Sledování minimální zbytkové choroby u pacientů. s akutní myeloidní leukémií

Masarykova univerzita v Brně Přírodovědecká fakulta

Katedra genetiky a molekulární biologie

Sledování minimální zbytkové choroby u pacientů s akutní myeloidní leukémií Diplomová práce

Brno 2005

Vlasta Čejnová

Ráda bych poděkovala především vedoucí své diplomové práce Mgr. Jitce

Berkovcové, Ph.D. za zadání zajímavého tématu a za odborné vedení a cenné rady při jeho zpracování. Mé poděkování patří také celému kolektivu Centra molekulární biologie a genové terapie za vytvoření přátelské atmosféry a spolupráci, zvláště pak Bc. Janě Vojtové za zpracování sekvenací. studia.

Dále bych chtěla poděkovat celé své rodině a přátelům za podporu a trpělivost během

SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK

názvy genů jsou psány velkými písmeny, názvy proteinů malými písmeny s prvním písmenem velkým ABL – Abelson

AL – acute leukemia (akutní leukémie)

AML – acute myeloid leukemia (akutní myeloidní leukémie) AML1 – acute myeloid leukemia 1

AML M0 – akutní leukémie s minimálními známkami myeloidní diferenciace AML M1 – akutní myeloidní leukémie bez vyzrávání AML M2 – akutní myeloidní leukémie s vyzráváním

AML M3 – akutní myeloidní leukémie promyelocytární AML M4 – akutní myelomonocytární leukémie

AML M4Eo – akutní myeloidní leukémie s abnormálními eosinofily AML M5 – akutní monocytární leukémie

ALL – acute lymphoid leukemia (akutní lymfoidní leukémie)

APL – acute promyelocytic leukemia (akutní promyelocytární leukémie) ATRA – all-trans retinoic acid

bcr – breakpoint cluster region

BM – bone marrow (kostní dřeň) B2M – beta-2-microglobulin bp – pár bází

CBF – core binding factor

CBFβ - core binding factor β subunit

Cbp – creb binding protein

cDNA – complementary DNA (komplementární DNA) CL – chronic leukemia (chronická leukémie)

CMBGT – Centrum molekulární biologie a genové terapie CR – complete remission (kompletní remise) CT – cycle threshold (hranice detekce)

DNA – deoxyribonucleic acid (deoxyribonukleová kyselina) EAC – Europe Against Cancer program

EDTA – etylendiamintetraoctová kyselina

ETO – eight twenty one

FAB – French-American-British klasifikace užívaná u AML GUS – beta-glucuronidase

HLA – Human Leukocyte Antigens

Ig – immunoglobulin (imunoglobulin)

IHOK – Interní hematoonkologická klinika inv – inversion (inverze)

IPTG – isopropyl-β-D-thiogalaktosid

K – pozitivní kontrola (při popisu obrázků) kb – kilo báze (1000 párů bází)

M – delkový (hmotnostní) standard (marker); (při popisu obrázků) MLL – mixed lineage leukemia; myeloid/lymphoid leukemia MYH11 – myosin heavy chain 11

OS – overall survival (celkové přežití) PB – peripheral blood (periferní krev)

PBSC –peripheral blood stem cells (kmenové buňky periferní krve) PCR – polymerase chain reaction (polymerázová řetězová reakce) PML – promyelocytic leukemia

RARα – retinoic acid receptor-α

RFS – relaps free survival (období bez relapsu)

Rn – normalized fluorescence (normalizovaná fluorescence)

RNA – ribonucleic acid (ribonukleová kyselina)

RT-PCR – reverse transcriptase PCR (reverzně transkripční PCR)

RQ RT-PCR – real-time quantitative RT-PCR (real-time kvantitativní RT-PCR) SET – Su(var)3-9, Enhacer of zeste, Trithorax t – translocation (translokace) TBE – Tris-borát-EDTA pufr TCR – T cell receptors

TF – transcription factor (transkripční faktor) Trx-G – Trithorax group

UV – ultra violet (ultrafialové světlo) WHO – World Health Organisation WT1 - Wilm΄s tumour

X-Gal – 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galaktosid

OBSAH

1. ÚVOD A PROBLEMATIKA ……………………………………………….…………….1 1.1. Leukémie ………………………………………………………………………………….1 1.2. Klasifikace akutní myeloidní leukémie (AML) ...………………………………………...2

1.2. Terapie AML ……………………………………………………………………………...3 1.4. Molekulární markery u AML ……………………………………………………………..4 1.5. Molekulární podstata AML ……………………………………………………………….5 1.5.1. Fúzní gen PML/RARα ………………………………………………………………….5 1.5.2. Fúzní gen AML1/ETO a CBFβ/MYH11 ……………………………………………….7

1.5.3. Fúzní geny s genem MLL ……………………………………………………………..10 1.6. Minimální zbytková choroba ……………………………………………………………11 1.7. RQ PCR („real-time“ PCR) ……………………………………………………………..13

1.8. Cíle diplomové práce …………………………………………………………………....16

2. MATERIÁL A METODY ……………………………………………………………….17 2.1. Přístroje ………………………………………………………………………………….17

2.2. Biologický materiál ……………………………………………………………………...18 2.3. Metodika ………………………………………………………………………………...18

2.3.1. Záchyt onemocnění ……………………………………………………………………18

2.3.1.1. Izolace leukocytů osmotickou lýzou ………………………………………………...18

2.3.1.2. Izolace RNA z leukocytů a měření její koncentrace ………………………………...19

2.3.1.3. Reverzní transkripce (RT) …………………………………………………………...19

2.3.1.4. Polymerázová řetězová reakce (PCR) ……………………………………………….20 2.3.1.4.1. Detekce fúzního genu PML/RARα ………………………………………………..21 2.3.1.4.2. Detekce fúzního genu AML/ETO a CBFβ/MYH11 ………………………………22 2.3.1.4.3. Detekce fúzních genů s genem MLL ……………………………………………...22

2.3.1.5. Elektroforéza na agarázovém gelu …………………………………………………..23 2.3.2. Minimální zbytková choroba ………………………………………………………….24 2.3.2.1. Sledování zbytkové choroby u fúzního genu PML/RARα ………………………….24

2.3.2.2. Sledování zbytkové choroby u fúzního genu AML1/ETO, CBFβ/MYH11 a fúzních genů s genem MLL …………………………………………………………………………..25

2.3.3. Příprava standardní DNA ……..…………………………………………………….....27

2.3.3.1. Amplifikace PCR produktu ….…………….………………………………………...28

2.3.3.2. Izolace a purifikace PCR produktu …………………..……………………………...28 2.3.3.3. pCR®2.1. vektor .…………………………………..………………………………...28

2.3.3.4. Ligace ……………………...………………………………………………………...29

2.3.3.5. Transformace ………………………...………………………………………………29 2.3.3.6. Analýza bakteriálních kolonií ……………..………………………………………...29

2.3.3.7. Izolace plazmidové DNA …………………………….……………………………...30

2.3.4. Sekvenování …………………………………………………………………………...30

2.3.4.1. Sekvenační reakce ……………...……………………………………………………30

2.3.4.2. Purifikace produktu sekvenační reakce ……………………………………………...31 3. VÝSLEDKY ……………………………………………………………………………...32

3.1. Záchyt onemocnění ……………………………………………………………………...32

3.1.1. Detekce fúzního genu PML/RARα …………………………………………………....32 3.1.2. Detekce fúzního genu AML1/ETO a CBFβ/MYH11 ………………………………....34 3.1.3. Detekce fúzních genů s genem MLL ………………………………………………….36 3.2. Minimální zbytková choroba …………………………………………………………....38

3.2.1. Sledování minimální zbytové choroby u fúzního genu PML/RARα ……………….....38 3.2.2. Sledování zbytkové choroby u fúzních genů AML1/ETO, CBFβ/MYH11 a fúzních genů

s genem MLL ……….…………………………………………………………………….….41

3.2.2.1. Monitorování pacienta č. 1 …………………………………………………………..41

3.2.2.2. Monitorování pacienta č. 2 …………………………………………………………..41 3.2.2.3. Monitorování pacienta č. 3 …………………………………………………………..42

3.2.2.4. Monitorování pacientky č. 4 ………………………………………………………....44 3.2.2.5. Monitorování pacienta č. 5 …………………………………………………………..44

3.2.2.6. Monitorování pacienta č. 6 …………………………………………………………..45 3.2.2.7. Monitorování pacienta č. 7 …………………………………………………………..45

3.2.2.8. Monitorování pacientky č. 8 ………………………………………………………....47 3.2.2.9. Monitorování pacientky č. 9 ………………………………………………………....47

3.2.2.10. Monitorování pacientky č. 10 ……………………………………………………....48

3.2.2.11. Monitorování pacientky č. 11 ……………………………………………………....48 3.2.2.12. Monitorování pacienta č. 12 ………………………………………………………..50

3.2.2.13. Monitorování pacientky č. 13 ……………………………………………………....50 3.2.2.14. Monitorování pacienta č. 14 ………………………………………………………..51

3.2.2.15. Monitorování pacientky č. 15 ……………………………………………………....51 3.2.2.16. Monitorování pacientky č. 16 ……………………………………………………....52

3.2.2.17. Monitorování pacienta č. 17 ……………………………………………………….52

3.3. Sekvenování ……………………………………………………………………………..53

4. DISKUZE …………………………………………………………………………………54 4.1. Detekce fúzního genu PML/RARα ……………………………………………………...54 4.2. Detekce fúzního genu AML1/ETO a CBFβ/MYH11 …………………………………...55 4.3. Detekce fúzních genů s genem MLL ……………………………………………………56 4.4. Minimální zbytková choroba ……………………………………………………………56 4.4.1. Sledování zbytkové choroby u fúzního genu PML/RARα ……………………………57

4.4.2. Sledování zbytkové choroby u fúzního genu AML1/ETO, CBFβ/MYH11 a fúzních genů s genem MLL ……………………………..………………………………………………….57

5. ZÁVĚR ……………………………………………………………………………………59 6. SUMMARY ………………………………………………………………………………60

7. LITERATURA …………………………………………………………………………...61

8. SEZNAM PŘÍLOH ………………………………………………………………………67

1. ÚVOD A PROBLEMATIKA

1.1. Leukémie

Leukémie

patří

do

skupiny

maligních

hematoonkologických

onemocnění

s nekontrolovanou proliferací a expanzí hematopoetických buněk, které ztratily schopnost normální diferenciace do zralých krevních buněk. Od jiných nádorových onemocnění se liší

tím, že patří mezi onemocnění systémová, která postihují kmenové krvetvorné buňky (Krahulcová aj., 1994; Lexová aj., 2000), (obr. 1).

Obr. 1: Schéma hematopoézy znázorňující diferenciaci multipotentní kmenové buňky přes

hematopoetické prekurzory až po zralé krevní buňky a působení cytokinů na jednotlivých úrovních diferenciace (převzato Naeim, 2001).

Soudí se, že patologický proces je zahájen transformací (mutací) v jediné (nejvýše

několika) hematopoetické buňce, z níž se poté formuje leukemický klon. Hlavním defektem

patologické buněčné populace je maturační a diferenciační porucha, nikoliv rychlá

a nadměrná proliferace, jak se usuzovalo v minulosti. Na transformaci kmenové buňky se podílí více faktorů. Proto mluvíme o multifaktoriální etiologii leukémie (Krahulcová aj.,

1994; Lexová aj., 2000). Leukemické buňky mohou vykazovat určitou selekční výhodu oproti normálním buňkám, například jsou nezávislé na vnějších růstových faktorech a mají delší

životnost v důsledku poruchy apoptózy. Nezralé hematopoetické buňky se hromadí v kostní 1

dřeni a dalších krvetvorných orgánech a tím se snižuje normální krvetvorba a následně imunita organismu.

Leukémie se klasifikují podle buňky postižené leukemickou transformací. Může to být

myeloidní prekurzorová buňka, či lymfoidní prekurzor anebo buňka, která je schopna diferenciace do obou tzn. myeloidní i lymfoidní linie (Krahulcová aj., 1994; Lexová aj.,

2000). Kmenová buňka pro myeloidní linii se může diferencovat různým směrem

a v konečném stádiu dát vznik erytrocytům, granulocytům, monocytům a trombocytům. Z kmenové buňky lymfoidní linie vznikají postupnou diferenciací v thymu, uzlinách a slezině

lymfocyty T a B. Oba typy kmenových buněk vznikají ze společného prekurzoru, kterým je pluripotentní kmenová buňka (Klener, 2003).

Dále se leukémie klinicky dělí na akutní a chronické. Průběh akutních leukémií (AL)

je rychlejší, pokud nejsou léčeny, vedou ke smrti během týdnů až měsíců. U neléčených chronických leukémií (CL) je průběh zpočátku mírnější a doba přežití je delší, řádově měsíce až roky (Krahulcová, aj. 1994; Lexová aj., 2000).

1.2. Klasifikace akutní myeloidní leukémie (AML)

AML představují heterogenní skupinu maligních hematologických onemocnění

s maximem incidence u dospělých (Wingo aj., 1995). Klasifikace je důležitá pro stanovení prognózy a léčebného postupu (Krahulcová aj., 1994; Lexová aj., 2000).

FAB (French-American-British) klasifikace, poprvé publikovaná kooperativní

skupinou francouzsko americko britských hematologů v roce 1976, je v praxi stále používána. Tato klasifikace je založena především na morfologickém hodnocení myelogramu a diferenciálního krevního obrazu. Tato vyšetření se doplňují o speciální cytochemická vyšetření umožňující klasifikaci blastů (nezralé buňky obsahující granula). FAB klasifikace je

od roku 1999 užívaná v současné podobě a definuje několik subtypů AML, označovaných písmenem M a číslem (M0-M7), (Krahulcová aj., 1994; Lexová aj., 2000).

V roce 1997 byla navržena dle WHO (World Health Organisation) nová klasifikace,

která se snaží o ujednocení klasifikace všech nádorových hematologických onemocnění. Její

definitivní inovované vydání bylo v roce 2001. Tato klasifikace rozděluje AML do čtyř hlavních skupin: s rekurentními cytogenetickými abnormalitami, s multilineární dysplázií, spojená s předchozí léčbou a ostatní typy AML (Schoch aj., 2003). Všechny skupiny mají

dobrou vnitřní homogenitu kromě podskupiny s 11q23 (MLL) abnormalitami. U WHO

2

klasifikace AML je kladen mnohem větší důraz na cytogenetické a molekulárně genetické nálezy, jež mají prognostický význam.

1.3. Terapie AML

Současná strategie léčebné terapie AML je založena na úvodní, tzv. indukční terapii

a na terapii postremisní (Mayer, 1999).

Cílem indukční terapie je navodit kompletní remisi (complete remission, CR)

onemocnění, to znamená zmenšit leukemickou populaci až pod hranici morfologického

stanovení a dosáhnout regenerace fyziologické krvetvorby a normalizace krevního postupu. Podle metody detekce leukemických buněk hovoříme o klinické, hematologické, cytogenetické a molekulární remisi (Mayer a Starý, 2002).

Postremisní terapie má zajistit kvalitu remise a zabránit relapsu, tedy opětovné

progresi onemocnění. Zdrojem relapsů jsou zbytkové leukemické buňky, které přežívají po terapii nebo perzistují po předtransplantační přípravě. Podobně jako o remisi můžeme

hovořit o klinickém, hematologickém, cytogenetickém a molekulárním relapsu (Mayer a Starý, 2002).

Postremisní terapie obnáší tzv. konsolidační terapii, při níž nemocný dostává

konvenční chemoterapii, případně vysokodávkovanou chemoterapii s autologní či allogenní

transplantací kostní dřeně nebo kmenových buněk získaných z periferní krve (peripheral

blood stem cells, PBSC). Součástí postremisní terapie může ale být i déletrvající cytostatická

udržovací terapie, zpravidla nízkými dávkami cytostatik. Během léčby je nutné velmi šetrně balancovat mezi dvěma nebezpečími: málo intenzivní terapie sice nemá tolik vedlejších

efektů, ale je také méně účinná a ve svém důsledku vede k nižšímu procentu vyléčených; intenzivnější terapie s sebou zase nese riziko závažnějších vedlejších účinků a úmrtí nemocného na komplikace terapie (Mayer, 1999).

Z hlediska léčebného postupu je třeba vyčlenit akutní promyelocytární leukémii

(APL), jež je léčena odlišně od ostatních typů (viz. kap. 1.5.1.).

Pravděpodobnost navození CR se u dospělých nemocných pohybuje mezi 70-80%.

Podobně vysoká je však také pravděpodobnost relapsu (60-70%), (Černý aj., 2003). 75% AML pacientů starších šedesáti let přitom vykazuje velmi slabou odpověď na léčbu (Stone, 2002).

3

1.4. Molekulární markery u AML

Fúzní geny, které jsou výsledkem cytogenetických abnormalit zodpovědných za vznik

některých subtypů leukémií, jsou označovány jako molekulární markery (obr. 2). Tyto diagnosticky významné geny se vyskytují přibližně u 30% pacientů s AML (Giles aj., 2002).

Význačně se podílí na maligní transformaci buňky a mohou po přenosu do hematopoetických buněk transgenních zvířat vyvolat leukemická onemocnění podobná např. APL.

Přítomnost některých fúzních genů nebo jejich mutací v leukemických buňkách má

výrazný vliv na prognózu onemocnění. Mezi prognosticky příznivé faktory patří fúzní gen AML1/ETO, který se vyskytuje u 20-40% případů AML M2 a fúzní gen CBFβ/MYH11, jenž

je přítomný přibližně u 10% AML (van Dongen aj., 1999). Naproti tomu např. abnormality MLL genu představují prognostický faktor nepříznivý.

Bylo též zjištěno, že u AML pacientů s normálním karyotypem se nachází

prognostické faktory zahrnující: vnitřní tandemovou duplikaci a bodovou mutaci FLT3 genu,

částečnou tandemovou duplikaci MLL genu, mutaci CEBPα genu a zvýšenou expresi

BAALC genu (Marcucci aj., 2005).

Ve své diplomové práci jsem se zaměřila na detekci fúzních genů PML/RARα,

AML1/ETO, CBFβ/MYH11 a fúzních genů s genem MLL.

Obr. 2: Procentuální zastoupení fúzních genů u AML (převzato Hoffbrand aj., 2001).

4

1.5. Molekulární podstata AML

AML vznikají akumulací několika genetických změn, mezi které řadíme jak aktivaci

protoonkogenů na onkogeny, tak inaktivaci tumor-supresorových genů. Mutace vedoucí k leukemické transformaci, postihují jak signální molekuly signálních drah, tak proteiny

buněčného cyklu, apoptózy či proteiny udržující stabilitu genomu. Vznik AML je většinou asociován s mutacemi onkogenních transkripčních faktorů (TF), (Look, 1997).

