Masarykova univerzita Lékařská fakulta
SLEDOVÁNÍ REZISTENCE VŮČI ANTIMYKOTIKŮM U LÉKAŘSKY VÝZNAMNÝCH KVASINEK
Bakalářská práce v oboru zdravotní laborant
Vedoucí bakalářské práce:
Autor:
Mgr. Martina MAHELOVÁ
Veronika LAZECKÁ
Brno, duben 2014
Jméno a příjmení autora: Veronika Lazecká Název bakalářské práce: Sledování rezistence vůči antimykotikům u lékařsky významných kvasinek
Pracoviště: Mikrobiologický ústav Fakultní nemocnice u svaté Anny v Brně Vedoucí bakalářské práce: Mgr. Martina Mahelová Rok obhajoby bakalářské práce: 2014
Souhrn: Nejčastějšími původci mykotických onemocnění jsou kvasinky rodu Candida. K jejich léčbě se používají antimykotika. Flukonazol patří k velmi často používaným antimykotikům, avšak díky jeho častému užívání došlo k rozvoji rezistence k tomuto léku. Cílem této práce bylo zjištění rozvoje rezistence k flukonazolu u kvasinek rodu Candida (C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis, C. dubliniensis) získaných z klinického materiálu v laboratořích Mikrobiologického ústavu Fakultní nemocnice u svaté Anny v Brně. Poté byly získané výsledky porovnány s literaturou. Práce je rozdělena na část teoretickou, která se zabývá obecnými vlastnostmi rodu Candida, charakteristikou jednotlivých druhů, kandidózami, léčbou kvasinkových infekcí a rezistencí. Praktická část obsahuje vlastní experiment, zjištění rozvoje rezistence k flukonazolu.
Klíčová slova: Candida, kandidózy, antimykotika, rezistence, flukonazol
Souhlasím, aby práce byla půjčována ke studijním účelům a byla citována dle platných norem.
Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně pod vedením Mgr. Martiny Mahelové a uvedla v seznamu literatury všechny použité literární a odborné zdroje.
V Brně dne 30. 4. 2014
Veronika Lazecká
Ráda bych zde poděkovala vedoucí své bakalářské práce Mgr. Martině Mahelové za její odborné rady, cenné připomínky a čas, který mi věnovala. Rovněž bych chtěla poděkovat zaměstnancům Mikrobiologického ústavu Fakultní nemocnice u svaté Anny za pomoc při realizaci praktické části.
Obsah 1 Úvod .....................................................................................................................................9 I
TEORETICKÁ ČÁST ....................................................................................................10
2 Rod Candida ......................................................................................................................10 2.1 Taxonomické zařazení .................................................................................................10 2.2 Obecný úvod ................................................................................................................10 2.3 Zastoupení druhů .........................................................................................................10 2.4 Morfologie ...................................................................................................................11 2.5 Epidemiologie..............................................................................................................11 2.6 Cesty přenosu ..............................................................................................................13 2.7 Faktory virulence .........................................................................................................13 3 Charakteristika jednotlivých druhů ....................................................................................17 3.1 Candida albicans .........................................................................................................17 3.2 Candida glabrata.........................................................................................................17 3.3 Candida tropicalis .......................................................................................................18 3.4 Candida dubliniensis ...................................................................................................19 4 Kandidózy ..........................................................................................................................21 4.1 Povrchové kandidózy ..................................................................................................21 4.2 Invazivní kandidózy ....................................................................................................24 5 Léčba kvasinkových infekcí ...............................................................................................27 5.1 Azoly ...........................................................................................................................27 5.2 Polyeny ........................................................................................................................28 5.3 Antimetabolity .............................................................................................................29 5.4 Echinokandiny .............................................................................................................30 5.5 Ostatní..........................................................................................................................31 6 Rezistence ..........................................................................................................................33 6.1 Definice rezistence ......................................................................................................33
6.2 Primární a sekundární rezistence .................................................................................33 6.3 Mechanismy rezistence k antimykotikům ...................................................................34 II
PRAKTICKÁ ČÁST .........................................................................................................41 7 Cíle práce ...........................................................................................................................41 8 Materiál a metody ..............................................................................................................42 8.1 Materiál........................................................................................................................42 8.1.1 Mikroorganizmy .......................................................................................................42 8.2 Metody .........................................................................................................................45 9 Výsledky ............................................................................................................................51 9.1 Testování indukce rezistence kmenů kvasinek k flukonazolu ....................................51 9.2 Výsledky E-testů .........................................................................................................51 9.3 Srovnání původních a indukovaných kmenů ..............................................................55 10 Diskuze.............................................................................................................................57 11 Závěr ................................................................................................................................59 Použitá literatura ...................................................................................................................60 Internetové zdroje..................................................................................................................64
Seznam použitých zkratek a symbolů 5-FC
5-fluorocytosin
5-FU
5-fluorouracil
ABC
ATP binding cassette
ABCD
Amphotericin B colloidal dispersion (Koloidní disperze amfotericinu B)
ABLC
Amphotericin B lipid complex (Lipidový komplex amfotericinu B)
AIDS
Acquired
Immunodeficiency
Syndrome
(Syndrom
získaného
imunodeficitu) ALS
Agglutinin-like sequence
ATP
Adenosintrifosfát
C.
Candida
CMK
Chronická mukokutánní kandidóza
CNA
Candida-non-albicans (Kandidy non-albicans)
CNS
Centrální nervový systém
DK
Diseminovaná kandidóza
DM
Diabetes mellitus
DMSO
Dimethylsulfoxid
DNA
Deoxyribonukleová kyselina
EK
Esofageální kandidóza
EPA
Epithelial adhesin
EUCAST
European Comittee On Antimicrobial Susceptibility Testing
EUCAST-AFST
European Comittee On Antimicrobial Susceptibility Testing subcommittee on Antifungal Susceptibility Testing
FdUMP
5-fluorodeoxyuridin monofosfát
FUTP
5-fluorouridin trifosfát
GI
Gastrointestinální
HIV
Human Immunodeficiency Virus (Virus lidského imunodeficientu)
HWP1
Hyphal wall protein 1
McF
McFarlandova stupnice optické denzity
MFS
Major facilitator superfamily
MH
Mueller-Hinton
MIC
Minimální inhibiční koncentrace
PCR
Polymerase chain reaction (Polymerázová řetězová reakce)
PL
Phospholipase (Fosfolipáza)
RNA
Ribonukleová kyselina
RPMI
Roswell Park Memorial Institute
SAP
Secreted Aspartyl Proteinases (Sekretované aspartylové proteinázy)
UPRTáza
Uracil fosforibosyltransferáza
VVK
Vulvovaginální kandidóza
1 Úvod Kvasinky rodu Candida patří mezi nejčastější původce mykotických onemocnění u člověka. U zdravých jedinců se chovají jako komenzálové, jsou součástí normální mikrobiální sliznice dutiny ústní, gastrointestinálního traktu a pochvy. Dojde-li k oslabení imunitního systému nebo k narušení přirozené mikroflóry, mohou vyvolat infekce, kandidózy. Kandidózy mohou být povrchové až život ohrožující invazivní infekce. K léčbě kandidóz se používají antimykotika. Flukonazol je nejčastěji používaným azolovým antimykotickým léčivem, protože je účinný, bezpečný a dobře dostupný. Díky těmto příznivým vlastnostem došlo k rozšířenému užívání flukonazolu a brzy byly zaznamenány flukonazol-rezistentní izoláty.
9
I
TEORETICKÁ ČÁST
2 Rod Candida
2.1 Taxonomické zařazení
Říše: Fungi Kmen: Ascomycota Podkmen: Ascomycotina Třída: Ascomycetes Řád: Saccharomycetales Čeleď: Saccharomycetaceae Rod: Candida
(www.doctorfungus.org/thefungi/Candida_spp.php)
2.2 Obecný úvod
„Kvasinky rodu Candida jsou nejčastější původci mykotických onemocnění člověka a také nejčastěji izolovanými houbami z humánního klinického materiálu.“ (Votava, 2010, 461)
2.3 Zastoupení druhů
Rod Candida se skládá ze skupiny heterogenních organizmů. Z této skupiny je více než 17 různých druhů známých jako původci lidských infekcí (Sardi a kol., 2013). Nejčastějším původcem infekcí je Candida albicans (Sullivan a kol., 2004). Kromě C. albicans se na etiologii podílejí i další druhy kandid, které označujeme termínem kandidy non-albicans 10
(CNA) (Votava, 2000; Votava, 2003). Candida tropicalis byla určena jako nejčastější patogenní druh ze skupiny CNA (Kothavade a kol., 2010). Mezi další CNA patří Candida parapsilosis, Candida glabrata, Candida krusei, Candida dubliniensis a další (Votava, 2003). Dříve se C. albicans vyskytovala v 70-80 % případů a ostatní druhy CNA se vyskytovaly jen zřídka. Nicméně v průběhu posledních 10-30 let se CNA druhy objevují jako významné oportunnní patogeny u člověka. Důvodem může být zlepšení diagnostických metod anebo změny v lékařské praxi. C. albicans je stále nejčastějším původcem, ale její výskyt klesá s rostoucím výskytem jiných druhů, jako jsou C. glabrata, C. tropicalis, C. parapsilosis (Silva a kol., 2012).
2.4 Morfologie
Rod Candida patří k dimorfním houbám, což znamená, že se mohou vyskytovat v různých formách podle podmínek prostředí (Sardi a kol., 2013; Votava, 2003). Blastokonidie (neboli blastospory) jsou kvasinkové buňky oválného či kulatého tvaru o velikosti kolem 3-15 µm. Množí se nepohlavně pučením, kdy z buňky vypučí buňka dceřiná. Protáhlé blastokonidie se nazývají pseudohyfy (Votava, 2003; Bednář, 1996). Pseudohyfy jsou vláknité útvary a soubor těchto hyf se označuje jako pseudomycelium. Pseudomycelium vzniká z pučících buněk, jednotlivé buňky se však zůstávají navzájem spojené a protahují se (Klaban, 2005). Také mohou vytvářet pravé hyfy (Bednář, 1996). C. albicans a C. dubliniensis mohou vytvářit další útvary tzv. zárodečné klíčky (germ tubes) a chlamydokonidie (neboli chlamydospory) (Bednář, 1996; Merz a Hay, 2005). Zárodečné klíčky jsou jemná vlákna pučící z blastokonidií bez zaškrcení, můžeme je pozorovat v prvních hodinách kultivace (Votava, 2003; Bednář, 1996). Chlamydokonidie jsou kulaté, silnostěnné buňky o velikosti 7-10 µm. Mohou být umístěny na konci hyf nebo i po stranách hyf (Bednář, 1996).
2.5 Epidemiologie
Kvasinky rodu Candida se u zdravých lidí chovají jako komenzálové. Jsou součástí normální mikrobiální sliznice dutiny ústní, gastrointestinálního traktu či pochvy (Sardi a kol., 2013). „Tato kolonizace se může stát zdrojem infekce, pokud makroorganizmus 11
nad kvasinkami ztratí kontrolu (oslabení imunitního systému, potlačení normální mikroflóry) a dojde k jejich přemnožení či invazi.“ (Votava, 2010, 462) Kriticky nemocní nebo imunokompromitovaní pacienti jsou více náchylní k rozvoji infekcí. Mezi predisponující faktory, které se podílející na nárůstu infekcí patří rostoucí počet imunokompromitovaných pacientů, stále častější zavádění intravenózních katétrů, celková parenterální výživa, invazivní postupy, hojné užívání širokospektrých antibiotik, cytotoxická chemoterapie a transplantace (Sardi a kol., 2013). Kvasinky tohoto rodu mohou způsobit širokou škálu lidských nemocí, a to od povrchových slizničních infekcí (jako jsou vulvovaginální a orální kandidózy) až po život ohrožující invazivní infekce. Ve většině případů se orální a systémové infekce vyskytují pouze u jedinců, kteří jsou těžce nemocní a nebo imunokompromitováni. Orální kandidózy jsou velmi často diagnostikovány u nemocných infikovaných virem HIV a u osob s AIDS. Zatímco invazivní infekce jsou často spojeny s pacienty, kteří mají neutropenii (například v důsledku protinádorové nebo imunosupresivní léčby) (Sullivan a kol., 2004). C. albicans je převládající příčinou invazivních mykotických infekcí a představuje závažný zdravotní problém vzhledem k vysoké míře úmrtnosti, zvýšení nákladů na péči a době trvání hospitalizace. Ačkoli je C. albicans nejrozšířenějším druhem podílející se na invazivních mykotických infekcích, roste výskyt infekcí způsobených kandidami non-albicans. Studie z evropských zemí ukázala, že více než polovina případů kandidémie byla způsobena druhem C. albicans a incidence infekcí způsobených kandidami non-albicans byla 14 % pro C. glabrata a C. parapsilosis, 7 % pro C. tropicalis a 2 % pro C. krusei. C. dubliniensis se obvykle vyskytuje společně s jiným druhem, zejména s C. albicans. Byl zjištěn vysoký výskyt C. dubliniensis v ústní dutině nemocných infikovaných virem HIV a u pacientů s AIDS. C. parapsilosis je významný nozokomiální patogen a vyvolává zejména endoftalmitidy, endokarditidy, septické artritidy, peritonitidy a fungémie. Kandidózy způsobené druhem C. tropicalis jsou spojovány s rakovinou, zejména s leukémií a také s neutropenií. Kandidózy způsobené druhem C. glabrata byly hlášeny v souvislosti s užíváním flukonazolu (Sardi a kol., 2013). 12
2.6 Cesty přenosu
U nemocí způsobených kandidami je hlavním zdrojem infekce pacient. Nezbytnou podmínkou pro propuknutí nemoci je snížení obranyschopnosti hostitele. Přenos kandid ze střeva do krevního oběhu vyžaduje přemnožení kvasinek ve střevě. To znamená, že většina infekcí se přenáší endogenně. Význam exogenního přenosu závisí na charakteru onemocnění. Bylo popsáno propuknutí nákazy vyplývající z kontaminovaných materiálů. Například pooperační endoftalmitida způsobená
kontaminovanými
intravitreálními
roztoky
nebo
kandidóza
způsobená
kontaminovanými roztoky pro celkovou parenterální výživu. Byl prokázán přenos od personálů k pacientovi a také přenos mezi pacienty navzájem, ale tyto cesty přenosu jsou významné pouze ve specializovaném prostředí, jako jsou například popáleninové jednotky, transplantační jednotky a jednotky intenzivní péče (Anaissie a kol., 2009).
