SITI ZAINATUR RAHMAH

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

PEMBENTUKAN SENYAWA DIMER ANETOL DENGAN BIOKATALIS ENZIM LAKASE DARI JAMUR TIRAM PUTIH

SKRIPSI

SITI ZAINATUR RAHMAH

PROGRAM STUDI S1-KIMIA

DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI UNIVERSITAS AIRLANGGA SURABAYA

2012

Skripsi

Pembentukan Senyawa Dimer Anetol dengan Biokatalis Enzim Lakase dari Jamur Tiram Putih

Siti Zainatur Rahmah


PEMBENTUKAN SENYAWA DIMER ANETOL DENGAN BIOKATALIS ENZIM LAKASE DARI JAMUR TIRAM PUTIH

SKRIPSI

Sebagai Salah Satu Syarat untuk Memperoleh Gelar Sarjana Sains Bidang Kimia pada Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Airlangga.

Oleh : SITI ZAINATUR RAHMAH 080810514

Tanggal Lulus : 10 Agustus 2012

Disetujui Oleh :

Skripsi

Pembimbing I

Pembimbing II

Dr. Alfinda Novi Kristanti, DEA

Dr. Sri Sumarsih, M. Si

NIP. 196711151991022001

NIP. 196001019881002001




LEMBAR PENGESAHAN SKRIPSI

Judul

: PEMBENTUKAN

SENYAWA

DIMER

ANETOL

DENGAN BIOKATALIS ENZIM LAKASE DARI JAMUR TIRAM PUTIH Penyusun

: Siti Zainatur Rahmah

NIM

: 080810514

Pembimbing I

: Dr. Alfinda Novi Kristanti, DEA

Pembimbing II

: Dr. Sri Sumarsih, M. Si

Disetujui oleh :

Pembimbing I

Pembimbing II

Dr. Alfinda Novi Kristanti, DEA

Dr. Sri Sumarsih, M. Si

NIP. 196711151991022001

NIP. 196001019881002001

Mengetahui: Ketua Program Studi Kimia Fakulatas Sains dan Teknologi Universitas Airlangga

Dr. Alfinda Novi Kristanti, DEA NIP. 196711151991022001

ii Skripsi




KATA PENGANTAR

Alhamdulillahirabbil ‘alamin, puji syukur kehadirat Allah SWT atas limpahan

rahmat,

taufiq

dan

hidayah-Nya

sehingga

penyusun

dapat

menyelesaikan penulisan skripsi yang berjudul “Pembentukan Senyawa Dimer Anetol dengan Biokatalis Enzim Lakase dari Jamur Tiram Putih”. Pada kesempatan ini penyusun menyampaikan terima kasih yang sebesarbesarnya kepada : 1. Ibu Dr. Alfinda Novi Kristanti, DEA selaku dosen pembimbing I atas bimbingan, bantuan dan masukan yang sangat bermanfaat bagi penyusun selama penyusunan skripsi ini. 2. Ibu Dr. Sri Sumarsih, M.Si selaku pembimbing II atas bantuan dan kesabaran dalam memberikan bimbingan kepada penyusun. 3. Ibu Dra. Aning Purwaningsih, M.Si selaku dosen wali yang telah memberikan pendampingan selama studi penyusun. 4. Para dosen program studi Kimia, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Airlangga. Semoga Allah selalu merahmati beliau semua. 5. Ayah, bunda, dan kakak tercinta atas hangatnya kasih sayang, dukungan moral, material, dan spiritual. 6. Teman-teman angkatan 2008 Kimia, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Airlangga atas kebersamaan, kekompakan, kerjasama dan dukungannya.

iii Skripsi




7. Adik-adik mentoring 2009 (sinta dan lia), adik-adik mentoring 2010 (fisika, matematika, dan teknobiomedik), dan adik-adik mentoring kimia 2011 (group RnB (Rombongan Ngaji Bareng)). 8. Teman seperjuangan Pipit Dwi N, Muhimmatus Sa’diyah, dan Dwi Setya (lanjutkan perjuangan). Penyusun menyadari bahwa naskah skripsi ini masih sangat banyak kekurangan, oleh karena itu kritik dan saran yang membangun sangat penyusun harapkan. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan.

Surabaya, 30 Agustus 2012 Penyusun,


iv Skripsi




Siti Zainatur Rahmah, 2012, Pembentukan Senyawa Dimer Anetol dengan Biokatalis Enzim Lakase dari Jamur Tiram Putih . Skripsi ini di bawah bimbingan Dr. Alfinda Novi Kristanti, DEA dan Dr. Sri Sumarsih, M.Si. Departemen Kimia, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Airlangga.

ABSTRAK Penggunaan enzim sebagai biokatalis telah banyak digunakan untuk melakukan sintesis senyawa organik. Hal ini dikarenakan enzim bersifat spesifik dan ramah terhadap lingkungan. Salah satu enzim yang banyak digunakan adalah lakase yang merupakan golongan oksireduktase. Penelitian ini dilakukan dengan tujuan mensintesis dimer anetol dengan mengunakan biokatalis enzim lakase. Pada penelitian ini digunakan minyak anis yang mengandung 90% anetol, enzim lakase sebagai biokatalis, dan hidrokuinon sebagai mediator. Enzim lakase yang digunakan merupakan hasil isolasi dari jamur tiram putih (Pleurotus ostreatus) yang memiliki aktivitas sebesar 712,758 U/L. Reaksi pembentukan dimer anetol dilakukan dalam medium bifasa (etil asetat : buffer fosfat = 4:1) yang dilakukan selama 24 jam dan 48 jam. Hasil reaksi kemudian diekstraksi dengan etil asetat dan menghasilkan cairan kental berwarna kecoklatan dengan intensitas warna yang lebih pekat pada reaksi 48 jam. Perbandingan hasil uji GC terhadap minyak anis, reaksi 24 jam, dan reaksi 48 jam menunjukan adanya penambahan peak dan perubahan tinggi puncak pada reaksi 48 jam. Senyawa anetol dan p-anisaldehid memiliki %area yang lebih kecil dibanding pada reaksi 24 jam. Diduga pada reaksi 48 jam dihasilkan senyawa baru yang berasal dari hasil reaksi oksidasi yaitu kariofilena oksida, namun belum teridentifikasi senyawa yang merupakan dimer anetol.

Kata kunci: jamur tiram putih, biokatalis, enzim lakase, anetol

v Skripsi




Siti Zainatur Rahmah, 2012, Formation of Dimer Anethol Compounds by Biocatalys Laccase Enzyme from White Oyster Mushroom.This scription under guidance Dr. Alfinda Novi Kristanti, DEA and Dr. Sri Sumarsih, M.Si.Chemical Departemen, Faculty of Science and Technology, Airlangga University.

ABSTRACT Enzymes as biocatalyst has been much used to perform synthesis of organic compounds. This is because the enzyme is specific and friendly to the environment. The purpose this research is synthesis dimer anethol using laccase enzyme biocatalyst. Laccase enzyme that is widely used is that a group oxireductase. In this study use anise oil containing 90% anethole, the laccase enzyme as a biocatalyst, and hydroquinone as a mediator. Laccase enzyme used is the isolation of the white oyster mushroom (Pleurotus ostreatus) which has the activity of 712,758 U/L. Anetol dimerization performed in medium bifase (ethyl acetate : phosphate buffer = 4:1) is carried out for 24 hours and 48 hours. The reaction was extracted with ethyl acetate and produce a brownish viscous liquid with a more color intensity in the reaction 48 hours. Comparison of GC assay results of anise oil, reaction 24 hours, and 48 hours showed the reaction to the addition of high-peak and peak changes in the reaction 48 hours. Anethole compound and p-anisaldehyde %area smaller than in the reaction 24 hours. Identification of 48 hours reaction estimed there are new compounds from of the oxidation reaction is caryophyllene oxide, but has not identifed a dimer anethole compound.

Key word : white oyster mushroom, biocatalyst, laccase enzymes, anethole

vi Skripsi




DAFTAR ISI Halaman HALAMAN JUDUL ..................................................................................... i LEMBAR PENGESAHAN .......................................................................... ii KATA PENGANTAR ................................................................................... iii ABSTRAK ...................................................................................................... v ABSTRACT .................................................................................................... vi DAFTAR ISI .................................................................................................. vii DAFTAR TABEL .......................................................................................... ix DAFTAR GAMBAR ..................................................................................... x BAB I PENDAHULUAN .............................................................................. 1 1.1 Latar belakang ..................................................................................... 1 1.2 Rumusan masalah................................................................................. 3 1.3 Tujuan penelitian.................................................................................. 4 1.4 Manfaat penelitian................................................................................ 4 BAB II TINJAUAN PUSTAKA .................................................................. 5 2.1 Jamur tiram putih ................................................................................. 5 2.2 Enzim ................................................................................................... 5 2.2.1 Penggolongan enzim ................................................................... 6 2.2.2 Kespesifikan enzim .................................................................... 6 2.2.3 Mekanisme kerja enzim .............................................................. 7 2.3 Metalloenzyme...................................................................................... 8 2.4 Enzim lakase ........................................................................................ 8 2.5 Minyak atsiri ........................................................................................ 10 2.6 Senyawa fenolik ................................................................................... 11 2.7 Anetol................................................................................................... 13 2.8 Dimerisasi dengan kopling oksidatif fenolik ....................................... 15 2.9 Kromatografi ....................................................................................... 17 2.9.1 Kromatografi lapis tipis (KLT) ................................................... 17 2.10 Spektroskopi....................................................................................... 19 2.10.1 Spektroskopi ultraviolet visibel................................................. 19 2.10.2 GC-MS Spektrometri ................................................................ 19 BAB III METODE PENELITIAN .............................................................. 20 3.1 Tempat penelitian ............................................................................. 20 3.2 Bahan dan alat penelitian ................................................................. 20 3.2.1 Bahan penelitian ...................................................................... 20 3.2.2 Bahan kimia ............................................................................ 20 3.2.4 Alat penelitian ......................................................................... 20 3.3 Prosedur kerja ................................................................................... 21 3.3.1 Isolasi enzim lakase dari jamur tiram putih ............................ 21 3.3.2 Penentuan aktivitas enzim lakase............................................. 21 3.3.3 Reaksi dimerisasi anetol dengan katalis enzim lakase............. 22 3.3.4 Isolasi produk reaksi ................................................................ 23 3.3.5 Analisis produk reaksi.............................................................. 23 3.4 Skema kerja ......................................................................................25

vii Skripsi




BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ...................................................... 26 4.1 Isolasi enzim lakase dari jamur tiram putih ..................................... 26 4.2 Pengendapan ekstrak kasar enzim lakase ......................................... 27 4.3 Penentuan aktivitas enzim lakase...................................................... 29 4.4 Reaksi dimerisasi anetol dengan katalis enzim lakase...................... 31 4.5 Analisis produk reaksi....................................................................... 35 4.5.1 Analisis GC-MS ...................................................................... 36 BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ........................................................ 43 5.1 Kesimpulan ...................................................................................... 43 4.2 Saran ................................................................................................. 43 DAFTAR PUSTAKA .................................................................................... 44

viii Skripsi




DAFTAR TABEL

Nomor

Judul Tabel

Halaman

4.1

Penggolongan enzim.......................................................................... 6