1.5.1. Fúzní gen PML/RARα APL

je

charakteristická

expanzí

leukemických

buněk

blokovaných

v promyelocytárním stádiu myelopoézy. Klinickému obrazu dominuje abnormální fibrinolýza

a anémie. APL tvoří asi 10-15% všech případů AML mladších dospělých pacientů (Grimwade, 1999). Podle FAB klasifikace je označována jako AML subtypu M3. Vyskytuje se ve dvou odlišných formách jako klasická hypergranulární varianta a mikrogranulární varianta.

Specifickým molekulárním znakem všech APL jsou molekulární translokace

zahrnující gen pro α receptor kyseliny retinové (RARα) ležící na chromozómu 17q21

(Borrow aj., 1992). Tyto aberace dávají vznik fúzním genům, kde v pozici druhého partnera vedle RARα byla popsána řada dalších genů (obr. 3). Nejčastějším partnerem genu RARα je

gen PML (promyelocytic leukemia) lokalizovaný na chromozomu 15 v oblasti q22 (Melnick a Licht, 1999).

Obr. 3: Možnosti fúze genu RARα s dalšími geny u APL

a odpověď na terapii ATRA (převzato Mayer a Starý, 2002).

5

RARα patří do skupiny jaderných receptorů, které se vyskytují jako regulační faktory

závislé na interakcích s dalšími kofaktory. RARα v nepřítomnosti svých ligandů vytváří

společně s histondeacetylačními proteiny transkripční represorový komplex, který zabraňuje

transkripci genů. Naopak vazba ligandu tento komplex disociuje, dochází k acetylaci histonů a je umožněna transkripce genů. RARα významně ovlivňuje hamatopoézu převážně

myeloidní linie (Melnick a Licht, 1999). Ke zlomu na chromozomu 17 dochází v oblasti intronu 2 (Borrow aj., 1992).

Protein Pml má řadu biologických funkcí. Jsou známé jeho nádor supresorové a pro-

apoptické vlatnosti. V buňkách byla detekována lokalizace proteinu Pml s dalšími proteiny ve

specifických buněčných strukturách, nazývaných jaderná tělíska (nuclear bodies). Jejich počet kolísá během buněčného cyklu (Pacholíková aj., 2002a).

Výsledkem reciproké translokace t(15;17)(q22;q21) je fúzní gen PML/RARα

(případně fúzní gen RARα/PML), který je možno detekovat ve více než 95% všech APL

(Grimwade aj., 1996). Z něho translatovaný fúzní protein PML/RARα má několik funkcí při

leukemické transformaci buňky (Melnick a Licht, 1999). Upevňuje deacetylační komplex

histonů, který vede ke změně konformace chromatinu a zamezení transkripce genů (Slack

a Rusiniak, 2000). Při hematopoéze blokuje koncovou diferenciaci promyelocytárních buněk a současně s tím vede k jejich hyperproliferaci prostřednictvím deregulace mitotických signálních drah (Faretta aj., 2001). Tvoří heterodimery s wild-type Pml i RARα proteiny a tím

inhibuje jejich vlastní funkce. Díky zachované ligand-vazebné doméně RARα u fúzního

proteinu je zajištěna buněčná odpověď na retinoidy u patologických promyelocytů. Této

vlastnosti je využíváno při lěčbě APL aplikací ATRA (all-trans retinoic acid) u pacientů

(Pacholíková aj., 2002a). ATRA navozuje degradaci abnormálního receptoru kódovaného fúzním genem PML/RARα a umožňuje vyzrávání patologických

promyelocytů a jejich

apoptózu (Lo Coco aj., 1998; Pacholíková aj., 2002b). Po její aplikaci se předpokládá zrestaurování jaderných tělísek (Zhong aj., 2000).

V oblasti genu PML na chromozomu 15 byla popsána tři zlomová místa: v intronu 3,

intronu 6 a exonu 6 (Grimwade aj., 1996), (obr. 4). Díky těmto zlomům vznikají také různé

formy fúzního genu PML/RARα. Nejčastější variantou, vyskytující se téměř u 55% pacientů s detekovaným fúzním genem PML/RARα, je tzv. dlouhá forma (long form), vznikající

zlomem v intronu 6 (bcr 1 = breakpoint cluster region 1). Druhou nejvíce zastoupenou (asi

u 35% pacientů) variantou je tzv. krátká forma (short form), která je podmíněna zlomem

v intronu 3 (bcr 3 = breakpoint cluster region 3). Nejméně častá je variabilní forma (variable

form), při níž dochází ke zlomu genu PML v oblasti exonu 6 (bcr 2 = breakpoint cluster

6

region 2), (Lo Coco aj., 2003). Pokud je přítomna dlouhá nebo variabilní forma fúzního genu

PML/RARα, můžeme detekovat více rozdílných izoforem, které jsou produktem

alternativního sestřihu exonů genu PML zachovaného u fúzního genu PML/RARα (Pacholíková aj., 2002b).

Obr. 4: Schématické znázornění různých variant fúzního genu PML/RARα. Šipky

indikují přibližnou lokalizaci primerů pro

amplifikaci tohoto fúzního genu (převzato Lo Coco aj., 2003).

Fúzní gen PML/RARα patří mezi důležité molekulární markery a pro pacienty s APL

znamená velmi dobrou prognózu. Jeho detekce vycházející z transkriptů PML/RARα genu

metodou reverzně transkripční polymerázové řetězové reakce (RT-PCR) má zásadní význam

pro nasazení odpovídající terapie, sledování zbytkové choroby a život pacienta (Pacholíková aj., 2002b).

1.5.2. Fúzní gen AML1/ETO a CBFβ/MYH11

Translokace t(8;21)(q22;q22) byla popsána jako první rekurentní translokace u AML

Rowleyovou v roce 1973 (Michaud aj., 2003). Je to jedna z nejčastějších chromozomálních abnormalit vyskytující se přibližně u 20% dospělých případů a 40% dětských případů AML subtypu M2. Pacienti s t(8;21) mají relativně dobrou prognózu (Tobal aj., 2000).

Při této translokaci dochází k fúzi genu AML1 (synonyma CBFα, PEBPα2, RUNX1)

lokalizovaném na chromozomu 21 s genem ETO (eight twenty one, synonymum MTG8) z chromozomu 8 (Viehmann aj., 2003), (obr. 5). Fúzní gen AML1/ETO (lokalizován na 8q22) lze velmi dobře detekovat molekulárně geneticky i cytogeneticky.

Gen AML1 (acute myeloid leukemia 1) kóduje heterodimerický TF CBF (core binding

factor) nezbytný pro normální hematopoézu, zatímco funkce genu ETO je stále neznámá (Buonamici aj., 2004). CBF sestává ze dvou částí: α podjednotky (CBFα), která se váže přímo

7

na DNA a β podjednotky (CBFβ), která tvoří s podjednotkou α komplex, ale sama se na DNA neváže.

Gen AML1 je dlouhý přibližně 260 kb a skládá se ze 12 exonů. Aml1 protein obsahuje

vysoce evolučně konzervativní doménu zvanou runt doména. Runt doména je tvořena 128 aminokyselinami a má sekvenční homologii u Drosophily melanogaster (Michaud aj., 2003).

Gen AML1 reguluje za fyziologických podmínek expresi celé řady genů specifických

pro jednotlivé linie hematopoetických prekurzorů jako je například myeloperoxidáza, interleukin 3 a TCR β (T cell receptors β) geny (Roumier aj., 2003). Je rovněž nezbytný

v procesu normální krvetvorby v průběhu fetálního vývoje. Při translokaci t(8;21) je jeho

fyziologická funkce, kterou sehrává v procesu diferenciace myeloidních buněk, dominantně potlačena fúzním genem AML1/ETO. Gen AML1 hraje jednu z hlavních rolí při regulaci

buněčné proliferace a diferenciace. Má také vliv na buněčný cyklus a apoptózu (Michaud aj., 2003).

Obr. 5: (a) Schématické znázornění

exonů a intronů genů AML1 a ETO, kteří

se

podílejí

na

translokaci

t(8;21)(q22;q22). Centromera (cen),

telomera

(tel),

číslo

exonu

a odpovídající zlomové oblasti jsou vyznačeny.

(b) Schématické znázornění fúzního genu

AML1/ETO,

který

je

výsledkem fúze exonu 5 genu AML1 s exonem 2 genu ETO. Šipky indikují lokalizaci

amplifikaci

5

primerů

tohoto

pro

fúzního

(převzato van Dongen aj., 1999).

PCR

genu

Fúzní gen CBFβ/MYH11 se nějčastěji vyskytuje u AML s abnormálními eosinofily

(M4Eo) jako výsledek inverze chromozomu 16 inv(16)(p13;q22) nebo translokace

t(16;16)(p13;q22). Tento fúzní gen je cytogeneticky obvykle obtížně diagnostikovaný, zatímco na molekulární úrovni jej lze dobře identifikovat pomocí RT-PCR (Kadkol aj., 2004).

8

Fúzní gen CBFβ/MYH11 vzniká na základě fúze genu CBFβ (core binding factor β

subunit, 16q22) s genem MYH11 (myosin heavy chain 11, 16p13), (Claxton aj., 1994), (obr. 6).

Gen CBFβ je podobně jako gen AML1 nezbytný pro normální fetální krvetvorbu.

CBFβ je exprimován v hematopoetických kmenových buňkách, megakaryocytech, ve všech myeloidních buňkách a T lymfocytech, zatímco jeho exprese v B lymfocytech klesá s jejich

diferenciací. Jediné hematopoetické buňky, které neexprimují gen CBFβ, jsou erytrocyty (Kundu aj., 2002). Gen MYH11 je dlouhý přibližně 37 kb a skládá se z 21 exonů. 5´ oblast genu MYH11 často deletuje během procesu inverze (van Dongen aj., 1999).

Bylo popsáno několik různých typů fúzního genu CBFβ/MYH11. Více než 85%

pozitivních pacientů má typ A tohoto fúzního genu. Další dva typy (typ D a E) se vyskytují

v 5% případů. Všechny ostatní typy tohoto fúzního genu byly popsány jako vzácné (obr. 6). Jakákoliv změna chromozomu 16 je v zásadě spojena s dobrou prognózou (van Dongen aj., 1999).

Obr. 6: (a) Schématické znázornění exonů a intronů genu MYH11,

který se podílí na inv(16)(p13;q22).

Centromera (cen), telomera (tel), číslo exonu a odpovídající zlomová oblast jsou vyznačeny.

(b) Schématické znázornění 10 různých

typů

fúzního

genu

CBFβ/MYH11 a jejich procentuální zastoupení.

Šipky

indikují

lokalizaci 7 primerů pro PCR amplifikaci tohoto fúzního genu (převzato van Dongen aj., 1999).

1.5.3. Fúzní geny s genem MLL 9

Gen MLL (synonyma Hrx/Htrx/ALL-1) je lokalizován na 11. chromozomu v oblasti

11q23, je přibližně 90 kb dlouhý a skládá se ze 36 exonů. Název MLL (mixed lineage

leukemia či myeloid/lymphoid leukemia) vznikl vzhledem k výskytu translokací tohoto genu u AL myeloidní i lymfoidní linie. Právě translokace s účastí MLL genu a mnoha různých

fúzních partnerů jsou nejdéle známými přestavbami tohoto genu. Nejčastější jsou u dětských

AL a sekundárních leukémií, které se mohou rozvinout po terapii inhibitory topoizomerázy II, užívaných při léčbě jiných malignit. Pacienti s 11q23 přestavbou tvoří specifickou skupinu AL se špatnou prognózou (Cimino aj., 1998).

MLL gen obsahuje několik regionů se sekvenční homologií k Trithorax genu

kódujícímu epigenetický TF u D. melanogaster (Gu aj., 1992; Tkachuk aj., 1992). Tyto homologie vedou k předpokladu, že MLL gen kóduje TF kontrolující vývoj a diferenciaci

lidských buněk (Cimino aj., 1998). Produkty obou genů patří do skupiny „Trithorax-group“ (Trx-G) proteinů, které udržují expresi HOX homeotických genů během embryonálního vývoje a hematopoézy. MLL je exprimován v mnoha tkáních – například v mozku, tračníku,

játrech,

slezině,

brzlíku,

a varlatech (Butler aj., 1997).

tonsilách,

ledvinách,

srdci,

štítné

žláze,

plicích

Specifické skupiny HOX homeotických genů regulují diferenciaci u různých

hematopoetických linií (Lawrence a Largman, 1992). Podle Milne aj., 2002 je Mll protein

schopen regulovat HOX geny přímou vazbou na jejich promotory. Přestavby MLL genu

vedou díky deregulaci exprese HOX genů ke globální transkripční deregulaci hematopoetické buňky a následně k poruchám diferenciace a leukemogenezi. Proto patří MLL gen k nejdůležitějším leukemogenním genům (Look, 1997).

MLL gen kóduje protein s několika funčními doménami (obr. 7).

Obr. 7: Schéma MLL proteinových domén. DNMT-represivní doméma homologní

s vazebnými motivy DNA metyltransferázy I, TA-transaktivační doména, SET (Su(var)3-9, Enhacer of zeste, Trithorax), AT hook-AT háčky (převzato Hsieh aj., 2003).

10

Na N-konci se nachází 3 AT háčky, vážící menší žlábek DNA (Tkachuk aj., 1992)

a kooperující s dalšími DNA vazebnými aktivitami při změně struktury DNA. Tím mohou usnadnit interakce s TF. V této oblasti se nachází i represivní doména obsahující sekvenci,

která je homologní s vazebnými motivy represivní domény DNA metyltransferázy I a která váže nemetylované CpG sekvence a tím potlačuje transkripci (Birke aj., 2002).

Na karboxylovém konci se nachází SET doména (Su(var)3-9, Enhacer of zeste,

Trithorax protein D. melanogaster) a transaktivační doména, která váže přímo

histonacetyltransferázu Cbp (creb binding protein). Předpokládá se, že vazba Cbp je nezbytná

pro aktivaci MLL cílových genů (Ernst aj., 2001). Proteiny obsahující SET doménu spojují

epigenetickou regulaci se signálními drahami účastnícími se růstu a diferenciace (Cui aj., 1998).

MLL je promiskuitní gen, který fúzuje s mnoha fúzními partnery. Zatím bylo

identifikováno více než třicet MLL fúzních partnerů, jejich funkce však ve většině případů

není známa (Ayton a Cleary, 2001). MLL gen může být změněn translokací, částečnou tandemovou duplikací, amplifikací (Felix aj., 1998), vmezeřenou delecí nebo dvouřetězcovým zlomem.

Translokace 11q23 zahrnují přes 60 různých míst na partnerských chromozomech,

z toho nejméně 33 již bylo naklonováno a analyzováno na molekulární úrovni (Drexler aj., 2004). Fúzní partneři MLL genu za normálních okolností kódují jaderné TF a signální

molekuly lokalizované v cytoplazmě nebo buněčných spojích (Ayton a Cleary, 2001). U

AML

jsou

t(9;11)(p22;q23)

nějčastější

(MLL/AF9),

translokace

t(6;11)(q27;q23)

t(10;11)(p12;q23)

(MLL/ELL nebo MLL/ENL), (Strout aj., 1999).

(fúzní

(MLL/AF10)

a

gen

MLL/AF6),

t(11;19)(q23;p13)

Určení prognostického významu abnormalit MLL genu a možnosti jejich využití

při sledování zbytkové choroby umožní efektivnější léčbu pacientů s AL.

1.6. Minimální zbytková choroba

U hematoonkologických pacientů lze dosáhnout s vysokou pravděpodobností CR,

dochází však také ve vysokém procentu k návratu nemoci, tj. relapsu. Relapsy jsou ve své

konečné fázi nejčastější příčinou selhání protinádorové terapie. Předpokládá se, že k rekurenci onkologických onemocnění přispívají reziduální maligní buňky (Černý aj., 2003).

Pacienti s AML mohou mít v čase diagnózy celkově přibližně 1012 maligních buněk.

Onemocnění je v CR, když je v kostní dřeni (bone marrow, BM) morfologicky detekováno 11

méně než 5% maligních buněk. Tito pacienti však stále přechovávají až 1010 leukemických buněk (Michálek a Šmarda, 2000; Liu Yin, 2002).

Populace leukemických buněk, která již není detekovatelná běžnými morfologickými

metodami se označuje jako minimální zbytková choroba. Během posledních 20 let bylo

vynaloženo obrovské úsilí v popisu a charakterizaci zbytkových leukemických buněk co se týče prognózy a terapie (Michálek a Šmarda, 2000). Mnoho studií ukazuje, že stanovení

zbytkové choroby signifikantně koreluje s klinickými výsledky u řady hematologických malignit (van der Velden aj., 2003).

V současnosti jsou pro detekci zbytkové choroby používány tři odlišné techniky,

jejichž citlivost je nejméně 10-3 (mohou detekovat 1 leukemickou buňku mezi 103 buňkami

normálními). Jsou to: průtoková cytometrická imunofenotypizace, která je založena

na detekci abnormálních nebo neobvyklých fenotypů; RT-PCR analýza fúzních genů chromozomových aberací a PCR analýza pacient specifických přestaveb imunoglobulinových (Ig) a TCR genů (van Dongen aj., 1999; Gabert aj., 2003; van der Velden aj., 2003). U AML

lze použít pouze první dvě techniky, jelikož většina pacientů postrádá přestavby Ig a TCR genů (Campana, 2003).

Kvantitativní data pro zbytkovou chorobu mohou být získána „real-time“ kvantitativní

PCR (RQ PCR) analýzou fúzních genů asociovaných s chromozomálními abnormalitami.

Pro tento účel byly v rámci programu Europe Against Cancer (EAC) vyvinuty sekvence

primerů a prób. Byly též vybrány tři kontrolní geny (Abelson, ABL; beta-2-microglobulin, B2M a beta-glucuronidase, GUS) na základě jejich vhodnosti pro studie zbytkové choroby

u leukemických pacientů (Beillard aj., 2003; Gabert aj., 2003; van der Velden aj., 2004).

Protože jen okolo 30% případů AML má vhodný fúzní gen (nejčastěji frekventovaný

je PML/RARα, AML1/ETO, CBFβ/MYH11), je potřeba u pacientů s AML identifikovat

alternativní cílové geny, které budou exprimovány v dostatečné míře. Takovým markerem je gen Wilmsova tumoru (Wilm΄s tumour, WT1), jenž je nadměrně exprimován přibližně

u 90% AML pacientů (Liu Yin, 2002). Nicméně WT1 je exprimován i progenitory normální hematopoézy a někteří výzkumníci ho nepovažují za spolehlivý (Campana, 2003).