2.7 Faktory virulence
Patogenita je umožněna díky několika virulenčním faktorům. Nejdůležitější z nich jsou adheze (přilnavost) k hostitelským tkáním či implantátům, tvorba biofilmu a sekrece hydrolytických enzymů (např. proteázy, fosfolipázy a hemolyziny). Dalšími virulenčními faktory jsou morfogeneze a přepínání fenotypu (Sardi a kol., 2013). Nejlépe byly tyto faktory popsány u C. albicans, a proto se tato kapitola zabývá především tímto druhem.
2.7.1 Adheze
Hlavním faktorem kolonizace lidských tkání je přilnutí na hostitelské povrchy. Tento proces je řízen a indukován několika buněčnými signálními kaskádami. Kandidy mohou přilnout i na povrchy implantátů a vytvářet na nich biofilm. Adheze je dosaženo kombinací nespecifických (hydrofobnost a elektrostatické síly) a specifických mechanismů (adheziny) (Sardi a kol., 2013; Anaissie a kol., 2009).
13
Adheziny jsou specializované proteiny přítomné na povrchu buněk. Adheziny vážou aminokyselinové nebo cukerné zbytky na povrch jiných buněk nebo podněcují vazbu k abiotickým povrchům (Verstrepen a Klis, 2006). Mezi adheziny patří rodina genů ALS (agglutinin-like sequence) kódující velké povrchové buněčné glykoproteiny, které jsou zapojeny do procesu adheze k hostitelským povrchům (Hoyer, 2001). Als1p a Als5p mají adhezivní funkci k bukálním epiteliálním buňkám. Als1p je důležitý pro adhezi na sliznici dutiny ústní během rané fáze infekce (Yang, 2003). Dále sem patří gen HWP1 kódující vnější povrch manoproteinu (Calderone a Fonzi, 2001). Hwp1 (hyphal wall protein 1) je protein potřebný k vytvoření stabilního připevnění k epitelilním buňkám (Anaissie a kol., 2009). Dalším genem je INT1, který kóduje povrchový protein a mannosyl transferázu (Anaissie a kol., 2009). Delece v genu MNT1 může mít vliv na adhezi a virulenci. Geny PMT1, PMT6 jsou také potřebné pro adhezi k epiteliálním buňkám. Všechny tyto tři geny jsou zapojeny do syntézy mannanů, mannan je hlavní složkou buněčné stěny hub. A proto se proteiny Mnt1p, Pmt1p, Pmt6p mohou podílet na rozpoznávání hostitele (Yang, 2003).
2.7.2 Tvorba biofilmu
Biofilmy jsou specifická a organizovaná společenstva buněk, která jsou připojena k různým živým i neživým povrchům (Douglas, 2003). Studie ukázaly, že mikroorganizmy téměř neexistují v jejich volné planktonické formě, ale jsou seskupeny dohromady a tvoří mnohobuněčná společenstva na tkáních, protézách, katétrech a dalších površích. Připevnění buněk
na
materiály
je
zprostředkováno
nespecifickými
interakcemi
(hydrofobní
a elektrostatické síly) a specifickými adhezin-ligandovými vazbami. Biofilmy mohou pomoci zachovat úlohu hub jako patogenů. Díky biofilmu jsou kvasinky schopny vyhnutou se hostitelským imunitním mechanismům, odolat antimykotickým látkám a odolat konkurenčnímu tlaku jiných organizmů (Sardi a kol., 2013). Tvorba biofilmu je jev se třemi základními fázemi: a) připevnění a kolonizace kvasinkových buněk k substrátu, b) růst buněk a tvorba bazální vrstvy, c) zrání
14
biofilmu - prodloužení hyf a pseudohyf, produkce extracelulární matrix (Anaissie a kol., 2009).
2.7.3 Sekrece hydrolytických enzymů
Extracelulární hydrolytické enzymy produkované kandidami hrají důležitou roli v adhezi, penetraci do tkání, invazi a ničení hostitelských tkání. Nejdůležitější hydrolytické enzymy jsou sekretované aspartylové proteinázy a fosfolipázy (Sardi a kol., 2013). Kvasinkové buňky mají hydrolytické enzymy, které ničí nebo narušují složky hostitelských buněčných membrán, což vede k jejich dysfunkci anebo k narušení. Buněčné membrány jsou složeny z fosfolipidů a proteinů a na ně enzymy útočí. Proteinázy hydrolyzují peptidové vazby proteinů a fosfolipázy hydrolyzují fosfolipidy (Ghannoum, 2000). Sekretované aspartylové proteinázy (secreted aspartyl proteinases, sap) jsou produkovány C. albicans, C. parapsilosis a C. tropicalis (Anaissie a kol., 2009). SAP u C. albicans má 10 různých izoenzymů a ty jsou zodpovědné za aktivitu proteázy. Izoenzymy jsou kódovány pomocí genů SAP 1-10 (Sardi a kol., 2013). SAP jsou asociovány s různými místy a mohou mít různou patogenezi. Například exprese SAP 1-3 byla prokázána jako velmi zásadní pro povrchové infekce, kdežto SAP 4-6 mohou být důležité pro systémové infekce. Fosfolipázy jsou produkovány C. albicans, C. dubliniensis, C. glabrata, C. parapsilosis a C. tropicalis (Anaissie a kol., 2009). Fosfolipázy zahrnují čtyři skupiny: PLA, PLB, PLC a PLD (Calderone a Fonzi, 2001). Například fosfolipáza B je nezbytná pro virulenci u C. albicans a je vylučována v průběhu infekce (Anaissie a kol., 2009). Také produkce hemolyzinů hraje důležitou roli ve virulenci. Hemolyziny jsou nezbytné pro přežití a souvisí se získáváním železa. Hemolyziny jsou proteiny produkované mikroorganizmy k destrukci červených krvinek. Železo je zásadní prvek pro rozvoj mikroorganizmů, včetně kvasinek a schopnost získat tento prvek je zásadní pro vytvoření infekčního procesu (Sardi a kol., 2013).
15
2.7.4 Morfogeneze
Kvasinky rodu Candida mají schopnost reverzibilního přechodu mezi jednobuněčnými kvasinkovými buňkami a růstem ve formě hyf (Calderone a Fonzi, 2001). Ze všech kandid, jen C. albicans a C. dubliniensis mohou vytvářet oba typy vláknitých útvarů (hyfy a pseudohyfy). Což naznačuje, že tyto kvasinky jsou schopny růst izotropicky (kvasinkové buňky) nebo apikálně „na vrcholu“ (hyfy a pseudohyfy) a proto mohou být označovány jako polymorfní (Sardi a kol., 2013; Calderone a Fonzi, 2001).
2.7.5 Phenotypic switching („Přepínání fenotypu“)
Dalším virulenčním faktorem C. albicans je specifická fenotypová nestabilita, která umožňuje kmenům přepínat fenotyp kolonií, aniž by to ovlivnilo genotyp. Tento jev je označován jako „přepínání fenotypu“ (Fidel, 1999). Přepínání fenotypu je spojeno s morfologickými změnami kolonií u C. albicans. Dochází k přechodu kolonií hladkých na drsné nebo k přechodu kolonií bílých na neprůhledné a k dalším morfologickým změnám (Merz a Hay, 2005). Pomes a kol. prokázali, že nízké dávky UV záření vedli u C. albicans k tvorbě hrubých kolonií ve vysokých frekvencích (3 x 10-3) a navrácení tohoto fenotypu na původní hladké kolonie se vyskytlo ve frekvenci 9 x 10-4. Proto je přepínání fenotypu reverzibilní a vyskytuje se ve vysokých frekvencích (Calderone a Fonzi, 2001). Nejvíce studovaný je kmen WQ-1, ve kterém hladké bílé kolonie přecházejí na ploché šedé kolonie. Existuje několik rozdílů mezi těmito dvěma typy kolonií, zahrnují tvar buněk, povrch buněčných struktur a pučení při 37 °C (Merz a Hay, 2005).
16
3 Charakteristika jednotlivých druhů
3.1 Candida albicans
Candida albicans je považována za významný patogenní druh kvasinek rodu Candida a je často izolována z klinického materiálu (Votava, 2010). C. albicans je u zdravých lidí izolována z gastrointestinálního traktu, z ústní sliznice, z vaginální sliznice a také z kůže. Obvykle nezpůsobuje problémy, ale pokud dojde k narušení normální mikroflóry je schopna vyvolat symptomatické infekce sliznic (Votava, 2010; Kim a Sudbery, 2011). Povrchové slizniční infekce vznikají narušením normální mikroflóry v důsledku užívání antibiotik, vaginální infekce jsou způsobeny hormonálními změnami u jinak zdravé ženy (Calderone a Clancy, 2011). C. albicans je potenciálním patogenem, což znamená, že u zdravého hostitele se chová jako komenzál a za určitých podmínek může dojít ke vzniku virulence (Bednář, 1996). Faktory virulence jsou podrobně popsány v kapitole 2.8.
3.2 Candida glabrata
C. glabrata byla původně zařazena do rodu Torulopsis a to z důvodu nedostatečné produkce pseudohyf. V roce 1978 bylo zjištěno, že schopnost produkovat pseudohyfy není spolehlivý rozlišovací faktor pro příslušníky rodu Candida. A proto bylo navrženo, aby byla T. glabrata zařazena do rodu Candida (Fidel, 1999; Bialková a Šubík, 2006). C. glabrata byla považována za poměrně nepatogenní druh u zdravých jedinců a jen zřídka způsobovala
závažné
infekce.
Ale
se
zvýšeným
užíváním
imunosupresiv
spolu
s širokospektrými antimykotickými léky se frekvence infekcí způsobených C. glabrata výrazně zvýšila. V závislosti na místě infekce je C. glabrata druhou nebo třetí nejčastější příčinou kandidóz po C. albicans. Infekce mohou být slizniční nebo systémové a jsou běžné u abnormálních hostitelů (u osob s oslabenou imunitou nebo u osob s DM). C. glabrata je nedimorfní kvasinka, která roste pouze jako malá blastokonidie. Je to jediný druh kandid, který netvoří pseudohyfy při teplotách nad 37 °C (Fidel, 1999). 17
Důležitým rozlišujícím genetickým znakem C. glabrata je její haploidní genom. Ostatní CNA včetně C. albicans mají diploidní genom (Silva a kol., 2012). C. glabrata se v poslední době ukázala jako významný nozokomiální patogen, ale zatím je jen
málo
známo
o
epidemiologii.
Vyznačuje
se
přirozeně
zvýšenou
rezistencí
vůči antimykotikům, konkrétně vůči flukonazolu (Fidel, 1999). C. glabrata je často izolována z intravenózních katétrů, stolice, moči a z různých povrchů u onkologických a HIV pacientů, dále u pacientů s DM, transplantáty, popáleninami a u novorozenců (Bialková a Šubík, 2006). U C. glabrata jsou faktory virulence mnohem méně prostudovány než u C. albicans (Fidel,
1999).
Absence
hyf,
absence
specifických
antigenů
a
nevelká
adheze
k endoteliálním a epiteliálním buňkám jsou fakta, která nepodporují schopnost C. glabrata způsobovat infekci. Potenciálními virulenčními faktory mohou být fosfolipázy, které usnadňují pronikání přes fosfolipidovou bariéru epiteliálních buněk nebo adheze k trombocytům, které usnadňují šíření kvasinek v krevním oběhu (Bialková a Šubík, 2006). Hlavní skupina adhezinů je kódována genovou rodinou EPA (epithelial adhesin). Struktura Epa proteinů je podobná jako u proteinů Als. Pouze jedna studie prokázala, že C. glabrata je schopna produkovat proteinázy, ale typ proteinázy nebyl specifikován (Silva a kol., 2012).
