Antibiotická rezistence Enterococcus spp. u ferálních holubů

Masarykova univerzita v Brně Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie, Oddělení mikrobiologie                

Antibiotická rezistence Enterococcus spp. u ferálních holubů

Rigorózní práce

Mgr. Petra Frolková Brno 2010    

Ráda bych touto cestou poděkovala všem, kteří mi pomohli s touto prací. Největší poděkování patří mému kolegovi Tomáši Radiměřskému, který mi pomáhal se zpracováním vzorků a panu RNDr. Pavlu Švecovi, PhD., který prováděl identifikací enterokoků pomocí rep-PCR a také mi poskytl cenné rady ohledně identifikace. Také děkuji Mgr. Petře Číkové, která nám poskytla mikrobiální vzorky. Zvláštní poděkování patří profesorům z VFU Brno, Prof. MVDr. Aloisi Čížkovi, Csc., který mi pomáhal s realizací celé této práce a Prof. MVDr. Ivanu Literákovi, Csc., mému školiteli, který financoval celý tento projekt v rámci Veterinární a farmaceutické univerzity Brno. Ještě jednou všem děkuji a vážím si jejich pomoci.    

Prohlášení

Prohlašuji, že jsem tuto rigorózní práci vypracovala samostatně a pouze s použitím pramenů uvedených v seznamu literatury.

    V Brně, dne                   

 

 

 

 

   

               Petra Frolková

 

OBSAH  

1.

ÚVOD ....................................................................................................................... 6 1.1.

Historie rodu Enterococcus ............................................................................... 7

1.2.

Charakteristika enterokoků ................................................................................ 8

1.3.

Antimikrobiální rezistence ................................................................................. 9

1.3.1.

Rezistence k β-laktamovým antibiotikům ................................................ 10

1.3.2.

Rezistence k aminoglykosidovým antibiotikům....................................... 12

1.3.3.

Rezistence ke glykopeptidovým antibiotikům ......................................... 13

1.3.4.

Rezistence k makrolidovým antibiotikům ................................................ 16

1.3.5.

Rezistence k tetracyklinovým antibiotikům ............................................. 17

1.3.6.

Rezistence k chloramfenikolu .................................................................. 18

1.4.

Plazmidy a transpozony ................................................................................... 18

1.4.1.

Plazmidy ................................................................................................... 18

1.4.2.

Transpozony ............................................................................................. 20

2.

CÍL PRÁCE ........................................................................................................... 22

3.

METODY ............................................................................................................... 23 3.1

Odběr vzorků a jejich pomnožení .................................................................... 23

3.2.

Materiál ............................................................................................................ 23

3.2.1.

Kultivační a zamražovací média............................................................... 23

3.2.2.

Chemikálie ................................................................................................ 24

3.2.3.

Použité přístroje ........................................................................................ 26

3.2.4.

Pracovní pomůcky a další materiál........................................................... 26

3.3.

Metody ............................................................................................................. 26

3.3.1.

Gramovo barvení, KOH test, katalázový test ........................................... 26

3.3.2.

Zamražování kultur................................................................................... 27  

 

4.

5.

3.3.3.

Rodově specifická PCR ............................................................................ 28

3.3.4.

Rep-PCR s GTG primery ......................................................................... 29

3.3.5.

Testování citlivosti na antibiotika pomocí difuzí diskové metody ........... 30

3.3.6.

Testování genů rezistence pomocí PCR ................................................... 32

3.3.6.1.

Rezistence k tetracyklinu ................................................................. 34

3.3.6.2.

Rezistence k vankomycinu .............................................................. 35

3.3.6.3.

Rezistence k erytromycinu............................................................... 35

3.3.6.4.

Rezistence k penicilinu .................................................................... 36

3.3.6.5.

Rezistence ke gentamicinu............................................................... 36

VÝSLEDKY........................................................................................................... 37 4.1.

Druhové zastoupení entrokoků u ferálních holubů .......................................... 37

4.2.

Zjišťování rezistence vůči vybraným antibiotikům ......................................... 39

4.3.

Geny rezistence ................................................................................................ 39

DISKUZE ............................................................................................................... 41 5.1.

Druhové zastoupení rodu Enterococcus u ferálních holubů ............................ 41

5.2.

Stanovení citlivosti a rezistence vůči vybraným antibiotikům ........................ 42

5.3.

Geny rezistence u jednotlivých izolátů rodu Enterococcus ............................. 44

6.

ZÁVĚR ................................................................................................................... 45

7.

SEZNAM LITERATURY .................................................................................... 46

   

Seznam zkratek

AACs

acetyltransferáza

ANTs

nukleotidyltransferáza

APHs

fosfotransferáza

BHI

agar s výtažky z mozku a ze srdce (brain heart infusion)

C

cytosin

CAT

chloramfenikol acetyltransferáza

CCM

Česká sbírka mikroorganismů

CFU

kolonie tvořící jednotku (colony-forming unit)

DMSO

dimetyl sulfoxid

DNA

deoxyribonukleová kyselina

dNTP

deoxynukleotid trifosfát

G

guanin

HLAR

rezistence k vysokým hladinám aminoglykosidů (high lavel aminoglycoside rasistance)

MIC

minimální inhibiční koncentrace

MLS

makrolidy, linkosamid, streptogramin typu B

NCCLS

Ústav pro tvorbu pokynů a norem v laboratorní medicíně (National Committee for Clinical and Laboratory Standards)

PBP

penicilin vázající proteiny

PCR

polymerázová řetězová reakce

PYR

pyrrolidonyl-β-naftylamid

RCR

plazmidy replikující se otáčivou kružnicí

rDNA

ribozomální deoxyribonukleová kyselina

rep-PCR

PCR využívající repetitivních primerů

RNA

ribonukleová kyselina

rRNA

ribozomální ribonukleová kyselina

TBE

Tris / borát/ EDTA pufr

tRNA

transferová ribonukleová kyselina

VRE

vankomycin rezistentní enterokoky  

 

1. ÚVOD Výskyt rezistence vůči antimikrobiálním látkám úzce souvisí s využitím antibiotické terapie (Singer a kol., 2003). Antimikrobiální látky se používají k léčbě a prevenci infekcí lidí a zvířat. Při používání antimikrobiálních látek se u patogenních i nepatogenních mikroorganismů vyvíjí rezistence (Singer a kol., 2003; Jackson a kol. 2004), které byly zjištěny u řady druhů bakterií izolovaných z lidí a zvířat. Mezi nejznámější zástupce grampozitivních bakterií patří zástupci rodu Enterococcus (Willems a kol., 2005). Problém antimikrobiální rezistence se dotýká nejen hospodářských zvířat, ale také volně žijících živočichů, kteří nejsou přímo zasaženi antibiotickou terapií (Literak a kol., 2007; Dolejska a kol., 2008). Potenciální rezervoár rezistentních bakterií mezi volně žijícími ptáky v blízkosti člověka je holub domácí (Columba livia forma domestica) (Hudec a Stastny, 2005). Synantropní zdivočelý holub domácí se vyskytuje kromě Antarktidy na všech kontinentech. Evropská hnízdní populace ferálních holubů domácích má více než 9,3 milionů párů (Hudec a Stastny, 2005). Ferální holubi žijí ve velkých městech i na vesnicích. Vhodnými místy pro jejich hnízdění jsou různé budovy. Živí se rostlinnou potravou, zejména obilovinami a také různými zbytky potravin, které nacházejí v intravilánech obcí. Často jsou také přikrmováni člověkem (Janiga a Johnston, 1995). Mikrobiální flóra gastrointestinálního traktu holubů je charakteristická výskytem enterokoků. Enterococcus columbae je hlavní gram-pozitivní bakterií ve střevním traktu holubů (Baele a kol., 2002). Oproti ostatním druhům zvířat je u holubů řídké zastoupení jiných enterokoků jako je E. faecalis a E. faecium (Devriese a kol., 1987; Baele a kol., 2002). Enterokoky jsou schopny rychle získávat antibiotickou rezistenci (Aerestrup, 2006) a problematickým se stává zejména narůstající výskyt enterokoků rezistentních vůči vankomycinu (Tacconelli, 2009). De Herdt a kol. (1994) také považují Streptococcus gallolyticus, dříve známý jako Streptococcus bovis, jako součást střevní mikroflory holubů, ačkoliv v nižším počtu než E. columbae. S gallolyticus je fakultativně patogenní bakterie, která způsobuje septikemie u holubů (Kimpe a kol., 2004). Enterokoky jsou přirozenou součástí střevní mikroflory většiny savců a ptáků. Téměř po dobu 100 let se používají jako indikátor fekálního znečištění vody a potravin. 6  

Význam enterokoků jako patogenů člověka v dnešní době nabývá na významnosti díky jejich schopnosti adaptace na změny prostředí a rozšiřování spektra faktorů rezistence. Důsledkem tohoto zjištění je zvýšený zájem o identifikaci rezervoárů těchto mikroorganismů, včetně jejich genů rezistence. Multirezistentní enterokoky byly také objeveny v potravinových zvířatech. Toto zjištění vedlo k upozornění na určitý ekosystém – používání antimikrobiálních látek k léčbě potravinových zvířat umožnilo vznik širokého množství rezervoárů multirezistentních enterokoků a genů rezistence. Navíc, enterokoky mají velkou schopnost získávat velký počet faktorů rezistence, díky kterým pak mohou způsobovat závažné enterokokové infekce (Facklam a kol., 2002). V posledních letech bylo zjištěno, že enterokoky jsou schopny rychle získávat rezistenci vůči antibiotikům (Aerestrup a kol., 2000). Tato schopnost dělá z enterokoků jakožto zástupců grampozitivních bakterií přímý indikátor výskytu antibiotické rezistence u bakterií kolonizujících střevo zvířat a člověka. 1.1.

Historie rodu Enterococcus Historie enterokoků začíná již v roce 1899, kdy francouzský vědec Thiercelin

poprvé použil tento termín, aby označil intestinální původ grampozitivních diplokoků. První zmínky o rodu Enterococcus jsou spojeny s názvem „streptokoky fekálního původu“. Nový rod Enterococcus byl navržen Thiercelinem a Jouhaudem v roce 1903. Později Andrews a Horder v roce 1906 přejmenovali enterokoky na Streptococcus faecalis. Předpokládalo se, že kmen izolovaný z pacienta s endokarditidou byl totiž fekálního původu (Doming a kol., 2003). Na základě sérologické typizace byly streptokoky zařazeny do skupiny D podle Lancefieldové (Lancefield, 1933). Pozoruhodně toto začlenění souhlasí s klasifikací navrženou Shermanem v roce 1937, který rozdělil streptokoky do čtyř skupin – enterokoky, mléčné bakterie, viridující a pyogenní streptokoky (Sherman, 1937). Proto termíny fekální streptokoky, enterokoky a streptokoky skupiny D mají stejný význam. O konečné zařazení rodu Enterococcus se zasloužili Schleifer a Kipper-Bälz v roce 1984, kteří navrhli oddělení enterokoků od rodu Streptococcus (Schleifer a Kipper-Bälz, 1984).

7  

1.2.

Charakteristika enterokoků Enterokoky jsou grampozitivní koky, které se vyskytují jednotlivě, ve dvojicích

nebo v krátkých řetízcích. Jsou fakultativně anaerobní s teplotním optimem 35 ºC, ale dokáží růst až v teplotním rozmezí 10 - 45 ºC. Rostou na půdách obsahujících 6,5 % NaCl, hydrolyzují eskulin za přítomnosti 40 % žlučových solí. Některé druhy jsou pohyblivé. Většina enterokoků kromě E. cecorum, E. columbae, E. pallens a E. sacharolyticus hydrolyzují pyrrolidonyl-β-naftylamid (PYR), všechny druhy produkují leucin aminopeptidázu (Facklam a kol., 2002; Fontana a kol., 1996). Enterokoky neobsahují cytochromové enzymy, ale často při růstu na krevním agaru produkují pseudokatalázu. Téměř všechny druhy jsou homofermentativní s produkcí kyseliny mléčné jako konečného produktu při fermentaci glukózy a přitom netvoří plyn. Obsah G + C se pohybuje v rozmezí 37 - 45 % (Facklam a kol., 2002). Taxonomie enterokoků zažila díky rozvoji molekulárně biologických metod velké změny. Stále jsou objevovány a popisovány nové druhy enterokoků. V roce 2003 bylo

celkově

popsáno

23

druhů

enterokoků,

v roce

2010

jich

je

40

(www.bacterio.cict.fr/e/enterococcus.html). Správná identifikace bakterií patřících do rodu Enterococcus je důležitá z hlediska prevalence antibiotické rezistence (Gray a kol., 1991) a jejich potenciální patogenity (Lewis a Zervos, 1990). Nejspolehlivější metody k identifikaci jsou genotypické. Ty jsou založeny na sekvenacích nukleových kyselin, jsou přesně definovány, citlivé a reprodukovatelné tak, aby rozlišily navzájem příbuzné mikroorganismy (Deasy a kol., 2000). V dnešní době se často užívá srovnávání sekvencí 16S a 23S rDNA. Geny pro tyto sekvence se liší v nukleotidech a obsahují jak univerzální konzervativní oblasti, tak jedinečné oblasti pro dané rody nebo druhy. Díky tomuto jsou tyto oblasti často používány k navrhování genově nebo druhově specifických DNA sond. Geny pro ribozomální RNA byly a jsou úspěšně používány ke klasifikaci spousty bakteriálních izolátů včetně 23S RNA cílených druhově specifických sond pro Lactococcus lacis, E. faecalis a E. faecium (Betzl a kol., 1990) a 16S rRNA genových sond, které slouží k rozlišení druhů u rodu Lactococcus (Klijn a kol., 1991). Enterokoky jsou široce rozšířené v prostředí (půda, voda, rostliny), dále feces obratlovců, v potravinách a v klinickém materiálu. Dokáží však způsobit i pyogenní infekce. Někdy jsou souhrnně označovány jako „mléčné koky“ (Sedlacek, 2007). Jsou 8  

rezistentní k nejrůznějším antibiotikům, jako jsou cefalosporiny, peniciliny rezistentní k β-laktamázám, klinicky dostupné skupiny linkosamidů a aminoglykosidy. Enterokoky nejsou významnými patogeny zvířat, ale u lidí mohou způsobovat infekční endokarditidy a infekce močových cest (Murray, 1990). V posledních několika letech zabírají enterokoky místo nozokomiálních patogenů. Je to způsobeno hlavně díky jejich zvyšující se rezistenci k antibiotikům, jako jsou třetí a čtvrtá generace cefalosporinů (Bogaard a kol., 2002). 1.3.

Antimikrobiální rezistence Antimikrobiální rezistence u enterokoků je dvojí: přirozená nebo získaná.

