiny 2. generace • • • • • •

cefamandol cefuroxim cefoxitin (parenterální) cefotetan cefuroxim axetil (perorální) cefaclor (perorální) - humánní

1.2.3. Cefalosporiny 3. generace • • • • • • • •

ceftriaxon (parenterální) - humánní cefodizin cefotaxim (parenterální) - humánní ceftazidim (parenterální) - humánní cefoperazon (intramamární) - veterinární / (parenterální) - humánní ceftiofur (parenterální) - veterinární cefovecin (parenterální) - veterinární ceftibuten (perorální)

1.2.4. Cefalosporiny 4. generace • • • • •

cefchinom (parenterální, intramamární) - veterinární cefpirom cefepim (parenterální) - humánní cefozopram ceftobiprol (nově 2008)

1.3. OSTATNÍ ß-LAKTAMOVÁ ANTIBIOTIKA 1.3.1. Karbapenemy • • •

imipenem cilastatin meropenem

1.3.2. Monobaktamy • aztreonam 2. INHIBITORY ß-LAKTAMÁZ • • •

kyselina klavulanová a její soli sulbactam tazobactam

Obrázek 1. Markery použité při elektroforéze PCR produktů a izolované plazmidové DNA A: firma BioLabs (100 bp DNA ladder, 100-1500 bp)

- testování genů rezistence - Inc skupiny plazmidů

B: firma BioLabs (2-log DNA ladder, 0,1-10 kb)

A

- testování integronů, RFLP

B

Tabulka 1. Seznam primerů, přiřazení primerů k typu rezistence, délka produktu PCR, annealingová teplota Ta a pozitivní kontroly. ATB

gen strA-B aadA1

STR aadA2 aadA5 tetA TET tetB blaTEM blaSHV AMP blaOXA blaCTX-M cat CHL

cmlA floR sul1

SUL

sul2 sul3

název primeru strA/F strA/R aadA1/F aadA1/R aadA2/F aadA2/R aadA5/F aadA5/R tetA/F tetA/R tetB/F tetB/R blaTEM/F blaTEM/R blaSHV/F blaSHV/R blaOXA/F blaOXA/R PANCTX-M.F PANCTX-M.R cat/F cat/R cmlA/F cmlA/R floF/F floF/R sul1/F sul1/R sul2/F sul2/R sul3/F sul3/R

o

délka produktu (bp)

Ta ( C)

kontrola

250

58

K1-K3

384

51

K2, K4

249

55

K3

217

55

K1

210

K2 55

659

K1

1150

K1-K3

702

kontrola blaSHV 55

885

F134

554

L6

623

55

K1

455

55

HR17

425

50

R128

417

68

K1-K4

249

58

F20

789

51

H195

VARIABILNÍ

55

VARIABILNÍ

55

o1 nebo o8 (prase Otice)

280

55

K1-K4

788

55

o1 nebo o8 (prase Otice)

384

50

K1

254

55

K2

462

51

K3

227

55

o1 nebo o8 (prase Otice)

234

55

o1 nebo o8 (prase Otice)

5´CS class 1 3´CS integrony

class 2 int1 int2 dhfr17

kazety integronu 1i2

dhfr1 dhfr12

kazety integronu 2

estX sat

Hep74 Hep51 int1/F int1/R int2/F int2/R dhfr17/F dhfr17/R dhfr1/F dhfr1/R dhfr12/F dhfr12/R estX/F estX/R sat/F sat/R

K4 (aadA, 1kb) K2 (dhfr1-aadA1, 1.5kb) K1 (dhfr17-aadA5, 1.7kb) K3 (dhfr12-orf-aadA2, 2kb)

AMP, ampicilin; CHL, chloramfenikol; STR, streptomycin; SUL, sulfonamidy; TET, tetracyklin; KONTROLY: K1=M44 , K2=M148, K3=M2, K4=M66