3.3 Candida tropicalis
C. tropicalis lze nalézt jako součást běžné komenzální mikroflóry u člověka, mohou způsobovat invazivní kandidózy u pacientů se závažným primárním onemocněním, především u pacientů s rakovinou (Calderone a Clancy, 2011). C. tropicalis je považována za třetí nejčastěji izolovaný druh CNA z krve a močových kultur (Silva a kol., 2012). Bylo zjištěno, že C. tropicalis je nejčastější příčinou invazivní kandidózy u pacientů s neutropenií, například u pacientů s akutní leukémií nebo u těch, kteří podstoupili transplantaci kostní dřeně (Kothavade a kol., 2010). Některé epidemiologické studie prokázaly, že C. tropicalis je spojena s vyšší úmrtností než ostatní druhy CNA včetně C. albicans. Tato tendence by mohla souviset s faktory virulence, které tento druh vykazuje. Mezi faktory virulence patří tvorba biofilmu, sekrece proteinázy a dimorfismus (Silva a kol., 2012). 18
C. tropicalis je stále se rozvíjející patogen po celém světě. Mezi hlavní faktory, které přispívají ke vzniku infekcí způsobených C. tropicalis, patří: a) zvýšené používání antimykotik, b) zvyšující se počet pacientů s oslabenou imunitou, c) dlouhodobé používání katétrů, d) užívání širokospektrých antibiotik, e) komplikace při léčbě základních subklinických stavů spojených s nesnášenlivostí k antimykotikům, opakující se infekce a nozokomiální nákazy (Kothavade a kol., 2010).
3.4 Candida dubliniensis
C. dubliniensis je fenotypově i genotypově velmi podobná druhu C. albicans (Klaban, 2005). Tento druh byl původně identifikován jako C. albicans na základě toho, že oba tyto druhy mají schopnost produkovat zárodečné klíčky a chlamydospóry (Sullivan a Coleman, 1998). C. dubliniensis byla poprvé popsána Sullivanem a jeho kolegy v případě orální kandidózy u HIV-infikovaných jedinců a pacientů s AIDS v roce 1995 (Sullivan a kol., 2005). Tento druh byl pojmenován po Dublinu, hlavním městě Irské republiky, kde byl nový druh poprvé identifikován (Sullivan a Coleman, 1998). C. albicans a C. dubliniensis jsou fenotypově velmi podobné a z toho důvodu je často velmi obtížné je od sebe odlišit (Calderone a Clancy, 2011). K jejich odlišení bylo vyvinuto velké množství fenotypových a genotypových testů. Identifikační fenotypové testy jsou shrnuty v tabulce 1. Tyto testy většinou nejsou 100 % přesné (Sullivan a kol., 2004). Testy založené na principu PCR jsou stále nejpřesnější metody k identifikaci C. dubliniensis (Calderone a Clancy, 2011). V ideálním případě by v klinických laboratořích měla být použita více než jedna metoda ke konečné identifikaci izolátů C. dubliniensis. S u
tímto
druhem
imunokompetentních
se
jen
zřídka
jedinců,
ale
setkáváme
v
setkáváme
se
normální s
ním
orální v
mikroflóře
ústní
dutině
imunokompromitovaných pacientů, zejména u HIV-infikovaných jedinců a u pacientů s AIDS, kteří dostávali antimykotickou léčbu (Sullivan a kol., 2004). Velmi zajímavou vlastností C. dubliniensis je nízká incidence tohoto druhu jako složky normální lidské mikroflóry a jako příčina systémových infekcí (Sullivan a kol., 2005). Sullivan a jeho kolegové provedli studii orální kandidózy a prokázali, že C. dubliniensis se 19
vyskytovala v ústní dutině u 26 % HIV-infikovaných jedinců a u 32 % pacientů s AIDS s klinickými příznaky orální kandidózy. Zatímco u pacientů bez klinických příznaků orální kandidózy se vyskytovala u 18 % HIV-infikovaných jedinců a u 25 % pacientů s AIDS (Sullivan a kol., 2004). Existuje jen několik studií, které se zabývají srovnáním virulence C. dubliniensis a C. albicans (Sullivan a kol., 2005; Gilfillan a kol., 1998; Hannula a kol., 2000). Zjistilo se, že jsou určité rozdíly mezi virulenčními faktory těchto dvou srovnávaných druhů. C. dubliniensis dobře roste in vitro při 37 °C, za určitých podmínek vytváří biofilm a bylo zjištěno, že tempo růstu je nižší než u C. albicans. Dále bylo prokázáno, že C. dubliniensis je schopna podstoupit „přepínání fenotypu“ a to dokonce častěji než C. albicans (Sullivan a kol., 2004).
Tab. 1: Porovnání specifických fenotypových znaků u C. albicans a C. dubliniensis (upraveno podle Sullivan a kol., 2004) Znak Produkce zárodečných klíčků Produkce chlamydokonidií Růst při teplotě 37 °Ca Růst při teplotě 42 °Ca Růst při teplotě 45 °Ca Růst v bujónu s 6,5 % NaCl Růst na xylózeb Růst na laktózeb Růst na α-methyl-D-glukozidub Růst na trehalózeb Barva kolonií na CHROMagaru Morfologie kolonií na Palově agaru a na bramborovém dextrózním agaru b
C. albicans ++ + ++ ++ + + + + + + zelené hladké
C. dubliniensis + ++ ++ +tmavě zelené nerovné
na základě údajů získaných použitím ID32C identifikačního systému kvasinek (bioMérieux,
France)
20
4 Kandidózy Jak již bylo zmíněno výše, infekce způsobené rodem Candida se nazývají kandidózy nebo kandidiázy. Kandidózy mohou být jednak povrchové (neboli superficiální) a druhou skupinu tvoří invazivní kandidózy (Sardi a kol., 2013). Tabulka 2.
Tab. 2: Rozdělení kandidóz (upraveno podle Merz a Hay, 2005) Povrchové kandidózy Kožní infekce Infekce nehtů Slizniční infekce Invazivní kandidózy Kandidózy kardiovaskulárního systému Kandidózy ledvin a močových cest Kandidózy centrálního nervového systému Kandidózy respiračního systému Kandidózy gastrointestinálního systému Diseminovaná kandidóza a kandidémie
4.1 Povrchové kandidózy
Povrchové infekce jsou výsledkem invaze povrchových vrstev kůže anebo sliznic mikroorganizmy. Makroskopicky jsou infekce charakterizovány tvorbou šedavých plaků, které jsou obklopeny edémy (Merz a Hay, 2005).
4.1.1 Kožní infekce
Kandidy mohou napadnout jakýkoliv povrch těla a způsobit tak povrchové infekce kůže, vlasů a nehtů. Suchá neporušená kůže je velmi odolnou překážkou proti fungální invazi. Nejčastějšími původci infekcí kůže a nehtů jsou C. albicans a C. tropicalis. Tyto organizmy upřednostňují růst v teplém vlhkém prostředí, což jsou například kožní záhyby u obézních
21
jedinců, prostory mezi prsty na rukou a nohou, třísla a podpaží (Anaissie a kol., 2009; Dismukes a kol., 2003). Mezi nejčastější typy kožní kandidózy patří intertrigo, interdigitální (neboli meziprstní) kandidóza, perianální (neboli plenková) vyrážka a chronická mukokutánní kandidóza. Intertrigo je nejčastější klinická forma kožní kandidózy. Kandidy mohou snadno kolonizovat kožní záhyby, zejména za ušima, pod prsy, v tříslech a v podpaží. Při intertrigu jsou léze zarudlé s přítomností puchýřků a vřídků. Při interdigitální kandidóze jsou postiženy kožní záhyby mezi prsty rukou. Kožní záhyby mezi prsty jsou macerované a svědí. Dalším typem kožní kandidózy, týkající se především dětí, které nosí plenky, je perianální vyrážka. Tato vyrážka se vyskytuje v perianální oblasti a na hýždích (Merz a Hay, 2005). Chronická mukokutánní kandidóza popisuje skupinu onemocnění, při kterých mají pacienti perzistentní nebo opakující se infekce kůže, nehtů a sliznic. CMK je považována za nejzávažnější onemocnění z povrchových kandidóz a je asociována s řadou predisponujících faktorů. Obecně mezi predisponující faktory patří kongenitální imunologické nebo endokrinologické poruchy (Merz a Hay, 2005; Kirkpatrick, 2001).
4.1.2 Infekce nehtů
Mezi kandidózy napadající nehty patří infekce nehtového valu, paronychium. Postižené nehtové valy jsou bolestivé, zarudlé a oteklé. Onychomykóza je plísňová infekce nehtů. Obě infekce mohou být často viděny u jedinců s dlouhodobým máčením rukou ve vodě (např. u umývačů nádobí a barmanů) a také u pacientů s DM (Anaissie a kol., 2009; Dismukes a kol., 2003).
4.1.3 Slizniční infekce
Poškození sliznic je považováno za nejčastější klinický projev kandidózy. Mezi slizniční infekce patří orální kandidóza a vulvovaginální kandidóza (Merz a Hay, 2005).
22
4.1.3.1 Orální kandidóza
Orální kandidóza je běžná oportunní infekce ústní dutiny a je způsobena přemnožením nebo infekcí dutiny ústní kandidami (Akpan a Morgan, 2002). C. albicans je nejčastější druh zodpovědný za orální kandidózu (80-90 %). Tyto infekce jsou nejčastější u novorozenců, starších osob a vyskytují se v souvislosti se závažnými onemocněními, jako jsou například DM, leukémie, neoplazie a HIV infekce (Dismukes a kol., 2003). Existuje několik různých typů orální kandidózy: akutní pseudomembranózní, akutní atrofická, chronická atrofická, chronická hyperplastická a angulární cheilitida (Merz a Hay, 2005). Akutní pseudomembranózní kandidóza je nejčastější forma orální kandidózy (Dismukes a kol., 2003). Také známá pod pojmem soor (česky moučnivka). Je charakterizována šedobílými pseudomembranózními lézemi na dásních, jazyku a také na sliznici dutiny ústní. Léze, zejména pokud pokrývají větší plochy, mohou být bolestivé a narušit příjem potravy. Někdy se mohou rozšířit na sliznici jícnu, jak je vidět u pacientů s HIV/AIDS a způsobit poruchy polykání. Akutní atrofická kandidóza je charakterizována bolestivou erytematózní sliznicí, zejména na jazyku (Merz a Hay, 2005). S chronickou atrofickou kandidózou se často setkáváme u starších osob, zejména u těch, kteří používají zubní protézy. Tato infekce je často asymptomatická, ale někdy se vyznačuje zarudnutím a otokem sliznic pod zubními protézami. Chronická atrofická kandidóza byla zaznamenána u 24-60 % nositelů zubních protéz (Merz a Hay, 2005; Dismukes a kol., 2003). Chronická hyperplastická kandidóza (leukoplakie) se projevuje skvrnitými nebo homogenními bílými lézemi, které se mohou objevit na sliznici dutiny ústní a na postranních okrajích jazyka. Je zde prokázána souvislost s kouřením. Tato kandidóza je schopna progredovat až k těžké dysplazii nebo k zhoubnému bujení a proto se jí někdy říká kandidózní leukoplakie (Akpan a Morgan, 2002). Angulární cheilitida je klinicky charakterizována zarudnutím a fisurami v koutcích úst. Zvrásnění v koutcích úst a podél nosoretních rýh, zejména u starších lidí, vede k chronicky vlhkému prostředí, které předurčuje k těmto lézím (Merz a Hay, 2005; Akpan a Morgan, 2002).
23
4.1.3.2 Vulvovaginální kandidóza
Vulvovaginální kandidóza je infekční onemocnění ženských genitálií způsobené kvasinkami rodu Candida, jedná se o druhou nejčastější vaginální infekci. Během reprodukčního věku prodělá nejméně 75 % žen alespoň jednu epizodu VVK a u 40-50 % žen dojde k opakovanému výskytu tohoto onemocnění (Dismukes a kol., 2003; Kliment a kol., 1998). C. albicans je nejčastějším původcem VVK (85-90 %), dále je to C. glabrata (5-10 %) a C. tropicalis (1-3 %) (Horák, 2011b). Candida je přítomna v genitálním traktu asi u 10-20 % asymptomatických zdravých žen v plodném věku. K přenosu do pochvy dochází z přilehlé perianální oblasti a poté kandidy adherují k epiteliálním vaginálním buňkám (Dismukes a kol., 2003; Horák, 2011b). Mezi rizikové faktory, které jsou asociovány se zvýšeným výskytem VVK, patří těhotenství, DM, užívání orální antikoncepce s vysokým obsahem estrogenů či předchozí léčba antibiotiky (Merz a Hay, 2005). Germinace kandid zvyšuje kolonizaci a invazi do tkání. Faktory, které zvyšují nebo usnadňují germinaci (například již zmíněné těhotenství nebo hormonální antikoncepce s vysokým obsahem estrogenů) mají tendenci vyvolat symptomatické záněty pochvy, zatímco faktory, které inhibují klíčení (např. bakteriální mikroflóra) mohou zabránit akutní VVK u žen, které jsou pouze asymptomatickými přenašečkami kandid (Dismukes a kol., 2003). Ve většině případů se jedná o akutní formu VVK. Příznaky jsou většinou mírné, ale nepříjemné (svědění, vaginální bolest, dyspareunie, dysurie a vaginální výtok), rychle reaguje na lokální léčbu. Asi u 5 % žen se rozvíjí rekurentní forma VVK, je charakterizována 4 a více epizodami za rok (Anaissie a kol., 2009). U mužů jsou pohlavní infekce mnohem méně časté než u žen. Infekce se u nich projevují jako balanitidy s lézemi a erytémem na penisu (Merz a Hay, 2005; Anaissie a kol., 2009).