Monitorování zbytkové choroby se provádí v průběhu léčby a po ukončení terapie

v pravidelných intervalech podle léčebných protokolů. Materiálem vhodným k jejímu stanovení je u leukémií BM a periferní krev (peripheral blood, PB).

Práce publikované v první polovině devadesátých let nepřinesly zcela jasnou odpověď

na význam zbytkové choroby u AML. Při stabilním množství zbytkové choroby zachycené v průběhu CR nemusí u nemocných dojít k relapsu ani při opakované PCR pozitivitě (Černý

12

aj., 2003). To platí zejména pro AML M2 s fúzním genem AML1/ETO, který perzistuje i po více než 5 letech trvání hematologické remise (Campana, 2003). Naproti tomu u APL je

pozitivita zjištěná pomocí RT-PCR spojená s vysokým rizikem relapsu (Grimwade, 1999; Černý aj., 2003). Stejně tak varující je i trvalý nárůst molekulárního markeru, jenž může být spojen s pozdějším návratem onemocnění (Černý aj., 2003).

Mnoho studií bylo uskutečněno i u AML s fúzním genem CBFβ/MYH11. Pacienti,

kteří v průběhu remise měli při „real-time“ PCR expresi fúzního transkriptu CBFβ/MYH11

více než 10 kopií, měli významně kratší trvání remise a vyšší riziko relapsu než pacienti s méně než 10 kopiemi tohoto transkriptu (Liu Yin, 2002; Campana, 2003).

Z prací, které byli publikovány nedávno vyplývá, že vyšší hladina zbytkové choroby

u pacientů po indukční a konsolidační terapii koreluje s kratším obdobím bez relapsu (relaps free survival, RFS) a horším celkovým přežítím (overall survival, OS). Stanovení zbytkové

choroby má též mimořádný význam při transplantační terapii. Nejpravděpodobnější příčinou rekurence je perzistence nádorových buněk v organismu, nelze však vyloučit ani podíl infiltrace autologního štěpu (Černý aj., 2003).

Na základě monitorování dynamiky zbytkové choroby je možné u jednotlivých

pacientů předpovědět riziko relapsu onemocnění a zahájit záchrannou léčbu. Nicméně, multicentrické mezinárodní léčebné protokoly pro detekci zbytkové choroby potřebují

pečlivou standardizaci a kontrolu kvality metod použitých k jejímu stanovení (van Dongen aj., 1999; Michálek a Šmarda, 2000; Liu Yin, 2002; Černý aj., 2003).

1.7. RQ PCR („real-time“ PCR)

Nejčastěji používanou metodou pro kvantitativní stanovení DNA nebo RNA

v odebraném materiálu je v současné době RQ PCR. Principem metody je detekce signálu (fluorescence) produkovaného během amplifikace PCR produktu. Bylo vyvinuto několik

fluorescenčních systémů schopných hodnotit množství amplifikovaného produktu v průběhu celé PCR. U leukémií poskytuje nejpřesnější detekci TaqMan systém.

TagMan systém využívá jedné kratší próby fluorescenčně značené na obou koncích

(na 5΄ konci zářič, reporter; na 3΄ konci zhášeč, quencher). Ve výchozích stavu je

fluorescence blízkým zhášečem potlačena. V reasociační (annealing) fázi PCR dojde

k hybridizaci próby k cílovému místu vytvořeného amplifikovaného produktu. Záření je zatím

ještě potlačováno zhášečem. Při následném kroku, při vytvoření nového řetezce (elongaci) postupující Taq (Thermus aquaticus) polymeráza svojí 5΄ exonukleázovou aktivitou nejdříve

13

rozruší komplex próby s cílovou sekvencí DNA. Poté dojde k exonukleázovému rozštěpení TaqMan próby, čímž dojde k ukončení efektu zhášení (obr. 8). Vzniklá fluorescence je měřena na konci této elongační, syntetické fáze PCR (Priglová a Kınig, 2002) fotooptickým

systémem přístroje. Software pak vyhodnocuje zaznamenané hodnoty a sestrojuje amplifikační křivky (obr. 9). 1. Amplifikace

2. Exonukleázová aktivita Tag polymerázy

3. Štěpení fluorescenční próby

Obr. 8: Princip Taqman systému. Základem je

konstrukce specifické próby fluorescenčně značené na obou koncích.

4. Kompletní PCR produkt

Amplifikace standardní DNA

106 105 104 103 102

10

Obr. 9: Znázonění amplifikačních křivek standardní DNA o známém počtu částic, díky kterým je možné kvantifikovat množství vloženého templátu v

neznámých vzorcích.

U vzorků s vyšším počtem kopií je zaznamenán nárůst fluorescence v nižším cyklu jak

u vzorků s menším počtem kopií. Podobné amplifikační křivky jsou sestrojeny i pro neznámé vzorky pacientů.

14

Na základě intenzity fluorescence detekované během prvních 3 - 15 cyklů PCR je

určena threshold. Threshold slouží k výpočtu CT (cycle threshold) u každého vzorku a označuje číslo cyklu, ve kterém fluorescence poprvé překročila threshold. Hodnota CT je inverzně proporcionální k množství cílové sekvence ve vzorku (van der Velden aj., 2003).

Do PCR reakce je přidáván vnitřní referenční fluorochrom pro ověření kontroly

rozdílů fluorescence u vzorků. Fluorescence próby se vypočítává poměrně k fluorescenci

vnitřního referenčního fluorochromu (normalizovaná fluorescence, Rn). Nárůst fluorescence během PCR je vyjádřen jako ∆Rn (van der Velden aj., 2003), (obr.10).

Obr. 10: Amplifikační graf znázorňující situaci s jedním vzorkem a jednou negativní

kontrolou (všechny složky reakce mimo cDNA vzorku). Na ose „y“ je vynesená normalizovaná fluorescence Rn. Hodnota Rn- může být naměřena pouze v případě negativní

kontroly a nebo na začátku samotné RQ PCR reakce, kdy v počátečních cyklech ještě nedošlo k detekovatelnému navýšení emitované fluorescence. Tato hodnota z počátečních cyklů pak definuje baseline. Threshold leží vždy nad baseline (upraveno podle Ginzinger, 2002).

Použití standardů o známém počtu DNA molekul umožňuje vytvořit standardní křivku

(standard curve) a určit množství templátu ve vzorku. Teoretický sklon standardní křivky pro PCR reakci s maximální účinností je -3.32 (Gabert aj., 2003). Nejběžnějším zdrojem

standardní DNA pro známý vzorek cílového genu je plazmid. Standardní křivka je pak založena

na

postupném

ředění

spektrofotometricky (Ginzinger, 2002).

vstupního

množství

plazmidu

kvantifikovaného

15

Pro monitorování zbytkové choroby u leukemických pacientů je využívána RQ RT-

PCR („real-time“ kvantitativní RT-PCR). Ve srovnání se standardní RT-PCR umožňuje RQ

RT-PCR přesnou kvantifikaci genové exprese. Charakteristickým rysem této techniky je

možnost hodnocení kvality a kvantity RNA. Toho je dosaženo paralelní amplifikací cílového genu a jednoho nebo více kontrolních genů, které jsou též označovány jako houskeepingové nebo referenční geny (Beillard aj., 2003). V programu EAC byly vybrány tři kontrolní geny

(ABL, B2M, GUS) mající stabilní expresi u různých typů vzorků. Vzhledem k tomu, že jen u genu ABL nebyla exprese signifikatně rozdílná mezi normálními a leukemickými vzorky,

byl navržen jako kontrolní gen pro RQ RT-PCR detekci u leukemických pacientů (Beillard aj., 2003; Gabert aj., 2003; van der Velden aj., 2004).

Při analýze výsledků RQ RT-PCR se využívá relativní kvantifikace, u níž je

zhodnocením poměr procentuální exprese (neboli absolutních hodnot kopií) mezi cílovým fúzním genem a referenčním genem.

1.8. Cíle diplomové práce •

•

• •

Cíle předkládané diplomové práce jsou následující:

Zvládnutí vybraných molekulárně biologických technik.

Detekce fúzních genů u pacientů s AML kvalitativními metodami.

Sledování minimální zbytkové choroby u pacientů s AML metodou kinetického sledování amplifikace v reálném čase (RQ RT-PCR). Charakterizace fúzních genů s genem MLL.

16

2. MATERIÁL A METODY

Laboratorní práce byly provedeny v Centru molekulární biologie a genové terapie

(CMBGT) při Interní hematoonkologické klinice (IHOK) Fakultní nemocnice Brno.

2.1. Přístroje

Amplifikátor: GeneAmp® PCR System 5700 (Applied Biosystems)

Automatický sekvenátor: ABI PRISMTM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) Centrifuga: Joun BR 4i

Heraus Biofuge 22R Hettich EBA 12R

Dokumentační systém: Ultra-Lum

Elektroforetické aparatury: vertikální: Submarine Mini-gel (Sigma) Fotoaparát: Polaroid DS 34

Mini-Sub-Cell® GT (BIO-RAD)

Hlubokomrazící box: Sanyo Chladnička: Calex

Gorenje

Magnetická míchačka: Variomag Electrocrührer Mono Mikrovlnná trouba: Tescoma

Spektrofotometr: Eppendorf Biophotometer 6131 Sterilní box: Captair®Bio (Erlab)

Juan MSC9 (Biotech)

Termocykler: Biometra T3 Thermocycler

PTC-200 Peltier Thermal Cycler (MJ Research)

Termostat: Juan IG150

Třepačka: Wather bath shaker type 357 (Elpan) UV transluminátor: EBCS-40E (Ultra-Lum) Váhy: Denver Instrument XL-410D Vodní lázeň: OMNI-BIO Brno Vortex: TechoKartell TK3S

Zdroj elektrického proudu: POWER PAC 300 (BIO-RAD) 17

2.2. Biologický materiál

Výchozím materiálem pro vyšetření bylo 5 – 10 ml nesrážlivé PB a 2 – 5 ml aspirátu

BM pacientů s AML. Vzorky byly odebírány pacientům při záchytu onemocnění a následně

pacientům podstupujícím indukční chemoterapii v pravidelných měsíčních intervalech

dle terapeutického protokolu IHOK. PB i BM byly nabírány do odběrových zkumavek s přídavkem ethylendiamintetraoctové kyseliny (EDTA). Všechny vzorky byly dodány do laboratoře maximálně do 3h po odběru.

2.3. Metodika

2.3.1. Záchyt onemocnění

Po izolaci RNA z buněk PB nebo BM a změření její koncentrace byla RNA přepsána

reverzní transkriptázou do cDNA. Při následné PCR byl detekován příslušní typ fúzního genu charakteristický pro konkrétní onemocnění. PCR produkt byl následně vizualizován pomocí gelové elektroforézy.

2.3.1.1. Izolace leukocytů osmotickou lýzou Materiál:

- 10x koncentrovaný lyzační pufr (1,55M NH4Cl, 0,1M NH4HCO3, 1mM EDTA) - fyziologický roztok (0,9% NaCl) Postup:

1) Vzorek krve přemístit do plastové centrifugační kyvety, naředit 1x koncentrovaným lyzačním pufrem v poměru 1 : 4, resuspendovat pipetou.

2) Inkubovat 30 – 40 minut v ledové lázni.

3) Vychladit centrifugu na 10˚C, centrifugovat 20 minut při 690 rcf. Supernatant vylít.

4) Sediment resuspendovat v 5 ml vychlazeného lyzačního pufru, přenést do sterilní 10-ml zkumavky.

5) Centrifugovat při 380 rcf po dobu 5 minut. Odstranit supernatant.

6) Opakovat kroky 4 a 5, dokud nezůstane nažloutlý sediment propraných buněk.

18

7) Sediment resuspendovat v 5 ml fyziologického roztoku, centrifugovat 5 minut při 380 rcf.

8) Odstranit supernatant, sediment přenést do 1,5-ml zkumavky a centrifugovat 5 minut při 250 rcf.

9) Supernatant vylít, k buňkám přidat 1 ml fyziologického roztoku a rozsuspendovat.

10) Spočítat množství vyizolovaných leukocytů v Bőrkerově komůrce. Vzorec pro výpočet počtu buněk: φ počet leukocytů x 25 (plocha čtverce) x 10 (výška) x koeficient ředění

x 1000 = počet buněk/ml.

2.3.1.2. Izolace RNA z leukocytů a měření její koncentrace

Při izolaci RNA a práci s ní je nutné zabránit kontaminaci ribonukleázami (RNázy),

které by mohly snížit množství RNA nebo ji zcela rozložit.

RNA byla izolována z leukocytů v množství přibližně 107 buněk pomocí kitu RNeasy

Mini Kit (QIAGEN). Vyizolovaná RNA byla uchovávána při teplotě –70˚C.

Stanovení koncentrace a čistoty RNA byla provedeno na spektrofotometru Eppendorf

Biophotometer 6131. Pro čistotu RNA platí poměr: A260 / A280 = 2,0. Optimální koncentrace

RNA by měla být okolo 100 ng/µl.

2.3.1.3. Reverzní transkripce (RT)

Vzorek vyizolované RNA se používá pro syntézu cDNA revezní transkriptázou.

Produkt revezní transkripce pak slouží jako templát pro PCR.

Přibližně 1 µg celkové RNA byl použit pro syntézu cDNA ve 20 µl reakci pomocí

náhodných hexamerů a M-MuLV reverzní transkriptázy. Materiál:

- 10x GOLD-PCR pufr (Applied Biosystems) - 25 mM MgCl2 (Applied Biosystems)

- 10 mM dNTPs (dATP, dTTP, dCTP, dGTP), (Applied Biosystems) - náhodné hexamery (Applied Biosystems) - inhibitor RNáz (Applied Biosystems)

- reverzní transkriptáza (M-MuLV), (Applied Biosystems) - RNA

19

Postup:

1) Připravit reakční směs podle tabulky 1 do jedné zkumavky, protřepat a stočit. Objemy jednotlivých složek násobit počtem vzorků.

2) Rozpipetovat 17 µl reakční směsi do jednotlivých označených PCR mikrozkumavek. 3) Přidat 3 µl vyizolované RNA, stočit.

4) Inkubovat 10 minut při laboratorní teplotě.

5) Vzorky umístit do termocykleru, zvolit příslušný program (viz. příloha 1, tab. 8). 6) Po 20 minutách vzorky vyndat ze cykleru a ihned dát chladit na –20˚C.

Složky reakční směsi

Koncentrace Výchozí

GOLD-PCR pufr

Objem pro jednu reakční směs

Konečná

10x

[µl] 1x

2

1 mM

po 2

1 U/µl

1

MgCl2

25 mM

5 mM

Náhodné hexamery

100 µM

5 µM

Reverzní transkriptáza

50 U/µl

dNTPs

Inhibitor RNáz

RNA (cca 1 µg)

10 mM

20 U/µl

2,5 U/µl

Celkový objem

Tab. 1: Reakční směs pro RT.

4 1 1 3

20

2.3.1.4. Polymerázová řetězová reakce (PCR)

Je metoda pro mnohonásobné namnožení (amplifikaci) specifického úseku DNA

in vitro založená na principu replikace.

5 µl cDNA bylo použito jako výchozí templát pro PCR ve 25 µl reakci.

Materiál:

- 10x GOLD-PCR pufr (Applied Biosystems) - 25 mM MgCl2 (Applied Biosystems) - 10 mM dNTP mix (Roche)

- 100 µM primery (syntéza Generi Biotech), (viz. příloha 2) - cDNA

- destilovaná voda (D.W.)

- AmpliTaq Gold polymeráza (Applied Biosystems)

20

Postup:

1) Připravit reakční směs (viz. tab. 2 – 5) do jedné zkumavky, protřepat a stočit. Objemy jednotlivých složek násobit počtem vzorků.

2) Rozpipetovat 20 µl reakční směsi do jednotlivých předem označených 0,2-ml PCR mikrozkumavek.

3) Přidat 5 µl příslušné cDNA, stočit na mikrocentrifuze.

4) Vzorky umístit do termocykleru, zvolit příslušný program. Program amplifikace pro jednotlivé fúzní geny je uveden v příloze 1, tab. 9 – 12.

2.3.1.4.1. Detekce fúzního genu PML/RARα

Pro detekci fúzního genu PML/RARα při záchytu onemocnění byla použita

jednokolová RT-PCR (Tobal aj., 1998), kdy je cyklicky množena vybraná sekvence

ohraničená párem primerů. Citlivost této metody je přibližně 10-3 – 10-5.

Protože u fúzního genu PML/RARα bylo popsáno více variant, jejichž vznik je

podmíněn různými zlomovými místy v genu PML, bylo nutné pro detekci fúzního genu zavést

více kombinací primerů, které pokrývají všechny varianty.

Každý pacient s podezřením na expresi fúzního genu PML/RARα byl otestován

ve dvou jednokolových PCR s různými kombinacemi primerů (M2 x R8 a M4 x R8). Kontrola

amplifikovatelnosti cDNA byla potvrzena další PCR s primery pro provozní gen FLT3. Použité primery, jejich kombinace a sekvence je uvedena v příloze 2, tab. 15 a 16.

Složky reakční směsi GOLD-PCR pufr MgCl2

dNTP mix D.W.

F primer


Konečná 10x

25 mM

10 mM 25 µM

R primer

25 µM

AmpliTaq Gold polymeráza

5 U/µl

cDNA

Celkový objem

Objem pro jednu reakční směs [µl] 1x

2,5

0,2 mM

0,5

1,0 mM

0,5 µM 0,5 µM 0,06 U/µl

Tab. 2: Reakční směs pro jednokolovou RT-PCR pro detekci fúzního genu PML/RARα.

1,0 14,7 0,5 0,5 5,0 0,3

25,0

21

2.3.1.4.2. Detekce fúzního genu AML1/ETO a CBFβ/MYH11

Pro detekci fúzního genu AML1/ETO a CBFβ/MYH11 při záchytu onemocnění byla

použita dvoukolová nested RT-PCR (van Dongen aj., 1999). Nested PCR využívá navíc tzv. vnitřních primerů, které rozpoznávají úseky genetické informace již v předem

namnožených sekvencích z jednokolové PCR. Tím se může zvýšit citlivost metody

na přibližně 10-5 – 10-6.

5 µl cDNA bylo výchozím templátem pro první kolo nested PCR se specifickými

primery a AmpliTaq Gold polymerázou. Do druhého kola PCR byly přidány 2 µl 25x

ředěného produktu z externího kola PCR. Kontrola amplifikovatelnosti cDNA byla potvrzena jednokolovou PCR s primery pro provozní gen FLT3. Použité primery a jejich sekvence je uvedena v příloze 2, tab. 17.


Výchozí GOLD-PCR pufr MgCl2

dNTP mix D.W.