4.2

Kadar minyak atsiri, anetol, fencon dan estragol dalam adas dan anis ................................................................................................... 14

4.3

Data kandungan senyawa pada reaksi 24 jam................................... 39

4.4

Data kandungan senyawa pada reaksi 48 jam................................... 41

ix Skripsi




DAFTAR GAMBAR

Nomor

Judul Gambar

Halaman

2.1

Jamur tiram putih (Pleurotus ostreatus) ........................................... 5

2.2

Struktur enzim lakase yang diisolasi dari M. albomyces .................. 8

2.3

3-Hydroxyanthranilic acid (HAA) dan 2,2′-azino-bis-(3ethylbenzothiazoline-6-sulphonicacid)(ABTS) .............................. 9

2.4

Mekanisme kopling oksidatif eugenol dengan mediator hidroquinon....................................................................................... 10

2.5

Struktur anetol................................................................................... 13

2.6

Struktur kimia cis-anetol (a), trans-anetol (b)................................... 14

2.7

Biosintesis propenilfenol dari jalur shikimat. ................................... 15

2.8

Pembentukan senyawa dimer fenolik ............................................... 16

2.9 . Pembentukan kopling dehidrodieugenol (orto-orto). ....................... 17 2.10

Instrumentasi GC-MS ....................................................................... 20

2.11 Agregasi protein akibat interaksi muatan berlawanan dari protein satu dengan protein lain ........................................................ 28 2.12 Denaturasi protein akibat pelarut organik......................................... 29 2.13 Proses pengendapan protein dengan aseton ...................................... 30 2.14 Reaksi oksidasi asam 2,2’-Azinobis-di-(3-ethylbenzthiazoline6-sulfonate) (ABTS) ......................................................................... 31 2.15 Grafik hubungan absorbansi radikal kation ABTS terhadap waktu................................................................................................. 31 2.16 Skema sistem mediator lakase .......................................................... 33 2.17 Mekanisme kerja Cu pada enzim lakase ........................................... 34 2.18 Hasil pengamatan reaksi dimerisasi anetol dan kontrol.................... 35 2.19 Proses ekstraksi dan produk hasil reaksi dengan enzim lakase ........ 36 2.20 Hasil KLT (a) minyak anis (b) produk reaksi 24 jam (c) produk reaksi 48 jam..................................................................................... 37 2.21 Kromatogram minyak atsiri anis....................................................... 38 2.22 Spektrum massa senyawa anetol....................................................... 38

x Skripsi




2.23 Kromatogram hasil reaksi minyak anis selama 24 jam .................... 39 2.24 Kromatogram hasil reaksi minyak anis selama 48 jam .................... 40 2.25 Mekanisme reaksi oksidasi kariofilena dengan oksigen menjadi kariofilena oksida.............................................................................. 42 2.26 Spektrum massa senyawa kariofilena oksida.................................... 42 2.27 Spektrum massa senyawa 1-(4-Metoksi-fenil)-2-fenil-eten-1,2dion ................................................................................................... 43 2.28 Struktur senyaawa 1-(4-Metoksi-fenil)-2-fenil-eten-1,2-dion .......... 43

xi Skripsi




1

BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang Masalah Indonesia adalah suatu negara kepulauan yang memiliki hutan tropika terbesar kedua di dunia, kaya dengan keanekaragaman hayati dan dikenal sebagai salah satu dari 7 (tujuh) negara megabiodiversity setelah Brazilia. Distribusi tumbuhan tingkat tinggi yang terdapat di hutan tropika Indonesia lebih dari 12 % (30.000) dari yang terdapat di muka bumi (250.000) (Ersam, 2004). Dengan fakta ini, menjadikan Indonesia sebagai negara yang berperan dalam memenuhi kebutuhan dunia akan minyak kelapa sawit, rempah-rempah, dan minyak atsiri. Dewasa ini minyak atsiri merupakan komoditas ekspor Indonesia yang meningkat signifikan sejak 2005 (Anonim, 2006). Minyak atsiri ini biasanya digunakan dalam industri farmasi, kosmetik, parfum, maupun makanan dan minuman. Minyak atsiri merupakan metabolit sekunder tumbuhan yang berfungsi sebagai pertahanan diri dan sarana yang merupakan daya tarik bagi lawan jenisnya (Guenther dan Ketaren, 2006). Di antara sekian banyak produk minyak atsiri yang dihasilkan, Indonesia dikenal sebagai penghasil minyak adas dan minyak anis yang sebagaian besar terdapat di Yogyakarta, Boyolali, dan Sumatera (Handayani, 2001). Minyak atsiri anis diketahui mengandung senyawa golongan propenil fenol, yaitu anetol sebesar 80-90% (Rostiana, 2007). Anetol biasanya digunakan sebagai salah satu bahan dasar dari minyak telon dan obat-obatan. Selain itu anetol juga memiliki aktivitas sebagai antioksidan, anti-inflamasi, dan gastroprotektor (Freire, et al., 2005)

Skripsi




2

Senyawa metabolit sekunder dalam minyak atsiri diantanya merupakan golongan terpenoid, fenolik, dan aril propanoid (Verpoorte, et al., 2000). Di alam, senyawa aril propanoid ditemukan dalam beberapa kelompok berdasarkan strukturnya yaitu lignan, alil fenol, propenil fenol, dan sinamat. Lignan sebagai senyawa yang lebih kompleks dapat disintesis dari kelompok senyawa aril propanoid yang lebih sederhana seperti kelompok propenil fenol (Lenny, 2006). Dewasa ini banyak penelitian dilakukan untuk mentransformasi senyawa aril propanoid menjadi senyawa lain yang memiliki aktivitas biologis yang lebih tinggi. Salah satu cara yang dilakukan yaitu dengan mensintesis senyawa dimer propenil fenol. Hal ini telah dilakukan oleh Arifin (2008) yang mensintesis senyawa dimer dari eugenol. Senyawa dimer eugenol ini kemudian diuji aktivitasnya sebagai antioksidan. Hasil uji aktivitas menunjukkan senyawa eugenol memiliki nilai IC50 yang lebih rendah dibandingkan senyawa dimernya. Dengan demikian pembentukan senyawa dimer eugenol dapat meningkatkan aktivitas antioksidan. Reaksi penggabungan (kopling) senyawa propenil fenol untuk membentuk senyawa dimer dapat dilakukan dengan menggunakan katalis asam seperti HCl (Ngadiwiyana, dkk., 2002), maupun melalui pembentukan radikal dengan UV. Namun cara yang terakhir ini memiliki kekurangan yaitu produk yang dihasilkan merupakan produk campuran lebih dari 5 senyawa (Castro, et al., 2010). Penggunaan katalis dalam reaksi kopling cukup mahal dan kurang ramah terhadap lingkungan sehingga banyak penelitian yang dilakukan untuk menemukan katalis yang lebih ramah terhadap lingkungan.

Skripsi




3

Reaksi dimerisasi senyawa turunan propenil fenol juga dapat dilakukan dengan menggunakan biokatalis enzim oksireduktase, seperti enzim lakase (Zille, 2005). Berdasarkan penelitian sebelumnya, enzim lakase dapat diisolasi dari jamur pelapuk kayu (Risdianto, dkk., 2008), kapang dari tandan kosong kelapa sawit (Dewi, 2011), dan jamur tiram putih (Arifin, 2008). Enzim lakase yang disolasi dari jamur tiram putih memiliki aktivitas spesifik sebesar 0,56 unit/mg protein (Arifin, 2008). Dalam proses katalitiknya, enzim lakase menggunakan oksigen dan hanya menghasilkan air sebagai produk samping, sehingga enzim ini merupakan katalis yang ramah lingkungan (Riva, 2006). Mengacu dari keberhasilan pada penelitian sebelumnya, telah dihasilkan produk senyawa dimer golongan propenil fenol yang bersifat bioaktif, antara lain senyawa dimer dari guaiakol (Andrian, 2007), etil ferulat (Junaedi, 2007), dan asam ferulat (Permatasari, 2007). Oleh karena itu, pada penelitian ini akan dilakukan reaksi dimerisasi terhadap golongan propenil fenol, yaitu anetol dengan katalis enzim lakase dari jamur tiram putih. Proses ini diharapkan dapat menjadi alternatif dalam penyediaan senyawa dimer propenil fenol dengan rendemen yang besar, bioaktivitas yang tinggi serta prosesnya bersifat ramah lingkungan. Produk yang terbentuk dari hasil sintesis akan diidentifikasi menggunakan metode spektroskopi GC-MS.

1.2 Rumusan Masalah 1. Berapa besar aktivitas unit enzim lakase yang diisolasi dari jamur tiram putih? 2. Apakah enzim lakase yang diisolasi dari jamur tiram putih dapat digunakan untuk mensintesis senyawa dimer anetol dari minyak anis?

Skripsi




4

1.3 Tujuan 1. Mengetahui aktivitas unit enzim lakase yang diisolasi dari jamur tiram pitih. 2. Mengetahui apakah enzim lakase yang diisolasi dari jamur tiram putih dapat digunakan dalam mensintesis senyawa aktif dimer anetol dari minyak anis.

1.3 Manfaat Hasil penelitian ini diharapkan dapat menghasilkan pengetahuan baru tentang pembentukan senyawa dimer anetol dengan menggunakan biokatalis enzim lakase yang disolasi dari jamur tiram putih.