4.2 Invazivní kandidózy
Mezi nejzávažnější infekce patří diseminované a orgánové kandidózy. Kandidy mohou do tkání pronikat invazí nebo krevním řečištěm, kde infikují například ledviny, plíce a bronchy, GI trakt (Bednář, 1996). 24
Kandidy mohou infikovat srdeční chlopně (endokarditida), myokard (myokarditida) a perikard (perikarditida). Nejčastějším typem je endokarditida (Calderone a Clancy, 2011). Kandidová endokarditida je závažné onemocnění, které je spojováno s vysokou úmrtností a s vysokou mírou recidivy (Doctor Fungus, 2007 [online]). Endokarditida se vyskytuje především u jedinců s poškozenou nebo protetickou srdeční chlopní, u intravenózních uživatelů drog a také u pacientů po kardiochirurgickém zákroku (Merz a Hay, 2005). Ledviny patří mezi nejčastější cílové orgány při infekcích krevního řečiště kandidami, izolaci kandid v moči (kandidurie) lze považovat za jeden z prvních projevů diseminované kandidózy. Kandidurie je především odrazem kolonizace dolních cest močových, často se vyskytuje u pacientů s močovými katétry, kteří jsou léčeni širokospektrými antibiotiky (Calderone a Fonzi, 2001). Močové katétry mohou sloužit jako brána vstupu pro mikroorganizmy do močových cest, všechny katétry mohou být kolonizovány, pokud je ponecháme na místě příliš dlouho (Dismukes a kol., 2003). Méně často se s kandidurií setkáme u pyelonefritidy (infekce ledvinných pánviček), která vzniká jako důsledek ascendentní infekce z dolních cest močových. Kandidy mohou infikovat CNS jako následek hematogenní diseminované kandidózy a také vznikají v důsledku pooperačních komplikací neurochirurgických postupů, zejména po umístění ventrikuloperitoneálního šantu (Calderone a Fonzi, 2001). Rozvíjí se akutní nebo chronické kandidové meningitidy a abscesy (Anaissie a kol., 2009). Respirační infekce mohou postihnout plíce a bronchy, objevují se především u pacientů se základním primárním onemocněním (Merz a Hay, 2005). Byly popsány dvě formy kandidové pneumonie. Jednou z nich je místní nebo difúzní bronchopneumonie vzniklá bronchogenním šířením. Druhou formou je pneumonie, která vznikla jako následek rozsáhlého rozsevu u pacientů s kandidémií (Dismukes a kol., 2003). Mezi příznaky esofageální kandidózy (EK) patří bolestivá dysfagie a případně i bolest na hrudi. Bílé skvrny, podobné těm u orální kandidózy, mohou být rozpoznány endoskopicky na sliznici jícnu. Epidemie HIV dramaticky zvýšila výskyt EK. U HIV-pozitivního pacienta může být EK prvním projevem AIDS. Odhaduje se, že 10-30 % pacientů s AIDS, kteří mají orální kandidózu, mohou mít také esofageální kandidózu (Merz a Hay, 2005; Calderone a Fonzi, 2001).
25
Žaludeční kandidózy jsou méně časté než EK, což znamená, že žaludeční sliznice je více odolná vůči kandidám. Kandidy obvykle postihují již existující žaludeční léze, zejména žaludeční vředy (Dismukes a kol., 2003). Diseminovanou kandidózu (DK) je možné definovat jako multiorgánovou infekci včetně možné kandidémie. Jak již bylo uvedeno, diseminované kandidózy mohou zahrnovat postižení CNS, ledvin nebo jiných orgánů a systémů. DK způsobená C. albicans a dalšími kandidami je asociována s oslabením, to můžeme vidět u pacientů s rakovinou, po chirurgickém výkonu, po transplantaci, u předčasně narozených dětí, u pacientů s popáleninami a u drogově závislých (Merz a Hay, 2005). Kandidémie neboli kandidóza krevního řečiště se stala jednou z nejvýznamnějších nozokomiálních infekcí v průběhu posledních dvou dekád (Doctor Fungus, 2007 [online]) Klinické příznaky kandidémie jsou velmi nespecifické - horečka a septický stav (Ráčil a kol., 2007). C. albicans byla historicky nejčastější příčinou kandidémie, zachycena v 85-90 % všech kandidémií. Od roku 1990 došlo ke změně, incidence C. albicans postupně klesala (až pod 50 %) a v ostatních případech byly izolovány CNA (Doctor Fungus, 2007 [online]; Haber a kol., 2009b). Tato změna souvisí s plošným zavedením flukonazolu do lékařské praxe (Haber a kol., 2009b). GI trakt je primárním zdrojem infekce, původ je tedy endogenní. S exogenním zdrojem se setkáváme jen výjimečně, jedná se o dlouhodobě zavedené centrální žilní katétry (Haber a kol., 2009a; Haber a kol., 2008).
26
5 Léčba kvasinkových infekcí K léčbě infekcí způsobených kvasinkami rodu Candida se používají antimykotika. Antimykotika rozdělujeme na lokálně a celkově neboli systémově působící (Horák, 2011a). Podle chemické struktury se antimykotika dělí na azoly, polyeny, antimetabolity, echinokandiny a ostatní (Rozsypal, 2008), jak je přehledně uvedeno v tabulce 3.
Tab. 3: Přehled antimykotik (upraveno podle Rozsypal, 2008)
Azoly
Skupina Imidazoly Triazoly
Polyeny Antimetabolity Echinokandiny Ostatní Allylaminy Morfoliny
Zástupci Ketokonazol, Mikonazol Flukonazol, Intrakonazol, Vorikonazol, Posokonazol, Ravukonazol Amfotericin B, Nystatin, Natamycin Flucytosin Kaspofungin, Anidulafungin, Micafungin Terbinafin, Naftifin Amorolfin
5.1 Azoly
V klinické praxi se azoly používají od konce 70. let 20. století. V budoucnu se tato skupina léčiv bude dále rozšiřovat (Krausová, 2009). Azoly jsou vhodné pro lokální užití i pro systémové užití. Mikonazol, klotrimazol, flutrimazol, ekonazol, ketokonazol jsou příklady léčiv pro lokální užití (Horák, 2011a). Azoly pro systémové užití lze podle struktury rozdělit na dvě skupiny. Starší imidazoly (ketokonazol, mikonazol) s molekulou se dvěma atomy dusíku v pětičlenném kruhu jsou méně specifické a z toho důvodu mají více nežádoucích účinků. Novější triazoly (flukonazol, itrakonazol, vorikonazol, posakonazol, ravukonazol) mají méně nežádoucích účinků a jejich heterocyklus obsahuje tři atomy dusíku. Triazoly se mohou dále dělit na generace: do první řadíme flukonazol, itrakonazol a do druhé vorikonazol, posakonazol, ravukonazol (Rozsypal, 2008). Všechna azolová antimykotika (imidazoly, triazoly) inhibují aktivitu enzymu cytochrom P450-dependentní C-14α-demethylázy (kódovaný genem ERG11), což je enzym zodpovědný 27
za přeměnu lanosinu na ergosterol (Merz a Hay, 2005; Pánková, 2012). Inhibice tohoto enzymu zablokuje syntézu ergosterolu v buněčných membránách hub, kdy ergosterol je hlavní složkou buněčných membrán. Nedostatek ergosterolu a akumulace fosfolipidů v buňce vedou ke smrti buňky (Merz a Hay, 2005; Rozsypal, 2008). Flukonazol je nejpoužívanější azolová sloučenina. Má příznivou klinickou účinnost, je bezpečný a dobře dostupný ve formě orálních a parenterálních přípravků. Díky těmto vlastnostem došlo k rozšířenému používání flukonazolu pro léčbu i profylaxi. Proto byly brzy zaznamenány flukonazol-rezistentní izoláty, s čímž souvisí snaha vyvinout nové sloučeniny s příznivým účinkem proti flukonazol-rezistentním organizmům (Merz a Hay, 2005).
Obr. 1: Struktura flukonazolu (http://www.doctorfungus.org/thedrugs/Fluconazole.php)
5.2 Polyeny
Polyeny jsou makrolidová antibiotika s nenasycenými dienovými vazbami (Merz a Hay, 2005). Mezi polyeny řadíme tři antimykotika: amfotericin B, nystatin a natamycin. Nystatin a natamycin jsou vhodná léčiva pro lokální užití a amfotericin B je vhodný pro systémové užití (Horák, 2011a). Polyeny se vážou na steroly, převážně na ergosterol. Důsledkem této vazby dojde k narušení permeability buněčné membrány a k úniku intracelulárních iontů (draslíku a hořčíku) z cytoplazmy. Polyeny také narušují funkci oxidativních enzymů v cílových buňkách (Merz a Hay, 2005; Matoušková, 2005). Amfotericin B patřil mezi významná antimykotika používaná k léčbě invazivních kandidóz. Dnes už se v klasické, tzv. konvenční podobě příliš nevyužívá pro jeho vysokou 28
toxicitu (Horák, 2011a). Akutní toxicita je provázená slabostí, horečkou, třesavkou, bolestmi hlavy a chronickou nefrotoxicitou (Horák, 2011a; Rozsypal, 2008). Aby se snížila toxicita, využívají se různé lipidové formy amfotericinu B: lipozomální amfotericin B, koloidní disperze (ABCD) a lipidový komplex (ABLC). V ČR se využívá lipidový komplex a koloidní disperze (Horák, 2011a).
Obr. 2: Struktura amfotericinu B (http://www.doctorfungus.org/thedrugs/Ampho_Deoxycholate.php)
5.3 Antimetabolity
Hlavním zástupcem antimetabolitů je flucytosin (fluorovaná pyrimidinová báze 5-fluorocytosin, 5-FC) (Rozsypal, 2008). Flucytosin je aktivním transportem převeden do buňky pomocí cytosin-permeázy, v buňce je aktivován na 5-fluorouracil (5-FU) pomocí enzymu cytosin-deaminázy (Merz a Hay, 2005; Matoušková, 2005). 5-FU může být převeden pomocí enzymů na 5-fluorodeoxyuridin monofosfát (FdUMP), který je specifickým inhibitorem thymidylát syntetázy (zásadní enzym pro syntézu DNA) a 5-fluorouridin trifosfát (FUTP) (Klepser, 2001; White a kol., 1998). Vestavěním do mykotické RNA je narušena syntéza proteinů a výsledkem je zánik buňky (Rozsypal, 2008; Ráčil a kol., 2008).
29
Obr. 3: Struktura flucytosinu (http://www.doctorfungus.org/thedrugs/Flucytosine.php)
5.4 Echinokandiny
Echinokandiny jsou antimykotika určená pro systémové použití. Do klinické praxe byly zavedeny teprve nedávno (začátkem 21. století). Mezi hlavní zástupce řadíme kaspofungin, anidulafungin a micafungin (Horák, 2011a). Echinokandiny jsou polysyntetické cyklické glykoproteiny o molekulové hmotnosti kolem 1200 kD (Haber, 2005). „Chemicky jde o cyklické hexapeptidy s N-acyl lipidovým postranním řetězcem. Struktura postranního řetězce je zásadní pro antifungální aktivitu.“ (Haber, 2008, 297) Mechanismus účinku se výrazně liší od ostatních skupin antimykotik (Haber, 2005). Echinokandiny inhibují β-1,3-D-glukan syntázu nezbytnou pro produkci 1,3-β-glukanu, což je hlavní složka buněčné stěny většiny hub. β-1,3-D-glukan syntáza je enzymový komplex, který se skládá ze dvou podjednotek: z velkého intergrálního membránového proteinu, který je označovaný jako FKS1 nebo FKS2 (kódovaný genem FKS1 nebo FKS2) a z malé podjednotky RHO1. Glukany spolu s chitinem, mannany a manoproteiny jsou hlavní složky buněčné stěny hub. β-1,3-D-glukan syntáza je vhodným místem pro zásah antimykotik, nenachází v savčích buňkách a díky tomu tyto látky vykazují jen minimální nefrotoxicitu a hepatotoxicitu. Echinokandiny se vážou na buněčnou stěnu a mohou difúzně ovlivnit její syntézu (Merz a Hay, 2005). V důsledku toho dojde k narušení integrity buňky a k lýze buňky (Rozsypal, 2008).
30
Obr. 4: Struktura kaspofunginu (http://www.doctorfungus.org/thedrugs/Caspofungin.php)
5.5 Ostatní
5.5.1 Allylaminy
Hlavními zástupci allylaminů jsou terbinafin a naftifin (Rozsypal, 2008). Jsou to léčiva lokálně i systémově působící, ale mají omezené použití jen na superficiální mykózy (Horák, 2011a). Mechanismus účinku allylaminů je podobný jako u azolů, na rozdíl od azolů k inhibici dochází dříve a za účasti jiného enzymu. Allylaminy inhibují aktivitu enzymu skvalenepoxidázy (kódovaný genem ERG1), který konvertuje skvalen na 2,3-oxoskvalen (Merz a Hay, 2005; Horák, 2011a; Hamal a Svobodová, 2011). To vede k akumulaci skvalenu a následně k zvýšené propustnosti membrány a k narušení buněčné organizace.
31
Nejčastěji používaným allylaminem v klinické praxi je terbinafin (Merz a Hay, 2005). Terbinafin je syntetické antimykotikum. Je vysoce lipofilní povahy a má tendenci hromadit se v kůži, v nehtech a v tukové tkáni (Doctor Fungus, 2007 [online]).