Přirozená rezistence je charakteristická pro jednotlivé druhy, takže slouží jako druhová charakteristika a je nesena na chromozomu. Enterokoky mají přirozenou rezistenci k penicilinům, cefalosporinům, linkosamidům, kyselině nalidixové, aminoglykosidům (rezistence k nízkým hladinám) a ke klindamycinu (rezistence k nízkým hladinám) (Murray, 1990; Marhoti a kol., 2005). Získaná rezistence vzniká mutací v DNA nebo získáním nového úseku DNA. Sem například patří rezistence vůči penicilinům způsobené tvorbou β-laktamáz, HLAR (high level aminoglycoside rasistance), rezistence k vankomycinu, chloramfenikolu, erytromycinu, klindamycinu (rezistence k vysokým hladinám) a fluorochinolonům (Marhoti a kol., 2005). Přehled přirozené a získané rezistence u enterokoků shrnuje tabulka 1.

9  

Přirozená rezistence β-laktamy (hlavně cefalosporiny a penicilináza rezistentní peniciliny) aminoglykosidy v nízkých hladinách clindamycin fluorochinolony trimetoprim-sulfometoxazol Získaná rezistence β-laktamy ve vysokých hladinách aminoglykosidy ve vysokých hladinách glykopeptidy (vankomycin, teikoplanin) tetracykliny erytromyciny fluorochinolony rifampicin chloramfenikol kyselina fusidová nitrofurantoin Tab. 1: Přehled přirozené i získané rezistence u enterokoků. Upraveno dle Cetinkaya a kol., 2000. Nejčastější příčinou infekcí způsobených enterokoky je E. faecalis (80 - 90 %) následován E. faecium (10 – 15 %) (Marhoti a kol., 2005). Ačkoliv nejvíce multirezistentních enterokoků, které nesou převážně rezistenci vůči vankomycinu patří do druhu E. faecium (Morris a kol., 1995). Jako jsou známy VRE (vankomycin rezistentní enterokoky), existují i enterokoky rezistentní vůči ampicilinu a HLAR (high level aminoglycoside resistance). Infekce vyvolané těmito enterokoky se hůře léčí (Marothi a kol., 2005). Nejčastější nozokomiální infekce, které způsobují tyto bakterie, jsou infekce močových cest, intra-abnominální infekce a infekce dutiny pánevní. Také způsobují infekce operačních ran, bakteremie, endokarditidy, neonatální sepse a meningitidy (Marhoti a kol., 2005). 1.3.1. Rezistence k β-laktamovým antibiotikům Úplná

nebo

částečná

rezistence

vůči β-laktamovým

antibiotikům

je

charakteristická pro celý rod Enterococcus. Enterokoky vykazují jak přirozenou, tak 10  

získanou rezistenci k těmto antibiotikům. Přirozená rezistence závisí na typu βlaktamového antibiotika. Peniciliny jsou proti enterokokům nejúčinnější, slabší účinek mají karbapenemy a nejmenší účinnost vykazují cefalosporiny. Přirozená rezistence vůči cefalosporinům u enterokoků je natolik vysoká, že se tato antibiotika nemohou používat k léčbě pacientů trpících enterokokovou infekcí (Kak a Chow, 2002). Minimální inhibiční koncentrace (MIC) daného antibiotika také závisí na druhu enterokoka (Kak a Chow, 2002). E. faecalis je desetkrát až stokrát méně citlivý vůči penicilinu než streptokoky a E. faecium je nejméně čtyřikrát až šestnáctkrát méně citlivý než E. faecalis (Murray, 1990). U E. faecium (a zřídka u E. faecalis) dochází ke zvyšování rezistence k ampicilinu. V některých nemocnicích dosahuje přes 90 % enterokoků MIC ≥ 32 μg / ml (Kak a Chow, 2002). U enterokoků byly rozpoznány dva mechanismy rezistence vůči penicilinům: první je založen na nadprodukci penicilin vázajících proteinů (PBP) s nízkou afinitou, které jsou běžnou součástí buněčné stěny těchto bakterií (Rice a kol., 2001). Enterokoky mají nejméně 5 různých PBP, nejčastěji však PBP9 (Williamson a kol., 1985). Represor pro PBP5 je pravděpodobně spojen se sníženou expresí PBP5 a dalšími komponentami v buňce, ačkoliv jeho role zatím není zcela objasněna (Rice a kol., 2001). Část vázající penicilin se vyskytuje na C-koncové části proteinu PBP5. Několik polymorfismů ve spektru aminokyselin v blízkosti konzervativních oblastí důležitých pro vázání penicilinu se ukázalo jako důležité z hlediska zvýšení rezistence k tomuto antibiotiku (Sifaoui a kol., 2001). Zvýšená rezistence vůči β-laktamovým antibiotikům je nejčastěji popisována u E. faecium (Fontana a kol., 1994) a je způsobena nadprodukcí PBP5 proteinu s nízkou aktivitou, který může převzít funkci všech PBP5 proteinů. Koncentrace ampicilinu, která je potřebná k inhibici enetrokoků je asi poloviční než penicilinu (Marothi a kol., 2005). Přítomnost těchto PBP5 proteinů byla zjištěna u klinických izolátů E. faecium, takže se někteří autoři domnívají, že se jedná spíše o přirozenou rezistenci daného druhu než získanou rezistenci (Rice a kol., 2001). Často se u E. faecium objevuje kromě rezistence vůči penicilinu ještě rezistence vůči ampicilinu. Zástupci tohoto druhu také často získávají rezistenci vůči vankomycinu (Rice a kol., 2001). Druhý mechanismus je založen na produkci β-laktamáz (Fontana, 1985; Murray, 1990). Tento druh rezistence byl nejčastěji prokázán u E. faecalis. Odpovědný gen je 11  

nesen na plazmidech a jeho tvorba je konstitutivní (Marothi a kol., 2005). Některé kmeny E. faecalis produkují β-laktamázy, které jsou identické s β-laktamázami typu A u stafylokoků, kódované genem blaZ (Murray, 1992). Enterokoky produkující βlaktamázy se mohou jevit jako citlivé vůči penicilinům in vitro při stanovení MIC, protože produkují tyto enzymy v malém množství (Gordon a kol., 1992). 1.3.2. Rezistence k aminoglykosidovým antibiotikům Primární účinek aminoglykosidů je zabránění tvorby proteinů vazbou na 16S rRNA ribozomální podjednotky 30S (Kotra a kol., 2000). Enterokoky vykazují přirozenou rezistenci vůči nízkým hladinám aminoglykosidů blokací transportu antibiotik přes cytoplazmatickou membránu. MIC gentamicinu u enterokoků se pohybuje v rozmezí od 6 do 64 μg / ml (Moellering a Wienberg, 1971). HLAR (high level aminoglycoside resistance) u enterokoků je nejčastěji způsobena enzymy modifikujícími aminoglykosidy (Vakulenko a kol., 2003), které snižují baktericidní účinek ztrátou synergismu mezi látkou aktivující buněčnou stěnu (penicilin, ampicilin nebo vankomycin) a aminoglykosidovými antibiotiky, která se používají při léčbě závažných infekcích způsobenými enterokoky, jako jsou endokarditidy (Papaparaskevas a kol., 2000). Enzymy se kovalentně váží na antibiotikum O-fosforylací, N-acetylací nebo O-adenylací a tím jej inaktivují (Shaw a kol., 1993). Enterokoky mohou tvořit několik enzymů modifikujících aminoglykosidy, patří mezi ně fosfotransferázy (APHs), acetyltransferázy (AACs) nebo nukleotidyltransferázy (ANTs). APH inaktivují aminoglykosidy přenosem γ-fosfátu z ATP na hydroxylovou skupinu aminoglykosidů. AAC používá acetyl-koenzym A jako donor a acetyluje amino skupinu aminoglykosidů. ANT používá ATP jako donor a adenyluje hydroxylovou skupinu

antibiotika.

Když

se

tyto

enzymy

vyskytují

u

enterokoků,

MIC

k aminoglykosidům dosahuje 2000 μg / ml (Chow, 2000). U enterokoků byl také popsán enzym - AAC(6´)-APH(2´´) se dvěmi enzymatickými aktivitami, 6´-N-acetyl transferázovou a 2´´-O-fosfotransferázovou. Tímto způsobem vzniká „high level gentamicin C rezistance“ (MIC > 2000 μg / ml). Geny kódující tyto bifunkční enzymy jsou nejčastěji nacházeny na transpozonech a jsou často neseny na R plazmidu nebo jsou součástí chromozomu (Daigle a kol., 1999). 12  

Jako první a nejznámější gen rezistence ke gentamicinu u enterokoků byl popsán aac(6´)-Ie-aph(2´´)-Ia. Později byly popsány aph(2´´)-Ib, aph(2´´)-Ic a aph(2´´)Id. Aph(3´)IIIa a ant (4´)-Ia geny také kódují rezistenci k aminoglykosidům u enterokoků, ale ne vůči gentamicinu (Vakulenko a kol., 2003). Aac(6´)-Ie-aph(2´´)-Ia se vyskytuje u 90 % klinických izolátů rezistentních ke gentamicinu, u 10 % se vyskytuje aph(2´´)-Ic, aph(2´´)-Id nebo aph(2´´)-Ib (Chow, 2000). U enterokoků se také vyskytují 2 typy rezistence vůči streptomycinu: rezistence k nízké hladině streptomycinu (MIC 62 – 500 μg / ml), která je způsobena nízkou permeabilitou. Ta může být překonána kombinací streptomycinu s penicilinem. Druhý typ rezistence je rezistence vůči vysoké hladině streptomycinu (MIC ≥ 2000 μg / ml), která je buď způsobena změnou na ribozomu, nebo vzniká produkcí aminoglykosid inaktivujících enzymů (Cetinkaya a kol., 2000). Rezistence vůči aminoglykosidům u enterokoků způsobená změnou na ribozomu byla popsána jen u rezistence vůči streptomycinu (Clark a kol., 1999). I když rezistence vůči gentamicinu a streptomycinu mají odlišné mechanismy, je důležité testovat citlivost k těmto antibiotikům společně. Jak již bylo uvedeno, rezistence vůči gentamicinu je způsobena přítomností inaktivačního enzymu 2fosfotransferázy-6-acetyltransférazy, který způsobuje rezistenci ke gentamicinu, tobramycinu, netilmicinu, amikacinu a kanamycinu Z tohoto důvodu je rezistence vůči gentamicinu

dobrý

prediktor

rezistence

k ostatním

aminoglykosidům,

včetně

streptomycinu. Rezistence vůči streptomycinu je zjišťována hlavně u kmenů, které produkují adenyltransferázu, tyto kmeny zůstávají citlivé ke gentamicinum (Cetinkaya a kol., 2000). 1.3.3. Rezistence ke glykopeptidovým antibiotikům Glykopeptidy působí na grampozitivní bakterie inhibicí biosyntézy buněčné stěny. Gramnegativní bakterie jsou k těmto antibiotikům rezistentní díky vnější membráně, která blokuje průchod antibiotika k cílovým molekulám v buňce (Arthur a Courvalin, 1993). První zmínky o enterokocích rezistentních vůči vankomycinu (VRE) pocházejí již z roku 1980 (Marothi a kol., 2005). Byly objeveny v Anglii a ve Francii u pacientů s leukémií a poruchou ledvin (Leclercq a kol., 1988). Od té doby byly postupně 13  

zjišťovány v dalších částech světa. Například v roce 1998 bylo v USA více jak 20 % izolátů enterokoků rezistentních vůči vankomycinu (Fridkin a Gaynes, 1999). V některých nemocnicích byl prokázán až 90 % podíl VRE, což je důsledek kolonizace pacientů a přežívání VRE v gastrointestinálním traktu a následného horizonálního šíření na dalším pacienty (Kak a Chow, 2002). Genů rezistence k vankomycinu stále přibývá, v současné době jsou nejznámější VanA, VanB, vanC, VanD a VanE. VanA a VanB geny rezistence byly poprvé popsány u E. faecalis a E. faecium (Arthur a Corvalin, 1993). VanA rezistence vykazuje vysokou inducibilní rezistenci k vankomycinu (MIC ≥ 64 μg / ml) a teikoplaninu (MIC ≥ 16 μg / ml) (Arthur a Corvalin, 1993) a je nejčastějším typem rezistence u enterokoků (Marhoti a kol., 2005). Rezistence může být vyvolána glykopeptidy (vankomycin, teikoplanin, avoparcin, ristocetin), ale také bacitracinem, polymyxinem B a robenidimem (Cetinkaya a kol., 2000). Tento typ rezistence je často přenášen transpozonem Tn1546 (Arthur a Corvalin, 1993). VanB rezistence vykazuje vysokou inducibilní rezistenci k vankomycinu (MIC 32 - 64 μg / ml), ale citlivost k teikoplaninu. VanB geny jsou také kromě na chromozomu neseny na mobilních elementech, což jim umožňuje snadné šíření do dalších kmenů enterokoků (Cetinkaya a kol., 2000). Často jsou přenášeny pomocí transpozonu Tn5382 (Carias a kol., 1998). VanC rezistence byla popsána u E. casseliflavus (vanC2) a E. gallinarum (vanC1) a patří mezi přirozenou rezistenci k nízkým koncentracím vankomycinu (MIC 4 - 32 μg / ml) (Cetinkaya a kol., 2000). Mechanismus účinku těchto genů je podobný, ale každý gen je specifický pro daný druh (Clark a kol., 1998). Kmeny nesoucí vanC geny jsou citlivé k teikoplaninu (Cetinkaya a kol., 2000). Bylo ale zjištěno, že E. gallinarum a E. casseliflavus nesou také VanA geny a tím dochází ke zvýšení rezistence k vankomycinu (MIC > 256 μg/ml) u těchto druhů a také k jejich rezistenci k teikoplaninu (Dutka-Malen, 1994). VanD rezistence byla poprvé popsána v roce 1991 u E. faecium (Cetinkaya a kol., 2000). VanD operon způsobuje nízkou rezistenci vůči vankomycinu (MIC 64 - 128 μg / ml) a teikoplaninu (MIC 4 - 64 μg / ml). Je nesena na chromozomu a je konstitutivní (Casadewall a Courvalin, 1999).