Tabulka 2. Seznam primerů ke specifikaci genu blaCTX-M ATB

gen blaCTX-M-1 blaCTX-M-2

AMP blaCTX-M-8 blaCTX-M-9

název primeru

sekvence

CTXM1-F3 CTXM1-R2 TOHO-2F TOHO-1R CTXM825F CTXM825R CTXM914F CTXM914R

GAC GAT GTC ACT GGC TGA GC AGC CGC CGA CGC TAA TAC A GCG ACC TGG TTA ACT ACA ATC C CGG TAG TAT TGC CCT TAA GCC CGC TTT GCC ATG TGC AGC ACC GCT CAG TAC GAT CGA GCC GCT GGA GAA AAG CAG CGG AG GTA AGC TGA CGC AAC GTC TG

délka produktu (bp)

Ta ( C)

kontrola

499

55

L6

351

55

TOHO 1

307

55

CTX-M8

474

55

CTX-M9

o

Ta…teplota použitá pro připojení primerů v PCR (annelingová teplota)

Tabulka 3. Seznam pozitivních kontrol Název primeru Sekvence primeru ( 5´-3´) tetA/F

GCT ACA TCC TGC TTG CCT TC

tetA/R

CAT AGA TCG CCG TGA AGA GG

tetB/F

TTG GTT AGG GGC AAG TTT TG

tetB/R

GTA ATG GGC CAA TAA CAC CG

tetC/F

CTT GAG AGC CTT CAA CCC AG

tetC/R

ATG GTC GTC ATC TAC CTG CC

tetD/F

AAA CCA TTA CGG CAT TCT GC

tetD/R

GAC CGG ATA CAC CAT CCA TC

tetE/F

AAA CCA CAT CCT CCA TAC GC

tetE/R

AAA TAG GCC ACA ACC GTC AG

tetG/F

CAG CTT TCG GAT TCT TAC GG

tetG/R

GAT TGG TGA GGC TCG TTA GC

blaTEM/F

ATT CTT GAA GAC GAA AGG GC

blaTEM/R

ACG CTC AGT GGA ACG AAA AC

blaSHV/F

CAC TCA AGG ATG TAT TGT G

blaSHV/R

TTA GCG TTG CCA GTG CTC G

blaOXA2/F

Cílový gen

Délka Kontrolní Ta produktu kmeny (oC) (bp)