F primer

R primer

cDNA/ 25x ředěný PCR produkt externího kola

AmpliTaq Gold polymeráza Celkový objem


Koncentrace

10x

25 mM

10 mM 25 µM

25 µM

5 U/µl

[µl]

Konečná

Externí kolo

Interní kolo

1x

2,5

2,5

0,2 mM

0,5

0,5

2,5 mM

0,5 µM 0,5 µM

0,04 U/µl

2,5

2,5

13,3

16,3

0,5

0,5

0,5

0,5

5,0

2,0

0,2

0,2

25,0

25,0

Tab. 3: Reakční směs pro dvoukolovou nested RT-PCR pro detekci fúzního genu AML1/ETO a CBFβ/MYH11.

2.3.1.4.3. Detekce fúzních genů s genem MLL

Pro detekci nejběžnějších fúzních genů s genem MLL (MLL/AF4, MLL/AF6,

MLL/AF9, MLL/AF10, MLL/ENL, MLL/ELL) byla použita metoda multiplexové RT-PCR

(Andersson aj., 2001). Multiplexová PCR umožňuje amplifikaci ve více oblastech sledované DNA paralelně s využitím více než jedné dvojice primerů během jedné reakce.

22

Každý pacient s podezřením na expresi fúzního genu s genem MLL byl otestován

ve dvou multiplexových PCR (OUT – MIX MLL a IN – MIX MLL) s různými kombinacemi primerů. Kontrola amplifikovatelnosti cDNA byla též potvrzena jednokolovou PCR s primery pro provozní gen FLT3. Použité primery a jejich sekvence je uvedena v příloze 2, tab. 18.



GOLD-PCR pufr MgCl2

dNTP mix D.W.

Objem pro jednu reakci směs [µl]

Konečná 10x

25 mM

10 mM

1x

1,25 mM 0,2 mM

MIX-primer: OUT/IN

25 µM

4,5 µM

AmpliTaq Gold polymeráza

5 U/µl

0,04 U/µl

cDNA

Celkový objem

2,5

1,25 0,5

11,05 4,5 5,0 0,2

25,0

Tab. 4: Reakční směs pro multiplexovou RT-PCR pro detekci fúzních genů s genem MLL.

2.3.1.5. Elektroforéza na agarózovém gelu

Elektroforéza na agarózovém gelu se používá ke stanovení kvality produktu PCR.

K separaci PCR produktů a k jejich vizualizaci pod UV světlem byl použit 1,5% a 2%

gel s ethidiumbromidem (výchozí koncentrace 5 mg/ml). Materiál:

- 1x koncentrovaný TBE pufr (Tris-borát-EDTA pufr) - agaróza (Serva, NuSieve)

- ethidiumbromid (5 mg/ml)

- 6x koncentrovaný nanášecí pufr (0,25% bromfenolová modř, 15% Ficoll 400, 0,25% xylen cyanol FF, rozpuštěno v 100 mM EDTA pH 8,0)

- DNA hmotnostní marker XIII (Roche)

- GeneRulerTM 50bp DNA marker (Fermentas) - PCR produkt

23

Postup:

1) Navážit příslušné množství agarózy, přilít odměřený 1x koncentrovaný TBE pufr.

2) Gel připravit rozvařením agarózy v TBE pufru. Po ochlazení na 50˚C přidat do roztoku ethidiumbromid do výsledné koncentrace 0,5 µg/ml, řádně promíchat. Roztok nalít do elektroforetické vany s hřebenem.

3) Po ztuhnutí gelu odstranit hřeben a přilít dostatečné množství TBE pufru, tak aby byl gel ponořený.

4) Do startovacích jamek nanést 10 µl PCR produktu s 2 µl nanášecího pufru (v poměru 5 : 1).

5) Spustit elektroforézu (napětí 65 – 75 V).

6) Po dostatečném elektroforetickém rozdělení PCR produktů, gel vyfotografovat pod UV světlem.

2.3.2. Minimální zbytková choroba

Minimální zbytková choroba představuje populaci maligních reziduálních buněk, která

již není detekovatelná morfologicky. Rozsah a vývoj zbytkové choroby v průběhu onemocnění lze sledovat s různou citlivostí detekčních metod. Pro většinu leukémií je postačující citlivost detekce 10-3.

Monitorování zbytkové choroby bylo prováděno v průběhu léčby a po ukončení

terapie v pravidelných měsíčních intervalech dle terapeutického protokolu IHOK.

2.3.2.1. Sledování zbytkové choroby u fúzního genu PML/RARα

Pro sledování zbytkové choroby u fúzního genu PML/RARα byla použita dvoukolová

nested RT-PCR (Tobal aj., 1998). Kontrola amplifikovatelnosti cDNA byla potvrzena jednokolovou PCR s primery pro provozní gen FLT3. Použité primery, jejich kombinace a sekvence je uvedena v příloze 2, tab. 15 a 16.

Materiál a postup: viz. kap. 2.3.1.4. – materiál a postup u PCR. Program amplifikace

dvoukolové nested RT-PCR pro detekci fúzního genu PML/RARα je uveden v příloze 1, tab. 12.

24


Výchozí GOLD-PCR pufr MgCl2


Koncentrace

10x 25 mM

[µl]

Konečná

Externí kolo 1x

0,5 mM/ 1,0mM

dNTP mix

10 mM

0,2 mM

F primer

25 µM

0,5 µM

D.W.

R primer

cDNA/ 25x ředěný PCR produkt externího kola

AmpliTaq Gold polymeráza Celkový objem

25 µM

5 U/µl

0,5 µM

0,06 U/µl

Interní kolo

2,5

2,5

0,5

0,5

0,5

1,0

15,2

17,7

0,5

0,5

0,5

0,5

5,0

2,0

0,3

0,3

25

25

Tab. 5: Reakční směs pro dvoukolovou nested RT-PCR pro detekci fúzního genu PML/RARα

při sledování zbytkové choroby.

2.3.2.2. Sledování zbytkové choroby u fúzního genu AML1/ETO, CBFβ/MYH11 a fúzních genů s genem MLL

V současnosti je nejčastěji používanou metodou pro kvantitativní detekci zbytkové

choroby na molekulární úrovni kinetické sledování amplifikace v reálném čase („real-time" RT-PCR, RQ RT-PCR). Zbytkové onemocnění je určováno na základě detekce a následné kvantifikace exprese molekulárního markeru AML.

Standardní DNA o známém počtu částic umožňuje kvantifikovat množství vloženého

templátu v neznámých vzorcích pacientů. Jako standardní DNA byla použita jednak syntetizovaná standardní DNA (Ipsogen) a jednak standardní DNA připravená z plazmidu.

Jako referenční (kontrolní) gen pro normalizaci vzorků pacientů byl použit gen ABL

(Ipsogen).

RQ RT-PCR je rychlá, vysoce citlivá a specifická metoda, která umožňuje průběžné

sledování PCR produktů již během jednotlivých amplifikačních cyklů. Vyznačuje se též velmi dobrou reprodukovatelností.

V případě kvantitativní detekce fúzního genu AML1/ETO, CBFβ/MYH11 a fúzních

genů s genem MLL představuje RQ RT-PCR dvoukrokovou metodu. V prvním kroku je to 25

RT (viz. kap. 2.3.1.3.). Následuje amplifikace se specifickou TaqMan próbou, fluorescenčně značenou na obou koncích (na 5΄ konci zářič, na 3΄ konci zhášeč).

Taqman próba je cílově specifická pro příslušný fúzní gen a pro referenční gen.

Současně s fúzním genem je kvantifikován i referenční gen, detekce obou genů probíhá v oddělených reakcích.

Výsledkem stanovení zbytkové choroby je potom relativní procentuální exprese

příslušných fúzních genů vztažená k referenčnímu genu ABL (příslušný typu fúzního genu / referenční gen ABL x 100%).

U kvantitativní detekce fúzního genu AML1/ETO a CBFβ/MYH11 byly použity

podmínky metod vycházející z pokynů programu EAC (Gabert aj., 2003).

U kvantitativní detekce fúzních genů s genem MLL bylo přistoupeno k designování

vlastních podmínek pacient specifických metod RQ RT-PCR.

Použité primery a próby a jejich sekvence je uvedena v příloze 2, tab. 19.

Materiál:

- UniMix TaqMan (Applied Biosystems)

- 100 µM primery (syntéza Generi Biotech)

- 100 µM Taqman Próba (syntéza Generi Biotech) - destilovaná voda (D.W.) - cDNA

- standardní DNA (viz. kap. 2.3.3.) - referenční gen ABL (Ipsogen) Postup:

1) RT reakce: viz. kap. 2.3.1.3. – materiál a postup u RT. 2) RQ PCR reakce:

a) Naředit standardní DNA desítkovou řadou. (Ředění standardní DNA fúzních genů: 101 – 106. Ředění standardní DNA referenčního genu: 103 – 105).

b) Připravit reakční směs podle tabulky 6 do jedné zkumavky, protřepat a stočit. Reakční směs připravit zvlášť pro každý fúzní gen. Objemy jednotlivých složek

násobit počtem vzorků, přičemž každý vzorek pacienta je pipetován

ve 2 paralelách, referenční gen a negativní kontrola je pipetována po 1 paralele. Poté analogicky připravit reakční směs pro referenční gen. Je nutné si s každým

26

novým vzorkem pacienta pipetovat i jeho předchozí vzorek pro srovnání reprodukovatelnosti metody.

c) Rozpipetovat 20 µl reakční směsi (tab. 6) do jednotlivých jamek 96-jamkové

destičky podle předem připravené tabulky. Každou reakční směs rozpipetovat zvlášť, nejdříve pro fúzní geny, pak pro referenční gen.

d) Přidat 5 µl příslušné cDNA, opět dle předem připravené tabulky. Poté analogicky

přidat přislušnou standardní DNA (5 µl). V případě negativní kontroly se místo

5 µl cDNA přidá 5 µl D.W. Nakonec destičku přelepit fólií a přikrýt gumovou podložkou kvůli zabránění výparu vzorku. Vzorky v destičce sklepnout jedním táhlým pohybem ruky.

e) Destičku se vzorky umístit do amplifikátoru (Gene Amp® PCR System 5700), (Applied Biosystems), zachovat orientaci jako na předem připravené tabulce. Nastavit a spustit program. Program RQ RT-PCR je uveden v příloze 1, tab. 13. Tento program je univerzální pro jakýkoliv z detekovaných fúzních genů.



UniMix Taqman Primery

Taqman Próba D.W.

Objem pro jednu reakční směs [µl]

Konečná 2x

30 µM

20 µM

1x

12,5

0,2 µM

0,25

0,3 µM

cDNA

Celkový objem

0,25 6,75 5,0 25

Tab. 6: Reakční směs pro RQ RT-PCR pro kvantitativní detekci fúzního genu AML1/ETO, CBFβ/MYH11 a fúzních genů s genem MLL při sledování zbytkové choroby.

2.3.3. Příprava standardní DNA

Klonováním do plazmidu byla standardní DNA připravena v případě fúzních genů

s genem MLL. V ostatních případech (fúzní gen AML1/ETO, CBFβ/MYH11 a referenční gen ABL) byla standardní DNA syntetizovaná komerčně (Ipsogen).

27

2.3.3.1. Amplifikace PCR produktu

PCR produkt byl amplifikován s reakční směsí (viz. tab. 4, kap. 2.3.1.4.3.) v celkovém

objemu 100 µl (4 × 25 µl reakcí). PCR produkt může být starý maximálně jeden den. Použité

primery a jejich sekvence je uvedena v příloze 2, tab. 18.

Materiál a postup: viz. kap. 2.3.1.4. – materiál a postup u PCR. Program amplifikace PCR produktu je uveden v příloze 1, tab. 11.

2.3.3.2. Izolace a purifikace PCR produktu

PCR produkt byl vyříznut ostrým skalpelem z agarózového gelu (1,5% nebo 2%)

a přečištěn za použití QIAquick Gel Extraction Kitu (QIAGEN). DNA byla eluována pomocí

50 µl D.W., centrifugací 1 minutu při maximální rychlosti. Koncentrace přečištěné DNA byla změřena na spektrofotometru Eppendorf Biophotometer 6131.

2.3.3.3. pCR®2.1 vektor

Pro přípravu standardní DNA byl použit linearizovaný pCR®2.1 vektor (TA Cloning

Kit, Invitrogen) o výchozí koncentraci 25 ng/µl (obr.11).

Obr. 11: Schéma pCR®2.1 vektoru.

28

2.3.3.4. Ligace

Přečištěný PCR produkt byl ligován do EcoRI místa pCR®2.1 vektoru (25 ng/µl).

Ligační poměry vektor : inzert byly nastaveny jako 1 : 1. Příslušné množství PCR produktu byla spočítáno z rovnice uvedené v návodu TA Cloning Kitu (Invitrogen): X ng PCR produktu = (Y bp PCR produktu) (50 ng pCR®2.1 vektoru) 3900 bp pCR®2.1

Ligace probíhala přes noc při 14˚C se 4 U T4 DNA ligázy (Invitrogen) v příslušném

pufru v celkovém objemu 10 µl.

2.3.3.5. Transformace

Reakční směsí pro ligaci (2 µl z 10 µl reakce) byly transformovány One Shot®

kompetentní buňky Escherichia coli (TA Cloning Kit, Invitrogen). Po smíchání byly vzorky

inkubovány na ledu 30 minut, následoval tepelný šok (42˚C, přesně 30 s) a rychlé zchlazení na ledu (2 minuty). Po přidání 250 µl SOC média (Invitrogen) byly vzorky inkubovány

třepáním při 37˚C 1 hodinu. Bakteriální kultura byla přenesena na agarové misky s LB médiem s přídavkem ampicilinu (100µg/ml). Při přípravě agarových misek se nejdříve misky

nechaly chvíli vyhřívat při 37˚C. Potom se na každou misku rozetřelo 40 µl 100 mM

isopropyl-β-D-thiogalaktosidu (IPTG) a 40 µl 4% 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-

galaktosidu (X-Gal) a misky se dále nechaly temperovat při 37˚C.

2.3.3.6. Analýza bakteriálních kolonií

Transformované baktérie s inzertem zůstávají bílé, baktérie bez inzertu jsou modré.

Přítomnost inzertu v transformovaných baktériích byla ověřena pomocí PCR reakce,

která byla provedena dle podmínek v práci již uvedených (viz. kap. 2.3.3.1.). PCR produkty byly separovány na 1,5% nebo 2% agarózovém gelu a vizualizovaný pod UV světlem.

29

2.3.3.7. Izolace plazmidové DNA

Pozitivní kolonie byly pomnoženy v kulturách: do 50 ml 1x koncentrovaného LB

média s přídavkem (50 µl) ampicilinu (100 µg/ml) byla sterilní špičkou přenesena pozitivní bakteriální kolonie. Kultura byla inkubována na třepačce při 37˚C, 12 – 16 hodin.

Plazmidová (standardní) DNA byla izolována za použití Plasmid Midi Kitu

(QIAGEN).

Poté

byla

změřena

její

koncentrace

na

spektrofotometru Eppendorf

Biophotometer 6131. Koncentrace plazmidové DNA byla přepočítána přes Avogadrovu konstantu na počet částic (kopií) a byly připraveny její 5 µl zásobní alikvoty o 1010 částic. Následně byly alikvoty standardní DNA naředěny desítkovým ředěním na 101 – 106 částic

pro monitorování zbytkové choroby.

2.3.4. Sekvenování

V případě pozitivní detekce fúzních genů s genem MLL při záchytu onemocnění byl

PCR produkt přečištěn za použití QIAquick Gel Extraction Kitu (QIAGEN) a následně sekvenován. Tento postup byl zvolen proto, aby v případě fúzních genů s genem MLL byla

známa sekvence těchto fúzních genů a mohla se nastavit metoda pro sledování zbytkové choroby.

2.3.4.1. Sekvenační reakce

K sekvenování vzorků byla použita dideoxyterminační metoda. Spočívá v amplifikaci

sledovaného úseku pomocí jednoho oligonukleotidového primeru v přítomnosti fluorescenčně značených terminačních dideoxynukleotidů, které začleněním do DNA řetězce zastaví jeho další prodlužování.

Sekvenace byla provedena na kapilátorovém sekvenátoru ABI PRISM 310 Genetic

Analyzer (Applied Biosystems) s využitím Gene Scan Analysis softwaru. Materiál:

- přečištěný PCR produkt - 10 µM primer

- sekvenační roztok BigDyeTMTerminator Ready Reaction Mix (Applied Biosystems) - 5x koncentrovaný sekvenační pufr (Applied Biosystems)

30

Postup:

1) Pipetovat PCR produkt podle koncentrace DNA (množství templátové DNA v závislosti na délce fragmentu je uvedeno v příloze 3, tab. 20), přidat 0,5 µl 10 µM primeru, 2 µl sekvenačního pufru, 4 µl sekvenačního roztoku a doplnit vodou do 20 µl.

2) Amplifikovat. Program amplifikace sekvenační reakce, který je obecný pro jakýkoliv PCR produkt, je uveden v příloze 1, tab. 14.

2.3.4.2. Purifikace produktu sekvenační reakce Materiál:

- 125 mM EDTA

- 3 M octan sodný pH 5,2 - 96% a 70% ethanol Postup:

1) K 20 µl PCR produktu přidat 2 µl 125 mM EDTA, 2 µl 3M octanu sodného a 50 µl 96% ethanolu, promíchat.

2) Protřepat a nechat inkubovat 15 minut při pokojové teplotě. 3) Centrifugovat 20 minut při maximální rychlosti.

4) Odstranit všechen supernatant a k sedimentu přidat 250 µl 70% ethanolu, protřepat. 5) Centrifugovat 5 minut při maximální rychlosti. 6) Vysušit sediment.

31

3. VÝSLEDKY

3.1. Záchyt onemocnění

Fúzní gen byl při vstupním vyšetření pacientů s nově diagnostikovanou AML

identifikován v CMBGT při IHOK ve 26 případech. Výchozím materiálem při záchytu onemocnění byla PB a BM. Výsledky pacientů s nalezeným fúzním genem jsou shrnuté v tabulce (tab. 7). Fúzní gen

Záchyt

Relaps Exitus

PML/RARa

BCR1 BCR3

AML1/ETO

6

3

8

2

0

2

0

0

CBFb/MYH11

typ A

5

2

typ D

1 1

Fúzní geny s MLL

1 0 0

MLL/AF6 MLL/AF9 3

2

1

2

1

Tab. 7: Výsledky detekce a monitorování fúzních genů u pacientů s AML.

1

MLL/ENL

1 0 0

3.1.1. Detekce fúzního genu PML/RARα

Fúzní gen PML/RARα byl identifikován v 9 případech. Z toho 6x byla zachycena

dlouhá varianta (bcr1) a 3x krátká varianta (bcr3) tohoto fúzního genu.

