VRK
Síkkromatográfia A kromatográfia a többfokozatú, nagyhatékonyságú, dinamikus elválasztási módszerek gyűjtőneve: közös alapjuk az, hogy az elválasztandó komponensek egy állófázis és egy azon, meghatározott irányban átáramló mozgófázis (eluens) között megoszlanak. A komponensek – általában valamilyen szorpción alapuló – megkötődése az állófázison és visszajutása a mozgófázisba dinamikusan ismétlődik. A mozgófázisban a komponensek eltérő sebességgel haladnak, így egymástól elválnak. Az állófázis egy meghatározott pontján (általában a végén) egy érzékelő (detektor) jelzi a komponenseket, valamilyen fizikai vagy kémiai tulajdonságuk mérésével. A detektor által előállított jel kiértékelése teszi lehetővé az elválasztott komponensek azonosítását (minőségi analízis) és mennyiségük meghatározását (kvantitatív analízis). A kromatográfiás módszerek többféleképpen csoportosíthatók. A mozgófázis halmazállapota alapján beszélhetünk gázkromatográfiáról vagy folyadékkromatográfiáról, a megkötődés alapjául szolgáló fizikai-kémiai folyamat szerint adszorpciós (az állófázis szilárd anyag), abszorpciós vagy megoszlásos (az állófázis folyadék), illetve ion(csere) kromatográfiáról. Technikai kivitelezéstől függően beszélhetünk oszlop- vagy sík(vékonyréteg-, papír-) kromatográfiáról. A kromatográfok felépítésének elvi vázlatát az alábbiakkal adhatjuk meg:
A detektorból jövő jeleket a számítógép feldolgozza, amiből mi egy detektorjel-idő függvényt kromatogramot kapunk. A kromatogram egyik legfontosabb jellemzője a retenciós (visszatartási) idő (tR), amely a minta mozgófázisba (eluensbe) történő bevitelének pillanatától (adagolásától) a komponens maximális koncentrációban való megjelenéséig eltelt idő. Ez az idő minden mintaalkotóra más és más. A tR tartalmazza azt az időt is, amit az eluens a mintaadagolóban, a kolonnaszemcsék közötti térben és a detektorban (a jel képzéséig) eltölt. Ezzel ún. holtidővel (tM) csökkentve a tR értékét a redukált (nettó) retenciós időt kapjuk: tR’=tR - tM. (A tM értékét például a gázkromatográfiában a kolonnán nem kötődő gáz áthaladásának idejével lehet meghatározni.) Kapacitásaránynak (kapacitási tényezőnek):
a mérendő komponens állófázisában (nS) és mozgófázisában (nM) lévő anyagmennyiségei.
1
VRK
Megoszlási hányados:
Szelektivitási tényező:
2
VRK
Az elválasztás hatékonyságának jellemzése Elmélet tányérszám:
Felbontás:
R = 1,0 értékén a csúcsterületek átfedése kb. 2%. Ahhoz, hogy az átfedés ne legyen több 0,1 %-nál, R > 1,5 feltételnek kell teljesülnie. Az elválasztást a retenciós idők változtatásával tudjuk befolyásolni. A retenciós időket pedig elsősorban a megoszlási hányados határozza meg. A megoszlási hányadosra ható kísérleti tényezők a következők: 1. Hőmérséklet. A hőmérséklet növelésével csökken a megoszlási hányados és csökken a retenciós idő. A legalacsonyabb forráspontú anyag eluálódik először. 2. Az állófázis fizikai, kémiai tulajdonságai. Az állófázis cseréje a megoszlási hányados megváltozását okozhatja, ami a kromatográfiás elválasztások hatékonyságát javíthatja. 3. Az állófázis mennyiségétől Minőségi analízis 1. A legegyszerűbb módszer a retenciós idők (pontosabban a redukált retenciós idők) összehasonlítása ismert vegyületek retenciós idejével. Az anyagok azonosításának ez a módja azonban nagyon munkaigényes, különösen, ha a minta összetevőiről nincs előzetes információnk, hiszen a retenciós idők több paramétertől (kolonnahosszúság, áramlási sebesség, hőmérséklet, stb.) függenek. Megbízhatóbb azonosítást nyerhetünk, ha az ismert anyagok retenciós (vagy relatív retenciós) idejével való összehasonlítást két, különböző állófázist tartalmazó kolonnán is elvégezzük. Különösen a gázkromatográfiában használható eredményesen a szintén relatív retenciós adatokon alapuló ún. homológ sorok módszere. Az a tapasztalat ugyanis, hogy szénhidrogén-származékok homológ sorában a retenciós idők a szénatomszámmal exponenciálisan növekednek. Ennek megfelelően a lg tR’ értékeit a szénatomszám