SIGI KANDUNGAN ASAM AMINO EKSATRAK DAUN BENALU DUKU (Loranthaceae Dendrophthoe spec.,) THE AMINO ACID SURVEILANCE OF BENALU DUKU LEAF EXTRACT (Loranthaceae Dendrophthoe spec.,) Ratna SM1, Roostantia I1, Teguh Wahyudi M1, Lazuardi M2 1 Bagian Farmasi-Kedokteran Fakultas Kedokteran UNAIR 2 Subbagian Farmasi-Veteriner Fakultas Kedokteran Hewan UNAIR ABSTRAK Maksud dilakukan penelitian ini adalah untuk perwatakan asam amino daun benalu duku hasil ekstraksi menggunakan pelarut organik methanol dan kloroform dengan menggunakan rancangan penelitian eksploratif. Benalu duku diperoleh dari Kabupaten Muara Enim, Sumatera Selatan, dimana tumbuhaan tersebut hidup pada tumbuhan induk (pohon Benalu) yang berumur tiga tahun. Jumlah tumbuhan Benalu duku yang digunakan sebagai sampel sejumlah empat pohon. Peralatan analisis asam amino yang digunakan adalah Asam Amino Analisator Hitachi AA 835 dengan metode Ninhydrine post column reaction. Ekstraksi daun Benalu duku dilakukan menggunakan asam klorida 6 N selanjutnya dilakukan pemanasan 1100C selama 22 jam. Khusus pencarian jenis L-Cystein dan L-Methionine tak dilakukan pemanasan. Pasca hidrolisis dilakukan analisis menggunakan perangkat analisator secara automatis. Hasil penelitian berupa kromatogram asam amino yang akan dilakukan analisis persentase jenis dan kandungan asam amino serta keragaman asam amino setiap sampel menggunakan perangkat SPSS 12.20. Pelaksanaan penelitian dilakukan di Bagian Ilmu Farmasi-Kedokteran FK UNAIR dan Laboratorium Dasar Bersama UNAIR. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak daun benalu duku terdapat dua puluh jenis asam amino dengan rerata kandungan 7,622% (b/b). Rerata dalam 4,385 mg serbuk daun Benalu duku mengandung 0,033 mg L-Asparagine, 0,017 mg L-Threonine, 0,017 mg L-Serine, 0,042 mg L-Glutamine, 0,019 mg Glycine, 0,018 mg L-Alanine, 0,013 mg L-Cystein, 0,017 mg L-Valine, 0,023 mg L-Methionine, 0,018 mg L-Isoleucine, 0,028 mg L-Leucine, 0,01 mg L-Tyrosine, 0,021 mg L-Phenylalanine, 0,015 mg L-Lysine, 0,008 mg L-Hystidine, 0,019 mg L-Arginine, 0,021 mg L-Proline, 0,009 mg L-Hydroxyproline, 0,0003 mg L-Hydroxylisine, 0,007 mg Ammonia. Kata-kata kunci: asam amino, tanaman obat, benalu duku ABSTRACT The purpose of this research is to explored of the amino acid profile of benalu duku leaf after extracted by organic solvent like methanol and chloroform using explorative research design. The research samples were used leaf of benalu duku on fourth sample sizes. The samples were obtained from their trees host of 3 years old. The trees hosts were founded at Muara Enim, South of Sumatra. The amino acid analyzer was used Hitachii AA 835 with Ninhydrine post column method. The extraction processes were used hydrolysis method by HCL 6 N in 110 0C at 22 hours, especially for LCystein and L-Methionine were not processed in hot conditions. The amino acid analyzer results were appeared peak area of amino acid chromatograms. The statistically analyzed of amino acid available were used percentage method. The variability concentrations of amino acid were analyzed by compared student t test one sample test each amino acid of samples at 5% significance by SPSS 12.20 versions. The result showed that the leaf of benalu duku contained amino acid at mean 7,622% (w/w). The powders of leaf Benalu duku at mean 4.385 mg were contained 0.033 mg of L-Asparagine; 0.017 mg of L-Threonine; 0.017 mg of L-Serine; 0.042 mg of L-Glutamine; 0.019 mg of Glycine; 0.018 mg of LAlanine; 0.013 mg of L-Cystein; 0.017 mg of L-Valine; 0.023 mg of L-Methionine; 0.018 mg of LIsoleucine; 0.028 mg of L-Leucine; 0.01 mg of L-Tyrosine; 0.021 of mg L-Phenylalanine; 0.015 mg of LLysine; 0.008 mg of L-Hystidine; 0.019 mg of L-Arginine; 0.021 mg of L-Proline; 0.009 mg of LHydroxyproline; 0.0003 mg of L-Hydroxylisine and 0.007 mg of Ammonia. Key words: amino acid, plant medicine, benalu duku