5.5.2 Morfoliny
Amorolfin je jediným zástupcem morfolinů. Morfoliny fungují na podobném principu jako allylaminy a také se používají jen k léčbě superficiálních mykóz (Hamal a Svobodová, 2011).
32
6 Rezistence
6.1 Definice rezistence
Rezistence je absence aktivity léčiva proti konkrétnímu mikroorganizmu. Tento termín je nepřesný, je důležité rozlišovat mezi in vitro, molekulární a klinickou rezistencí. In vitro rezistence je vyšší hodnota minimální inhibiční koncentrace (MIC, jednotky µg/ml) léčiva proti určitému kmenu než mezní hodnota tohoto léčiva (tzv. breakpoint). Molekulární rezistence znázorňuje rezistenci na genetické úrovni, což může zahrnovat detekci bodových mutací, genové převody či genové amplifikace, které vedou ke zvýšené expresi nebo mitotické rekombinaci. Klinická rezistence znamená klinické selhání v reakci na léčbu antifungálními látkami. Nejen in vitro aktivita léčiva, ale také farmakokinetické a farmakodynamické vlastnosti, imunitní stav hostitele, faktory virulence a permanentní katétry mohou mít vliv na konečný klinický výsledek (Merz a Hay, 2005).
6.2 Primární a sekundární rezistence
Rezistence může být primární (vnitřní) a sekundární (získaná) (Kanafani a Perfect, 2008). Primární rezistence znamená přirozenou odolnost určitého druhu nebo rodu bez předchozí expozice léčivem (Merz a Hay, 2005; Kanafani a Perfect, 2008). Jedná se o předvídatelný typ rezistence, a proto je kladen důraz na identifikaci druhů hub z klinického materiálu (Kanafani a Perfect, 2008; Klepser, 2001). Typickým příkladem tohoto typu rezistence je rezistence C. krusei k flukonazolu (Kanafani a Perfect, 2008). Je-li C. krusei izolována z klinického materiálu, flukonazol nesmí být vybrán pro léčbu (Klepser, 2001). Sekundární rezistence se může vyvinout prostřednictvím různých mechanismů, které mohou vést k selhání léčby (Anaissie a kol., 2009). Nejčastěji se rozvíjí u dosud citlivých kmenů po expozici antimykotikem a obvykle je závislá na změněné genové expresi (Kanafani a Perfect, 2008). Je mnohem méně předvídatelná a problematičtější než primární rezistence (Klepser, 2001). Příkladem je vznik rezistence k flukonazolu u C. albicans (Kanafani a Perfect, 2008). 33
6.3 Mechanismy rezistence k antimykotikům
6.3.1 Azoly
Rezistence proti azolovým antimykotickým látkám může být vnitřní, jak je tomu u C. krusei a C. glabrata nebo může být získaná v průběhu léčby. Získaná rezistence nás zajímá zvláště u pacientů s AIDS, kteří trpí orální kandidózou. Přesto, že flukonazol a jiné azoly, jsou účinné při léčbě orální kandidózy, může docházet k selhání léčby spojené se vznikem azolových rezistentních kmenů C. albicans. Získaná azolová rezistence byla hlášena také u ústních izolátů C. glabrata od pacientů se syndromem AIDS (Barker a Rogers, 2006). Je známo několik mechanismů rezistence vůči azolům u rodu Candida, které jsou popsány níže. Přehled viz obrázek 5.
6.3.1.1 Bodové mutace v ERG11
Jedním z mechanismů rezistence u kandid jsou bodové mutace v genu ERG11, které vedou k aminokyselinovým substitucím (Pfaller, 2012; Marie a White, 2009). Aby byly mutace efektivní, musí dojít ke snížení afinity enzymu k léčivu bez poškození jeho buněčné funkce. Substituce aminokyselin jsou omezeny na konkrétní hot spots v cílových enzymech (Marie a White, 2009). Bylo zjištěno přes 80 aminokyselinových substitucí v ERG11 (Kanafani a Perfect, 2008). Bodové mutace vedoucí k nahrazení argininu lysinem na aminokyselině 467 (zkráceně R467K, kde R a K představují arginin a lysin) jsou spojeny s azolovou rezistencí u klinického kmene C. albicans (Merz a Hay, 2005; Klepser, 2001). Předpokládá se, že tato mutace má za následek změny v hem kofaktoru (Klepser, 2001). Další bodová mutace v ERG11 byla vyvinuta v laboratoři u kmene C. albicans, jedná se o nahrazení threoninu alaninem v poloze 315 (T315A) (Merz a Hay, 2005). Mutace T315A se nachází v aktivním místě enzymu, snižuje se enzymatická aktivita a vazba azolů na aktivní místo, což způsobuje rezistenci k flukonazolu (Merz a Hay, 2005; White a kol., 1998). D116E E266D jsou další dvě bodové mutace, které se často vyskytují v ERG11 u C. albicans (Merz a Hay, 2005). 34
6.3.1.2 Zvýšená exprese ERG11
Byla prokázána zvýšená exprese ERG11 u klinických izolátů C. albicans rezistentních k azolům, přesto podíl tohoto jevu na rozvoji rezistencí zůstává prozatím neznámý (Merz a Hay, 2005). Zvýšená exprese ERG11 vždy doprovází další změny spojené s rezistencí expresi efluxních pump, bodovou mutace R467K, a proto musí být ještě přesně vymezeno, jakou hraje roli ve vývoji azolové rezistence (Klepser, 2001). Zvýšení exprese ERG11 může být dosaženo prostřednictvím zvýšeného počtu kopií a či amplifikací genu (Merz a Hay, 2005).
6.3.1.3 Efluxní pumpy
Ke snížení intracelulární akumulace léčiva může dojít zabráněním vstupu léčiva do buňky nebo usnadněním jejího odstranění, případně kombinací obou mechanismů. Exprese nebo zvýšená exprese efluxních pump je považována za primární mechanismus, kterým kandidy mění intracelulární akumulaci léčiva (Klepser, 2001). Byly identifikovány dva typy efluxních pump, které přispívají k rezistenci vůči azolům u kandid: ATP binding cassette (ABC) transporters a major facilitator superfamily (MFS) proteins (Merz a Hay, 2005). ABC systém se skládá ze 4 proteinových domén: dvou membránových domény, z nich se každá skládá z 6 nebo 7 segmentů a dvou nukleotidových vazebných domén (White a kol., 1998). Jako zdroje energie využívá ATP, které se váže na ABC (Merz a Hay, 2005; White a kol., 1998). MFS proteiny neobsahují nukleotidové vazebné domény. Jsou složeny převážně z 12 až 14 membránových segmentů (White a kol., 1998). MFS proteiny využívají protonovou hnací sílu v membráně (H+ gradient přes membránu) jako zdroj energie. ABC transportéry jsou kódovány několika geny, hlavními jsou CDR geny. Zvýšená exprese genů CDR1 a CDR2 koreluje s azolovou rezistencí u kmenů C. albicans. Údaje týkající se genetické regulace MFS bílkovin jsou omezenější než u ABC systému. MDR1 je hlavním MFS genem. Současné údaje naznačují korelaci mezi zvýšenou expresí MDR1 a azolovou rezistencí u C. albicans a C. dubliniensis (Merz a Hay, 2005). Jedním z rozlišujících znaků mezi geny CDR a MDR je, že exprese u CDR je spojena s efluxem různých azolů, včetně flukonazolu, itrakonazolu, ketokonazolu, zatímco exprese 35
MDR1 má vliv pouze na flukonazol (Klepser, 2001).
6.3.1.4 Změny v jiných genech ERG
Kromě změn v demethyláze, je mechanismem rezistence změna v jiných enzymech ve stejné ergosterolové biosyntetické dráze (White a kol., 1998). Enzym ∆ 5,6 sterol desaturáza, kódovaný genem ERG3 byl spojen s rozvojem rezistence u C. albicans a C. glabrata (White a kol., 1998; Geber a kol., 1995). ∆ 5,6 sterol desaturáza umožňuje přeměnu 14-methyl-fekosterolu na toxické steroly, 14-methyl-3,6-diol a episterol. Akumulace toxických sterolů je považována za klíčový proces v expresi azolové aktivity. Lze očekávat, že mutace v ERG3 mají za následek produkci enzymů se změněnou aktivitou a sníženou schopnost tvořit toxické dioly, což by se mohlo projevit sníženou účinností azolů (Klepser, 2001).
6.3.1.5 Změny ve složení membrán
Změnami ve složení sterolů a fosfolipidů buněčných membrán hub dochází ke snížení propustnosti membrány a ke snížení množství léčiva (Merz a Hay, 2005). Zjistilo se, že nejvýznamnější změnou ve složení sterolů je vyčerpání ergosterolu a jeho nahrazení methylovanými steroly, například methylfekosterolem u C. albicans (Merz a Hay, 2005; Ghannoum a Rice, 1999).
6.3.1.6. Biofilm
Tvorba biofilmu také patří mezi mechanismy rezistence. Biofilmy jsou odolné vůči většině antimykotik a z toho důvodu představují hlavní problém v léčbě (Marie a White, 2009).
36
Obr. 5: Molekulární mechanismy azolové rezistence (upraveno podle White a kol., 1998). U citlivých buněk, azoly vstupují do buňky prostřednictvím neznámého mechanismu, nejspíš pasivní difúzí. Azoly inhibují Erg11 (růžový kroužek), blokují tvorbu ergosterolu. Jsou exprimovány dva typy efluxních pump. ABC transportéry mají membránové póry (zelené rourky) a dvě ABC domény (zelené kroužky). MDR proteiny s membránou pórů (růžová rourka). U rezistentních buněk, azoly také vstupují do buněk pomocí neznámého mechanismu. Azoly jsou méně účinné proti Erg11 ze dvou důvodů: enzym byl upraven specifickými bodovými mutacemi (tmavé dílky v růžovém kroužku) a enzym může být nadměrně exprimován. Změny jiných enzymů mohou také přispívat k azolové rezistenci (tmavé dílky v modrém kroužku). Steroly v buněčné membráně jsou také modifikovány (tmavě oranžová membrána). Azoly jsou odstraněny z buňky zvýšenou expresí genů CDR a MDR. CDR geny jsou účinné proti mnoha azolovým lékům. Geny MDR se zdají být specifické pro flukonazol.
37
6.3.2 Polyeny (Amfotericin B)
Přestože se amfotericin B používá v klinické praxi více než 50 let, vyvinula se vůči němu jen minimální rezistence (Klepser, 2001). Pravděpodobně je to způsobeno fungicidní povahou léčiva (Merz a Hay, 2005). Vývoj rezistence k amfotericinu B je vzácný u mnoha běžných houbových patogenů, ale C. lusitaniae a C. guilliermondii jsou považovány za vnitřně rezistentní vůči amfotericinu B (Barker a Rogers, 2006). Polyeny přednostně interagují s ergosterolem v buněčné membráně hub (Klepser, 2001). A proto jakákoliv změna v obsahu sterolů v buněčné membráně hub ovlivňuje množství nebo dostupnost ergosterolu a může mít za následek snížení polyenové aktivity. Mezi mechanismy rezistence patří: snížené množství ergosterolu v buněčné membráně hub, výměna ergosterolu za jiné steroly (fecosterol a episterol), změna v poměru sterolů k fosfolipidům, přeorientování nebo maskování ergosterolu v membráně (Merz a Hay, 2005). Tyto membránové změny mohou souviset s mutacemi v genech ERG2 a ERG3. Polyenovou rezistenci je obtížné objasnit, protože je exprimována pouze v reakci na stres, buňky se vrátí na vnímavý fenotyp, jakmile se odstraní napětí (Klepser, 2001). Rezistence k amfotericinu B může být také zprostředkována zvýšenou aktivitou katalázy, což vede ke snížení oxidačního poškození (Kanafani a Perfect, 2008; Pfaller, 2012). Další mechanismus rezistence souvisí s fází růstu buněk hub. Zjistilo se, že během exponenciálního růstu probíhá rozdělení a syntéza buněčné stěny při vysoké rychlosti, která poskytuje lepší přístup léčiva na membránu. Naproti tomu, při stacionární fázi růstu dochází k rozdělení a syntéze buněčné stěny při mnohem nižší rychlosti, což může vést ke vzniku rezistence vůči amfotericinu B. Předchozí expozice azoly může mít také vliv na vznik polyenové rezistence. Problémem je vyčerpaní ergosterolu předchozí antimykotickou aktivitou azolů. Tento druh interakce azolů s amfotericinem je jedním z příkladů antagonistického působení jednoho antimykotika vůči druhému (Merz a Hay, 2005).
38
6.3.3 Antimetabolity (Flucytosin)
Primární rezistence k flucytosinu je běžný jev. Odhady naznačují, že tato rezistence se vyskytuje přibližně u 10 % klinických izolátů C. albicans a u dalších 30 % izolátů se může vyvinout sekundární rezistence (Klepser, 2001). Mezi mechanismy rezistence k 5-FC patří: ztráta cytosin-permeázové aktivity, defekt v cytosin-deaminázové aktivitě a snížení aktivity enzymu uracil fosforibosyltransferázy (UPRTázy) (Merz a Hay, 2005). FCY1 (gen kódující cytosin-deaminázu), FCY2 (gen kódující cytosin-permeázu) jsou geny, které byly definovány pro 5-FC, mutací některého z těchto genů vzniká rezistence vůči 5-FC (Merz a Hay, 2005; Marie a White, 2009). Při samostatném použití 5-FC v klinické praxi dochází rychle k rozvoji sekundární rezistence, která je zprostředkována mutací cytosin-permeázy nebo cytosin-deaminázy (Merz a Hay, 2005). Rychlý rozvoj rezistence přiměl lékaře k používání 5-FC pouze v kombinaci s jinými antimykotiky, zejména s amfotericinem B nebo flukonazolem (Merz a Hay, 2005; Kanafani a Perfect, 2008).