Pro detekci fúzního genu PML/RARα byla použita jednokolová RT-PCR (Tobal aj.,

1998). Pro toto vyšetření byla zvolena kombinace primerů M4 x R8, která zachytí všechny varianty fúzního genu PML/RARα. Avšak v případě exprese dlouhé varianty získáváme dva

PCR produkty o přibližné velikosti 400 bp a 700 bp, které odpovídají různým izoformám této varianty. Proto byla zavedena další PCR s párem primerů M2 x R8. Výsledkem reakce je

jediný pozitivní PCR produkt odpovídající buď dlouhé nebo variabilní variantě, což je výhodnější pro konečné zhodnocení PCR (obr. 12).

Použité primery, jejich kombinace a sekvence je uvedena v příloze 2, tab. 15 a 16.

Kontrola amplifikovatelnosti cDNA byla ověřena další PCR s primery (R5 x 12R) pro provozní gen FLT3 (obr. 13).

32

M2 x R8

M4 x R8

Obr.12: Záchyt onemocnění APL jednokolovou metodou RT-PCR. Každý pacient

s podezřením na expresi fúzního genu PML/RARα byl otestován ve dvou jednokolových PCR s různými kombinacemi primerů (M2 x R8 a M4 x R8).

1, 2…vyšetření odběru PB u pacienta ve dvou paralelách; K1…pozitivní kontrola dlouhé varianty; 3, 4…vyšetření odběru BM u pacienta ve dvou paralelách; M…DNA hmotnostní marker XIII (Roche), K2…pozitivní kontrola krátké varianty.

U pacienta byla potvrzena exprese krátké varianty fúzního genu PML/RARα.

Obr. 13: Ověření amplifikovatelnosti cDNA jednokolovou metodou RT-PCR s primery R5 x 12R pro provozní gen FLT3, který je exprimován ve všech jaderných buňkách BM i PB. 1 – 5…cDNA pacientů.

33

3.1.2. Detekce fúzního genu AML1/ETO a CBFβ/MYH11

Fúzní gen AML1/ETO byl detekován v 8 případech a fúzní gen CBFβ/MYH11 ve 3

případech, přičemž 2x byl zachycen typ A a 1x typ D u fúzního genu CBFβ/MYH11.

Pro vyšetření fúzního genu AML1/ETO a CBFβ/MYH11 ze vstupního materiálu byla

použita dvoukolová nested RT-PCR (van Dongen aj., 1999), (obr. 14 – 16).

Použité primery a jejich sekvence je uvedena v příloze 2, tab. 17. Kontrola

amplifikovatelnosti cDNA byla ověřena další PCR pro provozní gen FLT3 (viz. obr. 13).

Externí kolo PCR

Interní kolo PCR

Obr. 14: Záchyt onemocnění u fúzního genu AML1/ETO dvoukolovou nested RT-PCR.

1, 2…vyšetření odběru PB u pacientky ve dvou paralelách; 3, 4…vyšetření odběru BM

u pacientky ve dvou paralelách; K…pozitivní kontrola; M…DNA hmotnostní marker XIII (Roche).

U pacientky byla potvrzena exprese fúzního genu AML1/ETO v externím i interním kole PCR.

34

Externí kolo PCR

Interní kolo PCR

Obr. 15: Záchyt onemocnění u fúzního genu CBFβ/MYH11 dvoukolovou nested RT-PCR.

1, 2…vyšetření odběru BM u 1. pacientky ve dvou paralelách; K…pozitivní kontrola, typ A;

3, 4…vyšetření odběru BM u 2. pacienta ve dvou paralelách; M…DNA hmotnostní marker XIII (Roche).

U 1. pacientky byla potvrzena exprese fúzního genu CBFβ/MYH11, typ A v externím i interním kole PCR.

Externí kolo PCR

Interní kolo PCR

Obr. 16: Záchyt onemocnění u fúzního genu CBFβ/MYH11 dvoukolovou nested RT-PCR.

1, 2…vyšetření odběru BM u pacientky ve dvou paralelách; K…pozitivní kontrola, typ A; M…GeneRulerTM 50bp DNA marker (Fermentas).

U pacientky byla potvrzena exprese fúzního genu CBFβ/MYH11, typ D v externím i interním kole PCR.

35

3.1.3. Detekce fúzních genů s genem MLL

Fúzní geny s genem MLL byly zjištěny v 6 případech. 3x byl zachycen fúzní gen

MLL/AF6, 2x MLL/AF9 a 1x MLL/ENL.

Pro detekci nejběžnějších fúzních genů s genem MLL (MLL/AF4, MLL/AF6,

MLL/AF9, MLL/AF10, MLL/ENL, MLL/ELL) byla použita metoda multiplexové RT-PCR (Andersson aj., 2001), (obr. 17 – 19).

Použité primery a jejich sekvence je uvedena v příloze 2, tab. 18. Kontrola

amplifikovatelnosti cDNA byla prokázána další PCR pro provozní gen FLT3 (viz. obr. 13).

OUT – MIX MLL

IN – MIX MLL

Obr. 17: Záchyt onemocnění u fúzních genů s genem MLL multiplexovou metodou RT-PCR. Každý pacient s podezřením na expresi fúzního genu s genem MLL byl otestován ve dvou multiplexových PCR s různými kombinacemi primerů.

1, 2…vyšetření odběru PB u pacientky ve dvou paralelách; K1…pozitivní kontrola pro fúzní

gen MLL/AF6; M…GeneRulerTM 50bp DNA marker (Fermentas); K2…pozitivní kontrola pro fúzní gen MLL/AF9.

U pacientky byla potvrzena exprese fúzního genu MLL/AF6 v OUT – MIX MLL i IN – MIX MLL PCR. Tento typ přestavby byl ověřen následnou sekvenací (viz. příloha 3, obr. 23).

36

IN – MIX MLL

OUT – MIX MLL

Obr. 18: Záchyt onemocnění u fúzních genů s genem MLL multiplexovou metodou RT-PCR.

1…kontrola amplifikovatelnosti cDNA; K…pozitivní kontrola pro fúzní gen MLL/AF6; 2, 3…vyšetření odběru BM u pacientky ve dvou paralelách; M…DNA hmotnostní marker

XIII (Roche).

U pacientky byla potvrzena exprese fúzního genu MLL/AF9 v IN – MIX MLL PCR. Tento typ přestavby byl ověřen následnou sekvenací (viz. příloha 3, obr. 24). V OUT MIX MLL PCR nedošlo k amplifikaci u cDNA pacientky ani u cDNA pozitivní kontroly.

OUT – MIX MLL

IN – MIX MLL

Obr. 19: Záchyt onemocnění u fúzních genů s genem MLL multiplexovou metodou RT-PCR.

37

1, 2…vyšetření odběru PB u pacienta ve dvou paralelách; 3, 4…vyšetření odběru BM

u pacienta ve dvou paralelách; K…pozitivní kontrola pro fúzní gen MLL/AF6; M…DNA hmotnostní marker XIII (Roche).

U pacienta byla potvrzena exprese fúzního genu MLL/ENL v OUT – MIX MLL i IN – MIX MLL PCR. Tento typ přestavby byl ověřen následnou sekvenací (viz příloha 3, obr. 25).


Minimální zbytkovou chorobu je možné sledovat na základě exprese molekulárního

markeru AML. Ve zhruba 30% všech případů AML je možné molekulární marker identifikovat. Ve své diplomové práci jsem se zaměřila na detekci a sledování zbytkové

choroby u fúzních genů PML/RARα, AML1/ETO, CBFβ/MYH11 a u fúzních genů s genem MLL.

Pro kvantitativní vyšetřování exprese fúzních genů AML1/ETO a CBFβ/MYH11 byla

použita metoda RQ RT-PCR. Podmínky pro detekci těchto fúzních genů vychází z pokynů

programu EAC (Gabert aj., 2003). Do PCR je přidávána specifická TaqMan fluorescenční sonda, která je značena dvěma fluorochromy. V případě

pacientů

s detekovaným

MLL

fúzním

genem

bylo

k designování vlastních podmínek pro RQ RT-PCR (viz. příloha 3, obr. 23 – 25).

přistoupeno

Pro sledování pacientů s APL na terapii byla použita vysoce senzitivní metoda

dvoukolové nested RT-PCR (Tobal aj., 1998).

Materiálem pro stanovení zbytkové choroby byla PB a BM. Výsledkem vyšetření je

relativní procentuální exprese příslušného fúzního genu vzhledem k referenčnímu genu ABL. Použité primery a próby a jejich sekvence je uvedena v příloze 2, tab. 19.

3.2.1. Sledování zbytkové choroby u fúzního genu PML/RARα

Zbytková choroba byla u fúzního genu PML/RARα sledována u 9 pacientů.

2 pacienti zemřeli v počáteční fázi indukční chemoterapie. Molekulární relaps nebyl zaznamenán (viz tab. 7).

K monitorování zbytkové choroby u fúzního genu PML/RARα byla použita

dvoukolová nested RT-PCR (Tobal aj., 1998). Stejně jako v případě jednokolového vyšetření k stanovení záchytu onemocnění APL i zde byly zavedeny různé kombinace primerů pro detekci dlouhé, variabilní a krátké varianty fúzního genu PML/RARα. Páry primerů M4 x

38

RAR v externím a P2 x R8 v interním kole RT-PCR zachytí všechny varianty fúzního genu PML/RARα. (obr. 20 – 22). Opět v případě dlouhé a variabilní varianty zaznamenáváme více

pozitivních PCR produktů, které odpovídají různým izoformám těchto variant. Proto ke stanovení dlouhé a variabilní varianty byly použity kombinace primerů M1 x RAR v externím a M2 x R8 v interním kole RT-PCR.

Použité primery, jejich kombinace a sekvence je uvedena v příloze 2, tab. 15 a 16.

Kontrola amplifikovatelnosti cDNA byla ověřena pro provozní gen FLT3 (viz. obr. 13).

Externí kolo PCR

Interní kolo PCR

Obr. 20: Sledování zbytkové choroby dvoukolovou nested RT-PCR u pacienta na terapii s exprimovanou krátkou variantou fúzního genu PML/RARα.

1, 2…vyšetření odběru BM u 1. pacienta ve dvou paralelách; 3, 4…vyšetření odběru PB

u 2. pacienta ve dvou paralelách; K…pozitivní kontrola krátké varianty; M…GeneRulerTM 50bp DNA marker (Fermentas).

U 1. pacienta byla potvrzena exprese krátké varianty fúzního genu PML/RARα v externím i interním kole PCR – pacient není v remisi onemocnění.

39

Externí kolo PCR

Interní kolo PCR


1, 2…vyšetření následného odběru BM u 1. pacienta ve dvou paralelách; 3, 4…vyšetření

následného odběru PB u 2. pacienta ve dvou paralelách; K…pozitivní kontrola krátké varianty; M…GeneRulerTM 50bp DNA marker (Fermentas).

U 1. pacienta byla potvrzena exprese krátké varianty fúzního genu PML/RARα v interním

kole PCR – u pacienta došlo k poklesu pozitivity fúzního genu PML/RARα. Pacient není v remisi onemocnění.

Interní kolo PCR

Externí kolo PCR


1, 2…vyšetření následného odběru BM u 1. pacienta ve dvou paralelách; K1…pozitivní

kontrola krátké varianty; 3, 4…vyšetření následného odběru PB u 2. pacienta ve dvou paralelách; K2…pozitivní kontrola dlouhé varianty; M…GeneRulerTM 50bp DNA marker (Fermentas).

40

U 1. pacienta nebyla potvrzena exprese fúzního genu PML/RARα v externím i interním kole PCR – pacient je v remisi onemocnění.

3.2.2. Sledování zbytkové choroby u fúzních genů AML1/ETO, CBFβ/MYH11 a fúzních genů s genem MLL

Zbytková choroba byla u fúzních genů AML1/ETO, CBFβ/MYH11 a fúzních genů

s genem MLL sledována u 17 pacientů. Z toho u 8 pacientů byl zaznamenán molekulární relaps, přičemž u 3 pacientů byl molekulární relaps zaznamenán 2x a u 1 pacienta 3x. 6 pacientů zemřelo (viz. tab. 7).

K monitorování zbytkové choroby u fúzních genů AML1/ETO a CBFβ/MYH11 byla

použita metoda RQ RT-PCR (Gabert aj., 2003). V případě

pacientů

s detekovaným

MLL

fúzním

genem

bylo

přistoupeno

k designování vlastních podmínek pacient specifických metod RQ RT-PCR (viz. příloha 3, obr. 23 – 25).

Použité primery a próby a jejich sekvence je uvedena v příloze 2, tab. 19.

3.2.2.1. Monitorování pacienta č.1

U pacienta byl detekován fúzní gen AML1/ETO ve věku 53 let v době záchytu

onemocnění. Pacient byl diagnostikován jako AML M1 dle FAB klasifikace. U tohoto pacienta byla podána reindukční terapie po zaznamenání 1. relapsu onemocnění. Kvůli

infekčním komplikacím byla chemoterapie přerušena a zahájena paliativní léčba. Poté u pacienta došlo ke 2. relapsu. Pacient zemřel na progresi základního onemocnění spojenou s infekčními komplikacemi (graf 1).

3.2.2.2. Monitorování pacienta č. 2


onemocnění. Pacient byl diagnostikován jako AML M2 dle FAB klasifikace. U pacienta byly

zaznamenány 3 molekulární relapsy onemocnění. V případě 1. relapsu byla reindukční terapie zahájena hned v období záchytu molekulárního relapsu. V případě 2. a 3. relapsu byla

41

reindukční terapie podána v době hematologického relapsu. Pacient zemřel na progresi základního onemocnění spojenou s podávanou terapií (graf 2).

Exprese AML1/ETO

Naměřené hodnoty

200,00% 150,00%

E

1.RI

250,00%

I

2.RI 1.K

2.K

3.K

I… indukce

K... konsolidace

100,00%

RI… reindukce E… exitus

50,00%

20.2.2004

20.1.2004

20.12.2003

Datum odběru

20.11.2003

20.10.2003

20.9.2003

20.8.2003

20.7.2003

20.6.2003

20.5.2003

20.4.2003

20.3.2003

20.2.2003

0,00%

Graf 1: Dlouhodobé monitorování pacienta č. 1 s AML M1, u kterého byl detekován fúzní gen AML1/ETO.



onemocnění. Pacient byl diagnostikován jako AML M5 dle FAB klasifikace. Rovněž u tohoto pacienta byla podána reindukční terapie po zaznamenání relapsu onemocnění, na níž byla

velmi dobrá odpověď. Následně pacient podstoupil 2 cykly konsolidační chemoterapie a je nyní v dlouhodobé remisi onemocnění a dochází k pravidelným kontrolám (graf 3).

42

Exprese AML1/ETO 5000%

2.K

4500% Naměřené hodnoty

4000%

3.RI 3.RI

3500% 3000% 2500%

I

2000%

1.K

2.K

1.RI

3.K

2.RI

1.K

I… indukce

1.K

E

1500% 1000%

K... konsolidace RI… reindukce E… exitus

500%

24.4.2005

24.2.2005

24.12.2004

Datum odběru

24.10.2004

24.8.2004

24.6.2004

24.4.2004

24.2.2004

24.12.2003

24.10.2003

24.8.2003

24.6.2003

0%


Exprese AML1/ETO 350,00%

Naměřené hodnoty

300,00% 250,00% 200,00%

I 1.RI

I… indukce

2.K

K... konsolidace

1.K

150,00%

RI… reindukce

100,00% 50,00%

17.8.2005

17.6.2005

17.10.2005

Datum odběru

17.4.2005

17.2.2005

17.12.2004

17.10.2004

17.8.2004

17.6.2004

17.4.2004

17.2.2004

0,00%


43

3.2.2.4. Monitorování pacientky č. 4

U pacientky byl cytogeneticky prokázán fúzní gen AML1/ETO ve věku 61 let v době

záchytu onemocnění. Pacientka byla diagnostikována jako AML M4 dle FAB klasifikace.

Tato pacientka začala být monitorována pro zbytkovou chorobu až ve 4. cyklu konsolidační chemoterapie a pacientka byla v této době v remisi onemocnění. Následně byl u pacientky

zaznamenán molekulární relaps onemocnění, po kterém byla nasazena reindukční terapie, na níž byla též velmi dobrá odpoděď. Pacientka je nyní v dlouhodobé remisi onemocnění a dochází k pravidelným kontrolám (graf 4).

Exprese AML1/ETO 1.RI

20,00% 18,00% Naměřené hodnoty

16,00% 14,00% 12,00% 10,00%

4.K

K... konsolidace

1.K

RI… reindukce

8,00% 6,00% 4,00% 2,00%

Datum odběru

20.9.2005

20.7.2005

20.5.2005

20.3.2005

20.1.2005

20.11.2004

20.9.2004

20.7.2004

20.5.2004

20.3.2004

20.1.2004

20.11.2003

20.9.2003

20.7.2003

20.5.2003

20.3.2003

20.1.2003

0,00%

Graf 4: Dlouhodobé monitorování pacientky č. 4 s AML M4, u které byl detekován fúzní gen AML1/ETO.


U pacienta byl cytogeneticky prokázán fúzní gen AML1/ETO ve věku 61 let v době

záchytu onemocnění. Pacient byl diagnostikován jako AML M1 dle FAB klasifikace. Také tento pacient začal být monitorován pro zbytkovou chorobu až ve 2 cyklu konsolidační

chemoterapie. Třičtvrtě roku po 4. cyklu konsolidační chemoterapie byl u pacienta

zaznamenán molekulární relaps, po kterém byla ihned podána reindukční terapie mylotargem a monitoruje se jaká na ni bude odpověď (graf 5).

44


1.RI

Naměřené hodnoty

0,70% 0,60% 0,50% 0,40%

2.K

3.K

4.K

K... konsolidace RI… reindukce

0,30% 0,20% 0,10%

27.8.2005

27.6.2005

27.4.2005

27.2.2005

27.10.2005

Datum odběru

27.12.2004

27.10.2004

27.8.2004

27.6.2004

27.4.2004

27.2.2004

27.12.2003

27.10.2003

27.8.2003

27.6.2003

27.4.2003

27.2.2003

0,00%




onemocnění. Pacient byl diagnostikován jako AML M2 dle FAB klasifikace. Po indukční terapii pacient podstoupil 2 cykly konsolidační chemoterapie. Pacient je nyní v dlouhodobé remisi onemocnění a dochází k pravidelným kontrolám (graf 6).



onemocnění. Pacient byl diagnostikován jako AML M2 dle FAB klasifikace. Rovněž u tohoto pacienta byla po indukční terapii zahájena konsolidační chemoterapie. Pacient podstoupil 3 cykly konsolidační chemoterapie a je nyní v dlouhodobé remisi onemocnění (graf 7).