14  

VanE rezistence byla poprvé popsána u E. faecalis. VanE i VanG rezistence způsobují nízkou rezistenci k vankomycinu (MIC 16 μg / ml) a citlivost k teikoplaninu. Tento druh rezistence je podobný přirozené rezistenci způsobené VanC genem (Fines a kol., 1999). Přehled fenotypové rezistence u enterokoků uvádí tabulka 2. Toto fenotypické rozdělení v dnešní době není již tak jednoznačné, objevuje se stále více druhů, které mají nejrůznější geny rezistence. Přesto je tohoto schématu často využíváno, protože se shoduje s klasifikací podle genotypu (Elipoulos, 1997). Charakteristika

fenotyp VanA

VanB

Vankomycin 64->1000 4-1024 MIC (μg / ml) Teikoplanin 16-512 ≤0,5 MIC (μg / ml) Nejčastější druh E. faecium E. faecium E. faecalis E. faecalis

VanC

VanD

VanE

2-32

128

16

≤0,5

4

0,5

E. gallinarum E. faecium E. faecalis E. casseliflavus E. flavescens Rezistence získaná získaná přirozená získaná získaná Přenos ano ano ne ne ne Tab. 2: Charakteristika fenotypové rezistence enterokoků k vankomycinu. Převzato dle Casadewall a Courvalin, 1999. Biochemický mechanismus rezistence enterokoků ke glykopeptidům zahrnuje modifikaci cílového místa skrz změnu složení buněčné stěny (Billot-Klein a kol., 1994). Vankomycin se váže s vysokou afinitou na D-Ala-D-Ala místo pentapeptidového prekurzoru a tím blokuje jeho začlenění do peptidoglykanového řetězce a následné zesíťování. Rezistence k vankomycinu a teikoplaninu je způsobena začleněním Dalanyl-D-laktátu (VanA, VanB a VanD typ) nebo D-alanyl-D-serinu (VanC, VanE a VanG typ) do peptidoglykanových prekurzorů, které snižují afinitu glykopeptidů (Arthur a kol., 1996). Rezistence k vankomycinu je prokazována nejčastěji u E. faecium, který bývá většinou multirezistentní. VRE jsou často spojeny s rekurentní bakteriémií a zvyšují frekvenci endovaskulárních infekcí a mortality (Marothi a kol., 2005).

15  

1.3.4. Rezistence k makrolidovým antibiotikům Makrolidy, linkosamidy a streptograminy (MLS) jsou antibiotika, která se používají jako alternativa při léčbě infekcí způsobených enterokoky (Clancy a kol., 1996). U grampozitivních bakterií však vznikly tři různé mechanismy získané rezistence vůči MLS. Jsou to modifikace cílového místa, inaktivace antibiotika a aktivní eflux

daného

antibiotika.

Nejčastějším

mechanismem

získané

rezistence

vůči makrolidům u enterokoků je produkce enzymu, který metyluje adeninový zbytek 23S rRNA v ribozomální podjednotce 50S. Tímto způsobem vzniká rezistence nejen vůči erytromycinu, ale také vůči většině ostatních makrolidů (zahrnující azitromycin a claritromycin), ale také vůči linkosamidům a streptograminu B (Weisblum, 1995). Tento mechanismus je nejčastěji způsoben genem erm (Berryman a Rood, 1995). Podle literatury

je

právě

gen

erm

nejčastěji

zodpovědný

za

rezistenci

bakterií

vůči makrolidům, u enterokoků je to konkrétně gen erm(B), který kóduje získanou rezistenci (Martel a kol., 2003). Zřídka je tento typ rezistence determinován genem erm(A). V některých literárních pramenech je gen erm(B) uváděn jako erm(AM) a erm(AMR) (Roberts a kol., 1999). Byl také objeven gen přirozené rezistence u E. faecium msr(C), který zvyšuje MIC tohoto druhu oproti ostatním. Geny msr(A) a msr(B) jsou inducibilní a jsou lokalizovány na velkém plazmidu (Clancy a kol., 1996). Při inaktivaci vznikne rezistence pouze k strukturálně příbuzným MLS antibiotikům. Při efluxu a používání pump se účastní geny mef(A) (Clancy a kol., 1996), mef(E), msr(A) a mre(A), které způsobují rezistenci vůči makrolidům u grampozitivních

bakterií.

vůči makrolidům,

gen

Geny

msr(A)

mef je

a

mre(A)

spojován

jsou

spojovány

s rezistencí

s rezistencí

vůči makrolidům

a

streptograminu B (Portillo a kol., 2000). Mef(A) gen u Enterococcus spp. je mobilní element, který se přenáší při konjugaci a způsobuje nízkou úroveň rezistence vůči erytromycinu (MIC 2 – 16 μg / ml), na rozdíl od erm(B) genu, který má MIC > 32μg / ml (Fraimow a Knob, 1997). Nejvyšší úroveň rezistence vůči makrolidům, v porovnání s ostatními druhy, vykazuje E. faecium. Právě jeho rezistence vůči makrolidům se využívá k jeho identifikaci. Používá se amplifikace úseku genu aac(6´)-Ii, který kóduje chromozomální

16  

aminoglykosidtransferázu specifickou jen pro E. faecium a také amplifikace genu msr(C) (Portillo a kol., 2000). 1.3.5. Rezistence k tetracyklinovým antibiotikům Tetracykliny inhibují syntézu bakteriálních proteinů zabráněním spojení aminoacyl-tRNA s bakteriálním ribozomem. K těmto antibiotikům si bakterie (enterokoky) vytvořily vlastní řadu mechanismů získané rezistence. Patří mezi ně ochrana ribozomů, efflux antibiotika z buňky a enzymatická inaktivace antibiotika jako hlavní mechanismus (Chopra a Roberts, 2001). Rezistence vůči tetracyklinům byla zjištěna u 60 – 65 % klinických izolátů, proto se tato antibiotika nepoužívají k běžné léčbě infekcí způsobených enterokoky (Jones a kol., 1998). Roberts v roce 2005 popsala 38 různých genů rezistence vůči tetracyklinu (tet) a oxytetracyklinu (otr). Geny tet(L), tet(M), tet(O) a tet(U) byly identifikovány u enterokoků z drůbeže. Tet(S) byl identifikován u enterokoků ze skotu, vepřů a lidí. Tet(K) byl zase identifikován u E. faecalis lidského původu (Cauwerts a kol., 2007). Gen tet(M) je nejčastěji lokalizován na bakteriálním chromozomu. Může být přenášen konjugativními transpozony skupiny Tn916/Tn1545, které jsou nejvíce promiskuitní z dosud popsaných transpozonů. Mají široké rozmezí hostitelů zahrnujících jak grampozitivní, tak i gramnegativní bakterie (Chopra a Roberts, 2001). Zatímco Tn916 přenáší jen tet(M), transpozon Tn1545 přenáší tet(M) i erm(B). Gen pro integrázu (int) této skupiny transpozonů byl identifikován u enterokoků lidského a prasečího původu (Cauwerts a kol., 2007). Tet(L) a tet(K) kódují široké rozmezí proteinů s 14 transmembránovými doménami, které způsobují rezistenci aktivním efluxem antibiotika z buňky. Tet(L) gen může být lokalizován na konjugativních plazmidech nebo na chromozomu (Bentorcha a kol., 1991). Tet(K) byl původně popsán u Staphylococcus aureus a u urogenitálních izolátů enterokoků (Roberts a Hillier, 1990). Geny Tet(M), tet(O) a tet(S) kódují proteiny, které způsobují rezistenci jak vůči tetracyklinům, tak vůči minocyklinu, ochranou ribozomů. Tento mechanismus rezistence zahrnuje navázání rezistentního proteinu na ribozom a následnou alternaci ribozomální konformace, která zabraňuje vazbě tetracyklinu (McMurry a Levy, 2000). Tet(U) byl popsán u E. faecium, ale jeho mechanismus rezistence nabyl ještě objasněn. Tento gen kóduje protein o velikosti 105 17  

aminokyselin a má částečnou homologii s ostatními geny rezistence vůči tetracyklinům (Ridenhour a kol., 1996). Glycylcykliny, nové deriváty tetracyklinů, jsou poměrně rezistentní vůči efluxu a mechanismům ochrany ribozomů, takže mohou být potencionálně použity k léčbě multirezistentních enterokoků (McMurry a Levy, 2000). 1.3.6. Rezistence k chloramfenikolu Vysoká prevalence multirezistentních enterokoků v nemocnicích způsobila, že se začal používat chloramfenikol jako alternativní antibiotikum. Bohužel se ukázalo, že enterokoky jsou až z 50 % vůči tomuto antibiotiku rezistentní (Jones a kol., 2001). Ve většině případů je rezistence enterokoků vůči chloramfenikolu způsobena produkcí chloramfenikol acetyltransferázy (CAT). CAT acetyluje hydroxylovou skupinu na molekule chloramfenikolu a tím zabrání jeho vazbě na ribozom (Shaw, 1983). U E. faecalis a E. faecium byl nalezen gen podobný catpIP501 (chloramfenikol acetyltransferázový gen rezistence, který se vyskytuje u streptokokových plazmidů pIP501). Geny cat jsou obvykle neseny na plazminech, ale mohou být lokalizovány i na chromozomu (Pepper a kol., 1987). Přítomnost stejných cat genů u enterokoků, streptokoků i stafylokoků vedla k hypotéze o horizontálním přenosu těchto genů (Lynch a kol., 1997). U některých kmenů E. faecalis a E. faecium byl také popsán aktivní eflux chloramfenikolu a norfloxacinu (Lynch a kol., 1997). 1.4.

Plazmidy a transpozony Horizontální přenos hraje kritickou roli v rychlém šíření antibiotické rezistence

mezi bakteriálními druhy a je zodpovědný za vznik patogenity, metabolické diverzity a také vzniku nových operonů. Agens zodpovědné za přenos bakteriálních genů u enterokoků zahrnuje bakteriofágy, plazmidy a transpozony / inzerční sekvence (Weaver a kol., 2002). 1.4.1. Plazmidy U enterokoků jsou známy 3 druhy plazmidů, které jsou shopny replikace: RCR (rolling circle replicating) plazmidy, Inc18 plazmidy a feromonové plazmidy. RCR a 18  

Inc18 plazmidy jsou schopny replikace v širokém rozmezí grampozitivních bakterií, některé RCR plazmidy jsou také schopny replikace v gramnegativních bakteriích a Archea. Replikace feromonových plazmidů je omezena jen na enterokoky (Weaver a kol., 2002). RCR plazmidy jsou širokou skupinou malých plazmidů, vyskytující se v mnoha kopiích. Replikace u nich probíhá mechanismem otáčivé kružnice (Koonin a Ilyina, 1993). Přenos těchto plazmidů mezi buňkami je díky jejich malé velikosti snadný. Jejich velikosti, schopnosti přenosu rezistentních genů a schopnosti replikace v širokém rozmezí bakterií se využívá při klonování, používají se jako klonovací vektory. RCR plazmidy nesou např. geny pro rezistenci k antibiotikům či k UV záření (Weaver a kol., 2002). Inc18 plazmidy patří do skupiny asi 15 plazmidů, které se vykytují v bakteriích s nízkým obsahem G + C, včetně některých enterokoků (Janniére a kol., 1993). Jejich velikost se pohybuje v rozmezí 25 - 30 kb a vyskytují se v počtu maximálně 10 kopií na buňku. Spousta z nich je konjugativních a mohou se přenášet a replikovat v širokém rozmezí grampozitivních bakterií. Mechanismus replikace byl původně popsán u plazmidů pAMβ1 u druhu Enterococcus faecalis, který nese geny pro rezistenci vůči erytromycinu a pIP501 (Weaver a kol., 2002). Třetí typ plazmidů, který je typický pro rod Enterococcus, jsou feromonové plazmidy. Patří do skupiny asi 20

konjugativních plazmidů, jejichž schopnost

transformace je vyvolána feromony, malými lineárními peptidy kódovanými geny bakteriálního chromozomu. Ty produkují buňky bez feromonových plazmidů. Velikost těchto plazmidů je 37 - 91 kb, a vyskytují se ve 2 - 4 kopiích na buňku (Weaver a kol., 2002). Význam plazmidů v přenosu genů rezistence u enterokoků je neznámý, ale předpokládá se, že je důležitý. Díky jejich schopnosti přenosu genetické informace hrají velkou roli při schopnosti přežívat u pacientů v nemocnicích. Jak feromonové plazmidy, tak plazmidy mající široké rozmezí hostitelů jsou schopny přenosu antibiotické rezistence (Weaver a kol., 2000). Feromonové plazmidy se nacházejí jen u enterokoků a byly převážně objeveny u E. faecalis (Dunny a kol., 1995). Přenáší geny rezistence vůči vankomycinu, gentamicinu a také k β-laktamovým antibiotikům (Murray a kol., 1986). Rezistence ke gentamicinu u E. faecalis je nejčastěji přenášena pomocí 19  

transpozonů Tn4001 a Tn5281 a předpokládá se, že tyto transpozony jsou schopny inkorporace do plazmidů (Hodel-Christian a Murray, 1992). Inc18 plazmidy se také účastní přenosu genů rezistence vůči antibiotikům. Plazmid pAMβ1 nese gen rezistence k erytromycinu erm(AM) (Swinfield a kol., 1990). Schopnost Inc18 plazmidů přenosu a replikace v ostatních druzích bakterií je důležitá z hlediska přenosu genů rezistence do druhů, které jsou k antibiotikům citlivé. Plazmid Tn5358 má široké rozmezí hostitelů (Rice a Carias, 1998) a je schopen přenosu genů rezistence u stafylokoků a enterokoků (Rhinehart a kol., 1990). 1.4.2. Transpozony U enterokoků byla popsána spousta jednotlivých transpozonů a několich transpozonových skupin. Transpozony patří mezi další mobilní elementy, které jsou schopny přenosu genů rezistence. Podobně jako plazmidy, i tyto elementy můžeme rozdělit do několika skupin: skupina transpozonů Tn3, složené transpozony a konjugativní transpozony (Weaver a kol., 2000).

První dvě skupiny jsou široce

rozšířené u bakterií a jejich mechanismus byl popsán u Escherichia coli a ostatních gramnegativních bakterií. Konjugativní transpozony byly poprvé popsány u E. faecalis a vyskytují se u grampozitivních bakterií (Clewell a Flannagan, 1993). Skupina transpozonů Tn3 je široká skupina mobilních elementů, které kódují rezistenci vůči ampicilinu u gramnegativních bakterií (Lett, 1988). Tato skupina nemá konjugativní vlastnosti, jejich přenos do dalších bakterií se uskutečňuje pomocí integrace do mobilních elementů, jako jsou plazmidy (Weaver kol., 2000). Dvě nejznámější skupiny těchto transpozonů jsou Tn917 a Tn1546 (Arthur a kol., 1993). Složené transpozony obsahují terminální inzerční sekvence nebo IS elementy, pomocí kterých jsou mobilní (Galas a Chandler, 1989). Spousta z nich přenáší rezistenci vůči antibiotikům, patří mezi ně například IS256 a IS1216. IS1216 přenáší VanA klastr u E. faecium (Weaver a kol., 2000). Konjugativní transpozony jsou genetické elementy, které se přenáší z genomu donorové bakterie do genomu recipientní bakterie procesem, který vyžaduje intercelulární kontakt. Tento typ transpozonů byl poprvé objeven v 80. letech 20. století (Weaver a kol., 2000).