6.3.4 Echinokandiny
Mutace v genech (FKS1 a FKS2) kódující enzymový komplex β-1,3-D-glukan syntázu vyvolávají rezistenci vůči echinokandinům. Snížená citlivost a rezistence kandid k echinokandinům je spojena s bodovými mutacemi ve dvou „hot-spot“ oblastech (HS1 a HS2) genu FKS1. Tento mechanismus rezistence byl prokázán u C. albicans a CNA (C. glabrata, C. krusei, C. tropicalis a C. dubliniensis). U C. glabrata je rezistence spojena také s mutacemi v genu FKS2 (Pfaller, 2012). Echinokandiny, zejména kaspofungin, dobře působí proti kandidám rezistentním vůči azolům, což je jedna z jejich nejdůležitějších vlastností (Merz a Hay, 2005; Barker a Rogers, 2006).
39
6.3.5 Ostatní
6.3.5.1 Allylaminy
Rezistence vůči allylaminům nebyla zatím prokázána u lidských patogenních hub. Stejně jako u ostatních používaných antimykotik, lze rezistenci očekávat (White a kol., 1998; Ghannoum a Rice, 1999). Vander Bosshe a kol. nalezli kmen C. albicans, který se stal rezistentním vůči flukonazolu a exprimoval zkříženou rezistenci k terbinafinu. Předběžné důkazy indikují, že terbinafin má dobrou účinnost proti některým azolovým rezistentním kmenům C. albicans (Ghannoum a Rice, 1999).
6.3.5.2 Morfoliny
Zatím nejsou hlášeny žádné zprávy o rezistenci vůči morfolinům (White a kol., 1998; Georgopapadakou a Walsh, 1996).
40
II
PRAKTICKÁ ČÁST
7 Cíle práce • Zjištění rozvoje rezistence k flukonazolu u kvasinek rodu Candida (C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis, C. dubliniensis). • Srovnání získaných výsledků s literaturou.
41
8 Materiál a metody
8.1 Materiál
8.1.1 Mikroorganizmy
V praktické části bakalářské práce bylo použito celkem 80 kmenů kvasinek rodu Candida, kmeny byly získány z laboratoří Mikrobiologického ústavu Fakultní nemocnice u sv. Anny v Brně. Konkrétně se jednalo o 20 kmenů C. albicans, 20 kmenů C. glabrata, 20 kmenů C. tropicalis a 20 kmenů C. dubliniensis. Izoláty byly získány z různých klinických materiálů: • 34 výtěrů z krku • 12 výtěrů z dutiny ústní • 10 ze sputa • 4 z tracheálního aspirátu • 4 z endotracheální kanyly • 6 ze stolice • 8 z moči • 1 z centrálního venózního katétru • 1 z mediastina-purulentní výpotek
8.1.2 Pomůcky • kahan • mikrobiologické kličky • špičky k automatické pipetě • skleněné zkumavky s vrškem 42
• plastové zkumavky • stojan na zkumavky • mikrotitrační destičky • plastové Petriho misky (o průměru 9 cm) • skleněné laboratorní lahve • jehlový inokulátor • tampony • pinzeta
8.1.3 Kultivační média, roztoky a chemikálie
Krevní agar Složení: 44 g Columbia blood agar base (Imuna, Šarišské Michaĺany, Slovenská republika), 70 ml defibrilované beraní krve (ZOO servis, Dvůr Králové, Česká republika), destilovaná voda ad 1000 ml. Agar se rozpustí v destilované vodě a autoklávuje se 15 minut při 121 °C. Poté se nechá ochladit na 50 °C, přidá se 7 % beraní krve a rozlévá na Petriho misky.
CHROMagar Candida (CHROMagar, Francie; katalogové číslo CA222) Složení: agar (15 g/l), pepton (10,2 g/l), chromogenní mix (22 g/l), chloramfenikol (0,5 g/l). Médium bylo připraveno dle návodu výrobce: 47,7 g směsi se rozpustí v1l
destilované vody, povaří se a autoklávuje.
Sabouraudův agar (Sabouraud-4% maltose agar; Merck KGaA, Německo) Složení: maltóza (40 g/l), pepton (10 g/l), agar (15 g/l).
43
Médium bylo připraveno dle návodu výrobce: 65 g směsi se rozpustí v 1 l destilované vody povařením, autoklávuje se 15 minut při 121 °C.
Mueller-Hinton agar s methylenovou modří (CMO337, firma OXOID) Složení: glukóza (20 g/l), methylenová modř (0,0005 g/l). Médium bylo připraveno dle návodu výrobce: směs se rozpustí v 1 l destilované vody a autoklávuje se 15 minut při 121 °C.
RPMI médium 900 ml destilované vody, RPMI 1640 10,4 g, MOPS 34,53 g, glukóza 18 g. Rozpustit, upravit na pH 7. Přidat vodu do konečného objemu 1 litru. Filtrace - filtr 0,22 µm
Fyziologický roztok 8,5 g NaCl, destilovaná voda ad 1000 ml. NaCl se rozpustí ve vodě a sterilizuje 15 minut při 121 °C.
Flukonazol - prášek (Sigma Aldrich)
E-test flukonazol (Liofilchem, Itálie)
8.1.4 Přístroje • Nastavitelné automatické pipety (Biohit, Finsko) • Nastavitelná automatická pipeta multikanálová (RAININ, Pipet-Lite XLS) • Vortex mixer (Snijder, Nizozemí) 44
• Denzitometr Densi-La-Meter (Pliva-Lachema, Brno, Česká republika) • Lednice • Mrazák • Komorový termostat (teplota 37 °C) • Laminární box (ESCO Labculture, biohazardní box třídy II) • Třepačka
8.2 Metody
8.2.1 Příprava kmenů a jejich kultivace
Kmeny kvasinek byly pomocí vyžíhané bakteriální kličky naočkovány na CHROMagar Candida, kultivovány v komorovém termostatu při teplotě 37 °C po dobu 48 hodin. Po kultivaci byl zkontrolován růst kvasinek a kmeny byly krátkodobě uchovány v lednici. Před vlastní prací byly kmeny opět přeočkovány na Sabouraudův agar (37 °C po 48 hodin).
8.2.1.1 CHROMagar Candida
CHROMagar Candida je selektivní médium, které nám umožňuje odlišit jednotlivé druhy kandid na základě barvy a povrchu kolonií. Chromogenní substráty obsaženy v médiu se pomocí enzymů rozpadnou a vytvářejí různě zbarvené produkty. C. albicans vytváří na CHROMagaru modrozelené kolonie, C. glabrata růžové až fialové kolonie, C. tropicalis modré kolonie a C. dubliniensis tmavě zelené kolonie (Silva a kol., 2012; BD, 2014 [online]).
8.2.1.2 Sabouraudův agar
Sabouraudův agar je nejvíce používané médium pro izolaci kandid z klinických vzorků. 45
Nejedná se o diferentní médium, a proto kolonie kandid pěstovaných na tomto agaru od sebe nelze snadno odlišit. Kandidy na tomto médiu vytváří krémově zbarvené kolonie (Odds a Bernaerts, 1994).
8.2.2 Indukce rezistence kmenů kvasinek k flukonazolu
Příprava suspenze Suspenze kvasinek byly připraveny v plastových zkumavkách. Nejprve bylo do zkumavek napipetováno po 2 ml fyziologického roztoku nastavitelnou automatickou pipetou. Poté byly do zkumavek s fyziologickým roztokem přidány příslušné kolonie kvasinek narostlé na Sabouraudově agaru. Tyto suspenze byly pomocí vortexu homogenizovány a poté byla změřena hustota inokula denzitometrem, hustota měla být 0,5 McFarlandovy stupnice optické denzity (McF). Vyšla-li hustota jiná, bylo potřeba ji upravit na 0,5McF a to buď přidáním kolonií kvasinek nebo přidáním fyziologického roztoku.
Ředění flukonazolu Množství prášku potřebného pro přípravu standardního roztoku lze vypočítat následovně (EUCAST, 2012 [online]):
V=
hmotnost (mg) x potency (mg/g) požadovaná c (mg/l)
potency (síla) = 980 mg/g požadovaná c (koncentrace) = 1280 mg/l
Flukonazol se rozpustil v dimethylsulfoxidu (DMSO). Takto připravený flukonazol se poté rozplnil do eppendorfek a byl uchován při teplotě -80 °C.
46
Tab. 4: Pro 60 ml RPMI média Koncentrace (µg/ml)
Flukonazol (µl)
0,5
26,4
1
52,5
5
262,8
10
525,6
25
1314
50
2628
Kultivace bez flukonazolu Byly připraveny a popsány 4 mikrotitrační destičky (každá pro jeden druh kvasinek). Do všech jamek bylo napipetováno 180 µl RPMI média nastavitelnou multikanálovou pipetou. Dále bylo do jamek napipetováno 20 µl suspenze, jeden kmen vždy do 4 jamek mikrotitrační destičky. Každý destička obsahovala také negativní kontrolu (16 jamek), kdy bylo v jamkách pouze RPMI médium (Obr. 6). Destičky byly přikryty a kultivovány 48 hodin při 37 °C v komorovém termostatu na třepačce, aby se buňky neusazovaly na dně důlků destičky.
Obr. 6: Kultivace bez flukonazolu: postup pipetování
47
Kultivace s flukonazolem Po kultivaci mikrotitračních destiček bez flukonazolu byly připraveny 4 nové mikrotitrační destičky. Do 4., 8. a 12. sloupce každé destičky bylo napipetováno 180 µl RPMI média. Do všech důlku ostatních sloupců bylo napipetováno 180 µl RPMI média s konečnou koncentrací flukonazolu 0,5 µg/ml. A nakonec byly do všech důlku (96 jamek) přeneseny příslušné suspenze kvasinek z předchozí destičky bez flukonazolu, vždy po 20 µl (Obr. 7). Následovala kultivace 48 hodin/ 37 °C na třepačce. Postupně byla zvyšována koncentrace flukonazolu 0,5- 1- 5- 10- 25- 50 µg/ml, pro každou koncentraci vždy 2x.
Obr. 7: Kultivace s flukonazolem: postup pipetování
Kontrola růstu Z původních mikrotitračních destiček byla vždy provedena kontrola růstu. Suspenze byly pomocí 48jehlového inokulátoru přeneseny z destiček na média (krevní agar a CHROMagar
48
Candida). Kultivace 48 hodin/ 37 °C. Po kultivaci byl zaznamenán výsledek (roste/ neroste) a misky uchovány v lednici k dalšímu zpracování.
Obr. 8: Fotografie mikrotitrační destičky po kultivaci
8.2.3 Provedení E-testů
Příprava kmenů Všechny původní kmeny kvasinek a vybrané indukované kmeny byly přeočkovány na CHROMagar Candida, kultivace 48 hodin/ 37 °C.
Příprava suspenze Dále byly připraveny suspenze kvasinek, postup stejný jako v kapitole 8.2.2.
Samotný E-test Připravené suspenze byly pomocí tamponu naneseny na MH agar s methylenovou modří. Na takto připravené misky s naočkovanou suspenzí kvasinek byly kladeny proužky papíru 49
napuštěné stoupající koncentrací flukonazolu. Kultivace 24 hodin/ 37 °C. U některých kmenů byla kultivace prodloužena na 48 hodin.
Vyhodnocení E-testu Po inkubaci byl proveden odečet. V místě, kde okraj inhibiční zóny vejčitého tvaru protíná proužek, se odečetla hodnota MIC.
Obr. 9: Fotografie E-testu, MIC = 0,125 µg/ml
50
9 Výsledky
9.1 Testování indukce rezistence kmenů kvasinek k flukonazolu
Tabulka 5 uvádí počet kmenů, které rostly po přenosu z mikrotitrační destičky na pevné médium. Podle našich výsledků můžeme říci, že C. albicans rostla při koncentraci max. 25 µg/ml. C. glabrata rostla až do nejvyšší testované koncentrace (50 µg/ml). C. tropicalis rostla do koncentrace 10 µg/ml. A C. dubliniensis rostla pouze do koncentrace 1 µg/ml.
Tab. 5: Počet kmenů, které rostly na médiu při dané koncentraci flukonazolu koncentrace
0
(µg/ml)
0,5
1
5
10
I
II
I
II
I
II
I
25 II
I
50 II
I
II
C. albicans
20
20
19
19
19
19
17
14
6
2
0
0
0
C. glabrata
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
19
C. tropicalis
20
19
18
18
17
13
8
5
3
0
0
0
0
C. dubliniensis
20
14
10
7
0
0
0
0
0
0
0
0
0
9.2 Výsledky E-testů
E-testy byly provedeny u všech původních kmenů kvasinek (celkem 80) a u vybraných indukovaných kmenů (celkem 21).