45

I

Exprese AML1/ETO

600,00%

Naměřené hodnoty

500,00%

1.K

400,00%

2.K I... indukce

300,00%

K… konsolidace

200,00% 100,00%

Datum odběru

1.10.2005

1.9.2005

1.8.2005

1.7.2005

1.6.2005

1.5.2005

1.4.2005

1.3.2005

1.2.2005

1.1.2005

0,00%



Naměřené hodnoty

1200,00% 1000,00%

I

1.K

2.K

3.K

800,00%

I... indukce

600,00%

K… konsolidace

400,00% 200,00%

28.9.2005

28.8.2005

28.7.2005

28.6.2005

28.5.2005

28.4.2005

28.3.2005

28.2.2005

28.1.2005

28.12.2004

0,00%

Datum odběru


46


U pacientky byl detekován fúzní gen AML1/ETO ve věku 35 let v době záchytu

onemocnění. Pacientka byla diagnostikována jako AML M2 dle FAB klasifikace. Tato pacientka podstoupila po 1. cyklu konsolidační chemoterapie allogenní transplantaci krvetvorných buněk od příbuzného dárce. Pacientka je nyní v remisi onemocnění a dochází k pravidelným kontrolám. U pacientky byl také zjištěn středně diferencovaný epidermoidní

karcinom malé pánve s infiltrací rekta. Tato pacientka začala být monitorována pro zbytkovou chorobu v pravidelných intervalech až od roku 2005 (graf 8).

800,00%

Naměřené hodnoty

700,00%

Exprese AML1/ETO

I

1.K

600,00%

alloT

500,00%

I... indukce

K… konsolidace

400,00%

alloT...

300,00%

transplantace PBSC

200,00% 100,00%

1.11.2005

1.8.2005

1.5.2005

1.2.2005

1.11.2004

1.8.2004

1.5.2004

1.2.2004

1.11.2003

1.8.2003

1.5.2003

1.2.2003

1.11.2002

1.8.2002

0,00%

Datum odběru

Graf 8: Dlouhodobé monitorování pacientky č. 8 s AML M2, u které byl detekován fúzní gen AML1/ETO.


U pacientky byl detekován fúzní gen CBFβ/MYH11, typ A ve věku 61 let v době

záchytu onemocnění. Pacientka byla diagnostikována jako AML M5 dle FAB klasifikace. U pacientky byly zaznamenány 2 molekulární relapsy onemocnění. V případě 1. relapsu byla

reindukční terapie zahájena v době hematologického relapsu. V případě 2. relapsu byla

reindukční terapie podána hned v období záchytu molekulárního relapsu. Pacientka zemřela na infekční komplikace (graf 9).

47

Exprese CBFb/MYH11, typ A 140,00%

I

1.RI

Naměřené hodnoty

120,00%

1.K

100,00% 80,00%

2.K

3.K

4.K

1.K

3.K

2.K

E

2.RI

I... indukce

K… konsolidace

60,00%

RI... reindukce

40,00%

E… exitus

20,00%

26.4.2004

26.2.2004

26.12.2003

26.10.2003

Datum odběru

26.8.2003

26.6.2003

26.4.2003

26.2.2003

26.12.2002

26.10.2002

26.8.2002

26.6.2002

26.4.2002

26.2.2002

0,00%

Graf 9: Dlouhodobé monitorování pacientky č. 9 s AML M5, u které byl detekován fúzní gen CBFβ/MYH11, typ A.


U pacientky byl detekován fúzní gen CBFβ/MYH11, typ A ve věku 31 let v době

záchytu onemocnění. Pacientka byla diagnostikována jako AML M4Eo dle FAB klasifikace.

Rovněž u této pacientky byla podána reindukční terapie po zaznamenání relapsu onemocnění.

Po ní pacientka podstoupila allogenní transplantaci krvetvorných buněk od nepříbuzného dárce. Pacientka je nyní v dlouhodobé remisi onemocnění a dochází k pravidelným kontrolám (graf 10).


U pacientky byl detekován fúzní gen CBFβ/MYH11, typ D ve věku 20 let v době

záchytu onemocnění. Pacientka byla diagnostikována jako AML M2 dle FAB klasifikace.

Tato pacientka podstoupila 4 cykly konsolidační chemoterapie. Nyní je pacientka v dlouhodobé remisi onemocnění a dochází k pravidelným kontrolám (graf 11).

48

Exprese CBFb/MYH11, typ A

I

180,00% 160,00% Naměřené hodnoty

3.K

1.K

140,00% 120,00%

1.RI

2.K

100,00%

I... indukce

alloT

K… konsolidace RI… reindukce

80,00%

alloT...

60,00%

transplantace PBSC

40,00% 20,00% 4.10.2005

4.9.2005

4.8.2005

4.7.2005

4.6.2005

4.5.2005

4.4.2005

4.3.2005

4.2.2005

4.1.2005

4.12.2004

4.11.2004

4.10.2004

4.9.2004

4.8.2004

4.7.2004

4.6.2004

4.5.2004

4.4.2004

4.3.2004

0,00%

Datum odběru

Graf 10: Dlouhodobé monitorování pacientky č. 10 s AML M4Eo, u které byl detekován fúzní gen CBFβ/MYH11, typ A.

350,00%

I

Exprese CBFb/MYH11, typ D

Naměřené hodnoty

300,00% 250,00%

1.K

200,00%

2.K

3.K

4.K

I... indukce

K… konsolidace

150,00% 100,00% 50,00%

26.9.2005

26.8.2005

26.7.2005

26.6.2005

26.5.2005

26.4.2005

26.3.2005

26.2.2005

26.1.2005

26.12.2004

26.11.2004

26.10.2004

0,00%

Datum odběru

Graf 11: Dlouhodobé monitorování pacientky č. 11 s AML M2, u které byl detekován fúzní gen CBFβ/MYH11, typ D.

49


U pacienta byl detekován fúzní gen MLL/AF6 ve věku 20 let v době záchytu

onemocnění. Pacient byl diagnostikován jako AML M5 dle FAB klasifikace. Pacient podstoupil po 3. cyklu konsolidační chemoterapie allogenní transplantaci krvetvorných buněk od nepříbuzného dárce. Nyní je pacient v dlouhodobé remisi onemocnění a dochází k pravidelným kontrolám (graf 12).

Exprese MLL/AF6 3000% 2500% Naměřené hodnoty

I

2000%

I

3.K alloT

I... indukce

K… konsolidace

1500%

alloT...

1000%

transplantace PBSC

500%

21.9.2005

21.7.2005

21.5.2005

21.3.2005

21.1.2005

21.11.2004

21.9.2004

21.7.2004

21.5.2004

21.3.2004

21.1.2004

21.11.2003

21.9.2003

21.7.2003

21.5.2003

21.3.2003

0%

Datum odběru

Graf 12: Dlouhodobé monitorování pacienta č. 12 s AML M5, u kterého byl detekován fúzní gen MLL/AF6.


U pacientky byl detekován fúzní gen MLL/AF6 ve věku 43 let v době záchytu

onemocnění. Pacientka byla diagnostikována jako AML M5 dle FAB klasifikace. Rovněž tato pacientka podstoupila allogenní transplantaci krvetvorných buněk, a to od příbuzného dárce po 2. cyklu konsolidační chemoterapie. Nyní je pacientka v dlouhodobé remisi onemocnění a dochází k pravidelným kontrolám (graf 13).

50

Expre se MLL/AF6 160,00%

Naměřené hodnoty

140,00%

I

120,00%

1.K

100,00%

2.K

alloT

I... indukce

K… konsolidace

80,00%

alloT...

60,00%

transplantace PBSC

40,00% 20,00%

18.9.2005

18.8.2005

18.7.2005

18.10.2005

Datum odběru

18.6.2005

18.5.2005

18.4.2005

18.3.2005

18.2.2005

18.1.2005

18.12.2004

18.11.2004

18.10.2004

0,00%

Graf 13: Monitorování pacientky č. 13 s AML M5, u které byl detekován fúzní gen MLL/AF6.


U pacienta byl detekován fúzní gen MLL/AF6 ve věku 47 let v době záchytu

onemocnění. Pacient byl diagnostikován jako AML M5 dle FAB klasifikace. Poté co byla nasazena indukční terapie, byl u pacienta zaznamenán rychlý relaps onemocnění. Vzhledem

k úmrtí pacienta na komplikace v průběhu indukční terapie, nebyl u tohoto pacienta fúzní gen dále kvantifikován.



onemocnění. Pacientka byla diagnostikována jako AML M5 dle FAB klasifikace. Rovněž

vzhledem k úmrtí pacientky na infekční komplikace v průběhu indukční terapie, nebyl u této pacientky fúzní gen dále kvantifikován.

51



onemocnění. Pacientka byla diagnostikována jako AML M0 dle FAB klasifikace. Tato pacietka podstoupila po 1. cyklu konsolidační chemoterapie allogenní transplantaci

krvetvorných buněk od HLA (Human Luekocyte Antigens) identického bratra. Půl roku po transplantaci byl u pacientky zaznamenán rychlý relaps onemocnění, po kterém byla nasazena

reindukční chemoterapie, na kterou však nebyla zaznamenána požadovaná odpověď. Pacientka zemřela na komplikace v souvislosti s podávanou terapií (graf 14).

Exprese MLL/AF9

E

140%

Naměřené hodnoty

120% 100%

I

1.RI

1.RI 2.RI

80%

1.K

I... indukce

alloT


60%

alloT...

40%

transplantace PBSC E… exitus

20%

1.11.2004

1.10.2004

1.9.2004

1.8.2004

1.7.2004

1.6.2004

1.5.2004

1.4.2004

1.3.2004

1.2.2004

1.1.2004

1.12.2003

1.11.2003

1.10.2003

0%

Datum odběru

Graf 14: Dlouhodobé monitorování pacientky č. 16 s AML M0, u které byl detekován fúzní gen MLL/AF9.


U pacienta byl detekován fúzní gen MLL/ENL ve věku 39 let v době záchytu

onemocnění. Pacient byl diagnostikován jako AML M0 dle FAB klasifikace. Tento pacient podstoupil dvě allogenní transplantace. První transplantace krvetvorných buněk od HLA

identického bratra byla provedena po 2. cyklu konsolidační chemoterapie. Po zaznamenání

molekulárního relapsu 10 měsíců poté bylo přistoupeno ke druhé transplantaci, v tomto 52

případě od příbuzného dárce. Nyní je pacient v remisi onemocnění a dochází k pravidelným kontrolám (graf 15).

Exprese MLL/ENL 30%

I

Naměřené hodnoty

25% 20%

1.K

15%

2.K

1.alloT

2.alloT

1.RI

I... indukce


10%

alloT...

transplantace PBSC

5%

1.9.2005

1.8.2005

1.7.2005

1.6.2005

1.5.2005

1.4.2005

1.3.2005

1.2.2005

1.1.2005

1.12.2004

1.11.2004

1.9.2004

1.10.2004

1.8.2004

1.7.2004

1.6.2004

1.5.2004

1.4.2004

1.3.2004

0%

Datum odběru

Graf 15: Dlouhodobé monitorování pacienta č. 17 s AML M0, u kterého byl detekován fúzní gen MLL/ENL.

3.3. Sekvenování

K sekvenování byla použita dideoxyterminační metoda. Spočívá v amplifikaci

sledovaného úseku pomocí jednoho oligonukleotidového primeru v přítomnosti fluorescenčně značených terminačních dideoxynukleotidů, které začleněním do DNA řetězce zastaví jeho další prodlužování.

Sekvenace byla provedena u pacientů s pozitivní expresí fúzních genů s genem MLL

při záchytu onemocnění, aby se ověril identifikovaný typ přestavby a mohla se nastavit

pacient specifická metoda RQ RT-PCR pro sledování zbytkové choroby. Výsledky sekvenace jsou uvedeny v příloze 3, obr. 23 – 25.

53

4. DISKUZE

Molekulární diagnostika, která je založena na detekci molekulárních markerů

jednotlivých onemocnění, se stala nedílnou součástí vyšetření hematologických malignit. Řada těchto markerů má kromě diagnostického i význam prognostický, proto molekulární

vyšetření přispívají k upřesnění diagnózy, k volbě léčebné strategie a podávají informace o průběhu a vývoji onemocnění.

AML jsou heterogenní skupinou onemocnění, vznikající maligní transformací

kmenových hematopoetických buněk a mají maximum incidence u dospělých (Wingo aj.,

1995). Sestávají z řady podskupin s různým klinickým i laboratorním nálezem, prognózou a odpovědí na terapii. Fúzní geny, které jsou výsledkem chromozomálních abnormalit

vyskytujících se u některých subtypů leukémií, lze využít jako molekulární markery. Ve zhruba 30% všech případů AML je možné molekulární marker identifikovat (Giles aj., 2002).

Cílem mé diplomové práce byla detekce fúzních genů a sledování minimální zbytkové

choroby u pacientů s AML. Ve své diplomové práci jsem se zaměřila na fúzní geny PML/RARα, AML1/ETO, CBFβ/MYH11 a fúzní geny s genem MLL.

Celkový soubor nemocných, u kterých byl nalezen fúzní gen, obsahuje 26 pacientů.

Vyšetření pacientů pomocí molekulárních metod zahrnovalo expresní analýzu fúzních

transkriptů (RT-PCR) a kinetické sledování amplifikace v reálném čase (RQ RT-PCR). V případě fúzních genů s genem MLL bylo přistoupeno k podrobnější charakterizaci sekvenací.

4.1. Detekce fúzního genu PML/RARα

Typickým molekulárním markerem APL je u většiny pacientů přítomnost fúzního

genu PML/RARα, který vzniká chromozomální translokací t(15;17), postihující gen RARα na chromozomu 17 (Borrow aj., 1992). Zároveň je však přítomnost fúzního genu PML/RARα dobrým prognostickým faktorem, proto je zásadní pro život pacientů s APL rychlé stanovení fúzního genu PML/RARα a rychlé zahájení terapie, jež spočívá v aplikaci ATRA v kombinaci s chemoterapií (Lo Coco aj., 1998).

Pro prokázání fúzního genu PML/RARα byly užívány kombinace primerů, které

zachytí všechny varianty tohoto fúzního genu. Z tohoto důvodu byla k ověření exprese

54

fúzního genu PML/RARα u pacientů s podezřením na diagnózu APL použita metoda RT-PCR, založená na rychlé jednokolové identifikaci transkriptů ve dvou různých PCR s odlišnými páry primerů pro jednotlivé varianty fúzního genu PML/RARα (Tobal aj., 1998).

Touto jednokolovou RT-PCR byla detekována 3x krátká varianta a 6x dlouhá varianta

fúzního genu PML/RARα.

4.2. Detekce fúzního genu AML1/ETO a CBFβ/MYH11

Translokace t(8;21)(q22;q22) byla poprvé popsána v roce 1973 a nachází se primárně

u de novo AML subtypu M2. Při této translokaci dochází k fúzi genu AML1 na chromozomu

21 s genem ETO na chromozomu 8. AML1/ETO fúzní transkripty jsou zjistitelné RT-PCR metodou prakticky ve všech případech AML s pozitivní t(8;21). Převládají při ní PCR produkty konstantní velikosti, odpovídající fúzi AML1 exonu 5 s ETO exonem 2.

AML1/ETO fúzní transkripty nacházíme také u pacientů s komplexním karyotypem (van Dongen aj., 1999). Pericentrická

inverze

chromozomu

16

inv(16)(p13;q22)

a

translokace

t(16;16)(p13;q22) jsou spojeny s výskytem fúzního genu CBFβ/MYH11, který je nejčastěji

přítomný u AML subtypu M4Eo. Fúzní gen CBFβ/MYH11 vzniká fúzí genu CBFβ na chromozomu 16 s genem MYH11 na chromozomu 16 (Claxton aj., 1994). Bylo popsáno

10 odlišných CBFβ/MYH11 fúzních transkriptů. Nejčastěji (85%) se vyskytuje typ A fúzního genu CBFβ/MYH11. Další dva typy (D a E) reprezentují 5% případů a se zbývajícími typy se

setkáváme vzácně. CBFβ/MYH11 fúzní transkripty nalézáme i u dalších subtypů AML, zahrnující M4 bez abnormálních eosinofilů, M2 a M5 (van Dongen aj., 1999).

Přítomnost fúzního genu AML1/ETO a CBFβ/MYH11 znamená relativně dobrou

prognózu (van Dongen aj., 1999).

Při identifikaci fúzního genu AML1/ETO a CBFβ/MYH11 bylo vycházeno z práce

autorů van Dongen aj., 1999, ve které standardizovali RT-PCR analýzu 9 fúzních genů s častým výskytem u AL. Za tímto účelem zavedli metodu dvoukolové nested RT-PCR dosahující citlivosti 10-4 – 10-5, pro kterou navrhli a ověřili sady primerů a jejich kombinace pro externí a interní kolo PCR.

Metodou nested RT-PCR byl 8x zjištěn fúzní gen AML1/ETO a 3x fúzní gen

CBFβ/MYH11. Ve 2 případech byl prokázán typ A a v 1 případě typ D fúzního genu CBFβ/MYH11.

55

4.3. Detekce fúzních genů s genem MLL

Chromozomová změna 11q23 zahrnující přestavbu MLL genu, je častá u de novo

AML i u akutních lymfoidních leukémií (ALL) a u leukémií následujících po terapii

inhibitory topoizomerázy II (Andersson aj., 2001). Pacienti s MLL přestavbou mají špatnou prognózu, rozhodnutí o postupu léčby tedy vyžaduje přesnou detekci mutace.

MLL přestavby jsou značně heterogenní, zatím bylo identifikováno více než 30 MLL

fúzních partnerů (Ayton a Cleary, 2001). Zjištění konkrétního typu fúzního transkriptu MLL

u nemocných v době diagnózy umožňuje průkaz zbytkových buněk před transplantací, sledování odpovědi na léčbu a monitorování zbytkové choroby transplantovaných pacientů (van Dongen aj., 1999).

Bylo popsáno několik RT-PCR metod pro detekci chromozomálních přestaveb MLL

genu. Andersson aj., 2001 vyvinuli párovou multiplexovou metodu RT-PCR, umožňující

rychlou a přesnou detekci nejčastěji se vyskytujících MLL fúzních genů u dětských a dospělých AL. Pro zvýšení specifičnosti navrhli dvě sady primerů pro každý fúzní gen,

které byly použity paralelně ve dvou oddělených jednokolových multiplexových PCR. Za těchto podmínek byli schopni úspěšně amplifikovat a stanovit 6 klinicky závažných MLL

fúzních genů: MLL/AF4, MLL/AF6, MLL/AF9, MLL/AF10, MLL/ENL a MLL/ELL při jedné analýze. Vzhledem k těmto okolnostem byla metoda multiplexové RT-PCR zvolena k detekci MLL fúzních transkriptů.