PENDAHULUAN Benalu duku diketahui banyak dimanfaatkan oleh sebagian masyarakat di Kotamadya Surabaya sebagai tanaman obat untuk kasus-kasus kanker payu dara. Hasil uji laboratorium diketahui pula bahwa baik in vitro maupun in vivo seduhan air panas daun Benalu duku, pada rentang kadar 10-20% berkhasiat sebagai antiproliferatif (Roostantia et al., 2000 dan Nuraini et al., 2000). Pemanfaatan sari daun benalu duku kadar 1020% sebagai tanaman obat, secara laboratorium tak menimbulkan kerusakan organ hati dan ginjal (Arifa et al., 2005). Fenomena empirik tersebut menjadikan tanaman benalu duku banyak digunakan sebagai objek kajian laboratorium anti kanker sejak akhir tahun 2000. Kandungan tanaman benalu duku hingga saat ini belum banyak diketahui, namun hasil sari air panasnya, diketahui mengandung unsur-unsur penimbul radang pada serebelum mencit Balb-c (Maria Hepi, 2006). Sedangkan hasil kajian Nuraini (2006) menunjukkan adanya unsur terlarut dalam air panas pada daun benalu duku yang berpotensi mengeliminasi sel kanker. Unsur terlarut dalam air panas pada umumnya tanaman diantaranya adalah protein dan mineral. Bila protein terlarut mampu berpotensi sebagai bahan bioaktif berkhasiat, maka tidak menutup kemungkinan unsur terlarut dalam Benalu duku juga memiliki khasiat farmakodinami. Terkait dengan analogi kandungan daun teh sebagai tanaman obat anti kanker, maka unsur asam amino dalam tanaman tersebut memegang peranan penting dalam mencegah timbulnya kanker (Wang et al., 1994). Fenomena tersebut bila dikaitkan dengan potensi antikanker benalu duku, maka pengetahuan mengenai profil asam amino menjadi sangat penting. Persoalannya adalah hingga saat ini kandungan asam amino Benalu duku belum diketahui. Terkait dengan paparan tersebut di atas, maka dilakukan pengkajian mengenai kandungan asam amino tanaman obat benalu duku. Tujuan kajian tersebut adalah untuk mengetahui profil jenis dan kandungan asam amino yang ada dalam tanaman benalu duku. Dengan demikian hasil kajian tersebut dapat
dijadikan landasan teori lebih lanjut untuk meneliti mengenai kandungan bahan–bahan bioaktif lainnya. METODE PENELITIAN Rancangan penelitian yang dipilih adalah model eksploratif sehingga didapatkan data primer berupa aneka jenis dan kandungan asam amino pada tanaman Benalu duku. Jumlah sampel Jumlah tanaman yang digunakan dalam satu daerah populasi ditentukan menggunakan persamaan I, dengan asumsi simpang baku (S) ditetapkan 1,85 (Eni, Sumarno, 2001). Batas toleransi (E) ditetapkan 1,75 dengan alasan penetapan merupakan nilai di bawah 10% harga simpang baku. Bila harga Z1- α/2 pada kepercayaan Z0,95 = 1,96 maka jumlah sampel (N) pada pembulatan ke bawah adalah 4 buah. Persamaan I (World Health Organizaton, 1999) (Z1-α/2)2 • (s)2 N = -------------------(E)2 Koleksi tanaman Tanaman benalu duku berasal dari pohon duku asal Kabupaten Muarae Enim Sumatera Selatan berumur 2 tahun (lebih dari dua kali berbuah). Tanaman induk semang diambil tanggal 15 juni 2006 saat di daerah tersebut masuk dalam musim panas. Tumbuhan yang dipilih adalah bagian daun dan dilakukan determinasi di Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia UPT Balai Konservasi Tumbuhan Kebun Raya Purwodadi, Pasuruan, Jawa Timur. Daun dilakukan pembersihan dan dikeringkan dengan cara diangin-anginkan. Selanjutnya dilakukan pembuatan serbuk herba medicina dengan menggunakan mesin penggiling dan diayak halus. Peralatan analisis Peralatan analisis asam amino yang digunakan adalah Hitachi AA 835, sedangkan teknik analisis yang dipilih adalah metode Ninhydrin post column dengan sistem elusi
gradien kecepatan tinggi. Adapun eluen fase mobil yang digunakan adalah Ninhydrin-bufer (Tabel 1 dan Tabel 2) dengan jenis kolom strongly acidic cation-exchanger (resin penukar ion 4,6 mm ID x 150 mm, dilengkapi dengan resin filter amonia 4 mm ID x 5,0 mm). Kapasitas gerbang suntik kolom analit 50 µl Ekstraksi Serbuk Benalu duku dilakukan penimbangan hati-hati 1 mg dilakukan secara duplo dan dimasukan dalam tabung tertutup (tabung A dan tabung B). Tabung A segera ditambahkan 1,0 ml HCL 6 N dan dilakukan penggojokan selama 10 menit, segera diuapkan dengan gas Nitrogen (khusus analisis L-Cysteine dan L-Metionine).