Skripsi




5

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

2.1

Jamur Tiram Putih Jamur adalah organisme yang tidak berklorofil sehingga jamur tidak dapat

menyediakan makanan sendiri dengan cara fotosintesis seperti pada tanaman yang berklorofil. Salah satu contoh golongan jamur yang banyak dikonsumsi masyarakat adalah jamur tiram (Pleurotus ostreatus). Secara alamiah golongan jamur ini menempel pada pohon di daerah bersuhu antara 10-32 oC dengan pertumbuhan optimum pada suhu 25-26 oC. Suhu pertumbuhan jamur tiram pada saat inkubasi lebih tinggi dibandingkan suhu pada saat pertumbuhan (pembentukan tubuh buah jamur). Suhu inkubasi jamur tiram berkisar antara 2228 oC dengan kelembaban 60-80 %, sedangkan suhu pada pembentukan tubuh buah berkisar antara 16-22 oC (Dewi, 2009). Taksonomi jamur tiram putih

Skripsi

Kingdom

Fungi

Divisi

Basidiomycota

Kelas

Homobasidiomycetes

Ordo

Agaricales

Family

Tricholomataceae

Genus

Pleurotus

Spesies

Pleurotus ostreatus

Gambar 2.1 Jamur tiram putih (Pleurotus ostreatus)




6

2.2

Enzim Enzim merupakan suatu protein yang dapat mengkatalisis suatu reaksi

kimia dalam makhluk hidup. Sama seperti protein, enzim tersusun dari rantai lurus asam amino yang kemudian mengalami proses pelipatan membentuk suatu struktur tiga dimensi. 2.2.1 Penggolongan enzim Enzim

mempunyai

nama

yang

kompleks

berdasarkan

sistem

penggolongan yang didasarkan pada jenis reaksi yang dikatalisisnya. Golongan enzim utama diringkas dalam tabel 1.1 dibawah ini. Tabel 4.1 Penggolongan Enzim (Stryer, et al., 2007) No 1

Golongan Enzim

Jenis reaksi yang dikatalisis

Oksireduktase

Oksidasi-reduksi. Donor hidrogen atau donor elektron

2

Transferase

3

Hidrolase

Transfer gugus kimia dengan bentuk umum Pemutusan secara hidrolitik pada ikatan C-C, CN, C-O, dan ikatan lainnya.

4

Liase

Pemutusan (bukan hidrolitik) pada ikatan C-C, C-O, dan ikatan lainnya, menyisakan ikatan rangkap; atau, penambahan gugus pada ikatan rangkap dua.

5

Isomerase

Perubahan

susunan

geometris

pada

suatu

molekul 6

Skripsi

Ligase

Pengikatan (penggabungan) dua molekul




7

2.2.2 Kespesifikan enzim Sifat khusus enzim yang paling utama adalah spesifisitas dan aktivitas katalitik. Spesifisitas enzim sangat tinggi baik terhadap reaksi yang dikatalisisnya ataupun terhadap substrat yang dilibatkan dalam reaksi (Horton, et al., 2002). Secara umum terdapat empat jenis enzim yang berbeda spesifisitasnya, yaitu : 

Absolute specificity : enzim mengenali satu jenis substrat



Group specificity : enzim yang bertindak pada molekul yang spesifik gugus fungsionalnya



Linkage specifity : Enzim bertindak pada jenis ikatan kimia tertentu



Stereochemical specifity : enzim bertindak pada isomer sterik atau optik tertentu

2.2.3 Mekanisme kerja enzim Dalam proses kerjanya, enzim tidaklah merubah konstanta kesetimbangan, tetapi dengan enzim dibutuhkan energi yang lebih rendah untuk mengkonversi substrat menjadi produk. Proses katalisis dimulai dengan diikatnya substrat pada daerah sisi aktif enzim sehingga membentuk kompleks enzim substrat dan terjadi reaksi kimia diakhiri dengan pelepasan enzim dan produk (Stryer, et al, 2007).

E + S

Kompleks ES

EP

E + P

Mekanisme katalisis enzim melibatkan gugus fungsi yang terdapat pada sisi aktif enzim. Sisi aktif enzim adalah tempat pengikatan substrat yang mengandung residu asam amino yang berperan dalam pembuatan dan pemutusan ikatan selama proses katalisis. Ikatan – ikatan yang terjadi antara enzim dan substrat adalah ikatan elektrostatik, ikatan hidrogen, gaya Van Der Walls ataupun interaksi hidrofobik. Gugus yang terlibat dalam proses pengikatan substrat disebut

Skripsi




8

gugus pengikat (binding group). Gugus yang terlibat dalam proses katalitik antara enzim dan substrat disebut gugus katalitik (catalytic group). Gugus katalitik terletak pada gugus samping enzim (Horton, et al. 2002).

2.3 Metalloenzyme Metalloenzyme adalah sebuah protein enzimatik yang memiliki hubungan kuat antara bagian protein dan logam, dimana logam tertanam di dalam molekul enzim ini. Logam yang terdapat pada enzim ini biasanya dalam bentuk ion dan peran utamanya adalah berfungsi dalam reaksi enzimatik. Logam memainkan peran langsung dalam pengikatan atom yang bekerja untuk membantu menstabilkan protein setelah reaksi enzimatik. Logam juga membantu dalam proses transfer elektron. Logam ini berada di sisi aktif dari enzim, dimana mereka bertindak sebagai elektrofil yang menarik elektron dari zat lain untuk membentuk sebuah ikatan (Cynthia, et al., 2004)

2.4

Enzim lakase Lakase (EC 1.10.3.2; benzendiol: oksigen oksidoreduktase) sebagian besar

merupakan glikoprotein ekstraseluler yang mengandung atom tembaga dengan bobot molekul 60-80 kDa. Lakase merupakan enzim multy-copper (mangandung banyak ion tembaga) sehingga dapat membantu katalisis reaksi oksidasi beberapa substrat seperti polifenol, substituen fenol, dan diamin. Enzim ini pertama kali ditemukan dalam getah pohon pernis Jepang (Rhus vernicifera), pada tahun 1988 (Kunamneni, et al., 2008).

Skripsi




9

Gambar 2.2 Struktur enzim lakase yang diisolasi dari M. albomyces (Skalova, et al., 2007) Enzim lakase merupakan salah satu enzim yang banyak diteliti sejak abad ke 19. Enzim lakase banyak terdapat pada jamur dan tanaman tingkat tinggi. Pada kelompok jamur, enzim lakase telah diisolasi dari jamur golongan Ascomycetes, Deuteromycetes, Basidiomycetes. Enzim ini termasuk ke dalam kelompok oksidoreduktase, yang dapat mengkatalis reaksi oksidasi dan reduksi. Enzim lakase dapat mengkatalis proses oksidasi senyawa golongan fenolik menjadi radikal, yang selanjutnya dapat membentuk dimer, oligomer, maupun polimerasi. Dalam mekanismenya, enzim lakase menggunakan oksigen, dan hanya menghasilkan air sebagai produk samping. Oleh karena itu, enzim ini merupakan enzim yang sangat ramah lingkungan. Lakase telah banyak diteliti karena sifat spesivitasnya yang rendah terhadap substrat. Hidrokuinon, guaiakol, 2,6-dimetoksifenol, dan p-fenildiamin merupakan substrat-substrat yang sering digunakan. Substrat seperti 2,2-azinobis3-etilbenzethiazolin-6-sulfonat

(ABTS)

berperan

sebagai

mediator

yang

memungkinkan oksidasi komponen non-fenolik pada lignin yang tidak dapat

Skripsi




10

dioksidasi oleh lakase sendiri. Senyawa-senyawa yang telah digunakan sebagai mediator dalam industri antara lain, HAA dan ABTS.

Gambar 2.3 Struktur senyawa (a). 3-Hydroxyanthranilic acid (HAA) (b). 2,2′-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonicacid)(ABTS) Mekanisme reaksi enzimatis oleh lakase adalah reaksi oksidasi satu elektron. Oksigen dibutuhkan sebagai penerima elektron dan kemudian membentuk air. Ketika reaksi oksidasi berlangsung, substrat kehilangan satu elektronnya dan membentuk radikal fenoksi bebas yang berperan sebagai senyawa perantara. Radikal bebas yang terbentuk tersebut dapat melangsungkan reaksi oksidatif enzimatik selanjutnya atau reaksi non-enzimatik seperti hidrasi dan polimerisasi (Rochefort, et al., 2004). Salah satu contohnya adalah dalam pembentukan dimer eugenol, berikut :

Gambar 2.4 Mekanisme kopling oksidatif eugenol dengan mediator hidroquinon (Arifin, 2008)

Skripsi




11

2.5

Minyak atsiri Secara biologis, minyak atsiri merupakan metabolit sekunder yang

biasanya berperan sebagai alat pertahanan diri agar tidak dimakan oleh hewan (hama) ataupun sebagai agen untuk bersaing dengan tumbuhan lain dalam mempertahankan ruang hidup. Pada mulanya istilah “minyak atsiri” atau minyak eteris adalah istilah yang digunakan untuk minyak mudah menguap dan diperoleh dari tanaman dengan cara penyulingan uap. Definisi ini dimaksudkan untuk membedakan minyak/lemak dengan minyak atsiri yang berbeda tanaman penghasilnya (Agusta, 2002). Intensitas suatu bau (harum yang dihasilkan, dengan kekecualian pada kondisi tertentu) merupakan manifestasi dari sifat mudah menguap persenyawaan yang menghasilkan bau harum tersebut (Guenther, 2006). Minyak atsiri yang mudah menguap terdapat di dalam kelenjar minyak khusus di dalam kantung minyak atau di dalam ruang antar sel dalam jaringan tanaman. Minyak atsiri tersebut harus dibebaskan sebelum disuling yaitu dengan merajang/memotong jaringan tanaman dan membuka kelenjar minyak sebanyak mungkin, sehingga minyak dapat dengan mudah diuapkan (Guenther, 2006). Minyak atsiri yang bagian utamanya terpenoid terdapat pada fraksi atsiri yang tersuling uap. Zat inilah penyebab harum, wangi dan bau yang khas pada banyak tumbuhan (Harborne, 2000). Ditinjau dari segi kimia fisika, minyak atsiri hanya mengandung dua golongan senyawa yaitu oleopyna dan strearopyena. Oleopyna adalah bagian hidrokarbon di dalam minyak atsiri dan berwujud cairan. Sedangkan strearopyena adalah senyawa hidrokarbon teroksigenasi yang umumnya berwujud padat (Agusta, 2002).

Skripsi




12

2.6

Senyawa fenolik Senyawa fenolik adalah senyawa yang terbentuk atas cincin aromatik yang

sekurang-kurangnya tersubtitusi oleh satu gugus hidroksil. Contoh yang paling sederhana adalah fenol. Senyawa fenolik merupakan metabolit sekunder yang ada di alam dan biasanya berada dalam bentuk polimernya ataupun terikat pada beberapa gugus fungsi membentuk eter, ester, dan glikosida. Sebagian besar senyawa fenolik termasuk ke dalam golongan oligostilbenoid, flavonoid, fenil propanoid, dan turunan asam fenolat (Saroyobudiyono dan Aisyah, 2006). Aktivitas fisiologis senyawa fenolik yang terdapat pada tumbuhan sangat beragam. Beberapa senyawa tertentu yang tergolong flavanoid, berperan dalam merangsang atau menarik serangga untuk penyerbukan bunga. Selain itu, senyawa fenolik tertentu juga dapat dimanfaatkan manusia

sebagai antikanker,

antioksidan, antimikroba, herbisida dan lain-lain (Andrian, 2007). Menurut Lenny (2006) senyawa fenolik dapat dibedakan menjadi dua golongan berdasarkan biogenetiknya, yaitu senyawa yang berasal dari jalur shikimat dan asetat malonat. Namun ada juga senyawa-senyawa yang berasal dari kombinasi antara kedua jalur biosintesa ini yaitu senyawa-senyawa flavonoida. Senyawa fenolik yang berasal dari jalur shikimat yang utama adalah fenilpropanoid. Senyawa fenol ini memiliki kerangka dasar karbon yang terdiri atas cincin benzen (C6) yang terikat pada ujung rantai karbon propan (C3). Kelompok senyawa fenol ini banyak ditemukan dalam tumbuhan tingkat tinggi. Beberapa jenis senyawa yang termasuk fenil propanoid adalah turunan asam sinamat, alilfenol, propenilfenol, dan kumarin (Robinson, 1995).