Nejlépe prostudované konjugativní transpozony u

grampozitivních bakterií jsou příbuzné Tn916 a Tn1545 u E. faecalis (Courvalin a 20  

Carlier, 1986) a Streptococcus pneumoniae. Nesou rezistenci vůči tetracyklinům. Tn1545 také nese rezistenci vůči kanamycinu a erytromycinu. Mají široké rozmezí hostitelů, jsou schopny přenosu mezi grampozitivními i gramnegativními bakteriemi (Weaver a kol., 2000). Prvním transpozonem popsaným u enterokoků byl konjugativní transpozon Tn917 nalezený u E. faecalis. Byl také kompletně osekvenován a nese geny kódující rezistenci k makrolidům, linkosamidům a streptograminu pomocí erm(AM) genu. U E. faecalis byl také popsán transpozon Tn916, který má široké rozmezí hostitelů a přenáší tet(M) zprostředkovanou rezistenci k tetracyklinu a minocyklinu (Rice, 1998). Tn916 byl objeven u grampozitivních bakterií (Bertram a kol., 1991). Některé transpozony také přenáší jiné geny rezistence k tetracyklinu než tet(M). Patří mezi ně transpozon Tn1545, který ještě přenáší rezistenci k erytromycinu a kanamycinu (Caillard a kol., 1987). Byly také objeveny transpozony přenášející rezistenci vůči vankomycinu u E. faecium, Tn5382 a jsou podobné Tn916 (Carias a kol., 1998). Tn 5382 je velký 33 kb a kóduje vanB typ rezistence (Dahl a kol., 2000). Tn1546 kóduje typ rezistence VanA (Weaver a kol., 2000).

21  

2. CÍL PRÁCE Volně žijící živočichové nejsou léčeni antibiotiky, a přesto se u nich vyskytují bakterie rezistentní k účinku antibiotik. Je tedy možné je považovat za dobré ukazatele rozšíření antibiotické rezistence do prostředí volné přírody. Problematice výskytu bakterií rezistentních k antibiotikům u ferálních holubů domácích, kteří se vyskytují v těsné blízkosti člověka, dosud nebyla věnována pozornost. Cílem této studie bylo: 1.

Identifikovat enterokoky v trusu ferálních holubů.

2.

Stanovit citlivost vůči vybraným antibiotikům u jednotlivých izolátů.

3.

Zjistit zastoupení genů rezistence u rezistentních izolátů.

22  

3. METODY  

3.1

Odběr vzorků a jejich pomnožení Brno je městská aglomerace s 405 000 obyvateli, která se rozkládá na území 230

km2. Je to druhé největší město v České republice. Vyšetřovaní holubi určení pro odběr vzorků pocházeli ze dvou lokalit Brno Tuřany (49°8´N, 16°40´E) a Brno Chrlice (49°7´N, 16°39´E). Holubi byli získáni při jejich regulačním odstřelu schváleném odpovědným úřadem (Magistrát města Brna) v období od ledna do března 2006. Z každého holuba (n = 247) byl proveden jeden kloakální výtěr sterilním vatovým tamponem. Vzorky byly pomnoženy v peptonové vodě při 37 °C přes noc a následně kultivovány na Columbia agaru s antibiotickými suplementy 10 mg l-1 colistinu a 10 mg l-1 kyseliny nalidixové a zároveň na Slanetz-Bartley agaru. Slanetz-Bartley je selektivní médium, které se používá při identifikaci enterokoků. Toto médium potlačuje gramnegativní bakterie a některé zástupce rodu Staphylococcus. Obsahuje chlorid tetrazolný, který enterokoky rozkládají na formazan a to způsobuje jejich červené až hnědé zbarvení. Enterococcus faecalis tvoří červeno-hnědé kolonie s kovovým leskem Enterococcus faecium tvoří červeno-růžové kolonie Enterococcus hirae tvoří červeno-hnědé kolonie s kovovým leskem Enterococcus durans tvoří červeno-hnědé kolonie s kovovým leskem (http://www.sifin.de/english/produktinfo/enterococci-selective-agar-acc-slanetz-bartleytn1132.pdf)

3.2.

Materiál

 

3.2.1. Kultivační a zamražovací média  BHI agar (Brain Heart Infusion Agar, Oxoid, Velká Británie) Médium bylo připraveno smísením 47,5 g Brain Heart Infusion Agar s 1000 ml destilované vody.

23  

 Krevní agar 5 % Základ média byl připraven smísením 42 g Columbia Agar Base (Oxoid, Velká Británie) s 1000 ml destilované vody. Médium se vysterilizovalo v autoklávu, po ochlazení na 50 °C bylo přidáno 50 ml beranní krve.  Krevní agar 5 % s antibiotickými suplementy Základ média byl připraven smísením 42g Columbia Agar Base (Oxoid, Velká Británie) s 1000 ml destilované vody. Médium se vysterilizovalo, po ochlazení na 50 °C bylo přidáno 50 ml beraní krve, 10 mg l- colistinu a 10 mg l-1 kyseliny nalidixové.  Kryoprotektivní médium pro uložení kultur do - 70 °C Médium bylo připraveno smísením 435 ml glycerolu (PLIVA-Lachema ČR) s 7,5 g bactopeptonu (PLIVA-Lachema ČR) a 565 ml destilované vody.  Müeller-Hinton agar (Oxoid, Velká Británie) Médium bylo připraveno smísením 38 g Müeller-Hinton Agar s 1000 ml destilované vody.  Slanetz- Bartley agar (Oxoid, Velká Británie) Médium bylo připraveno smícháním 41,5 g média s 1000 ml destilované vody. Toto médium se nesmí autoklávovat, proto jsme jej zahřívali za normálního tlaku na 100 ºC. Všechna média kromě Slanetz-Bartley byla sterilizována v autoklávu 20 min při teplotě 121 °C a tlaku 100 kPa. 3.2.2. Chemikálie 

Buffered peptone water

8 g NaCl (PLIVA-Lachema, ČR) se smíchalo s 0,2 g KCl (PLIVA-Lachema, ČR), s 0,248 g KH2PO4 (PLIVA-Lachema, ČR) a s 2,34 g Na2HPO4 x 12H2O (PLIVALachema, ČR). Vše se doplnilo do objemu 1000 ml. Bylo upraveno pH na 7,2 – 7,3, sterilizace autoklávováním po dobu 20 min při teplotě 121 °C a tlaku 100 kPa.

24  



Pufrovaný fyziologický roztok

0,85 g NaCl (PLIVA-Lachema, ČR) se smíchalo s 0,07 g KH2PO4 (PLIVA-Lachema, ČR), s 0,015 g NaOH (PLIVA-Lachema, ČR) a vše se doplnilo do objemu 1000 ml. Bylo upraveno pH na 7,2 – 7,3, následovala sterilizace autoklávováním po dobu 20 min při teplotě 121 °C a tlaku 100 kPa. 

Roztok pro alkalickou lyzi

150 μl 0,25 % dodecil sulfátu sodného (PLIVA-Lachema, ČR) se smíchalo s 24 mg 0,05 M NaOH (PLIVA-Lachema, ČR) a 11850 μl destilované vody. Komponenty pro PCR 

PCR voda (Top-Bio, ČR)



PPP Master Mix (Top-Bio, ČR): 150 mM Tris-Cl; 40 mM (NH4)2SO4; 0,02 % Tween 20; 5 mM MgCl2; 400 μM dNTP, 100 U / ml Taq-Purple DNA polymerázy; stabilizátory a aditiva; pH = 8,8



PCR primery syntetizovány firmou Generi biotech, ČR (seznam primerů uvádí tabulka 4)

Komponenty pro rep-PCR  PCR voda (Top-Bio, ČR) 

Taq polymeráza (2U, Top-Bio, ČR)



ThermoPol pufr (Top-Bio, ČR)



DMSO (Top-Bio, ČR)



dNTP mix (200 µmol / l, Top-Bio, ČR)



PCR primery syntetizovány firmou Generi biotech, ČR

Komponenty pro gelovou elektroforézu 

Agaróza pro elektroforézu (SERVA Electrophoresis GmbH, Německo)



Ethidium bromid (Top-Bio, ČR)



0,5 x TBE pufr: Tris-base (Sigma-Aldrich, USA) 53,90 g; kyselina borsírová (Sigma-Aldrich, USA) 27,514 g; EDTA Na2 x 2H2O (Sigma-Aldrich, USA), 3,722 g (Sigma-Aldrich, USA). Doplnění do 1000 ml destilovanou vodou



Hmotnostní standardy (Bio-Rad, USA) 25

 

3.2.3. Použité přístroje 

Digitální fotoaparát Sony DSC-W30 (Sony, Japonsko)



Dispenzor antibiotických disků (Oxoid, Velká Británie)



Fotometr (Densi-La-Meter, PLIVA-Lachema, ČR)



Chlazená odstředivka Hettich Micro 22 R (Hettich, Německo)



Laminární box II. bezpečnostní třídy (Steril Antares, Itálie)



Mikropipety (Gilson, Francie; Labnet, USA)



Mikrovlnná trouba (Bosch, Německo)



Předvážky Kern 440 (Ecotech, ČR)



Stolní autokláv IP 44 (CertoClav, Rakousko)



Termocykler PTC 200 (MJ Research, USA)



Termostat Sanyo MIR-153 (Sanyo, Japonsko)



Transiluminátor Ultra Lum (Claremont, USA)



Vortex MS 2 Minishaker (IKA-WORKS, USA)



Zařízení pro elektroforézu a zdroj elektrického napětí Power Pac 3000 (BioRad, USA)

3.2.4. Pracovní pomůcky a další materiál 

Antibiotické disky (Oxoid, Velká Británie)



Antibiotika – zásobní substance (Sigma-Aldrich, Velká Británie)



Elektroforetická vana s gelovým nosičem



Laboratorní sklo: podložní sklíčka, Petriho misky, Pasteurovy pipety, odměrné baňky a válce, kádinky



Mikropipety



Plastové pomůcky: bakteriologické kličky, kryozkumavky, mikrozkumavky, Petriho misky, Pasteurovy pipety, špičky, zkumavky

3.3. Metody 3.3.1. Gramovo barvení, KOH test, katalázový test Při barvení dle Grama se na podložní sklíčko nanesla kapka vody, přidala se klička bakteriální kultury, sklíčko se nechalo usušit. Fixace v plameni. Fixovaný 26  

preparát se barvil krystalovou violetí (3 min), která obarvila buňky tmavěmodře až fialově. Následovalo barvení Lugolovým roztokem (2 min), což v buňkách vedlo ke vzniku komplexu barviva s jodem. Dalším krokem bylo působení 96 % etanolu, grampozitivní bakterie si podržely komplex krystalové violeti s jodem, gramnegativní bakterie se odbarvily. Poslední barvení bylo karbolbuchsinem (Votava, 2001). Usušená a nabarvená sklíčka se pozorovala pod světelným mikroskopem při zvětšení 10 x 100 pomocí imerzního oleje. KOH test se prováděl k potvrzení, zda jsou kultury grampozitivní či gramnegativní. Na podložní sklíčko se nanesla kapka 3 % KOH, do kterého se přidala klička 24. hod kultury. U gramnegativních bakterií došlo k porušení buněčné stěny a cytoplazmatické membrány a k lyzy buňky, tím došlo ke změně viskozity během 5 - 60 s. Kultura se táhla za kličkou. U grampozitivních bakterií k porušení buněčné stěny nedošlo (Carlone a kol., 1983). Katalázový test je založen na katalytické přeměně katalázy H2O2 na H2O + O2. Unikání kyslíku je pozorovatelné okem, vznikají bublinky. Na podložní sklíčko se nanesla kapka 3 % H2O2, vedle této kapky se nanesla klička 24. hod kultury, následovalo rozetření kultury v H2O2. K uvolňování kyslíku docházelo ihned po reakci kultury s H2O2 (MacFaddin, 2000). Kataláza se nemůže provádět u kultur narostlých na agaru s přídavkem krve, některé enterokoky mohou totiž v přítomnosti krve tvořit pseudokatalázu a tak by mohly dávat falešně pozitivní výsledky. Tvorba pseudokatalázy závisí na typu přidávané krve do média a na typu kmene, který je testován.

3.3.2. Zamražování kultur Vyizolované a přečištěné kultury, které byly grampozitivní koky, kataláza negativní, jsme považovali za presumptivní enterokoky, a proto jsme je zamrazili pro budoucí použití. Sterilním tamponem jsme setřeli 24. hod kulturu narostlou na BHI agaru při 37 ºC. Opatrně jsme přenesli kulturu do zamražovacího média, poté zvortexovali a zamrazili při – 70 ºC. Dobře a čitelně popsali.  

27  

3.3.3. Rodově specifická PCR Metodika pro PCR se specifickými primery pro rod Enterococcus byla provedena dle Deasy a kol., 2000. Izolace DNA se provedla alkalickou lyzí: 1-μl klička 24. hod bakteriální kultury se homogenizovala ve 20 μl lyzačního pufru a zahřála se na 95 ºC po dobu 15 min. Získaný lyzát se naředil přidáním 180 μl sterilní deionizované vody a krátce se centrifugoval (13 000 rpm, 5 min). Pro přípravu PCR směsi byl zvolen postup namíchání „master-mixu” tak, že objemy jednotlivých komponent byly vynásobeny počtem analyzovaných vzorků plus jeden vzorek navíc.

Jednotlivé složky směsi byly napipetovány a smíchány ve

zkumavce typu Eppendorf, kromě DNA. Ke každé PCR reakci se přidávala pozitivní kontrola E. phoeniculicola CCM 7236T a negativní kontrola PCR voda. Směs byla krátce homogenizována pomocí vortexu a rozpipetována po 24 μl do zkumavek typu Eppendorf o objemu 200 µl. Nakonec byl do každé zkumavky přidán 1 µl bakteriální DNA připravené alkalickou lyzí a uchované zamražením. Celkový objem reakční směsi byl 25 µl. Složení PCR směsi: PPP Master Mix

12,5 μl

PCR voda

10,5 μl

Primer Enterococcus

0,5 μl

Primer Enterococcus-F (5-TCA ACC GGG GAG GGT-3) a Enterococcus-R (5ATT ACT AGC AGC GAT TCC GG-3) se vázaly na pozice 632 – 646 a 1353 – 1369. Vázaly se komplementárně ke konzervativním sekvencím rodu Enterococcus. Docházelo k amplifikaci úseku o velikosti 404 bp z genů pro 16S rDNA. Počáteční denaturace při 94 ºC po dobu 1 min byla následována 30. ti cykly denaturace při 90 ºC po dobu 30 sec, chlazení při 54 ºC po dobu 30 sec a prodlužování řetězců při 72 ºC po dobu 1 min. Poslední cyklus byl následován konečným prodlužováním při 72 ºC po dobu 8 min. Pro detekci PCR produktu byl použit 1,5 % agarózový gel. Gel se připravil smícháním 1,2 g agarózy a 80 ml 1 × TBE pufru. Agaróza byla rozvařena v mikrovlnné 28  

troubě při 450 kW po dobu 2,5 min. Po vychladnutí přibližně na 60 oC bylo přidáno 80 μl naředěného ethidium bromidu. Agaróza s ethidium bromidem byla nalita do předem připraveného nosiče s hřebínkem. Gel byl ponechán ve vaničce ve vodorovné poloze při pokojové teplotě až do ztuhnutí, po dobu 20 - 30 min. Po ztuhnutí byl opatrně vyjmut hřebínek a gel byl přenesen do elektroforetické vaničky s 1 x TBE pufrem. Vzorky DNA v množství 10 µl včetně kontrol byly opatrně naneseny mikropipetou do komůrek v gelu v elektroforetické vaničce. Nakonec bylo do jedné komůrky gelu napipetováno 2 µl DNA markeru. Elektroforetická vanička s gelem byla umístěna v takové orientaci, aby záporně nabitá DNA mohla migrovat gelem směrem k anodě. Elektroforéza byla spuštěna při napětí 130 V. Separace probíhala po dobu 25 min. Gel byl přenesen na transluminátor a po zapnutí UV světla prohlížen přes sklo. Gel byl vyfotografován digitálním fotoaparátem. Jako standard o definovaném počtu bazí byl při elektroforéze multiplikovaného úseku DNA fragmentu použit komerčně dostupný DNA marker, který se na agarózovém gelu separuje do 10 fragmentů různých velikostí (1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100 bp).  