9.2.1 Původní kmeny
V tabulce 6 jsou uvedeny výsledky E-testů. Nejvyšší hodnota MIC u C. albicans byla 0,5 µg/ml, u C. glabrata 16 µg/ml, u C. tropicalis 2 µg/ml a u C. dubliniensis 0,38 µg/ml.
51
Tab. 6: Výsledky E-testů u původních kmenů C. albicans C. glabrata C. tropicalis C. dubliniensis MIC MIC MIC MIC Kmen Kmen Kmen Kmen (µg/ml) (µg/ml) (µg/ml) (µg/ml) 1 0,19 1 2 1 2 1 0,25 2
0,5
2
2
2
0,38
2
0,064
3
0,38
3
0,5
3
0,19
3
0,094
4
0,25
4
6
4
0,38
4
0,19
5
0,25
5
16
5
0,5
5
0,38
6
0,25
6
2
6
0,38
6
0,094
7
0,38
7
4
7
0,19
7
0,094
8
0,125
8
3
8
0,5
8
0,125
9
0,38
9
4
9
0,19
9
0,094
10
0,19
10
12
10
0,5
10
0,047
11
0,25
11
2
11
0,75
11
0,125
12
0,38
12
6
12
1
12
0,047
13
0,5
13
4
13
1
13
0,19
14
0,5
14
1
14
0,75
14
0,25
15
0,25
15
0,5
15
0,25
15
0,19
16
0,25
16
3
16
0,38
16
0,19
17
0,125
17
3
17
0,5
17
0,38
18
0,19
18
1
18
0,38
18
0,19
19
0,25
19
3
19
0,5
19
0,19
20
0,5
20
4
20
0,38
20
0,094
52
Tab. 7: Počet kmenů, které rostly při dané koncentraci flukonazolu c C. albicans C. glabrata C. tropicalis C. dubliniensis 0,016 0,023 0,032 0,047 2 0,064 1 0,094 4 0,125 2 3 0,19 3 3 6 0,25 7 1 2 0,38 4 6 2 0,50 4 2 5 0,75 2 1 2 2 1,5 2 4 1 3 4 4 4 6 2 8 12 1 16 1 24 32 48 64 96 128 192 256 S S ≤2 S ≤0,002 S ≤2 ND R R >4 R >32 R >4 ND
legenda: S - citlivý, R - rezistentní, ND - není definováno, c - koncentrace (µg/ml) Tato tabulka vychází z tabulky 6. Je zde vyjádřen součet jednotlivých kmenů, které rostly při dané koncentraci flukonazolu. Dále jsou v tabulce uvedeny hodnoty breakpointů pro jednotlivé druhy podle EUCAST-AFST.
53
9.2.2 Vybrané indukované kmeny
C. albicans Vybrali jsme 11 kmenů C. albicans, které rostly při vyšší koncentraci, a provedli u nich testování citlivosti pomocí E-testu.
Tab. 8: Výsledky E-testů u indukovaných kmenů C. albicans C. albicans Kmen
MIC (µg/ml)
3 25 I
0,75
3 25 II
0,75
4 50 II
0,38
6 50 II
0,25
7 25 I
0,25
8 25 I
0,75
13 25 II
0,75
14 25 II
0,75
18 25 II
0,38
19 50 I
0,25
20 50 II
0,38
C. glabrata Vybrali jsme 4 kmeny C. glabrata, které rostly při vyšší koncentraci a udělali u nich E-test.
Tab. 9: Výsledky E-testů u indukovaných kmenů C. glabrata C. glabrata Kmen
MIC (µg/ml)
1 50 II
256
2 50 II
6
6 50 II
3
11 50 II
6
54
C. tropicalis U C. tropicalis jsme vybrali 4 kmeny, které rostly při vyšší koncentraci a taktéž provedli E-test.
Tab. 10: Výsledky E-testů u indukovaných kmenů C. tropicalis C. tropicalis Kmen
MIC (µg/ml)
2 25 II
12
7 50 II
0,38
8 25 II
0,38
13 50 I
1
C. dubliniensis U C. dubliniensis jsme vybrali jen 2 kmeny pro testování pomocí E-testu, protože při vyšších koncentracích tyto kmeny nerostly.
Tab. 11: Výsledky E-testů u indukovaných kmenů C. dubliniensis C. dubliniensis Kmen
MIC (µg/ml)
1 5 II
0,25
16 1 II
0,5
9.3 Srovnání původních a indukovaných kmenů
Tab. 12: Porovnání výsledků E-testů u původních a u indukovaných kmenů C. glabrata
Kmen č.
C. glabrata Původní Indukované (µg/ml) (µg/ml)
1
2
256
2
2
6
6
2
3
11
2
6 55
Tab. 13: Porovnání výsledků E-testů u původních a u indukovaných kmenů C. albicans
Kmen č.
C. albicans Původní Indukované (µg/ml) (µg/ml)
3
0,38
0,75
4
0,25
0,38
6
0,25
0,25
7
0,38
0,25
8
0,125
0,75
13
0,5
0,75
14
0,5
0,75
18
0,19
0,38
19
0,25
0,25
20
0,5
0,38
Tab. 14: Porovnání výsledků E-testů u původních a u indukovaných kmenů C. tropicalis
Kmen č.
C. tropicalis Původní Indukované (µg/ml) (µg/ml)
2
0,38
12
7
0,19
0,38
8
0,5
0,38
13
1
1
Tab. 15: Porovnání výsledků E-testů u původních a u indukovaných kmenů C. dubliniensis
Kmen č.
C. dubliniensis Původní Indukované (µg/ml) (µg/ml)
1
0,25
0,25
16
0,19
0,25
56
10 Diskuze Výsledky E-testů ukázaly, že nejvyšší hodnota MIC byla 0,5 µg/ml pro C. albicans, 16 µg/ml pro C. glabrata, 2 µg/ml pro C. tropicalis a 0,38 µg/ml pro C. dubliniensis. Srovnáme-li jednotlivé druhy mezi sebou, tak lze konstatovat, že C. glabrata byla nejvíce odolná vůči flukonazolu a nejvíce citlivá byla C. dubliniensis, což bylo zjištěn také při testování indukce rezistence. Testováním indukce rezistence bylo zjištěno, že C. albicans rostla do koncentrace 25 µg/ml, C. glabrata do 50 µg/ml, C. tropicalis do 10 µg/ml a C. dubliniensis do 1 µg/ml. Výsledky E-testů u indukovaných kmenů ukázaly, že nejvyšší hodnota MIC byla 0,75 µg/ml pro C. albicans, 256 µg/ml pro C. glabrata, 12 µg/ml pro C. tropicalis a 0,5 µg/ml pro C. dubliniensis. Detekcí rezistence se zabývá organizace zvaná EUCAST (European Comittee On Antimicrobial Susceptibility Testing). Ta uvádí, že aktivita flukonazolu ke kandidám není jednotná. C. albicans a C. tropicalis inklinují k relativně nízkým hodnotám MIC, zatímco MIC pro C. glabrata bývá vyšší. Z toho důvodu EUCAST upozorňuje, že má být každý pokus o identifikaci kandid proveden na úrovni druhů. EUCAST-AFST (European Comittee On Antimicrobial Susceptibility Testing - subcommittee on Antifungal Susceptibility Testing) stanovil hodnoty breakpointů pro flukonazol u kandid. Tyto hodnoty byly již zmíněny v tabulce 7, ale pro přehlednost je zde uvedeme ještě jednou. C. albicans citlivé S ≤2 µg/ml, rezistentní R >4 µg/ml; C. glabrata citlivé S ≤0,002 µg/ml, rezistentní R >32 µg/ml; C. tropicalis citlivé S ≤2 µg/ml, rezistentní R >4 µg/ml; pro C. dubliniensis nejsou hodnoty zatím uvedeny. Mazuelos a kol. vypracovali v roce 1999 studii, cílem této studie bylo porovnat výsledky MIC získané z E-testů a z mikrodilučních metod pro testování citlivosti kandid k flukonazolu a itrakonazolu. Celkem bylo testováno 402 izolátů kvasinek získaných z oropharyngeálních vzorků od 145 pacientů s AIDS a 7 kontrolních a referenčních kmenů. Klinické izoláty měly následující druhové zastoupení: 360 C. albicans, 17 C. tropicalis, 9 C. krusei, 9 C. glabrata a 7 C. parapsilosis. Při testovaní pomocí mikrodiluční metody vyšly hodnoty MIC pro flukonazol: C. albicans a C. krusei 0,12-64 µg/ml, C. tropicalis 0,16-64 µg/ml, C. glabrata 2-64 µg/ml, C. parapsilosis 0,12-2 µg/ml. Při testování pomocí E-testu vyšly hodnoty MIC pro flukonazol: C. albicans a C. krusei 0,12-256 µg/ml, C. tropicalis 0,5-256 µg/ml, C. glabrata 32-256 µg/ml, C. parapsilosis 0,25-8 µg/ml. MIC stanovené 57
oběma metodami prokázali velký rozsah citlivosti. Celková shoda byla 74,5 %, korelace mezi těmito dvěma metodami u testovaných kvasinek pokrývá rozsah od 66,6 % (C. glabrata) do 88,2 % (C. tropicalis). Po studiu dopadu neshody mezi metodami bylo zjištěno, že 80 % izolátů C. albicans bylo buď citlivých anebo rezistentních oběma metodami, zatímco u 14 izolátů (3,8 %) zjistili velmi významné nesrovnalosti (rezistentní referenční metodou, ale citlivé E-testem). U 13 izolátů (3,6 %) zjistili významné nesrovnalosti (citlivé referenční metodou, rezistentní E-testem) a u 45 izolátů se ukázaly drobné nesrovnalosti. U ostatních druhů nebyly nalezeny tak významné odchylky jako u C. albicans. Moran a kol. provedli v roce 1998 studii, ve které se zabývali rezistencí k flukonazolu u C. dubliniensis. Uvedli, že rezistence k flukonazolu se vyskytovala u 20 % orálních izolátů C. dubliniensis (rozsah MIC: 8-32 µg/ml) získaných od pacientů s AIDS, kteří byli dříve léčeni flukonazolem. Tuto situaci se poté pokusili vyvolat in vitro. Po expozici flukonazol-citlivých klinických izolátů C. dubliniensis došlo ke zvýšené koncentraci flukonazolu v agarovém médium a to vedlo k obnově derivátů, které vykazovaly stabilní flukonazol-rezistentní fenotyp (rozsah MIC: 16-64 µg/ml). V našem experimentu jsme neprokázali, že po expozici léčivem došlo k nárůstu rezistence u C. dubliniensis. Po indukci byla nejvyšší hodnota MIC pro C. dubliniensis 0,5 µg/ml. Pfaller a kol. se ve svém článku publikovaném v roce 2004 mimo jiné zabývali citlivostí flukonazolu k izolátů z krevního řečiště. Uvedli, že u většiny druhů kandid, které způsobují infekce krevního řečiště se azolová rezistence vyskytuje jen zřídka. Výjimkou je C. glabrata, kde je více než 10 % izolátů rezistentních vůči flukonazolu. V článku z roku 2008 autoři Kanafani a Perfect publikovali, že výskyt azolové rezistence mezi nejčastěji se vyskytujícími invazivními druhy kandid zůstává nízký, výjimkou je C. glabrata. Podle údajů z ARTEMIS Global Antifungal Surveillance Program vzrostl výskyt rezistence k flukonazolu u C. glabrata ze 7 % (v roce 2001) na 12 % (v roce 2004). V našem experimentu jsme také prokázali, že ze všech čtyř testovaných druhů kandid je C. glabrata nejvíce rezistentní k flukonazolu a nejčastěji u ní dochází k rozvoji rezistence in vitro.
58
11 Závěr Cílem této práce bylo zjištění rozvoje rezistence k flukonazolu u čtyř druhů kvasinek rodu Candida, které byly získány z klinického materiálu. Konkrétně bylo hodnoceno 20 kmenů C. albicans, 20 kmenů C. glabrata, 20 kmenů C. tropicalis a 20 kmenů C. dubliniensis. Zjišťování rozvoje rezistence bylo testováno pomocí indukce rezistence kmenů kvasinek k flukonazolu na mikrotitrační destičce. Testováním indukce rezistence kmenů kvasinek k flukonazolu jsme došli k závěru, že C. albicans rostla do koncentrace 25 µg/ml, C. glabrata do 50 µg/ml, C. tropicalis do 10 µg/ml a C. dubliniensis do 1 µg/ml. E-testem byla u kmenů původních i indukovaných stanovena minimální inhibiční koncentrace. Bylo prokázáno, že C. glabrata byla ze všech čtyř testovaných druhů nejvíce odolná vůči flukonazolu, což platilo jak pro původní tak i indukované kmeny. Její nejvyšší hodnota MIC u původních kmenů byla 16 µg/ml a u indukovaných byla 256 µg/ml. Naopak C. dubliniensis byla nejvíce citlivým druhem, její nejvyšší hodnota MIC u původních kmenů byla 0,38 µg/ml a u indukovaných byla 0,5 µg/ml. C. albicans měla nejvyšší hodnotu MIC 0,5 µg/ml u původních kmenů a 0,75 µg/ml u indukovaných. C. tropicalis měla nejvyšší hodnotu MIC 2 µg/ml u původních kmenů a 12 µg/ml u indukovaných. V současné době je zvyšující se výskyt rezistentních kmenů považován za závažný problém, a proto je kladen důraz na správnou identifikaci jednotlivých druhů hub z klinického materiálu, testování jejich citlivosti před podáním léčiva a sledování vývoje rezistence v rámci evropských a celosvětových databází.