Skripsi




13

Senyawa fenol yang bersal dari jalur asetat malonat disebut senyawa poliketida. Senyawa poliketida dapat diklasifikasikan berdasarkan pola struktur tertentu yang berkaitan dengan jalur biogenetiknya diantaranya turunan kromon, antraquinon, dan turunan benzokuinon. Senyawa poliketida memiliki kerangka dasar aromatik yang disusun oleh beberapa unit dua atom karbon dan membentuk suatu rantai karbon yang linier yakni asam poli β-ketokarboksilat yang disebut rantai poliasetil (Manitto, 1999).

2.7

Anetol Anetol memiliki nama lain sebagai para-anisaldehid, para-metoksi

propenil benzen atau “anise champor”, mempunyai rumus kimia C10H12O, berat molekul 148,20 g/mol dan memiliki struktur kimia seperti pada gambar 2.7 (Kusumaningsih, 2000). Kandungan anetol dalam minyak adas maupun minyak anis mengeluarkan aroma yang khas anetol (Sastrohamidjojo, 2004).

Gambar 2.5 Struktur anetol Struktur kimia anetol terdiri dari cincin aromatis dengan dua rantai samping berupa alil dan metoksi. Hal ini memungkinkan anetol untuk dikonversi menjadi senyawa lain dengan tingkat kemanfaatan yang lebih tinggi. Gugus alil yang dimiliki anetol ini sama dengan gugus yang dimiliki oleh eugenol sehingga dapat mengalami polimerisasi kationik dengan menggunakan katalis Friedel Crafts dan asam mineral (Kartikawati, 2007). Anetol memiliki dua isomer yaitu

Skripsi




14

cis dan trans. cis-Anetol memiliki titik didih 70-70,5 oC/2,3 mmHg. trans-Anetol memiliki titik didih 81-81,5 oC/2,3 mmHg (Kusumaningsih, 2000). Struktur kimia cis dan trans anetol ditunjukkan pada gambar 2.6.

Gambar 2.6 Struktur kimia cis-anetol (a), trans-anetol (b) Anetol berwujud cair tak berwarna pada suhu 22,5 0C dan bersifat optis inaktif, berbau anis dan rasanya manis. Anetol tidak dapat mengkristal, berwarna kuning dan agak pahit dengan disertai kenaikan berat jenis di atas 1 jika terkena cahaya, udara, air atau kalor. Kelarutan anetol dalam air kurang baik karena anetol mempunyai sifat polaritas rendah. Dalam industri, anetol biasanya digunakan sebagai bahan dasar minyak telon dan obat batuk (Freire, et al., 2005). Sebagian besar anetol dapat diperoleh dari hasil isolasi minyak atsiri anis dan sebagian adas. Anis

(Pimpinella

anisum

L.) merupakan

salah

satu

tanaman yang tergolong famili Apiaceae, berasal dari Asia, Yunani dan Mesir. Bagian tanaman yang digunakan adalah buahnya yang mengandung minyak atsiri

yang

terdiri dari anetol (80-90%), pinen,

fencon, metil kavikol,

anisaldehid, kamfen, dan felandren (Rostiana, 2007). Berikut perbandingan kadar anetol yang terdapat dalam beberapa tanaman adas dan anis. Tabel 4.2 Kadar minyak atsiri, anetol, fencon dan estragol dalam adas dan anis (Anonim, 2006) Jenis/tempat asal Kadar Anetol Fencon Estragol minyak(g/100 ml) (%) (%) (%) Adas (F. vulgare) 3,83 43,3 33,3 15,3 Cipanas, Jawa

Skripsi




15

Barat Adas (F. vulgare) Lembang , Jawa Barat Adas jamu (F. vulgare) Jawa Tengah Adas (F. dulce) komersial Anis (Pimpinella anisum) komersial

3,23

28,3

28,9

16,9

4,39

44,5

16,9

22,7

2,23

73,0

2,0

0,96

13,97

82,8

-

0,96

Anetol merupakan senyawa golongan fenilpropanoid yang merupakan senyawa turunan propenilfenol. Propenilfenol ini merupakan senyawa yang bertalian satu sama lain dengan alilfenol. Berikut proses biosintesisnya dari jalur shikamat : Asam shikamat

Asam sinamat -X

CH2X

CH2

-H+

propenilfenol

-H+

alilfenol

Gambar 2.7 Biosintesis propenilfenol dari jalur shikimat

2.8 Dimerisasi melalui kopling oksidatif fenolik Pembentukan senyawa dimer dapat dilakukan melalui reaksi kopling oksidatif. Reaksi kopling oksidatif sendiri merupakan suatu reaksi penggabungan antara dua molekul atau lebih, yang telah teroksidasi dalam bentuk radikalnya. Reaksi ini dapat terjadi dengan bantuan biokatalis enzim, misalnya enzim

Skripsi




16

peroksidase dan lakase (Dewick, 1997) Radikal yang terbentuk akan mengalami resonansi dan menghasilkan intermediet radikal yang selanjutnya akan mengalami penggabungan. Berikut mekanisme penggabungan serta kemungkinan produk yang dihasilkan (Eickhoff, et al., 2000).

Gambar 2.8 Pembentukan senyawa dimer fenolik Seperti yang terlihat pada gambar di atas bahwasanya hasil kopling radikal fenoksi dapat membentuk dimer fenolik, baik pada orto-orto, para-para, maupun orto-para. Selain itu juga terdapat kemungkinan penggabungan O-para, O-orto, dan O-O, bergantung pada kestabilan peroduk kopling oksidatif. Berdasarkan Merly (2005) yang melakukan reaksi kopling oksidatif untuk menghasilkan senyawa dimer eugenol dengan bantuan katalis peroksidase,

Skripsi




17

dihasilkan produk dimer dari kopling posisi orto-orto yang dominan. Hal ini dikarenakan kestabilan radikalnya lebih tinggi dibandingkan pada posisi lainnya dan juga halangan steriknya yang lebih kecil. Berikut proses pembentukannya :

O

O

O

O

OCH3

OCH3

OCH3

OCH3

OCH3

O

O

OCH3

OCH3

O

+ O H3CO H3CO

O

Gambar 2.9 Pembentukan kopling dehidrodieugenol (orto-orto)

2.9 Kromatografi Kromatografi

adalah

teknik

pemisahan

campuran

berdasarkan

perbedaan kecepatan perambatan komponen dalam medium tertentu. Pada kromatografi, komponen-komponennya akan dipisahkan antara dua buah fase yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam akan menahan komponen campuran sedangkan fase gerak akan melarutkan komponen campuran. Komponen yang mudah tertahan pada fase diam akan tertinggal, sedangkan komponen yang mudah larut dalam fase gerak akan bergerak lebih cepat (Rizvi, 2008).

Skripsi




18

2.9.1 Kromatografi lapis tipis (KLT) Fenomena yang terjadi pada KLT adalah berdasarkan pada prinsip adsorpsi. Setelah sampel ditotolkan di atas fasa diam, senyawa-senyawa dalam sampel akan terelusi dengan kecepatan yang sangat bergantung pada sifat-sifat kemampuan terikat pada fasa diam dan kemampuan larut dalam fasa gerak, sifat kekuatan elektrolisis yang menarik senyawa di atas fasa diam kemampuan melarutkan senyawa. Pada KLT, secara umum senyawa yang memiliki kepolaran rendah akan terelusi lebih cepat daripada senyawa polar karena senyawa polar terikat lebih kuat pada bahan silika yang mengandung silanol (SiOH2) yang pada dasarnya memiliki avinitas yang kuat terhadap senyawa polar (Gritter, dkk., 1999). Karena prosesnya yang mudah dan cepat, KLT banyak digunakan untuk melihat kemurnian senyawa organik. Biasanya analisis dilakukan dengan mengubah pelarut beberapa kali (minimal 3 macam) dan hasil elusi tetap menampakkan satu noda maka akan dapat dikatakan bahwa sampel yang ditotolkan adalah murni. Selain itu, karena KLT juga dapat menampakkan jumlah senyawa dalam campuran sampel (menurut noda yang muncul), maka KLT dapat digunakan untuk mengikuti atau mengontrol jalannya reaksi organik maupun untuk mengontrol proses pemisahan campuran yang dilakukan menggunakan kromatografi kolom, kromatografi preparatif, dan kromatotron. KLT ini juga merupakan suatu cara yang umum dilakukan untuk memilih pelarut yang sesuai sebelum dilakukan pemisahan menggunakan berbagai jenis kromatografi . Untuk dapat menghitung jarak yang ditempuh oleh noda maka harus diketahui lokasi noda pada plat dengan tepat. Untuk noda yang bewarna dapat

Skripsi




19

dilihat secara visual, tetapi untuk noda yang tidak berwarna dapat diamati dengan cara menggunakan sinar lampu UV, uap iodium dan pereaksi penampak noda. Noda yang telah didapat diberi tanda, dan dihitung harga Rf (Rizvi, 2008).

Rf =

2.10

Jarak titik pusat bercak dari titik awal ---------------------------------------------Jarak garis depan dengan titik awal

Spektroskopi Metode spektoskopi berguna dalam penentuan struktur molekul. Terdapat

banyak teknik spektroskopi yang sering digunakan dalam penentuan struktur molekul dan berat molekul. Salah satunya adalah spektroskopi ultraviolet visible. 2.10.1 Spektroskopi ultraviolet visibel Spektroskopi ulatraviolet Visible (UV-Vis) adalah analisis yang didasarkan pada interaksi sinar dengan panjang gelombang tertentu dengan suatu materi. Materi atau zat tersebut menyerap (absorbsi) sinar, kemudian ditransfer ke atom atau molekul dalam sampel. Dalam hal ini, elektron terluar dipromosikan dari tingkat energi yang lebih rendah ke energi yang lebih tinggi (Underwood, 1998). Spektrum serapan kandungan tumbuhan dapat diukur dalam larutan yang sangat encer dengan blanko pelarut analit tersebut. Pelarut yang sering digunakan yaitu etanol 95%, hal ini dikarenakan sebagian besar senyawa larut dalam pelarut tersebut. Pelarut lain yang umum digunakan antara lain air, metanol, n-heksana, petroleum eter, dan eter. Senyawa yang tidak berwarna diukur pada panjang gelombang 200-400 nm. Sedangkan senyawa berwarna diukur pada panjang gelombang 400-700 nm (Harborne, 1987).