3.3.4. Rep-PCR s GTG primery K druhové identifikaci jsme použili rep-PCR, která používá jako jednu z možností (GTG)5 primery (5-GTG GTG GTG GTG GTG-3). Izolace DNA se prováděla stejně jako v předchozím případě - alkalickou lyzí. Pro přípravu PCR směsi byl zvolen postup namíchání „master-mixu” tak, že objemy jednotlivých komponent byly vynásobeny počtem analyzovaných vzorků plus jeden vzorek navíc.

Jednotlivé složky směsi byly napipetovány a smíchány ve

zkumavce typu Eppendorf, kromě DNA. Směs byla krátce homogenizována pomocí vortexu a rozpipetována po 24 μl do zkumavek typu Eppendorf o objemu 200 µl. Nakonec byl do každé zkumavky přidán 1 µl bakteriální DNA připravené alkalickou lyzí a uchované zamražením. Celkový objem reakční směsi byl 25 µl. Jako pozitivní kontrola byla použita DNA referenčního kmene Enterococcus casseliflavus CCM 2478T, jako negativní kontrola byla použita PCR voda.

29  

Složení PCR směsi: Taq polymeráza

0,4 µl

ThermoPol pufr

2,5 µl

DMSO

0,25 µl

dNTP mix

0,5 µl

PCR voda

15,35 µl

(GTG)5 primer

2,5 µl

Počáteční denaturace při 94 ºC po dobu 7 min byla následována 30. ti cykly denaturace při 94 ºC po dobu 1 min, chlazení při 40 ºC po dobu 1 min a prodlužování řetězců při 65 ºC po dobu 8 min. Poslední cyklus byl následován konečným prodlužováním při 65 ºC po dobu 16 min. Do všech vzorků bylo po skončení PCR reakce přidáno 5 µl 6 × koncentrovaného nanášecího pufru. Získané PCR produkty byly separovány pomocí gelové elektroforézy v 1,5 % agarózovém gelu o velikosti 20 × 25 cm v 0,5 × TBE elektroforetickém pufru. 200 ml tohoto pufru bylo smícháno s 3 g agarózy a rozvařeno v mikrovlnné troubě. Agaróza se nechala zchladit na tepoltou 60 °C, následně bylo přidáno 10 µl ethidium bromidu a agaróza byla nalita do připraveného gelového nosiče o velikosti 20 × 25 cm. Gelová elektroforéza byla prováděna po dobu 960 min při napětí 55 V. Separované PCR produkty byly vizualizovány na UV transiluminátoru a byly zhotoveny digitální fotografické snímky gelu fotoaparátem s oranžovým filtrem B + W 040 a UV filtrem B + W 486 UV IR CUT. Výsledné fingerprinty byly vyhodnocovány pomocí BioNumerics 4.601 softwaru. Byla provedena analýza jednotlivých rep-PCR profilů a jejich srovnání s profily typových a referenčních kmenů enterokoků a dalších grampozitivních rodů bakterií uložených v CCM rep-PCR databázi. Pro shlukovou analýzu rep-PCR profilů byl použit Pearsonův koeficient a metoda UPGMA s nastavením 1 % optimalizace. 3.3.5. Testování citlivosti na antibiotika pomocí difuzí diskové metody Nejdříve jsme si připravili bakteriální inokulum - do zkumavky z čirého plastu s 2 ml destilované vody jsme přenesli sterilním vatovým tampónem 1 až 2 kolonie 24. 30  

hod kultury a vytvořili

zákal 0,5 stupně McFarlanda, který přibližně odpovídal

koncentraci 1,5  108 CFU (colony-forming unit) / ml. Intenzitu zákalu bakteriální suspenze jsme změřili na fotometru. Do nových zkumavek jsme napipetovali 2 ml sterilního fyziologického roztoku a přidali 20 μl připravené zákalové suspenze (stonásobné ředění). Takto připravené inokulum se očkovalo pomocí sterilního kapátka na Müeller-Hinton agar. Důležité bylo rozlití po celé ploše misky. Toho bylo docíleno nakláněním plotny na všechny strany. Přebytek inokula se odsál kapátkem. Inokulum se před aplikací disků nechalo dobře zaschnout. Pomocí dispenzoru jsme kladli na každou Petriho misku 5 antibiotik, viz tabulka 3. Plotny jsme umístili do termostatu víčkem vzhůru, aby nedocházelo k odpadnutí disků z misek a nechali inkubovat 24 hod při 37 o

C. Po 24. hod jsme změřili průměr zóny inhibice vytvořený testovanou bakterií

kolem disků a porovnali jej s hraničním průměrem inhibiční zóny pro citlivé kmeny podle tabulkových hodnot uvedených v NCCLS (National Committee for Clinical and Laboratory Standards, USA, 2002). Vytvořil-li vyšetřovaný kmen inhibiční zónu o stejném nebo větším průměru, než je hraniční průměr inhibiční zóny pro citlivé kmeny, pokládal se za citlivý k danému antibiotiku. Vytvoření inhibiční zóny o menším průměru se považovalo za rezistenci.

Disk číslo

Antibiotický disk Zkratka

Název

Množství antibiotika v disku (μg)

Průměr inhibiční zóny v mm R rezistentní

I S intermediální citlivý

1 TE Tetracyklin 30 ≤ 14 15 - 18 ≥ 2 Vankomycin 30 ≤ 14 15 - 16 ≥ V 3 Erytromycin 15 ≤ 13 14 - 22 ≥ E 4 AMP Ampicillin 10 ≤ 16 ≥ 5 CN Gentamicin 120 ≤ 6 7-9 ≥ Tab. 3: Sestava antibiotických disků a průměry inhibičních zón pro hodnocení citlivých a rezistentních izolátů.

31  

19 17 23 17 10

3.3.6. Testování genů rezistence pomocí PCR Byly testovány geny rezistence vůči tetracyklinu, vankomycinu, erytromycinu, penicilinu a gentamicinu. Přehled jednotlivých primerů, jejich annealingová teplota a velikost amplifikovaného úseku jsou uvedeny v tabulce 4. DNA byla vyizolována stejnou metodikou jako v předchozích izolacích – pomocí alkalické lyze. Pro přípravu PCR směsi byl zvolen postup namíchání „mastermixu” tak, že objemy jednotlivých komponent byly vynásobeny počtem analyzovaných vzorků plus jeden vzorek navíc. Jednotlivé složky směsi byly napipetovány a smíchány ve zkumavce typu Eppendorf, kromě DNA. Směs byla krátce homogenizována pomocí vortexu a rozpipetována po 24 μl do zkumavek typu Eppendorf o objemu 200 µl. Nakonec byl do každé zkumavky přidán 1 µl bakteriální DNA připravené alkalickou lyzí a uchované zamražením. Celkový objem reakční směsi byl 25 µl. Složení PCR směsi: PPP Master Mix

12,5 μl

PCR voda

9,5 μl

Primer

1 μl

32  

Primer

Sekvence (5´-3´)

tet (M)-F

GTGGACAAAGGTACAACGAG

tet (M)-R

CGGTAAAGTTCGTCACACAC

tet (O)-F

AACTTAGGCATTCTGGCTCAC

tet (O)-R

TCCCACTGTTCCATATCGTCA

tet (L)-F

TGGTGGAATGATAGCCCATT

tet (L)-R

CAGGAATGACAGCACGCTAA

tet (K)-F

GATCAATTGTAGCTTTAGGTGAAGG

tet (K)-R

TTTTGTTGATTTACCAGGTACCATT

van A-F

GGGAAAACGACAATTGC

van A-R

GTACAATGCGGCCGTTA

van B-F

ATGGGAAGCCGATAGTC

van B-R

GATTTCGTTCCTCGACC

van C1-F

GGTATCAAGGAAACCTC

van C1-R

CTTCCGCCATCATAGCT

van C2/C3-F

CTCCTACGATTCTCTTG

van C2/C3-R

CGAGCAAGACCTTTAAG

erm(A)-F

CCCGAAAATACGCAAAATTTCAT

erm(A)-R

CCCTTTTACCCATTTATAAACG

erm (B)-F

TGGTATTCCAAATGCGTAATG

erm (B)-R

CTGTGGTATGGCGGGTAAGT

mef(A/E)-F

CAATATGGGCAGGGCAAG

mef (A/E)-R

AAGCTGTTCCAATGCTACGG

pbp5-F

AACAAAATGACAAACGGG

pbp5-R

TATCCTTGGTTATCAGGG

ant(4´)-Ia-F

CTGCTAAATCGGTAGAAGC

ant(4´)-Ia-R

CAGACCAATCAACATGGCACC

aac(6´)aph(2´´)-F

GAACATGAATTACACGAGGG

aac(6´)aph(2´´)-R

GAACATGAATTACACGAGGG

aph(3´)-IIIa-F

AAATGACGGACAGCCGGTAT

aph(3´)-IIIa-R

CGATGGAGT GAAAGAGCCTG

Gen rezistence

Velikost Annealingová amplifikovaného teplota ºC úseku (bp)

tet(M)

62

406

tet(O)

62

515

tet(L)

62

229

tet(K)

62

155

vanA

60

732

vanB

60

635

vanC1

60

822

vanC2/C3

60

439

erm(A)

62

590

erm(B)

62

745

mef(A/E)

62

317

pbp5

54

590

ant(4´)-Ia

55

294

aac(6´)aph(2´´)

55

348

aph(3´)-IIIa

55

523

Tab. 4: Použité primery, jejich sekvence, annealingová teplota a velikost amplifikovaného úseku. Pro detekci PCR produktu byl použit 1,5 % agarózový gel. Gel se připravil smícháním 1,2 g agarózy a 80 ml 1 × TBE pufru. Agaróza byla rozvařena v mikrovlnné troubě při 450 kW po dobu 2,5 min. Po vychladnutí přibližně na 60 oC bylo přidáno 80 μl naředěného ethidium bromidu. Agaróza s ethidium bromidem byla nalita do předem připraveného nosiče s hřebínkem. Gel byl ponechán ve vaničce ve vodorovné poloze při pokojové teplotě až do ztuhnutí, po dobu 20 - 30 min. 33  

Po ztuhnutí byl opatrně vyjmut hřebínek a gel byl přenesen do elektroforetické vaničky s 1 x TBE pufrem. Vzorky DNA v množství 10 µl včetně kontrol byly opatrně naneseny mikropipetou do komůrek v gelu v elektroforetické vaničce. Jako negativní kontrola se používala PCR voda. Nakonec byly do jedné komůrky gelu napipetovány 2 µl DNA markeru. Elektroforetická vanička s gelem byla umístěna v takové orientaci, aby záporně nabitá DNA mohla migrovat gelem směrem k anodě. Elektroforéza byla spuštěna při napětí 130 V. Separace probíhala po dobu 25 min. Gel byl přenesen na transluminátor a po zapnutí UV světla prohlížen přes sklo. Gel byl vyfotografován digitálním fotoaparátem. Jako standard o definovaném počtu bazí byl při elektroforéze multiplikovaného úseku DNA fragmentu použit komerčně dostupný DNA marker, který se na agarózovém gelu separuje do 10 fragmentů různých velikostí (1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100 bp).  

3.3.6.1.

Rezistence k tetracyklinu

Zjišťovali jsme geny rezistence vůči tetracyklinu: tet(M), tet(O), tet(K) a tet(L). Primery tet(M)-F a tet(M)-R amplifikovaly úsek DNA o velikosti 406 bp, primery tet(O)-F a tet(O)-R amplifikovaly úsek DNA o velikosti 115 bp, primery tet(K)-F a tet(K)-R amplifikovaly úsek DNA o velikosti 155 bp, primery tet(L)-F a tet(L)-R amplifikovaly úsek DNA o velikosti 229 bp. Počáteční denaturace při 93 ºC po dobu 3 min byla následována 30. ti cykly denaturace při 93 ºC po dobu 1 min, chlazení při 62 ºC po dobu 1 min a prodlužování řetězců při 65 ºC

po dobu 4 min. Poslední cyklus byl následován konečným

prodlužováním při 65 ºC po dobu 3 min. Jako pozitivní kontroly byly použity: tet(M): Streptococcus pyogenes BM137 tet(O): Enterococcus faecalis BM4110 tet(K): Staphylococcus aureus R-16794 tet(L): E. faecalis P33

34  

3.3.6.2.

Rezistence k vankomycinu

U rezistentních izolátů jsme zjišťovali geny rezistence vůči vankomycinu: vanA, vanB, vanC1 a vanC2/C3. Primery vanA-F a vanA-R amplifikovaly úsek DNA o velikosti 732 bp, primery vanB-F a vanB-R amplifikovaly úsek DNA o velikosti 635 bp, primery vanC1-F a vanC1-R amplifikovaly úsek DNA o velikosti 822 bp, primery vanC2/C3-F a vanC2/C3R amplifikovaly úsek DNA o velikosti 439 bp. Počáteční denaturace při 94 ºC po dobu 3 min byla následována 35. ti cykly denaturace při 94 ºC po dobu 1 min, chlazení při 60 ºC po dobu 2 min a prodlužování řetězců při 72 ºC po dobu 2 min. Poslední cyklus byl následován konečným prodlužováním při 72 ºC po dobu 3 min. Jako pozitivní kontroly byly použity: vanA: Enterococcus faecalis vanA gene vanB: Enterococcus faecalis vanB gene vanC1: Enterococcus gallinarum vanC1 gene vanC2/C3: Enterococcus gallinarum vanC gene 3.3.6.3.