Přestavby MLL genu byly nalezeny u 6 pacientů. Jednalo se: 3x o fúzní transkript

MLL u nemocných s translokací MLL na chromozom 6q27, 2x o fúzní transkript MLL/AF9

u nemocných s translokací MLL na chromozom 9p22 a 1x o fúzní transkript MLL/ENL u pacienta s translokací MLL na chromozom 19p13.3.


Jako minimální zbytkovou chorobu označujeme subklinickou úroveň nemoci, kdy

maligní buňky již nejsou běžnými cytologickými metodami detekovatelné a jejich zastoupení

v BM je menší než 5%. I pod touto hladinou však přežívají a mohou způsobit budoucí relaps.

Postupy založené na PCR, schopné odhalit jednu maligní buňku až v milionu buněk zdravých, jsou výborným nástrojem pro monitorování průběhu reziduální leukémie, jejíž stupeň má významný vliv pro prognózu nemocného. Ukazuje se totiž, že pacienti s vyšší hladinou

zbytkové choroby na konci indukční terapie mají signifikantně vyšší riziko relapsu onemocnění (Trka aj., 1999).

56

V současnosti je nejčastěji používanou metodou pro detekci zbytkové choroby

na molekulární úrovni RQ RT-PCR. V roce 1999 se 25 univerzitních laboratoří z 10

evropských zemí zapojilo do EAC programu. Jejich cílem byla standardizace a ověření kontroly kvality RQ RT-PCR analýzy u nejčastěji se vyskytujících transkriptů fúzních genů u leukémií. Pro tento záměr vybrali 3 kontrolní geny: ABL, B2M a GUS. Během testování

zjistili, že nejvhodnější pro leukemické studie je kontrolní gen ABL, jelikož jeho exprese

není signifikantně rozdílná u zdravých i nemocných pacientů. Při designování sad primerů a prób vycházeli z práce autorů van Dongen aj., 1999. Provedli velké množství analýz RNA vzorků leukemických pacientů, které ve výsledku umožnily validaci EAC sad primerů a prób (Gabert aj., 2003).

Mapování dynamiky zbytkové choroby významně přispívá k hodnocení průběhu léčby

– dává možnost předvídat relaps onemocnění a kontrolovat navození remise onemocnění. Stanovení zbytkové choroby má mimořádný význam též při transplantační terapii. Zbytkovou chorobu je podle literatury vhodné detekovat z odběrů BM nebo PB.

4.4.1. Sledování zbytkové choroby u fúzního genu PML/RARα

Při monitorování zbytkové choroby u fúzního genu PML/RARα byl kladen důraz

na dostatečnou citlivost testovací metody, zatímco při záchytu onemocnění tohoto fúzního genu to bylo rychlé a přesné stanovení diagnózy.

Tobal aj., 1998 vyvinuli vysoce senzitivní metodu dvoukolové nested RT-PCR

verifikované pro jednotlivé varianty fúzního genu PML/RARα, která umožňuje zachytit 2 aberantní buňky exprimující fúzní gen PML/RARα mezi 106 zdravými leukocyty.

Zbytková choroba u fúzního genu PML/RARα byla sledována u 9 pacientů. Z této

skupiny monitorovaných pacientů došlo u 7 pacientů k navození remise onemocnění. 2 pacienti zemřeli krátce po zahájení terapie. Molekulární relaps nebyl zaznamenán.

4.4.2. Sledování zbytkové choroby u fúzního genu AML1/ETO, CBFβ/MYH11 a fúzních genů s genem MLL

Pro kvantitativní vyšetření exprese fúzních genů AML1/ETO a CBFβ/MYH11 byla

použita metoda RQ RT-PCR. Podmínky pro detekci těchto fúzních genů vychází z pokynů

programu EAC (Gabert aj., 2003). Do PCR je přidávána specifická TaqMan fluorescenční

57

sonda, která je značena dvěma fluorochromy. Výsledkem vyšetření je relativní procentuální exprese příslušného fúzního genu vzhledem k referenčnímu genu ABL.

Jelikož MLL gen fúzuje s více než 30 fúzními partnery, nebylo možné

pro kvantitativní detekci fúzních genů s genem MLL použít univerzální protokol. Proto bylo

v případě pacientů s detekovaným MLL fúzním genem přistoupeno k designování vlastních podmínek pro RQ RT-PCR detekci transkriptů tohoto fúzního genu, které byly získány sekvenováním.

Minimální zbytková choroba byla metodou RQ RT-PCR monitorována u 17 pacientů.

V 8 případech byl sledován fúzní gen AML1/ETO, ve 3 případech fúzní gen CBFβ/MYH11 a v 6 případech fúzní geny s genem MLL. Dva pacienti (pacient č. 14 a pacientka č. 15) zemřeli na komplikace krátce po zahájení indukční chemoterapie a nebyl u nich fúzní gen dále kvantifikován.

U 15 pacientů, kteří byli dlouhodobě monitorováni byl molekulární relaps

zaznamenán u 8 pacientů (pacient č. 1, č. 2, č. 3, č. 5, a pacientka č. 4, č. 9, č. 10, č. 16), z nichž u 3 pacientů (pacient č. 1 a pacientka č. 9, č. 16) byl molekulární relaps zaznamenán

2x a u jednoho pacienta (pacient č. 2) 3x. Z této skupiny sledovaných pacientů zemřeli 2 pacienti (pacient č. 1, č. 2) na progresi základního onemocnění. U pacientky č. 9 došlo k úmrtí

na infekční komplikace. Pacientka č. 16 zemřela na komplikace spojené s podávanou terapií. 6 pacientů (pacient č. 12, č. 17 a pacientka č. 8, č. 10, č. 13, č. 16) podstoupilo allogenní

transplantaci krvetvorných buněk. V současnosti je 10 pacientů ( pacient č. 3, č. 6, č. 7, č. 12, č. 17 a pacientka č. 4, č. 8, č. 10, č. 11, č. 13) v remisi onemocnění a dochází k pravidelným

kontrolám. U pacienta č. 5 došlo v nedávné době k molekulárnímu relapsu, po kterém byla nasazena indukční terapie mylotargem a monitoruje se jaká na ni bude odpověď.

Z výsledků diplomové práce výplývá, že dlouhodobé sledování minimální zbytkové

choroby u pacientů s AML pomocí kvantifikace exprese fúzních genů (RQ RT-PCR) je

proveditelné. Lze předpovědět cytogenetický a hematologický relaps. Molekulární relaps je

možné pravděpodobně ovlivnit chemoterapií. Pro potvrzení těchto závěrů by bylo potřeba většího množství dat a delšího sledování pacientů. Naléhavou nutností zůstává vytvoření standardizovaných léčebných protokolů pro detekci minimální zbytkové choroby.

58

5. ZÁVĚR

Akutní myeloidní leukémie (AML) představují skupinu maligních hematologických

onemocnění, sestávající z řady podskupin s různým klinickým i laboratorním nálezem, prognózou a odpovědí na terapii. Fúzní geny, které jsou výsledkem chromozomálních

abnormalit zodpovědných za vznik některých subtypů leukémií, jsou označovány jako molekulární markery. Tyto diagnosticky významné geny se vyskytují přibližně u 30%

pacientů s AML a jsou vhodné pro dlouhodobé sledování minimální zbytkové choroby, tedy populace leukemických buněk, která již není detekovatelná morfologicky. V současnosti je

nejčastěji používanou metodou pro detekci zbytkové choroby u leukémií na molekulární

úrovni kvantitativní „real-time“ RT-PCR (RQ RT-PCR). Zbytkové onemocnění je určováno na základě detekce a následné kvantifikace exprese molekulárního markeru AML.

Pro detekci fúzních genů u AML pacientů jsem používala RNA izolovanou

z leukocytů BM nebo PB, kterou jsem amplifikovala pomocí RT-PCR metod. Zbytkovou chorobu jsem u pacientů s AML monitorovala pomocí metody RQ RT-PCR. U fúzních genů s genem MLL jsem provedla sekvenaci.

Fúzní gen jsem identifikovala u 26 dospělých pacientů s AML. Jednalo se : 9x o fúzní

gen PML/RARα, 8x o fúzní transkript AML1/ETO, 3x o fúzní gen CBFβ/MYH11 a 6x

o MLL fúzní transkripty. U 15 pacientů , u kterých byla dlouhodobě monitorována zbytková

choroba metodou RQ RT-PCR, jsem v 8 případech zaznamenala molekulární relaps. Z této skupiny sledovaných pacientů je nyní 10 pacientů v remisi onemocnění.

Z výsledků diplomové práce je zřejmé, že na základě monitorování dynamiky

zbytkového onemocnění u jednotlivých pacientů je možné předpovědět riziko relapsu a zahájit záchrannou léčbu.

59

6. SUMMARY

Monitoring of minimal residual disease in patients with acute myeloid leukemia Diploma thesis

Acute myeloid leukemias (AML) are heterogenous group of malignant hematological

disorders, consisting of a number of subgroups with various clinical and laboratory findings, prognosis and response to a therapy. Fusion

genes, they originate in chromosomal

abnormalities responsible for the development of some leukemia subtypes, are called

molecular markers suitable for the long-term monitoring of minimal residual disease

– the leukemic population undetectable by morphologic methods. Currently, the most frequent method used for the detection of residual disease in leukemias is „real-time“ quantitative RT-PCR (RQ RT-PCR). Residual disease is determined based on quantification of AML molecular marker expression.

I used RNA isolated from BM or PB leukocytes for the detection of fusion genes

in AML patients. RNA was amplified by RT-PCR methods. I used RQ RT-PCR method for the long-term monitoring of minimal residual disease in patients with AML. Fusion genes including MLL gene were sequenced.

I identified fusion gene in 26 adult AML patients. It was: 9x fusion gene PML/RARα,

8x fusion transcript AML1/ETO, 3x fusion gene CBFβ/MYH11 and 6x MLL fusion transcripts. In 15 AML patients, which were in the long-term monitoring of residual disease by RQ RT-PCR method, I detected molecular relaps in 8 cases. 10 patietns of this group in the long-term monitoring achieved remission after treatment.

Based on the results of this diploma thesis, I can demostrate an effective using of RQ

RT-PCR method as a predictor of the molecular relaps and as the assesment tool for treatment options in individual patients.

60

7. LITERATURA

1. Andersson, A., M. Höglund, B. Johansson, C. Lassen, R. Billström, S. Garwicz, P.G. Nilsson, F. Mitelman, and T. Fioretos. 2001. Paired multiplex reverse-transcriptase

polymerase chain reaction (PMRT-PCR) analysis as a rapid and accurate diagnostic tool for the detection of MLL fusion genes in hematologic malignancies. Leukemia 15: 1293-

1300.

2. Ayton, P.M., and M.L. Cleary.2001. Molecular mechanisms of leukemogenesis mediated by MLL fusion proteins. Oncogene 20: 5695-5707.

3. Beillard, E., N. Pallisgaard, V.H.J. van der Velden, W. Bi, R. Dee, E. van der Schoot,

E. Delabesse, E. Macintyre, E. Gottardi, G. Saglio, F. Watzinger, T. Lion, J.J.M. van Dongen, P. Hokland, and J. Gabert. 2003. Evaluation of candidate control genes for

diagnosis

and

residual

disease

detection

in

leukemic

patients

using

„real-time“ quantitative reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RQ-PCR) – a Europe against cancer program. Leukemia 17/12: 2474-2486.

4. Birke, M., S. Schreiner, M.P. García-Cuéllar, K. Mahr, F. Titgemeyer, and R.K. Slany. 2002. The MT domain of the proto-oncoprotein MLL binds to CpG-containing

DNA and discriminates against metylation. Nucleid Acid. Res. 30: 958-965.

5. Borrow, J., A.D. Goddard, B. Gibbons, F. Katz, D. Swirsky, T. Fioretos, I. Dube, D.A. Winfield, J. Kingston, and A. Hagemeijer. 1992. Diagnosis of acute

promyelocytic leukaemia by RT-PCR: detection of PML-RARA and RARA-PML fusion transcripts. Br. J. Haematol. 82: 529-540.

6. Buonamici, S., E. Ottaviani, G. Visani, F. Bonifazi, M. Fiacchini, M. Baccarani, and G. Martinelli. 2004. Patterns of AML1-ETO transcript expression in patients

with acute myeloid leukemia and t(8;21) in complete hematologic remission. Haematologica 89/1: 103-105.

7. Butler, L.H., R. Slany, X. Cui, M.L. Cleary, and D.Y. Mason. 1997. The HRX protooncogene product is widely expressed in human tissues and localizes to nuclear structures. Blood 89/9: 3361-3370.

8. Campana, D. 2003. Determination of minimal residual disease in leukaemia patients. Br. J. Haematol. 121: 823-838.

9. Cimino, G., M.C. Rapanotti, T. Sprovieri, and L. Elia. 1998. ALL1 gene alterations in acute leukemia: biological and clinical aspects. Haematologica 83/4: 350-357.

61

10. Claxton, D.F., P. Liu, H.B. Hsu, P. Marlton, J. Hester, F. Collins, A.B. Deisseroth,

J.D. Rowley, and M.J. Siciliano. 1994. Detection of Fusion Transcripts Genereted

by the Inversion 16 Chromosome in Acute Myelogenous Leukemia. Blood 83/7: 1750-

1756.

11. Cui, X., I. De Vivo, R. Slany, A. Miyamoto, R. Firestein, and M.L. Cleary. 1998.

Association of SET domain and myotubularin-related proteins modulates growth control. Nat. Genet. 18/4: 331-337.

12. Černý, J., M. Trněný, and P. Klener. 2003. The significance of minimal residual

disease and methods of its detection in patients with hematological malignancies. Klin. onkologie 16/2: 41-48.

13. Drexler, H.G., H. Quentmeier, and R.A. MacLeod. 2004. Malignant hematopoietic cell lines: in vitro models for the study of MLL gene alterations. Leukemia: 18/2: 227-232.

14. Ernst, P., J. Wang, M. Huang, R.H. Goodman, and S.J. Kosmayer. 2001. MLL

and CREB bind cooperatively to the nuclear coactivator CREB-binding protein. Mol. Cell. Biol. 21: 2249-2258.

15. Faretta, M., L.D. Croce, and P.G. Pelicci. 2001. Effects of the acute myeloid leukemia: associated fusion proteins on nuclear architecture. Semin. Hemat. 38/1: 42-53.

16. Felix, C.A., M.R. Hosler, D.J. Slater, R.I. Parker, M. Masterson, J.A. Whitlock, T.R. Rebbeck, P.C. Nowell, and B.J. Lange. 1998. MLL genomic breakpoint distribution

within the breakpoint cluster region in de novo leukemia in children. J. Pediatr. Hematol. Oncol. 20/4: 299-308.

17. Gabert, J., E. Beillard, V.H.J. van der Velden, W. Bi, D. Grimwade, N. Pallisgaard,

G. Barbany, G. Cazzaniga, J.M. Cayuela, H. Cavé, F. Pane, J.L.E. Aerts, D. De Micheli, X. Thirion, V. Pradel, M. González, S. Viehmann, M. Malec, G. Saglio, and J.J.M. van Dongen. 2003. Standardization and quality control studies of „real-time“ quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene

transcripts for residual disease detection in leukemia – A Europe Against Cancer Program. Leukemia 17: 2318-2357.

18. Giles, F.J., A. Keating, A.H. Goldstone, I. Avivi, C.L. Willman, and H.M. Kantarjian. 2002. Acute Myeloid Leukemia. Hematology (Am. Soc. Hematol. Educ.

Program): 73-110.

19. Ginzinger, D.G. 2002. Gene quantification using real-time quantitative PCR: An emerging technology hits the mainstream. Exp. Hematol. 30: 503-512.

62

20. Grimwade, D., K. Howe, S. Langabeer, L. Davies, F. Oliver, H. Walker, D. Swirsky,

K. Wheatley, A. Goldstone, A. Burnett, and E. Solomon. 1996. Establishing

the presence of the t(15;17) in suspected acute promyelocytic leukaemia: cytogenetic,

molecular and PML immunofluorescence assessment of patients entered into the M.R.C. ATRA trial. Br. J. Haematol. 94: 557-573.

21. Grimwade, D. 1999. The Pathogenesis of acute promyelocytic leukemia: evaluation

of the role of molecular diagnosis and monitoring in the management of the disease. Br. J. Haematol. 106: 591-613.

22. Gu, Y., T. Nakamura, H. Adler, R. Prasad, O. Canaani, G. Cimino, C.M. Croce,

and E. Canaani. 1992. The t(4;11) chromosome translocation of human acute leukemias

fuses the ALL-1 gene, related to Drosophila trithorax, to the AF-4 gene. Cell 71/4: 701708.

23. Hoffbrand, A.V., and J.E. Pettit. 2001. Color Atlas of Clinical Hematology, Third edition, Mosby.

24. Hsieh, J.J., P. Ernst, H. Erdjument-Bromage, P. Tempst, and S.J. Korsmeyer. 2003. Proteolytic cleavage of MLL generates a complex of N– and C–terminal fragments that confers protein stability and subnuclear localization. Mol. Cell. Biol. 23/1: 186-194.

25. Kadkol, S.S., A. Bruno, C. Dodge, V. Lindgren, and F. Ravandi. 2004. Comprehensive Analysis of CBFβ-MYH11 Fusion Transcripts in Acute Myeloid Leukemia by RT-PCR

Analysis. J. Mol. Diagn. 6/1: 22-27.

26. Krahulcová, E., M. Matýšková, and M. Penka. 1994. Hematologie. IDVPZ Brno: 40-43.

27. Klener, P. 2003. Hematologie, Vnitřní lékařství. Svazek VIII. Galén: 54.

28. Kundu, M., A. Chen, S. Anderson, M. Kirby, L. Xu, L.H. Castilla, D. Bodine, and P. P. Liu. 2002. Role of Cbfb in hematopoiesis and perturbations resulting from expression

of the leukemogenic fusion gene Cbfb-MYH11. Blood 100/7: 2249-2456.

29. Lawrence, H. J., and C. Largman. 1992. Homeobox genes in normal hematopoiesis and leukemia. Blood 80/10: 2445-2453.

30. Lexová, S., A. Buliková, E. Krahulcová, L. Bourková, and M. Jarošová. 2000. Hematologie pro zdravotní laboranty 1. díl. IDVPZ Brno: 92-93.

31. Liu Yin, J.A. 2002. Minimal residual disease in acute myeloid leukaemia. Best Pract. Res. Clin. Haematol. 15/1: 119-135.

32. Lo Coco, F., C. Nervi, G. Avvisati, and F. Mandelli. 1998. Acute promyelocytic leukemia: a curable disease. Leukemia 12: 1866-1880.

63

33. Lo Coco, F., M. Breccia, and D. Diverio. 2003. The importance of molecular monitoring in acute promyelocytic leukaemia. Best Pract. Res. Clin. Haematol.: 16/3: 503-520.