59
Použitá literatura AKPAN, A. a R. MORGAN. Oral candidiasis. Postgrad Med J. 2002, č. 78, s. 455-459. ANAISSIE, Elias J., Michael R. MCGINNIS a Michael A. PFALLER. Clinical Mycology. 2nd ed. Edinburgh: Churchill Livingstone Elsevier, 2009, 688 s. ISBN 9781416056805. BARKER, Katherine S. a P. David ROGERS. Recent Insights into the Mechanisms of Antifungal Resistance. Current Infectious Disease Reports. 2006, č. 8, s. 449-456. BEDNÁŘ, Marek et al. Lékařská mikrobiologie: bakteriologie, virologie, parazitologie. Vyd. 1. Praha: Marvil, 1996, 558 s. ISBN 80-238-0297-6. BIALKOVÁ, A. a J. ŠUBÍK. Biology of the Pathogenic Yeast Candida glabrata. Folia Microbiol. 2006, č. 51, s. 3-20. CALDERONE, Richard A. a Cornelius J. CLANCY. Candida and candidiasis [online]. (2nd Edition). Washington, DC, USA: ASM Press, 2011 [cit. 2014-03-18]. ISBN 9781555817176.
Dostupné
z:
http://site.ebrary.com/lib/masaryk/docDetail.action?docID=10607273 CALDERONE, Richard A. a William A. FONZI. Virulence factors of Candida albicans. TRENDS in Microbiology. 2001, roč. 9, č. 7, s. 327-335. DISMUKES, William E., Peter G. PAPPAS a Jack D. SOBEL. Clinical Mycology [online]. New York: Oxford University Press, 2003 [cit. 2014-03-18]. ISBN 01-951-4809-6. Dostupné z: http://site.ebrary.com/lib/masaryk/docDetail.action?docID=10142387 DOUGLAS, L. Julia. Candida biofilms and their role in infection. Trends in Microbiology. 2003, roč. 11, č. 1, s. 30-36. FIDEL. Candida glabrata: Review of Epidemiology, Pathogenesis, and Clinical Disease with Comparison to C. albicans. Clinical Microbiol. Rev. 1999, č. 12, s. 80-96. GEBER, Antonia, Christopher A. HITCHCOCK, Jessica E. SWARTZ, Frank S. PULLEN, MARSDEN, KWON-CHUNG a John E. BENNETT. Deletion of the Candida glabrata ERG3 and ERG11 Genes: Effect on Cell Viability, Cell Growth, Sterol Composition,
and
Antifungal
Susceptibility.
AND CHEMOTHERAPY. 1995, roč. 39, č. 12, s. 2708-2717.
60
ANTIMICROBIAL
AGENTS
GEORGOPAPADAKOU, Nafsika H. a Thomas J. WALSH. Antifungal Agents: Chemotherapeutic Targets and Immunologic Strategies. ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY. 1996, roč. 40, č. 2, s. 279-291. GHANNOUM, Mahmoud A. Potencial role of phospholipases in virulence and fungal pathogenesis. Clin. Microbiol. Rev. 2000, roč. 13, č. 1, s. 122-143. GHANNOUM, Mahmoud A. a Louis B. RICE. Antifungal Agents: Mode of Action, Mechanisms of Resistance, and Correlation of These Mechanisms with Bacterial Resistance. CLINICAL MICROBIOLOGY REVIEWS. 1999, roč. 12, č. 4, s. 501-517. GILFILLAN, Gregor D., Derek J. SULLIVAN, Ken HAYNES, Tanya PARKINSON, David C. COLEMAN a Neil A. R. GOW. Candida dubliniensis: phylogeny and putative virulence factors. Microbiology. 1998, č. 144, s. 829-838. HABER, Jan. Nová antimykotika - jaká jsou a co přinášejí. Remedia. 2005, roč. 15, č. 3, s. 247-258. HABER, Jan. Echinokandiny - nová skupina antimykotik. Remedia. 2008, roč. 18, č. 4, s. 297-309. HABER, Jan, Naďa MALLÁTOVÁ a Ľuboš DRGOŇA. Epidemiologie invazivní kandidózy a kandidémie: vývoj za poslední tři desetiletí. Onkológia (Bratisl.). 2009a, roč. 4, č. 2, s. 107-111. HABER, Jan, Naďa MALLÁTOVÁ a Ľuboš DRGOŇA. Změna spektra kandid způsobující invazivní kandidózu - status quo v Evropě, České a Slovenské republice. Onkológia (Bratisl.). 2009b, roč. 4, č. 5, s. 294-298. HABER, J., Z. RÁČIL, J. MAYER, N. MALLÁTOVÁ, M. KOUBA, P. SEDLÁČEK, E. FABER, I. HEROLD, P. MÚDRÝ, L. DRGOŇA, I. KOCMANOVÁ, M. KARAS, V. BUCHTA, J. VYDRA, M. KOLÁŘ, J. TRUPL, V. MAREŠOVÁ, O. NÝČ a K. CWIERTKA. Léčba invazivní kandidózy - doporučení odborných společností. Vnitř Lék. 2008, roč. 54, č. 12, s. 1174-1184. HAMAL, Petr a Lucie SVOBODOVÁ. Mykózy a antimykotika. Interní Med. 2011, roč. 13, č. 11, 445-449. HANNULA, J., M. SAARELA, B. DOGAN, J. PAATSAMA, P. KOUKILAKÄHKÖLÄ, S. PIRINEN, H. L. ALAKOMI, J. PERHEENTUPA a S. ASIKAINEN. Comparison of virulence factors of oral Candida dubliniensis and Candida albicans isolates 61
in healthy people and patients with chronic candidosis. Oral Microbiol Immunol. 2000, č. 15, s. 238-244. HORÁK, Petr. Specifická antimykotika a jejich použití u vybraných patologických stavů. Interní Med. 2011a, roč. 13, č. 4, s. 171-175. HORÁK, Petr. Vulvovaginální kandidóza, farmakoterapie a prevence. Prakt. lékáren. 2011b, roč. 7, č. 2, s. 80-84. HOYER, Lois L. The ALS gene family of Candida albicans. TRENDS in Microbiology. 2001, roč. 9, č. 4, s. 176-180. KANAFANI, Zeina A. a John R. PERFECT. Resistance to Antifungal Agents: Mechanisms and Clinical Impact. Clinical Infectious Diseases. 2008, roč. 46, č. 1, s. 120-128. KIM, Joon a Peter SUDBERY. Candida albicans, a major human fungal pathogen. The Journal of Microbiology. 2011, roč. 49, č. 2, s. 171-177. KIRKPATRICK, Charles H. Chronic mucocutaneous candidiasis. Pediatr Infect Dis J. 2001, roč. 20, č. 2, s. 197-206. KLABAN, Vladimír. Ilustrovaný mikrobiologický slovník. 1. české vyd. Praha: Galén, 2005, 654 s. ISBN 80-7262-341-9. KLEPSER, Michael E. Antifungal Resistance Among Candida Species. Supplement to PHARMACOTHERAPY. 2001, roč. 21, č. 8, s. 124-132. KLIMENT, Michal, Miroslav KORBEL, Peter HRÚZIK a Martin REDECHA. Etiológia, patogenéza a diagnostika akútnej a recidivujúcej vulvovaginálnej kandidózy. Prakt. Gynek. 1998, roč. 5, č. 1, s. 1-7. KOTHAVADE, Rajendra J., M. M. KURA, Arvind G. VALAND a M. H. PANTHAKI. Candida tropicalis: its prevalence, pathogenicity and increasing resistance to fluconazole. Journal of Medical Microbiology. 2010, č. 59, s. 873-880. KRAUSOVÁ, Lucie, Jiří GRIM a Petr PÁVEK. Azolová antimykotika: mechanismy lékových interakcí. Klin Farmakol Farm. 2009, roč. 23, č. 2, s. 86-89. MARIE, Chelsea a Theodore C. WHITE. Genetic Basis of Antifungal Drug Resistance. Curr Fungal Infect Rep. 2009, roč. 3, č. 3, s. 163-169. MATOUŠKOVÁ, M. Mykotické infekce. Urol List. 2005, roč. 3, č. 2, s. 39-43.
62
MERZ, William G. a Roderick J. HAY. Topley and Wilson's Microbiology and Microbial Infections, Medical Mycology. 10th Edition. London: Hodder Arnold, 2005, 869 s. ISBN 034088567X. ODDS, Frank C. a Ria BERNAERTS. CHROMagar Candida, a New Differential Isolation Medium for Presumptive Identification of Clinically Important Candida Species. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY. 1994, roč. 32, č. 8, s. 1923-1929. PÁNKOVÁ, Růžena. Komplexní léčba kandidóz. Urol. praxi. 2012, roč. 13, č. 5, s. 209-211. PFALLER, Michael A. Antifungal Drug Resistance: Mechanisms, Epidemiology and Consequences for Treatment. The American Journal of Medicine. 2012, roč. 125, č. 1A, s. 3-13. RÁČIL, Zdeněk, Iva KOCMANOVÁ, Barbora WAGNEROVÁ, Leoš KŘEN, Lucie KŘIKAVOVÁ a Jiří MAYER. Invazívní mykotické infekce u onkologických nemocných: změny v epidemiologii a diagnostice. Postgraduální medicína [online]. 2007, č. 3. [cit. 201403-27]. Dostupné z: http://zdravi.e15.cz/clanek/postgradualni-medicina/invazivni-mykotickeinfekce-u-onkologickych-nemocnych-zmeny-v-ep-295143 RÁČIL, Zdeněk, Iva KOCMANOVÁ, Barbora WEINBERGEROVÁ, Šárka BOHATÁ, Jana WINTEROVÁ a Jiří MAYER. Terapie invazivních mykóz. Interní Med. 2008, roč. 10, č. 4, s. 167-171. ROZSYPAL, Hanuš. Systémová antimykotika. Klin Farmakol Farm. 2008, roč. 22, č. 1, s. 40-44. SARDI, J. C. O., L. SCORZONI, T. BERNARDI, A. M. FUSCO-ALMEIDA a M. J. S. MENDES GIANNINI. Candida species: current epidemiology, pathogenicity, biofilm formation, natural antifungal products and new therapeutic options. Journal of Medical Microbiology. 2013, č. 62, s. 10-24. SILVA, Sónia, Melyssa NEGRI, Mariana HENRIQUES, Rosário OLIVEIRA, David W. WILLIAMS a Joana AZEREDO. Candida glabrata, Candida parapsilosis and Candida tropicalis: biology, epidemiology, pathogenicity and antifungal resistance. FEMS Microbiol Rev. 2012, č. 36, s. 288-305. SULLIVAN, Derek
a David COLEMAN. Candida dubliniensis: characteristics
and identification. J. Clin. Microbiol. 1998, roč. 36, č. 2, s. 329-334.
63
SULLIVAN, Derek J., Gary P. MORAN a David C. COLEMAN. Candida dubliniensis: Ten years on. FEMS Microbiology Letters. 2005, č. 253, s. 9-17. SULLIVAN, Derek J., Gary P. MORAN, Emmanuelle PINJON, Asmaa AL-MOSAID, Cheryl
STOKES,
Claire
VAUGHAN
a
David
C.
COLEMAN.
Comparison
of the epidemiology, drug resistance mechanisms, and virulence of Candida dubliniensis and Candida albicans. FEMS Yeast Research. 2004, č. 4, s. 369-376. SULLIVAN, Derek J., Thea J. WESTERNENG, Ken A. HAYNES, Desiree E. BENNETT a David C. COLEMAN. Candida dubliniensis sp. nov.: phenotypic and molecular characterization of a novel species associated with oral candidosis in HIVinfected individuals. Microbiology. 1995, č. 141, s. 1507-1521. VERSTREPEN, Kevin J. a Frans M. KLIS. Flocculation, adhesion and biofilm formation in yeasts. Molecular Microbiology. 2006, roč. 60, č. 1, s. 5-15. VOTAVA, Miroslav et al. Lékařská mikrobiologie speciální. Brno: Neptun, 2003, 495 s. ISBN 80-902-8966-5. VOTAVA, Miroslav. Lékařská mikrobiologie: vyšetřovací metody. Brno: Neptun, 2010, 495 s. ISBN 9788086850047. WHITE, Theodore C., Kieren A. MARR a Raleigh A. BOWDEN. Clinical, Cellular, and Molecular Factors That Contribute to Antifungal Drug Resistance. CLINICAL MICROBIOLOGY REVIEWS. 1998, roč. 11, č. 2, s. 382-402. YANG, Yun-Liang. Virulence factors of Candida species. J Microbiol Immunol Infect. 2003, č. 36, s. 223-228.
Internetové zdroje DOCTOR FUNGUS. [online]. 2007. [cit. 2014-03-08]. Dostupné z: http://www.doctorfungus.org/ BD. [online]. 2014. [cit. 2014-04-11]. Dostupné z: http://www.bd.com/resource.aspx?IDX=8603
64
EUCAST. [online]. 2013. [cit. 2014-04-12]. Dostupné z: http://www.eucast.org/antifungal_susceptibility_testing_afst/methods_of_antifungal_suscepti bility_testing/susceptibility_testing_of_yeasts/
65