Rezistence k erytromycinu

Zjišťovali jsme geny rezistence vůči erytromycinu: erm(A), erm(B) a mef(A/E). Primery erm(A)-F a erm(A)-R amplifikovaly úsek DNA o velikosti 590 bp, primery erm(B)-F a erm(B)-R amplifikovaly úsek DNA o velikosti 745 bp, primery mef(A/E)-F a mef(A/E)-R amplifikovaly úsek DNA o velikosti 317 bp. Počáteční denaturace při 93 ºC po dobu 3 min byla následována 30. ti cykly denaturace při 93 ºC po dobu 1 min, chlazení při 62 ºC po dobu 1 min a prodlužování řetězců při 72 ºC po dobu 1 min. Poslední cyklus byl následován konečným prodlužováním při 72 ºC po dobu 5 min. Jako pozitivní kontroly byly použity: erm(A): Streptococcus pyogenes UR1092 erm(B): Streptococcus pyogenes BM137 mef(A): Streptococcus pyogenes STP046 35  

3.3.6.4.

Rezistence k penicilinu Zjišťovali jsme gen rezistence vůči penicilinu pbp5.

Primery pbp5-F a pbp5-R amplifikovaly úsek DNA o velikosti 590 bp. Počáteční denaturace při 95 ºC po dobu 15 min byla následována 30. ti cykly denaturace při 94 ºC po dobu 30 sec, chlazení při 54 ºC po dobu 30 sec a prodlužování řetězců při 72 ºC po dobu 2 min. Poslední cyklus byl následován konečným prodlužováním při 72 ºC po dobu 7 min. Jako pozitivní kontrola byla použita: Enterococcus faecium pbp5 gene

3.3.6.5.

Rezistence ke gentamicinu

Zjišťovali jsme geny rezistence vůči gentamicinu: ant(4´)-Ia, aac(6´)aph(2´´) a aph(3´)-IIIa. Primery ant(4´)-Ia-F a ant(4´)-Ia-R amplifikovaly úsek DNA o velikosti 294 bp, primery aac(6´)aph(2´´)-F a aac(6´)aph(2´´)-R amplifikovaly úsek DNA o velikosti 348 bp, primery aph(3´)-IIIa-F a aph(3´)-IIIa-R amplifikovaly úsek DNA o velikosti 523 bp. Počáteční denaturace při 94 ºC po dobu 10 min byla následována 35. ti cykly denaturace při 94 ºC po dobu 1 min, chlazení při 55 ºC po dobu 1 min a prodlužování řetězců při 72 ºC po dobu 1 min. Poslední cyklus byl následován konečným prodlužováním při 72 ºC po dobu 10 min. Jako pozitivní kontroly byly použity: ant(4´)-Ia : Enterococcus faecalis ant (4´) gene aac(6´)aph(2´´): Enterococcus faecalis SF 350 Ia aph(3´)-IIIa: Enterococcei JH2-1-5 APH (3´´´)

36  

4. VÝSLEDKY  

4.1.

Druhové zastoupení entrokoků u ferálních holubů Z celkového počtu 247 izolátů bylo s využitím PCR s rodově specifickými

primery a rep-PCR jednoznačně identifikováno 143 enterokoků: E. faecalis, E. faecium, E. durans, E. hirae, E. mundtii, E. gallinarum, E. casseliflavus, E. columbae. Přehled jednotlivých druhů a jejich procentuální zastoupení jsou shrnuty v tabulce 5. Druh

Počet izolátů

Zastoupení (%)

E. faecalis

36

25

E. faecium

27

20

E. durans

19

13

E. hirae

17

12

E. mundtii

17

12

E. gallinarum

12

8

E. casseliflavus

12

8

E. columbae

3

2

Tab. 5: Přehled vyizolovaných jednotlivých druhů enterokoků a jejich procentuální zastoupení. Na obrázku 1 je vytvořený dendrogram pomocí BioNumerics 4.601 softwaru z profilů rep-PCR. Pro shlukovou analýzu rep-PCR profilů byl použit Pearsonův koeficient a metoda UPGMA s nastavením 1 % optimalizace.

37  

Obr. 1: Shluková analýza výsledků rep-PCR typizace určených environmentálních a vybraných referenčních kmenů Enterococcus spp.

38  

4.2.

Zjišťování rezistence vůči vybraným antibiotikům Rezistence k jednomu či více antibiotikům byla prokázána u 36 izolátů (25 %, n

= 143). Druhové zastoupení rezistentních izolátů bylo následující: E. faecalis, E. faecium, E. durans, E. hirae a E. gallinarum. Přehled rezistence k jednotlivým antibiotikům je shrnut v tabulce 6. Druh E. faecalis

TE 11

V 3

E 10

AMP 3

CN 4

E. faecium

2

-

1

1

-

E. durans

4

-

1

-

-

E. hirae

7

-

-

-

-

E. mundtii

-

-

-

-

-

E. gallinarum

-

2

-

-

-

E. casseliflavus E. columbae Tab. 6: Rezistence k jednotlivým antibiotikům u identifikovaných druhů enterokoků. AMP – ampicilin, E – erytromycin, CN – gentamicin, TE – tetracyklin, V – vankomycin

Nejčastější rezistence k antibiotikům byla k tetracyklinům (24 izolátů = 17 %), následována rezistencí erytromycinu (12 = 8 %). Také byla zjištěna rezistence k vankomycinu (5 = 3 %), ampicilinu (4 = 3 %) a gentamicinu (4 = 3 %). 4.3.

Geny rezistence Rezistence vůči tetracyklinu byla nejčastěji způsobena genem tet(M), kombinace

dvou genů způsobujících rezistenci vůči tomuto antibiotiku byla zjištěna ve čtyřech případech. Všechny izoláty rezistentní vůči erytromycinu byly pozitivní na gen erm(B). Rezistence vůči gentamicinu byla způsobena geny aph(3´)-IIIa a/nebo aac(6´)aph(2´´). Rezistence vůči vankomycinu byla způsobena geny vanA nebo vanC1. Rezistence vůči ampicilinu byla způsobena genem pbp5 pouze v jednom případě ze čtyř. Souhrn získaných genů rezistence u jednotlivých druhů enterokoků uvádí tabulka 7.

39  

Fenotyp ATB rezistence

Geny rezistence

TE

tet(M)

Druhy (počet izolátů) E. faecalis (4), E. durans (4), E.hirae (6), E. faecium(1)

TE

tet(M), tet(K)

E. hirae (2)

TE

ND

E. faecalis (1)

V

vanA

E. faecalis (3)

V

vanC1

E. gallinarum (2)

E

erm(B)

E. faecalis (1), E. faecium (1)

TE, E

tet(M), ND

E. faecalis (1)

AMP

pbp5

E. faecium (1)

AMP

ND

E. faecalis (2)

E, TE

erm(B), tet(M)

E. faecalis (2), E. faecium (1)

E, TE

erm(B), tet(M), tet(O)

E. faecalis (1)

E, CN, TE

erm(B), aac(6´)aph(2´´), aph(3´)-IIIa, tet(M) E. faecalis (1)

E, CN, TE

erm(B), aph(3´)-IIIa, tet(M)

E. faecalis (1)

E, CN, TE

erm(B), aac(6´)aph(2´´), tet(M), tet(L)

E. faecalis (1)

E, CN, TE, AMP erm(B), aph(3´)-IIIa, tet(M), ND

E. faecalis (1)

Tab. 7: Geny rezistence u jednotlivých druhů enterokoků. AMP – ampicilin, E – erytromycin, CN – gentamicin, TE – tetracyklin, V – vankomycin ND – neurčeno (not deternined)

40  

5. DISKUZE  

5.1.

Druhové zastoupení rodu Enterococcus u ferálních holubů Enterokoky jsou přirozenou součástí střevní mikroflory většiny savců a ptáků

(Aerestrup a kol., 2002). Baele a kol. (2002) identifikovali E. columbae jako hlavní grampozitivní složku střevní mikroflory holubů (61 % izolátů). Druhým nejčastějším zástupcem grampozitivních bakterií byl E. cecorum (20 % izolátů). E. faecium, E. faecalis, E. gallinarum a E. casseliflavus byly minoritní (méně než 19 % izolátů). Střevní mikroflora holubů se značně liší od střevní mikroflory hrabavých ptáků jako jsou kuřata. Je to přisuzováno tomu, že holubi nemají slepé střevo, zato hrabaví ptáci jich mají víc a jsou bohatá na mikroorganismy. Byla navrhnuta teorie, že ptáci jako jsou pěvci, kteří nemají slepé střevo, nemají stálou střevní mikrofloru (Baele a kol., 2002). Toto tvrzení ovšem popírá výskyt E. columbae u holubů, který se považuje za součást stálé mikroflory u holubů (Tannock, 1999). E. columbae je blízce příbuzný s E. cecorum (Baele a kol., 2002). Oba druhy mají specifické růstové charakteristiky, patří mezi ně inkubace s přídavkem CO2 a citlivost k 0,4 % azidu sodnému, který je součástí téměř všech médií k izolaci enterokoků (Devriese a kol., 1998) Mezi enterokoky z ferálních holubů v Brně převažovaly druhy E. faecalis a E. faecium, naproti tomu E. columbae se vyskytoval v minoritním podílu. E. columbae patří mezi enterokoky hostitelsky specifické, vyskytuje se jen u holubů (Baele a kol., 2002), na rozdíl od E. faecalis a E. feacium, které jsou široce rozšířené jak u zvířat, tak v prostředí (Aerestrup a kol., 2002). Některé studie také uvádí hostitelskou specifitu u E. faecium, ale až na úrovni kmenů. Quednau a kol. (1999) použili štěpení pomocí restrikčních endonukleáz ke klasifikaci, ale bylo použito omezené množství kmenů tohoto druhu. Zjistili různé kmeny E. faecium u kuřat, prasat a lidí. Další studie zkoumaly hostitelské zaměření enterokoků rezistentních vůči glykopeptidům. Izolace těchto enterokoků byla provedena na médiích s glykopeptidy, čímž pravděpodobně došlo k pomnožení minoritních populací (Willems a kol., 2000). Jejich výsledky se částečně shodovaly se studií Quadnau a kol. (1999), čímž se potvrdilo hostitelské zaměření některých kmenů (Aerestrup a kol., 2002). 41  

Rozdíly mezi naší a studií Baeleho kol. (2002) mohou být vysvětleny skutečností, že naše vzorky byly před selektivní kultivací na pevných půdách pomnožovány v peptonové vodě, což mohlo způsobit selektivní pomnožení druhů E. faecalis a E. faecium, které rychleji rostou na rozdíl od karboxyfilních E. columbae, který roste na selektivních půdách pro enterokoky špatně (Svec a Devriese, 2009). Na Slanetz-Bartley agaru, který jsme použili pro selektivní kultivaci pomnožených enterokoků v peptonové vodě, kromě E. columabe roste špatně i E. cecorum. Tím, že E. columbae vyžaduje CO2 pro svůj růst, může být jeho prevalence často podhodnocena. Musí se proto izolovat bez použití selektivních médií na enterokoky. 5.2.

Stanovení citlivosti a rezistence vůči vybraným antibiotikům Aerestrup a kol. (1998) a Butyae a kol. (2001) uvádí, že střevní druhy

enterokoků, které se nachází u lidí se většinou nenacházejí u holubů. U lidí převládají E. faecium a E. faecalis a jsou většinou rezistentní k antibiotikům a předpokládá se, že se nenachází u holubů. Nachází se však u prasat, drůbeže, skotu a u psů. Výskyt stejných rezistentních druhů enterokoků u lidí i zvířat potvrzuje teorii o šíření genů rezistence mezi různými hostiteli. Aerestrup a kol. (2002) také uvedli, že díky tomu, že holubi nemají rezistentní druhy E. faecalis a E. feacium v jejich zažívacím traktu, nejsou pravděpodobně zodpovědni za šíření genů rezistence těchto druhů, a ze zoonotického pohledu nehrají holubi důležitou roli v šíření rezistence ka antibiotiků u grampozitivních bakterií. V naší studii byla prevalence enterokoků k antimikrobiálním látkám vysoká. Celkově bylo rezistentních na jedno nebo více antibiotik 36 izolátů z celkového počtu 143 identifikovaných druhů. Pomnožení v peptonové vodě mohlo způsobit selektivní pomnožení druhů E. faecalis a E. faecium, nemá však vliv na antibiotickou rezistenci, která byla vysoká. Vysvětlení takto vysoké rezistence jsme hledali ve způsobu života a stravování holubů. Ferální holubi žijí ve velkých městech i na vesnicích a vhodnými místy pro jejich hnízdění jsou různé budovy. Živí se kromě rostlinné potravy také různými zbytky potravin, které nacházejí v intravilánech obcí. Často jsou také přikrmováni člověkem (Janiga, 1995). Kolonizace jejich střevního traktu rezistentními enterokoky může mít původ v kontaminovaných odpadcích, kterými se holubi přiživují nebo jimiž jsou cíleně přikrmováni, a ve fekálně znečištěné vodě (zdroje fekálního 42  

znečištění povrchových vod mohou být humánní i animální), kterou pijí. Uvažovat je nutné i s možností selektivního účinku antibiotických reziduí, s nimiž se holubi hypoteticky mohou setkat v prostředí. V zemědělských objektech chovu zvířat se synantropní ferální holubi mohou jistě dostat i k medikovaným krmným směsím používaným v prevenci či terapii infekčních onemocnění hospodářských zvířat. Nejvyšší prevalence našich izolátů byla k tetracyklinům (17 %), následována rezistencí erytromycinu (8 %). Také byla zjištěna rezistence k vankomycinu (3 %), ampicilinu (3 %) a gentamicinu (3 %). Rezistence k tetracyklinům u enterokoků také převládá u lidí a zvířat v České republice. Kolář a kol. (2002) zkoumali v letech 1999 – 2000 enterokoky z klinického materiálu a z tenkého střeva u drůbeže. Mezi vyšetřenými eneterokoky dominovala rezistence k tetracyklinům (80 %), pak k erytromycinu (59 %). Rezistence ke gentamicinu byla zjištěna u 7 % izolátů a rezistence k ampicilinu byla zjištěna u 3 % izolátů. Podobná prevalence byla zjištěna u enterokoků izolovaných z člověka, broilerů a prasat v ostatních státech Evropy (Aarestrup a kol., 2000). Van den Bogaard a kol. (1997) zjistili, že vankomycin rezistentní enterokoky (VRE) mohou být detekovány až u 50 % fekálních vzorků z krocanů a u 39 % fekálních vzorků z farmářů, kteří přichází do kontaktu s těmito zvířaty. Kromě toho byly izolovány VRE u 20 % fekálních vzorků z jatek zpracovávajících krocanní maso a u 14 % městských obyvatel ze stejné oblasti. Stejných výsledků dosáhl i Aerestrup a kol. (2000), kteří srovnávali antimikrobiální rezistenci a geny rezistence enterokoků u lidí, broilerů a prasat. Bates a kol. (1994) objevili vankomycin rezistentní enterokoky s identickými ribotypy z maloobchodních kuřat a lidí. Tím potvrdili přenos VRE mezi potravními zvířaty a lidmi. V Německu Reinert a kol. (1999) zjistili 1,5 % rezistenci k vankomycinu u 730 izolátů enterokoků u lidí, ve Švédsku je výskyt VRE jen sporadický (Lukasova a Sustackova, 2003). V České republice poprvé popsal VRE Kolář a kol. v roce 1997, a jejich frekvence dosahovala 3,7 % u lidí (Lukasova a Sustackova, 2003). V naší studii byla zjištěna 3% prevalence VRE u ferálních holubů, což odpovídá výsledkům Koláře a kol. Zjištění antibiotické rezistence u enterokoků z holubů ještě víc potvrzuje naši hypotézu, že ferární holubi mohou být považováni za druhy rizikové z hlediska šíření rezistentních bakterií v prostředí. 43  

5.3.