függvényében ábrázolva, egy homológ soron belül egyenest nyerünk. Csak említés szintjén: 2. A minőségi azonosítás megbízhatóbb módja, ha a kromatográf szelektív detektorhoz, tömegspektrométerhez, infravörös spektrométerhez, esetleg induktív csatolású plazmát (ICP) alkalmazó spektrométerhez csatlakozik közvetlenül (on line). Ezekkel a kombinált módszerekkel az átfedő kromatográfiás csúcsok is kellő biztonsággal analizálhatók. Mennyiségi értékelés A mennyiségi analízis alapja az, hogy a kromatográfiás csúcsok területe arányos a mintakomponensek mennyiségével, ill. koncentrációjával. Csak aki érti, és biztos a dolgában: A mennyiségi értékelésnél a mért csúcsterülethez (A) keressük az anyagmennyiséget (m). Ehhez viszont ismernünk kell az arányossági tényezőt (a), amit a műszeres analitikában érzékenységnek neveznek. A=a.m 3
VRK
A detektorok érzékenysége komponensenként más és más lehet, és az minden anyag esetében külön-külön meghatározandó. Egy adott komponenstől származó jelet akkor fogadunk el értékelhetőnek, ha az a háttér szórásának (zajszint) háromszorosát meghaladja. Ez tekinthető az adott komponens kimutatási határának, ami a módszerrel mérhető legkisebb anyagmennyiség.
A kromatográfiában is alkalmazzák a műszeres mérési módszereknél jól ismert kalibrációs (hitelesítési) eljárásokat (úgymint kalibrációs görbe felvétele, addíciós és belső standard módszer). Kalibrációs módszer: A standardból 1-5 tagú oldatsorozatot készítünk, azokat kromatografáljuk, és meghatározzuk az adott koncentrációkhoz tartozó csúcs alatti területeket (csúcsterületek meghatározására elektronikus integrátorok, illetve számítógépes programok szolgálnak). Az ismeretlen mintát azonos körülmények között kromatografáljuk, és az előbbi standardokból készített kalibrációs görbe segítségével ismeretlenünk koncentrációja meghatározható. Belső standard módszer: A vizsgálandó mintához egy olyan anyagot keverünk, amelyet a minta eredetileg nem tartalmaz, de a kromatografálás során jól elváló csúcsot ad. A kiértékelés során a belső standardra kapott jelet hasonlítjuk az ismeretlenhez. Papírkromatográfia: A síkkromatográfia egyik fajtája a papírkromatográfia. Mozgófázis halmazállapota szerint folyadékkromatográfia, a megkötődés alapjául szolgáló fizikai-kémiai folyamat szerint adszorpciós abszorpciós vagy ioncsere, a technikai kivitelezés szerint síkkromatográfia. Az elválasztás speciális papíron (nagytisztaságú cellulóz) történik. Az állófázis lehet maga a papír vagy a rajta megkötött folyadék (pl. víz). A mintát tartalmazó oldatot felcseppentik a papírcsík egyik végére és oldószert elpárologtatják A papírcsík végét alkalmasan megválasztott eluenselegybe merítik. A folyadék felszívódása a kapillárishatás következtében megindul. Az eluens a felcseppentett minta komponenseit különböző sebességgel viszi előre. A műveletet a kromatogram kifejlesztésének nevezik. Megfelelő kísérleti feltételek mellett egy idő után a minta alkotói az oldószer elmozdulásának irányában különböző távolságokban, egymástól elválasztva, foltokban helyezkednek el és vagy eleve színesek, vagy alkalmasan megválasztott színező kémiai reagenssel, esetleg megvilágítással (fluoreszcencia) láthatóvá tehetők. 4
VRK
A papírkromatográfiás elválasztásban domináló folyamat a két fázis közötti megoszlás, de szerepet játszik az adszorpció, valamint a cellulózon lévő karboxilcsoportok révén az ioncsere is. Fordított fázisú kromatográfiás elválasztás a papírkromatográfiában is megvalosítható. Kémiai átalakítással, pl. acetilezéssel vagy szilikonolajos impregnálással csökkenthető a papír polaritása és hidrofil jellege Az így előkészített hidrofób papírok olyan kromatográfiás elválasztásra alkalmasak, amelyben az állófázis a víznél kevésbé poláros Az elválasztás hatékonysága az oldószer vagy oldószerelegy megválasztásával nagymértékben befolyásolható. Számos oldószer ill. oldószerkombináció alkalmazható. Ezek közül az aceton, alkoholok, ecetsav, piridin a legismertebbek. A felsoroltak közös