Tabung B segera ditambahkan 1,0 ml HCL 6 N dan dilakukan penggojokan 10 menit. Tabung B segera dihidrolisis dengan memasukan dalam oven 110 0C (22 jam). Selanjutnya tabung B segera dikeringkan dengan uap Nitrogen sambil direndam dalam Waterbath ± 40 0C. Tabung A dan B segera ditambahkan 0,5 ml NaOH 0,01 N dan didiamkan selama 4 jam pada suhu kamar untuk mengoksidasi asam amino yang ada. Ke dua tabung ditambahkan 1,5 ml HCL 0,02 N dan dilakukan homogenisasi dengan memasukan dalam ultrasonik selama 5 menit. Tabung A dan B dilakukan penyaringan 0,2 µm dan dimasukan dalam vial autosampel.
Tabel 1. Larutan Bufer dan Pencuci Kolom Sebagai Eluen Fase Mobil Bahan Akuabides (Liter) Na sitrat (2H2O) NaOH NaCL Asam sitrat (H2O) Etil alkohol Benzil alkohol Tioglikolat Larutan Brij-35 Asam kaprilat Volume total
Botol A (pH 3,3) 0,71 7,74g 7,07g 20,00g 130,00ml 5,00ml 4,00ml 0,10ml 1L
Botol B (pH 3,3) 0,71 7,74g 7,07g 20,00g 20,00ml 5,00ml 4,00ml 0,10ml 1L
Botol C (pH 4,3) 0,71 14,71g 2,92g 10,50g 5,00ml 4,00ml 0,10ml 1L
Botol D (pH 4,9) 0,71 26,67g 54,35g 6,10g 5,00ml 4,00ml 0,10ml 1L
Botol RGN Pencuci kolom 0,71 8,00g 4,00ml 0,10ml 1L
Tabel 2. Komposisi 1 L Larutan Ninhydrine Bahan Akuabides (Liter) Na asetat anhidrat Asam asetat glacial Ditambah aquabidestilata sampai Etilglikol monoetil eter (20 menit) Ninhydrine (15 menit) Larutan Titanium klorida (10 menit)
Botol 150,00 ml 82,00 g 25,00 ml 250,00 ml 750,00 ml 20,00 g 1,70 ml
Analisis asam amino Peralatan Asam Amino Analyzer (AAA) diatur dengan sistem gradien menggunakan botol Bufer A-D dan BotoL Regenerasi (RGN) sebagai cairan pembersih. Kecepatan alir eluen fase mobil pada pompa Bufer diatur 0,225 ml.menit-1 , sedangkan pompa larutan Ninhydrine diatur 0,3 ml.menit-1, Suhu ruang kolom diatur 53 0C sedangkan suhu ruang reaction post colloumn diatur sampai dengan 100 0C. Peralatan dijalankan dan ditunggu ½ 1 jam untuk conditioning, pada saat demikian larutan RGN dihisap (diperhatikan kontrol panel sehingga muncul kontrol waktu 90’ 144’ dst) selanjutnya secara spontan analisator siap menghisap baku asam amino dan sampel. Pada saat demikian diperhatikan diagram alir panel kontrol kerja sistem gradient Bufer A ke D dan spektrum fotometer ke reaction post colloumn (± 96 0C). Asam amino pada proses elusi akan mengalami dekarboksilasi oksidatif membentuk Aldehid, CO2 dan Amonia. Ninhydrin yang tereduksi Amonia, akan membentuk senyawa kromogen komplek berwarna ungu (λ 570 nm). Proses elusi Prolin dan Hidroksi-Prolin akan menghasilkan kromogen kekuningan (λ 440 