Geny rezistence u jednotlivých izolátů rodu Enterococcus Rezistence k tetracyklinům je nejčastěji spojena s genem tet(M), (Aarestrup a

kol., 2000), který byl také zjištěn u našich izolátů (26 izolátů = 18%) rezistentních k tetracyklinům. Gen tet(M) je nejčastěji lokalizován na bakteriálním chromozomu. Může být přenášen pomocí konjugativních transpozonů skupiny Tn916 / Tn1545, které jsou nejvíce promiskuitní z dosud popsaných transpozonů. Mají široké rozmezí hostitelů zahrnujících jak grampozitivní, tak i gramnegativní bakterie (Chopra a Roberts, 2001). Další geny rezistence k tetracyklinu u našich izolátů byly tet(K) (2 izoláty = 1 %), tet(L) (1 izolát = 1 %) a tet(O) (1 izolát = 1 %). Rezistence k erytromycinu byla u našich izolátů spojena s genem erm(B), geny erm(A) a mef(A/E) nebyly zjištěny. Podle literatury je gen erm nejčastěji zodpovědný za rezistenci k makrolidům u bakterií z lidí a zvířat, v případě enterokoků se jedná o získanou rezistenci spojenou s genem erm(B) (Martel a kol., 2002). Nejvíce kmenů rezistentních k makrolidům v porovnání s ostatními druhy bylo prokázáno u E. faecium (Portillo a kol., 2000). U našich izolátů rezistentních k erytromycinu bylo 9 izolátů (6 %) E. faecalis a 1 izolát (1 %) E. faecium. Získaná rezistence ke glykopeptidům je způsobena různými mechanizmy. V Evropě převládají u vankomycin rezistentních enterokoků geny rezistence vanA a vanB. Rezervoárem těchto genů u lidí je nejčastěji E. faecalis (Willems a kol., 2005). My jsme získali 3 izoláty (2 %) E. faecalis mající gen rezistence vanA a 2 izoláty (1 %) E. gallinarum s genem rezistence vanC1, který je součástí jejich přirozené rezistence. V České republice jsou u lidí a zvířat nejčastější geny rezistence vanA u E. faecium a vanB u E. faecalis (Kolar a kol., 2002). Rezistence ke genatimicinu byla u našich izolátů zjištěna ve čtyřech případech (3 %), všechny byly druh E. faecalis. Dva izoláty měly gen rezistence aph(3´)-IIIa, jeden aac(6´)aph(2´´) a jeden aac(6´)aph(2´´) i aph(3´)-IIIa. Chow (2000) ve své studii zjistil, že aac(6´)-Ie-aph(2´´)-Ia se vyskytuje u 90 % klinických izolátů rezistentních ke gentamicinu, u 10 % se vyskytuje aph(2´´)-Ic, aph(2´´)-Id nebo aph(2´´)-Ib.

44  

6. ZÁVĚR  

Z 247 odstřelených holubů jsme získali stejný počet bakteriálních izolátů (n = 247). Pomocí PCR s rodově specifickými primery a rep-PCR se nám podařilo jednoznačně určit 143 izolátů jako zástupce rodu Enterococcus, u kterých jsme zjišťovali citlivost a rezistenci k antibiotikům a jejich geny rezistence. Rezistence k jednomu či více antibiotikům byla prokázána u 36 izolátů, což je poměrně vysoká prevalence. Jako nejčastější byla zjištěna rezistence k tetracyklinu. Byly rovněž nalezeny příslušné geny odpovědné za rezistenci k antimikrobiálním látkám. Zdroje rezistentních enterokoků pro ferální holuby je nutné hledat v prostředí, kde se tito holubi vyskytují – urbánní, suburbánní, zemědělské prostředí. Kolonizace jejich střevního traktu rezistentními enterokoky může mít původ v kontaminovaných odpadcích, kterými se holubi přiživují nebo jimiž jsou cíleně přikrmováni, a ve fekálně znečištěné vodě (zdroje fekálního znečištění povrchových vod mohou být humánní i animální), kterou pijí. Uvažovat je nutné i s možností selektivního účinku antibiotických reziduí, s nimiž se holubi hypoteticky mohou setkat v prostředí. V zemědělských objektech chovu zvířat se synantropní ferální holubi mohou jistě dostat i k medikovaným krmným směsím používaným v prevenci či terapii infekčních onemocnění hospodářských zvířat. Pak by selektivní účinek přijatých antibiotik byl jistě významný. Naše

studie

ukázala,

že

Enterococcus

spp.

je

rezistentní

k různým

antimikrobiálním látkám jako jsou tetracyklin, erytromycin, gentamicin a vankomycin. Toto zjištění je alarmující, zvláště když geny rezistence se snadno přenáší do dalších bakterií. Ferární holubi proto mohou být považováni za druhy rizikové z hlediska šíření rezistentních bakterií v prostředí.

45  

7. SEZNAM LITERATURY  

Aarestrup F. M., Bager F., Jensen N. E., Madsen M., Meyling A. and Wegener H. C. (1998): Surveillance of antimicrobial resistance in bacteria isolated from food animals to antimicrobial growth promoters and related therapeutic agents in Denmark. APMIS 106: 606-622.  Aarestrup F. M., Agerso Y., Gerner-Smidt P., Madsen M. and Jensen L. B. (2000): Comparison of antimicrobial resistance phenotypes and resistance genes in Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium from humans in the community, broilers, and pigs in Denmark. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 37: 127-137. Aarestrup F. M. (2006): Antimicrobial Resistance in Bacteria of Animal Origin. Washington D.C.: ASM Press. Arthur M. and Courvalin P. (1993): Genetics and mechanisms of glycopeptide resistance in enterococci. Antimicrob. Agents Chemother. 37(8):1563–1571. Arthur M., Molinas C., Depardieu F. and Courvalin P. (1993): Characterization of Tn1546, a Tn3-related transposon confering glycopeptide resistance by synthesis of depsipeptide peptidoglycan precursors in Enterococcus faecium BM4147. J. Bacteriol. 175: 117-127. Arthur M., Reynolds P. E. and Courvalin P. (1996): Glycopeptide resistance in enterococci. Trends Microbiol. 4: 401-407. Baele M., Devriese L. A., Butaye P. and Haesebrouck F. (2002): Composition of enterococcal and streptococcal flora from pigeon intestines. J. Appl. Microbiol. 92: 348351. Bentorcha F., Cespédès G. and Horaud T. (1991): Tetracycline resistance heterogenity in Enterococcus faecium. Antimicrob. Agents Chemother. 35: 808-812. Berryman D. I. and Rood J. I. (1995): The closely related ermB-ermAM genes from Clostridium perfringens, Enterococcus faecalis (pAMB1), and Streptococcus agalactiae (pIP501) are flanked by variant of directly repeated sequence. Antimicrob. Agents Chemother. 39: 1830-1834. Bertram J. M., Stratz M. and Durre P. (1991): Natural transfer of conjugative transposon Tn916 between gram-positive and gram-negative bacteria. J. Bacteriol. 173: 443-448. 46  

Betzl D., Ludwig W., Schleifer K. H. (1990): Identification of lactococci and enterococci by colony hybridization with 23S rRNA-targeted oligonucleotide probes. Appl. Environ. Microbiol. 56: 2927-29. Billot-Klein D., Blanot D., Gutmann L. and Heijenoort J. (1994): Association constants for the binding of vancomycin and teicoplanin to N-acetyl-D-alanyl-D-alanine and N-acetyl-D-alanyl-D-serine. Biochem. J. 304: 1021-1022. Bogaard A. E., Willems R., London N., Top J. and Stobberingh E. E. (2002): Antibiotic resistance of faceal enterococci in poultry, poultry farmers and poultry slaughterers. J. Antimicrob. Chemother. 49 (3): 497-505. Butaye P., Devriese L. A. and Heesebrouck F. (2001): Differences in antibiotic resistance patterns of Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium strains isolated from farm and pet animal. Antimicrob. Agents Chemother. 45: 1374-1378. Caillard F., Carlier C. and Courvalin P. (1987): Physical analysis of the conjugative shuttle transposon Tn1545. Plasmid. 17: 58-60. Carias L. L., Rudin S. D., Donskey C. J. and Rice L. B. (1998): Genetic linkage and co-transfer of a novel, vanB-containing transposon (Tn5382) and a low-affinity penicillin-binding protein 5 gene in a clinical vancomycin-resistant Enterococcus faecium isolate. J. Bacteriol. 180: 4426-4434. Carlone G. M., Valadez M. J., Pickett M. J. (1983): Methods for distinguishing Gram-positive from Gram-negative bacteria. J. Clin. Microbiol. 16: 1157 – 1159. Casadewall B. and Courvalin P. (1999): Characterization of the vanD glycopeptide resistance gene cluster from Enterococcus faecium BM4339. J. Bacteriol. 181: 36443648. Cauwerts K., Decostere A., De Graeg E. M., Haesebrouck F. and Pasmans F. (2007): High prevalence of tetracycline resistance in Enterococcus isolates from broilers carving the erm(B) gene. Avian Pathology. 36(5): 395-399. Cetinkaya Y., Falk P. and Mayhall G. C. (2000): Vancomycin-resistant enterococci. Clin. Microbiol. Rev. 13:686-707. Chopra I. and Roberts M. (2001): Tetracycline antibiotic: mode of action, applications, molecular biology, and epidemiology of bacterial resistance. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 65: 232-260. 47  

Chow J. W. (2000): Aminoglycoside resistance in enterococci. Clin. Infect. Dis. 31: 586-589. Clancy J., Petitpas J., Dib-Hajj F., Yuan W., Cronan M., Kamatj A. V., Bergeron J. and Retsema J. A. (1996): Molecular cloning and functional analysis of a novel macrolide-resistance determinant mefA, from Streptococcus pyogenes. Mol. Microbiol. 22:867-879. Clark N. C., Teixiera L. M, Facklam R. R. and Tenover F. C. (1998): Detection and differentation of vanC-1, vanC-2 a vanC-3 glycopeptide resistance genes in enterococci. J. Clin. Microbiol. 36: 2294-2297. Clark N. C., Olsvik Ø., Swenson J. M., Spiegel C. A. and Tenover F. C. (1999): Detection of streptomycin / spectinomycin adenyltransferase gene (aadA) in Enterococcus faecalis. Antimicrob. Agents Chemother. 43: 157-160. Clewell D. B. and Flannagan S. E. (1993): The conjungative transposons of grampositive bacteria, p. 369-393. In: D. B. Clewell (ed.), Bacterial Conjugation. Plenum Press, New York, N. Y. Courvalin P. and Carlier C. (1986): Transposable multiple antibiotic resistance in Streptococcus pneumoniae. Mol. Gen. Genet. 205: 291-297. Dahl K. H., Lundblad E. W., Rokenes T. P., Olsvik O. and Sundsfjord A. (2000): Genetic linkage of the vanB2 gene cluster to Tn5382 in vancomycin-resistant enterococci and characterisation of two novel insertion sequences. Microbiology 146:1469-1479. Daigle D. M., Hughes D. W. and G. D. Wright (1999): Prodigious substrate specificity of AAC(6')-APH(2"), an aminoglycoside antibiotic resistance determinant in enterococci and staphylococci. Chem. Biol. 6:99-110. De Herdt P., Haesebrouck F., Devriese L. A. and Ducatelle R. (1994): Prevalence of Streptococcus bovis in racing pigeons. Vet. Q. 16: 71-74. Deasy B. M., Rea M. C., Fitzgerald G. F., Cogan T. M. and Beresford T. P. (2000): A rapid PCR based method to distinguish between Lactococcus and Enterococcus. System. Appl. Microbiol. 23: 510-522.

48  

Devriese L. A., Van de Kerckhove A., Kilpper B. R. and Schleifer K. H. (1987): Characterization and identification of Enterococcus species isolated from the intestines of animals. Int. J. Syst. Bacteriol. 37: 257-259. Devriese L. A., Vandamme P., Pot B., Vanrobaeyes M., Kersters K. and Haesebrouck F. (1998): Differentiation between Streptococcus gallolyticus strains of human clinical and veterinary origins and Streptococcus bovis strains from the intestinal tracts or ruminants. J. Clin. Microbiol. 36: 3520-3523. Dolejska M., Senk D., Cizek A., Rybarikova J., Sychra O. a Literak, I. (2008): Antimicrobial resistant Escherichia coli isolates in cattle and house sparrows on two Czech dairy farms. Res. Vet. Sci. 85: 491–494. Doming K. J., Mayer H. K. and Kneifel W. (2003): Methods used for the isolation, enumeration, characterisation and identification of Enterococcus spp. 1. Media for isolation and enumeration. Int. J. of Food Microbiol. 88: 165-188. Dunny G. M., Leonard B. A. B. and Hedberg P. J. (1995): Pheromone-inducible conjugation in Enterococcus faecalis: interbacterial and host-parasite chemical communication. J. Bacteriol. 177: 871-876. Dutka-Malen S., Blaimont B., Wauters G. and Courvalin P. (1994): Emergence of high-level resistance to glycopeptides in Enterococcus gallinarum and Enterococcus casseliflavus. Antimicrob. Agents Chemother. 38(7): 1675–1677. Elippoulos G. M. (1997): Vancomycin-resistant enterococci: mechanism and clinical relevance. Infect. Dis. Clin. North Am. 11: 851-865. Facklam R. R., da Gloria S. Carvalho M. and Teixeira L. M. (2002): History, Taxonomy, Biochemical Chracteristics, and Antibiotics Susceptibility Testing of Enterococci. In: Gilmore M. S., Clewell D. B., Courvalin P., Dunny G. M., Murray B. E., Rice L. B. (eds), The Enterococci: Pathogenesis, Molecular Biology, and Antibiotics Resistance, 1-54. ASM Press, Washington, D.C. Fines M., Perichon B., Reynolds P., Sahm D. F. and Courvalin P. (1999): VanE, a New Type of Acquired Glycopeptide Resistance in Enterococcus faecalis BM4405. Antimicrob. Agents Chemother. 28: 678-683. Fontana R. (1985): Leading articles: penicillin-binding proteins and the intrinsic resistance to beta-lactams in gram-positive cocci. J. Antimicrob. Chemother. 16: 412-6.