tetA

55

210

E. coli M148

tetB

55

659

E. coli M44

tetC

55

418

tetD

55

787

Aeromonas spp. A233

tetE

55

278

Aeromonas spp. A233

tetG

55

468

Salmonella Typhimurium DT104 S1

blaTEM

55

1150

E. coli M44

blaSHV

55

702

Klebsiella pneumoniae ATTC 700603

TTC AAG CCA AAG GCA CGA TAG

blaOXA-2

blaOXA2/R

TCC GAG TTG ACT GCC GGG TTG

like

55

885

E. coli F134

blaOXA-1F

CCA AAG ACG TGG ATG

blaOXA-1/-

blaOXA-1R

GTT AAA TTC GAC CCC AAG TT

30

PANCTX-M.F

TTT GCG ATG TGC AGT ACC AGT AA

PANCTX-M.R

CGA TAT CGT TGG TGG TGC CAT A

cat/F

CCT GCC ACT CAT CGC AGT

cat/R

CCA CCG TTG ATA TAT CCC

cmlA/F

TGT CAT TTA CGG CAT ACT CG

cmlA/R

ATC AGG CAT CCC ATT CCC AT

floF/F

GCG ATA TTC ATT ACT TTG GC

floF/R

TAG GAT GAA GGT GAG GAA TG

55

blaCTX-M

55

554

E. coli L4

cat

55

623

E. coli M44

cmlA

55

455

E. coli HR17

floR

50

425

E. coli R128

sul1/F

CTT CGA TGA GAG CCG GCG GC

sul1/R

GCA AGG CGG AAA CCC GCG CC

sul2/F

AGG GGG CAG ATG TGA TCG AC

sul2/R

GCA GAT GAT TTC GCC AAT TG

sul3/F

GAG CAA GAT TTT TGG AAT CG

sul3/R

CAT CTG CAG CTA ACC TAG GGC TTT GGA

strA/F

CCT ATC GGT TGA TCA ATG TC

strA/R

GAA GAG TTT TAG GGT CCA CC

int1/F

CCT CCC GCA CGA TGA TC

int1/R

TCC ACG CAT CGT CAG GC

int2/F

CAC GGA TAT GCG ACA AAA AGG T

int2/R

GTA GCA AAC GAG TGA CGA AAT G

5´CS

GGC ATC CAA GCA GCA AG

3´CS

AAG CAG ACT TGA CCT GA

Hep74

CGGGATCCCGGACGGCATGCACGATTTGTA

Hep51

GATGCCATCGCAAGTACGAG

dhfr1/F

ACG GAT CCT GGC TGT TGG TTG GAC GC

dhfr1/R

CGG AAT TCA CCT TCC GGC TCG ATG TC

dhfr12/F

ACT CGG AAT CAG TAC GCA

dhfr12/R

GTG TAC GGA ATT ACA GCT

dhfr17/F

GAT TTC TGC AGT GTC AGA

dhfr17/R

CTC AGG CAT TAT AGG GAA

aadA1/F

CGA CTC AAC TAT CAG AGG TA

aadA1/R

CTT TTG TCA GCA AGA TAG CC

aadA2/F

CGG TGA CCA TCG AAA TTT CG

aadA2/R

CTA TAG CGC GGA GCG TCT CGC

aadA5/F

CAC TGG ACA CAA TCC ACC TG

aadA5/R

CCA AGG CAC TAC TTC GCT TC

estX/F

CCCATGAACCCATTATCCTG

estX/R

ATGAGCAGCTTCCAGACCAT

sat/F

CCGACCAAGGCTTTGAACTA

sat/R

TCGCAAATTCGATGAGACTG

sul1

68

417

E. coli M44

sul2

58

249

E. coli M44

sul3

55

789

E. coli H195

strA

58

250

E. coli M44

int1

55

280

E. coli M44

int2

55

788

E. coli OP1

Různé oblasti 55 integronu třídy 1 Různé oblasti 55 integronu třídy 2

E. coli M2, variabilní M44, M66, M148 variabilní E. coli OP1

dhfr1

55

254

E. coli M148

dhfr12

51

462

E. coli M2

dhfr17

50

384

E. coli M44

aadA1

51

384

E. coli M148

aadA2

55

249

E. coli M2

aadA5

55

217

E. coli M44

estX

55

227

E. coli OP1

sat1/2

55

234

E. coli OP1

Tabulka 4. Zamražené ESBL+ izoláty (Těšany, Luboměř Zamraženo - Těšany ESBL+, Rezistentní 3 4 5 6 4/B 8/B 10/B 11/B 13 14 15 16 25/B 27/B 28/B 30/B 23 24 25 26 41/B 42/B 43/B 45/B 33 34 35 36 61/B 65/B 68/B 75/B 43 44 45 46 89/B 92/B 94/B 95/B 53 54 55 56 111/B 112/B 113/B 114/B 63 64 65 66 134/B 137/B 138/B 142/B 73 74 75 76 163/B 164/B 165/B 166/B 83 84 85 86 175/B 177/B 179/B 183/B 93 94 95 96 249/B 250/B 251/B 256/B

1 2/B 11 21/B 21 38/B 31 58/B 41 85/B 51 106/B 61 130/B 71 154/B 81 171/B 91 195/B

2 3/B 12 23/B 22 39/B 32 60/B 42 87/B 52 107/B 62 132/B 72 158/B 82 173/B 92 197/B

1 266/B 11 284/B 21 322/B

2 3 4 268/B 269/B 270/B 12 13 14 285/B 286/B 288/B 22 23 324/B D12 I (1) Ekofarma

5 273/B 15 289/B

6 Filtr 1 16 290/B

7 14/B 17 32/B 27 49/B 37 76/B 47 96/B 57 118/B 67 143/B 77 167/B 87 184/B 97 257/B

8 15/B 18 34/B 28 52/B 38 79/B 48 102/B 58 120/B 68 148/B 78 168/B 88 185/B 98 258/B

9 16/B 19 35/B 29 53/B 39 81/B 49 103/B 59 125/B 69 151/B 79 169/B 89 190/B 99 262/B

10 20/B 20 36/B 30 57/B 40 83/B 50 104/B 60 126/B 70 153/B 80 170/B 90 191/B 100 263/B

7 277/B 17 291/B

8 279/B 18 296/B

9 281/B 19 300/B

10 282/B 20 306/B