nm). Dalam pengerjaan pembacaan analisis diawali pemeriksaan asam amino baku dilanjutkan pembacaan sampel (Hitachi Inc., 1989). Analisis Data Perolehan data berupa jenis asam amino ditentukan berdasarkan waktu tambat (retention time =RT) dalam menit dan peak area asam amino sampel terhadap asam amino baku. Sedangkan kandungan asam amino ditentukan dengan penghitungan seperti dalam Persamaan II dan Persamaan III. Kandungan asam amino dari masing-masing tumbuhan Benalu, dilakukan analisis persentase terhadap berat sampel awal. Sedangkan perbedaan kadar masing-masing sampel dilakukan uji t satu sampel dengan siknifikansi 5% menggunakan perangkat statistik SPSS 12.20. Persamaan II. Nanogram x 40*x100% % Kadar (b/b) = ---------------------------------Berat sampel
Adapun nilai 40 (*) = Berasal dari sampel yang diencerkan dengan 0,5 ml NaOH 0,01 N dan 1,5 ml HCL 0,02N = 2 ml = 2000 µl. Perangkat AAA 835 Hitachi secara spontan menghisap sampel 50 µl. Sedangkan nilai ηg dapat diketahui melalui penghitungan pada Persamaan III. Area sampel Nanogram (ηg) = ---------------------X Berat Molekul asam amino X kadar baku Area baku Kadar baku diketahui = 3 nmol (kecuali LCystein = 1,5 nml). HASIL DAN PEMBAHASAN Kandungan asam amino serbuk daun Benalu duku 4,385 mg berkisar 7,622% dengan rincian 0,327 mg tergolong esensial dan 6,753.10-3 mg tergolong non-esensial, sedangkan kandungan non-asam amino mencapai 92,378% (Gambar 1). Jenis asam amino esensial yang terkandung dengan persentase tertinggi adalah L-Asparagine (rerata 0,745%) sedangkan yang terendah adalah Hydroxylisine (0,006%). Kandungan asam amino non-esensial pada 4,385 mg daun Benalu duku ternyata hanya 0,154% (NH3). Rincian jenis dan kandungan asam amino lebih lanjut, tampak pada Tabel 3 di bawah. Kandungan 7,622% asam amino pada daun Benalu duku diperkirakan 50% lebih kecil dibanding kandungan asam amino pada tanaman jenis non parasit (Wijayakusuma, 2000). Namun demikian temuan persentase tersebut belum bisa dibandingkan dengan kandungan asam amino tanaman jenis Benalu lain. Hal tersebut disebabkan belum adanya data kandungan asam amino pada umumnya tanaman herba medicina golongan parasit. Kecilnya kandungan asam amino Benalu duku diperkirakan banyak terkait dengan struktur fisiologi tanaman induk sebagai unit penghantar terkumpulnya asam amino pada bagian daun benalu.
7,622% asam amino
92,378% non asam amino
Gambar 1. Persentase kandungan asam amino (7,622% b/b) dibandingkan kandungan non-asam amino (93,378% b/b) dalam serbuk daun Benalu duku (4,385 mg).