Skripsi




20

2.10.3 GC-MS Spektrometri Kromatografi Gas–Spektrometri Massa merupakan suatu instrumen gabungan kromatografi dan spektroskopi. Instrumen ini terdiri dari kromatografi gas (GC) yang merupakan alat pemisah berbagai komponen dalam analit dan spektrometer massa (MS) untuk mendeteksi struktur tiap komponen yang telah dipisahkan.

Banyak

campuran

senyawa

kimia

yang dapat

dipisahkan,

diidentifikasi, dan dihitung kadarnya dengan GC-MS. Senyawa yang akan dianalisis dengan GC-MS harus bersifat volatil dan stabil terhadap suhu. Selain itu komponen campuran harus mempunyai kelarutan yang baik di dalam fasa gerak. Untuk senyawa yang kurang volatil atau bahkan tak volatil harus diubah dulu menjadi turunan yang volatil dan lebih stabil (Gritter, et al., 1999). Komponen pada instrumen GC antara lain adalah: tangki gas pembawa dengan pengatur tekanan dan pengontrol aliran gas, kolom, fase diam, sistem injeksi, detektor, pengontrol temperatur oven, sistem ionisasi, dan perekam kromatogram (Skoog, et al., 1997). Berikut instrumen GC-MS :

G

Gambar 2.10 Instrumentasi GC-MS

Skripsi




21

BAB III METODE PENELITIAN

3.1

Tempat penelitian Penelitian dilaksanakan pada bulan Februari-Juni 2012, di Laboratorium

Kimia Organik dan Biokimia Departemen Kimia Fakultas Sain dan Teknologi Universitas Airlangga Surabaya.

3.2

Bahan dan alat penelitian

3.2.1 Bahan penelitian Bahan yang digunakan dalam penelitian ini berupa jamur tiram putih dan minyak anis 3.2.2 Bahan kimia Bahan-bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini adalah buffer fosfat, aseton, aquadem, hidroquinon, n-heksan, etilasetat, etanol, dan ABTS. 3.2.3 Alat penelitian Alat-alat penelitian yang digunakan dalam penelitian ini meliputi blender, labu erlenmeyer, corong pisah, rotary vacum evaporator, kertas saring, sentrifuga, GC-MS, UV-Vis, plat KLT, kromatotron, mikropipet, alumunium foil, pendingin, pH-meter, termometer, lemari pendingin, serta peralatan gelas yang biasa digunakan di laboratorium.

Skripsi




22

3.3

Prosedur kerja

3.3.1 Isolasi enzim lakase dari jamur tiram putih Sebanyak 300 gram jamur tiram putih diblender dalam larutan buffer fosfat 0,2 M, pH 6,0, kemudian dihomogenkan dengan homogenizer pada suhu 05oC selama 15 menit. Setelah itu, homogenat disaring menggunakan kain penyaring dan filtrat yang diperoleh disentrifugasi dengan kecepatan 3500 rpm selama 20 menit. Supernatan yang dihasilkan merupakan ekstrak kasar enzim dan didinginkan pada suhu 0-2 0C. Enzim kasar yang diperoleh kemudian dimurnikan dengan aseton untuk meningkatkan aktivitasnya. Pemurnian dengan pelarut organik (aseton) yang didinginkan hingga suhunya di bawah -10 0C. Lalu ekstrak enzim kasar yang telah diperoleh dicampurkan dengan perbandingan aseton:enzim kasar (1:3). Larutan distirer 7-12 menit, didiamkan sampai mengendap pada suhu -10-00C. Campuran disentrifugasi dan endapan yang diperoleh dipisahkan dari filtratnya. Endapan tersebut lalu disuspensikan dalam buffer fosfat pH 6,0 (Mustafa, et al., 2005). Suspensi dari enzim ini kemudian disebut ekstrak enzim. Ekstrak enzim ini kemudian ditentukan aktivitasnya. 3.3.2 Penentuan aktivitas enzim lakase Uji aktivitas lakase ditentukan berdasarkan metode Bourbonnais dan Paice (1990). Prinsip uji ini adalah sebagai berikut : pewarna non-fenol asam 2,2’Azinobis-di-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonate) (ABTS) dioksidasi oleh lakase menjadi radikal kation (ABTS+) yang lebih stabil. Konsentrasi radikal kation yang berwarna biru kehijauan (dibaca pada panjang gelombang 420 nm) berkolerasi dengan aktivitas lakase (Bar, 2001).

Skripsi




23

Pengukuran aktivitas lakase dilakukan sebagai berikut : larutan 0,4 mM ABTS dalam buffer fosfat (pH 6) sebanyak 160 µl dimasukkan ke dalam kuvet 1,5 ml. Selanjutnya ke dalam kuvet dimasukkan 40 µl enzim dan dikocok agar tercampur homogen. Kemudian absorbansi radikal kation diamati pada panjang gelombang 420 nm (εmM = 36 M-1 cm-1) selama 5 menit menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Perubahan absorbansi radikal kation diamati setiap menit. Aktivitas lakase dinyatakan sebagai Internasional Unit (IU) per liter, dengan 1 IU didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dapat mengoksidasi 1 µmol ABTS tiap menit. Aktivitas lakase ditentukan dengan menggunakan persamaan berikut : Aktivitas V

= volum total reaksi (ml)

v

= volum enzim (ml)

ε

= extinction coefficient ABTS pada 420 nm = 36 mM-1 cm-1

∆A.min-1 = perubahan absorbansi tiap menit pada 420 nm d

= perubahan absorbansi tiap menit pada 420 nm

3.3.3 Reaksi dimerisasi anetol dengan katalis enzim lakase Reaksi dimerisasi dengan katalis enzim lakase dilakukan dengan menggunkan medium bifasa. Adanya medium bifasa ini dapat meningkatkan kestabilan produk dan produk akan terekstraksi lebih banyak pada fasa organik jika dibandingkan dengan penggunaan medium monofasa (Mustafa, et al., 2005). Medium bifasa dibuat dari campuran etil asetat dan buffer fosfat dengan perbandingan (4:1). Medium ini dimasukkan ke dalam 2 tabung masing-masing 5 ml.

Skripsi




24

Selanjutnya, ke dalam masing-masing tabung ditambahkan 1ml larutan anetol. Tabung pertama diisi dengan 1ml hidroquinon (0,5 mg/ml) dan 4 ml ekstrak enzim. Sedangkan pada tabung kedua digunakan sebagai larutan kontrol untuk mengetahui adanya reaksi, sehingga tidak ditambahkan ekstrak enzim dan mediator hidroquinon (Johannes, 2000). Kemudian larutan tabung 1 dan 2 diaduk dan dibiarkan hingga membentuk dua lapisan. Diamati adanya reaksi dengan perubahan warna pada medium bifasa. 3.3.4 Isolasi produk reaksi Tahap pertama dilakukan reaksi dimerisasi dalam skala yang lebih besar agar produk yang diperoleh lebih banyak. Media reaksi dibuat dengan mencampurkan buffer fosfat dan etil asetat dengan perbandingan buffer fosfat : etil asetat (1:4). Larutan ekstrak enzim sebanyak 20 ml, anetol 5 ml, hidroquinon 20 ml ditambahkan dalam campuran tersebut. Kemudian campuran diaduk selama 30 menit dan dibiarkan 24 jam dan 48 jam. Endapan yang terbentuk dipisahkan dari larutannya dengan ekstraksi menggunakan etil asetat. Selanjutnya dipekatkan dengan cara menguapkan pelarutnya pada suhu 50-600C. 3.3.5 Analisis produk reaksi Uji kromatografi lapis tipis (KLT) digunakan untuk mengidentifikasi komponen-komponen senyawa yang terdapat pada campuran produk kasar. Pelarut pengembang yang digunakan berupa campuran n-heksana : etil setat dengan variasi perbandingan 1:1, 2:1, 3:2, 4:1, dan 5:1. Dari varasi tersebut dicari perbandingan yang menunjukkan pemisahan optimum dan penampakan noda terbanyak dan selanjutnya produk reaksi dianalisis dengan GC-MS

Skripsi




25

3.4.

Skema kerja

3.4.1 Isolasi enzim lakase dari jamur tiram putih

Jamur Tiram Putih - Diblender + buffer fosfat pH 6,0 (0-5o C) - Homogenat disaring

Endapan

Filtrat

Disentrifugasi 3000 rpm, 10 menit

Enzim Kasar

Endapan

-Ditambahkan aseton -Disentrifugasi 3500 rpm selama 20 menit

Supernatan

Estrak Enzim Bentuk Endapan

Uji Aktivitas Enzim

Skripsi




26

3.4.2 Reaksi dimerisasi anetol dengan mediator enzim lakase

Enzim lakase + anetol +hidroquinon

Produk reaksi

 Distirer selama 2 jam  Dibiarkan selama 24 jam dan 48 jam

Diekstraksi Fasa air

Fasa organik Pelarut diuapkan Produk reaksi

Uji KLT

Uji GC-MS

Skripsi




27

Skripsi




27

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Isolasi enzim lakase dari jamur tiram putih Enzim lakase banyak dihasilkan oleh jamur dan tanaman tingkat tinggi. Enzim lakase telah diisolasi dari jamur golongan Ascomycetes, Deuteromycetes, Basidiomycetes. Dalam penelitian ini, enzim lakase diisolasi dari jamur tiram putih (Pleurotus ostreatus) yang termasuk dalam golongan Basidiomycetes. Pada jamur tiram putih, lakase berperan dalam proses degradasi lignin dan beberapa fungsi lain diantaranya adalah pigmentasi, pembentukan badan buah, pembentukan spora, dan pertahanan (Gianfreda, et al., 1999). Tahap isolasi enzim lakase dari jamur tiram putih dimulai dengan menghaluskan jamur tiram putih dalam larutan buffer fosfat 0,2 M pH 6,0. Penggunaan buffer fosfat 0,2 M pH 6 ini berfungsi untuk menjaga kondisi sekitar pH 6, karena pH optimum enzim lakase dari jamur tiram putih berada pada jangkauan tersebut (Mustafa, et al., 2005). Kemudian jamur yang telah halus dihomogenkan dengan menjaga suhu 0-50C. Kondisi ini dipertahankan untuk mencegah kemungkinan terjadinya denaturasi protein enzim jika suhu lebih tinggi. Selain itu juga menjaga enzim agar tidak aktif sebelum dipakai pada saat reaksi. Setelah itu dilakukan pemisahan ekstrak enzim lakase dari debris sel. Penyaringan dilakukan dengan kain katun dan sentrifuge pada 3500 rpm sehingga dihasilkan supernatan. Supernatan ini merupakan enzim lakase kasar yang berwarna