sajátossága, hogy vízzel többé-kevésbé elegyednek. A módszer eszközigénye minimális. A kromatogram kifejlesztését üveglappal zárható üveghengerben vagy üvegkádban végezik. Az oldószert pedig vagy az előbbi edényben, vagy egy csészében helyezik el. A zárt edény alkalmazása feltétlenül szükséges, hogy futtatás közben az oldószer el ne párologjon, ill. az elegy összetétele ne változzon meg. A minőségi értékelés a komponensek retenciós adatai (az eluensfront és a komponens előrehaladásának aránya) alapján történik. A papírkromatográfia félkvantitatív mennyiségi értékelésre is lehetőséget ad. Alapja, hogy a foltok területe az. anyagmennyiség logaritmusával arányos. A foltok területének meghatározására alkalmas módszerek (pl.: denzitometrálás, a kivágott folt tömegének mérése) általában 10%-os pontosságot engednek meg. A módszer egyszerűsége az, amely a papírkromatográfiának még mindig helyet biztosít az analitikai eljárások sorában. Vékonyrétegkromatográfia: A vékonyrétegkromatográfia mozgófázis halmazállapota szerint folyadékkromatográfia, a megkötődés alapjául szolgáló fizikai-kémiai folyamat szerint adszorpciós abszorpciós vagy ioncsere, a technikai kivitelezés szerint síkkromatográfia. A papírkromatográfiától abban különbözik, hogy a papír helyett üveg, műanyag vagy alumíniumlemezen vékony rétegben elterített adszorbenst használnak állófázisként. Az előzőekben ismertetett általános feltételek és működési körülmények ennél a módszernél is érvényesek A legáltalánosabban használt adszorbensek a szilikagél. alumínium oxid, diatomaföld. cellulózpor vagy poliamid. A szilikagél savas tulajdonságú, a felületi SiOHcsoportok erős hidrogénkötést létesíthetnek egyes vegyületekkel, mint pl. karbonsavakkal, fenolokkal, aminokkal Adszorpciós fázisként való alkalmazásán kívül használható megoszlásos kromatográfiás célra is (pl. a szilikagélen adszorbeált víz lehet az állófázis). Az alumínium-oxid bázikus és elsődlegesen adszorbensként használható. A diatomföld közel semleges és a megoszlásos kromatográfia hordozójaként alkalmazható. Nagy figyelmet és körültekintést igényel a rétegek elkészítése Az egyenletes szemcseméretű hordozókhoz gipszet vagy műgyanta alapú ragasztót kevernek (az erősebb megkötés miatt) és vizes szuszpenziót készítenek belőle, amelyet zsírtalanított üveglapra kennek fel. A felkenéshez rendszeresített eszköz biztosítja az egyenletes. kb. 0.25 mm-es réteg kialakítását. Kereskedelmi forgalomban rendelkezésre állnak alumíniumfólián, üvegvagy műanyaglapon gyárilag kialakított vékonyrétegek. Ezek megbízhatóan egyenletesek és jól tapadnak a lemezre. További előnyük. hogy előhívás után a foltok kivághatók. A mintát mikropipettával viszik fel a lemez szélére, mennyisége néhány mikrogramm és néhány milligramm közölt változhat. Az eluens megválasztásánál általában ugyanazok a szempontok érvényesek, mint a folyadékkromatográfia más módszereinél. A kromatogram kifejlesztése és értékelése nagyon hasonlít a papírkromatográfiánál elmondottakra. A kromatogram előhívására legáltalánosabban használt reagens a jód és a tömény kénsav, KMnO4 vizes oldata, ill. az UV detektálás. A lemezre permetezett alkoholos jódoldat megjeleníti a foltokat (bár a jód egy idő után szublimál) ha viszont benzidint is 5
VRK
tartalmaz az előhívóoldal, tartós folt nyerhető. A tömény kénsav számos szerves komponenst megfeketít. A papírkromatográfiához viszonyítva a vékonyréteg kromatográfia gyorsabb, változatosabb módszer és a mérések reprodukálhatósága is jobb. A foltok szétterülése kisebb, ennek következtében a felbontás élesebb. A módszert gyakran alkalmazzák más kromatográfiás vizsgálat előtti tájékozódásra, kémiai vagy biokémiai rendszerek változásainak megfigyelésére, gyógyszerek azonosítására, tisztaságellenőrzésére, stb. A szilárd hordozó szemcseméretének csökkentésével, valamint ezekből szűkebb szitafrakciók alkalmazásával (a nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiához hasonlóan) hatékonyabb elválasztás érhető el.
6