Tabel 3. Hasil Sigi Jenis dan Kandungan Asam Amino Daun Benalu Duku Sampel I 4,449 mg
II 4,334 mg
III 4,305 mg
IV 4,453 mg
I Hingga IV Rerata 4,385 mg ± 1,751 %KV
p*
L-Asparagine L-Throenine L-Serine L-Glutamine Glycine L-Alanine L-Cysteine L-Valine L-Methionine L-Isoleucine L-Leucine L-Tyrosine L-Phenylalanine L-Lysine L-Histidine L-Arginine L-Proline Hydroxyproline Hydroxylysine
0,725% 0,372% 0,385% 0,951% 0,439% 0,438% 0,082% 0,403% 0,101% 0,408% 0,635% 0,286% 0,468% 0,342% 0,163% 0,462% 0,407% 0,209% 0,005%
0,725% 0,380% 0,380% 0,945% 0,430% 0,406% 0,054% 0,366% 0,015% 0,402% 0,639% 0,183% 0,488% 0,340% 0,185% 0,444% 0,495% 0,226% 0,006%
0,745% 0,365% 0,385% 0,963% 0,437% 0,394% 0,942% 0,367% 0,012% 0,383% 0,648% 0,202% 0,485% 0,345% 0,178% 0,400% 0,478% 0,142% 0,007%
0,768% 0,408% 0,412% 0,985% 0,450% 0,424% 0,082% 0,397% 0,079% 0,439% 0,650% 0,292% 0,472% 0,379% 0,192% 0,421% 0,500% 0,238% 0,009%
0,745% (0,033 mg) ± 2,819% 0,381% (0,017 mg) ± 4,987% 0,390% (0,017 mg) ± 3,590% 0,961% (0,042 mg) ± 1,873% 0,439% (0,019 mg) ± 1,822% 0,415% (0,018 mg) ± 4,675% 0,290 % (0,013 mg) ± 150% 0,383% (0,017 mg)± 4,961% 0,052%(0,023 mg) ±86,538% 0,408% ( 0,018 mg)± 5,637% 0,643% (0,028 mg)± 1,089% 0,241% (0,01mg) ± 23,236% 0,478% (0,021 mg) ± 2,092% 0,351% (0,015 mg) ± 5,242% 0,179 %(0,008 mg) ± 6,927% 0,432% (0,019 mg) ± 6,25% 0,470 %(0,021 mg) ± 9,149% 0,204%(0,009 mg) ±21,078% 0,006%(0,0003 mg)± 0,002%
0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,275 0,000 0,105 0,000 0,000 0,003 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,002 -
Ammonia
0,364%
0,067%
0,107%
0,080%
0,154% (0,007 mg)±90,968%
0,116
Total ± KV
7,645mg ± 57,402%
7,175 mg ± 67,131%
7,985mg ± 66,917%
7,677mg ± 62,5%
7,622 mg ± 59,055%
Non Esensial
Esensial
Asam Amino
Keterangan : * Pada tingkat siknifikansi 0,05. - Menunjukkan tidak memenuhi syarat untuk dilakukan analisis komparasi uji t satu sampel.
Alvin (1965), menyatakan bahwa berbelitnya perjalanan Saluran Konduksi Nutrisi (SKN) dari akar ke daun dapat memberikan kontribusi kualitas kandungan suatu zat pada daun tanaman. Pernyataan Alvin (1965) di atas bila dikaitkan dengan perolehan asam amino dapat disimpulkan bahwa sedikitnya persentase asam amino yang terkandung kemungkinan merupakan dampak berlikunya SKN dari akar tanaman induk. Faktor kesuburan hara tanah diperkirakan dapat mempengaruhi profil kandungan suatu zat pada tanaman herba medicina (Santosa, 1995). Sementara diketahui bahwa air sering menjadi masalah di wilayah-wilayah pertanian beriklim tropis. Disisi lain diketahui bahwa tanaman benalu duku akan hidup subur di wilayah-wilayah tropis bila memiliki kecukupan kadar air pada hara tanah. Diketahui pula bahwa sampel tanaman duku sebagai induk semang merupakan tanaman tropis yang diambil di saat musim panas dimana air tanah kemungkinan mengalami minimisasi. Pada keadaan demikian maka komposisi hara tanah di daerah tanaman induk semang menjadi berkurang sehingga berimplikasi menurunkan kesuburan tanah. Sehubungan dengan konsep-konsep tersebut di atas serta terkait dengan kecilnya persentase asam amino yang terkandung dalam daun benalu duku, maka temuan hasil penelitian diperkirakan merupakan salahsatu manifestasi profil hara tanah. Namun demikian kesimpulan tersebut masih dalam pernyataan hipotesis sebab dalam penelitian ini tidak dilakukan analisis kandungan hara tanah tanaman. Terlepas dari uraian tersebut di atas, dapat digaribawahi bahwa terdapat 92,378% sekumpulan zat di daun benalu duku baik bersama-sama dengan 7,622% asam amino atau bekerja sendiri memiliki potensi besar sebagai anti kanker. Potensi besar tersebut merupakan sekumpulan zat-zat dalam daun Benalu duku pasca mengalami hidrolisis asam kuat. KESIMPULAN Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak daun Benalu duku terdapat dua puluh jenis asam amino dengan rerata kandungan 7,622% (b/b). Rerata dalam 4,385 mg serbuk