Skripsi




28

kuning kecoklatan. Agar tidak terjadi denaturasi maka enzim ini disimpan pada suhu 0-20C. 4.2 Pengendapan ekstrak kasar enzim lakase Untuk meningkatkan aktivitas enzim maka perlu dilakukan pemurnian. Ada beberapa macam metode pemurnian enzim yaitu dengan pengendapkan protein dengan amonium sulfat atau pelarut organik dan kromatografi. Adapun metode kromatografi terdapat beberapa macam, diantaranya kromatografi penukar ion, afinitas, filtrasi, dan hidrofob (Scopes, 1994). Pada penelitian ini pengendapan protein dilakukan dengan menggunakan metode pengendapan protein dengan aseton. Pemurnian parsial dengan aseton prinsipnya adalah molekul hidrofobik pada enzim akan berkurang pada saat penambahan aseton. Molekul air di sekitar permukaan hidrofobik protein digantikan oleh molekul aseton, sehingga interaksi hidrofob hilang.

bagian hidrofob pelarut organik

Gambar 2.11 Agregasi protein akibat interaksi muatan berlawanan dari protein satu dengan protein lain (Scopes, 1994)

Skripsi




29

Faktor utama penyebab agregasi molekul protein oleh aseton adalah ikatan elektrostatik dan kekuatan dipolar. Keberadaan aseton dalam larutan protein menyebabkan agregasi antara muatan yang berlawanan dari permukaan molekul protein satu dan protein yang lain. Proses presipitasi dengan pelarut organik terjadi pada keadaan elektrostatik protein. Molekul protein besar akan lebih mudah beragregasi karena memiliki perbedaan muatan yang tinggi. Molekul yang besar akan segera teragregasi karena terjadi perubahan yang besar dari muatan permukaan protein satu dengan protein yang lain. Dalam proses pemurnian dengan aseton suhu harus di bawah -10oC. Pada saat temperatur tinggi, molekul dari pelarut organik masuk ke dalam protein melalui permukaannya, kemudian berinteraksi dengan residu hidrofobik dari protein. Interaksi tersebut menyebabkan protein mengalami denaturasi (Scopes, 1994). Kestabilan struktur saat suhu naik

Interaksi hidrofob internal

Molekul pelarut organik berinteraksi dengan residu hidrofob Gangguan akibat interaksi hidrofob

Gambar 2.12 Denaturasi protein akibat pelarut organik

Skripsi




30

Pengendapan protein dilakukan dengan menambahkan aseton dalam ekstrak enzim dengan perbandingan aseton : ekstrak enzim (3:1). Perbandingan ini merupakan hasil dari penelitian yang dilakukan Mustafa, et al. (2005) untuk pemurnian enzim lakase pada fraksi atau sebanding dengan perbandingan aseton : ekstrak enzim (3:1). Campuran ini kemudian distirer hingga mengendap. Setelah melalui tahap pengendapan, maka didapatkan endapan yang berwarna keputihan yang selanjutnya disentrifuge untuk memisahkan enzim dengan pelarut organik dan disuspensikan dalam buffer fosfat pH 6, seperti pada gambar berikut :

Gambar 2.13 Proses pengendapan protein dengan aseton 4.3 Penentuan aktivitas enzim lakase Pada penelitian ini aktivitas enzim lakase ditentukan dengan metode Bourbonnais dan Paice (1990). Prinsip uji ini adalah sebagai berikut : pewarna nonfenol asam 2,2’-Azinobis-di-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonate) (ABTS) dioksidasi oleh lakase menjadi radikal kation (ABTS+) yang lebih stabil. Konsentrasi radikal kation yang berwarna biru kehijauan (dibaca pada panjang gelombang 420 nm) berkolerasi dengan aktivitas lakase (Bar, 2001). Berikut adalah reaksi perubahan ABTS menjadi radikal kation ABTS.

Skripsi




31

Gambar 2.14 Reaksi asam oksidasi 2,2’-Azinobis-di-(3-ethylbenzthiazoline6-sulfonate) (ABTS) Perubahan absorbansi radikal kation diamati tiap menit selama 5 menit. Aktivitas lakase dinyatakan sebagai Internasional Unit (IU) per liter, dengan 1 IU didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dapat mengoksidasi 1 µmol ABTS tiap menit pada suhu kamar dan pH 6. Berikut grafik hubungan absorbansi radikal kation ABTS terhadap waktu.

4

5

Absorbansi

3 2 1

0 Waktu (menit)

Gambar 2.15 Grafik hubungan absorbansi radikal kation ABTS terhadap waktu.

Skripsi




32

Dari grafik diatas terlihat bahwa gradien maksimum dapat diperoleh dari dari titik 0-1. Dari hasil perhitungan, aktivitas enzim lakase yang diperoleh adalah 712,758 U/L . Nilai aktivitas enzim lakase ini termasuk dalam kategori yang dapat bertindak sebagai biokatalisator dalam reaksi senyawa organik membentuk senyawa dimer, trimer, maupun polimer. Hal ini berdasarkan atas perbandingan nilai dari beberapa hasil isolasi enzim dari berbagai sumber yang digunakan sebagai biokatalisator dalam reaksi organik. Untuk melakukan reaksi pembentukan senyawa dimer, trimer, dan polimer dibutuhkan aktivitas minimum sebesar 68 U/L sedangkan aktivitas maksimum yang pernah dilakukan sebesar 2200 U/L (Kunamneni, et al. 2008).

4.4 Reaksi dimerisasi anetol dengan katalis enzim lakase Enzim lakase yang digunakan dalam penelitian ini merupakan enzim oksidoreduktase, yang dapat mengkatalis reaksi oksidasi dan reduksi. Enzim lakase dapat mengkatalisis proses oksidasi senyawa golongan fenolik menjadi radikal, yang selanjutnya dapat membentuk dimer, oligomer, maupun polimerasi. Dalam reaksi katalisis senyawa fenolik, enzim lakase memerlukan senyawa lain yang bertindak sebagai mediator. Senyawa yang dapat bertindak sebagai mediator adalah senyawa golongan fenolik yang strukturnya lebih sederhana dibandingkan dengan substrat (Adinaraya, 2007). Dalam penelitian ini mediator yang digunakan adalah hidroquinon. Mediator hidrokuinon dapat bertindak sebagai electron shuttle, dimana akan mengalami oksidasi oleh enzim lakase. Setelah itu, mediator yang teroksidasi akan menyebabkan subtrat teroksidasi lebih cepat.

Skripsi




33

Gambar 2.16 Skema sistem mediator lakase Berdasarkan Johannes (2000) hidrokuinon dapat meningkatkan oksidasi hingga 13% lebih tinggi dibandingkan tanpa menggunkan mediator. Mediator hidroquinon yang kecil memungkinkan untuk berinteraksi dengan enzim lebih mudah dibandingkan substrat. Radikal hidrokuinon yang reaktif ini kemudian dapat mengoksidasi substrat fenolik seperti anetol menjadi radikal anetol. Sementara itu O 2 bertindak sebagai akseptor hidrogen dan tereduksi menjadi H2O. Enzim lakase sebagai biokatalis merupakan metaloenzyme yaitu sebuah protein enzimatik yang memiliki hubungan kuat antara bagian protein dan logam, dimana logam tertanam di dalam molekul enzim. Logam pada enzim dapat bekerja dalam proses transfer elektron, transfer muatan, substrat transfer, oksigenasi dan detoksifikasi. Pada haloenzim lakase dapat terdiri dari monomer, dimer, dan trimer. Pada masing-masing monomer terdapat 4 atom Cu yang terdistribusi ke dalam 3 lokasi redoks dan dibagi menjadi 3 tipe. Masing-masing tipe, mempunyai peranan tersendiri (D’souza-ticlo, 2008). Adanya logam Cu pada lakase membantu terjadinya transfer elektron dari substrat yang telah tereduksi kepada molekul oksigen tanpa melepaskan peroksida (intermediet) yang sifatnya toksik. Mekanisme kerja enzim dibagi menjadi 3 langkah

Skripsi




34

utama yaitu : reduksi pada atom mononuclear Cu kepada trinuclear Cu dan akhirnya terjadi reduksi pada O2 oleh trinuclear Cu menjadi H2O (Baldrian & Gabriel, 2006). OH

O

4x

4x R

R

4e-+ 4H+ T2 His-Cys-His

T1 Cu2+Cu

O2

T3 T2

H 2O

Gambar 2.17 Mekanisme kerja Cu pada enzim lakase (Baldrian & Gabriel, 2006) Reaksi dimerisasi anetol dilakukan pada medium bifasa. Penggunaan medium bifasa dapat meningkatkan kestabilan produk dan terekstraksi lebih banyak pada fasa organik jika dibandingkan dengan medium monofasa (Mustafa, et al., 2005) Berdasarkan Adelakun, et al. (2001), medium bifasa dalam sintesis senyawa organik melalui biokatalis lakase dapat dilakukan dengan mencampurkan buffer dan pelarut organik. Adapun pelarut organik yang telah digunakan yaitu aseton, etil asetat, etanol, dioksan, dan metanol. Berdasarkan hasil penelitian tersebut etil asetat merupakan

Skripsi




35

pelarut organik yang dapat menghasilkan produk dengan rendemen terbesar, sehingga pada penelitian ini medium bifasa yang digunakan merupakan campuran etil asetat dan buffer fosfat dengan perbandingan (4:1). Uji kualitatif dengan membandingkan senyawa reaksi pada tabung reaksi II dan kontrol tabung reaksi I menunjukkan adanya perbedaan secara fisik. Pada tabung II dengan komposisi larutan bifasa, enzim lakase, hidroquinon, dan minyak anis menghasilkan warna kecoklatan di lapisan bawah jauh lebih pekat dibandingkan pada tabung I dengan komposisi sama namun tanpa penambahan enzim lakase. Hal ini dapat dikatakan telah terjadi perubahan, yang kemungkinan karena terbentuknya terbentuk suatu senyawa baru dalam tabung II.

Tabung I

Tabung II

Gambar 2.18 Hasil pengamatan uji kualitatif reaksi dimerisasi anetol (tabung II) dan kontrol (tabung I) Untuk mengisolasi produk yang terbentuk, reaksi dilakukan dalam skala yang lebih besar yaitu dengan 5 ml minyak anis pada medium bifasa (etil asetat : buffer fosfat = 4:1). Campuran distirer selama 2 jam dan dibiarkan selama 24 jam dan 48 jam. Kemudian dilakukan ekstraksi dengan etil asetat untuk memisahkan fasa organik

Skripsi




36

dan fasa airnya. Pemisahan yang terjadi didasarkan adanya perbedaan kepolaran antara masing-masing komponen dalam larutan. Fasa organik yang berhasil diekstrak, diuapkan untuk menghilangkan pelarutnya. Dari hasil penguapan dihasilkan cairan kecoklatan kental. Reaksi pada 48 jam menghasilkan intensitas kepekatan yang lebih tinggi dibandingkan reaksi pada 24 jam, seperti gambar dibawah ini :

Reaksi 24 jam

Reaksi 48 jam

Gambar 2.19 Proses ekstraksi dan produk hasil reaksi dengan enzim lakase

4.5 Analisis produk reaksi Pembentukan produk reaksi secara kualitatif dapat dilihat dari perubahan warna dan aroma. Selain itu dapat juga diidentifikasi dengan kromatografi lapis tipis (KLT). Cara ini juga dapat menunjukan jumlah komponen senyawa dalam produk reaksi. Proses pemisahannya berdasarkan perbedaan distribusi masing-masing komponen dalam suatu campuran, kedalam fasa gerak dan fasa diamnya.