34. Look, A.T. 1997. Oncogenic transcription factors in the human acute leukemias. Science 278: 1059-1064.

35. Marcucci, G., K. Mrozek, and C.D. Bloomfield. 2005. Molecular heterogenity and prognostic biomarkers in adults with acute myeloid leukemia and normal cytogenetics. Curr. Opin. Hematol. 12/1: 68-75.

36. Mayer, J. 1999. Jaká je optimální terapie mladších nemocných s akutní myeloidní leukémií? Klin. onkologie 12/3: 82-90.

37. Mayer, J., and J. Starý. 2002. Leukemie. Grada Publishing: 96, 100-101.

38. Melnick, A., and J.D. Licht. 1999. Deconstructing a disease: RARα, its fusion partners,

and their role in the pathogenesis of acute promyelocytic leukemia. Blood 93/10: 3167-

3215.

39. Michaud, J., H.S. Scott, and R. Escher. 2003. AML1 Interconnected Pathways of Leukemogenesis. Cancer Invest. 21/1: 105-136.

40. Michálek, J., and J. Šmarda. 2000. Detection of minimal residual disease in acute myeloid leukemia. Scr. Med. 73/4: 223-228.

41. Milne, T.A., S.D. Briggs, H.W. Brock, M.E. Martin, D. Gibbs, C.D. Allis, and J.L. Hess. 2002. MLL targets SET domain methyltransferase activity to Hox gene promoters.

Mol. Cell 10/5: 1107-1117.

42. Naeim, F. 2001. Atlas of Bone Marrow and Blood Patology. Philadelphia Saunders.

43. Pacholíková, J., D. Dvořáková, and J. Mayer. 2002a. Molekulární diagnostika

hematoonkologických onemocnění založená na detekci fúzních genů. XXVI. brněnské onkologické dny, Brno.

44. Pacholíková, J., D. Dvořáková, Y. Brychtová, M. Doubek, M. Protivánková,

and J. Mayer. 2002b. Možnosti a úskalí diagnostiky akutní promyelocytární leukémie na molekulární úrovni. Kongres MEFA. Brno.

45. Priglová, M., and J. Kınig. 2002. Kvantitativní PCR (Q-PCR). Zprávy CEM 11/2: 8286.

46. Roumier, C., P. Fenaux, M. Lafage, M. Imbert, V. Eclache, and C. Preudhomme.

2003. New mechanisms of AML1 gene alteration in hematological malignancies. Leukemia 17: 9-16.

47. Schoch, C., S. Schnittger, W. Kern, M. Dugas, W. Hiddemann, and T. Haferlach.

2003. Acute myeloid leukemia with recurring chromosome abnormalities as defined 64

by the WHO-classification: incidence of subgroups, additional genetic abnormalities,

FAB subtypes and age distribution an unselected series of 1,897 patients with acute myeloid leukemia. Haematologica 88:351-352.

48. Slack, J.L., and M.E. Rusiniak. 2000. Current issues in the management of acute promyelocytic leukemia. Ann. Hematol. 79: 227-238.

49. Stone, R.M. 2002. Treatment of acute myeloid leukemia: state-of-the-art and future directions. Semin. Hematol. 39/3: 4-10.

50. Strout, M.P., G. Marcucci, M.A. Caligiuri, and C.D. Bloomfield. 1999. Core-binding factor (CBF) and MLL-associated primary acute myeloid leukemia: biology and clinical implications. Ann. Hematol. 78/6: 251-264.

51. Tkachuk, D.C., S. Kohler, and M.L. Cleary. 1992. Involvement of a homolog

of Drosophila trithorax by 11q23 chromosomal translocations in acute leukemias. Cell 71: 691-700.

52. Tobal, K., and J.A. Liu Yin. 1998. RT-PCR method with increased sensitivity shows

persistence of PML-RARA fusion transcripts in patiens in long-term remission of APL. Leukemia 12: 1349-1354.

53. Tobal, K., J. Newton, M. Macheta, J. Chang, G. Morgenstern, P.A.S. Evans, G. Morgan, G.S. Lucas, and J.A. Liu Yin. 2000. Molecular quantitation of minimal

residual disease in acute myeloid leukemia with t(8;21) can identify patients in durable remission and predict clinical relaps. Blood 95/3: 815-819.

54. Trka, J., J. Zuna, C. Haškovec, A. Brabencová, M. Kalinová, K. Mužíková, R. Paukertová, O. Hrušák, Z. Zemanová, K. Michalová, and J. Starý. 1999. Detection of BCR/ABL, MLL/AF4 and TEL/AML1 Hybrid Genes and Monitoring of Minimal Residual Disease in Paediatric Pacients with Acute Lymphoblastic Leukaemia. Čas. Lék. čes. 138/1: 12-17.

55. van der Velden, V.H.J., A. Hockhaus, G. Cazzaniga, T. Szczepanski, J. Gabert, and J.J.M. van Dongen. 2003. Detection of minimal residual disease in hematologic

malignancies by real-time quantitative PCR: principles, approaches, and laboratory aspects. Leukemia 17: 1013-1034.

56. van der Velden, V.H.J., N. Boeckx, M. Gonzalez, M. Malec, G. Barnaby, T. Lion, E. Gottardi, N. Pallisgaard, E. Beillard, W.C.J. Hop, P.G. Hoogeveen, J. Gabert, and J.J.M. van Dongen. 2004. Differential stability of control gene and fusion gene

trascripts over time may hamper accurate quantification of minimal residual disease – a study within the Europe Against Cancer Program. Leukemia 18: 884-886.

65

57. van Dongen, J.J.M., E.A. Macintyre, J.A. Gabert, E. Delabesse, V. Rossi, G. Saglio, E. Gottardi, A. Rambaldi, G. Dotti, F. Griesinger, A. Parreira, P. Gameiro,

M.González Diáz, M. Malec, A.W. Langerak, J.F. San Miguel, and A. Biondi. 1999. Standardized RT-PCR analysis of fusion gene transcripts from chromosome aberrations in acute leukemia for detection of minimal residual disease. Leukemia 13: 1901-1928.

58. Viehmann, S., A. Teigler-Schlegel, J. Bruch, C. Langebrake, D. Reinhardt, and J. Harbott. 2003. Monitoring of minimal residual disease (MRD) by real-time quantitative

reverse transcription PCR (RQ-RT-PCR) in childhood acute myeloid leukemia with AML1/ETO rearrangement. Leukemia 17: 1130-1136.

59. Wingo, P.A., T. Tong, and S. Bolden. 1995. Cancer statistics. CA Cancer J. Clin. 45/1: 8-30.

60. Zhong, S., P. Salomoni, and P.P. Pandolfi. 2000. The Transcriptional role of PML and the nuclear body. Nat. Cell Biol. 2: 85-90.

66

8. SEZNAM PŘÍLOH

Příloha 1: programy amplifikace a reverzní transkripce (3 strany)

Tab. 8: Program reverzní transkripce

Tab. 9: Program amplifikace jednokolové RT-PCR pro detekci fúzního genu PML/RARα

Tab. 10: Program amplifikace dvoukolové nested RT-PCR pro detekci fúzního genu AML1/ETO a CBFβ/MYH11

Tab.11: Program amplifikace multiplexové RT-PCR pro detekci fúzních genů s genem MLL

Tab. 12: Program amplifikace dvoukolové nested RT-PCR pro detekci fúzního genu PML/RARα při sledování zbytkové choroby

Tab. 13: Program RQ RT-PCR pro kvantitativní detekci fúzního genu AML1/ETO,

CBFβ/MYH11 a fúzních genů s genem MLL při sledování zbytkové choroby Tab. 14: Program amplifikace sekvenační reakce

Příloha 2: sekvence primerů a prób (4 strany)

Tab.15: Primery pro detekci sledování zbytkové choroby

fúzního genu PML/RARα při záchytu onemocnění a při

Tab. 16: Kombinace primerů pro detekci fúzního genu PML/RARα při záchytu onemocnění a při sledování zbytkové choroby

Tab. 17: Primery pro detekci fúzního genu AML1/ETO a CBFβ/MYH11 při záchytu onemocnění

Tab. 18: Primery pro detekci fúzních genů s genem MLL při záchytu onemocnění Tab. 19: Primery a próby pro RQ RT-PCR při sledování zbytkové choroby

Příloha 3: sekvenování (4 strany)

Tab. 20: Množství templátové DNA v sekvenační reakci v závislosti na délce fragmentu Obr. 23: Sekvence fúzního genu MLL/AF6 Obr. 24: Sekvence fúzního genu MLL/AF9

Obr. 25: Sekvence fúzního genu MLL/ENL

67

Příloha 1: programy amplifikace a reverzní transkripce

Krok

Teplota

Čas

1.

45˚C

15 min

3.

-20˚C

Ihned

Počet cyklů

Teplota

Čas

1x aktivační krok

95˚C

10 min

2.

99˚C

Tab. 8: Program reverzní transkripce.

40x 1x konečná extenze

5 min

94˚C

45 s

72˚C

1 min

58˚C

72˚C

45 s

5 min

Tab. 9: Program amplifikace jednokolové RT-PCR pro detekci fúzního genu PML/RARα.

Počet cyklů

Teplota

Čas

1x aktivační krok

95˚C

10 min


94˚C

30 s

72˚C

60 s

65˚C

72˚C

60 s

7 min

Tab. 10: Program amplifikace dvoukolové nested RT-PCR pro detekci fúzního genu AML1/ETO a CBFβ/MYH11.

Příloha 1: (pokračování)

Počet cyklů

Teplota

Čas

1x aktivační krok

95˚C

10 min


95˚C

30 s

72˚C

60 s

60˚C

72˚C

30 s

7 min

Tab. 11: Program amplifikace multiplexové RT-PCR pro detekci fúzních genů s genem MLL.

Počet cyklů

Teplota

Čas

1x aktivační krok

95˚C

10 min


95˚C

50 s

72˚C

50 s

60˚C

72˚C

50 s

7 min

Tab. 12: Program amplifikace dvoukolové nested RT-PCR pro detekci fúzního genu PML/RARα při sledování zbytkové choroby.

Krok

Teplota

Čas

1.

95˚C

10 min

3.

60˚C

1 min

2. 50x

95˚C

15 s

Tab. 13: Program RQ RT-PCR pro kvantitativní detekci fúzního genu AML1/ETO, CBFβ/MYH11 a fúzních genů s genem MLL při sledování zbytkové choroby.


Počet cyklů

30x

Teplota

Čas

96°C

30 s

50°C

15 s

60°C

4 min

10°C

10 min

Tab. 14: Program amplifikace sekvenační reakce.

Příloha 2: sekvence primerů a prób

(F – přímý primer, R – zpětný primer)

Metoda Jednokolová RT-PCR Záchyt onemocnění

Primer

Sekvence 5΄ - 3΄

M2/F

AGT GTA CGC CTT CTC CAT CAA AG

R8/R

CAG AAC TGC TGC TCT GGG TCT CAA T

M4/F

AGC TGC TGG AGG CTG TGG ACG CGC GGT ACC

M4/F

AGC TGC TGG AGG CTG TGG ACG CGC GGT ACC

Dvoukolová nested

M1/F

Zbytková choroba

RAR/R

AGG GCT GGG CAC TAT CTC TTC

M2/F

AGT GTA CGC CTT CTC CAT CAA AG

RT-PCR/Externí kolo Dvoukolová nested

P2/F

Zbytková choroba

R8/R

RT-PCR/Interní kolo Kontrola

amplifikovatelnosti cDNA

FLT3-12R/F FLT3-R5/R

AGT CAG TGC CCG GGG CAC AC

TGT GCT GCA GCG CAT CCG CA

CAG AAC TGC TGC TCT GGG TCT CAA T

CTT TCA GCA TTT TGA CGG CAA CC

TGT CGA GCA GTA CTC TAA ACA TG

Tab. 15: Primery pro detekci fúzního genu PML/RARα při záchytu onemocnění a při sledování zbytkové choroby.

Metoda Jednokolová RT-PCR pro všechny varianty

Kombinace primerů M4 x R8

Jednokolová RT-PCR pro dlouhou a variabilní variantu

M2 x R8

Dvoukolová nested RT-PCR pro všechny varianty/Interní kolo

P2 x R8

Dvoukolová nested RT-PCR pro dlouhou a variabilní variantu/Interní kolo

M2 x R8

Dvoukolová nested RT-PCR pro všechny varianty/Externí kolo Dvoukolová nested RT-PCR pro dlouhou a variabilní variantu/Externí kolo

M4 x RAR M1 x RAR

Tab. 16: Kombinace primerů pro detekci fúzního genu PML/RARα při záchytu onemocnění a při sledování zbytkové choroby.


Metoda

Primer

Sekvence 5΄ - 3΄

Dvoukolová nested

AML1-A/F

CTA CCG CAG CCA TGA AGA ACC

Dvoukolová nested

AML1-C/F

ATG ACC TCA GGT TTG TCG GTC G

Dvoukolová nested

CBFβ-A/F

GCA GGC AAG GTA TAT TTG AAG G

Dvoukolová nested

CBFβ-C/F

GGG CTG TCT GGA GTT TGA TG

RT-PCR/Externí kolo RT-PCR/Interní kolo RT-PCR/Externí kolo RT-PCR/Interní kolo Kontrola


ETO-B/R

ETO-D/R

MYH11-B2/R

AGA GGA AGG CCC ATT GCT GAA

TGA ACT GGT TCT TGG AGC TCC CT TCC TCT TCT CCT CAT TCT GCT C

MYH11-D2/R

CTT GAG CGC CTG CAT GTT

FLT3-R5/R


FLT3-12R/F


Tab. 17: Primery pro detekci fúzního genu AML1/ETO a CBFβ/MYH11 při záchytu

onemocnění.


Metoda

Primer

Sekvence 5΄ - 3΄

MLL-A/F

CCC AAA GAA AAG CAG TAG TGA

AF6-B2/R

TTC CCG ATC ATC TTT GTT C

AF4-B1/R

Multiplexová RT-PCR/ OUT – MIX MLL

AF9-B3/R

AF10-B4/R

ENL-B7/R

CGT ACC CCG ACT CCT CTA CT

MLL-C/F

CTC AGC CAC CTA CTA CAG GAC

AF6-D2/R

GAT AAC CCC TTC TTT TTC CTG

AF4-D1/R AF9-D3/R

AF10-D4/R

AF1O-D5/R ELL-D6/R

Kontrola


CTG TTC TAT GCT GGC TGC TA

CTG GTT GAT CAT AGC GAA TC

ENL-B8/R

IN – MIX MLL

GAT TTG CTT TGC TTT ATT GG

AF10-B5/R ELL-B6/R

Multiplexová RT-PCR/

TTT GTA GGG AAA GGA AAC TTG

GCT TCC TTG AAA TCG GAT AG

GCC TGA CAC CTT GCT GTT

TTT GGT TTT GGG TTA CAG AAC AGC GAG CAA AGA TCA AAA TC

CCT GGA AAT TTG CAT TTG TAA TCT TCC AAG CGC TTC AAT

CCG ATG TTG GAG AGG TAG AA

ENL-D7/R

GGA CAA ACA CCA TCC AGT C

FLT3-12R/F


ENL-D8/R

FLT3-R5/R

GGC GCT GTT GTC ACT CTC


Tab. 18: Primery pro detekci fúzních genů s genem MLL při záchytu onemocnění.


Fúzní gen/

Referenční gen

Fúzní gen

AML1/ETO

Primer/ Próba

AML1/R

CAC CTA CCA CAG AGC CAT CAA A

AML1/ETO-Próba

AAC CTC GAA ATC GTA CTG AGA AGC ACT CCA

ETO/F

CBFβ/F Fúzní gen

CBFβ/MYH11

MLL/AF6

Fúzní gen MLL/AF9

Fúzní gen MLL/ENL

Referenční gen ABL

ATC CAC AGG TGA GTC TGG CAT T

CAT TAG CAC AAC AGG CCT TTG A

MYH11-1/R

AGG GCC CGC TTG GAC TT

MYH11-3/R

CTC TTT CTC CAG CGT CTG CTT AT

MYH11-2/R CBFβ/MYH11-Próba

Fúzní gen

Sekvence 5΄ - 3΄

CCT CGT TAA GCA TCC CTG TGA

TCG CGT GTC CTT CTC CGA GCC T

MLL/F

AGC CTC CAC CAC CAG AAT CA

MLL/AF6-Próba

AGA AAA AAG TGG CTC CCC GCC CAA

AF6/R

TTT CCA GCA GCT TTA TCT TGA AAA

MLL/F

AGC CTC CAC CAC CAG AAT CA

MLL/AF9-Próba

AGA AAA AAG TGG CTC CCC GCC CAA

AF9/R

GGT CTG GGA TGG TGT GAA GCT

MLL/F

TCT AAG CAA AAA ATT CCA GCA GAT G

MLL/ENL-Próba

ACG GTG CAC TTA AAG TCC ACT CTG GAT CCT G

ENL/R ABL/F

ABL/R

ABL-Próba

GGG CTT CTT GCG CAG TTG

TGG AGA TAA CAC TCT AAG CAT AAC TAA AGG T

GAT GTA GTT GCT TGG GAC CCA

CCA TTT TTG GTT TGG GCT TCA CAC CAT T

Tab. 19: Primery a próby pro RQ RT-PCR při sledování zbytkové choroby.

Příloha 3: sekvenování

Délka fragmentu DNA (bp)

Množství DNA (ng)

100 – 200

1–3

500 – 1000

5 – 20

200 – 500

1000 – 2000 >2000

3 – 10 10 – 40

40 – 1000

Tab. 20: Množství templátové DNA v sekvenační reakci v závislosti na délce fragmentu.


Obr. 23: Sekvence fúzního genu MLL/AF6. Na obrázku jsou znázorněny primery a próby použité ke kvantitativnímu stanovení fúzního genu MLL/AF6 u pacienta s expresí tohoto fúzního genu. Sekvence je vyobrazena v oblasti dvou možných zlomových míst.


Obr. 24: Sekvence fúzního genu MLL/AF9. Na obrázku jsou znázorněny primery a próby použité ke kvantitativnímu stanovení fúzního genu MLL/AF9 u pacienta s expresí tohoto fúzního genu. Sekvence je vyobrazena v oblasti dvou možných zlomových míst.


Obr. 25: Sekvence fúzního genu MLL/ENL. Na obrázku jsou znázorněny primery a próby použité ke kvantitativnímu stanovení fúzního genu MLL/ENL u pacienta s expresí tohoto fúzního genu. Sekvence je vyobrazena v oblasti zlomového místa.

Sledování minimální zbytkové choroby u pacientů. s akutní myeloidní leukémií

Recommend Documents