daun Benalu duku mengandung 0,033 mg LAsparagine, 0,017 mg L-Threonine, 0,017 mg L-Serine, 0,042 mg L-Glutamine, 0,019 mg Glycine, 0,018 mg L-Alanine, 0,013 mg LCystein, 0,017 mg L-Valine, 0,023 mg LMethionine, 0,018 mg L-Isoleucine, 0,028 mg L-Leucine, 0,01 mg L-Tyrosine, 0,021 mg LPhenylalanine, 0,015 mg L-Lysine, 0,008 mg L-Hystidine, 0,019 mg L-Arginine, 0,021 mg L-Proline, 0,009 mg L-Hydroxyproline, 0,0003 mg L-Hydroxylisine, 0,007 mg Ammonia. SARAN Saran hasil penelitian adalah perlu dilakukan penelitian sejenis dengan melibatkan sampel di berbagai wilayah tropis di Indonesia. Hasil dari penelitian ini daat direkomendasikan bahwa unsur amina (NH3) dapat digunakan sebagai senyawa inditifkator tanaman Benalu duku. DAFTAR PUSTAKA Alvin N, 1965. Textbook of Modern Biology. New York-London-Sidney: ohn Willey & Son, pp 414-415. Arifa M, Roostantia I, Ratna SM, 2005. Pengaruh PemberianInfusum Benalu Duku (Loranthaceae Dendrophthoe spec) Pada kadar Transaminase Serum dan Nekrosis Jaringan hati Tikus. Surabaya : Laporan Penelitian Medical Research Unit. Fakultas Kedokteran Univ. Airlangga Hitachi Inc. 1989. Instruction Manual High Speed Amino Acid Analyzer (AA 835 series). Tokyo-Japan: Hitachi Inc., Press. Maria,H. 2006. Pengaruh Pemberian Infusum Benalu duku (Loranthaceae dendrophthoe spec.,) di atas dosis lazim terhadap gambaran histopatologi Cerebrum mencit (Mus Musculus Albinos Balb-c). Skripsi Sarjana Kedokteran Hewan, Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga. Nuraini F, 2006. Studi kepulihan tikus (Rattus Norvegicus Strain Wistar) penderita kanker pasca pemberian Benalu duku (Loranthaceae dedrophthoe spec.). Dalam : Seminar Nasional Kontribusi Herbal Medicina dan Akupuntur dalam dunia kedokteran Yogyakarta 5 Agustus 2006. Yogyakarta: Bagian Farmasi Kedokteran FK UGM dan BPP PEFARDI. Nuraini F, Lazuardi M, Siti F, 2000. The study of anti cancer effect of Benalu duku (Loranthaceae Dendrophthoe spec.) infusion
to the myeloma induced rat. Jurnal Kedokteran YARSI. 8 (1) : 59-81. Roostantia I, Lazuardi M, Ratna SM, 2000. Perbandingan daya hambat pertumbuhan sel mieloma antara maserasi Benalu duku dan Benalu teh dengan metotreksat. Ebers papyrus. 6 (1): 13-21. Santosa MH, 1995. Penyediaan Bahan Penelitian Tumbuhan Obat : Dalam Rapat Kerja Penelitian Tumbuhan Obat Indonesia 10 dan 18 April 1995. Surabaya : Lembaga Penelitian Univ. Airlangga. Wang ZY, Huang MT, Lou YR, Xie JG, Reuhl KR, Newmark HI, Ho CT, Yang CS, Conney AH, 1994. Inhibitory effects of black tea, green tea, decaffeinated black tea, and decafeinated green tea on ultraviolet by lightinduced skin carcinogenesis in 7,12dimethylbenz(a)anthrazene-initiated SKH-1 mice. Cancer Research 54: 3428-3435. Wijayakusuma H, 2000. Bunga-bungaan, Ensiklopedi Milenium Tumbuhan Berkhasiat Obat Indonesia, Jilid I. Jakarta : Prestasi Insan Indonesia. World Health Organization, 1999. Health Research Methodology : A Guide for Training in Research Methods. Basel, Switzerland : World Health Organization.