Skripsi




37

Pada penelitian ini, larutan pengembang (fasa gerak) yang digunakan adalah campuran n-heksan dan etil asaetat dengan beberapa perbandingan komposisi. Secara umum dari hasil uji KLT ini tidak dapat menunjukkan adanya perubahan reaksi yang signifikan. Hal ini dimungkinkan karena jumlah produk reaksi yang kecil dan jumlah campuran yang banyak, sehingga produk reaksi tidak dapat teridentifikasi.

a

b

c

Gambar 2.20 Hasil KLT (a) minyak anis (b) produk reaksi 24 jam (c) produk reaksi 48 jam

4.5.1 Analisis GC-MS Analisis minyak atsiri anis dengan menggunkan GC-MS menghasilkan kromatogram dengan 5 puncak senyawa seperti yang ditunjukkan pada gambar 2.21 sebagai berikut:

Skripsi




38

Gambar 2.21 Kromatogram minyak atsiri anis Berdasarkan kromatogram di atas diketahui bahwa puncak tertinggi muncul pada waktu retensi 18,96 menit dengan %area 65,71. Dari hasil analisis MS, puncak tertinggi tersebut memiliki m/z 148 yang merupakan senyawa anetol. Sedangkan puncak no 1 merupakan pelarut yaitu klroform. Untuk puncak yang lain secara berurutan 2-4 adalah anetol, p-anisaldehid, dan p-metoksibenzil metil ketone. Adapun spectrum MS anetol tertera pada gambar 2.21.

Gambar 2.22 Spektrum massa senyawa anetol Pada penelitian ini minyak anis direaksikan dalam medium bifasa, menggunakan biokatalis enzim lakase, dan hidroquinon sebagai mediator. Hal ini untuk mereaksikan anetol membentuk senyawa dimernya. Reaksi dilakukan selama

Skripsi




39

24 jam dan 48 jam. Berikut hasil dari analisis GC-MS reaksi minyak anis selama 24 jam.

Gambar 2.23 Kromatogram hasil reaksi minyak anis selama 24 jam Hasil kromatogram senyawa hasil reaksi minyak anis selama 24 jam memiliki puncak tertinggi pada waktu retensi 18,958 menit dengan luas area 77,68% dan dideteksi dengan MS sebagai anetol. Berikut data senyawa yang dihasilkan dari reaksi 24 jam. Tabel 4.3 Data kandungan senyawa pada reaksi 24 jam No Peak

Waktu Retensi (menit)

Nama Senyawa

% Area

1

18,056

Anetol

1,59

2

18.960

Anetol

77,68

3

21,379

p-Anisaldehis

17,25

4

22,992

Anisil aseton

3,47

Analisis GC-MS untuk reaksi minyak atsiri anis selama 48 jam dapat dilihat pada gambar 4.5 berikut.

Skripsi




40

Gambar 2.24 Kromatogram hasil reaksi minyak anis selama 48 jam Kromatogran analisis GC untuk reaksi 48 jam memiliki jumlah puncak yang lebih banyak dibandingkan reaksi 24 jam sehingga dapat disimpulkan terdapat senyawa baru. Berikut perbedaan yang dihasilkan : Waktu Retensi (menit)

Nama Senyawa

% Area Reaksi 24 jam Reaksi 48 jam

18,958

Anetol

77,68

37,42

21,347

p-anisaldehid

17,25

27,27

Senyawa anetol dan p-anisaldehid pada reaksi 24 jam memiliki %area yang lebih besar dibandingkan reaksi 48 jam. Hal ini menunjukan berkurangnya jumlah anetol pada reaksi 48 jam yang dimungkinkan mengalami reaksi membentuk senyawa lain. Berikut data senyawa yang dihasilkan pada reaksi 48 jam :

Skripsi




41

Tabel 4.4 Data kandungan senyawa pada reaksi 48 jam No

Waktu Retensi (menit)

Nama Senyawa

% Area

1

16.897

Anetol

0.86

2

18.024

Estragol

3.82

3

18.958

Anetol dan Estragol

37.42

4

19.009

Anetol dan Estragol

19.30

5

21.080

Kariofilena

0.42

6

21.347

p-Anisaldehis

27.27

7

22.955

Anisil Aseton

6.92

8

23.867

p-metoksipropiofenon

1.39

Peak

dan 1-(4-Metoksi-fenil)-2fenil-eten-1,2-dion

Data di atas menunjukan adanya senyawa yang berbeda dari produk reaksi 24 jam. Dari keenam senyawa tersebut terdapat tiga senyawa yang merupakan hasil reaksi oksidasi yaitu pada waktu retensi 21,083 dengan %area 0,42 merupakan senyawa kariofilena oksida. Senyawa ini dapat disintesis dari kariofilena secara oksidatif dengan pereaksi H2O2 (Kadarohman, dkk., 1999 ). Terbentuknya senyawa ini pada reaksi 48 jam diperkirakan adanya reaksi oksidasi yang dilakukan oleh enzim lakase. Berikut proses pembentukannya.

Skripsi




42

Gambar 2.25 Mekanisme reaksi oksidasi kariofilena dengan oksigen menjadi kariofilena oksida. Berikut adalah spektrum senyawa kariofilena oksida.

Gambar 2.26 Spektrum massa senyawa kariofilena oksida Kemudian pada waktu retensi 23,86 dengan %area 1,39 yang diduga dapat dihasilkan dari proses kopling oksidatif. Berikut hasil analisis MS untuk senyawa tersebut.

Skripsi




43

Gambar 2.27 Spektrum massa senyawa 1-(4-Metoksi-fenil)-2-fenil-eten-1,2-dion Dugaan ini berasal dari data spectrum MS senyawa yang memiliki kemiripan 86% dengan senyawa 1-(4-Metoksi-fenil)-2-fenil-eten-1,2-dion yang terdapat pada library. Struktur senyawa pembanding tertera pada gambar berikut :

Gambar 2.28 Struktur senyawa 1-(4-Metoksi-fenil)-2-fenil-eten-1,2-dion Adanya dua gugus fenil pada senyawa tersebut menunjukkan terjadi reaksi kopling antara dua senyawa yang masing-masing memiliki gugus fenil seperti halnya anetol. Oleh karena analisis hanya menggunakan data MS, senyawa hasil sintesis belum dapat ditentukan strukturnya. Walaupun senyawa anetol memiliki persentasi yang besar dalam minyak anis namun senyawa ini termasuk kurang reaktif dibandingkan senyawa golongan fenol yang memiliki gugus hidroksi. Hal ini menyebabkan anetol lebih sulit bereaksi dibandingkan senyawa eugenol yang berhasil disintesis senyawa dimernya dengan proses yang sama menggunakan biokatalis enzim lakase

Skripsi




44

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan Kesimpulan dari penelitian ini adalah sebagai berikut: 1. Aktivitas unit enzim lakase yang diisolasi dari jamur tiram putih sebesar 712,758 U/L dengan definisi 1 U yaitu jumlah enzim yang dapat mengoksidasi 1 µmol ABTS tiap menit pada suhu kamar dan pH 6. 2. Enzim lakase yang diisolasi dari jamur tiram putih belum dapat digunakan untuk mensintesis senyawa dimer anetol namun dapat digunakan untuk mensintesis senyawa kariofilena oksida dari kariofilena dengan proses oksidasi oleh enzim lakase.

5.2 Saran Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan maka disarankan untuk melakukan reaksi pembentukan dimer anetol dengan biokatalis enzim yang lain. Selain itu, enzim lakase kasar yang dihasilkan dari penelitian ini dapat digunkan untuk mensintesis kariofilena oksida tanpa menggunkan H2O2 sehingga lebih ramah terhadap lingkungan.

Skripsi




45

Daftar Pustaka Adinaraya, k. 2007. Fugal Laccase-a Versatile Enzyme for Biotechnolohical Application. J. Trends in App. Microbiol. 4 : 233-245 Adelakun, O.E., Kuduga T., Parker A., Green I.R., Roes-Hill M., Burton S.G., 2011, Laccase Catalyzed Dimerization of Feluric Acid Amplifies Antioxidant Activity. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymetic 74 : 29-35 Agusta, A. 2002. Minyak Atsiri Tumbuhan Tropika Indonesia. Penerbit ITB. Bandung. Andrian, H. 2007. Identifikasi Produk Oxidative Coupling Etil Ferulat oleh Enzim Peroksidase dan Uji Aktifitas Biologis. Skripsi. Departemen Kimia FMIPA UI Anonim. 2006. Strategi Pengembangan Minyak Atsiri Indonesia. BALITRO. Warta Penelitian dan Pengembangan Pertanian Vol. 28, No. 5 : 13-14 Arifin, Z. S. 2008. Pembentukan Dimer Eugenol dengan Katalis Enzim Lakase dan Uji Aktivitasnya sebagai Antioksidan. Skripsi. Departemen Kimia FMIPA UI. Baldrian, P., Gabriel, J., 2006, Cooper and Cadnium Increas Laccase Activity in Pleuorotus ostreatus, FEMS Microbiology Letters, p. 69-74 Bar, M. 2001. Kinetics and Physico-chemical Properties of White-Rot Fungal Laccase. Thesis. University of The Free State, Bloemfontein. Castro, H. T., Jairo, R. M., and Elena, S. 2010. Anethole Isomerization and Dimerization Induced by Acid Sites or UV Irradiation. Molecules, No. 5 : 5012-5030 Couto, S.R. dan Toca, Jose LH. 2006. Industrial and biotechnological applications of laccases: A review. Tarragona Spain, No. 28: 500-513 D’ souza-ticlo, D.T., 2008, The Lignin-Degrading Enzyme, Laccase from Marine Fungi ; Biochemical and Molecular Approaches. Goa University, p. 28-33 Darmawan, A., Hanafi, M., Broto, S K., Umar, A J. 2003. Pengembangan Pangkalan Data Struktur Kimia di LIPI Berbasis Data Resonansi Magnetik Inti. Serpong : LIPI