49  

Fontana R., Aldegheri M., Ligozzi M., Lopez H., Sucari A. and Satta G. (1994): Overproduction of a low afnity penicillin-binding protein and high level ampicilin resistance in Enterococcus faecium. Antimicrob. Agents Chemother. 38:19803. Fontana R., Ligozzi M., Pittaluga F. and Satta G. (1996): Intrinsic penicillin resistance in enterococci. Microb. Drug Resist. 2: 209-213. Fraimow H. and Knob C. (1997): Amplification of macrolide efflux pumps msr and mef from Enterococcus faecium by polymerase chain reaction, abstr. A-125, p. 22. In: Abstract of the 98th General Meeting of the American Society for Microbiology. American Society for Microbiology, Washington DC. Fridkin S. K. and Gaynes R. P. (1999): Antimicrobial resistance in intensive care units. Clin. Chest. Med. 20: 303-316. Galas D. J. and Chandler M. (1989): Bacterial insertion sequences, p. 109-162. In: D. E. Berg and M. M. Howe (ed.): Mobile DNA. American Society for Microbiology, Washington, D. C. Gordon S., Swenson J. M., Hill B. C., Pigott N. E., Facklam R. R., Cooksey R. C., Thornsberry C., Enterococcal Study Group, Jarvis W. R. and Tenover F. C. (1992): Antomicrobial susceptibility patterns of common and unusual species of enterococci causing infections in the Ubited States. J. Clin. Microbiol. 30: 2373-2378. Gray L. W., Stewert D. and Pedler S. J. (1991): Species identification and antibiotic susceptibility testing of enterococci isolated from hospitalized patiens. Anti. Agent. Chem. 35: 1943-45. Hodel-Christian S. L. and Murray B. E. (1992): Comparsion of the gentamicin resistance transposon Tn5281 with regions encoding gentamicin resistance in Enterococcus faecalis isolates from diverse geographic regions. Antimicrob. Agents Chemother. 36: 2259-2264. Hudec K. and Stastny K. (2005): Fauna ČR. Ptaci-Aves 2/II. Prague: Academia Press. Jackson C. R., Fedorka-Cray P. J., Barrett J. B. and Ladely S.R. (2004): Effects of tylosin use on erythromycin resistance in enterococci isolated from swine. Appl. Environ. Microbiol. 70: 4205–4210.

50  

Janniére L., Gruss A. and Ehrlich S. D. (1993): Plasmids, p. 625-644. In: A. L. Sonenshein, J. Hoch and R. Losik (ed.), Bacillus subtilis and other Gram-positive Bacteria: Biochemistry, Physiology, and Molecular Genetics. American Society for Microbiology, Washington D. C. Janiga M. and Johnston R. F. (1995): Feral Pigeon. Oxford University Press. 307 s. Jones R. N., Beach M. L., Pfaller M. A. and Doern G. V. (1998): Antimicrobial activity of gatifloxacin tested against 1676 strains of ciprofloxacin-resistant grampositive cocci isolated from patient infections in North and South America. Diag. Microbiol. Infect. Dis. 32: 247-252. Jones R. N., Hare R. S., Sabatelli F. J. and the Ziracin Susceptibility Testing Group (2001): In vitro gram-positive antimicrobial activity of evernimicin (SCH27899), a novel oligosacharide, compared with other antimicrobials: a multicentre international trial. J. Antimicrob. Chemother. 47: 15-25. Kak V. and Chow J. W. (2002): Acquired antibiotic resistances in Enterococci. In: Gilmore M. S., Clewell D. B., Courvalin P., Dunny G. M., Murray B. E., Rice L. B. (eds), The Enterococci: Pathogenesis, Molecular Biology, and Antibiotics Resistance, 154. ASM Press, Washington, D.C. Kimpe A., Decostere A., Baele M., Devriese L. A. and Haesebrouck F. (2004): Presence and mechanism of macrolide-lincosamide resistance in Enterococcus columbae strains belonging to the intestinal flora of pigeons. Avian pathology. 33(3): 310-313. Klijn N., Weerkamp A. H., de Vos W. M. (1991): Identification of mesophilic lactic acid bacteria by using polymerase chain reaction-amplified variable regions of 16S r RNA and specific DNA probes. Appl. Environ. Microbiol. 57: 3390-3393. Kolar M., Pantucek R., Bardon J., Vagnerova I., Typovska H., Valka I. and Doskar J. (2002): Occurrence of antibiotic-resistant bacterial strains isolated in poultry. Vet. Med. (Praha) 47: 52–59. Koonin E. V. and Ilyina T. V. (1993): Computer-assisted dissection of rolling circle DNA replication. Biosystems. 30: 241-268. Kotra L. P., Haddad J. and Mobashery S. (2000): Aminoglycosides: perspectives on mechanisms of action and resistance and strategies to counter resistance. Antimicrob. Agents Chemother. 44: 3249-3256. 51  

Lancefield R. C. (1933): A serological differentation of human and other groups of hemolytic enterococci. J. Exp. Med. 57: 571-595. Leclercq R., Derlot E., Duval J. and Courvalin P. (1988): Plasmid-mediated resistance to vancomycin and teicoplanin in Enterococcus faecium. N. Engl. J. Med. 319: 157-161. Lett M. C. (1988): Tn3-like elements: molecular structure, evolution. Biochemie 70: 167-176. Lewis C. M. and Zervos M. J. (1990): Clinical manifestations of enterococcal infection. Eur. J. Clin. Micro. Infect. Dis. 9: 111-117. Literak I., Vanko R., Dolejska M., Cizek A. and Karpiskova R. (2007): Antibiotic resistant Escherichia coli and Salmonella in Russian rooks (Corvus frugilegus) wintering in the Czech Republic. Lett. Appl. Microbiol. 45: 616–621. Lukasova J. and Sustackova A. (2003): Enterococci and Antibiotic resistance. Acta Vet. 72: 315-323. Lynch C., Courvalin P. and Nikaido H. (1997): Active efflux of antimicrobial agents in wild-type strains of enterococci. Antimicrob. Agents Chemother. 41: 869-871. MacFaddin J. F. (2000): Biochemical tests for identification of medical bacteria. Lippincott Williams and Wilkins. Philadelphia. p. 78-96. Marothi Y. A., Agnihotri H. and Dubey D. (2005): Enterococcal resistance-an overview, Indian J. Med. Microbiol. 23(4):214-9. Martel A., Devriese L. A., Decostere A. and Haesebrouck F. (2003): Presence of macrolide resistence genes in streptococci and enterococci isolated from pigs and pork carcasses. Int. J. Food Microbiol. 84: 27-32. McMurry L. M. and Levy B. S. (2000): Tetracycline resistance in gram-positive bacteria, p. 660-677. In: V. A. Fischetti, R. P. Novick, J. J. Ferretti, D. A. Portnoy and J. I. Rood (ed.), Gram-Positive Pathogens. ASM Press, Washington, D. C. Moellering R. C. Jr. and Wienberg A. N. (1971): Studies on antibiotic synergism against enterococci. II. Effect of various antibiotics on the uptake of 14C-labelled streptomycin by enterococci. J. Clin. Invest. 50: 2580-2584. 52  

Morris J. G., Shay D. K., Hebden J. N., McCarter R. J., Perdue B. E. and Jarvis W. (1995): Enterococci resistant to multiple antimicrobial agents, including vancomycin. Ann. Intern. Med. 23: 250-259. Murray B. E., An F. Y. and Clewell D. B. (1986): Plasmids and pheromone response of the β-lactamase-producer Streptococcus (Enterococcus) faecalis HH22. Antimicrob. Agents Chemother. 32: 547-551. Murray B. E. (1990): The life and times of the Enterococcus, Clin. Microbiol. Rev. 3(1):46-65. Murray B. E. (1992): β-lactamase-producing enterococci. Antimicrob. Agents Chemother. 36: 2355-2359. Papaparaskevas J. A., Vatopoulos P. T., Tassios A., Avlami N. J., Legakis and Kalapothaki V. (2000): Diversity among high-level aminoglycoside-resistant enterococci. J. Antimicrob. Chemother. 45:277-283. Pepper K., Horaud T., Le Bouguenec C. and de Cespedes G. (1987): Location of antibiotic resistance markers in clinical isolates of Enterococcus faecalis with similar antibiotypes. Antimicrob. Agents Chemother. 31: 1394-1402. Portillo A. F., Ruiz-Larrea M., Zarazaga A., Alonso J., Martinez L. and Torres C. (2000): Macrolide resistance genes in Enterococcus spp. Antimicrob. Agents Chemother. 44:967-971. Quednau M., Ahrné S. and Moulin G. (1999): Genomic relationships between Enterococcus faecium strains from different sources and with different antibiotic resistance profiles evaluated by restriction endonuclease analysis of total chromosomal DNA using EcoRI and PvuII. Appl. Environ. Microbiol. 65: 1777-1780. Rhinehart E., Smith N. E., Wennersten C., Gorss E., Freeman J., Eliopoulos G., Moellering R. C. Jr. and Goldman D. A. (1990): Rapid dissemination of β-lactamaseproducing, aminoglycoside-resistant Enterococcus faecalis among patiens and staff on an infant-toddler surgical ward. N. Engl. J. Med. 323: 1814-1818. Rice L. B. (1998): TN916-family conjugative transposons and dissemination of antimicrobial resistance determinants. Antimicrob. Agents Chemother. 42: 1871-1877. Rice L. B. and Carias L. L. (1998): Transfer of Tn5385, a composite, multiresistance element from Enterococcus faecalis. J. Bacteriol. 180: 714-721. 53  

Rice L. B., Carias L. L., Hutton-Thomas R., Sifaoui F., Gutmann L. and Rudin S. D. (2001): Penicillin-binding protein 5 and expression of ampicilin resistance in Enterococcus faecium. Antimicrob. Agents Chemother. 45:1480–1486. Ridenhour M. B., Fletcher H. M., Mortensen J. E. and Daneo-Moore L. (1996): A novel tetracycline-resistant determinant, tet(U), is encoded on plasmid pKQ10 in Enterococcus faecium. Plasmid. 35: 71-80. Roberts M. C. and Hillier S. L. (1990): Genetic basis of tetracycline resistance in urogenital bacteria. Antimicrob. Agents Chemother. 34: 476-478. Roberts M. C., Sutcliffe J., Courvalin P., Bogo Jensen L., Rood J. and Seppala H. (1999): Nomenclature for macrolide and macrolide-lincosamide-streptogramin B resistance determinants. Antimicrob. Agents Chemother. 43: 2823-2830. Schleifer K. H. and Kilpper-Bälz R. (1984): Molecular and chemotaxonomic approaches to the classification of streptococci, enterococci and lactococci: a review. Syst. Appl. Microbiol. 10: 1-19. Sedlacek I. (2007): Bakterie s buněčnou stěnou grampozitivního typu. In: Taxonomie prokaryot, Masarykova univerzita, p. 187-256. Shaw W. V. (1983): Chloramphenicol acetyltransferase: enzymology and molecular biology. Crit. Rev. Biochem. 14: 1-47. Shaw K. J., Rather P. N., Hare R. S. and Miller G. H. (1993): Molecular genetics of aminoglycoside resistance genes and familial relationships of the aminoglycoside-modifying enzymes. Microbial. Rev. 57:138-l 63. Sherman (1937): The streptococci. Bacteriol. Rev. 1: 3-97. Sifaoui F., Arthur M., Rice L. and Gutmann L. (2001): Role of penicillin-binding protein 5 in expression of ampicilin resistance and peptidoglycan structure in Enterococcus faecium. Antimicrob. Agents Chemother. 45:2594–2597. Singer R. S., Finch R., Wegener C., Bywater R., Walters J. and Lipsitch M. (2003): Antibiotic resistance – the interplay between antibiotic use in animals and human beings. Lancet. Infect. Dis. 3: 47–51.

54  

Svec P. and Devriese L. A. (2009): Genus I. Enterococcus (ex Thiercelin and Jouhaud 1903) Schleifer and Kilpper-Bälz 1984, 32VP. In: Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, The Firmicutes eds. De Vos P., Garrity G. M., Jones D., Krieg N. R., Ludwig W., Rainey F. A., Schleifer K. H. and Whitman W. B. pp. 594–607. New York: Springer. Swinfield T. J., Oultram J. D., Thompson D. E., Brehm J. K. and Minton N. P. (1990): Physical characterisation of the replication region of the Streptococcus faecalis plasmid pAM β1. Gene 87: 79-90. Tacconelli E. (2009): Antimicrobial use: risk driver of multidrug resistant microorganisms in healthcare settings. Curr. Opin. Infect. Dis. Aug. 22(4): 352-8. Tannock G. W. (1999): A fresh look at the intestinal microflora. In: Probiotics, a critical review ed. Tannock, G. W. pp 5-14. Norfolk: Horizon Scientific Press. Vakulenko S. B., Donabedian S. M., Voskresenskiy A. M., Zervos M. J., Lerner S. A. and Chow J. W. (2003): Multiplex PCR for detection of aminoglycoside resistance genes in enterococci. Antimicrob. Agents Chemother. 47:1423-1426. Van den Bogaard A. E. and Stobberingh E. E. (1997): Vancomycin resistant enterococci in turkeys and farmers. N. Engl. J. Med. 337: 1558-1599. Votava M. (2001): Základní vlastnosti bakterií, Antimikrobiální látky In: Lékařská mikrobiologie obecná, Neptun, p.19-53, 161-191. Weaver K. E., Rice L. B., Churchward G. (2002): Plasmids and Transpozons. In: Gilmore M.S., Clewell D.B., Courvalin P., Dunny G.M., Murray B.E., Rice L.B. (eds.), The Enterococci: Pathogenesis, Molecular Biology, and Antibiotic Resistance, 219-263. ASM Press, Washington, D.C. Weisblum B. (1995): Erythromycin resistance by ribosome modification. Antimicrob. Agents Chemother. 39: 577-585. Willems R. J., Top J., van der Braak N., van Belkum A., Endtz H., Mevius D., Stobberinger E., van den Bogaard A. and Emben D. A. (2000): Host specificity of vancomycin-resistant Enterococcus faecium. J. Infect. Dis. 182: 816-823. Willems R. J., Top J., van Santen M., Robinson D. A., Coque T. M., Baquero F., Grundmann H. and Bonten M. J. (2005): Global spread of vancomycin-resistant Enterococcus faecium from distinct nosocomial genetic complex. Emerg. Infect. Dis. 11: 821–828. 55  

Williamson R. L., Gutmann T., Horaud F., Delbos F. and Acar J. F. (1985): Use of penicillin-binding proteins for the identification of enterococci. J. Gen. Microbiol. 132: 1929-1937.

Internetové zdroje: www.bacterio.cict.fr/e/enterococcus.html www.sifin.de/english/produktinfo/enterococci-selective-agar-acc-slanetz-bartleytn1132.pdf

56