Skripsi




46

Dewi, G. F. D. 2011. Isolasi dan Karakterisasi Ekstrak Kasar Enzim Lakase dari Kapang. Skripsi. Departemen Kimia FST Universitas Airlangga. Dewi, I. K. 2009. Efektifitas Pemberian Blotong Kering terhadap Pertumbuhan Jamur Tiram Putih (Pleurotus ostreatus) pada Media Serbuk Kayu. Skripsi. Jurusan Biologi Universitas Muhammadiyah Surakarta Dewick, P. 1997. Medicinal Natural Products : A Biosynthetic. Approach. John Wiley dan Sons ltd : Inggis. Eickhoff H., Jung, Gu E., Rieker A. 2000. Oxidative Phenol Coupling Tyrosine Dimers and Libraries Containing Tyrosyl Peptide Dimers. Tetrahedron, 57, 353-364 Ersam, T. 2004. Keunggulan Biodiversitas Hutan Tropika Indonesia dalam Merekayasa Model Molekul Alami. Makalah Seminar Nasional Kimia VI . Jurusan Kimia, FMIPA, ITS Fessenden, R.J, Fessenden, J.S. 1999. Kimia Organik. A.H. Pudjaatmaka (Penerjemah). Jakarta : Penerbit Erlangga. Freire, R S., Selene M. Morais, Francisco E A., dan Diana C. S. N. Pinheirob. 2005. Synthesis and Antioxidant, Anti-inﬂammatory and Gastroprotector Activities of Anethole and Related Compounds. Bioorganic & Medicinal Chemistry,13 : 4353–4358 Gandjar, Gholib I., Rohman A., 2008, Kimia Farmasi Analisis. Pustaka Pelajar. Yogyakarta. Gianfreda L, Xu F, Bollag JM. 1999. Laccases: a useful group of oxidoreductive enzymes. Bioremed J ; 3: 1-25. Gritter, R. J., Bobbit, J. M., Schwarting, A. F., 1999, Pengantar Kromatografi, Bandung : Penerbit ITB Guenther E, Ketaren S. 2006. Minyak Atsiri Jilid 1. Jakarta : UI-Press. Handayani, W. 2001. Sintesis Polieugenol dengan Katalis Asam Sulfat. Jurnal Ilmu Dasar, Vol.2, No. 2 : 1-13 Harborne, J. B., 2000, Metode Fitokimia, Penentuan Cara Modern Menganalisis Tumbuhan, Terjemahan oleh K. Padmawinata dan Iwang Soediro, Bandung : Penerbit ITB Horton, R; Moran, L; Ocsh, R; Rawn, J; Scringeour, K., 2002, Principles of Biochemistry, 3nd edition, Upper Saddle River: Prentice Hall, p. 130-195.

Skripsi




47

Johannes, C. 2000. Natural Mediators in the Oxidation of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons by Laccase Mediator System. Microbiol. 66 (2): 524-528 Junaidi, Y. 2007. Uji Aktifitas Biologi Senyawa Hasil Reaksi Guaiacol Oleh Enzim Lakase dari Jamur Tiram (Pleurotus Ostreatus). Skripsi. Jakarta: Departemen Kimia FMIPA UI Kadarohman A., Sastrohamidjojo H., Muchalal M., 1999, Sintesis Klovanadiol dari Kariofilena. Karya ilmiah. Kimia FPMIPA UPI dan Kimia FMIPA UGM Kartikawati, N.G. 2007. Pemisahan Logam Berat Dengan Polieugenol Sebagai Carrier Menggunakan Teknik BLM (Bulk Liquid Membrane). Skripsi Jurusan Kimia FMIPA UNDIP Kristanti, A. N., Aminah, N.S., Tanjung, M., Kurniadi, B., 2008. Buku Ajar Fitokimia. Surabaya : Airlangga University Press Kunamneni, A., Francisco J. Plou, Antonio, B., and Miguel, A. 2008. Laccases and their applications: A patent review. CSIC : 28049. Kusumaningsih, T., Sastrohamidjojo, H., Dwi, R. S. 2000. Derivatisasi Anetol Hasil Isolasi Minyak Adas. Tesis. Pascasarjana Universitas Gajah Mada Lenny, S. 2006. Senyawa Flavonoid, Fenilpropanoid, dan Alkaloid. Karya Ilmiah. Jurusan Kimia, FMIPA, Universitas Sumatra Utara. Manitto P, 1999. Biosíntesis Produk Alami, terjemahan oleh Koensoemardiyah. Semarang : IKIP Semarang Press Merly, S. 2005. Dimersiasi Senyawa Eugenol oleh Enzim Peroksidase dan Uji Aktivitasnya sebagai Antioksidan. Skripsi. Jakarta: Departemen Kimia FMIPA UI. Mustafa, R., Muniglia, L., Rovel, B., Girardin, M. 2005. Phenolic Colorants Obtained by Enzymatic Synthesis Using a Fungal Laccase in Hydroorganic Biphasic Syistem. J. Food Res. Inter, No. 38 : 995-1000. Ngadiwiyana, Soelistyowati, Sastrohamidjojo, H., 2002. Dimerisasi Metilisoeugenol dengan Katalis HCl. JKSA. Volume 5, No. 3 : 3-14 Permatasari, N. 2007. Pembentukan Senyawa Dehidrodiferulat Melalui Oksidasi Kopling Asam Ferulat Dengan Biokatalis Peroksidase Dan Uji aktivitas Allelopati. Skripsi. Departemen Kimia FMIPA UI Risdianto, H., Suhardi, Niloperbowo, W., Setiadi, T. 2008. Produksi Lakase dan Potensi Aplikasinya dalam Proses Pemutihan Pulp. Majalah Ilmiah Berita Selulosa. Vol. 43 (1) : 5-17

Skripsi




48

Riva, S. 2006. Laccases: blue enzyme for green chemistry. Rev. Trends in biotech. 25(5): 219-226. Rizvi, V. 2008. Thin Layer Chromatography in Phytochemistry. CRC Press Robinson T. 1995. Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi, terjemahan oleh Kosasih Padmawinata. Bandung : Penerbit ITB. Rochefort, D., Leech, D., Bourbonnais, R. 2004. Electron-transfer mediator systems for bleaching of paper pulp. Green Chem 6: 14–24. Rostiana, Otih. 2007. Perbanyakan Tanaman Anis (Pimpinella anisum L) Secara In Vitro. Bul. Littro. Vol. XVIII, No. 2 : 3-7 Saroyobudiyono, H. dan Aisyah, S. 2006. Suatu Senyawa Trimer Resveratrol dari Kulit Batang Shorea platyclados Sloot (Diptoterocarpacease). Skripsi. Kimia Farmasi FMIPA UPI Bandung Sastrohamidjojo, H. 2004. Kimia Minyak Atsiri. Yogyakarta : Penerbit UGM Skalova, T, Duskova, J, Hasek, J, Oestergaard, L. H., Kolenko, P., Duskova, J.. Hasek, J., 2007. Crystalization and Preliminary X-Ray Diffraction Analysis of the Small Laccase from Streptomyces coelicolor, Acta Crystallographica section F-Structural Biology and Crystalization Communication, P, 1077-1079 Skoog, D.A., Holler, F.J & Nieman, A.T., 1997, Principle of Instrumental Analysis, Fifth Edition, New York, Hancourt Brace & Company Stryer, L., Berg, J. M., Tymoczko, J. L., 2007, Biochemistry, 5th Edition, W. H. Freeman and Company, New York. Underwood, R., M., 1998. Spectrometric Identification of Organic Compound. John Willey and Sons Inc, New York. Verpoorte, R., Alfermann, A. W. (2000). Metabolic Engineering of Plant Secondary Metabolism. Springer. 6 : 1-3 Zille, A., Gornack, B., Rehorek, A. and Cavaco-Paulo, A. 2005. Degradation of Azo Dyes by Trametes Villosa Laccase Over Long Periods of Oxidative Condition. Appl. Environ. Microbial. 71, 6711-6718.

Skripsi




LAMPIRAN Lampiran 1 Pembuatan Larutan 1. Pembuatan Substrat ABTS 5 mM Larutan substrat ABTS dibuat dengan cara menimbang 0,011 gr ABTS. ABTS tersebut dilarutkan dalam Buffer fosfat pH 6 dengan menggunakan aquades. 2. Pembuatan larutan bufer fosfat Larutan A NaH2PO4 0,2 M dibuat dengan cara menimbang 3,12 g NaH2PO4, kemudian dilarutkan dengan akuades. Larutan tersebut diencerkan dalam labu ukur 100 ml hingga tanda batas. Larutan B 0,2 M dibuat dengan cara menimbang 3,56 g Na2HPO4, kemudian dilarutkan dengan akuades. Larutan tercebut diencerkan dalam labu ukur 100 ml hingga tanda batas. Adapun komposisi larutan A dan B untuk memperoleh bufer fosfat pH 6 yaitu mencampurkan 43, 85 ml (larutan A) dan 6,15 ml (larutan B)

Skripsi




Lampiran 2 Penentuan aktivitas enzim lakase dengan substrat ABTS Pengukuran aktivitas lakase dilakukan sebagai berikut : Pengukuran aktivitas lakase dilakukan sebagai berikut : larutan 0,4 mM ABTS dalam buffer fosfat (pH 6) sebanyak 160 µl dimasukkan kedalam kuvet 1,5 ml, selanjutnya kedalam kuvet dimasukkan 40 µl enzim dan dikocok agar tercampur homogen. Kemudian absorbansi radikal kation diamati pada panjang gelombang 420 nm (εmM = 36 M-1 cm-1) selama 5 menit menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Menit ke-

Absorbansi

0

0,023

1

0, 445

2

0,585

3

0,728

4

0,896

5

0,921

Dari data diatas dibuat grafik hubungan antara absorbansi dan waktu. Selanjutnya ditentukan kemiringan gradien maksimum grafik tersebut. Berikut adalah grafik pengamatan absorbansi radikal kation permenit.

Skripsi




4

5

Absorbansi

3 2 1

0 Waktu (menit)

Kemudian gradien maksimum yaitu pada titik 0-1 yaitu 0,422 dimasukkan kedalam rumus. Slope titik 0-1 :

Dimasukkan kerumus :

Skripsi




Lampiran 3 Hasil analisis GC reaksi minyak anis

Skripsi




Lampiran 4 Hasil analisis GC reaksi minyak anis 24 jam

Skripsi




Lampiran 5 Hasil analisis GC reaksi minyak anis 48 jam

Skripsi




Lampiran 6 Hasil analisis MS minyak atsiri anis

Skripsi




Skripsi




Lampiran 7 Hasil analisis MS hasil reaksi 24 jam

Skripsi




Skripsi




Lampiran 8 Hasil analisis MS hasil reaksi 48 jam

Skripsi




Skripsi




Skripsi




Skripsi




Skripsi




Skripsi



SITI ZAINATUR RAHMAH

Recommend Documents